CN1798842A - 核酸检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测来自于生物或环境标本的核酸的方法。该技术包括扩增感兴趣的核酸，之后如果必要将其逆转录为cDNA，将扩增的核酸作为进一步的实时PCR(RT－PCR)扩增的模板。相比于常规扩增技术，该组合的扩增方法提高了扩增的灵敏度和特异性。本发明还涉及该方法使用的引物和诊断测试试剂盒。

Description

核酸检测
                      技术领域
本发明涉及对来自生物样品和环境样品的核酸的检测方法。本发明还涉及检测核酸的诊断试剂盒和检测方法中使用的引物和探针。
                      发明背景
重症急性呼吸道综合症是一种新认识的人类非典型性肺炎(Drosten等人，“Identification of a novel coronavirus in patients withsevere acute respiratory syndrome”The New England Journal of Medicine，(2003)348：1967-1976，2003年5月15日发表)。其由一株新的冠状病毒所引起的，即SARS冠状病毒和Urbani SARS-相关冠状病毒。已经证明此病毒通过气溶(acrosol)和人与人之间的接触而有效的传播。根据Case Definitions for Surveillance of Severe Acute RespiratorySyndrome(SARS)(World Health Organization，2003年4月30日修订)详细说明的WHO诊断标准制定了对疑似或可能的SARS的诊断。然而，没有通过对患者标本中存在的新冠状病毒的抗体或者冠状病毒的核酸证明的病因鉴别，就无法给出SARS的阳性诊断。该病可以引起肺部不可恢复的损伤，已经报道确诊SARS感染人群的死亡率为5-10％。为了限制疾病的严重性并控制疾病的传播，及早检测出感染患者非常重要以便启动快速的治疗。
最常使用的检测病毒感染的方法是使用标准的血清学方法检测患者血清标本中的抗体，包括但并不局限于琼脂糖凝胶免疫扩散(AGID)或酶联免疫吸附方法(ELISA)。由于在感染后7-21天后产生的抗体浓度才足以进行精确和灵敏的检测，这些方法具有局限性。
在体外易感细胞中培养病毒也是检测病毒的一个建立完善的方法。然而，与SARS相关的冠状病毒是一个新的实体并且其最适生在条件没有被描述过。另外，因为检测产品是完整的具感染性的病毒，所以培养病毒需要高水平的生物安全性，。因此需要高度专业的人员，设备和工具，这限制了此技术对于常规诊断的应用。另外，病毒生长可能太慢，以至于不能在足以启动快速治疗的时间内完成检测。
在先描述了针对多种致病病毒的基于病毒遗传物质扩增和检测的分子方法，该方法可以应用于SARS冠状病毒的检测。通常核酸扩增方法是迅速、高度特异和敏感的。
曾经描述了多种不同类型的核酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)及随后的琼脂糖凝胶电泳、巢式PCR、实时TaqMan PCR、分子信标PCR(molecular beacon PCR)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)等温和嵌合的引物起始的核酸扩增(ICAN)等等。
PCR以及随后的凝胶电泳(也称为传统PCR)是在1985年被第一次描述的标准方法。从那时起其成为实验室常规方法。然而，其相对耗时并且工作量大。另外，与最近发展的技术相比，常规PCR具有较低的灵敏度。
之后进行凝胶电泳的巢式PCR是提高了传统PCR灵敏度的一项技术。巢式PCR包括使用特定的DNA寡聚核苷酸引物(外部引物)对特定的遗传序列的第一次扩增。第一次扩增的产物被用作模板进行第二次扩增，其中另外一对引物(内部引物)选自第一次扩增产物内的区域。因此第二次扩增产物比第一次扩增产物短。由于这个方法包括一个额外的扩增步骤，所以很费力。因而此方法容易污染。
NASBA基于下述文章而延伸，即compton J.“Nucleic AcidSequence-Based Amplification”(1991)Nature 350：91-92；Heim Al等人“Highly Sensitive Detection Of Gene Expression Of An Intronless Gene：Amplification of mRNA，but not Genomic DNA by Nucleic Acid SequenceBased Amplification(NASBA)”(1998)Nucleic Acids Research26(9)：2250-2251和Deiman B等人“Characteristics And Applications OfNucleic Acid Sequence Based Amplification(NASBA)”(2002)MolcularBiotechnology 20：163-179。
据证明称为实时PCR的高度自动化的方法(其将作为RT-PCR被始终提到)具有高特异性和用户易掌握的技术，但是有时会有比巢式PCR低的灵敏度。RT-PCR结合使用了另外的DNA寡聚核苷酸分子，该分子一端用荧光吸收部分标记，而在另一端用荧光放射部分标记，并且该分子与靶基因的位于DNA寡聚核苷酸引物之间的一个区域杂交。标记的分子为荧光探针。随着扩增过程的进行，由于荧光探针被前进的DNA聚合酶置换和降解，因此荧光信号增强。实时PCR通过下述文献而得到扩展，即Desjardin LE等人“Comparison of the ABI7700 System(TaqMan)and Competitive PCR For Quantification ofIS6110 DNA in Sputum during Treatment Of Tuberculosis.”(1998)J ClinMicrobial.36(7)：1964-8和Wang T等人“mRNA Quantification by RealTime Taqman Polymerase Chain Reaction：Validation and ComparisonWith RNase Protection”(1999)Anal Biochem.269(1)：198-201。
2003年5月8日出版的Yang等人“Clinical Detection ofPolymerase Gene of SARS-associated Coronovirus”，Academic J FirstMed(2003)23(5)：424-427中的文献，指出利用SARS冠状病毒的特异引物进行逆转录PCR的应用。前文提到的Drosten等人指导分别使用巢式RT-PCR或RT-PCR对SARS冠状病毒进行检测。
对于大规模的患者标本中的SARS冠状病毒的检测，单独使用传统PCR、巢式PCR和RT-PCR可能都不具备足够的精确性或灵敏度。阴性的PCR结果不一定表明患者没有患SARS，因为多种因素影响对病毒核酸的检测，包括在扩增过程中所用引物和探针不敏感，缺少SARS冠状病毒感染，观察到的病情是由于其它感染物所致，假阴性PCR结果，或者在收集的标本中病毒或其遗传物质还没有出现或者存在的量以目前的技术方法无法检测出来的时间内收集标本。因此，设计一种有足够灵敏度能够有效筛选SARS冠状病毒的方法，以及通过使用具有高灵敏度，高特异性和高速的扩增技术检测SARS冠状病毒的核酸的特异区域以提高对SARS的诊断非常重要。
可以理解本发明并不局限于仅仅对SARS冠状病毒进行检测，而还可以应用到通常的核酸检测中。因此，本发明能够对包括SARS冠状病毒的多种不同类型的病原体和病毒进行检测。
本发明的目的之一是提供检测包括SARS冠状病毒的核酸的高灵敏度的方法，以便可以检测出处于感染早期的个体。
设计用户易掌握的诊断试剂盒以检测核酸也是本发明的目标之一。
                  发明概述
一般而言，本发明提供了一种提取和检测方法，例如从各种生物或环境样品中提取和检测冠状病毒核酸，该方法包括下述步骤(A)收集怀疑含有SARS冠状病毒的标本，(B)从收集的标本中提取核糖核酸(RNA)，(C)使用RNA/DNA扩增技术扩增特异的靶序列和(D)使用DNA扩增技术和合适的报告***例如包括TaqMan探针或分子信标(molecular beacon)的荧光探针检测靶核酸扩增产物。
此外，本发明还提供检测SARS冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括复制靶分子的核酸复制试剂，其中的靶分子包括含有至少一部分与SARS冠状病毒RNA序列互补的核酸序列；以及在扩增过程中扩增复制的靶分子和检测复制产物的核酸复制和检测试剂。这些试剂包括能够扩增复制产物的引物对和能够与扩增产物互补的荧光探针。
根据本发明的第一方面，本文提供一个包括任何SEQ ID Nos 1-27序列的分离的DNA序列。
