JP5917248B2 - ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途 - Google Patents

ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP5917248B2
JP5917248B2 JP2012089507A JP2012089507A JP5917248B2 JP 5917248 B2 JP5917248 B2 JP 5917248B2 JP 2012089507 A JP2012089507 A JP 2012089507A JP 2012089507 A JP2012089507 A JP 2012089507A JP 5917248 B2 JP5917248 B2 JP 5917248B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
base
seq
probe
polymorphism
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2012089507A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2012249629A (ja
Inventor
亜希 井口
亜希 井口
光春 平井
光春 平井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arkray Inc
Original Assignee
Arkray Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arkray Inc filed Critical Arkray Inc
Priority to JP2012089507A priority Critical patent/JP5917248B2/ja
Priority to CN2012101501465A priority patent/CN102776277A/zh
Priority to US13/467,240 priority patent/US20120288859A1/en
Priority to KR1020120048994A priority patent/KR101392952B1/ko
Priority to EP12167373.5A priority patent/EP2522745B1/en
Publication of JP2012249629A publication Critical patent/JP2012249629A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5917248B2 publication Critical patent/JP5917248B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/44—Multiple drug resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Description

本発明は、ＨＧＦ（ｈｙｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：肝細胞増殖因子）遺伝子のプロモーター領域におけるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異の多型を検出するためのプローブ、およびその用途に関する。
乳癌は、***組織に発生する癌腫である。世界中でよく見られる癌であり、西側諸国では女性のおよそ１０％が一生涯の間に乳癌を罹患する機会を有する。また、乳癌女性患者のおよそ２０％がこの疾患で死亡する。そのため、癌腫の早期発見方法、および効果的な治療方法を達成すべく、膨大な労力が費やされている。
近年、乳癌の発症リスクが、ＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域における、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異に関連していることがわかった。具体的には、ＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が正常型の３０である場合と、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が短縮変異しており、例えば、２５またはそれ以下となっている場合とでは、乳癌の発症リスクが異なるということがわかった（非特許文献１）。
ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異検出方法の１例として、ダイレクトシークエンス法、および電気泳動で検出する方法がある。しかし、例えば、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が３０と２５以下の場合におけるＡのリピート数の違いを判別するには、ダイレクトシークエンス法では同じ塩基の連続配列を測定すると波形が乱れてしまい、正確な塩基配列がわかりにくい。また、電気泳動を用いても、数塩基、例えば、３０と２５以下との違いを判別するのは難しく、正常型であるか変異型であるかを正確に判断することは困難である。
一方、近年の遺伝子多型の検出方法では、融解曲線分析（Ｔｍ解析）を利用した検出方法が用いられている。これは、検出目的の遺伝子多型を含む検出標的配列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的１本鎖ＤＮＡと当該プローブとのハイブリッド（２本鎖ＤＮＡ）を形成させ、このハイブリッドに加熱処理を施して温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を吸光度または蛍光強度等のシグナル測定により検出し、この検出結果に基づいてＴｍ値（℃）を決定することによって目的多型の有無を判断する方法である。Ｔｍ値（℃）は、ハイブリッドの相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。このため、目的多型を含む検出標的配列とそれに相補的なプローブとのハイブリッドについて予めＴｍ値（℃）（評価基準値）を求めておき、検出試料の標的１本鎖ＤＮＡと当該プローブとのＴｍ値（℃）を測定し、当該測定値が評価基準値と同じであれば、パーフェクトマッチ、すなわち標的ＤＮＡに目的多型が存在すると判断でき、当該測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち標的ＤＮＡに目的多型が存在しないと判断できる。
なお、特許文献１には、以下に示すような、Ｅ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ−特異的補足プローブ、およびＥ．ｃｏｌｉ １６Ｓ ｒＲＮＡ−特異的検出補足プローブについて記載されている（配列番号１および配列番号２）。しかし、これらのプローブはＡを１４個までしか有していない。また、Ａがリピートとなっている部分が必ずプローブの配列の端に位置している。そのため、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が１５個以上の変異型の場合はもちろん、他の塩基に挟まれているＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域におけるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異を検出することはできない。
配列番号１
５’−ＧＣＣＡＧＣＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣＣＡＴＧＡＴＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’
配列番号２
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＧＡＧＴ−３’
特表２００７−５１０１５４号公報
Ｊｉｈｏｎｇ Ｍａ， ｅｔ ａｌ．、２００９、Ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ＨＧＦ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃａｕｓｅｓ ｉｔｓ ａｂｅｒｒａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ １１９ Ｎｕｍｂｅｒ３．、４７８−４９１
本発明は、ＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を正確に判別することができる多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを用いるＨＧＦ遺伝子の多型検出方法、当該多型検出方法を利用する薬剤の評価方法、および、当該多型検出用プローブを含むＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットを提供することを目的とする。
本発明者らは、ＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を判別することができる多型検出用プローブを設計し、当該多型検出用プローブを用いるＴｍ解析を行うことにより、当該ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異の多型をより正確に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は以下のとおりである。
〈１〉 融解曲線分析によりＨＧＦ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであって、配列番号５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号１５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、および配列番号１６に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドより選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、多型検出用プローブ。
〈２〉 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする、〈１〉に記載の多型検出用プローブ。
〈３〉 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする、〈２〉に記載の多型検出用プローブ。
〈４〉 〈１〉ないし〈３〉のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを用いることを特徴とする、ＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
〈５〉 （Ｉ）〈１〉ないし〈３〉のいずれか１つに記載の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッドを得る工程と、
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程と、
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価する工程と、
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＨＧＦ遺伝子における、多型の存在を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、〈４〉に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
〈６〉 さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前、または、前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅する工程を含むことを特徴とする、〈５〉に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
〈７〉 〈１〉ないし〈３〉のいずれか１つに記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット。
〈８〉 配列番号５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号１５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、または配列番号１６に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする、〈７〉に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット。
本発明の多型検出用プローブによれば、検出標的配列のＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を数塩基単位でも正確に判別することができ、さらに、正常型と変異型とが共存している場合でもｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数を判別することができる。また、当該多型検出用プローブを利用する本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法でも同様である。
実施例１に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。 実施例２に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。 実施例３に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。 比較例に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。 実施例４に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。
本発明において、検出する目的の多型とは、基本的に、ＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を意味する。本発明におけるＨＧＦ遺伝子の詳細についてはＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）アクセッションＮｏ．ＮＴ＿００７９３３．１５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ７ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｎｔｉｇ， ＧＲＣｈ３７．ｐ２ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｉｍａｒｙ ａｓｓｅｍｂｌｙ）に部分配列として登録されている。本発明における「塩基番号」とは、当該部分配列である、配列番号３に示す塩基配列の、５’末端から３’末端方向に数えた当該塩基の番号、すなわち塩基番号１〜塩基番号２４９を意味している。なお、当該塩基番号１〜塩基番号２４９の塩基配列は、前述のアクセッションＮｏ．ＮＴ＿００７９３３．１５に登録されている７７４１２２２０ｂｐの全塩基配列の１９４３８６１番目の塩基〜１９４３３１０１番目の塩基の部分配列に対応している。
ヒトのＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数は、正常型であれば３０（３１）であるが、変異型であれば０（１）〜２９（３０）となっている。本発明における「ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異」とはこのような変異型となっている場合を意味する。本発明のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数において、例えば３０（３１）と示す場合、「３０」は配列番号３の塩基配列に示す、ＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数である塩基番号１０２〜１３１のＴ（またはＴに相補的なＡ）の数を意味し、「（３１）」は配列番号３に示す塩基配列において、前述のプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔの５’末端側に連なっているＴも合わせた塩基番号１０１〜１３１のＴ（またはＴに相補的なＡ）の数を意味する。
本発明において、検出対象となる試料中の１本鎖核酸、多型検出用プローブまたはプライマーの個々の配列に対して、これらの配列の相補的な関係に基づく事項は、特に断らない限り、それぞれの配列と、当該それぞれの配列に対して相補的な配列とについても適用される。各配列に対して相補的な配列について、本発明の事項を適用する際には、当該相補的な配列が認識する配列は、対応する本明細書に記載された配列に相補的な配列に、本明細書全体を読み替えるものとする。当該適用は、当業者にとっての技術常識の範囲内で読み替えるものである。
本発明において、「Ｔｍ値」とは、２本鎖核酸が解離する温度（解離温度：Ｔｍ）であって、一般に、２６０ｎｍにおける吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。例えば、２本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、２本鎖ＤＮＡにおける両鎖間での水素結合が加熱によってほどけ、１本鎖ＤＮＡに解離すること（ＤＮＡの融解）が原因である。そして、全ての２本鎖ＤＮＡが解離して１本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱時間開始時の吸光度（２本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示す。これにより、融解が完了したことが判断できる。Ｔｍ値は、この現象に基づき設定される。本発明におけるＴｍ値は、特に断らない限り、吸光度が吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度を言う。
本発明において、「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。また、本発明において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。本発明において、オリゴヌクレオチドの配列に関して「３’末端から数えて１〜３番目」という場合は、オリゴヌクレオチド鎖の３'末端を１番目として数える。
本発明における「標的配列」とは、多型（ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異）を検出するために当該プローブがハイブリダイズする核酸配列を意味する。以下に、本発明に係る多型検出用プローブについて説明する。なお、本発明における「含む」および「有する」は、「からなる」および「から構成される」との意も含むものとする。本発明における「少なくとも８０％以上の同一性」とは、検出感度の観点より、８５％以上の同一性、９０％以上の同一性、９５％以上の同一性、９６％以上の同一性、９７％以上の同一性、９８％以上の同一性または９９％以上の同一性を示してもよい。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
本発明における「ストリンジェントな条件下」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。典型的なストリンジェントな条件下とは、カリウム濃度が約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、およびマグネシウム濃度が約１．０ｍＭ〜約５．０ｍＭ中において、ハイブリダイゼーションを行う条件が挙げられる。詳細な１例として、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２５ｍＭのＫＣｌ、および１．５ｍＭのＭｇＣｌ２中において行う条件が挙げられる。その他、ストリンジェントな条件としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ， ２００１）に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。当業者は、ハイブリダイゼーション反応や、ハイブリダイゼーション反応液の塩濃度等を変化させることによって、このような条件を容易に選択することができる。
〈多型検出用プローブ〉
本発明の多型検出用プローブは、ＨＧＦ遺伝子の多型を検出するためのプローブであって、下記（Ｐ１−１）、（Ｐ１−２）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ１’−２）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２−２）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ２’−２）、（Ｐ３−１）、（Ｐ３−２）、（Ｐ３’−１）および（Ｐ３’−２）のいずれかから選択される、少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする。
（Ｐ１−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９５〜１００および塩基番号１３２と、前記塩基番号９５〜１００の３’末端と前記塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜９４塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９５に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号９５に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ１−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９５〜１００および塩基番号１３２と、前記塩基番号９５〜１００の３’末端と前記塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜９４塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９５に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号９５に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ１’−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９５〜１００と、前記塩基番号９５〜１００の３’末端と塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む７〜５５塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９５に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号９５に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ１’−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９５〜１００と、前記塩基番号９５〜１００の３’末端と塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む７〜５５塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９５に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号９５に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ２−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９２〜１００および塩基番号１３２と、前記塩基番号９２〜１００の３’末端と前記塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む１１〜９４塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９２に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号９２に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ２−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９２〜１００および塩基番号１３２と、前記塩基番号９２〜１００の３’末端と前記塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む１１〜９４塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９２に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号９２に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ２’−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９２〜１００と、前記塩基番号９２〜１００の３’末端と塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む１０〜５５塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９２に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号９２に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ２’−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号９２〜１００と、前記塩基番号９２〜１００の３’末端と塩基番号１３２との間に挟まれる１〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む１０〜５５塩基の塩基配列に相補的な塩基配列であり、塩基番号９２に対応する塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号９２に対応する塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ３−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号１００および塩基番号１３２〜１３４と、前記塩基番号１００と前記塩基番号１３２〜１３４の５’末端との間に挟まれる４〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜１２０塩基の塩基配列であり、塩基番号１３４の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号１３４の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ３−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号１００および塩基番号１３２〜１３４と、前記塩基番号１００と前記塩基番号１３２〜１３４の５’末端との間に挟まれる４〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜１２０塩基の塩基配列であり、塩基番号１３４の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号１３４の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ３’−１）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号１３２〜１３４と、塩基番号１００と前記塩基番号１３２〜１３４の５’末端との間に挟まれる５〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜５６塩基の塩基配列であり、塩基番号１３４の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３の塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有し、前記塩基番号１３４の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド；
（Ｐ３’−２）配列番号３に示す塩基配列の塩基番号１３２〜１３４と、塩基番号１００と前記塩基番号１３２〜１３４の５’末端との間に挟まれる５〜３１塩基のいずれかの個数の連続するＴからなる塩基配列と、を含む８〜５６塩基の塩基配列であり、塩基番号１３４の塩基がシトシンであるという条件で、配列番号３に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記塩基番号１３４の塩基が蛍光色素で標識されている、蛍光標識オリゴヌクレオチド。
本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、相補鎖にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補鎖にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少（消光）するかまたは増加する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。その中でも相補鎖にハイブリダイズしていないときの蛍光強度に比べて、相補鎖にハイブリダイズしているときの蛍光強度が減少する蛍光標識オリゴヌクレオチドとすることができる。
このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般的に、グアニン消光プローブと呼ばれており、いわゆるＱ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。中でも、３’末端もしくは５’末端がシトシン（Ｃ）となるように設計され、その末端のＣがグアニン（Ｇ）に近づくと発光が弱くなるように蛍光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドが挙げられる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
なお、Ｑ Ｐｒｏｂｅ（登録商標）を用いた検出方法以外にも、公知の検出様式を適用してもよい。このような検出様式としては、Ｔａｑ−ｍａｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ法、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｅａｃｏｎ法またはＭＧＢ Ｐｒｏｂｅ法等を挙げることができる。
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミンまたはポリメチン色素誘導体等が挙げられる。これらの蛍光色素の市販品としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ＦＡＭ、Ｃｙ３およびＣｙ５、ＴＡＭＲＡ等が挙げられる。
蛍光標識オリゴヌクレオチドの検出条件は特に制限されず、使用する蛍光色素により適宜決定できる。例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅは、検出波長４４５ｎｍ〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５ｎｍ〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬは、検出波長５２０ｎｍ〜５５５ｎｍで検出できる。このような蛍光色素を有するプローブを使用すれば、それぞれの蛍光シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合は、通常の方法、例えば特開２００２−１１９２９１号公報等に記載の方法に従って行うことができる。なお、蛍光標識オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値と、１塩基のみが非相補的な塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズした場合のＴｍ値との差は、例えば２．０℃以上、３．０℃以上、５．０℃以上または７．０℃以上等が挙げられる。
また、本発明の多型検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、標的配列は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法等の遺伝子増幅法によって調製することもできる。この際、本発明の多型検出用プローブを遺伝子増幅反応の反応液中に共存させることができる。このような場合に、多型検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、当該多型検出用プローブ自体が遺伝子増幅反応によって伸長することを充分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識化物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。以下に、本発明の多型検出用プローブから代表して、（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）および（Ｐ３’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドについて詳細に述べる。なお、（Ｐ１−２）は（Ｐ１−１）に、（Ｐ１’−２）は（Ｐ１’−１）に、（Ｐ２−２）は（Ｐ２−１）に、（Ｐ２’−２）は（Ｐ２’−１）に、（Ｐ３−２）は（Ｐ３−１）に、（Ｐ３’−２）は（Ｐ３’−１）に類似した塩基配列の蛍光標識オリゴヌクレオチドであるため、特徴は同様とし、詳細は割愛する。
まず、前記（Ｐ１−１）および前記（Ｐ１’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号９５に対応する塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号９５となる塩基「Ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「Ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ１−１）および（Ｐ１’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有しているが、当該同一性は、塩基番号９５に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。（Ｐ１−１）および（Ｐ１’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素で標識されるＣの部位は、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも３’末端である必要はないが、このＣが３’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが挙げられ、このＣが３’末端に存在することで、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。当該（Ｐ１−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、２７〜５７塩基長、３２〜５２塩基長、３７〜４７塩基長としうる。また、当該（Ｐ１’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、２２〜５２塩基長、２７〜４７塩基長、３２〜４２塩基長としうる。
例えば、具体的な（Ｐ１−１）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。（Ｐ１’−１）の場合は、以下に示すような（Ｐ１−１）とは異なり、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔとなっている部分の配列の３’末端のみに、他の種類の塩基を含む塩基配列が付属している状態となっている。
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、４６ｍｅｒ、配列番号４
５’−ＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、４２ｍｅｒ、配列番号５
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数０（１）、１２ｍｅｒ、配列番号６
５’−ＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＣ−（蛍光標識）−３’
次に、前記（Ｐ２−１）および前記（Ｐ２’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号９２に対応する塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号９２となる塩基「Ｇ（グアニン）」に対応する相補塩基「Ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ２−１）および（Ｐ２’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有しているが、当該同一性は、塩基番号９２に対応する塩基がシトシンであるということが条件となっている。このＣは、下記の具体的なバリエーションのように、必ずしも３’末端である必要はないが、３’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが挙げられ、このＣが３’末端に存在することで、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。当該（Ｐ２−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、３２〜６２塩基長、３７〜５７塩基長、４２〜５２塩基長としうる。また、当該（Ｐ２’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、２２〜５２塩基長、２７〜４７塩基長、３２〜４２塩基長としうる。
例えば、具体的な（Ｐ２−１）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。（Ｐ２’−１）の場合は、以下に示すような（Ｐ２−１）とは異なり、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔとなっている部分の配列の３’末端のみに他の種類の塩基を含む塩基配列が付属している状態となっている。
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、４６ｍｅｒ、配列番号７
５’−ＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、４２ｍｅｒ、配列番号８
５’−ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数０（１）、１１ｍｅｒ、配列番号９
５’−ＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−（蛍光標識）−３’
最後に、前記（Ｐ３−１）および前記（Ｐ３’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの「塩基番号１３４の塩基」とは、配列番号３に示す塩基配列において塩基番号１３４となる塩基「Ｃ（シトシン）」を意味する。すなわち、（Ｐ３−１）および（Ｐ３’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有しているが、当該同一性は、塩基番号１３４の塩基がシトシンであるということが条件となっている。このＣは、下記の具体的なバリエーションのように必ずしも３’末端である必要はないが、このＣが３’末端から数えて１〜３番目の位置に有することが挙げられ、このＣが３’末端に存在することで、例えば検出感度が高くなる等の傾向がある。当該（Ｐ３−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、３０〜６０塩基長、３５〜５５塩基長、４０〜５０塩基長としうる。また、当該（Ｐ３’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドの長さは、１９〜４９塩基長、２４〜４４塩基長、２９〜３９塩基長としうる。
例えば、具体的な（Ｐ３−１）のバリエーションとして、以下のような蛍光標識オリゴヌクレオチドが挙げられる。（Ｐ３’−１）の場合は、以下に示すような（Ｐ３−１）とは異なり、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔとなっている部分の配列の３’末端のみに他の種類の塩基を含む塩基配列が付属している状態となっている。
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、４６ｍｅｒ、配列番号１０
５’−ＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）、３６ｍｅｒ、配列番号１１
５’−ＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−（蛍光標識）−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数２（３）、８ｍｅｒ、配列番号１２
５’−ＧＣＴＴＴＣＡＣ−（蛍光標識）−３’
このような（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）または（Ｐ３’−１）（特徴が類似する（Ｐ１−２）、（Ｐ１’−２）、（Ｐ２−２）、（Ｐ２’−２）、（Ｐ３−２）または（Ｐ３’−２）についても含む）の蛍光標識オリゴヌクレオチドのような本発明に係る多型検出用プローブは、ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異の検出に利用することができる。検出方法は、何ら限定されず、標的配列とこれらの多型検出用プローブとのハイブリダイズを利用する方法であればよい。例えば、（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）または（Ｐ３’−１）のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）の多型検出用プローブ（正常型プローブ）のみを用い、ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ変異を検出することも可能である。また、（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）または（Ｐ３’−１）のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数３０（３１）以外の種々のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の多型検出用プローブ（変異型プローブ）を用い、ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を検出することも可能である。また、本発明の多型検出用プローブは、融解曲線分析用のプローブであることを特徴とする。このような融解曲線分析による方法も含め、ＨＧＦ遺伝子の多型検出方法の詳細について以下に述べる。
〈ＨＧＦ遺伝子の多型検出方法〉
本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法（ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異の検出方法）は、前述した多型検出用プローブを使用することを特徴とする。すなわち、本発明の多型検出方法は、前述した本発明の多型検出用プローブを使用することが特徴であって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
本発明の多型検出方法は、例えば、下記工程（Ｉ）、工程（ＩＩ）、工程（ＩＩＩ）および工程（ＩＶ）を含む。
（Ｉ）前記多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび１本鎖核酸のハイブリッドを得る工程。
（ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程。
（ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価する工程。
（ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＨＧＦ遺伝子における、多型の存在を検出する工程。
なお、上記工程（ＩＩＩ）において、Ｔｍ値を評価するとは、Ｔｍ値での温度を評価する（決定する）ことだけでもよいし、Ｔｍ解析でのピークの高さ、すなわち単位時間当たりの蛍光強度の変化量のピークを評価する（決定する）ことを含んでも構わない。当該ピークの高さを評価することより、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を有する塩基配列の存在比を確認することができる。
