KR20100090730A - 핵산 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플에서 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 필요하다면 cDNA로 전환한 후 관심있는 핵산을 증폭시키는 것으로, 증폭된 핵산은 실시간 PCR(RT PCR) 기술에 의한 추가 증폭에서 주형으로 사용된다. 증폭 과정의 조합은 통상의 증폭 기술과 비교하여 증폭의 감도와 특이성을 향상시킨다. 본 발명은 또한 이 방법에서 사용하는 프라이머와 진단 시험 키트에 관한 것이다.

Description

핵산 검출 방법{NUCLEIC ACID DETECTION}
본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플로부터 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 검출 방법에서 사용하는 핵산, 프라이머, 및 프로브를 검출하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다.
심각한 급성 호흡기 증후군은(SARS)은 사람에서 새롭게 동정된 형태의 비전형적 폐렴이다(Drosten et al.,"Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome" The New England Journal of Medicine, (2003) 348:1967-1976, published on 15 May 2003). 이것은 SARS 코로나바이러스 또는 어바니(Urbani) SARS-관련 코로나바이러스로 알려진, 신규한 코로나바이러스 종에 의해 발생된다. 이 바이러스는 아크로솔(acrosol) 및 대인 접촉에 의해 유효하게 전염되는 것으로 증명되었다. 의심되거나 가능성 있는 SARS의 진단은 문헌(Case Definitions for Surveillance of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS))(세계 보건 기구, 2003년 4월 30일 개정됨)에 명시된 하기 WHO 진단 기준에 따라 이루어진다. 그러나, SARS의 양성은 신규 코로나바이러스에 대한 항체의 존재를 증명하거나 환자 샘플에서 코로나바이러스 핵산의 존재를 증명함으로써 병인물질(aetiological agent)을 확인하지 않고는 달성될 수 없다. 이 질병의 진행 과정은 되돌릴 수 없는 폐 손상을 일으켜 확인된 SARS 감염 환자의 사망률이 5 내지 10%인 것으로 보고되었다. 이러한 질병의 심각성을 제한하고 질병의 전염을 조절하기 위해, 즉각적인 치료를 개시할 수 있도록 가능한 빨리 감염 환자를 확인하는 것이 중요하다.
바이러스 감염을 확인하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법은 표준 혈청 검사 방법, 예컨대 아가 겔 면역확산법(AGID) 또는 효소-결합 면역흡착법(ELISA)을 이용하여 환자 혈청 샘플에서 항체를 확인하는 것이다. 이러한 방법들은 정확한 고 감도 검출을 가능하게 하기에 충분한 농도로 항체가 생성되기까지 감염 후 7일 내지 21일이 소요된다는 한계를 가진다.
또한, 시험관 내에서 감수성을 나타내는 세포에서 바이러스를 배양하는 방법도 잘 확립된 바이러스 검출 방법이다. 그러나, SARS 관련 코로나바이러스는 새로 동정된 것이므로 최적의 성장 조건이 알려져 있지 않다. 또한, 상기 분석법의 생성물은 온전한 감염성 바이러스이기 때문에 바이러스의 증식에는 높은 수준의 생물학적 안전 조치가 요구된다. 따라서, 고도의 기술을 가진 기술자, 장비 및 설비가 필요하므로, 이 기술은 관용적인 진단에 사용하기에는 적절하지 않다는 한계를 가진다. 또한, 바이러스의 성장이 너무 느려서 충분한 시간이 경과된 후에야 검출이 가능하므로 즉각적인 조치를 개시할 수 없다.
바이러스의 유전 물질의 증폭과 검출을 기초로 한 분자적 방법이 많은 병원성 바이러스에 대해 이미 공지되어 있고, 상기 SARS 코로나바이러스의 검출에 적용가능하다. 핵산 증폭 방법은 일반적으로 신속하고, 매우 특이적이며 민감하다.
폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 후 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis), 중첩(nested) PCR, 실시간-태크만®(Real-Time Taqman®) PCR, 분자 표식(molecular beacon) PCR, 핵산 서열을 기초로 한 증폭(NASBA), 키메라 프라이머에 의해 개시되는 핵산 등온 증폭(ICAN) 등을 포함하는 다수의 상이한 핵산 증폭 방법이 공지되어 있다.
PCR 후 겔 전기영동(통상의 PCR로서 공지됨)은 1985년도에 처음 공지된 표준 기술이다. 이후로 상기 기술은 관용적인 실험 방법이 되었다. 그러나, 상기 기술은 비교적 느리고 노동력이 많이 요구된다. 또한, 보다 최근에 개발된 통상의 PCR에 비해 감도가 더 낮다.
중첩 PCR 후 겔 전기영동은 통상의 PCR의 감도를 증가시키는 기술이다. 중첩 PCR은 특정한 1쌍의 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머(외부 프라이머)를 사용하여 특이적인 유전자 서열을 1 순환 증폭시키는 단계를 수반한다. 이 증폭 생성물은 2 순환 증폭에서 주형으로 사용되고, 2 순환 증폭에서는 또 다른 1쌍의 프라이머(내부 프라이머)가 1 순환 증폭 생성물 내의 영역에서 선택된다. 따라서, 2 순환 증폭 생성물은 1 순환 증폭 생성물보다 더 짧다. 이 방법은 추가 증폭 단계를 수반하기 때문에 많은 노동력을 요구한다. 결과적으로 이 방법은 쉽게 오염된다.
NASBA는 문헌[Compton J. "Nucleic acid sequence-based amplification"(1991) Nature 350:91-92; Heim AI et al., "Highly sensitive detection of gene expression of an intronless gene; amplification of mRNA, but not genomic DNA by nucleic acid sequence based amplification (NASBA)"(1998) Nucleic Acids Research 26(9):2250-2251; and Deiman B et al "Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification (NASBA)"(2002) Molecular Biotechnology]에 상세히 기재되어 있다.
실시간 PCR로 명명되는(본 명세서에서 RT-PCR로 언급됨) 고도로 자동화된 방법은 매우 특이적이고 사용자 친화적인 기술인 것으로 입증되었으나, 때때로 중첩 PCR 보다 낮은 감도를 보일 수 있다. RT-PCR은 한쪽 말단에서는 형광 흡수 잔기(moiety)로 표지되어 있고 다른 한쪽 말단에서는 형광 방출 잔기로 표지되어 있는 추가 DNA 올리고뉴클레오티드 분자를 사용하는데, 이 분자는 상기 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머들 사이에서 있는 표적 유전자의 한 영역에 혼성화된다. 이렇게 표지된 분자는 형광원성 프로브로서 공지되어 있다. 증폭 과정이 계속됨에 따라, 형광원성 프로브가 전진하는 DNA 폴리머라제 효소에 의해 치환되어 분해되기 때문에 형광 신호는 증가한다. 실시간 PCR은 문헌[Desjardin LE et al., "Comparison of the ABI 7700 system(TaqMan) and competitive PCR for quantification of IS6110 DNA in sputum during treatment of tuberculosis." (1998) J. Clin. Microbiol. 36(7):1964-8 and Wang T et al., "mRNA quantification by real time TaqMan polymerase chain reaction: validation and comparison with RNase protection"(1999) Anal Biochem. 269(1):198-201]에 상세히 기재되어 있다.
문헌[Yang et al., "Clinical detection of polymerase gene of SARS-associated coronavirus" Academic J First Med(2003) 23(5): 424-427, published on 8 May 2003]은 SARS 코로나바이러스-특이적 프라이머를 사용하는 역전사효소 PCR의 사용에 관한 것이다. 이전에 언급된 문헌[Drosten et al]은 SARS 코로나바이러스 검출을 위한 중첩 RT-PCR 또는 RT-PCR을 별도로 사용하는 것에 관한 것이다.
통상의 PCR, 중첩 PCR, 및 RT-PCR은 광범위한 환자 샘플 중에서 SARS 코로나바이러스를 충분히 정확하고 민감하게 검출할 수 없다. PCR에 의한 음성 결과는 환자가 SARS를 갖지 않는다는 것을 반드시 의미하지 않는데, 이는 많은 인자, 예컨대 증폭 프로토콜에서 사용된 프라이머와 프로브의 무감도, SARS-CoV 감염의 부재, 또 다른 감염제에 의해 야기되는 관찰된 질병, 가짜 음성 PCR 결과가 바이러스 핵산 검출에 영향을 미치거나, 바이러스 또는 그의 유전 물질이 존재하지 않을 때 또는 현재의 방법으로 검출 불가능한 수준으로 존재할 때 상기 표본들이 동시에 수집되기 때문이다. 때 상기 표본이 수집되었기 때문이다. 따라서, SARS-CoV를 효과적으로 스크린하기에 충분한 감도를 갖는 방법을 고안하고, 고 감도, 높은 특이성 및 속도를 겸비하는 증폭 기술로 SARS 코로나바이러스 핵산의 특정 영역을 검출하여 SARS 진단을 개선시키는 것이 중요하다.