根据本发明的第二个方面，本文提供一个在DNA扩增中作为引物或荧光探针的包括任何SEQ ID Nos 1-27序列的分离的DNA序列。该引物或探针可以由任何SEQ ID Nos 1-27的序列组成。
根据本发明的第三个方面，本文提供检测核酸的方法，该方法包括下述步骤：核酸提取，DNA扩增和实时PCR。优选地，DNA扩增包括PCR，NASBA或其它任何合适的核酸扩增技术。
最优选地，方法包括下述步骤：
i)从生物或环境标本中提取核酸；
ii)扩增核酸，任选使用PCR，NASBA或其它任何核酸扩增技术；
iii)使用实时PCR扩增和检测步骤(ii)中的核酸产物。
更优选，步骤(ii)包括使用PCR扩增核酸。步骤(ii)也被称为预扩增步骤。这个扩增步骤可以包括使用PCR的DNA扩增和检测。作为选则，可以使用NASBA。另外适合的步骤(ii)的核酸扩增技术可以从随后进行琼脂糖凝胶电泳的聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR，实时TaqManPCR、分子信标PCR或等温和嵌合的引物起始核酸扩增(ICAN)中选择。
通过这种新的核酸扩增技术的结合而完成本发明的方法。预扩增步骤与其后的实时PCR的结合有利的提供了一个用于检测核酸的高灵敏度的方法。这确保能够检测被病毒或其它病原体感染的早期患者。
本发明的另一个方面涉及含有SEQ ID Nos 1-27序列的分离DNA序列在检测核酸的方法中的应用，还涉及含有SEQ ID Nos 1-27序列的分离DNA序列在制备用于检测核酸的方法中的组合物的应用，该检测方法包括下述步骤：
i)从生物或环境标本中提取核酸；
ii)扩增核酸，任选使用PCR，NASBA或其它任何核酸扩增技术
iii)使用实时PCR扩增和检测步骤(ii)的核酸产物。
步骤(ii)也被称为预扩增步骤。可以使用PCR或NASBA方法完成预扩增。根据使用的方法，在预扩增步骤中使用的引物将不同。
用于检测的核酸优选来自SARS冠状病毒的RNA或cDNA。
一般而言，本发明涉及用于检测生物或环境标本中SARS冠状病毒的诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(i)用于从标本中分离SARS冠状病毒RNA的分离试剂；
(ii)用于复制靶分子的核酸复制试剂，其中的靶分子包括：与至少一部分SARS冠状病毒的RNA序列互补的核酸序列；
(iii)用于检测靶分子的核酸检测试剂，其中的核酸检测试剂包括检测分子。
本发明的再一方面涉及包括两个或更多的对应于SEQ ID Nos 1-27的分离DNA序列的SARS诊断试剂盒。
优选的SARS诊断试剂盒包括相应于SEQ ID Nos 1、2、3、4或5中的任何一个和6、7、8、9或10中的任何一个的预扩增引物对。引物对之一选自SEQ ID Nos 1、2、3、4或5，而另一个引物选自SEQ IDNos 6、7、8、9或10。SEQ ID Nos 1-5相当于PCR的正向引物，而SEQ ID Nos 6-10相当于PCR的反向引物。或者，预扩增的引物对相应于SEQ ID Nos26和27。SEQ ID Nos 1、2、3、4或5和6、7、8、9或10可以使用在预扩增PCR中，而SEQ ID Nos26和27可以使用在预扩增NASBA中。
另外，SARS诊断试剂盒还包括相应于任一SEQ ID Nos 11、12、13、14或15和任一16、17、18、19或20的实时PCR引物。RT-PCR引物对之一选自SEQ ID Nos 11、12、13、14或15，而另一个引物选自SEQ ID Nos 16、17、18、19或20。而且，SARS诊断试剂盒还可以包括相应于SEQ ID Nos 21、22、23、24或25任何一个的实时PCR探针。这些引物和探针在实时PCR中使用。SEQ ID Nos 11-15相应于实时PCR的正向引物，而SEQ ID Nos 16-20相应于实时PCR的反向引物。SEQ ID Nos 20-25相应于实时PCR的探针。
如果需要，预扩增PCR和RT-PCR中所使用的引物可以互换。
或者，诊断试剂盒包括下述引物对a)SEQ ID Nos 1、2或3和6、7或8，b)SEQ ID Nos11、12或13和16、17或18，探针选自SEQ IDNos21、22或23。
作为一个优选的实施方案，诊断试剂盒包括下述引物对A和B；C和D；以及探针E：
A)选自SEQ ID Nos 1、2、3、4或5中任何一个的引物；
B)选自SEQ ID Nos 6、7、8、9或10中任何一个的引物；
C)选自SEQ ID Nos 11、12、13、14或15中任何一个的引物；
D)选自SEQ ID Nos 16、17、18、19或20中任何一个的引物；
E)选自SEQ ID Nos 20-25中任何一个的探针。
当预扩增步骤包括PCR时可以使用此诊断试剂盒。另外，引物对A和B；或C和D在或者传统PCR和/或RT/PCR中可以互换使用。
作为一个供选择的优选的实施方案，诊断试剂盒包括下述引物对A；和C和D以及探针E：
A)一个选自SEQ ID Nos 26或27的引物，和
C)一个选自SEQ ID Nos 11、12、13、14或15的引物；和
D)一个选自SEQ ID Nos 16、17、18、19或20的引物；和
E)一个选自SEQ ID Nos 20-25中任一的探针。
当预扩增步骤包括NASBA时可以使用此诊断试剂盒。SEQ ID Nos26和27分别相应于SARS NASBA T7引物和SARS NASBA电化学发光(ECL)引物。
                 附图简要说明
本发明将通过引用下述图进行描述：
图1显示根据本发明优选实施方案的检测SARS冠状病毒的整个方法的流程图。
图2显示根据本发明优选实施方案的分离SARS冠状病毒和其转换为互补DNA(cDNA)的方法。
图3显示根据本发明优选的实施方案，通过两个DNA分子，引物A和B扩增SARS冠状病毒cDNA分子的一部分，以及随后的使用扩增产物作为模板，通过两个DNA分子，引物C和D进行进一步扩增，通过探针E检测和量化效果(quantification effected)。
图4显示相应于SEQ ID Nos1-27的核酸序列。
图5-8显示增强的和标准的实时扩增的比较。对于每一个例子，根据循环数对ΔRn(报告染料释放的量与淬灭染料释放量的比)作图。荧光的强度与输入的靶DNA的量直接相关。达到荧光可检测水平的循环数越少表明初始拷贝量越高。
图5显示使用增强实时PCR分析的临床标本。箭头所示的SARS冠状病毒阳性标本明显不同于SARS冠状病毒阴性标本。
图6显示对与组A相同的临床标本中使用标准实时PCR。SARS冠状病毒阳性和阴性标本不易区分。
图7显示SARS冠状病毒连续10倍稀释(2×102.5TCID50/ml[最上面的曲线]到2×10-10.5TCID50/ml)的增强实时PCR。最下面曲线显示逆转录的阴性对照和TaqMan的阴性对照。
图8显示SARS冠状病毒连续10倍稀释(2×102.5TCID50/ml[最上面的曲线]到2×10-10.5TCID50/ml)的增强实时PCR。
               优选实施方案的详细描述
通过直接显示在患者组织中存在的感染生物体，核酸扩增迅速的成为确定许多疾病诊断的标准的实验室方法。由于这些方法的特异性和灵敏度能够迅速确认感染并允许对抗病毒治疗的监控，在SARS暴发的时期，这些方法成为不可缺少的方法。通过使用例如ELISA和免疫荧光的方法，已经发展起通过依靠显示抗SARS冠状病毒的宿主抗体的SARS诊断方法。然而，这些检测经常缺乏核酸方法的灵敏度，并且不能检测最新的感染患者，因为抗体达到检测水平需要7-21天。
本发明提供了检测核酸的灵敏的方法，如检测生物和环境标本中SARS冠状病毒的RNA或cDNA的方法。该生物标本包括血液、唾液、血清、血浆、鼻咽拭子、口咽拭子、尿、大便以及其它体液，环境标本包括水、污水、废物等等。
本发明的核酸检测方法包括预扩增步骤以及其后的实时PCR。Lau等人的“A real-time PCR for SARS-coronavirus incorporating target genepre-amplification”Biochemical and Biophysical ResearchCommunication(2003)312：1290-1296的内容在此引用作参考。PCR和实时PCR(RT-PCR)是本领域熟知的技术。实时聚合酶链式反应(RT-PCR)结合荧光定量是迅速、高灵敏度和高特异的检测DNA的方法，并且可以应用到检测SARS冠状病毒的核酸。仅该技术的结果可以在3个小时获得。RT-PCR可以使用荧光定量但不仅仅局限于荧光定量。例如，RT-PCR包括使用一个额外的DNA寡聚核苷酸分子(这里称为探针)，优选的该分子在一端使用荧光吸收部分标记，而在另一端用荧光放射部分标记。额外的DNA寡聚核苷酸与位于DNA寡聚核苷酸引物之间的一段感兴趣的核酸区域杂交。因此，信号产生子可以是荧光分子、分子信标或另外的可以被刺激并释放可被合适探测器检测和定量的光子的分子。