より具体的に説明すると、例えば、正常型プローブのみを使用してこのような多型検出法を行う場合、予め正常型１本鎖核酸を用いた場合によるＴｍ値を測定しておく。正常型１本鎖核酸は、例えば、全血等からゲノムＤＮＡを市販のゲノムＤＮＡ単離キットを用いて単離して使用する。その後、当該正常型のＴｍ値と、試料のＴｍ値とを比較することによって、試料のＨＧＦ遺伝子がｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を有しているか否かを評価することができる。すなわち、Ｔｍ値が正常型の場合と全く同じ値となった場合、試料のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔは正常型プローブとパーフェクトマッチとなっていることが判断される。しかし、Ｔｍ値が正常型よりも小さい場合には、試料の１本鎖核酸と正常型プローブとの解離温度が低いことを意味しているため、この場合には、試料の１本鎖核酸のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が正常型の３０（３１）よりも少なくなっているということがわかる。
また、正常型プローブでなくとも、０（１）〜２９（３０）のいずれかのｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異型プローブであってもこのような方法を用い、パーフェクトマッチかミスマッチかを評価し、試料のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を正確に検出することができる。また、このような種々の多型検出用プローブは、少なくとも１種類を使用すればよく、２種類以上を併用しても構わない。２種類以上の多型検出用プローブを併用し、単位時間当たりの蛍光強度の変化量（蛍光シグナル）のピークを評価することによって、それぞれの多型検出用プローブにパーフェクトマッチするｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の標的配列の存在比を一度に評価することができる。反応系における本発明の多型検出用プローブの添加濃度は、特に制限されないが、例えば、１種類の多型検出用プローブにつき、１０〜１０００ｎｍｏｌ／Ｌ、または２０〜５００ｎｍｏｌ／Ｌが挙げられる。
本発明に係るＨＧＦ遺伝子の多型検出方法では、前述した（Ｉ）のハイブリッドを得る前、または、ハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅する工程を含んでもよい。核酸の増幅法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、または、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等が挙げられる。この中でも、ＰＣＲ法がよい。
核酸の増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。鋳型とする核酸からの増幅産物の生成には、例えば、当該検出目的のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を含む配列を増幅するためのプライマーを使用することが挙げられる。当該プライマーの増幅領域は、特に制限されず検出目的のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異に応じて適宜設定できる。例えば、前述の（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）または（Ｐ３’−１）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域が挙げられる。また、当該プライマーの配列は、特に制限されず、例えば、検出目的のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異の配列を増幅できればよく、当該検出配列およびその周辺配列等に応じて従来公知の方法により適宜設定できる。さらに、当該プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さに設定可能であり、例えば１０〜５０塩基長が挙げられる。
このようなプライマーとしては、例えば、センス鎖を増幅するフォワードプライマー（Ｆプライマー）およびアンチセンス鎖を増幅するリバースプライマー（Ｒプライマー）のいずれか一方を使用できるが、両者を一対とするプライマーセットを使用することが挙げられる。当該プライマーを使用する反応系において、プライマーの添加濃度は、特に制限されないが、例えば、１種類のプライマーについて０．１〜４μｍｏｌ／Ｌ、０．２５〜１．５μｍｏｌ／Ｌ、０．５〜１μｍｏｌ／Ｌが挙げられる。また、ＦプライマーとＲプライマーとを使用する場合、ＦプライマーとＲプライマーとの添加割合は、特に制限されないが、例えば、モル比でのＦプライマー：Ｒプライマーで、１：０．１〜１：１０、または１：０．５〜１：５が挙げられる。
本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法を適用する試料としては、特に制限されないが、生体試料があげられる。当該生体試料の具体例としては、例えば、全血、白血球細胞等の血球、骨髄、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪もしくは毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、または、胃洗浄液等が挙げられる。本発明において、当該試料の採取方法、および当該試料からの被検核酸の調製方法等は制限されず、従来公知の方法を採用できる。当該生体試料が全血の場合、本発明の反応系における当該全血の濃度は、例えば、０．０１〜２体積％、０．０５〜１．５体積％、または０．１〜１体積％が挙げられる。また、当該生体試料が血清の場合、本発明の反応系における当該血清の濃度は、例えば、０．１〜２０体積％、０．２５〜１５体積％、または０．５〜１０体積％が挙げられる。
〈薬剤の評価方法〉
本発明の薬剤の評価方法は、前述のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法を利用することにより、ＨＧＦ遺伝子に関連する疾患に利用できる薬剤の耐性または薬効を評価することを特徴とする。すなわち、本発明の薬剤の評価方法は、前述のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法を用いて評価することに特徴があり、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。
本発明の薬剤の評価方法は、例えば、下記工程（Ｉ）および工程（ＩＩ）を含む。
（Ｉ）前述のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法により、ＨＧＦ遺伝子における多型を検出する工程。
（ＩＩ）検出された多型の有無に基づいて、薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を評価する工程。
具体的な詳細は、前述のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法と同様である。（ＩＩ）における、検出された多型の有無に基づく薬剤に対する耐性または薬剤の薬効の評価とは、例えば、乳癌等の薬剤に対する耐性または薬剤の薬効を、変異型と正常型との存在比、または有無等に基づき評価を行うことを意味する。このような薬剤の評価方法は、薬剤の投与量の増減、または他の治療薬への変更等の当該ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異が原因となる疾患の治療方針を決定するのに有用である。
〈ＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット〉
本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことを特徴とする。すなわち、本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットは、前述の多型検出用プローブを含むことに特徴があって、その他の構成または条件等は、以下の記載に制限されない。なお、前述の多型検出用プローブの（Ｐ１−１）、（Ｐ１’−１）、（Ｐ２−１）、（Ｐ２’−１）、（Ｐ３−１）または（Ｐ３’−１）（特徴が類似する（Ｐ１−２）、（Ｐ１’−２）、（Ｐ２−２）、（Ｐ２’−２）、（Ｐ３−２）または（Ｐ３’−２）についても含む）の蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする塩基配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含まれていてもよい。
本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットの１例について述べる。例えば、本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットは、ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異の検出に使用する試薬キットである。試薬キットにおいて、前述の多型検出用プローブは、１種類でもよいし２種類以上であっても構わない。後者の場合、２種類以上の多型検出用プローブは、混合された状態で含まれてもよいし、別個の試薬として含まれていてもよい。また、２種類以上の本発明の多型検出用プローブが混合された状態で、本発明のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キットに含まれる場合、または、別個の試薬として含まれているが、例えば、使用時に同じ反応系で各多型検出用プローブと各標的配列とのＴｍ解離分析を行う場合、各多型検出用プローブは、異なる蛍光色素で標識化されているとよい。このように蛍光色素の種類を変えることで、同じ反応系であっても、それぞれの多型検出用プローブについての検出が可能になる。前記蛍光色素としては、例えば、検出波長が異なる物質であるものが挙げられる。
前述のように、近年、ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異は、乳癌の発症リスクと関連すると言われている。そこで、本発明の多型検出用プローブ、ＨＧＦ遺伝子の多型検出方法およびＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット等によれば、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の数塩基単位の変異を正確に検出することができるため、乳癌の発症リスクを予め検査することが可能となり、乳癌の早期発見等に繋げることができる可能性が高い。
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
ＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域の部分配列である１９４３２９６１番目の塩基から１９４３２９９１番目の塩基までのｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を、本発明の多型検出用プローブを使用し評価した実施例について、以下に述べる。
（実施例１）
実施例１では、本発明の多型検出用プローブを利用し、ＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域におけるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異について、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ（ＩＳ−５３１０）、アークレイ社製）を用いＴｍ解析を行った。ｉ−ｄｅｎｓｙ（ＩＳ−５３１０）に添加するプローブ等の溶液、試薬の処方は下記の表の通りである。
Figure 0005917248
上記表１におけるプローブとは、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブ（正常型検出用プローブ）であり、配列を下記に示す。
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブ、配列番号５、３０（３１）
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブは、上記配列の３’末端のＣにＴｍ解析のための蛍光色素として、ＴＡＭＲＡを用いた。
上記配列の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブとハイブリッドを形成する相補鎖を、本実施例１では２種類使用した。また、これら２種類の相補鎖を各々０．１μＭずつ用いたものについても実験を行った。各々の配列は、下記に示す。
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ３０−６０、配列番号１３、３０（３１）
５’−ｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａ−３’
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ２５−６０、配列番号１４、２５（２６）
５’−ｇｇｇｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａｃｔ−３’
このような反応液を、それぞれｉ−ｄｅｎｓｙ（ＩＳ−５３１０）に添加し、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長（５８５〜７００ｎｍ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
図１は、実施例１に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図１において、３０Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｒ−Ａ３０−６０を用いた結果であり、２５Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｒ−Ａ２５−６０を用いた結果であり、３０Ａ／２５Ａは各々０．１μＭの相補鎖を用いたＴｍ解析の結果である。３０Ａに示す通り、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が３０（３１）である場合（正常型である場合）、ピークが６５℃になっており、融解温度Ｔｍ値が高くなっている。また、２５Ａでは、正常型よりもｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔが数塩基程度しか少なくなっていないにもかかわらず、ピークは６１℃になっており、３０Ａと比較するとそれぞれを区別できる程度に融解温度Ｔｍ値が下がっている。さらに、各々０．１μＭを用いた３０Ａ／２５Ａでは、両方の融解温度Ｔｍ値において、ピークを有していることがわかる。