본 발명은 단지 SARS 코로나바이러스의 검출에만 제한되지 않고 일반적인 핵산 검출에 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 SARS 코로나바이러스를 포함한 다수의 상이한 종류의 병원체 및 바이러스를 검출하는 데 적용될 수 있다.
본 발명의 목적은 초기 감염 단계에 있는 사람이 식별될 수 있도록 핵산, 예컨대 SARS 코로나바이러스를 검출하는 고 감도의 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 핵산을 검출하기 위한 사용자-친화적인 진단 키트를 고안하는 것이다.
발명의 요약
일반적으로 본 발명은 다양한 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터, 예컨대, 코로나바이러스 핵산을 추출하고 검출하는 방법으로서, (A) SARS 코로나바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 채취하는 단계, (B) 상기 채취된 샘플로부터 리보핵산(RNA)을 추출하는 단계, (C) RNA/DNA 증폭 기술을 이용하여 특정 표적 서열을 증폭시키는 단계, 및 (D) 증폭된 표적 핵산 생성물을 DNA 증폭 기술과, 적절한 보고 시스템, 예컨대, 태크만® 프로브 또는 분자 표식(beacon)을 비롯한 형광원성(fluorogenic) 프로브를 사용하여 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
더욱이 본 발명은 표적 분자를 복제하기 위한 핵산 복제제, 및 복제된 표적 분자를 증폭시키기 위한 핵산 복제제 및 증폭하는 동안 복제된 생성물을 검출하기 위한 핵산 검출제를 포함하는, SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 키트를 제공하는데, 이때 상기 표적 분자는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 물질들은 상기 복제된 생성물을 증폭할 수 있는 프라이머 세트 및 상기 증폭된 생성물에 상보적인 형광원성 프로브를 포함한다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면, 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나를 포함하는 단리된 DNA 서열이 제공된다.
본 발명의 제 2 측면에 따르면, 프라이머 또는 형광 표지된 프로브로서 DNA 증폭에서 사용하기 위한 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나를 포함하는 단리된 DNA 서열이 제공된다. 상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1 내지 27 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
본 발명의 제 3 측면에 따르면, 핵산 단리 단계 후 DNA 증폭 단계, 및 후속 실시간 PCR 단계를 포함하는, 핵산 검출 방법이 제공된다. 바람직하게, DNA 증폭은 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 적절한 핵산 증폭 기술을 포함한다.
가장 바람직하게, 상기 방법은 ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계; ⅱ) 상기 핵산을 경우에 따라 PCR, NASBA 또는 어느 하나의 다른 증폭 기술을 이용하여 증폭시키는 단계; 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 사용하여 증폭시키고 검출하는 단계를 포함한다.
보다 바람직하게, 단계 ⅱ)는 PCR을 이용하여 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 단계 ⅱ)는 예비-증폭 단계로서 공지되어 있다. 이러한 증폭 단계는 DNA 증폭과 PCR에 의한 검출을 포함할 수 있다. 별법으로, NASBA가 사용될 수 있다. 단계 ⅱ)의 다른 적절한 핵산 증폭 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 후 아가로스 겔 전기영동법, 중첩된 PCR, 실시간 태그만® PCR, 분자 표식 PCR, 및 키메라 프라이머에 의해 개시되는 핵산 등온 증폭(ICAN)으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법은 핵산 증폭 기술의 이러한 새로운 조합에 의해 달성다. 예비-증폭 단계와 후속 실시간 PCR의 조합은 유리하게는 고 감도 핵산 검출 방법을 제공한다. 이는 바이러스 또는 다른 병원체에 의한 초기 감염 단계의 사람을 쉽게 식별할 수 있게 한다.
본 발명의 추가 측면은 핵산을 검출하는 방법에 사용하기 위한 서열번호 1 내지 27을 포함하는 단리된 DNA 서열; 및 ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계, ⅱ) 상기 핵산을 경우에 따라 PCR, NASBA 또는 어느 하나의 핵산 증폭 기술을 이용하여 증폭시키는 단계, 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 이용하여 증폭시키고 검출하는 단계를 포함하는, 핵산의 검출 방법에 사용하기 위한 조성물의 제조에 있어서 서열번호 1 내지 27을 포함하는 단리된 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.
또한, 단계 ⅱ)는 예비-증폭 단계로서 공지되어 있다. 예비-증폭 단계는 PCR 또는 NASBA에 의해 수행될 수 있다. 이러한 예비-증폭 단계에 사용되는 프라이머는 어떤 방법이 이용되었느냐에 따라 다를 것이다.
검출될 핵산은 바람직하게는 SARS 코로나바이러스 RNA 또는 cDNA로부터 유래한 것이다.
본 발명은 ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 SARS 코로나바이러스 RNA를 단리하는 단리제; ⅱ) SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 표적 분자를 복제하는 핵산 복제제; 및 ⅲ) 검출 분자를 비롯하여 표적 분자를 검출하는 핵산 검출제를 포함하는, 상기 샘플 중에서 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 키트에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 면은 서열번호 1 내지 27에 상응하는 두 개 이상의 단리된 DNA 서열을 포함하는 SARS 진단 시험 키트에 관한 것이다.
바람직하게, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5 중 어느 하나; 및 6, 7, 8, 9 및 10 중 어느 하나에 상응하는 예비-증폭 프라이머를 포함한다. 상기 1쌍의 프라이머 중 하나는 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택되고 나머지 하나는 서열번호 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된다. 서열번호 1 내지 5는 PCR 전방향(forward) 프라이머에 상응하고 서열번호 6 내지 10은 PCR 역방향(reverse) 프라이머에 상응한다. 별법으로, 예비-증폭 프라이머는 서열번호 26 및 27에 상응한다. 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5, 및 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10은 예비-증폭 PCR에서 사용될 수 있고 서열번호 26 및 27은 예비-증폭 NASBA에서 사용될 수 있다.
또한, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15 중 어느 하나, 및 서열번호 16, 17, 18, 19 및 20 중 어느 하나에 상응하는 실시간 PCR 프라이머를 포함한다. 상기 1쌍의 RT-PCR 프라이머 중 하나는 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택되고, 다른 하나는 서열번호 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택된다. 더욱이, SARS 진단 시험 키트는 서열번호 21, 22, 23, 24 및 25 중 어느 하나에 상응하는 실시간 PCR 프로브를 포함할 수 있다. 이러한 프라이머와 프로브는 실시간 PCR에서 사용된다. 서열번호 11 내지 15는 실시간 PCR 전방향 프라이머에 상응하고 서열번호 16 내지 20은 실시간 PCR 역방향 프라이머에 상응한다. 서열번호 20 내지 25는 실시간 PCR 프로브에 상응한다.
예비-증폭 PCR 및 RT-PCR에 사용된 프라이머는 필요하다면 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한 진단 시험 키트는 프라이머 세트 (a) 서열번호 1, 2 또는 3, 및 서열번호 6, 7 또는 8; 및 b) 서열번호 11, 12 또는 13, 및 서열번호 16, 17 또는 18; 및 서열번호 21, 22 및 23으로부터 선택된 프로브를 포함한다.
바람직한 구체예로서, 진단 시험 키트는 하기 프라이머 세트 A 및 B; C 및 D와; 하기 프로브 E를 포함한다:
A) 서열번호 1, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 프라이머;
B) 서열번호 6, 7, 8, 9 및 10으로부터 선택된 프라이머;
C) 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택된 프라이머;
D) 서열번호 16, 17, 18, 19 및 20으부터 선택된 프라이머; 및
E) 서열번호 20 내지 25로부터 선택된 프로브.
상기 진단 시험 키트는 예비-증폭 단계가 PCR을 수반할 때 사용될 수 있다. 추가로, 프라이머 세트 A 및 B; 또는 C 및 D는 통상적인 PCR 및/또는 RT/PCR과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
다른 바람직한 구체예로서, 진단 시험 키트는 하기 프라이머 세트 A 및 B; C 및 D와; 하기 프로브 E를 포함한다:
A) 서열번호 26 및 27로부터 선택된 프라이머;
C) 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15로부터 선택된 프라이머;
D) 서열번호 16, 17, 18, 19 및 20으로부터 선택된 프라이머; 및
E) 서열번호 20 내지 25로부터 선택된 프로브.
