KR20100103846A

KR20100103846A - 내부 고체 코어 내에 성장 호르몬을 함유하는 고체 지질 마이크로캡슐

Info

Publication number: KR20100103846A
Application number: KR1020107016389A
Authority: KR
Inventors: 조엘 리샤르; 헬렌 가브리엘라 발다스키니; 리타 아고스티네토; 안젤리스 루이사 데; 프란츠 데샹
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2010-09-28
Also published as: CN101903014B; JP5773651B2; EA201001002A1; WO2009080164A1; ZA201005167B; ATE514417T1; US8729015B2; AU2008340785B8; EP2231120B1; ES2367093T3; AU2008340785B2; JP2011506499A; AU2008340785A1; CA2710062A1; CN101903014A; AR069844A1; CA2710062C; BRPI0821359A2; EP2231120A1; IL206393A0

Abstract

본 발명은 서방성을 갖는 성장 호르몬 (GH), 특히 인간 성장 호르몬 (hGH) 제형 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 성장 호르몬 제형은 단백질의 변성 없이 제조될 수 있고, 직경이 작은 바늘을 통해 통상의 주사기에 의해 이를 필요로 하는 사람에게 편리하게 투여될 수 있다.

Description

내부 고체 코어 내에 성장 호르몬을 함유하는 고체 지질 마이크로캡슐 {SOLID LIPID MICROCAPSULES CONTAINING GROWTH HORMONE IN THE INNER SOLID CORE}

본 발명은 서방성을 갖는 성장 호르몬 (GH), 특히 인간 성장 호르몬 (hGH) 제형 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 성장 호르몬 제형은 단백질의 변성 없이 제조될 수 있고, 직경이 작은 바늘을 통해 통상의 주사기, 또는 기계적 또는 전자적 주사 장치를 사용하여 이를 필요로 하는 사람에게 편리하게 투여될 수 있다.

인간에서 hGH 결핍에 대한 현행의 치료 섭생은 예를 들어, 주로 피하 주사에 의한 hGH-전달에 기초하고 있다. hGH 는 세포 및 기관 성장의 조절 및 다양한 발달 및 성숙 단계 동안의 생리적 기능에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, hGH 의 과생성은 어린이의 거인증 및 성인의 말단거대증을 야기하는 반면, 저생성은 어린이의 왜소증 [Mauras et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 85(10), 3653-3660 (2000); Frindik et al., Hormone Research, 51 (1), 15-19 (1999); Leger et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 83(10), 3512-3516 (1998)], 터너 증후군 (여성에만 국한) [Bramswig, Endocrine, 15(1), 5-13 (2001); Pasquino et al., Hormone Research, 46(6), 269-272 (1996)] 및 만성 신부전 [Carroll et al., Trends in Endocrinology and Metabolism, 11(6), 231-238 (2000); Ueland et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism, 87(6), 2760-2763 (2002); Simpson et al., Growth Hormone & IGF Research, 12, 1-33 (2002)] 을 유발한다. 성인에서, hGH 결핍은 단백질, 탄수화물, 지질, 미네랄의 대사 과정 및 결합 조직에 영향을 줄 수 있으며, 근육, 뼈 또는 피부 위축증을 야기할 수 있다 [Mehls and Haas, Growth Hormone & IGF Research, Supplement B, S31-S37 (2000); Fine et al., J. Pediatrics, 136(3), 376-382 (2000); Motoyama et al., Clin. Exp. Nephrology, 2(2), 162-165 (1998)]. 성장부전 또는 문제를 특징으로 하는 기타 hGH 결핍-관련 장애에는 AIDS 소모증후군 [Hirschfeld, Hormone Research, 46, 215-221 (1996); Tritos et al., Am. J. Medicine, 105(1), 44-57 (1998); Mulligan et al., J. Parenteral and Enteral Nutrition, 23(6), S202-S209 (1999); Torres and Cadman, BioDrugs, 14(2), 83-91 (2000)] 및 프라더-윌리 증후군 (Prader-Willi syndrome) [Ritzen, Hormone Research, 56(5-6), 208 (2002); Eiholzer et al., Eur. J. Pediatrics, 157(5), 368-377 (1998)] 이 포함된다.

안정하고 지속성이어서, 횟수를 좀더 줄인 주사 스케줄에 의해 전달될 수 있는 hGH 치료에 대한 필요성을 해결하려는 시도로 많은 제품들이 개발되어 왔다.

이를 위해, 다양한 약물 전달 기술, 예컨대 히드로겔 [Katakam et al., J. Controlled Release, 49(1), 21-26 (1997); Kim and Park, J. Controlled Release, 80(1-3), 69-77 (2002)], 리포좀 [Weiner et al., J. Pharm. Sci., 74(9), 922-925 (1985)], 오일 에멀젼 [Yu et al., J. Pharm. Sci., 85(4), 396-401 (1996); Zhao et al., J. Dairy Sci., 75(11), 3122-3130 (1992)] 및 생분해성 중합체 마이크로스피어 [Jostel et al., Clin. Endocrinol. (Oxf), 62 (5) :623-627 (2005); Sun et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 289 (3):1523-1532 (1999); Jones et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 28(1): 1-84 (1997); Johnson et al., Wat Med, 2(7):795-799 (1996)] 가 사용되어 왔다. 그러나, 수득되는 hGH 제형은 종종 약물의 바람직하지 못한 파열 방출을 나타내거나, 제조하기가 어려울 수 있다.

예를 들어, Nutropin Depot^® 은 재조합 인간 성장 호르몬 (r-hGH)-함유 폴리락티드-코-글리콜리드 (PLG) 마이크로스피어의 주사용 현탁액이다 (참조 http://www.gene.com). 이 제품은 큰 제조 비용으로 인해 시장에서 철수하게 되었다. 게다가, 소아 환자에서의 Nutropin Depot^® 의 투여와 관련된 연구는 주사-부위 부작용을 야기하여, 결절, 홍반, 통증, 타박상, 가려움, 지방위축증 및 부기를 유발한다는 것을 보여준다.

LG 제약회사 [LG Pharmaceuticals Inc. (South Korea)] 에서 현재 개발되고 있는 또다른 제품은 hGH, 히알루로네이트, 레시틴, 및 트리글리세라이드를 함유하는 마이크로입자 현탁액 제형이다. 이 제품의 단점은 비호의적인 전달 수단, 구체적으로는 26 게이지 바늘에 의해 주사되어야만 하는 전달 유체이다 [Kim et al., J. Controlled Release, 104: 323-335 (2005); U.S. Application No. 2005/0100605; EP 0918535 B1].

PCT 특허 출원 WO 2004/060310 및 WO 2004/060920 은 폴리전해질 (즉, 폴리양이온) 과 복합체를 이룬 hGH 의 결정을 포함하는 제형을 비롯한 hGH 제형에 관한 것이다. 이러한 조성물은 1 주 이하의 기간 동안 안정하고 지속적인 hGH 방출이 가능하다. 폴리양이온-복합체 hGH 결정 성분이 이러한 조성물을 안정하고 지속성있게 만드는 반면, 일부 환자에서, 복합체 결정 표면의 전하 특성이 주사 부위에서의 경매한 홍조 및 부기를 포함하는 국부적 반응을 유발할 가능성이 있다.

파열 효과, 제한된 서방성과 같은 종래의 제형의 단점을 크게 없애고, 폴리전해질과 같은 부작용을 일으키는 보조제를 함유하지 않는 서방성 제형을 제공하는 것이 본 발명의 주제이다. 또한, 서방성 제형은 통상의 주사기를 사용함으로써, 또는 기계적 또는 전자적 주사 장치를 통해, 27 - 29 게이지 (G) 바늘로 쉽게 투여가능해야만 한다.

놀랍게도 이러한 제형이 성장 호르몬, 벌크제 및 계면활성제를 함유하는 하나 이상의 내부 고체 코어, 및 1 종 이상의 지질을 포함하는 상기 내부 고체 코어를 둘러싸고 있는 외부 쉘을 포함하는 마이크로캡슐을 제공함으로써 수득될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 (1) 성장 호르몬, 벌크제 및 계면활성제를 적어도 함유하는 하나 이상의 내부 고체 코어 및 (2) 1 종 이상의 지질을 포함하는 외부 쉘을 포함하는 미립자 제형에 관한 것이다. 상기 내부 고체 코어는 성장 호르몬을 함유하는 하나 이상의 마이크로입자로 제조된다. 고체, 다중-코어를 갖는, 즉 외부 쉘에 의해 둘러싸인 하나 초과의 성장 호르몬 마이크로입자를 함유하는 마이크로캡슐이 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명에 따라 제형화될 수 있는 성장 호르몬은 소 또는 돼지 성장 호르몬과 같은 동물 기원의 것일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 인간 기원이다. 본 발명의 하나의 바람직한 구현예는 성장 호르몬이 인간 성장 호르몬 (hGH) 또는 인간 성장 호르몬의 생물학적 활성을 보유하는 이의 기능적 유도체, 절편, 변이체, 유사체, 또는 염인 마이크로캡슐에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 바와 같은 "인간 성장 호르몬", 또는 "hGH" 라는 용어는, 바람직하게는 도 5 에 묘사되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 바와 같은 "인간 성장 호르몬" 또는 "hGH" 라는 용어는 또한 GH 의 술폭시드화 및 탈아미드화된 형태인 GH-V, 20 kD 및 22 kD 인간 성장 호르몬 및 성장 호르몬 유전자 좌의 기타 일원 모두를 제한 없이 포함하는 상기 기재되는 바와 같은 자연 발생적 및 합성 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.