众所周知以起始扩增循环的产物作为随后扩增模板的巢式PCR方法能提高许多靶基因检测的忠实性和灵敏度。由于相对于传统PCR技术，实时PCR能够产生极高的灵敏度，因此被认为对于多种实时PCR，此预扩增是没有必要的。然而，在感兴趣的靶基因稀少和/或存在于其它污染的背景的情况下，令人惊讶的发现，预扩增结合本发明能有利的改善检测的局限性。
本发明的方法，即预扩增以及其后的实时PCR，在本文中将被称为“增强的实时PCR”。通过PCR、NASBA或其它核酸扩增方法进行预扩增。令人惊讶的发现，此ERT技术的一个优点是其检测极限达到TCID50(2×10-11.5)，其是常规TaqMan实时PCR的100倍，是传统PCR的108。另一个优点是该增强实时PCR检测的周转时间(turnaroundtime)大约为5.5小时。为了进一步缩短整个检测方法的时间并提高检测的灵敏度，也可以使用将用于预扩增的NASBA技术和实时PCR结合的方法。当预扩增步骤包括NASBA时，发现周转时间有利的变为4小时之内。因此，该预扩增/RT-PC相结合的技术在检测极限和时间方面的优点都是没有预料到的并且是有利的。
另外，ERT能够以清楚的方式区分阳性和阴性标本。这在不允许任何误诊或错误描述的临床诊断中特别有用。
当使用标准实时PCR方法对同样的标本分析时，对阳性和阴性信号的区分非常模棱两可，其中SARS冠状病毒阳性和阴性扩增曲线趋于相互的紧密的重叠(图6)。因此，通过ERT获得的增强的结果，缺乏解释实时PCR结果经验的临床医师可以容易的区分阳性和阴性信号。相比于常规实时PCR，这是本发明的非常重要的用处。
增强实时PCR的增加的灵敏度使得其可应用在简单临床诊断之外的许多领域。假设污染物和污水与SARS暴发有关，使用对环境标本应用核酸检测的方法的恰当性是显而易见的。检测公共区域(电梯、等候区等)的表面SARS冠状病毒存在的证据将提供监控该疾病的传播以及监控清洁/消毒方法的效力的机会。
由于SARS的症状和体征高度可变，尤其在诸如老年人的高危险的患者中，例如发烧不是经常出现，因此检测SARS冠状病毒存在的灵敏的方法将非常有利于限制病毒在临床环境中传播。及早检测也能使应急措施及早实施以便控制局部暴发并防止国际间传播SARS冠状病毒，限制公众的担忧和潜在的经济影响。
参考图对本发明的优选实施方案进行描述。表1包括图1-3使用的附图标记。
附图标记                  项目
10                        单链SARS冠状病毒RNA
12                        层析柱
14                        分离核酸的混合物
16                        互补DNA(cDNA)
18                        引物A
20                        引物B
22                        延伸的引物A
24                        延伸的引物B
26                        过量双链产物
28                        引物C
30                        引物D
32                        探针E
34                        过量双链产物
                  表1：图1-3中附图标记
例如口咽拭子的生物标本中的SARS冠状病毒的含量可能特别的低，以至于不能直接对生物标本中存在的SARS冠状病毒的病毒RNA进行检测。为了将病毒RNA分子的数量提高到可以检测的足够的含量，需要合适的扩增技术。已知聚合酶链式反应(PCR)是特别用于DNA扩增的灵活的技术。RNA反转为DNA使得PCR方法可以应用到具有RNA基因组的病原体，如SARS冠状病毒。扩增的DNA分子然后可以被任何合适的技术检测。
SARS冠状病毒包括以单链核糖核酸(RNA，10)的形式存在的遗传物质。病毒RNA含有其本身复制必须的基因，必要基因之一被称为聚合酶。该基因大约有2800个核苷酸，从分子的5’端开始计算核苷酸。
图1显示使用检测试剂盒检测SARS冠状病毒的整个过程。如图1所示，首先从生物标本中提取以RNA单链形式存在的靶SARS冠状病毒的病毒核酸分子。合适的生物标本可包括血液、血清/血浆、外周血单核细胞/外周血淋巴细胞(PBMC/PBL)、唾液、尿、粪便、喉拭子、皮肤病变拭子、脑脊液、宫颈涂片、脓液标本、食物基质(matrices)和来自身体不同部位的包括脑、脾和肝的组织。也可以使用这里没有列出的其它标本。分离试剂完成本发明检测试剂盒核酸提取过程的。
从生物标本中提取靶SARS冠状病毒RNA分子(10)之后，标本中RNA分子的量可能不足以进行检测。因此，通过例如聚合酶链式反应(PCR)或NASBA或RT-PCR的合适的扩增方法对SARS冠状病毒RNA分子(10)的一部分进行复制而得到靶核酸分子。然后靶核酸分子再被合适的方法检测。在RT-PCR之前使用预扩增步骤令人惊讶的提供了一系列益处，包括与单独的传统PCR技术相比的更高的检测水平、改善的灵敏度和缩短的时间。
下文将讨论详细的分离和扩增过程
核酸分离
通过对生物标本使用合适的分离试剂而可以从生物标本分离SARS冠状病毒RNA分子(10)。优选在分离试剂前可以使用裂解试剂。例如裂解缓冲液的裂解试剂用于溶解蛋白质和脂类，并变性生物标本中的蛋白质，以便使这些物质可以更容易的从标本中除去。而且，裂解试剂还可以作为缓冲液稳定RNA分子，以达到长期储存的目的。正如图2所示，存在于裂解缓冲液中的RNA分子可以在室温的条件下稳定存在最多48小时，并且可以在-70℃无限期保持稳定。这样做的益处是可以不必要在标本采集时(sample site)进行分析，那时可能不适合进行该过程。
合适的裂解缓冲液的例子可以包括5M的硫氰酸胍和Tris/HCl。这样的裂解缓冲液在本领域是众所周知的。含有不同组合物的仍能够达到溶解蛋白质和脂类、变性蛋白质并稳定RNA分子的目的的裂解试剂也可以使用在本发明检测试剂盒中。
在裂解试剂作用于生物标本之后，下一个步骤是使用分离试剂将核酸分子从标本中分离出来。图2描述了检测试剂盒中的整个分离过程。在裂解试剂作用于生物标本之后，核酸与其它不想要的组分以溶液形式存在。然后将该溶液加入到一个小的对核酸分子具有高亲和性的层析柱(12)中。通过洗涤将非核酸组分从柱中除去。然后使用核酸洗脱试剂将核酸从柱中特异地洗脱下来。这里描述的核酸纯化方法在本领域是众所周知的。
将标本中含有的核酸分离之后，如果必要，而后可以将扩增试剂加到核酸混合物中以便通过使用逆转录酶将SARS冠状病毒RNA分子反转为互补DNA(cDNA)(16)拷贝。该方法在本领域众所周知。仅在某些条件下需要转录为cDNA。因此，根据预扩增使用的方法，RNA或cDNA可以作为下一步骤的模板。
预扩增步骤：
在所谓的预扩增步骤中，使用例如PCR技术或NASBA或其它任何合适的核酸扩增技术，为了检测目的而复制SARS冠状病毒基因组的一部分。在扩增过程中，合成了cDNA和单链RNA。
NASBA(依赖核酸序列的扩增)是连续、等温和依赖酶的扩增核酸的方法。该方法使用逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和两个特异设计的DNA寡聚核苷酸引物的混合物。NASBA可以直接作用于RNA，因此不需要将RNA反转为DNA。在NASBA预扩增步骤中SEQID NOS 26和27可以被用作引物。
或者，在此预扩增步骤中可以使用传统PCR或其它核酸扩增技术。可以使用SEQ ID NOS 1-10作为预扩增PCR步骤中的引物。作为选择地，SEQ ID NOS 11-20可以作为此预扩增PCR步骤的引物。对于PCR，SARS RNA首先反转为cDNA，然后cDNA作为预扩增PCR的模板。
使用PCR的预扩增步骤：
如图3所示，通过引物A(18)和B(20)与加热到95℃而形成单链的靶SARS冠状病毒cDNA退火而启动扩增过程。设计引物A和B以使其可以与靶cDNA分子结合。准确的结合位点取决于所检测的病毒株。经过一段时间之后，结合位点可以改变。引物A和B的重要技术特征是其分别保持与SARS冠状病毒cDNA结合的能力。
因此，引物A和B包括一个编码与SARS冠状病毒cDNA至少部分序列互补的DNA序列的结合序列。为了本发明的目的，发现适合与引物A结合的SARS冠状病毒cDNA的区域为介于SARS冠状病毒聚合酶基因18319-18338之间的核苷酸，发现该区域含有具有结合功能的最少数目的核苷酸。在这些研究中使用的生物类型是SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank接受号为AY278491。因此，优选的引物A的结合序列包括一个与SARS冠状病毒聚合酶基因的介于18319-18338之间的核苷酸互补的DNA序列，其在图4中SEQ ID No.1中列出。需要注意的是通常SEQ ID No.1以5’-3’的方向书写。因此关于病毒基因的结合方向就是从“后”向“前”。
作为一种选择，SARS冠状病毒聚合酶基因的18363-18382位核苷酸(SEQ ID No.2，图4)或18404-18386位核苷酸(SEQ ID No.3，图4)也可以作为引物A的结合目标。或者SEQ ID Nos 4或5可以作为引物A的结合目标。