（実施例２）
実施例２では、前述の実施例１で用いた本発明の多型検出用プローブとは異なる本発明の多型検出用プローブを用い、Ｔｍ解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については、前述の実施例１と同様である。
本実施例２では、実施例１の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブの代わりに、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブを用いた。３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブの配列を下記に示す。
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブ、配列番号１５、３０（３１）
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
このように、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブは、実施例１と同様に、上記配列の３’末端のＣにＴｍ解析のための蛍光色素として、ＴＡＭＲＡを用いた。
上記配列の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブとハイブリッドを形成する相補鎖を、本実施例２でも２種類および各々０．１μＭのものについて使用したが、これは下記の配列に示す通り、実施例１と同様である。
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ３０−６０、配列番号１３、３０（３１）
５’−ｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａ−３’
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ２５−６０、配列番号１４、２５（２６）
５’−ｇｇｇｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａｃｔ−３’
このような反応液について、実施例１と同様の方法でＴｍ解析を行った。
図２は、実施例２に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ３プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図２において、３０Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ３０−６０を用いた結果であり、２５Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ２５−６０を用いた結果であり、３０Ａ／２５Ａは各々０．１μＭの相補鎖を用いたＴｍ解析の結果である。３０Ａに示す通り、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が３０（３１）である場合（正常型である場合）、ピークが７１℃になっていた。２５Ａでは、実施例１の結果よりも大きく差がでることはなかったが、ピークは６８℃になっており、減少していた。しかしながら、各々を０．１μＭずつ用いた３０Ａ／２５Ａは、各々の温度のピークにあまり大きな差がなかったためか、明確な２つのピークを検出できなかった。
（実施例３）
実施例３でも、前述の実施例１および実施例２で用いたプローブとは異なる本発明の多型検出用プローブを用い、Ｔｍ解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については、前述の実施例１と同様である。
本実施例３では、実施例１の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ１プローブの代わりに、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブを用いた。３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブの配列を下記に示す。
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブ、配列番号１６、３０（３１）
５’−ｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
このように、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブは、実施例１と同様に、上記配列の３’末端のｃにＴｍ解析のための蛍光色素として、ＴＡＭＲＡを用いた。
上記配列の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブとハイブリッドを形成する相補鎖を、本実施例３でも２種類使用した。また、これら２種類の相補鎖が各々０．１μＭずつ用いたものについても実験を行った。各々の配列は、下記に示す。
ＨＧＦ−Ｆ−Ａ３０−６０、配列番号１７、３０（３１）
５’−ＴＴＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧ−３’
ＨＧＦ−Ｆ−Ａ２５−６０、配列番号１８、２５（２６）
５’−ＡＧＴＴＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣ−３’
このような反応液について、実施例１と同様の方法でＴｍ解析を行った。
図３は、実施例３に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図３において、３０Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ３０−６０を用いた結果であり、２５Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ２５−６０を用いた結果であり、３０Ａ／２５Ａは各々の相補鎖を０．１μＭずつ用いたＴｍ解析の結果である。まず、３０Ａに示す通り、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が３０（３１）である場合（正常型である場合）、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１を使用すると、ピークが６２℃になった。また、２５Ａでは、実施例１の結果と同様に、正常型よりもｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数が数塩基減少しているので、ピークは５６℃になっており、３０ＡのＴｍ値と比較すると大きく差が開いていた。各々を０．１μＭずつ用いた３０Ａ／２５Ａでも同様に、各々の温度のピークを判別することが可能であった。
（比較例）
比較例では、本発明の多型検出用プローブとは異なるプローブを用い、Ｔｍ解析を行った。実験プロトコルおよび試薬等の配合については前述の実施例１と同様である。
本比較例では、実施例１での本発明に係る多型検出用プローブの代わりに、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブを用いた。３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブの配列を下記に示す。
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブ、配列番号１９、３０（３１）
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
このように、３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブでも、実施例１と同様に、上記配列の３’末端のＣにＴｍ解析のための蛍光色素として、ＴＡＭＲＡを用いた。
上記配列の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブとハイブリッドを形成する相補鎖を、本比較例でも２種類および各々０．１μＭのものについて使用したが、これは下記の配列に示す通り実施例１および実施例２と同様である。
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ３０−６０、配列番号１３、３０（３１）
５’−ｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａ−３’
ＨＧＦ−Ｒ−Ａ２５−６０、配列番号１４、２５（２６）
５’−ｇｇｇｃｔｃａｇａｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃａａａｃｔｇｃｃａａａｃｔ−３’
このような反応液について、実施例１と同様の方法でＴｍ解析を行った。
図４は、比較例に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｆ２プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図４において、３０Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ３０−６０を用いた結果であり、２５Ａは０．２μＭの相補鎖ＨＧＦ−Ｆ−Ａ２５−６０を用いた結果であり、３０Ａ／２５Ａは各々の相補鎖を０．１μＭずつ用いたＴｍ解析の結果である。図４に示す通り、本比較例では３０Ａ、２５Ａおよび３０Ａ／２５Ａのいずれの場合においてもピーク、すなわちＴｍ値を検出することができなかった。
実施例１ないし実施例３の結果から、ＨＧＦ遺伝子のプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数の変異を正確に判別するためには、当該ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔの配列の周辺の「Ｃ」の位置を基準に、蛍光標識を用いたＴｍ解析を行い、蛍光標識のシグナルのピーク値の温度を評価することにより、変異が判別可能であることがわかった。しかし、比較例の結果から、蛍光標識の基準となるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔの配列の周辺の「Ｃ」の位置は、限定されていることも確認された。すなわち、実施例１では配列番号３の塩基番号９５のＧの相補塩基の「Ｃ」、実施例２では配列番号３の塩基番号９２のＧの相補塩基の「Ｃ」、実施例３では配列番号３の塩基番号１３４の「Ｃ」に蛍光標識することによって、ＨＧＦ遺伝子プロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を分析することが可能であることがわかった。
（実施例４）
実施例４では、ＰＣＲの工程を間に入れ、ＨＧＦ遺伝子におけるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ変異について、Ｔｍ解析を行った。ＰＣＲおよびＴｍ解析を行うための装置は、前述の実施例１、実施例２および実施例３と同様の、ｉ−ｄｅｎｓｙ（ＩＳ−５３１０）を使用した。添加するプローブ等の溶液・試薬の組成を下記の表の通りである。
Figure 0005917248
上記表２におけるＨＧＦ−ＫＫＤ−ＦおよびＨＧＦ−ＫＫＤ−Ｒはプライマーであり、配列を下記に示す。
ＨＧＦ−ＫＫＤ−Ｆ、配列番号２０、３２ｍｅｒ、Ｔｍ＝６３．６℃
５’−ＧＧＧＡＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＴＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧ−３’
ＨＧＦ−ＫＫＤ−Ｒ、配列番号２１、２８ｍｅｒ、Ｔｍ＝６１．４℃
５’−ｇｇｇｔｇｔｇｇｔａｔｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａａａｔａａｇ−３’
また、上記表２におけるプローブとは、前述の実施例３と同様の３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブであり、配列を下記に示す。
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブ、配列番号１６、３０（３１）
５’−ｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−（ＴＡＭＲＡ）−３’
３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブは、上記配列の３’末端のｃにＴｍ解析のための蛍光色素として、前述と同様にＴＡＭＲＡを用いた。
テンプレートには、３種類のプラスミド（全て、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ社製）を使用し、比較した。配列番号２２に示すプラスミド（２９Ａ）と、配列番号２３に示すプラスミド（２５Ａ）と、配列番号２４に示すプラスミド（２０Ａ）とを、全て２５００ｃｏｐｙ／μｌにて使用した。このような反応液を、それぞれｉ−ｄｅｎｓｙ（ＩＳ−５３１０）に添加し、まずＰＣＲを行うため、９５度で６０秒間熱した後、９５度で１秒間から６０度で１５秒間を５０サイクル行った。その後、前述の実施例１、実施例２および実施例３と同様に、９５度で１秒間、次に４０度で６０秒間、さらに温度の上昇速度を３秒間に１度として４０度から７５度まで加熱し、当該プローブの蛍光色素に応じた検出波長（５８５〜７００ｎｍ）における、経時的な蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。
図５は、実施例４に係る３Ｔ−ＨＧＦ−ＷＴ−Ｒ１プローブでのＴｍ解析の結果を示す図である。横軸は温度（℃）であり、縦軸は単位時間当たりの蛍光強度の変化量である。図５において、２９Ａは配列番号２２に示すプラスミドを使用し、２５Ａは配列番号２３に示すプラスミドを使用し、２０Ａは配列番号２４に示すプラスミドを使用しＰＣＲ、Ｔｍ解析を行った結果を示す。ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数においてＡを２９（３０）塩基有する場合、図５の２９Ａに示すように、ＰＣＲを行うとピークが５５℃になっていた。また、ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数においてＡを２５（２６）塩基有する場合、図５の２５Ａに示すように、ＰＣＲを行うとピークが５１℃になっていた。ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数においてＡを２０（２１）塩基有する場合、図５の２０Ａに示すように、ＰＣＲを行うとピークが４８℃になっており、ＰＣＲを工程に含んでも、それぞれのピークを判別することが可能であることがわかった。
また、上述の実施例１ないし実施例３よりも、より少数単位での標的配列におけるｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔのＡ塩基欠失によるＴｍ値の変化を指標とした場合、正確なＡ塩基の欠失個数を判別できるか否かをＴｍ値計算ソフトウェアＭｅｌｔＣａｌｃを用い、算出した。
まず、算出に使用する正常型配列および変異型配列、すなわちＡ塩基欠失配列について下記に示す。
正常型、配列番号５、３０（３１）
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ １塩基欠失、配列番号２５、２９（３０）
