KR20100089060A

KR20100089060A - 전자 현미경으로 핵산 중합체를 시퀀싱하는 방법

Info

Publication number: KR20100089060A
Application number: KR1020107008686A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 안드레그; 마이클 안드레그
Original assignee: 할싸이언 몰레큘러
Priority date: 2007-10-04
Filing date: 2008-10-06
Publication date: 2010-08-11
Also published as: US20100267156A1; ZA201002881B; WO2009046445A1; CA2701726A1; AU2008308457A1; US8153438B2; US20100268478A1; EA201000427A1; CN101889074A; US20100267152A1; US20100267155A1; MX2010003724A; EP2203547A1; JP2010539991A; US20100267157A1; IL204866A0; US20100267153A1; EP2203547A4; US20100267154A1; US20100331195A1

Abstract

본 발명은, 전자 현미경을 이용하여 라벨링되고 신장된 DNA의 직접 관찰에 의한 시퀀싱 방법에 관한 것이다. 이 방법은 현재 DNA 시퀀싱 방법보다 더 정확하고, 비용이 적게 들며, 판독 길이도 더 길다.

Description

전자 현미경으로 핵산 중합체를 시퀀싱하는 방법{SEQUENCING NUCLEIC ACID POLYMERS WITH ELECTRON MICROSCOPY}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 2007년 10월 4일자로 출원된 미국 가특허 출원 US 제 60/997,427호와 2008년 6월 23일자로 출원된 미국 가특허 출원 제 61/132,960호를 우선권으로 주장하고, 이들 출원 내용은 참조로 포함된다.

본 발명은, 핵산을 시퀀싱(sequencing)하는 방법에 관한 것이다.

현재 DNA 시퀀싱은 대부분 Sanger 방법 및 기타 시퀀싱-합성 방법에 의해 이루어진다. 이들 방법은 고비용, 판독 길이의 짧음, 불충분한 산출량의 문제점을 갖는다.

전자 현미경을 이용한 시퀀싱도 연구되었다. 전자 현미경에 의한 시퀀싱의 개념은 새롭지 않다. 전자 현미경에 의한 시퀀싱의 개념은 DNA 구조가 밝혀진 후 불과 6년 만에 Richard Feynman이 제안한 것이다. 그러나, 의미있는 서열 정보를 만드는데 있어서 성공한 적이 없었다.

투과형 전자 현미경(transmission electron microscopy)(TEM)은 샘플을 통하여 전자빔(electron beam)을 보내고, 감지기 또는 스크린상에서 작업된다. 샘플내 일부분들이 빔을 방해하거나 편향시켜, 감지기에 도달하는 전자들의 패턴으로 이미지가 형성되게 된다. 대부분 경우, 원자가(Z)가 낮은 원자들은 거의 조영(contrast)을 만들지 않고, 전자 현미경에서도 기본적으로 볼 수 없다. Z-가 낮은 수소, 탄소, 질소, 산소 및 인을 포함하는 통상의 DNA는 전자 현미경에서 거의 조영을 나타내지 않으며, 지지 배경을 두고도 거의 보는 것이 불가능하다. 현재 전자 현미경 기술을 이용하여 DNA가 보이도록 하기 위해서는 염기에 Z가 높은 원자로 라벨링되거나, TEM으로 감지될 수 있다.

전자 현미경을 이용한 시퀀싱의 의미있는 첫 번째 작업은 Beer, M. and Moudrianakis, E.N, 48(3) PNAS 409~416(1962)에 의해 이루어졌다. 그의 초기 작업은 DNA를 위한 중 원자 라벨(heavy atom label)에 초점을 두었으며, 전자 현미경에서 중 원자를 보려고 시도하였다. 추후 작업 및 아마도 현재까지 최고의 그 밖에 다른 작업은 Whiting과 Ottensmeyer에 의한 것이다. Ottensmeyer의 보고에서 "티민, 아데닌, 구아닌용 중 원자 마커가 개발되었고, 모델 서열에 시도되었으며, 전자 현미경 및 화학이 더 이상의 주요 장애 요소는 아니지만, 표본 준비만이 장애 요소가 된다는 것이었다. 마크가 붙은 단일-가닥 핵산 중합체의 견본 지지 상에 통제되지 않는 방식으로 배치됨으로써 다소 불균일한 염기간 공간이 초래되었다. 따라서, 단일 분자의 용이하고 정확한 판독이 불가능한 것으로 되어있다. Ottensmeyer, F. P. (1979), "Molecular Structure Determination by High Electron Microscpoy" Ann . Rev . Biophys . Bioeng . 9129: 129~144 (Internal references omitted).

개별 게놈 및 기타 서열을 신속하게 서열화하는 능력을 보유하는 것이 생의학적으로 상당히 중요하며, 앞에서 언급한 바와 같이, 개선 방법이 요구된다.

본 발명에는 전자 현미경을 이용하여 라벨링되고, 신장된 DNA와 같은 핵산의 직접 검사를 통하여 서열화하는 방법이 기재되어 있다. 본 발명의 방법, 장치, 그리고 조성물로 기질에 핵산이 통제 가능하게 배치될 수 있도록 하여 염기간 공간이 일관되어 전자 현미경을 이용하여 정확한 핵산 시퀀싱 정보가 얻어진다. 본 발명은 여러 방식으로 실시될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법에는 DNA 염기들이 염기 특이성 또는 염기 선택성을 갖는 조영제(contrast agent)로 라벨링된 DNA 중합체 가닥이 포함된 용액이 제공되며; DNA 결합 수단(tool)이 용액으로 도입되어 수단 상에 DNA 중합체 단편이 결합되고; 용액으로부터 수단을 빼내고; 라벨링된 DNA 중합체 가닥은 공기/용매 경계면과 상기 수단 사이에 부유되도록 공간으로 신장되고; 기질에 신장된 라벨링 DNA 중합체 가닥이 증착되며; 전자 현미경을 이용하여 라벨링된 DNA 중합체 가닥이 영상화되고, 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되며; 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치를 DNA 중합체 서열과 서로 관련시키는 단계가 포함된다.

이 방법에는 조영제로 DNA를 라벨링하기 전 단일 가닥 DNA를 만들기 위해 DNA 가닥을 변성시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 변성 단계는 열 변성 또는 화학적 변성에 의해 실시된다. 이 방법에는 또한 영상화 단계 전 기질에 부착된 라벨링된 DNA 중합체 가닥의 상부에 탄소 층을 증착시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 이 방법에는 또한 서로 다른 라벨로 라벨링된 DNA 중합체 샘플로부터 다중 가닥을 라벨링하는 단계와 완전한 서열 정보를 얻기 위해 DNA 중합체 다중 가닥의 영상으로부터 얻어진 데이터를 편집시키는 단계가 더 포함된다.

DNA는 약 100kb 이상의 큰 분자량의 DNA일 수 있다. 신장 단계로 DNA 중합체 가닥에 일관된 염기간 공간이 초래될 수 있다. 염기에서 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 액 7Å 범위 내에 있을 수 있고, 좀더 특이적으로는 약 5Å일 수 있다. DNA 중합체 가닥은 적어도 약 2㎛의 길이로 신장될 수 있다.

DNA 중합체 염기의 부분집합(subset)만이 라벨링될 수 있다. 염기의 부분집합에는 티민과 시토신이 포함된다. 염기의 부분집합에는 아데닌 및 구아닌이 포함된다.

상기 수단(tool)은 바늘이 될 수 있는데, 바늘의 팁(tip)은 DNA 중합체 가닥에 결합되는 제 1 코팅으로 기능화되었다. 바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC 또는 실리콘으로 만들어질 수 있다. 코팅은 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 및 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물이 될 수 있다. 바늘은 핵산에 결합되지 않는 제 2 코팅으로 기능화될 수 있다. 제 2 코팅은 옥탄티올, 헥산티올, 노난티올(nonanethiol), 데칸티올(decanethiol), 그리고 셉탄티올(septanethiol) 중 적어도 하나일 수 있다. 바늘의 팁은 약 200nm 미만의 곡률 반경(radius of curvature)을 갖는다. 바늘은 초당 약 1nm 내지 약 100m의 속도로 용액 안과 밖으로 움직일 수 있다. 특히, 바늘은 약 1Å 내지 약 20㎛ 범위의 깊이로 용액 안으로 들어갈 수 있을 것이다.

조영제(contrast agent)는 Z 번호가 큰 원자 라벨링 화합물일 수 있다. Z번호가 큰 원자는 Os-bipy, 아세트산 수은(mercuric acetate) 및 디메틸설폭시드 백금일 수 있다. 조영제는 Z 번호가 큰 원자 클러스터(cluster) 라벨일 수 있다.

DNA 중합체 가닥은 셸프 트레딩(shelf threading)을 이용하여 기질에 부착될 수 있다. DNA 중합체 가닥은 지지 기질 또는 영상 기질에 부착될 수 있다. DNA 중합체 가닥은 셸프 트레딩을 이용하여 지지 기질에 부착된 후, 이동 프린팅(transfer printing)을 이용하여 지지 기질에 부착된 라벨링된 DNA 중합체 가닥이 영상 기질로 이동된다. DNA 중합체 가닥은 갭 트레딩(gap threading)에 의해 지지 기질에 부착되며, 후속적으로 스와이프 프린팅(swipe printing)에 의해 영상 기질로 이동된다. DNA 중합체 가닥은 다중 DNA 중합체 가닥일 수 있으며, 기질에 평행인 가닥 배열로 배치될 수 있다. 신장된 라벨 DNA 중합체 가닥은 단일 가닥일 수 있다.

발명의 한 측면에서, 핵산 서열 정보를 얻는 방법에는 전자 현미경으로 복수의 라벨링된 핵산 가닥 각각에서 적어도 1000개 연속 염기 부위 내 핵산 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되는 것이 포함된다. 특히, 핵산 가닥의 1000개 연속 염기의 위치가 결정되는데, 좀더 특별하게는 핵산 가닥의 10,000개 연속 염기의 위치가 결정된다.

적어도 약 20개 개별 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정될 수 있고, 적어도 약 100개 다중 가닥의 위치가 결정될 수 있으며, 적어도 약 5,000개 다중 가닥의 위치가 결정될 수 있으며, 그리고 적어도 약 10,000개 다중 가닥의 위치가 결정될 수 있다. 동일한 샘플 내 상이하게 라벨링된 핵산 중합체 가닥의 위치들도 결정될 수 있다. 적어도 200개 연속 염기, 적어도 500개 연속 염기, 적어도 1000개 연속 염기, 또는 적어도 10,000개 연속 염기의 상이하게 라벨링된 핵산 중합체 가닥의 위치들이 결정된다.

핵산 서열은 초당 적어도 1,000개 염기의 속도로 얻어질 수 있다. 핵산 가닥은 연장되었을 때 적어도 약 100㎛의 길이를 가질 수 있다. 핵산에서 염기-염기 공간은 염기간 약 3Å 내지 약 7Å, 특히 약 5Å 내에 있을 수 있다. 핵산 서열은 DNA 서열일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 제조 물품에는 복수의 핵산 중합체 가닥을 보유하는 액체, 수단(tool), 그리고 액체 내에 제 1 단부(end)가 있고, 수단에 부착된 제 2 단부가 있는 단일 핵산 중합체 가닥이 포함될 수 있는데, 이때 단일 핵산 중합체 가닥의 적어도 일부분은 수단과 액체 사이의 공간에 부유되어 있다. 핵산 중합체 가닥의 염기는 염기-염기 공간이 일정하도록 신장된다. 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å 범위 내에 있다. 핵산 중합체 가닥은 가닥이 선형이 되도록 신장될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 제조 물품에는 고형 평면 기질, 평면 기질에 배치된 적어도 하나의 연장된 핵산 중합체 가닥이 포함될 수 있다. 적어도 하나의 길게 연장된(elongated) 핵산 중합체 가닥은 약 1000개 염기쌍 길이에 걸쳐 일관된 염기-염기 공간을 갖는다. 제조 물품에는 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체의 상단에 배치된 필름이 더 포함되는데, 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체는 평면 기질과 필름 사이에 끼워져 있다. 필름은 탄소 또는 Z 번호가 낮은-원소로 구성될 수 있다. 평면 기질은 PDMS, 탄소, 붕소, 리튬, 수소, 베릴륨, 알루미늄, 질화물(nitrides), 산화 질화물(nitride oxides), 그리고 이들의 복합물로 구성될 수 있다.