为了本发明的目的，发现适合与引物B结合的SARS冠状病毒cDNA的区域为介于SARS冠状病毒聚合酶基因18157-18179之间的核苷酸，发现该区域含有具有结合功能的最少数目的核苷酸。在这些研究中使用的生物的类型是SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank接受号为AY278491。因此，优选的引物B的结合序列包括一个与SARS冠状病毒聚合酶基因的介于18157-18179之间的核苷酸互补的DNA序列，其在图4中SEQ ID No.6中列出。需要注意的是通常SEQ ID No.6以5’-3’的方向书写。
作为一种选择，SARS冠状病毒聚合酶基因的18125-18144位核苷酸(SEQ ID No.7，图4)或18103-18122位核苷酸(SEQ ID No.8，图4)也可以作为引物B的结合目标。或者SEQ ID Nos 9或10可以作为引物B的结合目标。
在引物A和B与SARS冠状病毒cDNA结合之后，通过例如TaqDNA聚合酶的合适的聚合酶的作用，在存在合适的核苷酸的情况下，引物A和B在其3’端被延伸。因此，延伸的引物A(22)和B(24)包括下列序列(a)与SARS冠状病毒RNA一部分互补的DNA序列被制备出来。
通过使用合适的扩增程序，可以将SARS冠状病毒cDNA转化为大量的双链DNA产物(26)。合适的扩增程序是：
起始步骤                   50℃，2min
DNA聚合酶活化              95℃，3-5min
40个循环                   95℃，30sec
                           50℃，45sec
                           72℃，15sec
使用NASBA进行预扩增
作为选择，可以使用NASBA(依赖核酸序列的扩增)方法进行预扩增，其为连续、等温和依赖酶的扩增核酸的方法。该技术使用逆转录酶、核糖核酸酶H、RNA聚合酶和两个特异设计的DNA寡聚核苷酸引物的混合物。在扩增过程中，既合成cDNA又合成单链RNA。因此，TaqMan实时PCR可以使用存在于NABSA中的cDNA而运行。RNA可以作为NABSA的模板，因此，在这种情况下，没有必要将SARSRNA反转为DNA。
完成NASBA合适的引物包括SEQ ID Nos 26和27，其分别相应于SARS NASBA T7引物和SARS NASBA ECL引物。在预扩增步骤中可以使用这些NASBA的引物而代替PCR引物SEQ ID Nos 1-10。
实时PCR
为了增强检测方法的灵敏度，将预扩增步骤，即PCR反应或NASBA的产物应用在进一步的，也就是RT-PCR方法的扩增中。可以使用SEQ ID Nos 11-20作为完成RT-PCR的引物，然而，如果必要作为选择也可以使用SEQ ID Nos 1-10作为引物。使用SEQ ID Nos 21-25作为RT-PCR的探针。
为了达到检测目标，将预扩增步骤，如PCR反应或NASBA中的扩增的双链DNA产物作为模板，使用RT-PCR，优选TaqMan定量实时PCR进行进一步的扩增。在复制的DNA作为进一步扩增的模板使用之前，必须首先将其稀释到合适的液体中，以使随后的扩增过程的效率最大化。用于复制的DNA分子的合适稀释剂包括无核酸酶的水或缓冲液。RT-PCR方法合适的扩增程序是：
起始步骤                50℃，2min
DNA聚合酶活化           95℃，10min
50个循环                95℃，15sec
                        72℃，1min
扩增的程度可以通过合适的设备自动监控，例如ABI Prism 7700基因检测***(Applied Biosystems)。
RT-PCR扩增需要两个DNA寡聚核苷酸引物(引物C(28)和引物D(30))和荧光探针(E，32)。
为了本发明的目标，发现适合与引物C结合的SARS冠状病毒cDNA扩增产物的区域为介于SARS冠状病毒聚合酶基因18264-18245之间的核苷酸，发现该区域含有具有结合功能的最少数目的核苷酸。在这些研究中使用的生物类型是SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank接受号为AY278491。因此，优选的引物C的结合序列包括一个与SARS冠状病毒聚合酶基因的介于18264-18245之间的核苷酸互补的DNA序列，其在图4中SEQ ID No.11中列出。需要注意的是通常SEQ ID No.11以5’-3’的方向书写。因此与病毒基因的结合方向就是从“后”向“前”。
作为一种选择，SARS冠状病毒聚合酶基因的18295-18314位核苷酸(SEQ ID No.12，图4)或18322-18304位核苷酸(SEQ ID No.13，图4)也可以作为引物C的结合目标。或者SEQ ID Nos 14或15可以作为引物C的结合目标。
为了本发明的目的，发现适合与引物D结合的SARS冠状病毒cDNA扩增产物的区域为介于SARS冠状病毒聚合酶基因18193-18211之间的核苷酸，发现该区域含有具有结合功能的最少数目的核苷酸。在这些研究中使用的生物类型是SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank接受号为AY278491。因此，优选的引物D的结合序列包括一个与SARS冠状病毒聚合酶基因的介于18193-18211之间的核苷酸互补的DNA序列，其在图4中SEQ ID No.16中列出。需要注意的是通常SEQ ID No.16以5’-3’的方向书写。
作为一种选择，SARS冠状病毒聚合酶基因的18219-18336位核苷酸(SEQ ID No.17，图4)或18205-18220位核苷酸(SEQ ID No.18，图4)也可以作为引物D的结合目标。或者SEQ ID Nos 19或20可以作为引物D的结合目标。
为了本发明的目的，发现适合与探针E结合的SARS冠状病毒cDNA扩增产物的区域为介于SARS冠状病毒聚合酶基因18217-18234之间的核苷酸，发现该区域含有结合功能的最少数目的核苷酸。在这些研究中使用的生物类型是SARS冠状病毒HKU-39849，GenBank接受号为AY278491。因此，优选的探针E的结合序列包括一个与SARS冠状病毒聚合酶基因的介于18217-18234之间的核苷酸互补的DNA序列，其在图4中SEQ ID No.21中列出。
作为一种选择，SARS冠状病毒聚合酶基因的18241-18260位核苷酸(SEQ ID No.22，图4)或18228-18246位核苷酸(SEQ ID No.23，图4)也可以作为探针E的结合目标。或者SEQ ID Nos 24或25可以作为探针E的结合目标。
通过合适的酶，例如Taq DNA聚合酶的作用以及加入核苷酸，引物C和D从3’端延伸形成双链产物(34)。在扩增过程中，探针E被DNA聚合酶的核酸外切酶活性置换和降解。这使得与扩增程度相关的并因此与扩增产物的浓度相关的荧光信号增加。RT-PCR扩增过程的产物是大量的并且每个都含有下述DNA序列的靶DNA分子：
(a)一个与最初SARS冠状病毒基因的一部分互补的DNA序列
TaqMan实时探针的序列可以是与由引物C和D界定末端的DNA扩增产物互补的任何区域。然而，探针序列不能重叠引物C和D，因为这将阻止扩增反应的发生。
增强实时PCR
这里将预扩增和实时PCR技术结合起来的技术称为“增强实时PCR”(ERT)。图3显示了使用PCR和RT-PCR结合方法扩增SARS冠状病毒RNA的原理示意图。
本新方法的显著特点是使用来自例如传统PCR或NASBA起始循环的预扩增的产物作为第二个RT-PCR循环的模板。这个结合技术提高了对SARS冠状病毒检测的灵敏度。任选，同样的引物可以使用在传统PCR和RT-PCR起始预扩增阶段。这个额外的预扩增步骤提高了对临床标本中的SARS冠状病毒的检测灵敏度。
表2列出了相应于GenBank CUHK AG03 AY 345988中SARS序列的引物序列。
SEQ ID NO 1：18323-18304
SEQ ID NO 2：18367-18348
SEQ ID NO 3：18389-18371
SEQ ID NO 6：18142-18160
SEQ ID NO 7：18110-18129
SEQ ID NO 8：18088-19107
SEQ ID NO 11：18249-18288(BNI TM SARS S2)
SEQ ID NO 12：18299-18280
SEQ ID NO 13：18307-18289
SEQ ID NO 16：18178-18196(DNA SA HUF)
SEQ ID NO 17：18204-18221(DNA SA HUT)
SEQ ID NO 18：18190-18205
SEQ ID NO 21：18202-18219
SEQ ID NO 22：18266-18245
SEQ ID NO 23：18213-18231