20 kD-hGH 는 뇌하수체 뿐 아니라 혈류에서도 생성되는 것으로 보고되어 있다 (Lewis et al, J. Biol. Chem. 253:2679 (1978); Lewis et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. 92:511 (1980). 15 개의 아미노산 잔기 Glu-32 에서 Gln-46 이 결손된 상기 화합물은 메신저 리보핵산의 대안적인 스플라이싱으로부터 생성된다 (DeNoto et al, Nucleic Acids Res. 9:3719 (1981)). 20-K-hGH 는 뇌하수체에서 생성되고 혈액 내로 분비된다. 이것은 성인에서는 약 5% 의 성장 호르몬 생성량, 어린이에서는 약 20% 의 성장 호르몬 생성량을 만들어낸다. 이것은 22 kD 성장 호르몬과 동일한 성장 촉진 활성을 갖고, 22 kD 형태와 동등한 또는 이보다 큰 지질분해 활성을 갖는 것으로 보고된다. 이것은 22 kD 성장 호르몬과 동일한 친화성으로 성장 호르몬 수용체에 결합하고, 22 kD 호르몬의 1/10 의 젖촉진 (프로락틴 유형) 생물활성을 갖는다. 22 kD 과 달리, 20-k-hGH 는 약한 항-인슐린 활성을 갖는다.

GH-V 는 태반에서 발견되는 성장 호르몬의 변이체이다. GH 의 추가로 알려진 유도체에는 hGH 의 탈아미드화 및 술폭시드화된 형태가 포함된다. 단백질 내의 아스파라긴 및 글루타민 잔기는 적합한 조건하에서 탈아미드화 반응을 일으키기 쉽다. 뇌하수체 hGH 는 이러한 유형의 반응을 거쳐, Asn-152 를 아스파르트산으로 전환시키고, 또한 좀더 적은 범위로 Gln-137 을 글루탐산으로 전환시킨다 (Lewis et al, Endocrinology 104:1256 (1979). 탈아미드화 hGH 는 효소 서브틸리신으로의 단백질 가수분해에 대한 감수성이 변경되었다는 것을 나타내어, 탈아미드화가 hGH 의 단백질 가수분해 분할을 지시하는데 생리학적 유의성을 가질 수 있다는 것을 암시한다. 생합성적 hGH 는 특정 저장 조건 하에서 분해되는 것으로 알려져 있고, 상이한 아스파라긴 (Asn-149) 에서의 탈아미드화를 야기한다. 이것은 탈아미드화의 일차 부위이나, Asn-152 에서의 탈아미드화가 또한 관찰된다 (Becker et al, 1988). 뇌하수체-유래 및 생합성적 hGH 모두가 Met-14 및 Met-125 에서 술폭시드화된다 (Becker et al, 1988). Met-170 에서의 산화는 또한 뇌하수체 hGH 에서는 보고되어 있으나, 생합성 hGH 에서는 보고되어 있지 않다.

데사미드 hGH 및 Met-14 술폭시드 hGH 모두는 완전한 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (Becker et al, Biotechnol. Appl. Biochem. 10:326 (1988). 본 발명에 따르면, hGH 는 예를 들어, 뇌하수체 샘 또는 혈액 또는 혈청으로부터 정제되는 자연 발생적 인간 성장 호르몬일 수 있고, 또는 이것은 재조합 hGH 일 수 있다. 재조합 GH 는 임의의 적합한 숙주, 원핵, 또는 진핵 숙주에서 발현될 수 있다. 예를 들어 E. 콜라이 (E. coli) 는 hGH 의 발현에 특히 적합한 숙주이다. 바람직하게는, E. 콜라이에서 발현되는 hGH 는 인간 서열에 비해 부가적인 N-말단 메티오닌을 포함하며, 이러한 hGH 는 또한 Met-GH 로 불린다. 효모, 곤충, 또는 포유류 세포는 또한 재조합 성장 호르몬의 발현에 적합하다. hGH 는 인간 또는 동물 세포, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포에서 발현될 수 있다. 바람직하게는, hGH 는 예를 들어 C127 세포주와 같은 쥣과 세포주에서 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "성장 호르몬" 이라는 용어에는 또한, hGH 의 기능적 유도체, 절편, 변이체 또는 유사체가 성장 호르몬의 생물학적 활성을 보유하는 한, 즉, 성장 호르몬 수용체에 대한 아고니스트로서 작용한다면 도 5 에 묘사되는 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 hGH 의 기능적 유도체, 절편, 변이체, 또는 유사체가 포함된다. 즉, 이들은 성장 호르몬 수용체에 결합하여 수용체의 신호 활성을 개시할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "기능적 유도체", 또는 "화학적 유도체" 라는 용어는 당업계에 알려진 수단에 의해 N- 또는 C-말단기의 잔기 상의 측쇄로서 발생되는 작용기로부터 제조될 수 있는 유도체를 포함하고, 이들이 약학적으로 허용가능하게 남아있고, 본원에 기재된 바와 같은 hGH 의 생물학적 활성, 즉, hGH 수용체 결합 능력 및 수용체 신호 개시를 유의하게 감소시키지 않고, 이를 함유하는 조성물에 대해 독성을 부여하지 않는다면 본 발명에 포함된다. 이러한 유도체가 hGH 의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하고 약학적으로 허용가능하게 남아있다면, 상기 유도체는 카르보히드레이트 또는 포스페이트 잔기와 같은 화학적 부분을 가질 수 있다.

예를 들어, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 1 차 또는 2 차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, N-아실 유도체 또는 아실 부분으로 형성되는 아미노산 잔기의 유리 아미노기 (예를 들어, 알카노일 또는 카르보시클릭 아로일기) 또는 아실 부분으로 형성되는 유리 히드록실기 (예를 들어, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 것) 의 O-아실 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 또한 항원 부위를 차폐하고 체액 중 분자의 체류를 연장할 수 있는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 포함할 수 있다.

복합제와 조합될 수 있거나 유도될 수 있는 성장 호르몬은 오래 지속될 수 있다. 그러므로, 본 발명의 구현예는 인간 성장 호르몬의 PEG화 형태에 관한 것이다. 이러한 인간 성장 호르몬의 PEG화 형태는 예를 들어, WO 2005/074546 에 기재되어 있다. 체내에서 긴 지속성을 나타내기 위해 유전적으로 조작된 성장 호르몬은 또한 본 발명의 범주 내에서의 hGH 유도체에 대한 예이다. N-말단에서 아세틸화된 hGH 가 단리되고 확인되었다 (Lewis et al, 1979). 아실화가 조절 역할을 하거나, 정제 공정을 단순히 한다는 것은 명확하지 않다. 그러나, 상기 분자가 기타 hGH 유도체와 유사한 방식으로 GH 활성을 나타내는 것으로 예상된다. 그러므로, 구현예에서, 본 발명은 N-말단에서 아세틸화된 인간 성장 호르몬의 유도체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 제형의 하나의 구현예는 사슬내 디술피드 결합을 통해 결합되는 디술피드 이량체, 공유 비가역성 비-디술피드 이량체, 비-공유 이량체, 및 이의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 성장 호르몬의 이량체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "뮤테인" 이라는 용어는 야생형 GH 와 비교하여 수득되는 생성물의 활성을 상당하게 감소시키지 않으면서, 자연적인 GH 의 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 아미노산 잔기로 대체되거나, 결실되거나, 또는 GH 의 자연적인 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 첨가되는 GH 의 유사체를 말한다. 이러한 뮤테인은 공지된 합성 및/또는 부위-지정 돌연변이화 기술, 또는 적합한 임의의 공지된 기술에 의해 제조된다.

본 발명에 따른 뮤테인에는 엄격한 조건하에서 GH 를 코딩하는 DNA 또는 RNA 에 혼성화되는 DNA 또는 RNA 와 같은 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 포함된다. hGH 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 도 5 에 묘사되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

"엄격한 조건" 이라는 용어는 당업자가 "엄격한" 이라고 통상적으로 언급하는 혼성화 및 후속 세정 조건을 말한다. [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992)] 를 참조한다. 제한 없이, 엄격한 조건의 예에는 예를 들어, 2 x SSC 및 0.5% SDS 에서 5 분, 2 x SSC 및 0.1 % SDS 에서 15 분; 37℃, 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 에서 30 ~ 60 분, 이후 68℃, 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 에서 30 ~ 60 분의 연구 하에서 혼성화의 계산된 Tm 12 ~ 20℃ 미만의 세정 조건이 포함된다. 당업자는 엄격한 조건은 또한 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 탐침 (예컨대 10-40 염기) 또는 혼합 올리고뉴클레오티드 탐침의 길이에 따라 다르다는 것을 이해한다. 혼합 탐침을 사용하는 경우, SSC 대신 테트라메틸 염화암모늄 (TMAC) 을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 Ausubel 를 참조한다.

일치성은 서열 비교에 의해 측정되는 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계를 반영한다. 일반적으로, 일치성은 비교되는 서열의 길이에 대해, 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 2 개의 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산 대응성을 말한다.

정확한 대응성이 없는 서열의 경우, "% 일치성" 을 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 2 개의 서열은 서열 사이에서 최대 관련성을 산출하도록 배열된다. 이것은 배열 정도를 향상시키기 위해, 1 개 또는 2 개의 서열에 "갭 (gap)" 을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. % 일치성은 비교되는 각 서열의 전체 길이에 대해 측정될 수 있고 (소위 전반적 배열), 이것은 동일한 또는 매우 유사한 길이의 서열에 특히 적합하며, 또는 짧은, 규정된 길이에 대해 측정될 수 있고 (소위 국부적 배열), 이것은 같지 않은 길이의 서열에 더욱 적합하다.

2 개 이상의 서열의 일치성 및 상동성을 비교하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 그러므로 예를 들어, Wisconsin Sequence Analysis Package, 버전 9.1 (Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984) 에서 이용가능한 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP 는, 2 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 % 일치성 및 2 개의 폴리펩티드 서열 사이의 % 일치성 및 % 상동성을 측정하기 위해 사용될 수 있다. BESTFIT 는 Smith and Waterman (Smith and Waterman J Mol Biol, 147,195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981) 의 "국부적 상동성" 알고리즘을 사용하며 2 개의 서열 사이의 유사성의 최적 단일 영역을 찾아낸다. 서열 사이의 일치성 및/또는 유사성을 측정하기 위한 기타 프로그램이 또한 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 BLAST 계열 프로그램 (Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 19) 및 FASTA (Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988) 가 있다.