적어도 하나의 길게 연장된 핵산 가닥의 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å 범위 내에 있다. 복수의 길게 연장된 핵산 가닥은 서로 실질적으로 평행일 수 있다. 복수의 길게 연장된 핵산 가닥에는 약 1 × 10⁶ 핵산 가닥이 포함될 수 있다. 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 가닥은 적어도 약 2㎛ 길이가 되도록 신장될 수 있다. 적어도 하나의 핵산 중합체 가닥은 적어도 하나의 Z-라벨링 화합물로 라벨링될 수 있다. Z-라벨링 화합물은 Z 번호가 큰 원자 라벨링 화합물, 예를 들어, Os-bipy, 아세트산 수은, 디메틸설폭시드 백금, 또는 클러스터 라벨링일 수도 있다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 전자 현미경을 이용하여 핵산 가닥의 적어도 200개 연속 염기를 시퀀싱하는 방법에는 적어도 하나의 Z-라벨링 화합물로 복수의 핵산 가닥이 라벨링되고; 복수의 라벨링된 핵산 가닥을 포함하는 용액으로부터 단일 라벨링된 핵산 가닥이 수단 상에 결합되고; 단일 라벨링된 핵산 가닥을 신장하여, 핵산의 단일 라벨링된 가닥이 공기/용매 경계면과 수단의 팁(tip) 사이에 부유되도록 하고; 신장된 라벨링 핵산이 기질에 부착되고, 그리고 전자 현미경을 이용하여 라벨링된 핵산 가닥이 영상화되는 단계가 포함될 수 있다.

이 방법에는 라벨링 단계 전에, 복수의 핵산 가닥이 포함된 용액이 중아황산염(bisulfite)으로 선처리되어 메틸화되지 않은 시토신 염기를 우라실 염기로 변환시키는 단계가 더 포함될 수 있다. 이 방법에는 라벨링 단계 전 복수의 핵산 가닥을 단일 가닥 핵산으로 만들기 위한 변성 단계가 포함될 수 있다. 변성 단계는 열 변성 또는 화학적 변성을 통하여 실시될 수 있다. 이 방법에는 또한 영상화 단계 전 기질에 부착된 라벨링된 핵산 가닥의 상부에 탄소 층을 증착시키는 단계가 포함될 수 있다.

핵산은 고분자량 DNA일 수 있다. 신장 단계에 의해 핵산 가닥에 일관된 염기-염기 공간을 갖는다. 염기-염기 공간 및 라벨-라벨 공간은 약 3Å 내지 약 7Å, 특히 약 5Å 내에 있을 수 있다. 핵산 가닥은 적어도 약 25㎛ 길이가 되도록 신장될 수 있다. 핵산 가닥의 부분집합(subset)만이 라벨링된다. 염기 부분집합에는 티민과 시토신이 포함될 수 있다. 염기의 부분집합에는 아데닌 및 구아닌이 포함될 수 있다.

수단은 바늘의 팁은 핵산 가닥에 결합되는 제 1 코팅으로 기능화된 바늘이 될 수 있다. 유리, 금, 텅스텐, 폴리메틸 메틸아크릴레이트 (PMMA), 폴리스티렌, PVC 그리고 실리콘과 같은 물질로 바늘이 제조될 수 있다. 코팅은 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 그리고 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물이 될 수 있다. 바늘은 핵산에 결합되지 않는 제 2 코팅으로 기능화될 수 있다. 제 2 코팅은 옥탄티올, 헥산티올, 노난티올, 데칸티올 및 셉탄티올와 같은 화합물이 될 수 있다.

바늘의 팁은 약 200nm 미만의 직경을 가질 수 있다. 바늘은 초당 약 1nm 내지 약 100m의 속도로 용액 안과 밖으로 움직일 수 있다. 특히, 바늘은 약 0nm 내지 약 20㎛ 범위의 깊이로 용액 안으로 들어갈 수 있을 것이다.

적어도 하나의 라벨링 화합물은 Z 번호가 큰 원자 라벨링 화합물이 될 수 있다. Z 번호가 큰 원자는 Os-bipy, 아세트산 수은, 그리고 디메틸설폭시드 백금과 같은 하나 이상의 화합물이 될 수 있다. 적어도 하나의 라벨링 화합물은 Z 번호가 큰 원자 클러스터 라벨이 될 수 있다.

부착(attaching) 단계에는 셸프 트레딩을 이용하여 적어도 하나의 라벨링된 핵산 가닥이 영상 기질에 부착되는 것이 포함될 수 있다. 부착 단계에는 셸프 트레딩에 의한 적어도 하나의 라벨링된 핵산 가닥이 지지 기질에 부착되고, 이어서 이동 프린팅에 의해 지지 기질상의 적어도 하나의 라벨링된 핵산 가닥이 영상 기질로 이동하는 단계가 포함될 수 있다. 부착 단계에는 갭 트레딩에 의해 적어도 하나의 라벨링된 핵산 가닥이 지지 기질에 부착되고, 이어서 스와이프 프린팅에 의해 지지 기질상의 적어도 하나의 라벨링된 핵산 가닥이 영상 기질로 이동하는 단계가 포함될 수 있다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 기질 상의 적어도 하나의 핵산 가닥이 제어된 방식으로 배치되는 방법에는 복수의 핵산 가닥을 포함하는 용액이 제공되며; 용액으로 바늘 팁이 삽입되어, 핵산에 결합되는 제 1코팅으로 기능화된 바늘 팁이 복수의 핵산 가닥이 포함된 용액 밖으로 끌어 당겨지고; 핵산 가닥은 빈 공간으로 신장되어 핵산의 단일 가닥이 공기/용매 경계면과 바늘의 각 팁 사이에 부유되며; 적어도 하나의 신장된 핵산 가닥이 기질에 부착되는 단계가 포함될 수 있다. 핵산은 고분자량 DNA다.

바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 및 실리콘과 같은 물질로부터 제조될 수 있다. 제 1 코팅은 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 그리고 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물일 수 있다. 바늘은 핵산에 결합되지 않는 제 2 코팅으로 기능화될 수 있다. 제 2 코팅은 옥탄티올, 헥산티올, 노난티올, 데칸티올, 그리고 셉탄티올와 같은 화합물일 수 있다.

바늘의 팁은 약 200nm 미만의 곡률 반경(radius of curvature)을 갖는다. 바늘의 팁은 초당 약 1nm 내지 약 100m의 속도로 용액 안과 밖으로 움직일 수 있다. 바늘의 팁은 약 10nm 내지 약 20㎛ 범위의 깊이로 용액 안으로 들어갈 수 있을 것이다. 바늘은 나노포지셔너(nanopositioner)-구동 지지체 상에 배치될 수도 있다. 복수의 바늘이 나노포지셔너 구동 지지체와 동시에 용액 안으로 삽입될 수 있다.

신장 단계(stretching step)로 핵산 가닥 내 일관된 염기-염기 공간이 형성된다. 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å 범위 내가 될 수 있다. 염기-염기 공간과 라벨-라벨 공간은 약 5Å가 될 수 있다. 핵산은 약 100㎛의 길이가 되도록 신장될 수 있다.

기질에 부착된 적어도 두 개의 핵산 가닥은 서로 실질적으로 평행하도록 방향을 잡고 있다. 부착 단계에는 셸프 트레딩을 이용하여 적어도 하나의 핵산 가닥이 기질에 부착되는 단계가 포함된다. 부착 단계에는 갭 트레딩에 의해 적어도 하나의 핵산 가닥이 기질에 부착되는 단계가 포함될 수 있다. 기질은 영상 기질일 수 있다. 부착 기질 내 기질은 지지 기질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 메모리 내 저장된 핵산 서열을 분석하는 방법에는 적어도 하나의 라벨링 화합물로 복수의 핵산 가닥이 라벨링되고; 복수의 라벨링된 핵산 가닥을 포함하는 용액으로부터 단일 라벨링된 핵산 가닥이 수단 상에 결합되고; 단일 라벨링된 핵산 가닥이 공간으로 신장되어 핵산의 단일 라벨링된 가닥이 공기/용매 경계면 및 수단의 팁 사이에 부유되며; 신장된 라벨 핵산이 기질에 부착되며, 그리고 전자 현미경에 의해 라벨링된 핵산 가닥이 영상화되는 단계들에 의해 서열이 결정되었다. 핵산 서열은 인간 개체의 게놈 서열이다.

상기 분석에는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphisms), 복사체 수, 변이체, 삽입-결실(indels), 재배열중 하나 이상의 유무, 또는 전체 게놈 비교를 결정하는 단계가 포함될 수 있다. 상기 메모리는 하드 또는 플로피 디스켓, 광학 매체, 콤팩트 디스크(CD), 디지털 비디오 디스크(DVD), 반도체 매체 및 플래시 메모리로 이루어진 군에서 선택된 매체가 된다.

본 발명의 추가 측면에 따르면, 바늘에는 말단부(distal end), 인접 단부(proximal end) 그리고 양단을 이어주고, 유체가 양단을 통과하게 되는 샤프트(shaft)가 포함되고, 전단은 곡률 반경이 약 200nm 미만이며, 핵산의 단부에 결합하는 화합물로 기능화된 팁(tip) 부분이 포함된다. 바늘은 핵산에 결합되는 친화력을 보유하지 않는 제 2 화합물로 코팅될 수 있다. 팁(tip) 부분은 PMMA 폴리스티렌, PVB, 실란화(silanization), 올리고뉴클레오티드, 텔로머(telomeres), 그리고 제한효소 오버행(restriction site overhangs)과 같은 화합물로 기능화될 수 있다. 핵산은 단일 가닥의 DNA가 될 수 있다. 바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 그리고 실리콘과 같은 화합물로 구성될 수 있다. 바늘은 단일 나노포지셔너-구동 지지체 상에 배치될 수 있다.

본 발명의 추가 특징, 장점 및 실시예는 다음의 상세한 설명, 도면 및 청구항으로부터 제시되거나 명백할 것이다. 또한, 상기 발명의 요약 및 다음의 상세한 설명은 예를 든 것이며, 청구되는 본 발명의 범위를 제한시키지 않고 추가 설명을 제공하기 위해 의도된 것임을 이해할 것이다.

본 발명은, 기질에 핵산이 통제 가능하게 배치될 수 있도록 하여 염기 사이의 공간이 일관되어 전자 현미경을 이용하여 정확한 핵산 시퀀싱 정보를 얻는 효과를 갖는다.