이러한 진단 시험 키트는 예비-증폭 단계가 NASBA를 수반할 때 사용될 수 있다. 서열번호 26 및 27은 SARS NASBA T7 프라이머 및 SARS NASBA 전기화학적발광(ECL) 프라이머에 각각 상응한다.
이하, 본 발명은 하기 도면을 참조하여 설명될 것이다:
도 1은 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 SARS 코로나바이러스 검출의 전체적인 과정의 순서도이고,
도 2는 SARS 코로나바이러스의 단리 및 본 발명의 바람직한 구체예에 의한 상보적인 DNA(cDNA)로의 전환 방법을 보여주며,
도 3은 SARS 코로나바이러스 cDNA 분자의 일부가 두 개의 DNA 분자, 즉 프라이머 A 및 B에 의해 증폭된 후, 증폭된 생성물이 두 개의 DNA 분자, 즉 프라이머 C 및 D에 의한 추가 증폭을 위한 주형으로 사용되고 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 프로브 E에 의해 검출되고 정량되는 것을 보여주고,
도 4a와 4b는 서열번호 1 내지 27에 상응하는 핵산 서열을 보여주고,
도 5 내지 8은 향상된 실시간 증폭과 표준 실시간 증폭을 비교하여 보여준다. 각 샘플에 대한 △Rn(리포터(reporter) 염료 방출량과 소광(quenching) 염료 방출량의 비)를 주기 수에 대해 작도한 것이다. 형광 강도는 입력된 표적 DNA의 양과 직접 관련되어 있다. 검출가능한 형광도에 도달하는 데 요구되는 주기 수가 적을수록 초기 카피 수가 커진다.
도 5는 향상된 실시간 PCR을 이용하여 분석한 임상 샘플을 보여준다. SARS-CoV 양성 샘플은 화살표로 표시된 SARS-CoV 음성 샘플과 분명히 구별된다.
도 6은 표준 실시간 PCR을 사용한 패널 A에서 나타낸 동일한 임상 샘플을 보여준다. SARS-CoV 양성 샘플과 SARS-CoV 음성 샘플은 쉽게 식별되지 않는다.
도 7은 향상된 실시간 PCR을 사용한 SARS-CoV의 순차적인 10배 희석(2x102.5 TCID50/㎖[최대 미량] 내지 2x10-10.5 TCID50/㎖)을 보여준다. 보다 낮은 미량은 역전사 음성 대조군과 태크만® 음성 대조군에서 보여진다.
도 8은 표준 실시간 PCR을 사용한 SARS-CoV의 순차적인 10배 희석(2x102.5 TCID50/㎖[최대 미량] 내지 2x10-10.5 TCID50/㎖)을 보여준다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
핵산 증폭은 환자 조직에서 감염 유기체의 존재를 직접 입증함으로써 많은 질병의 진단을 확인시켜 주는 표준 실험 방법이 되었다. 이러한 방법은 그의 특이성 및 감도가 감염을 빠르게 확인시켜 주고 항바이러스 요법의 효과가 모니터링될 수 있게 하기 때문에 SARS의 급격한 증식 과정 동안에 필요하게 되었다. SARS-CoV에 대한 숙주 항체의 존재의 입증에 의존하는 SARS 진단 분석은 ELISA 및 면역형광법을 이용하여 개발하여 왔다. 그러나, 이러한 시험은 종종 핵산 방법의 감도가 결실되어 있고 항체가 검출가능한 수준에 도달하는 데 7 내지 21일이 소요되기 때문에 새롭게 감염된 환자를 검출할 수 없다
본 발명은 생물학적 샘플 및 환경 샘플에서 SARS 코로나바이러스 RNA 또는 cDNA와 같은 핵산을 민감하게 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 생물학적 샘플은 혈액, 타액, 혈청, 혈장, 비인두 면봉 채취물, 입인두 면봉 채취물, 소변, 대변, 다른 체액, 및 환경 샘플, 예컨대, 물, 오수, 폐기물 등을 포함한다.
핵산 검출을 위한 본 발명의 방법은 예비 증폭 단계 후 실시간 PCR을 수반한다. 문헌(Lau et al., "A real-time PCR for SARS-coronavirus incorporating target gene pre-amplification" Biochemical and Biophysical Research Communication (2003) 312: 1290-1296)의 내용이 참고로 도입된다. PCR 및 실시간 PCR(RT PCR)은 당업계에 잘 공지된 기술이다. 형광 정량과 함께 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)은 신속한 고 감도 고 특이적 DNA 검출 방법이고 SARS 코로나바이러스 핵산의 검출에 적용될 수 있다. 이 기술의 결과는 3시간 정도의 적은 시간내에 얻어질 수 있다. RT PCR은 형광 정량을 이용할 수 있으나 단지 형광 정량으로 제한되지 않는다. RT PCR은 예를 들면 바람직하게 하나의 말단이 형광 흡수 잔기로 표지되어 있고 다른 말단이 형광 방출 잔기로 표지되어 있는 추가 DNA 올리고뉴클레오티드 분자(본 명세서에서는 프로브로서 지칭됨)의 사용을 포함한다. 부가적인 DNA 올리고뉴클레오티드는 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머들 사이에서 관심있는 핵산의 한 영역와 혼성화된다. 여기에서, 신호 발생제(generator)는 형광원성 분자, 분자 표식, 또는 자극받아 적절한 검출기에서 검출되고 정량될 수 있는 광자를 방출할 수 있는 또 다른 분자일 수 있다.
초기 순환 증폭 생성물이 후속 순환 증폭에서 주형으로서 사용되는 중첩 PCR 방법은 많은 표적 유전자 검출의 신뢰도 및 감도를 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 예비-증폭 방법은 다양한 실시간 PCR 기술이 통상의 PCR 기술에 비해 대체적으로 더 우수한 감도를 가지기 때문에 상기 다양한 실시간 PCR 기술에 있어서 필요하지 않은 것으로 생각된다. 그러나, 관심있는 표적 유전자가 드물고/드믈거나 다른 오염물질 중에 존재하는 상황에서는, 본 발명에 따른 예비-증폭이 놀랍게도 검출의 한계를 개선시키는 데 있어서 유리한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 방법, 즉 예비 증폭 후 실시간 PCR은 본 명세서에서 "향상된 실시간 PCR(Enhanced Real-time PCR)"로 지칭될 것이다. 예비-증폭은 PCR, NASBA, 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술에 의해 일어날 수 있다. 이 ERT 기술의 한 이점은 검출 한계가 놀랍게도 통상의 태크만® 실시간 PCR 보다 100배 더 높고 통상의 PCR 보다 108배가 더 높은 TCID50(2x10-11.5)까지 상승되는 것으로 밝혀졌다는 점이다. 추가 이점은 이 향상된 실시간 PCR 검출을 위한 턴어라운드(turnarround) 시간이 약 5.5시간 걸린다는 점이다. 전체 검출 방법의 시간을 더 단축하고 시험의 감도를 증가시키기 위해, 예비-증폭을 위한 NASBA 기술과 실시간 PCR을 조합하는 방법이 또한 이용될 수 있다. 예비-증폭 단계가 NASBA를 포함할 때, 턴어라운드 시간은 유리하게는 약 4시간 이내인 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이렇게 조합된 예비-증폭/RT-PCR 기술에 대한 검출 한계 및 시간을 고려할 때 상기 이점은 예상되지 않은 것이고 유익하다.
부가적으로 ERT는 분명한 방식으로 양성 샘플과 음성 샘플을 구별할 수 있게 한다. 이것은 임의의 오진 또는 오판을 허용하지 않는 임상 진단에서 특히 중요하다.
양성 신호와 음성 신호의 차이는 동일한 샘플이 표준 실시간 PCR에 의해 분석될 때 더 불분명한데, 이때 SARS CoV 양성 증폭 곡선과 음성 증폭 곡선이 서로 밀접하게 중첩되는 경향이 있다(도 6). 그러므로, 실시간 PCR 결과를 해석하는 데 있어서 보다 덜 숙련된 임상의는 ERT에 의해 얻어진 향상된 결과를 이용하여 양성 신호와 음성 신호를 쉽게 구별할 수 있다. 이것은 통상의 실시간 PCR에 비해 본 발명의 매우 중요한 이점이다.