1. 임의의 이러한 뮤테인은 바람직하게는, 예컨대 GH 에 대해 실질적으로 유사한 활성을 갖도록 GH (예를 들어, 도 5 에 묘사되는 아미노산 서열) 의 것과 충분히 복제성인 아미노산 서열을 갖는다. GH 의 하나의 활성은 GH 수용체에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 GH 수용체 (GHR) 에 대한 실질적인 결합 활성을 갖는 한, 이것은 GH 에 대해 실질적으로 유사한 활성을 갖는 것으로 고려될 수 있다. 그러므로, 임의의 제시된 뮤테인을 예를 들어, 방사면역검정법 또는 ELISA 검정법과 같은 적합하게 표지된 GHR 또는 세포 발현 GHR 에 결합되는지의 여부를 측정하기 위해 간단한 샌드위치 경쟁 검정법에 적용하는 것을 포함하는 정규적인 실험에 의해 이러한 뮤테인이 GH 와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 것을 측정할 수 있다.

2. 바람직한 구현예에서, 임의의 이러한 뮤테인은 GH 의 아미노산 또는 DNA 서열과 적어도 60% 또는 70 % 또는 80 % 또는 90 % 또는 95 % 또는 98 % 또는 99 % 일치성 또는 상동성을 갖는다. hGH 의 아미노산 서열은 도 5 에 제시된다. GH 를 코딩하는 DNA 서열은 당업계, 예를 들어 [DeNoto et al, 1981 또는 Martial et al., 1979] 에 알려져 있다.

3. 본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변경은 "보존적" 치환으로서 알려진 변경이다. GH 폴리펩티드의 보존적 아미노산 치환은, 그룹 일원 사이의 치환이 분자의 생물학적 기능을 보존할 충분히 유사한 물리화학적 특성을 갖는 그룹 내 비슷한 아미노산을 포함할 수 있다 (Grantham, 1974). 특히 삽입 또는 결실이 오직 소수의 아미노산, 예를 들어, 30 이하, 20 이하, 바람직하게는 10 이하로만 포함되고, 기능적 변형에 중요한 아미노산, 예를 들어, 시스테인 잔기를 제거 또는 대체하지 않는 경우 아미노산의 삽입 및 결실이 또한 기능의 변형 없이 상기 정의된 서열 내에 만들어질 수 있다는 것이 명백하다. 이러한 결실 및/또는 삽입에 의해 생성되는 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 범주 내에 있다.

4. "융합 단백질" 이라는 용어는 예를 들어, 체액 중에서 연장된 체류 시간을 갖는 또다른 단백질과 융합된 GH 를 포함하는 폴리펩티드, 또는 이의 뮤테인 또는 절편을 말한다. 융합은 직접적으로 또는 예를 들어 5 내지 10 개의 아미노산의 펩티드 링커와 같은 링커를 통해 이루어질 수 있다. 그러므로 GH 는 또다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들어 이의 면역글로불린 또는 절편에 융합될 수 있다. IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 와 같은 IgG 의 Fc 부분은 면역글로불린-융합 단백질의 제조에 적합하다. Ig 융합 단백질은 예를 들어 EP 314 317 A1 (Genentech) 또는 EP 0 325 224 A2 (Zymogenetics Inc.) 에 기재되어 있다.

5. GH, 또는 뮤테인 및 융합 단백질의 "활성 분획" 으로서, 본 발명은 단백질 분자 단독 또는 이와 연결된 관련 분자 또는 잔기, 예를 들어, 당 또는 포스페이트 잔기, 또는 단백질 분자 또는 당 잔기의 그 자체에 의한 응집체의 폴리펩티드 사슬의 임의의 절편 또는 전구체를, 상기 분획이 GH 에 대해 실질적으로 유사한 활성을 갖는다는 조건하에서 포함한다.

6. 본 발명에 따라 제형화되는 GH 는 단독으로 또는 기타 활성 성분과 조합으로 다수의 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 장애는 바람직하게는 불충분한 내생 GH 생성과 관련이 있다. 정제된 GH 는 예를 들어, GH 결핍증, AIDS 소모병, 지방이상증 (또한 HARS - HIV-관련 형태이상/대사불량 증후군으로 불림), 또는 짧은 창자 증후군 (특히 소아) 의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다. 성장 호르몬의 투여가 필요할 수 있는 추가의 질환에는 간 경화, 성인 성장 결핍, 죽상동맥경화증, 크론 질환 및 궤양대장염, 골관절염, 심인성 악액질, 울혈 심부전, 만성 신부전, 혈액 세포 재구성 또는 동원, 남성 불임, 조혈 줄기 세포 동원, 다발성 경화증, 뇌졸중, 다계통 위축증, 또는 암이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "마이크로캡슐" 이라는 용어는 마이크로- 및 마이크로이하-크기의 입자로서, 이것은 하나 이상의 내부 고체 코어 및 외부 쉘을 포함하고, 다소 구형의 형상을 나타내는 구조를 갖는다. 정의된 바와 동일한 구조를 갖는 마이크로이하-크기 범위의 입자인 나노캡슐로서 언급되는 입자는, 본원에서 사용되는 바와 같은 "마이크로캡슐" 에 명백하게 포함된다.

전형적으로는, 본 발명의 마이크로캡슐의 중량-평균 직경은 대략 100 nm 내지 대략 500 ㎛ 의 범위이다. 더욱 바람직하게는, 평균 입자 직경은 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛ 이다. 또다른 구현예에서, 마이크로스피어의 평균 직경은 약 10 ㎛ 내지 약 80 ㎛ 이고, 이것은 직경이 작은 바늘이 장착된 주사기를 통해 적용되기에 매우 유용한 크기 범위이다. 본 발명의 마이크로캡슐은 입자 내로 도입된 성장 호르몬의 서방출을 제공하는 저장소가 마련될 수 있도록 근육내 또는 피하 주사 후 국부적 조직 체류를 달성하는데 매우 유용하다.

본 발명에 따른 입자에 사용되는 벌크제는 바람직하게는 당 알코올, 당, 당 알코올 및/또는 아미노 당이다. 벌크제가 당인 경우, 이것은 바람직하게는 단당-, 이당- 또는 삼당류이다. 언급될 수 있는 단당류의 예는 글루코오스, 만노오스, 갈락토오스, 프룩토오스 및 소르보오스이고, 언급될 수 있는 이당류의 예는 수크로오스, 락토오스, 말토오스 및 트레할로오스이고, 언급될 수 있는 삼당류의 예는 라피노오스이다. 바람직한 것은 수크로오스, 락토오스, 말토오스 및 트레할로오스이고, 특히 바람직한 것은 수크로오스이다. 당 알코올은 반응성 카르보닐기가 알코올기로 환원된 단당류, 예를 들어, 헥시톨 또는 펜티톨을 의미한다. 벌크제로서 사용될 수 있는 당 알코올은 바람직하게는 헥시톨, 예를 들어, 만니톨, 소르비톨, 둘시톨, 자일리톨 또는 리비톨을 포함한다. 특히 바람직한 것은 만니톨 및/또는 소르비톨이고, 더욱 특히 바람직한 것은 만니톨이다.

벌크제로서 사용될 수 있는 아미노 당은, 1 차, 2 차 또는 3 차 아미노기 또는 히드록실기대신 아실화 아미노기 (-NH-CO-R) 를 함유하는 단당류이다. 본 발명의 목적을 위해, 여기서 특히 바람직한 것은 글루코사민, N- 메틸글루코사민, 갈락토사민 및 뉴라민산이다.

마이크로캡슐의 코어를 구성하는 마이크로입자는 하나의 벌크제 또는 상이한 벌크제의 혼합물을 함유할 수 있다. 혼합물이 사용되는 경우, 이러한 혼합물은 예를 들어, 당, 당 알코올 또는 아미노 당과 동일한 그룹으로부터의 벌크제를 함유할 수 있거나, 예를 들어, 당 및 당 알코올 모두와 상이한 그룹의 벌크제를 함유할 수 있다.

벌크제는 본 발명에 따른 마이크로캡슐의 코어를 구성하는 마이크로입자 내에 총 중량의 20 내지 99%, 바람직하게는 총 중량의 30 내지 90%, 특히 바람직하게는 총 중량의 35 내지 75% 의 비율로 존재한다.

사용될 수 있는 계면활성제는 약학 제제에 통상 사용되는 모든 계면활성제이다. 바람직하게는 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 특히 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 (폴리소르베이트) 및 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체이다. 마이크로캡슐의 코어를 구성하는 마이크로입자는 1 종 이상의 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제 또는 계면활성제의 혼합물은 이러한 마이크로입자 내에 총 중량의 0.01 내지 2%, 바람직하게는 총 중량의 0.05 내지 0.5%, 더욱 바람직하게는 총 중량의 약 0.1% 의 비율로 존재한다.

폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는 또한 폴리소르베이트 및 상표명 Tween^® 으로 알려져 있다. 적합한 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르는, 특히, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노팔미테이트 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노스테아레이트이다. 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트 및 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트가 바람직하며, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트가 특히 바람직하다. 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체는 또한 상표명 폴록사머 (Poloxamer) 로 알려져 있다. 특히 바람직한 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체는 폴록사머 188 로, 상표명 Lutrol^® F68 로 시판된다.