                   表2
SEQ ID Nos 4、9、14、19和24来源于SARS核壳蛋白(NP)基因，而SEQ ID Nos 5、10、15、20和25来源于SARS聚合酶(Pol)基因。
另外，本发明还涉及在制造检测生物或环境标本中SARS冠状病毒的试剂盒中第一和第二纯化和分离的DNA分子的应用，其中使用分离试剂从生物或环境标本中提取SARS冠状病毒的RNA分子；使用包括第一和第二纯化并分离的DNA分子的核酸复制试剂复制靶分子，，其中该靶分子包括：与至少SARS冠状病毒RNA序列一部分互补的核酸序列；与检测分子结合的核酸序列；使用核酸检测试剂对靶分子检测，其中核酸检测试剂包括检测分子。
优选地，靶分子是cDNA分子，尽管靶分子可以是RNA或其它核酸。第一纯化和分离的DNA分子可以包括与至少一部分SARS冠状病毒RNA序列结合的DNA序列，以便当第一纯化和分离的DNA分子与至少一部分SARS冠状病毒cDNA序列结合时，在酶和DNA核苷酸存在的情况下，第一纯化和分离的DNA分子延伸并产生一个包括与至少一部分SARS冠状病毒的RNA序列互补的DNA序列。
更优选第一DNA序列可以编码SEQ ID Nos 1、2、3、4或5所列出的DNA序列的任一，和SEQ ID Nos 6、7、8、9或10的任一。或者，第一DNA序列可以编码SEQ ID Nos 26和27所列出的DNA序列。
另外，核酸复制试剂可以包括第二纯化和分离的DNA分子，该分子包括与至少一部分SARS冠状病毒RNA序列结合的DNA序列，以便在酶和DNA核苷酸存在的情况下，当第二纯化和分离的DNA分子与包括与至少一部分SARS冠状病毒的RNA序列互补的DNA序列时，第二纯化和分离的DNA分子延伸并产生一个包括编码至少一部分SARS冠状病毒RNA序列的DNA序列。更优选该DNA序列可以编码SEQ ID Nos 11、12、13、14或15所列出的DNA序列的任意之一，以及SEQ ID Nos 16、17、18、19或20的任意之一。复制的DNA产物可以在进一步扩增之前进行第一次稀释。
检测分子可以包括编码SARS冠状病毒RNA序列至少一部分的DNA序列以便与靶分子结合，以及一个信号产生子。
信号产生子可以包括下述之一：荧光分子、分子信标、其他可以被刺激而释放可以被恰当的监测器检测和定量的光子的分子。优选的检测分子的DNA序列编码SEQ ID Nos 20-25所列出的DNA序列任意之一。
本发明将通过下述非限制实施例进行进一步的说明。值得注意的是在不超出本发明范围的情况下，可以对下述实施例和方法的各种改变和修改。
实施例
这里展开列出实施例所使用的组分和常规方法：
标本
从SARS患者处获得用于提取核酸的标本，并且这些标本由中国北京的医院提供。
A盒(核酸分离)
Qiagen RNeasyMini Kit核酸提取试剂盒
B盒(核酸扩增)
总混合物(Mastermix)(0.5ml)(购自Eurogentec)
含有具有dUTP的dNTPs(0.2Mm dATP，dCTP，dGTP和0.4mMdUTP)，
热启动(HotStart)Taq DNA聚合酶，氯化镁，尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)和被动参考(Possive Reference)。
SARS引物(20μl)
互补于与SARS相关冠状病毒的聚合酶基因的一部分区域的DNA寡聚核苷酸，并包括SEQ ID Nos 1-20和26及27。
SARS探针(10μl)
互补于与SARS相关冠状病毒的聚合酶基因的一部分区域的DNA寡聚核苷酸，并且该分子由荧光释放标记和荧光淬灭分子标记，而且包括SEQ ID Nos 21-25。
将0.2mM的每种SARS引物和0.24mM TaqMan SARS探针加入通用总混合物中。
SARS阳性对照(10μl)
含有SARS相关冠状病毒聚合酶基因的一部分区域的高纯化的且没有感染力的质粒。
试剂制备方法
A盒(核酸分离)
准备所需的足够数量的RNeasy的微型柱(每个标本一个)。根据要求准备(RNeasy试剂盒中均有提供)RLT缓冲液(每个标本0.4ml)，RW1缓冲液(每个标本0.7ml)和RPE缓冲液(每个标本0.5ml)并缓慢升温到室温。根据需要准备70％乙醇(每个标本0.4ml)和不含核酸酶的水(每个标本50μl)并缓慢升温到室温。
B盒(核酸扩增)
准备需要的总混合物、SARS引物、SARS探针、纯化的核酸模板(标本)和无核酸酶的水，并缓慢升温到室温。
核酸提取方法(Qiagen RNeasyMini Kit)
1.混合0.4ml标本和0.4ml RLT缓冲液
2.将0.4ml 70％乙醇加入试管
3.将0.6ml的溶液混合物加入RNeasy柱。轻轻盖上管并在约10000×g的条件下离心15s。流出液丢弃在2ml收集管中。重复步骤3。
4.将0.7ml RW1缓冲液加入RNeasy柱。轻轻盖上管并在约10000×g的条件下离心15s，以洗涤柱。弃掉流出液。
5.将0.5ml RPE缓冲液加入RNeasy柱并在约10000×g的条件下离心15s。弃掉流出液并重复步骤5。
6.柱再在约10000×g的条件下离心2分钟。
7.将RNeasy柱转移到一个新的1.5ml收集管中，50μl无RNA酶的水直接滴加到二氧化硅凝胶膜上并在室温孵育3分钟。
8.在约10000×g的条件下离心1分钟洗脱RNA。
9.获得核酸RNA。
测序方法
对扩增反应的产物进行测序以确保扩增产物是所需要的靶序列。使用商业上可获得的测序试剂盒(Applied Biosystems)并根据操作指南进行测序反应。通过使用373A测序***(Applied Biosystems)解析测序反应而获得DNA序列。使用从国家生物技术信息中心(NCBI)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST序列比对对DNA序列分析。
实施例1
使用PCR进行预扩增的增强实时PCR
PCR进行预扩增
在总体积为25μl的体系中，混合下述组分：无核酸酶的水，0.2mMdNTPs，1U Platimun Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，5mM氯化镁，1×PCR缓冲液，引物(10μl)和cDNA模板(大约100ng)。使用下述温度方式在MasterCycler(Eppendorf)中进行PCR扩增：
起始步骤                50℃，2min
DNA聚合酶活化           95℃，3-5min
40个循环                95℃，30sec
                        50℃，45sec
                        72℃，15sec
实时PCR
第一个PCR预扩增循环之后，使用产物的一部分作为模板进行下一步的RT-PCR扩增。
表3提供了混合的PCR组分的比例。
组分                   体积(μl)
无核酸酶水             7.8
总混合物               10
SARS引物               0.8
SARS探针               0.4
模板(100ng)            1
总体积                 20
                   表3
根据表4的扩增方式在RT-PCR设备(ABI 7700)执行扩增。
起始步骤                 50℃，2min
DNA聚合酶活化            95℃，10min
50个循环                 95℃，15sec
                         72℃，1min
表4实时PCR程序(ABI Prism 7700序列仪)
使用PCR的预扩增以及随后的RT-PCR方法检测SARS冠状病毒的结果出示在表5和6中。使用Pekin ElmerABI 310基因分析仪和上述的常规方法对DNA测序确认了结果。
对从SARS患者获得的核酸标本进行不同扩增方法的比对
通过试图对从不同患者标本提取的核酸进行扩增获得的结果在表5和6中出示。从SARS患者获得的标本由中国北京的医院提供。每个标本使用3种不同的方法检测：
I)传统PCR结合琼脂糖凝胶电泳，
Ii)实时TaqManPCR
Iii)最新描述的方法，使用预扩增步骤的增强RT-PCR。
使用与PCR预扩增相同的方法进行传统PCR。使用ERT方法中相同的方法进行实时TaqManPCR。
  标本编号   标本类型  传统PCR  实时PCR   增强RT-PCR   临床诊断
  123456789101112131415   白细胞鼻拭子咽喉拭子咽喉拭子血清鼻咽大便血清咽喉拭子尿尿鼻拭子大便血清尿  NEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGPOS  NEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGPOSNEG   POSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOS   SARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARSSARS
表5不同扩增和检测技术的结果
灵敏度研究的结果
提取冠状病毒的RNA并将其逆转录为cDNA。将该cDNA系列稀释并用表6中描述的方法检测。
  标本编号   稀释  传统PCR  实时PCR   增强RT-PCR
  1234567891011   10e-110e-210e-310e-410e-510e-610e-710e-810e-1010e-1110e-12  POSPOSPOSPOSNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEG  POSPOSPOSPOSPOSPOSNEGNEGNEGNEGNEG   POSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSPOSNEGNEG
表6：灵敏度研究
实施例2
使用PCR做预扩增的增强实时PCR
从120个诊断为疑似或可能为SARS病例的患者获得临床标本，使用传统PCR及其后的琼脂糖凝胶电泳、常规TaqMan实时PCR和根据本发明使用实施例1方法的增强TaqMan实时PCR方法对标本进行分析。
在ERT中，使用传统PCR从cDNA中扩增大约190bp的SARS冠状病毒聚合酶基因的片段。测序扩增产物并确认其相应于SARS冠状病毒所期望的区域。此PCR产物然后用作使用RT-PCR引物的增强实时PCR的模板。相比于使用标准实时方法检测有21/120(18.3％)和使用多种传统PCR方法检测仅有10.6％的患者为SARS冠状病毒阳性，使用此方法，有28/120(23.3％)患者标本被鉴定为阳性。在扩增过程的每一个阶段，使用合适的阴性、阳性和PCR抑制(PCR inhibition)对照。
图5-8出示了一个选择的标准方法和增强实时PCR对临床标本(检测)的数据。SARS冠状病毒阳性和阴性之间的清晰区别是显而易见的。(图5箭头所示)。当使用标准的实时PCR方法对同样的标本分析时，阳性信号和阴性信号之间的区别变得更加模糊不清，其中SARS冠状病毒阳性和阴性扩增曲线趋向于相互紧密重叠(图7)。使用ERT获得的增强结果更容易解释实时PCR的结果，以致容易区分阳性和阴性信号。相比于常规实时PCR，增强实时PCR方法对SARS冠状病毒阳性标本的循环时间(Ct)值得到降低。为了从标本中清楚的区分出含有SARS冠状病毒核酸，Ct值≤3.5是一个合适的取舍点。
灵敏度分析
通过系列稀释来自于SARS冠状病毒培养标本(2×102.5TCID50/ml)的总核酸提取物而检测各种扩增方法的检测极限，该病毒来自香港一患者。传统PCR、标准实时PCR和增强实时PCR方法的检测极限分别是2×10-5.5TCID50/ml、2×10-10.5TCID50/ml(图1D)和2×10- 12.5TCID50/ml(图1C)。因此，增强实时PCR至少比标准实时PCR灵敏102倍，而比目前用作SARS冠状病毒分子检测的任何一种传统PCR技术灵敏107倍。通过病毒培养进行SARS冠状病毒检测可能是灵敏度最低的方法，对于被培养的SARS冠状病毒，使用增强实时PCR仅仅检测出3/28(10.7％)例为阳性。
发现在一些病例中，增强实时PCR检测SARS冠状病毒阳性的标本无法用其它任何方法确认。因此，任何提高诊断精确性的新的检测方法是对临床医生能获得的所有诊断工具的有价值的补充。单独使用传统PCR和实时PCR可检测较少的SARS冠状病毒阳性病例。在3/28病例中使用病毒培养已经确认了结果。增强实时PCR的检测极限比标准实时PCR高102倍，而比传统PCR方法高107倍。该方法提高的灵敏度可以帮助控制在将来SARS爆发时的疾病传播。
实施例3：
使用NASBA做预扩增的增强实时PCR
(i)NASBA反应
NASBA的试剂混合物的成分(终浓度)
SARS引物对           0.2mM(SEQ ID NOS 26和27)
Tris-Cl，Ph8.5       40mM
MgCl2                12mM
KCl                  70mM
DTT                  5mM
DMSO                 10％
dNTPs                每种1mM
NTPs                 每种2mM
NASBA的酶混合物的成分(终浓度)
BSA                  0.1mg/ml
T7 RNA聚合酶         30个单位
逆转录酶             8个单位
RNase H              0.1个单位
NASBA反应混合物
5μl             RNA标本
0.83μl          SARS引物混合(10μM)
6.67μl          试剂混合物
1.33μl          KCl
1.17μl          水
15μl            总体积
反应混合物在65℃孵育5分钟，然后冷却到41℃5分钟。然后将5μl酶混合物(对于lenzyme sphere总共55μl)加入到反应混合物。简单混合后，冷却到41℃孵育5分钟。反应混合物瞬时离心然后在41℃孵育1.5小时。
(ii)TaqMan实时PCR
紧接着NASBA预扩增的第一个循环，使用NASBA的产物作为模板进行RT-PCR扩增。
TaqMan反应混合物
2.0μl           模板
1.6μl           引物和探针混合物(10μM)
10μl            通用混合物(2×)
8.9μl           DEPC-水
20μl            总体积
热循环程序：
50℃             2分钟
95℃             10分钟
40个循环：95℃   15秒
58℃             1分钟
NASBA增强实时PCR结果：
如表7、8和9所示，发现冠状病毒NASBA的产物可以被TaqMan实时PCR成功的扩增和检测。
  标本   NASBA读数   标本   NASBA读数
  RSTCID50 10-2(2×100.5)TCID50 10-4(2×10-1.5)TCID50 10-6(2×10-3.5)TCID50 10-7(2×10-4.5)TCID50 10-8(2×10-5.5)TCID50 10-9(2×10-6.5)TCID50 10-10(2×10-7.5)   3457499266015666321000000123824947407415341   TCID50 10-11(2×10-8.5)TCID50 10-12(2×10-9.5)TCID50 10-13(2×10-10.5)TCID50 10-14(2×10-11.5)TCID50 10-15(2×10-12.5)NASBA阴性阴性   401355411355506352142
表7：使用电化学发光(ECL)方法检测NASBA产物
  标本   Ct值   标本   Ct值
  TCID50 10-2 (2×100.5)TCID50 10-4(2×10-1.5)TCID50 10-6(2×10-3.5)TCID50 10-7(2×10-4.5)TCID50 10-8(2×10-5.5)TCID50 10-9(2×10-6.5)TCID50 10-10(2×10-7.5)   11.2914.1210.798.307.164040   TCID50 10-11(2×10-8.5)TCID50 10-12(2×10-9.5)TCID50 10-13(2×10-10.5)TCID50 10-14(2×10-11.5)TCID50 10-15(2×10-12.5)阴性   404040404040
表8：NASBA-TaqMan实时PCR
  标本   Ct值   标本   Ct值
  TCID50 10-3(2×10-0.5)TCID50 10-4(2×10-1.5)TCID50 10-5(2×10-2.5)TCID50 10-6(2×10-3.5)TCID50 10-7(2×10-4.5)TCID50 10-8(2×10-5.5)TCID50 10-9(2×10-6.5)   25.9932.824040404040   TCID50 10-10(2×10-7.5)TCID50 10-11(2×10-8.5)TCID50 10-12(2×10-9.5)TCID50 10-13(2×10-10.5)TCID50 10-14(2×10-11.5)TCID50 10-15(2×10-12.5)阴性   40404040404040
表9：常规实时PCR
发现NASBA-TaqMan PCR的反应条件需要最优化。NASBA-TaqMan PCR的灵敏度与常规NASBA方法的灵敏度相似，大约为TCID502×10-5.5。表7(NASBA ECL结果)表明其检测可以低至TCID 50×10-8，这同样是NASBA TaqMan PCR(ERT)的检测极限。然而，读数是7407的NASBA ECL结果显著不同于其它阳性信号(通常超过百万值)。因此，在实际情况中，这个结果不能轻易的判断为阳性。然而，对于NASBA实时PCR(ERT)，Ct为7.16的结果与其它阳性信号相似。因此，相比于常规NASBA方法，我们的NASBA实时PCR(ERT)仍然具有优势。