본 발명의 추가 이해를 제공하기 위해 포함된 첨부 도면은 본 명세서의 일부로 구성, 포함되었으며, 본 발명의 실시예를 설명하고, 그리고 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명한다. 본 발명의 기초적 이해와 이를 실행하는 다양한 방법에 필수적이라기 보다 본 발명의 구조적 상세함을 보이기 위해 만들어진 의도는 없다.
도 1은, 본 발명의 원리에 따라 전자 현미경을 이용하여 핵산이 시퀀싱되는 방법을 설명하는 순서도.
도 2는, 핵산 가닥에 결합할 수 있는 코팅 1과 핵산 가닥에 결합하지 않는 코팅 2로 기능화된 바늘을 보여주는 도면.
도 3은, 뾰족한 바늘의 곡률 반경을 보여주는 도면.
도 4는, 빈 공간으로 핵산 가닥을 신장하기 위한 본 발명의 원리에 따른 방법을 설명하는 도면. Panel I은 바늘 팁(tip)과 복수의 핵산 가닥이 포함된 용액 방울을 보여준다. Panel II는 핵산 가닥이 포함된 용액 방울 안으로 바늘 팁이 들어가서, 단일 핵산 가닥에 결합되는 것을 보여준다. Panel III은 빈 공간으로 신장된 핵산 가닥을 보여준다.
도 5는, 핵산 가닥이 포함된 용액의 방울 안으로 바늘 팁이 최대 깊이로 들어가는 도면(Panel I)과 적어도 깊이로 들어가는 도면(Panel II)을 보여주는 도면.
도 6은, 핵산 가닥이 포함된 용액의 방울 안으로 바늘 팁이 적어도 깊이로 들어가는 것을 보여주는 도면. 확대 도면은 용액의 방울 안에서 용액 내에 있거나 대기/용액 경계면에 있는 단일 핵산 가닥에 특이적으로 결합되는 바늘 팁을 보여준다.
도 7은, 본 발명의 원리에 따라 셸프 트레딩의 방법을 보여주는 도면. Panel I은 라벨링된 핵산 가닥이 포함된 용액 안으로 바늘이 들어가는 것을 보여준다. Panel II는 용액으로부터 뾰족한 바늘을 빼내어 부착된 핵산이 빈 공간으로 신장하는 것을 나타낸다. Panel III은 연장된 핵산이 TEM 격자(grid)와 접촉되는 것을 보여준다. Panel IV와 V는 뾰족한 바늘을 다시 끌어당겨 뾰족한 바늘의 팁으로부터 핵산이 방출되도록 하는 도면을 보여준다.
도 8은, 본 발명의 셸프 트레딩 방법의 대표 도면이다. Panel I은 단일 바늘이 이용되는 셸프 트레딩을 보여주고, Panel II는 복수의 바늘이 이용되는 셸프 트레딩을 보여준다.
도 9는, 연장된 핵산 가닥이 방울 표면으로 정상적으로 지향되어 있는 것을 나타내는 도면.
도 10은, 빈 공간에서 연장된 핵산이 가닥이 길이를 따라 배치된 지지 기질에 실질적으로 접촉되는 것을 보여주는 도면.
도 11은, 전단에 고정되어 핵산 가닥이 더 연장되는 것을 나타내는 도면.
도 12는, DNA 가닥과 같은 근접한 핵산 가닥의 큰 평행 배열을 나타내는데, 담금(dipping-in)-꺼냄(dipping-out)-내려놓음(setting-down), 드래깅(dragging), 들어올림(lifting-up), 해독(translating)으로 이루어진 기본적으로 프로그램된 피에조(piezo)-작동기-조절된 바늘 움짐임이 반복되어 형성된다. 이 도면에서 실질적 실행시에 형태인 핵산 가닥들이 직선으로 표현되지 않는다.
도 13은, 용액 표면/지지 기질/바늘 움직임 각이 부적절하게 고려되어 바늘-기질 접촉전, 지지 기질과 부유된 가닥 사이에 제어되지 않은 접촉이 유도되고, 다시 과도한 신장으로 가닥 절단의 원인이 되는 실패한 방식을 나타낸 도면.
도 14는, 잘못 계산된 용액 표면/지지 기질/바늘 움직임 각으로 인하여 가닥이 실질적으로 기질과 접촉되지 못하고, 부유된 가닥의 상당 부분이 용액 표면과 바늘-기질 접촉점 사이의 빈 공간에 남아있게 되는 실패한 방식을 나타내는 도면.
도 15는, 본 발명의 원리에 따른 갭 트레딩 방법을 나타내는 도면.
도 16은, 본 발명의 원리에 따라 지지 기질에 핵산 증착 후 이동 프린팅 방법을 설명하는 도면.
도 17은, 전자 현미경으로 영상화되기 전, 상층(top layer)에 임베딩된(embedding) 기질에 핵산 가닥을 보여주는 도면.
도 18은, 본 발명의 원리에 따라 핵산의 시퀀싱을 위한 시스템을 설명하는 도면.
도 19는, 본 발명의 원리에 따라 핵산의 시퀀싱을 위한 가상 시스템을 설명하는 도면으로, 본 발명의 원리에 의해 생성된 단일 오스뮴(osmium)-라벨링된 ssDNA 분자의 시뮬레이션화된 영상이다.
도 20은, 대체 준비 방법으로 얻은 불명료한 영상을 보여주는 도면.
도 21은, 단순한 방식의 방울 홀더(holder)를 보여주는 도면.

본 발명은, 본 명세서에 설명된 특정한 방법, 프로토콜, 및 시약은 당업자가 인지하는 바와 같이 다양할 수 있기 때문에 이에 제한되지 않음을 인지해야 한다. 또한, 본 명세서에 사용된 용어는 본 발명의 특정한 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 이용된 것이며, 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 의도는 없다는 것도 인지해야 한다. 또한, 여기에서 사용된, 그리고 청구범위에 사용된, 단수형에는 다른 명시적 언급이 없는 한, 복수도 포함된다. 따라서, 분자를 언급할 때 하나 이상의 분자 및 당업자에 공지된 이의 등가물도 지칭된다.

다른 정의가 없는 한, 여기에서 사용된 모든 기술적 그리고 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 통상 이해하는 바의 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 실시예에서, 및 다양한 특징 및 이의 유일한 설명은 첨부된 도면들 및 다음의 설명과 함께 비-제한적 실시예를 참고하여 더욱 상세하게 설명된다. 도면에서 설명되는 특징은 반드시 규격에 맞게 그려진 것이 아니며, 명시적으로 언급되지 않더라도 일 실시예의 특징은 당업자가 인지하는 바와 같이 다른 실시예에서 이용될 수 있다

본 명세서에 기재된 임의의 수치에 임의의 더 낮은 값과 임의의 더 높은 값 사이에 적어도 두 개 단위 구별이 있다면, 더 낮은 하위 값부터 더 높은 상위 값까지 모든 수치가 포함된다. 예를 들어, 성분의 농도 또는 공정의 변수 가령, 크기, 각 크기, 압력, 시간 및 이와 유사한 기타 변수의 값이 예를 들어 1 내지 90, 특별히, 20 내지 80, 좀 더 구체적으로 30 내지 70으로 표시되면, 15 내지 85, 22 내지 68, 43 내지 51, 30 내지 32 등의 값도 명시적으로 나열된다. 1보다 작은 값의 경우, 한 단위는 적절하게 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1로 간주된다. 이들은 특별히 의도된 예일 뿐이며, 나열된 최하위 값 및 최상위 값 사이의 수치 복합 또한 유사한 방식으로 본 명세서에서 명시적으로 언급된 것으로 간주된다.

또한, 바로 아래 언급된 "정의" 부분에서는 본 발명과 연관된 특정 용어들이 정의된다. 특정한 방법, 장치, 그리고 물질이 설명되지만, 본 명세서에 설명된 것과 유사한 또는 등가의 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 테스트에 이용될 수 있다. 여기에서 언급된 모든 참고문헌은 그 전체 기재 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다.

정의

A: 아데닌.

C: 시토신.

G: 구아닌.

T: 티민.

U: 우라실.

ssDNA: 단일 가닥의 DNA.

AFM: 원자력 현미경(Atomic Force microscope).

CCD: 전하 결합 소자(Charge Coupled Device).

CMSO: 상보성 금속 산화 반도체(Complementary Metal Oxide Semiconductor).

DMSO: 디메틸 설폭시드(Dimethyl Sulfoxide)

EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid).

HAADF: 높은 각 환상 다크 필드(High Angle Annular Dark Field)

IMPREST : 개별 분자 배치 신속 빈공간 트레딩(Individual Molecule Placement Rapid Empty Space Threading)

PFGE: 펄스장 겔 전기영동(pulsed field gel electrophoresis-PFGE)

Os-bipy: 오스뮴 테스라옥사이드 2,2'-비피리딘

(Osmium tetroxide 2,2'-bipyridine)

PDMS : 폴리디메틸실옥산

PLD-UHV: 펄스 레이져 증착-초고진공(Pulsed Laser Deposition-Ultra High Vacuum)

PMMA: 폴리메틸 메틸아크릴레이트

PMT: 광전증배관(Photo Multiplier Tube)

PVB: 폴리비닐 부티랄

SEM: 주사전자 현미경(Scanninig Electron Microscopy)

STEM: 주사투과전자 현미경(Scanning Transmission Electron Microscopy)

TE: Tris EDTA

TEM: 투과(Transmission) 전자 현미경

UHV: 초고진공(Ultra High Vacuum)

여기에서 사용된 바와 같이, "Z"는 원자의 핵 안에 양자 수를 지칭하고, 또한 원자 번호로 알려져 있다. Z 번호가 큰("high-Z") 것은 얇은 영상 필름보다 큰 원자 번호, 실제 시퀀싱에서는 30 이상, 또는 바람직하게는 약 70 이상, 좀더 바람직하게는 약 90 이상의 원자 수를 지칭한다.

여기에서 사용된 바와 같이 "일관된(consistent)"는 신장된 핵산 가닥 염기간 공간이 신장된 핵산 가닥 길이 전체에서 상대적으로 동일한 것을 의미한다. 염기 "사이" 공간은 일반적으로 중심에서 중심까지 또는 인산염에서 인산염까지의 거리를 말한다. 가닥의 전자 현미경 영상에서 특정 길이, 가령, 약 50개 염기, 약 100개 염기, 약 1000개 염기 또는 약 10,000개 염기에 걸쳐 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기 순서가 결정될 때 염기들은 일관되게 공간을 이룬다.

여기에서 사용된 바와 같이, "끊임없는(contiguous)"은 핵산 가닥에 염기가 일반적 경계 내에 있고, 중단 없이 일반적으로 연결되어 있다는 것을 의미한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "연속(consecutive)"은 핵산 가닥에 염기가 중단없이 또는 순서에 맞게 다른 하나에 이어진다는 것을 의미한다.

"복수의 가닥", "복수의 핵산 가닥", "복수의 DNA 가닥" 및 이와 유사한 표현들은 2개 가닥, 5개 가닥, 10개 가닥, 100개 가닥, 1000개 가닥 등을 지칭한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "지지 기질(support substrate)"은 연장된 및/또는 신장된 핵산 중합체가 흡착될 수 있는 임의 매트릭스를 지칭한다.

여기에서 사용된 바와 같이 "영상 기질(imaging substrate)"은 전자 현미경 영상으로 바로 이용될 수 있는 기질을 지칭한다. 영상 기질은 현미경에 둘 수 있으며, 선택적으로 얇은 영상 필름을 지지한다. 영상 기질에는 다공성 또는 레이시 폼바 메시(lacey formvar mesh), 다른 중합체 메시, 다공성의 얇은 실리콘 질화물 필름, 격자의 다른 적절한 타입의 격자가 포함될 수 있다. 영상 기질은 얇은 영상 필름보다는 일반적으로 두껍지만, 정교한 얇은 영상 필름을 지지할 수 있어야 한다. 여기에서 사용된 바와 같이, 영상 기질은 얇은 영상 필름 및 이를 고정하는 지지 구조 또는 지지 기질만을 지칭할 수 있다. M. Hayat, Principles and Techniques of Electron Microscopy : Biological Applications 4 th edition , which describes general methods in Electron Microscopy .