본 발명에 따른 제제의 쉘에 사용되는 지질은 순수할 수 있거나 또는 지방 알코올, 지방산 에스테르 및/또는 폴리올 에스테르의 블렌드 (폴리올은 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있음) 일 수 있다. 본 발명의 특정 방식에서, 지질은 인지질, C₈ - C₂₂ 지방산의 모노-, 디-, 및 트리-글리세라이드, 지방산 에스테르, 지방 알코올, 글리코글리세롤지질, (상기 화합물은 글리세롤 또는 디아실글리세롤에 글리코시드에 의해 연결된 1 또는 2 개의 당을 함유함), 수크로오스 에스테르 및 이들의 블렌드 군으로부터 선택된다. 바람직하게 사용되는 지질은 지질의 용융으로 인한 단백질의 급속 전달을 피하기 위해 적용되게 되는 인간 또는 동물 신체의 온도 초과의 융점을 갖는다. 바람직하게는 사용되는 지질의 융점은 약 4O℃ 이상, 바람직하게는 45℃ 내지 8O℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 48℃ 내지 75℃ 의 범위이다.

발명의 바람직한 방식에서, 쉘을 형성하는데 사용되는 인지질은 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤, 디포스파티딜글리세롤, 디팔미토일-포스파티딜콜린, 디올레일포스파티딜에탄올아민, 디올레일포스파티딜콜린, 디미리스톨-포스파티딜글리세롤, 및 이들의 블렌드로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

글리세롤과 지방산의 에스테르는 글리세롤과 중쇄 및/또는 장쇄 (C₈ 내지 C₂₂) 지방산 및/또는 이의 혼합물의 모노에스테르, 디에스테르 및/또는 트리에스테르일 수 있다. 발명의 바람직한 방식에서, 모노-, 디-, 트리글리세라이드는 C₈ - C₂₂ 지방산의 모노-, 디-, 트리글리세라이드의 군, 특히 카프르산, 카프릴산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 및 이들의 블렌드의 모노-, 디-, 트리글리세라이드의 군으로부터 선택된다. 순수 트리글리세라이드, 예컨대 상표명 Dynasan^® 으로 시판되는 것, 예를 들어 Dynasan^® 114 (트리미리스틴), Dynasan^® 118 (트리스테아린) 은 또한 마이크로캡슐의 쉘을 형성하는데 사용될 수 있다.

수소화 식물유, 바람직하게는 유형 I 의 장쇄 수소화 식물유, 예컨대 팜유, 대두유 또는 면화씨유가 또한 지질 쉘의 일부에 특히 적합할 수 있다. 특히 바람직한 수소화 식물유는 상표명 Dynasan^® P 60 으로 시판되는 것과 같은 수소화 팜유이다.

지방산 에스테르는 지방산과 1 가 또는 2 가 알코올과의 모노-에스테르이다. 본 발명에 사용될 수 있는 지방산 에스테르는 바람직하게는 C₁₂ - C₂₂ 산과 C₁ - C₁₀ 선형 또는 분지형 지방족 알코올 및 이들의 혼합물과의 에스테르, 예컨대 에틸 팔미테이트, 에틸 미리스테이트, 이소프로필 미리스테이트, 에틸 스테아레이트, 옥틸 스테아레이트 및 이들의 혼합물로부터 선택된다.

본 발명에 사용될 수 있는 지방 알코올은 장쇄 (C₁₂ - C₂₂) 알코올 및 이들의 혼합물, 예컨대 세틸 알코올, 미리스틸 알코올, 세테아릴 알코올, 스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올 및 이들의 혼합물이다. 본 발명에 사용될 수 있는 글리코글리세롤지질의 예는 모노갈락토실 디아실글리세롤 (MGDG) 및 디갈락토실 디아실글리세롤 (DGDG), 이들의 혼합물 및 이들의 아실화 및 술폰화 유도체이다. 본 발명에서 이용가능한 예는 글리세롤과 베헨산 (C₂₂) 의 에스테르 (INCI: 트리베헤닌, USP: 글리세릴 베헤네이트) 로서, 이것은 또한 상표명 Compritol^® 888 로 시판된다. 이것은 모노- (12 ~ 18%), 디- (52%) 및 트리-글리세라이드 (28 ~ 32%) 로 이루어지고, 베헨산 (>85%) 외에, 추가로 C₁₆ - C₂₀ 지방산을 함유한다. 글리세릴 베헤네이트는 69 내지 74℃ 의 융점을 갖는다.

본 발명에서 이용가능한 글리세롤과 지방산의 에스테르에 대한 추가의 예는 상표명 Precirol^® ATO 5 (Precirol) 로 시판되는 지질이고, 이것은 글리세롤과 팔미트산 및 스테아르산의 에스테르의 혼합물 (글리세릴 팔미토스테아레이트) 이며 팔미트산 및 스테아르산과의 모노- (8 ~ 17%), 디- (54%) 및 트리-글리세라이드 (29 ~ 38%) 로 이루어진다. Precirol^® ATO 5 는 50 내지 6O℃ 의 융점 및 약 2 의 HLB 값을 갖는다.

폴리에틸렌 글리콜과 지방산의 에스테르는 또한 폴리글리콜화 (polyglycolyzed) 글리세라이드로서 알려져 있고, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 천연 오일의 알코올 분해 반응에 의해 제조될 수 있다. 이들은 장쇄 (C₁₂ 내지 C₁₈) 지방산의 글리세라이드의 모노에스테르, 디에스테르 및/또는 트리에스테르, 및 장쇄 (C₁₂ 내지 C₁₈) 지방산의 PEG (모노- 및/또는 디-) 에스테르의 혼합물이고, 유리 PEG 를 포함할 수 있다.

폴리글리콜화 글리세라이드는 예를 들어, 상표명 Gelucire^® 로 Gattefosse 에서 시판된다. 통상적으로 상표명 Gelucire^® 로 시판되는 지질은 융점 및 HLB 값을 나타내는 2 개의 2 자리 숫자로 더욱 구체적으로 명시된다. 융점은 섭씨로 표현되고 HLB (Hydrophile-Lipophile Balance: 친수성-친유성 균형) 는 0 내지 대략 20 범위의 수치이다. HLB 값이 낮을수록 더욱 친유성이고 소수성인 성분을 나타내고, HLB 값이 높을수록 더욱 친수성이고 소유성 (lipophobic) 인 성분을 나타낸다. 물에 대한 또는 오일 물질에 대한 화합물의 친화성을 측정하고 이의 HLB 값을 실험적으로 정한다. 마이크로캡슐의 쉘 내에 존재하는 폴리글리콜화 글리세라이드의 예는 Gelucire^® 50/13, Gelucire^® 53/10, 및 바람직하게는 Gelucire^® 50/02 이다.

미립자 제형의 쉘은 하나의 지질 또는 상이한 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 혼합물이 사용되는 경우, 이러한 혼합물은 예를 들어, 글리세롤과 지방산의 에스테르 또는 폴리글리콜화 글리세라이드와 동일한 그룹으로부터의 지질을 함유할 수 있거나, 또는 이것은 예를 들어, 글리세롤과 지방산의 에스테르 및 폴리글리콜화 글리세라이드 모두와 상이한 그룹의 지질을 함유할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 마이크로캡슐의 쉘 내에 존재하는 지질은 폴리글리콜화 글리세라이드 및/또는 글리세롤과 지방산의 에스테르이다.

지질 외에도 쉘은 지질의 막형성 능력을 향상시킬 수 있는 가소제와 같은 부가제를 함유할 수 있다. 가소제는 지질에 용해되어, 지질의 가소성과 유동성을 향상시키는 실온에서 통상 액체인 성분이다. 가소제의 첨가는 코팅 내에 결정형 도메인의 형성에 제한을 가하며 (지질) 코팅 물질의 다공성을 감소시킨다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 구현예는 외부 쉘이 또한 가소제를 함유하는 마이크로캡슐에 관한 것이다.

지질 또는 가소제 및 분산제와 같은 마이크로캡슐의 쉘 내에 존재할 수 있는 첨가제와 함께 지질의 혼합물이 본 출원에서 "지질상" 으로 언급된다.

예를 들어, 지질상 내에 존재할 수 있는 가소제는 예를 들어, 중쇄 트리글리세라이드 (MCT) 또는 양친매성 블록 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체 (폴록사머), 예컨대 Lutrol^® F127 과 같은 코팅 물질로서 사용되는 지질과 비교하여 유의하게 낮은 융점을 갖는 지질이다. 지질상의 총 중량에 대한 가소제의 농도는 0 내지 10 % 의 범위, 바람직하게는 1 내지 6 % 의 범위이다. 쉘은 또한 용융 지질 중의 코어 hGH 마이크로입자의 분산을 용이하게 하는 1 종 이상의 분산제를 함유할 수 있다. 따라서, 추가의 바람직한 구현예는 외부 쉘을 구성하는 지질상이 내부 코어에 대한 분산제를 함유하는 마이크로캡슐에 관한 것이다. 특정의 바람직한 구현예에 따르면, 분산제는 인지질 또는 이의 유도체, 예를 들어 대두 레시틴, 바람직하게는 대두 레시틴이다. 전체 쉘-형성 지질상의 총 중량에 대한 분산제의 농도는 0 내지 2 % 의 범위, 바람직하게는 0.1 내지 1 % 의 범위이다.

본 발명의 마이크로캡슐은 2 단계 절차에 의해 제조될 수 있다. 제 1 단계에서, 마이크로캡슐의 내부 코어를 구성하는 입자가 제공되고, 제 2 단계에서, 외부 쉘이 제공된다.

바람직하게는 마이크로캡슐 제조의 제 1 단계는 분무-건조 기술을 사용하여 수행되고, 제 2 단계는 임계압 (P_c) 근처의 압력에서 가압된 유체를 이용하는 공정을 사용하여 수행된다. "임계압 (P_c) 근처의 압력에서 가압된 유체" 라는 표현은 0.4 P_c 내지 3 P_c 에 포함되는 압력으로 가압된 유체를 지칭한다. 따라서, 본 발명의 추가의 목적은 내부 코어는 분무-건조 기술을 사용하여 제조하고, 외부 쉘은 가압 유체-기재 공정을 사용하여 제조하는 본 발명의 마이크로캡슐의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공정은 초임계 (SC) 압에서 조작된다. "SC 압에서의 유체" 라는 표현은 그 온도와 상관없이 임계압 (P_c) 초과의 압력에서 가압된 유체를 지칭한다. 이것은 온도가 임계 온도 (T_c) 미만 또는 초과로부터 선택될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 방식에서, 초임계 유체 (Supercritical Fluid: SCF) 를 이용하는 마이크로캡슐화 공정이 사용되고, 이것은 유체의 압력 및 온도 모두는 적어도 공정의 일부분에서 P_c 및 T_c 각각보다 높을 것임을 의미한다.