如上述实施例所示，可以明白检测试剂盒能方便的使用在多种试验基地。另外，检测试剂盒比存在的方法相对更容易使用，而且可以在较短的时间内提供检测结果，如果需要，检测结果可以在3小时内获得。由于其为基于DNA的检测***，所以可以增强其特异性和灵敏度，在实施例中描述的检测试剂盒是特异用于SARS冠状病毒的检测，并且由于病毒能被复制为用于检测的靶分子，所以标本中的SARS冠状病毒的含量不再重要。
尽管在前面内容描述了本发明的优选实施方案，对于本领域技术人员应该明白在本发明范围内对本发明的修改和版本更新是可能的，这些修改和更新仍在本发明的范围内，且在权利要求中阐明。另外，实施例和图表不能限制对本发明实施方案的解释。
                         序列表
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<120>核酸检测
<130>FP5260
<150>GB 0310181.3
<151>2003-05-02
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>1
accagtcggt acagctacta                                           20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>2
gcattaactc tggtgaattc                                           20
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>3
ctggtcacct ggtggaggt                                            19
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>4
gcgctaacaa agaaggcatc                                          20
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>5
ggattatgtg ttgacatacc ag                                       22
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>6
attaccaagt caatggttag ggt                                      23
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>7
tagactcatc tctatgatgg                                          20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>8
taccaaagga catgacctac                                          20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>9
ccttgttgtt gttggccttt                                            20
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>10
ccagtcggta cagctactaa gt                                         22
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>11
ctctagttgc atgacagccc                                            20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>12
aacacctgta gaaaatccta                                            20
<210>13
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>13
actaagttaa cacctgtag                                             19
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>14
gcggcagtca agcctcttc                                             19
<210>15
<211>18
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>15
cccgcgaaga agctatcg                                              18
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>16
cccgcgaaga agctattcg                                             19
<210>17
<211>18
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>17
cgtgcgtgga ttggcttt                                              18
<210>18
<211>16
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>18
ctattcgtca cgttcg                                                16
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>19
tgctgccagg agttgaattt c                                           21
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>20
cgtgcgtgga ttggcttt                                               18
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>21
ttcgtgcgtg gattggct                                               18
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>22
tagagggctg tcatgcaact                                             20
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>23
attggctttg atgtagagg                                              19
<210>24
<211>29
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>24
cgctcctcat cacgtagtcg ctgtaattc                                    29
<210>25
<211>16
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>25
ctattcgtca cgttcg                                                  16
<210>26
<211>56
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>26
aattctaata cgactcacta tagggagaag gagctggaga ggtaggttag taccca      56