여기에서 사용된 바와 같이, "얇은 영상 필름(imaging thin -film)"은 탄소, 붕소, 리튬, 수소, 베릴륨, 알루미늄, 또는 기타 Z 번호가 낮은-원소 또는 질화물 및 이의 산화물 중 하나의 얇은 층을 지칭한다. 얇은 층은 약 0.2nm 내지 약 30nm 범위의 두께를 갖는다. 얇은 영상 필름은 영상 기질 또는 다른 표면 위에 지지될 수 있다.

"실질적으로 평행한(substantially parallel)"은 두 직선이 절대 만나지 않는 기하학적 의미를 말한다. 여기에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 평행한"이라는 의미는 서열 데이터가 결정되는 부위에서 만나거나 교차되지 않는 연장된 핵산 중합체를 지칭한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "핵산"에는 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드가 포함되며, 게놈, 재조합 또는 합성된 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA 또는 천연, 재조합 또는 합성된 DNA 또는 임의의 DNA-유사 또는 RNA-유사 물질을 지칭한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "상보성(complementary)"은 염기쌍을 허용하는 염 및 온도 조건하에 폴리뉴클레오티드의 자연적 수소 결합이 포함된다. 예를 들어, 서열 "A-G-T"는 상보적 서열 "T-C-A"에 결합된다.

두 개 단일 가닥 분자간에 핵산의 일부만이 결합되는 경우 상보성은 부분적이며 또는 단일 가닥 분자사이에 전체적인 상보성이 존재하면 완벽한 것이 될 수 있다. 핵산 가닥 사이에 상보성 수준은 핵산 가닥 사이에 하이브리드화의 효능 및 강도에 상당한 영향을 준다.

여기에서 사용된 바와 같이, "샘플(sample)"은 핵산을 포함하는 사람 또는 동물로부터 기인된 조직 또는 혈장, 혈청, 척수액, 림프액을 포함하나 이에 국한되지 않는 유체로부터 얻은 조직 또는 액체, 피부, 호흡기, 내장 및 비뇨생식 기관의 외부 부분, 눈물, 타액, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직뿐만 아니라, 식물, 곰팡이, 세균, 병인균 및 in vitro 세포 배양물로부터 얻어진 샘플을 지칭한다. 샘플은 핵산을 포함하는 계통발생론적으로 모든 바이러스, 원핵 및 진핵세포를 포함하는 임의의 종으로부터 얻어질 수 있다. 샘플에는 또한 당 분야에 공지된 기술 예를 들어 고형상 합성과 같은 기술을 이용하여 인위적으로 합성된 핵산 또는 PCR과 같은 것을 이용하여 in vitro 합성된 것들도 포함된다.

여기에서 사용된 바와 같이, "약(about)"은 범위의 상한 및 하한 모두에 적용되는 값의 범위를 설명하는데 이용된다. 예를 들어, "약 10 내지 100"의 범위는 "약 10 내지 약 100"의 범위와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 거리가 언급되는 경우, "약"은 일반적으로 +/-10%를 의미한다. 예를 들어, "약 5nm"는 5nm+/-10%를 의미한다.

여기에서 사용된 바와 같이, "조영제", "라벨" 또는 "라벨링 화합물"은 얇은 영상 필름 물질과 라벨링되지 않은 DNA 보다 더 큰 원자 번호(Z) 또는 밀도 또는 차등적인 전자 분산을 갖는 원자, 분자, 클러스터 또는 물질을 지칭한다. "조영제", "라벨", 또는 "라벨링 화합물"은 핵산 가닥의 염기 자체보다 상이한 조영 화합물이며, 핵산 가닥에 부착된다.

여기에서 사용된 바와 같이, "클러스터(cluster)"는 두 개 이상의 Z 번호가 큰 원자를 포함하는 화학 구조로, 핵산 가닥에 염기-선택적 또는 염기-특이적으로 부착된다.

개요

본 발명은 일반적으로 전자 현미경을 이용하여 라벨링되고 신장된 핵산의 직접 관찰을 통하여 핵산 서열을 결정하기 위한 방법, 장치 및 제품에 관한 것이다. 특정 실시예에서, 본 발명은 용액으로부터 핵산 단일 가닥을 끌어내는 수단을 이용하여 기질 또는 지지 상에 핵산을 조절된 방식으로 배치시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 현재의 시퀀싱 기술보다 더 정확하고, 비용이 적게 들고, 더 긴 판독 범위를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 시퀀싱 방법은 전자 현미경을 이용하여 핵산 염기 샘플의 적어도 약 20개 연속 핵산 염기, 바람직하게는 적어도 약 50개 연속 염기, 좀더 바람직하게는 적어도 약 1,000개 연속 염기, 좀더 바람직하게는 적어도 약 10,000개 연속 염기, 그리고 더욱 더 바람직하게는 적어도 약 100,000개 연속 염기, 더더욱 바람직하게는 적어도 약 1,000,000개 염기가 정확하게 결정되도록 한다. 본 내용에서 "연속 염기(consecutive bases)"는 분석될 DNA 출발 물질로부터 염기 순서를 지칭한다.

본 발명의 방법을 이용하면, 합성 방법을 이용하여 가능한 것보다 훨씬 신속하게 서열을 만들 수 있다. 본 발명의 방법(고속 EM과 복합하여)으로 초당 적어도 약 10,000개 염기, 그리고 바람직하게는 초당 적어도 약 100,000개 염기, 그리고 더욱 바람직하게는 초당 적어도 약 200,000개 염기가 영상화되도록 할 수 있다. TEM 영상을 이용하여 본 발명에 따라 배열된 DNA 가닥은 초당 약 1㎛²의 고해상속도로 영상화될 수 있다.핵산 가닥을 포함하는 초당 1㎛²지역이 영상화되는데, 이는 초당 약 500,000개 염기의 영상화 속도에 상응된다.

도 1은 본 발명의 원리에 따라 전자 현미경을 이용하여 핵산이 시퀀싱되는 방법을 설명하는 순서도이다. 이 도면은 설명을 위해 제공된 것이며, 본 발명을 이에 제한시키고자 함은 아니다. 단계 102에서, 관심 대상 핵산 서열을 갖는 개체로부터 핵산이 포함된 샘플이 얻어진다. 단계 104에서, 당분야에 공지된 기술을 이용하여 관심 대상의 핵산이 샘플로부터 분리된다. 단계 106에서, 분리된 핵산의 특정 염기는 가령, Z 번호가 큰 원자로 라벨링되어 Z 번호가 큰 원자 라벨링된 핵산 중합체가 만들어진다. 단계 108에서, 핵산 중합체를 빈 공간으로 신장하여 뉴클레오티드의 염기간 공간이 일관되도록 한다. 단계 110에서, 핵산 중합체가 지지에 부착되고, 겹쳐지지 않는 패턴(가령, 서로에 대해 실질적으로 평행하게)으로 내려놓는다. 단계 112에서, 부착된 핵산 중합체는 전자 현미경에 의해 영상화되어 중합체를 따라 라벨의 위치가 결정된다. 영상은 감지기(가령, CCD 또는 CMOS 카메라 또는 PMT)에 의해 잡히고, 컴퓨터 판독 매체상에 일반적으로 라벨 위치가 기록된다. 단계 114에서 핵산 중합체로부터 염기 서열 정보를 결정하기 위해 공간 정보를 이용하는 알고리즘이 사용된다. 이들 단계들은 하기에서 더 상세하게 설명된다.

핵산 제조

단계 104에서 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 소스, 핵산 성질, 유사 인자들에 따라 특정 방법을 선택함으로써 관심 핵산이 분리된다. 관심 핵산은 합성 또는 재조합에 의한 것이 아니라 자연적으로 발생된 것이거나 게놈에서 기원된 것이며, 단일 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 대안으로, 관심의 핵산 가닥은 단일 또는 이중 가닥의 합성 또는 재조합된 것일 수 있다. 한 가지 특정 실시예에서, 핵산은 DNA이며, 특히 약 100kb 염기 이상의 매우 분자량이 큰 DNA이다. 일부 실시예에서, 고분자량 DNA는 길이가 적어도 300 kb 염기이다. 초고분자량을 분리시키는 방법이 공지되어 있다 (Murry and Thompson, 1980, Nucleic Acids Research 10: 4321~5, and Kovacic, R, ET AL, 1995, 23(19) Nuc ACIDS RES 23(19) 3999~4000).

한 방법에 따르면, 초고분자량 DNA는 잘림(shearing)을 최소화시키기 위하여 아가로즈 플러그에 임베드된 진핵 세포로부터 분리된다. 기타 세포 성분들로부터 PFGE를 통하여 DNA가 분리되며, 후속적으로 아가로즈로부터 약 0.01ng/㎕ 내지 약 0.5ng/㎕ 농도 범위로 TE 완충액으로 전기 용출된다. 당분야에 공지된 열 변성 또는 화학 변성에 의해 DNA는 이중 가닥형으로부터 단일 가닥으로 형으로 변성된다. See Barnes, W., 91 PNAS 2216-2220 (1994). 예를 들어, 이중 가닥 DNA의 열 변성은 DNA 샘플을 2분간 94℃로 가열시켜 실행될 수 있다. 변성 단계는 라벨링 이전에 실시되며, 핵산 트레딩 이전에 실시될 수도 있다. 시퀀싱에서 ssDNA가 이용되면 라벨링 전에 dsDNA를 ssDNA로 변환시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 당업자가 인지하는 바와 같이 반드시 그럴 필요는 없으며, dsDNA가 라벨될 수도 있다.

핵산 라벨링

단계 106에서, 전자 현미경에 의한 효과적인 감지를 위하여 핵산의 특정 염기는 Z 번호가 큰 원자와 같은 조영제로 라벨링된다. 핵산은 적어도 부분적으로 염기 특이적인 방식으로 전자 밀집 원자들과 연합되어야 한다. 부분적으로 염기 특이적인(가령, 염기 선택적) 조영제 또는 라벨은 4개 DNA 또는 RNA 염기 중 하나 이상에 선호적으로 연합된다 (가령, A는 다소 강하게 착색, G는 다소 약하게 착색, T는 착색이 전혀 없음). 조영제가 오직 한 개 염기(가령, A) 또는 서열(가령, 특정 이량체 서열)에만 기본적으로 연합된다면 이 조영제는 완벽하게 염기 특이적이다. DNA 라벨링을 위한 여러 가지 방법이 공지되어 있으며, 본 발명에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 염기-특이적 및/또는 염기 선택적 중금속 착색 프로토콜에 대해 설명되어 있다. Whiting ET AL., 474 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 334~348 (1977), Jelen ET AL., 10 GEN . PHYSIOL . BlOPHY . 461~473 (1991), and Dale ET AL, 14(11) BIOCHEMISTRY 2447~2457 (1975), 모든 참고문헌은 그 전체 기재 내용이 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 당업자가 인지하는 바와 같이 임의 특정 핵산 라벨링 방법에 한정하기 위한 것이 아니고, 많은 방법이 과학 문헌에 설명되어 있다.