향상된 실시간 PCR의 증가된 감도는 상기 실시간 PCR이 단순한 임상 진단을 넘어서 많은 분야에 적용될 수 있게 한다. 매개물과 오수가 SARS의 급속 증식과 관련되어 있는 경우, 핵산 검출 방법을 환경 샘플에 적용하는 것이 명백히 적절하다. SARS-CoV 핵산의 존재에 대해 대중 공간(리프트, 대기실 등) 내의 표면을 조사하는 것은 세정/살균 과정의 효능를 모니터링하고 질병의 전염을 모니터링하는 기회를 제공할 것이다.
SARS의 징후와 증상은, 예컨대, 종종 열이 없는 노령자들과 같은 높은 위험성을 가진 환자들에서 매우 다양하기 때문에, SARS-CoV의 존재를 확인하기 위한 고감도 방법이 임상 환경 하에서의 바이러스 전염을 제한하기에 매우 유용할 것이다. 조기 검출은 응급 처치가 곧 실시될 수 있게 하여 SARS-CoV가 국소적으로만 출현되게 하고 SARS-CoV의 국제적인 전염을 방지하며, 공중의 염려와 잠재적인 경제적 영향이 한정된다.
본 발명의 바람직한 구체예는 도면을 참고하여 설명된다. 하기 표 1은 도 1 내지 3에서 사용된 참조 번호를 포함한다.
Figure pat00001
생물학적 샘플, 예컨대 입인두 면봉 채취물 중의 SARS 코로나바이러스의 농도는 매우 낮아서 SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 존재의 검출은 생물학적 샘플에 대해 직접 실시될 수 없다. 검출 목적에 충분한 양까지 바이러스 RNA 분자의 수를 증가시키기 위해, 적절한 증폭 기술이 요구된다. 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 DNA의 증폭을 위해 특별히 사용되는 편리한 기술인 것으로 알려져 있다. RNA를 DNA로 전환하는 것은 PCR 과정이 SARS 코로나바이러스 같은, RNA 게놈을 가진 병원체를 커버하도록 확장되게 한다. 이 증폭된 DNA 분자는 임의의 적절한 기술로 검출될 수 있다.
SARS 코로나바이러스는 리보핵산(RNA, 10)의 단일가닥 형태로 그의 유전 물질을 함유한다. 이 바이러스 RNA는 재생을 위해 필요한 유전자들을 함유하며 필수 유전자들 중 하나는 소위 폴리머라제이다. 이 유전자는 대략 길이가 2800 뉴클레오티드이고, 뉴클레오티드는 그 분자의 5' 말단으로부터 번호가 매겨진다.
도 1은 검출 키트로 SARS 코로나바이러스를 검출하는 전체 과정을 보여준다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 표적 SARS 코로나바이러스의 바이러스 핵산 분자는 단일 가닥의 RNA 형태이고 생물학적 샘플에서 먼저 추출된다. 상용가능한 생물학적 샘플 유형은 혈액, 혈청/혈장, 말초 혈액 단핵구 세포/말초 혈액 림프구(PBMC/PBL), 타액, 소변, 대변, 인두 면봉 채취물, 피부 병변 면봉 채취물, 뇌척수액, 자궁 경관 도말, 고름 샘플, 푸드 매트릭스(food matrices) 및 뇌, 비장, 및 간을 포함한 신체의 다양한 부분으로부터 얻어진 조직을 포함한다. 열거되지 않은 다른 샘플도 사용될 수 있다. 단리제는 본 발명의 검출 키트의 핵산 추출 과정을 달성한다.
표적 SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 분자(10)가 생물학적 샘플로부터 추출된 후, 샘플 중의 RNA 분자의 양은 검출되기에 충분하지 않을 수 있다. 따라서, SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 분자의 일부는 적절한 증폭 기술, 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), NASBA, 또는 RT-PCR에 의해 표적 핵산 분자로 복제된다. 그 후, 표적 핵산 분자는 적절한 방법에 의해 검출될 수 있다. RT-PCR 이전에 예비-증폭 단계의 사용은 놀랍게도 통상의 PCR 기술에 의해 제공된 것보다 높은 검출 수준, 향상된 감도 및 보다 빠른 시간을 포함한 이점을 제공한다.
단리 및 증폭 과정이 하기에 상세하게 설명될 것이다.
핵산 단리:
SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 분자(10)는 생물학적 샘플에 적합한 단리제를 가하여 상기 생물학적 샘플로부터 단리할 수 있다. 바람직하게, 단리제를 가하기 전에 용해제(lysis agent)를 가할 수 있다. 용해제 예컨대, 용해 완충액은 단백질 및 지질을 녹이고 생물학적 샘플 중의 단백질을 변성시켜, 이 물질들이 샘플로부터 보다 쉽게 제거될 수 있다. 또한, 용해제는 장기 저장을 위해 RNA 분자를 안정화시키는 완충액으로서 작용할 수도 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, RNA 분자는 실온에서 48시간까지 용해 완충액 중에서 안정할 수 있고 -70℃에서 무기한 저장될 수 있다. 이렇게 하여 얻는 이점은 이러한 과정을 수행하기에 적절하지 않은 샘플링 장소에서 분석을 수행할 필요가 없을 수 있다는 점이다.
적절한 용해 완충액은 예를 들면 5M 구아니딘 티오시아네이트와 Tris/HCl을 포함한다. 이러한 용해 완충액은 당업계에 널리 공지되어 있다. 단백질과 지질을 녹이고 단백질을 변성시키고 RNA 분자를 안정화시킬 수 있는 상이한 조성의 용해제가 본 발명의 검출 키트에서 사용될 수 있다.
용해제를 생물학적 샘플에 가한 후, 다음 단계는 단리제를 사용하여 샘플로부터 핵산 분자를 단리하는 것이다. 도 2는 검출 키트에서의 전체적인 단리 과정을 설명하고 있다. 용해제를 생물학적 샘플에 가한 후, 다른 원치 않는 성분과 함께 핵산은 용액의 형태로 존재한다. 이 용액을, 핵산에 대한 친화도가 높은 소형 크로마토그래피 컬럼(12)에 가한다. 비핵산 성분은 세척에 의해 컬럼으로부터 제거된다. 그 다음 핵산은 적절한 용출제를 사용하여 상기 컬럼으로부터 특이적으로 용출할 수 있다. 본 명세서에 설명된 핵산 정제 과정은 당업계에 널리 공지되어 있다.
샘플 중에 함유된 핵산을 단리한 후, 필요하다면 증폭제를 핵산의 혼합물(14)에 가함으로써 역전사 효소를 사용하여 SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 분자를 상보적인 DNA(cDNA)(16)로 전환시킨다. 이 과정은 당업계에 널리 공지되어 있다. cDNA로의 전환은 특정 상황에서만 요구된다. 따라서, RNA 또는 cDNA는 어떤 과정이 예비-증폭을 위해 사용되느냐에 따라 다음 단계를 위한 주형이 될 수 있다.
예비-증폭 단계:
SARS 코로나바이러스 게놈의 일부는 예컨대, PCR 기술 또는 NASBA 또는 다른 적절한 핵산 증폭 기술에 의해 소위 예비-증폭 단계에서 검출 목적으로 복제된다. 증폭 동안 cDNA 및 단일가닥 RNA가 합성된다.
NASBA(핵산 서열-기재 증폭)은 핵산 증폭을 위한 연속적 등온 효소-기재 방법이다. 이 기술은 역전사효소, 리보뉴클레아제-H, RNA 폴리머라제, 및 두 개의 특별히 고안된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼합물을 사용한다. NASBA는 직접 RNA에 작용할 수 있으므로 RNA를 cDNA로 전환할 필요가 없다. 서열번호 26과 27이 NASBA 예비-증폭 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다.
별법으로, 통상의 PCR 또는 다른 핵산 증폭 기술이 이 예비-증폭 단계에서 사용될 수 있다. 서열번호 1 내지 10은 예비-증폭 PCR 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다. 별법으로, 서열번호 11 내지 20은 이 예비-증폭 PCR 단계에서 프라이머로서 사용될 수 있다. PCR에서, SARS RNA는 우선 cDNA로 전환된 다음, 예비-증폭 PCR을 위한 주형으로 사용된다.
PCR 에 의한 예비-증폭 단계:
도 3에서와 같이, 증폭 과정은 프라이머 A(18)와 프라이머 B(20)를 95℃로 가열하여 단일가닥 형태로 만든 표적 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA(16)에 어닐링(annealing)함으로써 개시한다. 프라이머 A와 프라이머 B는 그들이 표적 cDNA 분자와 결합할 수 있도록 고안된다. 정확한 결합 위치는 조사되는 바이러스 종에 따라 다르다. 결합 부위는 특정 주기 후에 변할 수 있다. 프라이머 A와 프라이머 B의 중요한 기술적 특징은 그들 각각이 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA의 일부에 결합할 수 있다는 점이다.