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ３塩基欠失、配列番号２６、２７（２８）
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ５塩基欠失、配列番号２７、２５（２６）
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
正常型、配列番号１５、３０（３１）
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ １塩基欠失、配列番号２８、２９（３０）
５’−ｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ３塩基欠失、配列番号２９、２７（２８）
５’−ｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ５塩基欠失、配列番号３０、２５（２６）
５’−ｇｃａｇｇｃａｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔ−３’
正常型、配列番号１６、３０（３１）
５’−ｇｃｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ １塩基欠失、配列番号３１、２９（３０）
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ３塩基欠失、配列番号３２、２７（２８）
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−３’
ｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ ５塩基欠失、配列番号３３、２５（２６）
５’−ｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｃａｃ−３’
以下に上記正常型配列および欠失配列での、塩基数（ｍｅｒ）、Ａ（ｔ）の数、および算出されたＴｍ値（℃）について表に示す。
Figure 0005917248
また、同様の効果を奏する当該蛍光標識プローブの塩基長および塩基配列について、より詳細に調査するため、実施例１ないし実施例３と同様の方法を用い、Ｔｍ値（℃）およびその変化と塩基配列との関連について調査した。
まず、配列番号３の塩基番号９５に対応する塩基を蛍光標識し調査したプローブの塩基配列について下記に示す。
配列番号３４
５’−ＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号３５
５’−ＧＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号３６
５’−ＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号３７
５’−ＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号３８
５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号３９
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号４０
５’−ＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号４１
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧ−３’
配列番号４２
５’−ＣＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号４３
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡ−３’
配列番号４４
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧ−３’
配列番号４５
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧ−３’
配列番号４６
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣ−３’
配列番号４７
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡ−３’
配列番号４８
５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＴＴ−３’
配列番号４９
５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴ−３’
次に、これらのプローブの塩基配列における、ｍｅｒ、Ａの数、Ｔｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）、１塩基欠失のＴｍ値（℃）、およびＴｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）−１塩基欠失のＴｍ値（℃）の値（Δ）を表に示す。
Figure 0005917248
１ｍｅｒ欠失するとΔ１℃以上（検出不可も含む）の差が出た場合のみ、本発明の多型検出用プローブとして検出可能とし、さらに当該プローブ自体のＴｍ値（℃）が０℃以上であることを条件とすると、上記表４では配列番号４６、配列番号４７および配列番号４９の蛍光標識プローブでは検出不可能であることが示唆される。
さらに、配列番号３の塩基番号９２に対応する塩基を蛍光標識し調査したプローブの塩基配列について下記に示す。
配列番号５０
５’−ＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５１
５’−ＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５２
５’−ＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５３
５’−ＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５４
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣ−３’
配列番号５５
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５６
５’−ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５７
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣ−３’
配列番号５８
５’−ＴＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣ−３’
配列番号５９
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧ−３’
配列番号６０
５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡ−３’
配列番号６１
５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＴＴ−３’
配列番号６２
５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＣＴＧＣＧＴＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴ−３’
次に、これらのプローブの塩基配列における、ｍｅｒ、Ａの数、Ｔｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）、１塩基欠失のＴｍ値（℃）、およびＴｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）−１塩基欠失のＴｍ値（℃）の値（Δ）を表に記す。
Figure 0005917248
前述と同様の条件で本発明の多型検出用プローブとして検出可能とすると、上記表５では配列番号６０および配列番号６２の蛍光標識プローブでは検出不可能であることが示唆される。
さらに、配列番号３の塩基番号１３４の塩基を蛍光標識し調査したプローブの塩基配列について下記に示す。
配列番号６３
５’−ＣＴＣＡＣ−３’
配列番号６４
５’−ＣＴＴＣＡＣ−３’
配列番号６５
５’−ＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号６６
５’−ＣＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号６７
５’−ＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号６８
５’−ＣＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号６９
５’−ＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７０
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７１
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７２
５’−ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７３
５’−ＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７４
５’−ＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣ−３’
配列番号７５
５’−ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣ−３’
配列番号７６
５’−ＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＡＣＴＴＴＴＴＡＡＧＡＧＡＡＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＣＡＴＴＧＴＣＣＡＴＡＧＣＣＴ−３’
配列番号７７
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＴＡ−３’
配列番号７８
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣ−３’
配列番号７９
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＴＡＣＣＡＣＡＣＡＴＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＡＣＡ−３’
次に、これらのプローブの塩基配列における、ｍｅｒ、Ａの数、Ｔｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）、１塩基欠失のＴｍ値（℃）、およびＴｍ値（℃）（パーフェクトマッチ）−１塩基欠失のＴｍ値（℃）の値（Δ）を表に記す。
Figure 0005917248
前述と同様の条件で本発明の多型検出用プローブとして検出可能とすると、上記表６では配列番号６３ないし配列番号６９、配列番号７６、配列番号７８および配列番号７９の蛍光標識プローブでは検出不可能であることが示唆される。
このように、実施例１、実施例２および実施例３の結果、ならびにＴｍ値計算ソフトウェアＭｅｌｔＣａｌｃでのＴｍ値推測結果から、蛍光標識プローブのｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔの配列（または相補的なＴ）の周辺の「Ｃ」の位置を基準に蛍光標識を用いたＴｍ解析を行い蛍光標識のシグナルのピーク値の温度を評価することにより、標的配列のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を数塩基単位でも正確に判別可能であることがわかった。
さらに詳細には、表４ないし表６に示すように、蛍光色素を用いて標識化する位置、Ｔ（または相補塩基のＡ）の連続個数および塩基長によっては、当該多型が検出可能となる場合と不可能となる場合とで条件がある。例えば、配列番号３の塩基番号９５に対応する塩基を蛍光標識する場合は、塩基番号９５〜１００と塩基番号１３２との間にＴが挟まれた塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は１〜３１で塩基長は８〜９４であり（Ｐ１−１）、塩基番号９５〜１００の塩基配列とＴの連続配列からなる塩基配列（Ｔの連続配列が挟まれていない状態）に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は１〜３１で塩基長は７〜５５であることが示唆される（Ｐ１’−１）。
配列番号３の塩基番号９２に対応する塩基を蛍光標識する場合は、塩基番号９２〜１００と塩基番号１３２との間にＴが挟まれた塩基配列に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は１〜３１で塩基長は１１〜９４であり（Ｐ２−１）、塩基番号９２〜１００の塩基配列とＴの連続配列からなる塩基配列（Ｔの連続配列が挟まれていない状態）に相補的な塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は１〜３１で塩基長は１０〜５５であることが示唆される（Ｐ２’−１）。配列番号３の塩基番号１３４の塩基を蛍光標識する場合は、塩基番号１００と塩基番号１３２〜１３４との間にＴが挟まれた塩基配列に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は４〜３１で塩基長は８〜１２０であり（Ｐ３−１）、塩基番号１３２〜１３４の塩基配列とＴの連続配列からなる塩基配列（Ｔの連続配列が挟まれていない状態）に対して少なくとも８０％以上の同一性を有する配列では、元の塩基配列のＴの連続個数は５〜３１であり塩基長は８〜５６であることが示唆される（Ｐ３’−１）。
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文および公開特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
本発明を利用することにより、ＨＧＦ遺伝子におけるプロモーター領域のｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を数塩基単位でも正確に判別することができ、さらに、正常型と変異型とが共存している場合でもｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数を判別することができる。特に、Ｔｍ解析を同時に利用した場合、融解曲線を評価することにより、１種類であっても２種類以上であっても容易にｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ数変異を判別することができる。さらに、実施例および比較例にて前述したとおり、Ｔｍ解析の融解曲線にてｐｏｌｙ Ａ ｒｅｐｅａｔ変異数を評価可能とする蛍光色素の標識箇所は限定されているため、当該標識箇所を利用する本発明に係る多型検出用プローブおよびＨＧＦ遺伝子の多型検出方法は、大いに有用な発明であると言える。