이용 방법에 따라, 각 핵산 염기는 Z-번호가 높은 상이한 라벨링 화합물로 배타적으로 라벨링될 수 있으며, 선택된 핵산 염기 부분집합(subset)은 서로 상이한 Z-번호가 높은 라벨링 화합물로 라벨링되거나, 선택된 핵산 염기 부분집합은 동일한 Z번호가 높은 라벨링 화합물, 가령, Os-bipy (하기에서 설명됨)으로 라벨될 수 있다. 한 가지 특정 실시예에서, 가령, A, G, C, T와 같은 각 DNA 염기는 서로 다른 Z 번호를 갖는 라벨링 화합물로 배타적으로 또는 선호적으로 라벨링된다. Z 번호가 높은 방대한 라벨링 화합물들이 본 발명의 방법들에 이용될 수 있지만, Pt, Hg, I, Rh, Au, Ir, Ag, Os 및 이와 유사한 것이 포함된 화합물들이 있으나 이에 한정되지 않는다. 상이한 염기는 예를 들어, Z 번호가 높은 라벨링 물질의 차이 또는 Z 번호가 높은 물질과 라벨링되지 않은 염기 사이의 차이에 근거하여 구별될 수 있으며, 거의 눈에 보이지는 않는다. 예를 들어, Os-bipy 와 요오드는 분산 단면에 근거하여 구별된다. 또한, 예를 들어, 모든 A 염기에 결합된 단일 Au 원자는 모든 G 염기에 결합된 세 개 Au 클로스터와는 구별될 것이다.

본 발명의 방법에서, TEM 영상은 일관된 염기 공간을 갖는 복수의 비-겹침 DNA 가닥을 감지하기 때문에, 라벨링의 충실성이 결정적인 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 한 가지 장점은 핵산이 화학적으로 라벨링되고, 주어진 반응 배치(batch)에서, 각 가닥의 모든 표적 염기가 라벨될 필요는 없다(가령, T-특이적 라벨링이 이용되는 경우, 가닥에 있는 각 T가 라벨링되어야 할 필요가 없다). 동일 가닥의 다중 영상이 복합되어 하위 서열을 결정하기 때문에, 라벨링된 염기 사이에 라벨링되지 않은 염기 수가 결정되기 때문에 완전한 라벨 정확성이 필요하지 않다. 설명하자면, DNA 배치(batch)의 20배를 나타내는 특정 게놈 서열이 고려된다 (가령, 한 위치가 공통인 부분을 소유하는 20개 분자 모두 배치에 있다). 예를 들어, 배치는 전체 DNA의 약 20개 게놈 균등물이 포함되도록 조정될 수 있다. 서열에서 특정 위치의 염기 상동성이 T라면, 20개 분자 모두 그 위치에 T를 갖는다. 임의 주어진 T는 시간의 90% 내지 100%, 임의 주어진 A, C 또는 G의 경우 시간의 0% 내지 10% 라벨링되는 특정 반응 조건에 이들 분자들이 포함된 DNA 배치가 있게 된다. 영상화될 때, 그 위치는 이 경우 19개 분자에 라벨될 것이고, 한 개 분자는 라벨링되지 않는다. 유사하게, "A"는 한 개 분자가 라벨링되며, 19개 분자에는 라벨링되지 않는다. 확률적 처치(probabilistic treatment)로 게놈의 해당 위치는 그 부위에 대해 정확한 실체가 상당히 정확하게 할당된다. 이 경우, 19/20 분자에서 라벨링된 위치의 실체는 "T" 가 되며, 1/20 분자에 라벨링된 위치의 실체는 "T 이외의 것(not T )"이 된다. 또한, 서열의 배열 및 결합은 당 분야에 공지된 확률적 처치에 의해 영향을 받을 수 있다.

본 발명의 방법들의 또 다른 장점은 상보적 가닥에 대한 서열 정보가 유도되어, 이는 주어진 염기 결정의 유효성에 대한 추가적인 통계학적 뒷받침도 제공되는데, 가령, 한 분자 상에 T 위치에 대한 상당한 확실성과 상보 가닥 상의 A 위치에 대한 상당한 확실성이 동반된다. 따라서, 예를 들어, 화학적 라벨링 의미에서 T의 양호한 식별만을 허용하는 화합물/반응 조건 배치로부터 서열 내 모든 A와 T의 위치들이 확실하게 결정되는 것이 가능하다. 각 가닥 위에 라벨링된 T는 상보 가닥 상에 A 위치를 한정시킨다.

따라서, 일부 실시예에서, 핵산 염기 부분집합만 라벨링된다. 예를 들어, DNA 소량은 적어도 부분적으로 염기 특이적인 방식으로 별도 라벨링된다. 한 가지 방식에서, 복수의 핵산 분자가 포함된 용액은 하나 이상의 특이적 뉴클레오티드 염기 (A, T, G 또는 C)의 적어도 약 70%, 일부 경우 적어도 약 80% 그리고 일부 경우 적어도 약 90% 내지 100%만을 라벨시키고, 그리고 적어도 한 개 뉴클레오티드 염기는 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만으로 라벨시키는 조건하에 반응된다. 예를 들어, 용액은 T와 C는 약 90% 내지 약 100% 라벨링되는 반면, A와 G는 소량만 라벨링되는 조건에서 반응한다.

일 실시예에서, 상이한 염기-특이적 라벨링 밀도가 얻어질 수 있도록 상이한 조건하에서 소량의 DNA가 Os-bipy로 라벨될 수 있다. 예 1 참고. 이와 같은 방식에서, 관심 DNA가 분리되고, 두 개 용액, 예를 들어, 각 용액에 약 0.01ng/㎕ 내지 약 1ng/㎕ 농도 범위의 용액 1과 2로 분배된다. 상이한 염기-특이적 라벨링 밀도가 얻어질 수 있도록 상이한 조건들(하기에서 추가 설명되는 것과 같이)에서 각 용액은 Os-bipy와 반응된다. 또한, 하기에서 설명되고, 예 1에서 볼 수 있는 것과 같이, Os-bipy로 반응시키기 전에, 선택된 용액은 중아황산염 선-처리와 같은 선처리가 될 수 있다.

용액 1은 100mM Tris, 10mM EDTA이 포함된 TE 완충액 pH 8.0 내 테트라옥사이드 오스뮴과 Os_bipy의 4배 몰 과량과 함께 26℃에서 20시간 동안 반응되는데; 이들 조건에서는 T는 약 100%, C는 약 85%, G는 약 7% 그리고 A는 0%로 라벨링된다. 용액 2는 용액 1과 동일한 조건하에서 반응되는데, 단, 반응은 15분간만 진행되며, 테트라옥사이드 오스뮴과 2,2'-비피리딘는 2.5배 몰 과량만 이용되는데; 이들 조건에서는 T는 약 90%, C는 약 8%, G는 약 5% 그리고 A는 0%로 라벨링된다. 하기에서 설명된 바와 같이, 이와 같은 방법들이 이용됨으로써, 짧은 항온처리(incubation) 시간 반응 동안 얻어진 결과를 비교하여, C에 대한 염기-특이적 패턴이 결정되며, 상보 가닥 상에 G로 확장되는 것이 가능하다. 확대 해석하면, 본 발명의 방법을 이용하여, T에 대한 염기-특이적 패턴이 결정되고, 이를 상보 가닥 상의 A로 확대시키는 것이 가능하다. 따라서, T, A, G, 및 C의 패턴을 결정하는데 두 가지 반응조건으로 단일 라벨링 화합물이 이용될 수 있다.

본 발명은 Os-bipy를 이용하여 시토신 메틸화 반응 패턴의 결정도 고려된다는 것을 인지해야 한다. 이 경우, 4가지 소량(용액 1, 2, 3, 4)이 이용된다. 용액 1과 2는 상기 용액 1과 동일하게 처리된다. 용액 3과 4는 상기 용액 2와 동일하게 처리된다. 그러나, Os-bipy 반응 전, 메틸화되지 않은 C 잔기를 U로 우선 전환시키기 위해 용액 2와 4는 중아황산염 처리를 받게 된다. 이로써 용액 내 중아황산염으로 처리된 서열과 용액 내 처리되지 않고 남아있는 것과 비교됨으로써 메틸화 패턴이 결정되게 된다. Jelen ET AL. 10 Gen . PHYSIO . AND BIOPHYS 461~473(1991). 메틸시토신과 U는 반응에서 규정의 4개 염기에 대한 라벨링 효능으로부터 구별될 수 있는 상이한 반응 조건들에서 Os-bipy와의 라벨링 효능을 갖는다. 따라서, 게놈 샘플에 대한 후생적(epigenetic) 변형 정보를 끌어내기 위하여, 중아황산염으로 처리되지 않는 DNA에서 메틸시토신의 염기-특이적 패턴이 결정되거나, 중아황산염 처리후 시퀀싱에서 U 패턴의 결정이 가능하다. 라벨링 반응 후, 라벨링되지 않은 오스뮴은 한외여과(ultrafiltration) 또는 투석(dialysis)으로 제거되어 영상 공정 동안 외부(extraneous) 중 원자 오염이 최소화되도록 하고, DNA 중합체는 TE 완충액(pH 8.0)에서 약 0.1 ng/㎕으로 희석시킨다.

기타 여러 고 원자 염기-특이적 고 원자 라벨링 방법이 당분야에 공지되어 있다. 일부 예는 다음과 같다: Beer and Moudrianakis는 구아닌 잔기의 라벨링을 위하여 우라닐 이온에 결합된 디아조니움 염 화합물 사용을 설명하였다 (Beer, M and Moudrianakis, E., Determination of Base Sequence in Nucleic Acids with the Electron Microscope 48(3) PNAS, 409~416 (1962)). Robert Whiting는 Pt-DMSO [디메틸설폭시드 백금 KPtCl₃(DMSO)]을 이용하여 아데닌 뉴클레오티드의 동정에 적합한 분별 라벨링을 얻었다(암장 전자 현미경에 의한 핵산 서열 연구, Ph. D. Thesis, (1975), University of Toronto, School of Graduate Studies). 아세트산 수은을 이용한 시토신 잔기의 수은화반응(Mecuration)이 보고되었다{Dale and coworkers (Direct covalent mercuration of nucleotides and polynucleotides, Dale, RMK, ET AL., 14 BIOCHEMISTRY, 2447~2457 (1975)}. DNA를 라벨링하기 위한 또 다른 방식은 염기-특이적 방식으로 DNA를 공유적으로 변형시켜, 변형된 염기에서 중금속 라벨을 DNA가 수용하도록 한다. 이와 같은 방법의 한 예가 Seth Rose에 의해 설명되었는데, Rose는 아데닌과 시토신 잔기를 클로로아세틸알데히드로 변형시켜, 아세트산 수은 또는 테트라옥사이드 오스뮴이 후속적으로 이들 잔기에 결합되도록 하였다 {Rose, SD., Mercuration of Modified Nucleotides : Chemical Methods Toward Nucleic Acid Sequencing by Electron Microscopy, 361 BlOCHIM . BlOPHYS. ACT ., 231~235 (1974)}.