따라서, 프라이머 A와 프라이머 B는 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA의 적어도 일부에 상보적인 DNA 서열을 암호화하는 결합 서열을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 프라이머 A가 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA에 결합하기에 적합한 영역은 결합 기능에 필요한 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 확인된, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18319 내지 18338에 걸친 영역이다. 이러한 연구에서 사용된 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 조회 번호(GenBank Accession Number) AY278491이다. 따라서, 프라이머 A의 결합 서열은 바람직하게는 도 4a와 4b에서 서열번호 1로 기재된 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18319 내지 18338에 걸친 영역에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 1은 5'-3' 방향으로 일반 형식으로 기재되어 있음을 인식해야 한다. 결과적으로 바이러스 유전자에 대한 결합 방향은 "후방"에서 "전방"이 된다.
별법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18363 내지 18382(서열번호 2, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18404 내지 18386(서열번호 3, 도 4a와 4b)가 프라이머 A에서 결합 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 4 또는 5가 프라이머 A에서 결합 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 프라이머 B가 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA에 결합하기에 적합한 영역은 결합 기능에 필요한 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 확인된, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18157 내지 18179에 걸친 영역임이 확인되었다. 이러한 연구에 사용된 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 조회 번호 AY278491이다. 그러므로, 프라이머 B의 결합 서열은 바람직하게는 도 4a와 4b에서 서열번호 6으로 기재된 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18157 내지 18179에 걸친 영역에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 6은 5'-3' 방향으로 일반 형식으로 기재되어 있음을 인식해야 한다.
별법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18125 내지 18144(서열번호 7, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18103 내지 18122(서열번호 8, 도 4a와 4b)가 프라이머 B에서 결합 목적으로 사용될 수 있다. 또한, 서열번호 9 또는 10이 프라이머 B에서 결합 목적으로 사용될 수 있다.
프라이머 A 및 B가 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA에 결합한 후, 프라이머 A 및 B는 프라이머 A 및 B의 3' 말단에 적절한 뉴클레오티드가 존재하면 적절한 폴리머라제, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제의 활성을 통해 연장된다. 따라서, (a) SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA의 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 연장된 프라이머 A(22) 및 B(24)가 생성된다.
적절한 증폭 프로그램을 적용하여 SARS 코로나바이러스 cDNA를 과량의 이중가닥 DNA 생성물(26)로 전환시킬 수 있다. 적절한 증폭 프로그램은 다음과 같다:
Figure pat00002
NASBA 에 의한 예비-증폭
별법으로, 예비-증폭은 핵산의 증폭을 위한 연속적 등온 효소-기재 방법인 NASBA에 의해 달성될 수 있다. 이 기술은 역전사효소, 리보뉴클레아제-H, RNA 폴리머라제, 및 두 개의 특별히 고안된 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머의 혼합물을 사용한다. 증폭과정 동안, cDNA와 단일가닥 RNA가 합성된다. 따라서, 태크만 실시간 PCR이 NASBA 생성물에서 cDNA의 존재하에 수행될 수 있다. RNA는 NASBA를 위한 주형으로 작용할 수 있으므로 이러한 상황에서는 SARS RNA를 cDNA로 전환하는 것이 불필요하다.
NASBA를 수행하기에 적합한 프라이머는 SARS NASBA T7 프라이머와 SARS NASBA ECL 프라이머에 각각 상응하는 서열번호 26 및 27을 포함한다. 이러한 NASBA 프라이머는 예비-증폭 단계에서 PCR 프라이머 서열번호 1 내지 10 대신 사용될 수 있다.
실시간 PCR
검출 과정의 감도를 높이기 위해, 예비-증폭 단계, 즉 PCR 반응 또는 NASBA의 생성물이 추가 증폭 과정, 즉 RT-PCR과정에서 사용된다. 프라이머 서열번호 1 내지 10이 필요에 따라 대안으로 사용될 수 있더라도 서열번호 11 내지 20은 RT-PCR을 수행하기 위한 프라이머로서 사용될 수 있다. 서열번호 21 내지 25는 RT-PCR에서 프로브로서 사용된다.
검출 목적을 달성하기 위하여, 예비-증폭 단계, 예컨대 PCR 또는 NASBA의 증폭된 이중가닥 DNA 생성물(26)은 RT-PCR, 바람직하게 태크만® 정량 실시간 PCR을 이용하는 추가 증폭에서 주형으로서 사용된다. 후속 증폭 과정의 효율을 최대화하기 위해, 복제된 DNA는 추가 증폭에서 주형으로서 사용되기 전에 먼저 적절한 액체 중에서 희석되어야 한다. 복제된 DNA 분자에 적합한 희석액은 뉴클레아제-무함유 물 또는 완충액을 포함한다. RT-PCR 과정에 적합한 증폭 프로그램은 다음과 같다:
Figure pat00003
증폭 정도는 적절한 장치, 예컨대 ABI 프리즘 7700 유전 물질 검출 시스템(Applied Biosystems)에서 자동적으로 모니터링될 수 있다.
RT-PCR에 의한 증폭은 두 개의 DNA 올리고뉴클레오티드 프라이머(프라이머 C(28) 및 프라이머 D(30))와 형광원성 프로브(E, 32)를 필요로 한다.
본 발명의 목적을 위해, SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA 증폭 생성물과 프라이머 C의 결합에 적합한 영역은 결합 기능에 필요한 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 밝혀진, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18264 내지 18245에 걸친 영역이다. 이러한 연구에서 사용된 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 조회 번호 AY278491이다. 따라서, 프라이머 C의 결합 서열은 바람직하게는 도 4a 및 4b에서 서열번호 11로 기재된 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18264 내지 18245에 걸친 영역에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 11은 5'-3'방향으로 일반 형식으로 기재되어 있음을 인식해야 한다. 결과적으로 바이러스 유전자에 대한 결합 방향은 "후방"에서 "전방"이 된다.
별법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18295 내지 18314(서열번호 12, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18322 내지 18304(서열번호 13, 도 4a와 4b)가 프라이머 C에서 결합 목적으로 사용될 수 있다. 별법으로, 서열번호 14 또는 15가 프라이머 C에서 결합 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해 SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA 증폭 생성물에 대한 프라이머 D의 결합에 적합한 영역은 결합 기능에 필요한 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 밝혀진, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18193 내지 18211에 걸친 영역이다. 이러한 연구에서 사용된 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 조회 번호 AY278491이다. 따라서, 프라이머 D의 결합 서열은 도 4a와 4b에서 서열번호 16으로 기재된 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18193 내지 18211에 걸친 영역에 상보적인 DNA 서열을 포함한다. 서열번호 16은 5'-3'방향으로 일반 형식으로 기재되어 있음을 인식해야 한다.
별법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18219 내지 18336(서열번호 17, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18205 내지 18220(서열번호 18, 도 4a와 4b)이 프라이머 D에서 결합을 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 서열번호 19 또는 20이 프라이머 D에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, SARS 코로나바이러스의 바이러스 cDNA 증폭 생성물과 프로브 E의 결합에 적합한 영역은 결합 기능에 필요한 최소 수의 뉴클레오티드를 함유하는 것으로 밝혀진, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18217 내지 18234에 걸친 영역이다. 이러한 연구에서 사용된 유기체는 SARS 코로나바이러스 HKU-39849, 유전자은행 조회 번호 AY278491이다. 따라서, 프로브 E의 결합 서열은 도 4a와 4b에서 서열번호 21로 기재된 SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18217 내지 18234에 걸친 영역에 상보적인 DNA 서열을 포함한다.
별법으로, SARS 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 18241 내지 18260(서열번호 22, 도 4a와 4b) 또는 뉴클레오티드 18228 내지 18246(서열번호 23, 도 4a와 4b)이 프로브 E에서 결합을 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 서열번호 24 또는 25가 프로브 E에서 결합을 위해 사용될 수 있다.
프라이머 C 및 D는 적절한 효소, 예컨대 Taq DNA 폴리머라제 및 첨가된 뉴클레오티드의 활성에 의해 3' 말단으로부터 신장하여 이중가닥 생성물(34)을 형성한다. 증폭 과정 동안, 프로브 E는 DNA 폴리머라제 효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 치환되고 분해된다. 그 결과, 증폭 정도 및 증폭된 생성물의 농도와 관련되는 형광 신호이 증가된다. 따라서 RT-PCR 증폭 과정의 생성물은 하기 DNA 서열을 각각 포함하는 다량의 표적 DNA 분자이다:
(a) 본래의 SARS 코로나바이러스의 일부에 상보적인 DNA 서열.