이미 언급된 제 1 단계와 같이, 즉, 내부 코어를 구성하는 입자의 제조는 분무-건조 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 원리적으로 분무-건조는 용매 추출 공정이다. 수득되는 생성물의 구성성분을 지질에 용해/분산시킨 후, 예를 들어 연동 펌프를 사용하여, 분무-건조기의 분무기에 공급한다. 액체의 분무화에 사용될 수 있는 적합한 분무기에는, 노즐 또는 회전 디스크가 포함된다. 노즐의 경우 압축 기체의 작용으로 인해 분무화가 일어나는 반면, 회전 디스크를 사용하는 경우 디스크의 빠른 회전으로 인해 인해 분무화가 일어난다. 두 경우, 분무화는 건조 챔버 내로 액체의 작은 액적으로의 분열을 야기하고, 에어로졸 액적으로부터 용매가 추출되고, 예를 들어 배기관을 통해 용매 트랩으로 배출된다.

입자 제조에 사용될 수 있는 적합한 분무-건조 기술은 잘 알려져 있고, 예를 들어, [K. Masters in "Spray-drying Handbook", John Wiley & Sons, New York, 1984] 에 기재되어 있다. 바람직한 구현예에서, 액체의 분무화는 노즐을 사용하여 수행된다. 적합한 분무-건조기의 예에는 Buchi 의 랩 규모 분무-건조기, 예컨대 Mini Spray Dryer 290, 또는 MOBILE MINOR™, 또는 Niro 의 Pharma Spray Dryer PharmaSD^® 가 포함된다.

분무-건조 조건은 생성물 특성, 습도, 입자 크기, 형태학 및 단백질 응집 및 분해 범위에 주요한 영향을 미친다. 고온에 대한 단백질의 노출이 분해를 야기할 수 있으므로, 온도가 가장 중요한 공정 파라미터이다. 분무-건조기의 경우, 2 가지 온도: 주입구 온도 및 배출구 온도가 조절되어야만 한다. 주입구 온도는 독립적인 공정 파라미터이고 오퍼레이터에 의해 설정될 수 있으며, 배출구 온도는 액체 공급 속도, 분무화 공기 용적 유속, 건조 용적 유속, 및 맹백하게는 선택된 주입구 온도에 종속적이다.

본 발명의 적합한 구현예에 따르면, 주입구 온도는 90℃ 내지 150℃, 바람직하게는 95℃ 내지 130℃, 더욱 바람직하게는 100℃ 내지 120℃ 의 범위이다.

본 발명에 따르면, 미립자 제형 제제의 코어 제조에 사용되는 단백질-, 벌크제- 및 계면활성제-함유 용액은 계면활성제를 0.001 내지 2 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 1 중량%, 특히 바람직하게는 0.1 내지 0.2 중량% 의 양으로 포함한다. 분무-건조에 사용되는 용액/분산액은 마이크로캡슐의 내부 코어 내에 존재하는 모든 성분, 즉, 성장 호르몬, 벌크제 및 계면활성제를 함유한다. 용액/분산액은, 예를 들어 이러한 용액/분산액 내에서 성장 호르몬의 안정성을 향상시키기 위해 또는 이들의 가공성 향상을 위해 추가의 보조제를 함유할 수 있다. 예를 들어 용액/분산액은 완충액으로서, 예를 들어, 포스페이트 완충액, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액 및/또는 숙시네이트 완충액을 함유할 수 있다. 이러한 완충액은 1 mM 내지 100 mM, 바람직하게는 5 mM 내지 50 mM, 더욱 바람직하게는 10 mM 내지 20 mM 의 농도로 존재할 수 있다.

바람직하게는 용액/분산액은 pH 5.0 내지 pH 8.5, 바람직하게는 pH 5.5 내지 pH 7.5, 더욱 바람직하게는 pH 5.85 내지 pH 7.4 의 범위의 pH 를 갖는다. 특히 바람직한 pH 값은 pH 5.85 및 pH 7.4 이다.

적합한 구현예에 따르면, 성장 호르몬은 약 1 mg/ml 내지 약 10 mg/ml 의 농도로 존재한다.

추가의 구현예에 따르면, 분무-건조용 용액/분산액은, 벌크제를 1 mg/ml 내지 20 mg/ml, 바람직하게는 2 mg/ml 내지 10 mg/ml, 더욱 바람직하게는 5 mg/ml 의 농도로 포함한다.

1 종 이상의 지질을 함유하는 쉘은, 코어 마이크로입자를 P_c 근처의 압력 P, T_c 근처의 온도로 가압된 유체와 접촉시켜, 쉘 물질을 팽윤시킬 수 있도록 하는 공정을 사용하여 단백질-적재 코어에 적용될 수 있다. "T_c 근처의 온도" 라는 표현은 0.8 T_c (단위: 캘빈, Kelvin, K) 내지 1.5 T_c (단위: K) 에 속하는 온도 T (단위 :K) 에서의 유체를 지칭한다. 예를 들어, 이것은 US 5,057,342 (H. F. Bok et al., 1989), US 5,066,522 (T.A. Cole et al., 1989), 및 또한 더욱 최근의 US 2003/0157183 A1 에서 기재되는 바와 같은 캡슐화 공정일 수 있다. 이러한 공정은 분산된 코어 마이크로입자를 함유하는 용융된 지질에 가압 유체를 용해하여, 소위 기체-포화 현탁액을 수득하고, 이것을 노즐을 통해 추가로 확장시켜 단백질-적재 코어를 함유하는 고체 지질 마이크로캡슐를 형성하는 것으로 이루어진다. 가압 유체는 바람직하게는, 단독으로 또는 조용매의 존재하에서 사용되는 아산화질소, 프로판, 에탄 및 이산화탄소 (CO₂) 로 이루어지는 군으로부터 선택된다. CO₂ 는 본 발명에서 사용되는 바람직한 가압 유체이다. 조용매는 지질상으로의 가압 유체의 용해를 돕고 분산액의 점도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 조용매는 케톤, 알코올, 에스테르, 및 탄소수 3 내지 8 의 경질 탄화수소, 바람직하게는 아세톤, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 또는 에틸 아세테이트일 수 있다. 이들은 10 % 미만, 바람직하게 약 1 % 정도의 적은 농도로 사용된다. 조용매는 공정의 최종 감압/팽창 상 동안 최종 마이크로캡슐로부터 제거된다. EP 0784 506 B 에 기재되는 공정과는 반대로, 본 발명에서 사용되는 지질상은 공정을 실시하기 위해 초임계 유체에 용해될 필요가 없다. 쉘을 형성하기 위해 사용될 수 있는 고체 지질의 범위를 상당히 확장시켜, 훨씬 더 높은 생산율을 산출하고, 제형 내에 도입되는 본래 물질 중 하나와 동일한 조성의 잘 정의된 고체 지질 쉘을 보장하는 것으로, 이것이 EP 0784 506 B 와 비교하였을 때의 본 발명의 핵심 장점이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 유압 P 의 값은 지질 용융물 내 hGH 코어 마이크로입자의 분산 상 동안 약 0.75 Pc 내지 약 1.5 P_c 의 범위이다. 따라서, 본 발명의 하나의 바람직한 목적은, 내부 코어는 분무-건조 기술을 사용하여 제조하고, 외부 쉘은 0.5 P_c 내지 2 P_c, 더욱 바람직하게는 약 0.75 P_c 내지 약 1.5 P_c (P_c 는 유체의 임계압임) 의 범위에 포함되는 압력으로 가압된 유체를 사용하여 제조하는 마이크로캡슐의 제조 공정이다.

본 발명의 캡슐화 공정에서, 성장 호르몬-적재 코어 마이크로입자 및 지질 작용제는 이산화탄소 (CO₂) 와 같은 가압 유체와 접촉시켜 용융된, 기체-포화 지질 작용제(들) 내에 단백질 입자의 현탁액을 산출한다. 가압 유체로서 CO₂ 가 사용되는 경우, 상기 상 동안 사용되는 압력은 바람직하게는 5 MPa 내지 15 MPa, 바람직하게는 5.8 MPa 내지 11.0 MPa 의 범위로부터 선택된다. 부형제 내의 가압 유체 용해는 일반적으로 이것의 용융/유리 전이 온도 훨씬 이하의 (~10 내지 50℃) 온도에서 부형제 팽윤/용융을 유도하여, 감소된 점도를 갖는 포화 용융물을 생성한다. 포화 용융물의 온도는 바람직하게는 30℃ 내지 70℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 35℃ 내지 65℃ 의 범위이다.

용융 지질 내 단백질-적재 코어 마이크로입자의 균질 분산액이 가압 유체에 의해 팽윤된 후, 노즐을 통한 포화 현탁액의 감압은 액적에 용해된 유체의 큰 부피 팽창을 야기하고, 이들을 유체 팽창과 관련된 강한 온도 하강 (즉, 소위 줄-톰슨 효과) 으로 인해 빠르게 고형화되는 작은 액적으로 파괴시킨다. 지질 내 유체 용해, 분산 및 감압 조건은 낮은 파열 방출을 야기하는 유사한 구형 형태학, 저 다공성 및 고 응집력을 가진 마이크로캡슐을 생성하기 위해 조정된다. 균질 분산액이 가압되는 압력은 바람직하게는 주위 압력 내지 5.5 MPa 의 범위, 더욱 바람직하게는 1.5 MPa 내지 3.5 MPa 의 범위, 가장 바람직하게는 약 3 MPa 이다.