추가 실시예에서, 클러스터 라벨링이 본 발명에서 이용될 수 있다. 클러스터라벨은 하나 이상의 중 원자가 포함된 라벨 화합물이다. 클러스터 라벨은 충분한 염기간 분리를 제공하는 신장(stretching) 방법들이 이용되는 프로토콜에서 이용될 수 있다. 인접하여 부착된 클러스트간 공간적 방해로 제한받지 않는 서열 데이터를 얻기 위해서는 충분한 분리가 필수적이다. 클러스트는 올리고머에 부착될 수 있고, 그 다음 올리고머는 상보적 염기쌍의 형성을 통하여 DNA 하이브리드된다. 이와 같은 방식으로, 전자 현미경을 이용하여 상보적 서열의 위치가 배정될 것이다. 완전한 서열 데이터가 효과적으로 얻어지도록 미지의 서열에 하이브리드된 매우 짧은 클러스트-라벨링된 올리고머 (삼량체 및 사량체)의 별도 배치의 영상들로부터 정보가 복합될 것이다. 특히, 매우 짧은 클러스트-라벨링된 올리고머는 변형되지 않은 DNA, 가령, 클러스트 라벨링의 효과를 증가시킬 수 있는 작용기를 갖는 비-자연적 염기가 없는 자연 염기 조성물(트리오스뮴 화합물 포함)을 보유하는 DNA를 직접 라벨시킬 수 있는 약 5개 내지 약 20개 염기 클러스트 범위의 길이를 보유할 수 있다. Rosenberg ET AL, 689 J. ORGANOMETAL CHEM 4729~4738 (2004). 특이적으로 변형된 뉴클레오티드는 아미노알릴 또는 티올기와 같은 작용기를 보유한 DNA 가닥의 클러스터 라벨링은 모노말레이미도 운데카골드{monomaleimido undecagold-Nanoprobes lnc (Yaphank, NY)}와 같은 시판되는 클러스트 라벨 시약들과의 효과적인 반응을 허용한다. 상업적으로 이용 가능한 클러스터 라벨링 시약은 염기-특이적 또는 염기 선택적인 방식으로 DNA와 반응하는 링커들로 기능화될 수 있는데, 예를 들어, 트리오스뮴 도데카카르보닐, 트리우테눔 도데카카르보닐 및 테트라리디움 도데카카르보닐(이들 세 가지 모두 Sigma Aldrich Corp, St Louis, MO로부터 구할 수 있음) 그리고 모노알레이미도 운데카골드(Nanoprobes, supra)가 포함된다. 입체 장애 클러스트로 클러스터 라벨링시키면 용액 내 신장된 DNA 상에서 라벨링 반응을 실행하는데 더 효과적이 될 수 있다. 라벨링은 미세 튜브(직경이 약 30nm 내지 약 1㎛) 내부에서 실시될 수 있으며, 이때 튜브 또는 모세관 내에 용액 내에서 공지 기술로 DNA는 길게 연장되고(Chan, E., and Goncalves, N., 14(6) GENOME RES 1137~1146 (2004)), 라벨과 반응된다. 이 방법은 하나 이상의 결합 부위를 갖는(가령, 나노골드) 라벨이 교차 연결되는 것을 저지시키는 장점을 갖는다.

일 실시예에서, 클러스터 라벨이 조영제로 이용될 수 있는데, 염기-특이적 또는 염기-선택적으로 핵산 중합체에 결합되는 또는 변형시키는 것으로 공지된 화학적 링키지 구조를 이용하여 염기-특이적 또는 염기-선택적방식으로 핵산 중합체에 공지의 클러스트가 부착될 수 있다. 이와 같은 클러스터 라벨링 방식을 "피기백킹(piggybacking)"으로 부르기도 한다. 피기백킹은 다음과 같은 방식으로 실시될 수 있는데, 예를 들어, 아세트산 수은은 Dale, R., ET AL., 14 BIOCHEMISTRY 2447~2457 (1975)에서 설명되는 것과 같이, 시토신을 수은화하고, 시토신에 부착될 클러스터 화합물은 수은-연결된 트리오스뮴 클러스터(mu3-eta2-c2-t-Bu)Os₃(CO)₉(mu-Hg)I(Rosenberg, E., ET AL., 10 ORGANOMETALLICS 203~210 (1991))의 아세틸화에 의해 아세트산 수은 모이어티로 준비된다. 피기백킹의 또 다른 예로써, 페난트롤린은 염기 선택적 라벨로 이용될 수 있는 테트라옥사이드 오스뮴과 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다 (Paecek, E., ET AL., J. 13(3) BlOMOL. STRUCT. DYN. 537~46 (1995)). 5-아미노 페난트롤린(polysciences, Inc., Warrington PA)은 엑소사이클 아민 기를 경유하여 디페닐포스피노 프로피온산 숙시니미딜 에스테르에 부착될 수 있다(Argus Chemicals SRL, Vernio, Italy). 당업자에 공지된 기술을 통하여 몇 가지 클러스터 화합물에 포스핀이 결찰될 수 있다 (Cheng ET AL., 127 J STRUCT. BIO. 169~76 (1999). 피기백킹의 또 다른 예로, 클러스터 화합물은 술포네이트 에스테르와 같은 알킬화 모이어티로 유도될 수도 있다. 관련 합성 공정은 Susan Ermer, ET AL, J. ORGANOMET. CHEM., (1980), 187, 81-90에서 설명되어 있다. 핵산 중합체를 알킬화시키는데 술포네이트 에스테르를 이용하는 것에 대해서는 Yi-Zhang ET AL., 32(31) BIOCHEMISTRY 7954-7965 (1993)에서 볼 수 있다.

본 발명에서는 핵산(가령, DNA) 가닥의 특정 부위에 선택된 염기의 위치적 서열(positional sequence)이 결정됨으로써 핵산 중합체의 서열 정보를 얻는 방법이 제공된다. 서열 정보는 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 하나 이상의 핵산 염기의 위치가 공지된다는 의미이며, 위치 서열은 다른 염기에 대하여 적어도 하나의 염기 (가령, T) 위치들이 결정된다는 것을 의미한다. 예를 들어, T가 라벨링된 25개 염기 DNA 가닥에서, 25개 염기 영역 내 위치 서열이 다음과 같이 표시될 수 있다:

TOOOTOOOOTTTOOTOOTOOOTOOT

이때 "0"은 T 이외의 염기이다. 따라서, Ts와 Ts가 아닌 위치를 파악함으로써 Ts의 위치 서열이 결정된다. 이 설명으로부터 인지할 수 있는 바와 같이, T 및/또는 C 및/또는 G 및/또는 A 또는 이의 조합의 위치 서열이 결정된다. 본 발명의 방법에서는 단일 핵산 가닥에서 적어도 하나의 염기의 위치 서열이 적어도 70%, 또는 적어도 80% 및 가끔 적어도 90% 정확성으로 제공된다. 적어도 100개 내지 100만개의 염기, 일부 경우 200개 내지 100만개의 염기, 일부 경우 1000개 내지 100만개의 염기, 일부 경우, 10,000개 내지 100만개의 염기를 포함하는 부위에서 위치 서열이 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 가닥에서 적어도 200개, 적어도 1000개, 적어도 5000개, 적어도 10,000개, 적어도 100,000개 또는 적어도 하나의 100만개 염기 부위에서 위치 서열이 결정된다. 일 실시예에서, 적어도 하나의 염기의 위치 서열은 1000개 내지 100,000개 염기 범위에서 결정된다. 서열이 공지된 DNA를 다시 시퀀싱함으로써 이 방법의 정확도가 결정될 수 있을 것이다.

"위치 서열"은 서열 정보 중 한 가지 형식이다. 명세서로부터 개별 염기에 위치 서열을 비교함으로써, 가닥 또는 게놈 부위 내 4개 모든 염기의 위치 서열(완전한 서열)을 포함하는 좀더 완벽한 서열 정보를 얻는 것이 가능하다.

유리하게는, 본 발명의 시퀀싱 방법은 DNA 또는 핵산 가닥에 의존하거나 변형된 뉴클레오티드를 이들에 결합시키는 것에 의존하지 않는다. 이 방법은 양립성이 있으며, 효소적으로 결합된 라벨(중합 동안 결합된)을 이용할 수 있지만, 분리된 그리고 직접 라벨링된(예를 들어, 상기에서 설명된 그리고 문헌에서 설명된 라벨을 이용하여) 자연 발생적 DNA 가닥을 더 많이 이용한다. 또한, 본 발명은 이중 가닥 분자보다는 단일 가닥 DNA의 서열 결정이 가능하게 됨으로써 (반드시 그럴 필요는 없지만), 따라서 다른 방법들에 발생될 수 있는 모호성이 제거된다.

핵산 부유액

단계 108에서, 핵산 가닥 내에 염기간 공간이 일관되도록 하기 위해 빈 공간으로 개별 핵산 중합체가 신장되도록 한다. 일 실시예에 따라, 개별 DNA 가닥은 공간상으로 연장된다(가령, 가닥 길이 중 실질적인 부분이 기질에 의해 지지되지 않거나 용액 또는 완충액내에 부유된다). 용액 또는 완충액으로부터 기본적으로 자유롭게 부유된 DNA는 후속 영상화를 위하여 영상 기질로 이동된다. 이 과정은 하기에서 상술되는 DNA 트레딩(DNA threading)으로도 지칭된다.

DNA 부유액이 빈 공간으로 나옴으로써 핵산 중합체의 염기간 공간이 일정하게 된다. 개념적으로 두 손으로 스프링의 양단을 쥐고 신장하는 것과 유사하다. 이때 스프링의 각 루프는 모두 동일한 힘을 받기 때문에 루프간의 거리는 동일하다. 이는 전자 현미경에서 볼 수 있는 중 원자 라벨들이 핵산 중합체를 따라 실질적인 공간에 상응하도록 공간과 이들이 부착된 특정 염기의 공간에 상응하게 배치되도록 만든다. 또한, 라벨링되지 않은 염기의 위치는 일관된 공간에 근거하여 결정될 수 있다.

특정 실시예에서, DNA 가닥의 한 단부가 부착된 수단에 의해 DNA가 부유된다. 복수의 핵산 중합체 가닥 또는 단일 가닥이 포함된 용액(일반적으로 한 방울) 내로 수단이 잠길 수 있고, 핵산 가닥은 수단의 팁(tip)에 선호적으로 결합되어, 용액 밖으로 수단을 끌어당길 때, 핵산 가닥의 제 1 말단은 용액에 있고, 제 2 말단은 수단에 부착되어, 양단 사이 부분("부유된 부분")이 공간에서 부유되는 있는 방식이 된다. DNA 분자의 "양단"은 용액 내 분자의 물리적인 말단(가령, 5' 인산염 및 3'하이드록실기)으로 반드시 정의될 필요는 없다. 예를 들어, 140 kb 분자는 한 방울 용액 내 한 단부에 20 kb, 부유 부분은 100 kb, 바늘에 결합된 또 다른 단부는 20 kb로 구성될 수 있다. 핵산 중합체 가닥의 염기가 연장되어, 염기의 염기간 공간이 일관되도록 핵산 가닥이 부유된다. 특히, 각 인산염의 중심에서 중심까지 측정될 경우 염기-염기 공간 또는 주기성(periodicity)은 염기간 약 3Å 내지 약 7Å 범위 내에 있다.

일 실시예에서, 한 방울은 약 0 5 ㎕ 내지 약 50 ㎕; 일부 경우 약 1 ㎕ 내지 약 25 ㎕; 일부 경우 약 1 ㎕ 내지 약 15 ㎕; 일부 경우 약 1 ㎕ 내지 약 10 ㎕; 그리고 일부 경우 약 1 ㎕ 내지 약 5 ㎕의 용적 범위를 갖는다.

일부 실시예에서, 단일 핵산 중합체 가닥의 적어도 일부분은 수단과 액체사이 공간에 부유될 수 있다. 핵산 중합체 가닥의 염기들은 염기간 공간이 일관되도록 연장될 수 있다. 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å 범위, 특히 5Å의 범위 내에 있을 수 있다. 가닥이 선형이 되도록 핵산 중합체 가닥이 연장될 수 있다.

DNA 분자를 빈 공간으로 끌어내기(가령, 방울 밖으로) 위해 이용된 수단은 단일 핵산 가닥에 결합되고, 이를 공간 내 부유시키는데 이용될 수 있는 다양한 장치 중 임의의 것이 될 수 있다. 일부 실시예에서, 수단은 뾰족한 바늘, 공동(hollow) 바늘, 또는 자성 프로브로 이용된 핵산에 결합 친화력을 갖는 작은(가령, 직경이 약 300nm 미만) 자성 입자다.