태크만® 실시간 프로브의 서열은 말단이 프라이머 C 및 D로 정의되는 말단을 갖는 증폭된 DNA 생성물의 임의의 영역에 상보적일 수 있다. 그러나, 프로브 서열은 프라이머 C 및 D의 서열과 중첩될 수 없는데, 이는 상기 프로브 서열이 증폭 반응이 일어나는 것을 방해하기 때문이다.
향상된 실시간 PCR
이렇게 조합된 예비-증폭과 실시간 PCR 기술은 본 명세서에서 "향상된 실시간 PCR"(ERT)로 지칭된다. 도 3은 PCR과 RT-PCR의 조합에 의한 SARS 코로나바이러스의 바이러스 RNA 증폭에 대한 개략도이다.
이러한 신규 분석의 내포적 특징은 예비-증폭 단계, 예컨대 통상의 PCR 또는 NASBA의 1 순환의 증폭 생성물을 RT-PCR의 2 순환을 위한 주형으로서 사용된다는 점이다. 이렇게 조합된 기술은 SARS-CoV 검출 감도를 증가시킨다. 경우에 따라, 동일한 프라이머가 통상의 PCR 및 RT-PCR 단계에 의해 초기 예비-증폭에서 사용된다. 이러한 부가적인 예비-증폭 단계는 임상 샘플 중의 SARS-CoV의 검출 감도를 향상시킨다.
하기 표 2는 열거된 프라이머 서열이 CUHK AG03 AY345988 유전자은행 서열을 기초로 한 SARS 서열에 어떻게 상응하는지를 보여준다.
Figure pat00004
서열번호 4, 9, 14, 19 및 24는 SARS 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 유전자로부터 유도되고, 서열번호 5, 10, 15, 20 및 25는 SARS 폴리머라제(Pol) 유전자로부터 유도된다.
또한, 본 발명은 생물학적 또는 환경 샘플에서 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 키트의 제조에 있어서 정제되고 단리된 제 1 DNA 분자 및 제 2 DNA 분자의 용도에 관한 것으로, SARS 코로나바이러스의 RNA 분자는 단리제에 의해 생물학적 또는 환경 샘플로부터 단리되고, 표적 분자는 상기 제 1 DNA 분자 및 제 2 DNA 분자를 포함하는 핵산 복제제에 의해 복제되며, 표적 분자는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열번호; 및 검출 분자에 결합하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 표적 분자는 상기 검출 분자를 비롯한 핵산 검출제에 의해 검출된다.
바람직하게, 상기 표적 분자는 RNA 또는 다른 핵산일 수 있지만 cDNA 분자이다. 상기 제 1 DNA 분자는 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재하에 연장됨으로써 상기 제 1 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 cDNA 서열의 적어도 일부에 결합될 때 SARS 코로나바이러스의 cDNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 발생시키도록 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 결합하는 DNA 서열을 포함한다.
보다 바람직하게, 상기 제 1 DNA 서열은 서열번호 6, 7, 8, 9 또는 10에 기재된 DNA 서열과 함께 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 5에 기재된 DNA 서열을 암호화할 수 있다. 또한, 제 1 DNA 서열은 서열번호 26 및 27에 기재된 DNA 서열을 암호화할 수 있다.
또한, 상기 핵산 복제제는 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 정제되고 단리된 제 2 DNA 분자를 포함할 수 있고, 이때 상기 제 2 DNA 분자는 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재하에 연장됨으로써 상기 제 2 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 결합될 때 SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 발생시킨다. 보다 바람직하게, 상기 DNA 서열은 서열번호 16, 17, 18, 19 또는 20에 기재된 DNA 서열과 함께 서열번호 11, 12, 13, 14 또는 15에 기재된 DNA 서열을 암호화한다. 상기 복제된 DNA 생성물은 추가 증폭 전에 먼저 희석된다.
검출 분자는 표적 분자에 결합하는, SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부; 및 신호 발생제를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다.
상기 신호 발생제는 다음 중 하나를 포함한다: 형광원성 분자; 분자 표식; 및 자극받아 적절한 검출기에서 검출되고 정량될 수 있는 광자를 방출할 수 있는 다른 분자. 바람직하게, 검출 분자의 DNA 서열은 서열번호 20 내지 25에 기재된 DNA 서열 중 어느 하나를 암호화한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 설명된다. 하기 실시예에 대해 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식해야 한다.
[실시예]
하기 실시예에 사용된 성분과 일반적인 프로토콜은 하기를 기초로 하여 확장된다:
샘플
핵산을 단리하는 데 사용된 샘플은 SARS 환자로부터 얻어졌으며 중국, 북경의 병원에서 제공되었다.
박스 A(핵산 단리)
퀴아젠 RNeasy® 미니 키트(Qiagen RNeasy® Mini Kit) 핵산 단리 키트
박스 B(핵산 증폭)
마스터믹스(MASTERMIX)(0.5㎖)(유로젠텍(Eurogentec)에서 구입)
dUTPfmf 포함한 dNTPs(0.2mM dATP, dCTP, dGTP 및 0.4mM dUTP), 핫스타트(HotStart) Tag DNA 폴리머라제, MgCl2, 유라실-N-글리코실라제(UNG), 및 음성 기준물(Passive Reference)을 함유한다.
SARS 프라이머 (20㎕)
SARS와 관련된 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 한 영역에 상보적이며 서열번호 1 내지 20, 26, 및 27을 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드.
SARS 프로브 (10㎕)
SARS와 관련된 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 한 영역에 상보적이고 형광 방출 표지와 형광 소광 분자로 표지되어 있으며 서열번호 21 내지 25를 포함하는 DNA 올리고뉴클레오티드. 0.2mM의 SARS 프라이머 + 0.24mM 태크만 SARS 프로브를 보편적인 마스터믹스(mastermix)에 첨가한다.
SARS 양성 대조군(10㎕)
SARS와 관련된 코로나바이러스의 폴리머라제 유전자의 일부를 포함하는 고도로 정제된 비-감염성 플라스미드
제제( reagents )의 제조를 위한 프로토콜
박스 A(핵산 단리)
필요에 따라 충분한 수의 RNeasy(RNeasy) 미니-컬럼(샘플당 하나)을 준비했다. RLT 완충액(샘플당 0.4㎖), RW1 완충액(샘플당 0.7㎖) 및, 필요에 따라, RPE 완충액(샘플당 0.5㎖)(모두 RNeasy 키트에서 제공된다)을 제조하고 실온으로 천천히 가온했다. 70% 에탄올(샘플당 0.4㎖) 및, 필요에 따라, 뉴클레아제-무함유 물(샘플당 50㎕)을 준비하여 실온으로 천천히 가온했다.
박스 B(핵산 증폭)
마스터믹스, SARS 프라이머, SARS 프로브, 정제된 핵산 주형(샘플) 및, 필요에 따라, 뉴클레아제-무함유 물을 준비하고 실온으로 천천히 가온했다.
핵산 추출 프로토콜( Qiagen RNeasy ® Mini Kit )
1. 0.4㎖ 샘플과 0.4㎖ RLT 완충액을 혼합했다.
2. 0.4㎖ 70% 에탄올을 튜브에 첨가했다.
3. 0.6㎖의 혼합 용액을 RNeasy 컬럼에 첨가했다. 상기 튜브를 조심스럽게 밀폐시키고 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다. 통과된 유체를 2㎖ 회수 튜브에 따라 버렸다. 단계 3을 반복했다.
4. 0.7㎖ RW1 완충액을 RNeasy 컬럼에 첨가했다. 튜브를 조심스럽게 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켜 컬럼을 세적하였다. 통과된 유체를 따라 버렸다.
5. 0.5㎖ RPE 완충액을 RNeasy 컬럼에 첨가하고 15초 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다. 통과된 유체를 따라 버렸다. 단계 5를 반복했다.
6. 상기 컬럼을 추가 2분 동안 약 10,000x g으로 원심분리시켰다.
7. 상기 RNeasy 컬럼을 새로운 1.5㎖ 회수 튜브에 옮겼다. 50㎕ RNase-무함유 물을 실리카-겔 막 위에 직접 피펫으로 떨어뜨리고 3분 동안 RT에서 항온처리했다.
8. RNA는 1분 동안 약 10,000x g으로 원심분리에 의해 용출되었다.
9. 핵산 RNA가 얻어졌다.