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 마이크로캡슐은 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:

(a) 성장 호르몬, 벌크제 및 계면활성제를 적어도 포함하는 수용액/분산액을 제조하는 단계;

(b) 상기 단계 (a) 에서 제조된 수용액/분산액을 분무-건조하여 단백질-함유 마이크로입자를 제조하는 단계;

(c) 상기 단계 (b) 에서 수득된 마이크로입자를 수집하는 단계;

(d) 가압 유체가 지질상에 용해되는 압력 및 온도 조건 하에서, 가압 유체 내에 지질 및 상기 단계 (c) 에서 수득된 마이크로입자를 포함하는 균질 분산액을 제조하는 단계;

(e) 노즐을 통해 상기 단계 (d) 에서 제조된 분산액을 갑압하고 단계 (e) 에서 수득된 마이크로캡슐을 수집하는 단계.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 공정을 실시하기 위해 사용되는 가압 유체는 CO₂ 이고, 유체 용해 및 hGH 마이크로입자의 분산액에 대한 압력은 약 6.MPa 또는 100 MPa 이고, 온도는 약 60℃ 내지 약 70℃ 의 범위이며, 후팽창 압력 (이것은 감압 용기 내의 압력임) 은 약 3.0 MPa 내지 약 5.0 MPa 의 범위이다.

본 발명의 마이크로캡슐은 예를 들어 직경이 작은 바늘을 통해 및 통상의 주사기 (25 - 30 게이지) 를 사용하여 적합한 약학적으로 허용가능한, 주사가능 매질 내에 현탁액을 형성한 후 이를 필요로 하는 사람에게 투여될 수 있다. 바람직하게는 현탁액 매질은 적합한 계면활성제 및/또는 벌크제를 추가로 함유할 수 있는 수성 매질이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "수성" 이라는 용어는 물 또는 물과 기타 용매, 특히 유기 용매와의 혼합물로서 이해된다. 하나 이상의 성분이 물 또는 물과 기타 용매와의 혼합물에 용해 또는 현탁되는 경우 수용액/현탁액이 존재한다. 수용액/현탁액이 하나 이상의 약동학적 활성 성분을 함유하고 이러한 용액/현탁액이 인간 또는 동물의 치료 또는 예방적 치료에 적합한 경우, 이러한 용액/현탁액은 약학 제제이다. 유기 용매가 수용액/현탁액 또는 약학 제제에 존재하는 경우, 바람직하게는 비경구 투여에 적합한 이러한 유기 용매가 존재한다 (예컨대 디메틸 술폭시드 (DMSO), 그러나 바람직하게는 알코올, 예를 들어 에탄올, 1,2-프로판디올, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜 및 글리코푸롤).

비경구 투여의 내약성을 증가시키기 위해, 현탁액의 삼투압 농도는 바람직하게는 등장성 범위, 즉, 약 250 내지 350 mOsmol/kg 의 삼투압 농도이다. 그 다음 제제는 실질적으로 통증 없이 정맥 내로, 동맥 내로 그리고 또한 피하로 직접적으로 투여될 수 있다.

삼투압 농도를 달성하기 위해 수성 매질은 등장성 개질제, 바람직하게는 생리학적으로 내약성인 염, 예를 들어, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 또는 생리학적으로 내약성인 폴리올, 예를 들어, 글루코오스 또는 글리세롤을, 등장성 개질에 필요한 농도로 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 마이크로캡슐에 대한 수성 분산 매질은 생리 식염수이다.

분산 매질은 추가의 보조제, 예컨대 적합한 계면활성제 (폴록사머 188 및 407, Solutol^® HS 15, Tween^® 20) 및/또는 적합한 당 알코올, 예를 들어, 만니톨 및/또는 소르비톨을 함유할 수 있다.

대안적으로는, 마이크로캡슐의 투여용 현탁 매질은 저점도의 비수성, 주사가능 액체, 예컨대 중쇄 트리글리세라이드 (글리세롤의 지방산 에스테르) 의 혼합물일 수 있다. 바람직한 중쇄 트리글리세라이드는 Mygliol^® 812 (Dynamit Nobel 사제), Labrafac^® WL1349 (카프릴산 트리글리세라이드, Gattefosse 사제, France), 또는 Lipoid MCT (Lipoid 사제, Germany) 이다.

적용가능한 비경구 투여에 적합한 마이크로캡슐을 제조하기 위해, 사용 전 저장에 적합한 용기 내에, 멸균 조건하에서 밀봉 밀폐된 형태로 유리하게는 존재한다. 따라서, 본 발명의 유리한 목적은 사용 전 저장에 적합한 용기 내에, 멸균 조건하에서 밀봉 밀폐된 마이크로캡슐 제제의 형태이다. 비경구 투여에 적합한 마이크로캡슐의 현탁액을 제공하는데 사용되는 요소는 유리하게는 키트에 함께 제공될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가의 목적은 (1) 성장 호르몬, 벌크제, 계면활성제를 포함하는 내부 코어 및 (2) 1 종 이상의 지질을 포함하는 외부 쉘을 포함하는 마이크로캡슐을 함유하는 용기 및 분산 매질이 있는 용기를 포함하는 키트이다.

이제 본 발명에서 충분히 설명되었겠지만, 당업자는 본 발명이 발명의 범주 및 취지에서 벗어나지 않고 과도한 실험 없이 광범위한 동등한 파라미터, 농도 및 조건 내에서 실시될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

본 발명이 이의 구체적인 구현예와 관련하여 기재되고 있지만, 추가의 변화가 이뤄질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본 출원은, 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 업계 내에 공지된 또는 통상의 실시 내에 있으면서, 하기 특허 청구 범위에서 언급되는 상기 필수적인 특징에 적용될 수 있는 본 명세로부터의 이탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 각색을 포함하는 것으로 의도된다.

저널 논문 또는 요약, U.S. 또는 외국 특허에서 발행된 공개 또는 미공개 U.S. 또는 외국 특허 출원 또는 임의의 기타 참조를 비롯한 본원에 언급되는 모든 참조는, 언급된 참조에 제시되는 모든 데이터, 표, 도면 및 텍스트를 비롯하여 본원에 참조로서 전체가 인용된다. 부가적으로는, 본원에 언급된 참조 내에 언급된 참조의 전체 내용도 또한 참조로서 전체가 인용된다.

공지된 방법 단계, 통상의 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상의 방법에 대한 참조는 본 발명의 임의의 양상, 설명 또는 구현예가 관련 업계에 기재되고, 교시되거나 제안되었다는 것을 인정하는 어떠한 방식도 아니다.

특정 구현예의 상기 기재는 당업자의 지식을 적용함으로써 (본원에 언급된 참조의 내용 포함), 다른 사람들이 본 발명의 일반적인 개념에서 벗어나지 않고, 과도한 실험 없이 이러한 구체적인 구현예를 다양한 적용을 위해 쉽게 변형 및/또는 각색할 수 있도록 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 밝힐 것이다. 그러므로, 이러한 각색 및 변형은 그 의미가 본원에 제시된 교시 및 지침에 근거하여 기재된 구현예의 동등한 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본원의 어법 또는 용어가 기술을 목적으로 하는 것이지 제한하려는 것은 아니며, 이러한 본 발명의 어법 또는 용어는 당업자의 지식과 함께 본원에 제시된 교시 및 지침의 견지에서 당업자에 의해 해석되는 것으로 이해된다.

다르게 구체적으로 설명되지 않는다면, 본 특허 출원에 기재된 모든 백분율 (%) 데이터는 중량% (% (w/w)) 를 의미하는 것으로 의도된다.

하기 실시예는 본 발명을 제한 없이 설명하고자 한다.

분무-건조

Buechi 사의 Mini Spray Drier 를 사용하였다. 고온 기체는 제습 공기 또는 질소였다. 기체 온도는 약 80℃ 내지 약 150℃ 의 범위였다.

입자 크기 분포 분석

분무-건조법을 사용하여 제조된 분말의 입자 크기 분포는 Laser Diffraction System (Mastersizer 2000, Malvern Instruments) 및 입자 이미지 분석기 (Morphologi G2, Malvern Instruments) 에 의해 특징을 분석하였다. Mastersizer 2000 를 사용하여, 용매로서 이소프로판올을 사용하는 액체 현탁액 중 분무-건조 분말의 입자 크기 분포를 측정하였다. 각각의 현탁액을 약 2 분 동안 초음파 분쇄한 후, 샘플 셀에 적재하였다.

상기 일반적인 절차 외에, 배치 참조 DM5, GP5 b, D5 및 DM10 의 입자 크기를, 각각의 현탁액을 보르텍스 혼합기 (10 초) 로 혼합하고 약 5 분 동안 초음파 분쇄한, Tween 20 을 함유하는 수용액에서 재현탁 후에 측정하였다.

대안적으로는, Morphologi G2 (Malvern) 를 사용하는 광학 현미경에 의해 분말을 관찰하여 입자 형태학 및 환형 등가 직경을 사용하여 입자 크기 분포를 측정하였다. 입자 크기 결과는 수 평균 분포 및 파라미터 (D(n 0.9), D(n, 0.5) 및 D(n, 0.1), 입자 샘플 수의 90, 50 및 10% 가 상응하는 D 값 미만임을 의미함) 로서 및 부피 분포 및 파라미터 (D(v, 0.9), D(v, 0.5) 및 D(v, 0.1), 입자 샘플 부피의 90, 50 및 10% 가 상응하는 D 값 미만임을 의미함) 로서 마이크로미터로 표현된다.