<210>27
<211>42
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒
<400>27
gatgcaaggt cgcatatgag taccgtagac tcatctctat ga                     42

Claims (41)

1.一个包括任何SEQ ID Nos 1-27的分离的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括任何SEQ ID Nos 1-27。
3.根据权利要求1或2所述的分离的DNA序列在DNA扩增中的应用。
4.根据权利要求3所述的分离的DNA序列作为引物或探针的应用，其中该探针可以被荧光标记。
5.一种核酸检测方法，该方法包括核酸分离步骤，及其后的核酸扩增和实时PCR步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的核酸扩增包括PCR、NASBA或任何其它的核酸扩增技术。
7.根据权利要求5或6所述的核酸检测方法，其特征在于，所述的实时PCR使用荧光标记探针。
8.根据权利要求5-7的任何一项所述的方法，其中被检测的核酸是DNA或cDNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的核酸是SRAS冠状病毒的cDNA。
10.根据权利要求5-9任一项所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：
i)从生物或环境标本中提取核酸；
ii)扩增核酸，任选使用PCR，NASBA或其它任何核酸扩增技术；
iii)使用实时PCR扩增和检测步骤(ii)的核酸产物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，如果获得的核酸是RNA，则在步骤(i)之后有一附加步骤，其中该步骤包括使用逆转录酶将该RNA逆转录为cDNA。
12.根据权利要求5-11任一项所述的方法，其特征在于，所述的引物和/或探针在步骤(ii)和(iii)中使用。
13.根据权利要求12所述的用于诊断SARS冠状病毒cDNA的方法，其特征在于，所述的引物和/或探针与SARS冠状病毒cDNA的至少一部分结合。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，其中所使用的引物和探针对应于包括SEQ ID Nos 1-27的分离的DNA序列。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(iii)中使用的引物不与探针重叠。
16.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(ii)中使用的引物对对应于任何SEQ ID Nos 1、2、3、4或5，以及6、7、8、9或10。
17.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤(ii)中使用的引物对对应于任何SEQ ID Nos 26和27。
18.根据权利要求14或15所述的方法，其中在步骤(iii)中使用的引物对对应于任何SEQ ID Nos 11、12、13、14或15；以及16、17、18、19或20。
19.根据权利要求16-18任一所述的方法，其中在步骤(iii)中使用的探针对应于任何SEQ ID Nos21、22、23、24或25。
20.根据权利要求1所述的分离的DNA序列在检测核酸方法中的应用。
21.用于权利要求20所述的应用中的分离DNA序列，其中核酸是SARS冠状病毒RNA或cDNA。
22.根据权利要求1所述的分离的DNA序列在制备用于检测核酸的方法中的组合物的应用，该方法包括下述步骤：
i)从生物或环境标本中提取核酸；
ii)扩增核酸，任选使用PCR，NASBA或其它任何核酸扩增技术；
iii)使用实时PCR扩增和检测步骤(ii)的核酸产物。
23.根据权利要求22所述的应用，其中核酸是DNA或cDNA。
24.根据权利要求23所述的应用，其中核酸是SARS冠状病毒的cDNA。
25.SARS冠状病毒的特异引物在制备用于检测病毒感染的诊断试剂盒中的应用，其中病毒是SARS冠状病毒，引物包括SEQ ID Nos1-27。
26.一种SARS诊断试剂盒，其包括两个或多个对应于SEQ ID Nos1-27的分离的DNA序列。
27.根据权利要求26所述的SARS诊断试剂盒，其包括对应于任何SEQ ID Nos 1、2、3、4或5，以及6、7、8、9或10的引物。
28.根据权利要求26所述的SARS诊断试剂盒，其包括对应于任何SEQ ID Nos 26和27的引物。
29.根据权利要求26-28任一项所述的SARS诊断试剂盒，其包括对应于任何SEQ ID Nos11、12、13、14或15，以及16、17、18、19或20的引物。
30.根据权利要求29所述的SARS诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括对应于任何SEQ ID Nos 21、22、23、24或25的探针。
31.一个检测生物或环境标本中的SARS冠状病毒的诊断试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：
(i)用于从标本中分离SARS冠状病毒RNA的分离试剂；
(ii)用于复制靶分子的核酸复制试剂，其中的靶分子包括：与SARS冠状病毒的RNA序列的至少部分区域互补的核酸序列；
(iii)用于检测靶分子的核酸检测试剂，其中的核酸检测试剂包括检测分子。
32.根据权利要求31所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的靶分子是cDNA分子。
33.据权利要求31或32所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的核酸复制试剂包括一个第一纯化和分离的DNA分子，其包括与SARS冠状病毒RNA序列的至少一部分结合的DNA序列，以便当第一纯化和分离的DNA分子与SARS冠状病毒的cDNA序列的至少一部分结合时，在酶和DNA核苷酸存在的情况下，第一纯化和分离的DNA分子延伸并产生一个包括与SARS冠状病毒的cDNA序列的至少一部分互补的DNA序列。
34.根据权利要求31-33任一项所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的第一DNA序列即编码任一列出的SEQ ID Nos1、2、3、4或5的DNA序列，又编码任一列出的SEQ ID Nos 6、7、8、9或10的DNA序列，或者SEQ ID Nos 26和27。
35.根据权利要求31-33任一所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的核酸复制试剂包括一个第二纯化和分离的DNA分子，其包括与由第一个扩增循环产生的SARS冠状病毒DNA序列的至少一部分结合的DNA序列，以便当第二纯化和分离的DNA分子与SARS冠状病毒的cDNA序列的至少一部分结合时，在酶和DNA核苷酸存在的情况下，第二纯化和分离的DNA分子延伸并产生一个包括与在第一个扩增循环产生的SARS冠状病毒的cDNA序列的至少一部分互补的DNA序列。
36.根据权利要求32-33任一项所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的第二DNA序列即编码任一列出的SEQ ID Nos11、12、13、14或15的DNA序列，又编码任一列出的SEQ ID Nos 16、17、18、19或20的DNA序列。
37.根据权利要求31-36任一项所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其中复制的DNA产物在作进一步扩增之前首先进行稀释。
38.根据权利要求31-37的任一项所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，其中检测分子包括：编码至少一部分与SARS冠状病毒的RNA序列互补并用于和靶分子结合的DNA序列，以及一个信号产生子。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其特征在于，其中第一DNA分子的DNA序列不与第二DNA分子重叠。
40.根据权利要求36或39所述的试剂盒，其特征在于，所述的信号产生子包括下述之一：荧光分子、分子信标、或其他的可以被刺激并释放使用合适探测器能够检测和定量的光子的分子。
41.根据权利要求38-40任一项所述的检测SARS冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述的检测分子编码任一的SEQ ID Nos 21-25的DNA序列。
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