시퀀싱 프로토콜
증폭 반응의 생성물을 시퀀싱하여 앰플리콘(amplicon)이 의도하는 표적 서열에 상응하는지를 확인했다. 시퀀싱 반응은 시판되는 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 수행되었다. DNA 서열은 373A 시퀀서 시스템(Applied Biosystems)을 이용하여 시퀀싱 반응을 해상함으로써 얻었다. NCBI(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 이용가능한 BLAST 서열번호 비교 수단을 사용하여 DNA 서열을 분석했다.
실시예 1
예비-증폭을 위해 PCR 을 사용하는 향상된 실시간 PCR
PCR 예비-증폭
전체 부피 25㎕에서, 하기 성분들을 혼합한다: 뉴클레아제-무함유 물, 0.2mM dNTPs, 1U 플라티늄 Taq DNA 폴리머라제(Invitrogen), 5mM MgCl2, 1xPCR 완충액, 프라이머(10μM), 및 cDNA 주형(약 100ng). PCR 증폭은 하기 온도 프로파일을 갖는 마스터사이클러(MasterCycler)(Eppendorf)에서 수행했다:
Figure pat00005
실시간 PCR
제 1 순환 PCR 예비-증폭에 이어서, 생성물의 일부를 RT-PCR을 이용한 추가 증폭에서 주형으로 사용했다.
PCR 성분을 표 3에 설명된 비율로 혼합했다.
Figure pat00006
RT-PCR 장치(ABI 7700)는 표 4의 증폭 프로파일로 프로그래밍했다.
Figure pat00007
PCR 예비-증폭 후 RT-PCR을 사용한 SARS 코로나바이러스 검출 결과가 하기 표 5 및 6에 나타나 있다. 상기 결과는 퍼킨 엘머 ABI 310 유전 물질 분석기(Perkin Elmer ABI 310 Genetic Analyzer) 및 상기 일반 프로토콜을 사용한 DNA 시퀀싱에 의해 확인되었다.
SARS 환자로부터 얻어진 핵산 샘플에 대한 상이한 증폭 방법들의 비교
표 5와 6에 보여진 결과들은 다양한 환자 샘플로부터 단리된 핵산의 증폭을 시도함으로써 얻어졌다. 샘플들은 SARS 환자로부터 얻어졌고 중국 베이징 병원으로부터 제공되었다. 각 샘플은 세 가지 상이한 방법에 의해 시험되었다:
ⅰ) 아가로스 겔 전기영동을 이용한 통상의 PCR,
ⅱ) 실시간 태크만® PCR, 및
ⅲ) 새롭게 기술된 방법인, 예비-증폭 단계를 이용한 향상된 RT-PCR.
통상의 PCR은 PCR 예비-증폭과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행되었다. 실시간 태크만® PCR은 ERT 방법과 동일한 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
Figure pat00008
감도 연구 결과
코로나바이러스를 추출하여 cDNA로 전사시켰다. cDNA를 순차로 희석하고 표 6에 기재된 세 가지 방법으로 시험했다.
Figure pat00009
실시예 2
예비-증폭을 위한 PCR 을 사용한 향상된 실시간 PCR
의심되거나 가능한 SARS 케이스로 진단받은 120명의 환자로부터 임상 샘플을 채취하고, 실시예 1의 프로토콜을 사용하여 통상의 PCR 후 아가로스 겔 전기영동, 통상의 태크만® 실시간 PCR 및 본 발명에 따른 향상된 태크만® 실시간 PCR 분석법으로 분석했다.
ERT를 사용하여, SARS-CoV 폴리머라제 유전자의 약 190bp 영역을, 통상의 PCR을 사용하여 cDNA로부터 증폭했다. 이 앰플리콘을 시퀀싱하여 SARS-CoV의 예측된 영역에 상응하는지를 확인했다. 그 후, 상기 PCR 생성물은 RT-PCR 프라이머를 사용하는 향상된 실시간 PCR 프로토콜을 위한 주형으로서 사용되었다. 표준 실시간 방법을 사용한 경우 21/120(18.3%)만이 SARS-CoV 양성으로 확인되고, 다양한 통상의 PCR 방법을 사용한 경우 단지 평균 10.6%만이 SARS-CoV 양성으로 확인된 결과에 비해, 상기 프로토콜을 이용한 경우 28/120(23.3%) 환자 샘플이 SARS-CoV 양성으로 확인되었다. 적절한 음성, 양성, 및 PCR 억제 대조군을 증폭 과정의 각 단계에서 사용하였다.
임상 샘플에 대한 표준 및 향상된 실시간 PCR 데이터의 선택은 도 5 내지 8에 도시되어 있다. SARS-CoV 양성 샘플과 SARS-CoV 음성 샘플 사이의 구별이 명확하다(도 5, 화살표로 표시됨). 양성 신호와 음성 신호 사이의 구별은 동일한 샘플을 표준 실시간 PCR로 분석했을 때 더욱 불분명하고, 이때 SARS-CoV 양성 및 음성 증폭 곡선이 서로 밀접하게 중첩되는 경향이 있다(도 7). ERT에 의해 얻어진 향상된 결과를 얻으면서 양성 신호와 음성 신호를 쉽게 구별하기 위해 실시간 PCR 결과를 해석하는 것이 보다 용이하다. 향상된 실시간 PCR 방법은 통상의 실시간 PCR 방법과 비교하여 SARS-CoV 양성 샘플에 대한 순환 시간(Ct) 값을 낮춘다. 35.0 이하의 Ct 값은 SARS-CoV 핵산을 함유한 샘플과 그렇지 못한 샘플을 명확히 구별하기에 적절한 컷-오프이다.
분석 감도
각 증폭 방법의 검출 한계는 홍콩의 환자에서 얻어진 SARS-CoV(2x102.5 TCID50/㎖) 배양 샘플로부터 추출된 전체 핵산을 순차로 희석하여 측정되었다. 통상 PCR, 표준 실시간 PCR, 및 향상된 실시간 PCR 방법의 검출 한계는 각각 2x10-5.5 TCID50/㎖, 2x10-10.5 TCID50/㎖(도 1D),및 2x10-12.5 TCID50/㎖(도 1C)이었다. 따라서, 향상된 실시간 PCR 방법은 표준 실시간 PCR 보다 적어도 102배 이상 더 민감하고 SARS-CoV의 분자 검출을 위해 현재 사용되는 통상의 PCR 기술보다 107배 더 민감하다. 바이러스 배양물에 의한 SARS-CoV의 검출은 가장 민감하지 않은 방법일 수 있는데, 향상된 실시간 PCR에 의해 검출된 3/28(10.7%) 경우만이 바이러스 배양에 의한 SARS-CoV에 대해 양성이었다.
향상된 실시간 PCR 방법은 여러 경우에서 임의의 다른 분석에 의해 확인되지 않은 SARS-CoV 양성 샘플을 검출하는 것으로 확인되었다. 그러므로, 진단의 정확도를 높이는 임의의 신규 검출법은 임상의가 이용할 수 있는 또 다른 가치있는 진단 수단이다. 통상의 PCR 및 실시간 PCR만으로는 SARS-CoV 양성인 경우를 거의 확인하지 못했다. 결과는 3/28 경우에서 바이러스 배양에 의해 확인되었다. 향상된 실시간 PCR 방법의 검출 한계는 표준 실시간 PCR 분석보다 102배 이상 더 민감하고 통상의 PCR 방법보다 107배 더 민감하다. 상기 분석법의 증가된 감도는 향후 SARS의 급격한 증식 동안 질병 전염의 억제를 도울 수 있다.
실시예 3
예비-증폭을 위한 NASBA 를 사용한 향상된 실시간 PCR
(ⅰ)NASBA 반응
NASBA 시약을 위한 혼합물의 함량(최종 농도):
SARS 프라이머쌍 0.2mM(서열번호 26 및 27)
Tris-Cl, pH 8.5 40mM
MgCl2 12mM
KCl 70mM
DTT 5mM
DMSO 10%
dNTPs 각 1mM
NTPs 각 2mM
NASBA 효소를 위한 혼합물의 함량(최종 농도):
BSA 0.1㎎/㎖
T7 RNA 폴리머라제 30유닛(Units)
역전사효소 8유닛
RNase H 0.1유닛
Figure pat00010
반응 혼합물을 65℃에서 5분 동안 항온처리한 후 41℃에서 5분 동안 냉각시켰다. 그 다음, 5㎕ 효소 혼합물(1 효소구에 대해 전체 55㎕)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 잠시 혼합한 후, 41℃로 냉각시키고 5분 동안 항온처리하였다. 상기 반응 혼합물을 잠시 회전시킨 다음 41℃에서 1.5시간 동안 항온처리하였다.