Claims (8)

  1. 融解曲線分析によりＨＧＦ遺伝子の多型を検出するための多型検出用プローブであって、配列番号５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号１５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、および配列番号１６に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドより選択される少なくとも１種の蛍光標識オリゴヌクレオチドからなることを特徴とする、多型検出用プローブ。
  2. 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少するかまたは増加することを特徴とする、請求項１に記載の多型検出用プローブ。
  3. 前記蛍光標識オリゴヌクレオチドは、標的配列にハイブリダイズしないときに蛍光を発し、かつ、前記標的配列にハイブリダイズしたときに蛍光強度が減少することを特徴とする、請求項２に記載の多型検出用プローブ。
  4. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを用いることを特徴とする、ＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
  5. （Ｉ）請求項１ないし３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブおよび試料中の１本鎖核酸を接触させ、前記蛍光標識オリゴヌクレオチドおよび前記１本鎖核酸のハイブリッドを得る工程と、
    （ＩＩ）前記ハイブリッドを含む試料の温度を変化させることで、前記ハイブリッドを解離させ、前記ハイブリッドの解離に基づく蛍光シグナルの変動を測定する工程と、
    （ＩＩＩ）前記蛍光シグナルの変動に基づいて、前記ハイブリッドの解離温度であるＴｍ値を評価する工程と、
    （ＩＶ）前記Ｔｍ値に基づいて、ＨＧＦ遺伝子における、多型の存在を検出する工程と、
    を含むことを特徴とする、請求項４に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
  6. さらに、前記（Ｉ）のハイブリッドを得る前、または、前記（Ｉ）のハイブリッドを得ることと同時に核酸を増幅する工程を含むことを特徴とする、請求項５に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出方法。
  7. 請求項１ないし３のいずれか１項に記載の多型検出用プローブを含むことを特徴とする、ＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット。
  8. 配列番号５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、配列番号１５に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチド、または配列番号１６に示す塩基配列からなり、３’末端の塩基が蛍光色素で標識されている蛍光標識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列を含む領域を鋳型として増幅可能なプライマーをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のＨＧＦ遺伝子の多型検出用キット。
JP2012089507A 2011-05-09 2012-04-10 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途 Active JP5917248B2 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012089507A JP5917248B2 (ja) 2011-05-09 2012-04-10 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途
CN2012101501465A CN102776277A (zh) 2011-05-09 2012-05-09 HGF基因的Poly A重复单元数目突变多态性检测用探针及其用途
US13/467,240 US20120288859A1 (en) 2011-05-09 2012-05-09 Probe for Detecting Poly A Repeat Number Polymorphism of HGF Gene and Uses Thereof
KR1020120048994A KR101392952B1 (ko) 2011-05-09 2012-05-09 Ｈｇｆ 유전자의 폴리 ａ 반복수 변이 다형 검출용 프로브 및 그 용도
EP12167373.5A EP2522745B1 (en) 2011-05-09 2012-05-09 Probe for detecting poly A repeat number polymorphism of HGF gene and uses thereof