한 방법에서, 수단은 뾰족한 바늘이 된다. 뾰족한 바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 실리콘, 또는 매우 뾰족한 바늘로 만들 수 있는 임의의 기타 다른 적절한 물질로 구성될 수 있다. 표준 피펫 풀러(standard pipette puller), 미세조립(microfabrication)(Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication, P. Rai-Choudhury, SPIE Optiacl Engineering Press) 1997), 증대(growth), 또는 조형(molding) 및 주조(casting)와 같은 당업자에 공지된 기술을 이용하여 바늘 팁(tip)이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 에탄올 불꽃에서 유리 화어버(미세관과 동일한 직경)의 중간을 가열시키고, 화이버의 양단중 하나를 잡아당기면 유리 바늘이 만들어질 수 있다. 대안적으로, 표준 피펫 풀러가 이용될 수 있다. 도 2에서 볼 수 있는 것과 같이, 일 실시예에서, 바늘(200)에는 약 200nm 미만의 직경을 갖는 팁(tip)(206)이 포함된 인접 단부(202), 말단부(204), 그리고 인접 단부와 말단부를 이어주는 샤프트(208)가 포함될 수 있다. 팁(206)은 약 1㎛ 미만, 최대 1㎛ 또는 1㎛ 이상의 직경을 가질 수 있다. 팁의 직경은 SEM을 이용하여 측정될 수 있다. 말단부의 곡률 반경은 기하학적 방식으로 측정될 수 있는데, 예를 들어, 팁에서 둥근 부위를 확인하고, 이를 만곡에 고정된 가상 원에 끼워넣고, 원의 중심에서 원주까지의 거리를 측정함으로써 원의 반경이 측정될 수 있다. 일부 경우, 바늘 단부의 둥근 호는 원의 외부 모서리에 대략적으로만 근접될 것이다(도면 3). 다른 경우, 약 20nm 내지 약 500nm의 대각선을 갖는 편평한 대지를 닮도록 바늘의 단부가 부러져있을 수 있다. 바람직한 직경은 약 300nm 미만이 될 수 있다.

핵산의 단부에 선호적으로 결합되는 물질로 바늘 팁이 코팅되어 기능화될 수 있고, 이와 같은 물질에는 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 실란화, 게놈 서열에 상보적인 올리고 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 제한효소 오버행(overhangs)(올리고머는 이노신과 같은 염기에 퇴행적으로 쌍을 이루는 것이 포함되어 더 큰 선택적 범위가 허용됨), 특이적 서열 또는 구조에 높은 친화력을 갖는 아파타머, 스트렙타아비딘 또는 바이오틴과 같은 분자에 높은 친화력을 갖는 기타 단백질 또는 핵산의 단부에 특이적으로 부착되는 임의의 기타 적절한 물질이 포함된다. 하나의 특이적 실시예에서, 바늘 팁을 아세톤 약 0.5% PMMA 용액에 담그고, 아세톤 포화 대기에서 건조시켜 바늘 팁이 PMMA로 코팅될 수 있다.

추가 실시예에서, 바늘 팁에서 핵산이 결합되는 부위를 제한시키기 위하여 제 2 코팅으로 팁이 코팅될 수 있는데, 여기에는 옥탄티올, 노난티올, 헥사데칸티올, 또는 기타 선형 알칸-티올 쇄와 같은 물질들이 포함된다. 도면 2에서, 코팅 1은 DNA 양단에 결합되나, 코팅 2는 결합되지 않거나 다소 결합이 덜하다. 예를 들어, 한 가지 방법에서, 금으로된 바늘 팁이 폴리스티렌 용액에 담기고, 폴리스티렌이 전자빔에서 바로 팁 부분에 교차 연결될 수 있다. 후속적으로, 교차연결되지 않은 폴리스티렌은 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 아세톤 또는 클로로포름에 담그는 방식에 의해 바늘의 나머지 부분으로부터 제거된다. 바늘이 옥탄티올 용액에 잠길 수 있는데, 이로써 금에 단층이 형성되나, 폴리스티렌에서는 형성되지 않을 것이다. DNA의 양단은 옥탄티올 부분에는 결합되지 않는다.

또 다른 실시예에서, 자성 나노입자 올리고뉴클레오티드가 핵산 중합체 가닥의 양단을 특이적으로 라벨시키는데 이용될 수도 있다. 이 방식에서, 자성을 띄는 단부를 갖는 수단을 자성 라벨링된 핵산 중합체 가닥이 포함된 용액에 담그고, 나노입자 라벨링된 핵산 중합체 가닥의 단일 분자의 한 단부에 결합된다. 자성을 띈 수단을 용액 밖으로 당길 때, 핵산의 제 1 말단은 용액에 있고, 핵산의 제 2 말단은 수단에 부착되도록 핵산 분자가 연장되어 공간에 부유된다. 핵산 중합체 가닥의 염기들은 염기간 공간이 일관되도록 연장되어 핵산 가닥이 부유되고, 특히 염기-염기 공간은 염기간 약 3Å 내지 약 7Å 범위, 특히 5Å가 된다.

일 실시예에서, 뾰족한 수단은 공동(hollow) 바늘이 될 수 있다. 특히, 공동 현미침(microneedle)은 당분야 공지 기술로 제조될 수 있고, 핵산 용액이 구멍을 통하여 펌프될 수 있다. 후속적으로, 현미침은 공동 구멍 밖으로 바로 꿸 수 있도록 핵산 말단에 친화력을 갖는 지지 기질 또는 중합체-코팅된 뾰족한 고형 바늘에 접촉될 수 있다. 따라서, 공동 현미침들은 직접적으로 트레딩(threading) 도구로 작용되고, 정확한 용액 조절을 위한 채널로도 작용할 수 있다. 구멍은 당분야에 공지된 기술에 의해 제조되는데, 오로지 한 가닥만 구멍 길이 방향(bore-length-wise)으로 들어갈 수 있으며, 핵산 트레드 농도의 제어를 지원한다. 이것은 뾰족한 수단을 이용하여 용액 밖으로 DNA를 끌어내는 것과 일관된 공동 바늘을 이용하는 기술이다. 공동 바늘을 이용하는 것에 차이는 용액의 표면과 모양이 매우 작아지고, 공동 바늘 벽에 압박받게 된다는 것이다.

뾰족한 바늘이 기능화된 후에, 핵산이 뾰족한 바늘에 트레드("threaded") 또는 부착된다. 일 실시예에서, 기능화된 뾰족한 바늘을 DNA 중합체 용액의 안과 밖으로 담그고, 도면 4에서 나타낸 바와 같이 DNA 가닥을 빈 공간으로 끌어당겨 DNA 트레딩이 실시된다. 바늘 팁은 약 1nm/hr 내지 약 10 m/s 범위, 특히 1㎛/s 내지 약 10 mm/s의 속도로 용액의 안과 밖으로 이동될 수 있다. 당겨져 나온 DNA 가닥은 DNA 용액 표면에 정상적으로 남아있게 됨을 인지할 것이다. AFM에서 이용되는 것과 같은, 피에조-작동기(piezo-actuators)를 포함하는 나노포지셔너를 이용하여 바늘의 위치 및 움직임이 옹스트롬 이하 단위로 정확하게 조절될 수 있다(우수한 양질의 피이드백 기전이 이용되어). 나노포지셔너는 당분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 5,903,085호에서 설명되며, Piezosystem Jena(Germany) 사에서 시판된다. 단일 가닥의 효과적인 트레딩에 영향을 주는 변수들에는 용액 온도, pH, 주변 대기 습도, 용액에 라벨링된 ssDNA의 농도, 용액의 안과 밖으로 잠기는 바늘의 속도, 용액에 바늘이 있는 시간, 바늘의 날카로움, 코팅, 바늘이 용액에 잠기는 깊이, 유입각 등이 포함된다.

"잠기는(dipping in)" 거리는 바늘에 부착된 DNA 양을 조절하는 변수다. (도 5). 예를 들어, 약 0.01 ng/㎕ 내지 약 0.5 ng/㎕ 범위의 농도를 보유한 고분자량 DNA의 경우, 바늘 잠김 거리는 용액 안으로 약 1Å 내지 약 20㎛ 범위가 될 것이다. 일 실시예에서, 얕은 잠김(shallow dipping)이 이용되었다 (도 6). 얕은 잠김의 경우, 용액 내 매우 짧은 거리(가령, 약 1㎛ 미만)에 바늘이 위치하여 가닥 결합에 이용될 수 있는 바늘 표면적이 제한된다. 바늘 트레딩에 다중 바늘 및/또는 자동화 시스템이 이용될 수 있다.

또 다른 변수는 용액에 머무는 바늘의 시간 양이다. 바늘 팁에 부착되는 핵산 분자의 양은 바늘 팁이 용액 내 머무르게 되는 시간의 양이 조절됨에 따라 조정될 수 있다. 주어진 용액에서, 용액 내에서 분자의 확산 및 바늘에 부착을 위해 요구되는 시간에 대한 함수로써, 바늘이 더 오래동안 머무르면 더 많은 부착이 초래될 것이며, 머무는 시간이 짧을수록 부착은 더 적어질 것이다. 이 시간 범위는 1ns부터 수초 내지 수분까지 다양할 수 있다.

예를 들어, 극단적으로 뾰족한 복수의 바늘이 충분히 가까운 공간을 두고 단일 나노포지셔너-구동 지지체 상에 위치될 수 있어, 단일 잠김 움직임으로 동시에 여러 가닥들이 가닥간에 간섭 없도록 충분히 떨어져 있는 상태로 끌어당기게 된다. 바늘의 평행한 또는 "배드(bed)"는 당분야에 공지된 미세제조 기술에 의해 만들어 질 수 있을 것이다.

핵산이 일단 바늘에 부착되면, 바늘이 용액 밖으로 당겨져 핵산 염기는 빈 공간으로 연장되어 염기간 공간이 일관되게 된다. 연장된 핵산은 약 3Å 내지 약 7Å, 특이적으로는 약 5Å의 공간 범위 내에 있다. 그러나, 염기의 공간은 이와 같은 배타적 범위로 제한되어서는 않아야 하고, 염기의 적절한 공간은 핵산이 셸프(shelf) 사용(하기에서 설명)을 통하여 추가 신장 여부와 같은 여러 변수에 따라 달라지기 때문이다. 공기-물 경계면과 바늘 팁 사이에 작용되는 힘으로 약 5Å의 염기간 공간을 유도해야하거나 약 65 pN의 힘을 유도해야 한다. 빈 공간에서 특정 연장된 가닥의 총 길이는 가닥에 염기 수에 평균 염기간 공간을 곱한 것에 상응될 것이다. 예를 들어, 약 5Å의 염기간 공간이 제공되면 약 1천만 염기 가닥은 약 5mm 길이로 신장될 것이다. 핵산 가닥은 약 20nm의 길이, 일부 경우 약 100nm의 길이, 일부 경우 약 200nm의 길이, 일부 경우 약 1㎛의 길이로 신장될 것이다. 특정 핵산 풀(pool)에서 길이 분포가 고려되어야 할 것이다. 가닥이 용액 밖으로 완전하게 당겨지지 않으면 공기-용액 경계면에서 메니스커스 힘이 가닥 말단에 장력이 바늘 팁에 지속적으로 적용된다. 용액이 길이가 더 긴 핵산 중합체를 포함하면, 핵산 가닥은 길이가 더 짧은 핵산 중합체가 포함된 용액에 비교하여 용액으로부터 더 먼거리로 당겨질 것이다. 일관된 염기-염기 공간을 얻기 위한 충분한 신장은 핵산 분자의 분자량에 대한 직선 함수다. 특이적 실시예에서, 핵산 가닥은 신장될 것이고, 적어도 약 2㎛의 길이로 연장되며, 좀더 특이적으로, 적어도 약 25㎛의 길이로, 더욱 특이적으로는 적어도 약 50㎛, 그리고 더욱 특이적 적어도 약 100㎛의 길이로 연장된다.