(ⅱ) 태크만 실시간 PCR
제 1 순환 NASBA 예비-증폭 후, NASBA 생성물을 하기 RT-PCR을 사용하는 추가 증폭에서 주형으로서 사용했다:
Figure pat00011
온도순환( Thermocycle ) 프로파일;
50℃에서 2분
95℃에서 10분
95℃에서 15초; 40 주기
58℃에서 1분
NASBA 향상된 실시간 PCR 의 결과:
하기 표 7, 8 및 9에 나타낸 바와 같이 코로나바이러스 NASBA 생성물은 태크만 실시간 PCR에 의해 성공적으로 증폭되고 검출되는 것으로 확인되었다.
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
NASBA-태크만 PCR을 위한 반응 조건이 최적화된 것으로 확인되었다. NASBA-태크만과 통상의 NASBA의 감도는 약 TCID50 2x10-5.5로 유사하다. 표 7(NASBA ECL 결과)로부터, 시험이 TCID50 2x10-8 이하로 검출될 수 있으며, 이는 NASBA 태크만 PCR(ERT)과 동일함을 알 수 있다. 그러나, NASBA ECL의 판독값은 다른 양성 신호(일반적으로 다수의 수치에 대해)와 매우 다른 7407이다. 따라서, 실제 상황에서, 이러한 결과는 양성인 것으로 용이하게 판정될 수 없다. 그러나, NASBA 실시간 PCR(ERT)에서, Ct는 다른 양성 신호와 유사한 7.16이다. 따라서, 본 발명자들의 NASBA 실시간 PCR(ERT)은 통상의 NASBA 방법에 비해 여전히 이점이 있다.
상기 실시예에서 보여진 바와 같이, 검출 키트는 다양한 시험 장소에서 편리하게 사용될 수 있음을 인식할 수 있다. 또한, 검출 키트는 기존 방법들보다 사용하기에 비교적 용이하고, 보다 짧은 시간 내에 검출 결과를 제공할 수 있으며, 상기 검출 결과는 원한다면 3시간 내에 이용될 수 있다. 이것은 DNA-기재 검출 시스템이기 때문에, 특이성 및 감도가 향상될 수 있고 실시예에서 기재된 검출 키트는 SARS 코로나바이러스에 대해 특이적이고, SARS 코로나바이러스가 검출을 위한 표적 분자로 복제될 것이므로 샘플 중의 SARS 코로나바이러스의 농도는 더 이상 중요하지 않을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예가 이전의 그래프로 설명되었지만, 본 발명의 변형 및 치환이 당업자에게는 자명하며, 이러한 변형 및 치환은 하기 청구의 범위에 기재된 본 발명의 범주 내에 있다. 또한, 본 발명의 구체예는 실시예 또는 도면으로만 제한적으로 설명되는 것은 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> HONG KONG DNA CHIPS LIMITED YU, Chueng Hoi LAU, Lok Ting <120> Nucleic Acid Detection <130> FP5260 <150> GB 0310181.3 <151> 2003-05-02 <160> 27 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 1 accagtcggt acagctacta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 2 gcattaactc tggtgaattc 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 3 ctggtcacct ggtggaggt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 4 gcgctaacaa agaaggcatc 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 5 ggattatgtg ttgacatacc ag 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 6 attaccaagt caatggttag ggt 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 7 tagactcatc tctatgatgg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 8 taccaaagga catgacctac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 9 ccttgttgtt gttggccttt 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 10 ccagtcggta cagctactaa gt 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 11 ctctagttgc atgacagccc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 12 aacacctgta gaaaatccta 20 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 13 actaagttaa cacctgtag 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 14 gcggcagtca agcctcttc 19 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 15 cccgcgaaga agctatcg 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 16 cccgcgaaga agctattcg 19 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 17 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 18 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 19 tgctgccagg agttgaattt c 21 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 20 cgtgcgtgga ttggcttt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 21 ttcgtgcgtg gattggct 18 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 22 tagagggctg tcatgcaact 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 23 attggctttg atgtagagg 19 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 24 cgctcctcat cacgtagtcg ctgtaattc 29 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 25 ctattcgtca cgttcg 16 <210> 26 <211> 56 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 26 aattctaata cgactcacta tagggagaag gagctggaga ggtaggttag taccca 56 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> SARS Coronavirus <400> 27 gatgcaaggt cgcatatgag taccgtagac tcatctctat ga 42

Claims (17)

  1. 핵산 단리 단계 후 핵산 증폭 단계, 및 후속 실시간 PCR 단계를 포함하는 핵산 검출 방법.
  2. 제 2 항에 있어서,
    핵산 증폭 단계가 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술을 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    실시간 PCR 단계가 형광 표지된 프로브를 사용하는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    검출되는 핵산이 DNA 또는 cDNA인, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    핵산이 SARS 코로나바이러스 cDNA인, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 핵산을 추출하는 단계;
    ⅱ) 상기 핵산을 경우에 따라 PCR, NASBA 또는 임의의 다른 핵산 증폭 기술을 이용하여 증폭시키는 단계; 및
    ⅲ) 단계 ⅱ)에서 생성된 핵산을 실시간 PCR을 이용하여 증폭시키고 검출하는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    얻어진 핵산이 RNA인 경우, 단계 ⅰ) 후 역전사효소를 사용하여 상기 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    프라이머 또는 프로브를 단계 ⅱ) 및 단계 ⅲ)에서 사용하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    프라이머 또는 프로브가 SARS 코로나바이러스 cDNA의 적어도 일부에 결합함으로써 SARS 코로나바이러스 cDNA가 검출되는, 방법.
  10. ⅰ) 생물학적 샘플 또는 환경 샘플로부터 SARS 코로나바이러스 RNA를 단리하기 위한 단리제(isolating agent);
    ⅱ) SARS 코로나바이러스의 RNA 서열의 적어도 일부에 상보적인 핵산 서열을 포함하는 표적 분자를 복제하기 위한 핵산 복제제(replicating agent); 및
    ⅲ) 검출 분자를 포함하는, 표적 분자를 검출하기 위한 핵산 검출제
    를 포함하는, 생물학적 또는 환경 샘플 중에서 SARS 코로나바이러스를 검출하기 위한 진단 시험 키트.
  11. 제 10 항에 있어서,
    표적 분자가 cDNA 분자인, 키트.
  12. 제 10 항에 있어서,
    핵산 복제제가 SARS 코로나바이러스 RNA의 적어도 일부에 결합하는 DNA를 포함한 정제되고 단리된 제 1 DNA 분자를 포함하고, 상기 제 1 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스 cDNA의 적어도 일부에 결합될 때, 상기 제 1 DNA 분자가 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재 하에 연장됨으로써 SARS 코로나바이러스 cDNA의 적어도 일부에 상보적인 DNA를 포함한 DNA를 발생시키는, 키트.
  13. 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서,
    핵산 복제제가 제 1 순환 증폭에 의해 생성된 SARS 코로나바이러스 RNA의 적어도 일부에 결합하는 DNA를 포함한 정제되고 단리된 제 2 DNA 분자를 포함하고, 상기 제 2 DNA 분자가 SARS 코로나바이러스 cDNA의 적어도 일부에 결합될 때, 상기 제 2 DNA 분자가 효소 및 DNA 뉴클레오티드의 존재 하에 연장됨으로써 제 1 순환 증폭 과정 동안 생성된 SARS 코로나바이러스 cDNA의 적어도 일부에 상보적인 DNA를 포함한 DNA를 발생시키는, 키트.
  14. 제 10 항에 있어서,
    복제된 DNA 생성물이 추가 증폭 이전에 먼저 희석되는, 키트.
  15. 제 10 항에 있어서,
    검출 분자가 표적 분자에 결합하는 SARS 코로나바이러스 RNA의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖는 DNA, 및 신호 발생제(signal generator)를 포함하는, 키트.
  16. 제 13 항에 있어서,
    제 1 DNA 분자의 DNA 서열이 제 2 DNA 분자와 중첩되지 않는, 키트.
  17. 제 15 항에 있어서,
    신호 발생제가 형광원성 분자, 분자 표식(beacon), 및 자극되어 적절한 검출기에서 검출되고 정량될 수 있는 광자를 방출할 수 있는 수 있는 다른 분자 중 하나를 포함하는, 키트.
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