단백질 물리 화학적 특성 분석 - 크기 배재 및 역상 크로마토그래피

분무-건조에 의해 수득된 GH 코어 마이크로입자 샘플을 크기 배재 크로마토그래피 (SEC) (단백질 함량 및 응집% 측정용) 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) (% 산화 및 탈아미노화 형태 측정용) 에 의해 분석하였다. RP-HPLC 의 경우, 45℃ 로 유지되는 C4 컬럼을 사용하여 본래 형태로부터 주요한 GH 화학적 분해 산물 (산화 및 탈아미노화 형태) 을 분리하였다. 220 nm 에서 단백질 피크를 모니터링하였다. 71% 50 mM Tris 완충액 및 29% 이소프로판올로 구성되는 용매로의 등용매 용리에 의해 컬럼으로부터 단백질을 용리하였다. 실온으로 유지되는 TSK 겔 G2000 SWXL 컬럼으로 SEC 분석을 수행하였다. 214 nm 에서 단백질 피크를 모니터링하였다. 97% v/v 63 mM 포스페이트 완충액 및 3% v/v 이소프로판올로 구성되는 용매로의 등용매 용리에 의해 컬럼으로부터 단백질을 용리하였다.

실시예 1: 분무화에 적합한 작업 조건 스크리닝 및 선별

주입구 온도 (℃)

단백질이 분무-건조 동안 노출되는 열 응력 및 기계적 응력이 단백질 분해를 일으킨다는 것은 잘 알려져 있다. 분무-건조 동안 적용되는 작업 조건은 분무-건조 공정 동안 단백질 안정성을 유지하는데 최적이었다. 주입구 온도 및 공급 물질 중의 단백질 농도는 GH 의 회수율 및 제조된 마이크로입자 중의 분해 산물의 수준에 대한 영향을 평가하기 위해 변화되었다. 여러 분말을 2 가지 농도 (20 mg/㎖ 및 10 mg/㎖) 로부터 시작하고 상이한 주입구 온도 (80℃, 9O℃, 120℃ 및 150℃) 를 설정하여 수득하였다. 분석을 위해, 분말을 포스페이트 완충 식염수 (PBS) pH 7.4 에 (1 mg/㎖ 의 이론적 농도까지) 용해하고 hGH 의 양 및 분말 중의 고분자량 성분 (HMWS) 의 존재를 검정하기 위해 SE-HPLC 로 분석하였다.

표 1 에는, SEC-HPLC 에 의한 hGH 의 회수율 및 온전성에 대한 결과가 요약되어 있다.

표 1: 분무-건조 분말로부터 수득되는 SEC - HPLC 결과

표 1 에 제시된 결과에 따르면, 순수 단백질의 분무-건조는 보호제를 이용하지 않는 경우 단백질 안정성에 대해 크게 영향을 미칠 수 있다. 공급물 중의 hGH 농도 및 사용되는 주입구 온도와 관계 없이 분무-건조 후에 40% 미만의 hGH 가 회수된다. 상기 낮은 회수율은, 재구성 후 잔류 백색 입자로서 눈에 보이는 큰 불용성 응집물의 형성과 관련이 있다.

높은 % 의 hGH HMWS 는 높은 주입구 온도에서 제조되는 분말에 대해 측정되었고, 고온에 대한 단백질의 노출에 의해 야기되는 열-유도 분해 위험을 확인시켜준다. 높은 주입구 온도를 사용하면 또한 낮은 습도 함량을 갖는 마이크로입자 생성이 선호될 수 있다 (표 1). 그러나, 낮은 주입구 온도를 갖는 이러한 코어 마이크로입자의 경우 수득되는 7 - 10 % 이하의 습도 함량은 허용가능하고, 단백질의 양호한 안정성과 일관된다.

실시예 2: 벌크제 및 계면활성제의 영향에 대한 연구

분무-건조 동안 hGH 의 분해를 방지하기 위한 부형제의 능력을 연구하기 위해, 계면활성제 (폴리소르베이트 20 및 폴록사머 188, 0.1 %) 를 첨가하거나 첨가하지 않고, 당 (트레할로오스, 수크로오스, 만니톨, 10 mg/㎖) 을 함유하는 몇 가지 용액을 분무-건조를 위해 제조하였다. hGH 농도를 2 mg/㎖ 로 설정하였다. 포스페이트 완충액 (pH 7.4) 에 계면활성제 및 벌크제를 용해한 후 천천히 혼합하면서 hGH 벌크를 첨가하여 용액을 제조하였다. 상기 용액을 120℃ 의 주입구 온도, 538 L/h 의 공기 유속, 5 ㎖/분의 용액 유속 및 38 ㎥/h 의 흡인기 속도로 분무화하였다. 분말 샘플을 hGH 회수율 및 순도 (SE-HPLC 에 의함) 에 대해 검정하고, 입자 크기 분포 (Mastersizer 2000 에 의함) 와 관련하여 특징을 분석하였다. 또한 계면활성제를 함유하는 제형을 비 분무-건조된 참조 hGH 물질과 비교하여 산화 및 탈아미드화된 형태 (RP-HPLC 에 의함) 의 % 증가에 대해 분석하였다.

분무-건조에 사용되는 조성물 및 수득된 제형의 분석 데이터 (회수율 및 % HMWS (SE-HPLC 에 의함)) 를 표 2 에 요약한다. 분석을 위해, 분말을 PBS pH 7.4 에 (1 mg/㎖ 의 이론적 농도까지) 용해하고 hGH 회수율 및 온전성에 대해 SE-HPLC 에 의해 검정하였다.

표 2: 벌크제 ( 카르보히드레이트 ) 농도 및 계면활성제 유형 및 농도의 함수로서의 분무-건조에 의해 수득되는 hGH 마이크로입자의 물리 화학적 특성 분석.

hGH 를 카르보히드레이트만으로 제형화하는 경우, 카르보히드레이트 농도와 관계 없이 낮은 회수율 (20% 내지 44%) 이 측정되었다. 이것은 재구성 후 백색 입자로서 눈에 보이고, 계면활성제가 사용되는 경우에는 존재하지 않는 큰 불용성 응집물의 형성과 관련이 있을 수 있다. 폴리소르베이트 20 또는 폴록사머 188 (0.1 중량%) 의 첨가는 계면활성제의 유형과 관계없이, 아마도 단백질의 계면 노출을 제한함으로써 회수율을 상당히 향상시키고, 분석 전 분말의 총 용해를 가능하게 한다.

또한 카르보히드레이트 및 계면활성제로 제형화된 hGH 를 RP-HPLC 에 의한 산화 및 탈아미드화 형태 % 에 대해 분석하였다. PBS (pH 7.4) 에 분말을 용해하여 2 mg/㎖ 의 이론적 농도를 수득하였다. 동시에, 비-분무-건조 hGH 벌크를 참조로서 시험하였다.

표 2 에서 제시된 수득된 결과는 hGH 의 산화 및 탈아미드화 형태 % 가 참조 비-분무-건조 벌크에 비해 분무화 샘플의 경우에는 증가하지 않았다는 것을 보여주었다.

실시예 3: 입자 크기 분포

표 2 에 기재된 분말의 입자 크기를 표 4 에 제시한다: 직경은 부피 분포 및 수 분포 모두로 표현한다.

분무-건조된 입자의 평균 직경은 수 분포로서 표현되는 경우 5 ㎛ 미만이며 분무된 분말이 세립질인 것을 나타낸다. 부피 분포는 더 큰 평균 직경을 나타내었고, 큰 응집물이 매우 적은 % 로 존재한다는 것을 나타낸다.

표 4: hGH 를 함유하는 분무-건조 분말의 입자 크기 분포

가압 유체 공정을 사용하는 마이크로입자의 코팅

도 1 에서 도식적으로 제시되는 SCF 장비를 사용하였다. 모든 실험에서, 하기 절차를 사용하였다:

- 혼합 셀 (1) 에 혼합물 입자/코팅제(들) (2) 를 넣고, 가압된 CO₂ 와 접촉시키고, 10 분 동안 혼합 조건에서 CO₂ 탱크 (4) 로부터 펌프하였다.

- 그 다음 상기 혼합물을 교반기 (3) 으로 1 시간 동안 진탕하였다. 본 단계 동안, 분쇄 조건은 배압 조절기 (8) 이 구비된 수집 용기 (7) 에서 설정되었다.

- 1 시간 후, 진탕을 멈추고 밸브를 열어 노즐 (6) 을 통한 분쇄를 시작하였다.

- 분쇄 종결시, 수집 용기 (7) 을 천천히 감압하였다; 샘플을 수집하고 체질하였다 (500 ㎛).

지질 마이크로캡슐 중 마이크로입자 5 % w/w 적재량 (payload) 으로 hGH-적재된 지질 마이크로입자의 8 가지 제형을 상기 가압 유체-기재 캡슐화 공정을 사용하여 제조하고 분석적으로 특징화하다 (hGH 물리 화학적 특징화, 시험관 내 hGH 방출 프로파일). 또한, 예비 공정 및 분석 평가를 위해 10 중량% 적재량 제형을 또한 제조하였다. 공정 파라미터 및 제형 데이터를 표 5 에 요약한다.

5 중량% 적재량으로 제조된 샘플은 입자 크기 분포, 양상 및 생산 수율에 있어 허용가능하다. 게다가, 10 중량% 적재량의 예비 제형은, 표적 투여량을 달성하는데 잠재적으로 필요한 이러한 고 적재량의 입자 제조가 실현가능하다는 것을 보여준다.

표 5: hGH -적재 지질 마이크로캡슐; 공정 작업 파라미터 및 제형 조성 (10 bar = 1.0 MPa )

- 분석 결과를 표 6 에 요약한다. 본 공정을 사용하여 제조된 hGH-적재 지질 마이크로캡슐은 매우 높은 단백질 회수율 (> 98 %) 을 보였고, 관련 단백질 분해 산물의 증가 (RP-HPLC 에 의함) 가 6 % 미만으로 유지되므로 본 공정에 의해 단백질 분해는 거의 유도되지 않았다.