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011104503 2011-05-09
JP2011104503 2011-05-09
JP2012089507A JP5917248B2 (ja) 2011-05-09 2012-04-10 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2012249629A JP2012249629A (ja) 2012-12-20
JP5917248B2 true JP5917248B2 (ja) 2016-05-11

Family

ID=46027853

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012089507A Active JP5917248B2 (ja) 2011-05-09 2012-04-10 ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20120288859A1 (ja)
EP (1) EP2522745B1 (ja)
JP (1) JP5917248B2 (ja)
KR (1) KR101392952B1 (ja)
CN (1) CN102776277A (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2999403A1 (en) * 2015-09-22 2017-03-30 Biocartis Nv Improved detection of short homopolymeric repeats

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3963422B2 (ja) 2000-08-03 2007-08-22 日鉄環境エンジニアリング株式会社 核酸の測定方法
ATE306562T1 (de) * 2000-11-15 2005-10-15 Hoffmann La Roche Verfahren zur analyse von wiederkehrenden pcr- podukten, das auf der analyse von dns- schmelzkurven basiert
JP2007510154A (ja) 2003-10-29 2007-04-19 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 検体／ポリマー活性剤の二層配置による検体検出法
US7977108B2 (en) * 2005-07-25 2011-07-12 Roche Molecular Systems, Inc. Method for detecting a mutation in a repetitive nucleic acid sequence
US8404438B2 (en) * 2006-11-30 2013-03-26 Arkray, Inc. Probes for detection of SULT1A1 gene, reagent containing the same, and the uses thereof
KR20100098570A (ko) * 2008-12-16 2010-09-07 아크레이 가부시키가이샤 핵산 증폭의 컨트롤의 검출 방법 및 그 용도
US20100248239A1 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for detecting fragile x mutations

Also Published As

Publication number Publication date
CN102776277A (zh) 2012-11-14
US20120288859A1 (en) 2012-11-15
EP2522745B1 (en) 2014-12-03
KR20120125969A (ko) 2012-11-19
JP2012249629A (ja) 2012-12-20
EP2522745A1 (en) 2012-11-14
KR101392952B1 (ko) 2014-05-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3219814B1 (en) Probe for detection of polymorphism in egfr gene, amplification primer, and use thereof
EP2523965B1 (en) Oligonucleotides and methods for detecting kras and pik3ca mutations
JP3844996B2 (ja) 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法
JP2013081450A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用試薬キット
JP2013090622A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
JP4942508B2 (ja) ａｂｌ遺伝子変異の検出用プローブおよびその用途
US9057103B2 (en) Method for detecting mutations at IL28B and ITPA
JP5290957B2 (ja) 免疫関連遺伝子の多型の検出用プローブおよびその用途
JP6153758B2 (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
JP5917248B2 (ja) ＨＧＦ遺伝子のｐｏｌｙＡｒｅｐｅａｔ数変異多型検出用プローブおよびその用途
JP2013081448A (ja) 遺伝子変異検出用プローブ
JP5613160B2 (ja) ゲノムｄｎａ中の標的配列の検出又は解析方法
JP6205216B2 (ja) 変異検出用プローブ、変異検出方法、薬効判定方法及び変異検出用キット
TWI674320B (zh) 用以預斷吉特曼症候群的方法及套組
WO2012056694A1 (ja) 乳がん発症感受性の判定方法
JP5860667B2 (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途
JP2018088883A (ja) 上皮成長因子受容体遺伝子変異の検出方法
JP5940771B2 (ja) ａｂｌ遺伝子多型の検出用プローブおよびその用途
EP4253564A1 (en) Target nucleic acid amplification method with high specificity and target nucleic acid amplifying composition using same
KR101513276B1 (ko) 변형 ｍｌｐａ 를 이용한 카피 수 다형성의 다중 분석 방법
JPWO2013065646A1 (ja) 遺伝子存在量の測定方法
JP2013094116A (ja) Ｓｌｃ２８ａ１／ａ２／ａ３遺伝子の多型検出用プローブおよびその用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20141110

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20141209

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20141211

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20151027

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151117

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160308

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160406

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5917248

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250