표 6: hGH -적재 지질 마이크로캡슐; 분석 데이터

* 배치 1G5, 1GP5, 1G10 에 대한 참조.

** 배치 1P5, 2P5, 3P5, 4P5 에 대한 참조.

*** 배치 2G5, 3G5, 5P5 에 대한 참조.

표 7: hGH 적재 마이크로캡슐의 생산 수율 및 입자 크기 분포

부가하여, 상기 제형의 시험관 내 방출 특성을 또한 검증하였다. Gelucire^®-기재 제형에 대한 결과는 도 2a & 2b 에, Precirol^®-기재 제형에 대한 결과는 도 3 에, 그리고 Precirol^®/Gelucire^®-기재 제형에 대한 결과는 도 4 에 제시한다. 추가의 Precirol^®/Gelucire^®-기재 제형 및 Dynasan^®-기재 제형에 대한 결과는 도 6 에 제시한다.

Gelucire^®-기재 제형은 낮은 시험관 내 파열 방출 (약 20 ~ 30%) 및 서방성 프로파일을 나타낸다. Gelucire^® 50/02 제형의 2 가지 상이한 배치 (1G5 및 3G5) 의 시험관 내 방출 프로파일은 유사하고, 본 공정이 매우 재현가능성 있다는 결론을 낼 수 있게 한다. 10 중량% 적재량의 hGH 마이크로입자로 생성된 제형으로 또한 낮은 파열 방출이 발견되었다.

동일한 hGH 적재 (5%) 의 경우 시험관 내 파열이 Dynasan^®-기재 제형에서 추가로 감소되고, 이러한 낮은 파열이 향상된 서방성 프로파일과 연관된다는 것이 놀랄만하다.

동일한 hGH 적재 (5%) 의 경우, Precirol^®-기재 제형은 보다 높은 파열을 나타내었으나, 그 후 느린 방출 속도를 보였다. Precirol^® 제형의 2 가지 상이한 배치 (1P5 및 5P5) 의 시험관 내 방출 프로파일은 본 공정이 매우 일관된다는 결론을 낼 수 있게 한다.

분무-건조 미분화 hGH 입자로부터 시작하여, 낮은 시험관 내 파열 방출 및 시험관 내 서방성 프로파일을 나타내는 hGH-적재 주사가능 고체 지질 마이크로캡슐이 가압 유체 공정을 사용하여 제조될 수 있다는 것이 추가로 증명되었다. 이러한 제형이 임의의 hGH 변성 없이 (낮은 수준의 HMWS 및 관련 단백질-분해 산물 증가) 제조될 수 있다는 것을 보여주었다.

2 ~ 8℃ 및 25℃ 에서 질소 하에 3 ㎖ 유리 바이알에 채워진 hGH-적재 주사가능 지질 마이크로캡슐의 저장 안정성을 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 단백질 함량 및 단백질의 응집 수준 평가를 위해 SEC 에 의해 샘플을 분석하였고, 산화 및 탈아미드화 형태의 측정을 위해 RP-HPLC 분석을 실시하였다. 분석을 위해, 디클로로메탄을 사용하여 hGH 를 지질 마이크로입자로부터 추출하였다. 용매로 마이크로입자 내의 지질을 용해하고, 단백질을 침전시켰다. 단백질 침전물을 용매로 세정하고, 건조시킨 다음, 수성상으로 재구성 한 후 HPLC 분석을 실시하였다. 상기와 같이 크로마토그래피 분석을 수행하였다. 또한 샘플을 전량 분석에 의해 습도 함량에 대해 분석하였다. 시작 시간, 2 주, 1 개월 및 2 개월에 샘플을 추출하고 분석하였다. 표 8 및 9 의 결과는 본 공정에 의해 수득되는 지질 마이크로입자 내의 hGH 가 2 ~ 8℃ 및 25℃ 에서 2 개월 이상 안정하다는 것을 보여준다.

당업자는 더 이상의 정규적인 실험을 사용하지 않고도, 본원에 구체적으로 기재된 본 발명의 특정 구현예의 많은 동등한 내용들을 인지하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 동등한 내용은 하기 특허 청구 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

표 8: 2 ~ 8℃ 에서의 hGH 지질 마이크로캡슐의 안정성

표 9: 25℃ 에서의 hGH 지질 마이크로캡슐의 안정성

SEQUENCE LISTING <110> Merck Patent GmbH <120> Solid lipid microcapsules containing GH inner core microparticles <130> P07/137-lg/bs <140> PCT/EP2008/009849 <141> 2008-11-21 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> human growth hormone <400> 1 Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg 1 5 10 15 Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu 20 25 30 Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro 35 40 45 Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg 50 55 60 Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu 65 70 75 80 Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val 85 90 95 Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp 100 105 110 Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu 115 120 125 Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser 130 135 140 Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe 165 170 175 Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 180 185 190

Claims

성장 호르몬, 벌크제, 계면활성제를 적어도 함유하는 하나 이상의 내부 고체 코어 및 (2) 1 종 이상의 지질을 포함하는 외부 쉘을 포함하는 마이크로캡슐.
제 1 항에 있어서, 성장 호르몬이 인간 성장 호르몬 (hGH) 또는 인간 성장 호르몬의 생물학적 활성을 보유하는 이의 기능적 유도체, 절편, 변이체, 유사체, 또는 염인 마이크로캡슐.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 벌크제가 당 알코올, 당 및/또는 아미노 당인 마이크로캡슐.
제 3 항에 있어서, 당이 단당-, 이당- 또는 삼당류인 마이크로캡슐.
제 4 항에 있어서, 당이 수크로오스, 락토오스, 말토오스 또는 트레할로오스, 바람직하게는 수크로오스인 마이크로캡슐.
제 3 항에 있어서, 아미노 당이 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민 또는 뉴라민산인 마이크로캡슐.
제 3 항에 있어서, 당 알코올이 만니톨, 소르비톨, 둘시톨, 자일리톨 또는 리비톨, 바람직하게는 만니톨인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 계면활성제가 폴리소르베이트 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체인 마이크로캡슐.
제 8 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트 또는 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 지질의 융점이 약 40℃ 이상, 바람직하게는 45℃ 내지 80℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 48℃ 내지 75℃ 의 범위인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 지방 알코올, 지방산 에스테르, 폴리올 에스테르, 또는 하나 이상의 지방산과 하나 이상의 폴리올의 에스테르인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 폴리글리콜화 글리세라이드 및/또는 글리세롤과 지방산의 에스테르인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 폴리글리콜화 글리세라이드 Gelucire^® 50/02, 글리세릴(팔미토스테아레이트), 또는 이들의 블렌드인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 외부 쉘을 구성하는 상이 내부 코어에 대한 분산제를 함유하는 마이크로캡슐.
제 14 항에 있어서, 분산제가 인지질 또는 이의 유도체, 바람직하게는 대두 레시틴인 마이크로캡슐.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 외부 쉘이 또한 가소제를 함유하는 마이크로캡슐.
제 16 항에 있어서, 가소제가 폴록사머 (Poloxamer) 의 중쇄 트리글리세라이드인 마이크로캡슐.
분산 매질에 현탁되어 있는 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 마이크로캡슐을 포함하는 약학 제형.
사용 전 저장에 적합한 용기 내에, 멸균 조건하에서 밀봉 밀폐된 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 제형의 제시 형태.
(1) 성장 호르몬, 벌크제, 계면활성제를 포함하는 내부 코어 및 (2) 1 종 이상의 지질을 포함하는 외부 쉘을 포함하는 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 마이크로캡슐을 함유하는 용기 및 분산 매질이 있는 용기를 포함하는 키트.
내부 코어는 분무-건조 기술을 사용하여 제조하고, 외부 쉘은 가압 유체-기재 공정을 사용하여 제조하는 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 제형의 제조 방법.
제 21 항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 마이크로캡슐의 제조 방법:
(a) 성장 호르몬, 벌크제 및 계면활성제를 적어도 포함하는 수용액/분산액을 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a) 에서 제조된 수용액/분산액을 분무-건조하여 단백질-함유 마이크로입자를 제조하는 단계;
(c) 상기 단계 (b) 에서 수득된 마이크로입자를 수집하는 단계;
(d) 가압 유체가 지질상에 용해되는 압력 및 온도 조건 하에서, 가압 유체 내에 외부 쉘을 구성하는 상 및 상기 단계 (c) 에서 수득된 마이크로입자를 포함하는 균질 분산액을 제조하는 단계;
(e) 노즐을 통해 상기 단계 (d) 에서 제조된 분산액을 갑압하고 단계 (e) 에서 수득된 캡슐화 단백질 입자를 수집하는 단계.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 내부 코어는 분무-건조 기술을 사용하여 제조하고, 외부 쉘은 용해 및 분산 단계 동안 0.4 P_c 내지 3 P_c, 바람직하게는 0.5 P_c 내지 2 P_c, 더욱 바람직하게는 0.75 P_c 내지 1.5 P_c (P_c 는 유체의 임계압임) 의 범위에 포함되는 압력으로 가압된 유체를 사용하여 제조하는 마이크로캡슐의 제조 방법.
제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 가압 유체가 이산화탄소인 마이크로캡슐의 제조 방법.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 이산화탄소가 지질을 팽윤시켜 용해 및 분산 단계 (d) 동안 포화 용융물을 형성하는 방법.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 용해 및 분산 단계 (d) 동안의 온도가 30℃ 내지 70℃ 의 범위, 바람직하게는 35℃ 내지 65℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 약 60℃ 인 방법.
제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 용해 및 분산 단계 (d) 동안의 압력이 6.0 MPa 내지 11.0 MPa 의 범위, 바람직하게는 약 6 MPa 또는 10 MPa 에 근접하고, 후팽창 압력이 1.0 MPa 내지 5.5 MPa 의 범위, 바람직하게는 1.5 MPa 내지 3.5 MPa 의 범위, 더욱 바람직하게는 3.0 MPa 내지 5.0 MPa 의 범위인 방법.