핵산을 신장하는데 관여되는 힘이 공유 결합을 파괴하지 않기 때문에, 신장하는 과정 동안에 핵산이 파괴되지는 않을 것이다. 공기-물 경계면에 작용되는 메니스커스 힘은 2차 구조를 제거할 정도로 충분히 강하나, 공유 결합을 파괴시킬 정도로 강하지 못하다. 트레딩 장비가 용액 밖으로 DNA를 끌어내는데 요구되는 것 이상의 추가 힘이 적용되도록 배열되고, 설정되어 있다면, DNA가 파괴되지 않도록 주의를 기울여야 한다.

많은 실시예에서 방울의 위치 및 각을 조절하고, 기화를 최소화시키는 것이 바람직하다. 가장 간단한 방식으로, 방울은 PDMS 홀더 피스의 신중한 위치 및 배치로 움직이지 않도록 유지된다. 도 21에서, 패널 I에서는 격자 홀더 피스에 방울의 접근을 보여준다. 패널 II에서는 PDMS의 두 피스간에 유지된 방울을 보여주는데, 방울은 트레딩 표면 정면에 유지될 것이다. 방울이 기화될 때, 트레딩 표면 정면은 변화없이 유지되며, 단지 물러가는(receding) 표면 정면만 Panel III를 이동시킨다. 또 다른 간단한 방식에서 습실(humid chamber)은 트레딩 장비 주변에 만들어져, 높은 습도(가령 약 100%) 상태가 되며, 방울은 기화되지 않을 것이다.

대안으로, 핵산 가닥이 용액으로부터 제거되어, 광학 또는 자성 비드를 이용하여 용액 내 두 점에 핵산 가닥이 부착됨으로써 두 점 사이에 부유될 것이다. (Bustamante, C, ET AL., 421(6921) NATURE 423~427 (2003)). 그 다음 가닥이 동결 건조되고, 얼음이 승화되어 사라지면 부유된 단일 가닥이 남게 되어, 영상 기질로 이동될 것이다. 다른 실시예에서, 개별 핵산 가닥은 단일 자성 입자에 결합되고, 그 다음 방울로부터 철수되어(가령, 자성 프로브를 이용), DNA 가닥은 공간으로 연장된다.

영상 기질에 부착

단계 110에서, 핵산 가닥이 빈 공간 내 바늘과 방울 사이에 트레드되고, 핵산 가닥은 용액 또는 완충액에 에워있지 않으며, 전자 현미경을 통한 영상화를 위하여 지지 기질 또는 영상 기질과 같은 기질 상에 가닥이 바로 위치될 것이다. 이를 실행하기 위한 한 가지 방법은 "셸프 트레딩(shelf threading)"이라 불리고, 연장된 DNA 가닥들이 영상 기질 상에 위치하거나 또는 지지 기질 상에 위치하고, 별도 단계에서 영상 기질로 이동된다 (도 7 참조). 관련 방식을 "갭 트레딩(gap threading)"이라 지칭하는데, 이때 DNA 가닥들은 지지 기질 내 갭을 통하여 부착되며, 별도 단계에서 영상 기질로 이동된다 (도 15 참조).

가닥이 "부유된 부분" 내에서 겹치거나 교차되지 않는 한 2차원 내지 3차원 내 방향이 포함되는 많은 방향으로 가닥이 배치될 수 있다. EM 샘플 준비를 위한 가장 편리한 표준 방법은 서로 평행하게 위치된 복수의 가닥으로 된 2차원이다 (도 8 참조). 이와 같은 형태에서, 빈 공간 또는 "샘플이 없는" 공간에 대해 샘플의 비율이 최대화될 것이다. 일반적으로, 가닥간 공간은 가닥이 이들 주변의 동정이나 가시화를 방해할 정도로 근접되지 않는 한, 가까울수록 더 낫다. 준-나노메터 정확성을 갖는 포지셔너(positioners)가 시판되고 있으며, 좀더 편리한 형태는 가닥들이 서로 약 2nm 내지 약 10nm 선형 범위로 떨어져 있도록 배치된다. 다른 실시예에서, 가닥들은 방사 모양으로 배치된다.

일 실시예에서, 다중의 부유된 가닥은 실질적으로 직선 방향으로 배치될 것이다. 도 12에서는 핵산 가닥(704)의 배치를 보여주는데, 핵산 가닥(704)을 포함하는 용액 방울(702)로부터 바늘(706)을 이용하여 기질(1202) 상에 DNA가 배치된다. 가닥을 증착시키고(deposit), 들어올리고(lifting-up), 가닥 사이에 바람직한 거리에 걸쳐 해독(translate)되도록 하기 위하여, 지지 기질을 따라 바늘 팁의 잠김(dipping-in), 꺼냄(dipping-out), 내려놓음(setting-down), 그리고 선택적으로 드래깅(dragging) 순서의 기본 프로그램된 나노포지셔너-제어된 바늘 움직임이 반복됨으로써 근접한 공간을 둔 핵산 가닥 가령, DNA 가닥의 평행한 복수의 배열이 형성된다. 산업적, 높은 처리량 규모에서 이와 같은 방식, 특히 바늘이 평행한 거대 배열에 이용되어 수백만 가닥이 지지 기질 상에 배치될 것이다.

이 방법은 다른 방법들보다 좀더 바른(선형에 더 가까운) DNA 가닥을 제공하기 때문에, 복잡한(crowded) 배열이 이용될 수 있고, 정확하게 서열이 결정될 수 있다. 배열에는 약 200만 내지 1000만개 범위의 실질적으로 선형 가닥 및/또는 평행한 가닥이 포함되는데, 부유된 영역의 길이는 약 1㎛ 내지 약 5 mm 범위가 되고, 약 1nm 내지 약 10nm 범위의 공간을 가지고 있어, 밀도는 약 1 염기/nm² 내지 약 1 염기/5nm² 범위가 된다. 예를 들어, 배열은 5개 이상, 10개 이상, 100개 이상, 1000개 이상 또는 10,000개 이상 DNA 가닥을 포함할 수 있다.

분명하게 본 발명은 선형(직선) 이중 가닥 및 단일 가닥의 핵산 가닥을 만든다. 선형성(Linearity)은 지지 기질에 가닥(또는 이의 선형 부분)을 에워싸는 가상 상자 또는 좀더 편리하게는 가닥의 2차원 돌출(또는 가닥 자체)을 에워싸는 가상 직사각형의 크기로 설명된다. 가닥의 선형 부분은 통상 적어도 약 2㎛, 좀더 빈번하게는 적어도 약 5㎛, 더욱 빈번하게는 적어도 약 10㎛, 20㎛, 30㎛, 50㎛ 또는 100㎛ 의 길이를 갖는다. 일부 경우, 가닥의 선형 부분은 가닥의 거의 전체 길이가 될 것이다. 일 실시예에서, 직사각형은 가닥 또는 이의 선형 부분을 에워싸도록, 그리하여 모든 부분이 직사각형내에 있도록 최소한의 가능한 가상 직사각형이 그려지고, 직사각형의 길이 대 폭비는 100:1 미만, 적절하게는 적어도 160:1 또는 적절하게는 적어도 200:1, 좀더 바람직하게는 적어도 500:1, 그리고 더욱 바람직하게는 적어도 2000:1이 될 것이다. 예를 들어, 선형 부분의 길이가 5㎛인 경우, 편평한 표면상에 선형 트레드 가닥을 에워싸는 상자는 폭이 약 30nm(1:160 비율) 또는 2.5nm(2000:1 비율)이 될 것이다. 10㎛ 길이의 가닥인 경우, 바운딩(bounding) 상자는 10㎛, 62.5nm 비율은 160:1이 될 것이다. 3㎛ 길이의 선형 부분인 경우, 바운딩 상자는 500:1의 비율로 4nm가 될 것이다. 3차원에서, 상자의 3차원(깊이)은 폭 크기의 5배, 바람직하게는 2배 범위 내, 가장 바람직하게는 폭과 동일하게 된다. 본 발명의 방법을 이용하여 배치된 가닥이 직선이기 때문에(통상 부유된 부분의 전장을 따라 실질적으로 위치된), 배열에서 이웃 가닥들은 서로 매우 근접하게 배치되는데, 가령, 이웃 가닥으로부터 약 2nm 떨어진, 약 3nm 떨어진, 약 4nm 떨어진, 약 10nm 떨어진, 약 20nm 떨어진, 또는 약 50nm 떨어져 있다. 일부 실시예에서, 복수의 이웃 가닥들은 50 mn 미만으로 떨어진, 적절하게는 20nm 미만으로 떨어진, 더욱 적절하게는 10nm 미만으로 떨어진, 또는 4nm 미만으로 떨어져 있다(예를 들어, 2 ~ 50nm 떨어진, 2 ~ 20nm 떨어진, 2 ~ 10nm 떨어진, 4 ~ 50nm 떨어진, 4 ~ 20nm 떨어진, 또는 4 ~ 10nm 떨어진). 특정 실시예에서, 선형 가닥은 서로 교차되지 않도록 배치된다.

셸프 트레딩( Shelf Threading )

한 방식에서, 영상 기질에 바로 DNA를 배치시키기 위해 셸프 트레딩이 이용될 수 있다. 도면 7, 패널 I-V 참고. 영상 기질은 단일 그래펜(graphene) 시트, 탄소, 베릴륨 옥사이드 또는 베릴륨 질화물, 얼음물(냉동-전자빔 기술에 요구), Z 번호가 낮은 고형(전자 투명한)의 매우 얇은 필름을 형성하는데 적절한 기타 물질과 같은 물질로 구성된 얇은 영상 필름을 지지한다. 이와 같은 매우 얇은 필름은 매우 민감하게 때문에, 이들은 격자 또는 TEM 격자상에 표준 폼바 레이시 필름, SiN 막(DuraSiN by Protochips, lnc)에 미세 조립된 구멍 또는 유사하게 조립된 다공성 격자로 구성된 매쉬상에 배치되거나 이들의 지지를 받는다. 도면 7에서는 복수의 라벨링된 핵산 가닥(704)(명확하게 보이기 위해 하나만 표시함)을 포함하는 용액 방울(702), 바늘(706), PDMS 블록(710) 상단의 TEM 격자(708)를 보여준다. 도면 7, Panel I에서 나타낸 것과 같이, 바늘(706)은 용액의 방울(702)에 잠긴다. Panel II에서, 바늘(706)은 용액(702) 밖으로 당겨져, 핵산 가닥(704)이 빈 공간으로 연장된다. Panel III에서, 연장된 핵산 가닥(704)이 TEM 격자(708)와 접촉된다. 핵산 가닥(704)이 바늘(706)로부터 방출된다 - Panel IV-V.

셸프 트레딩의 또 다른 방법에서, 도 8에 설명된 것과 같이, 지지 기질(710)을 핵산 중합체 용액(702) 옆에 배치시켜, 핵산 가닥이 방울 사이에 부유되고, 지지 기질에 접촉되도록 뾰족한 바늘을 아래로 내린다. 그 다음 복수의 핵산 가닥이 영상 기질로 이동되거나 하기에서 설명되는 것과 같이 "이동 프린팅"된다. 도 8, Panel I에서는 PDMS 지지 기질(710) 상에 핵산 가닥(704)을 증착시키는 단일 바늘이 구조적으로 설명된다. 도면 8, Panel II에서는 조립된 TEM 격자 (708)를 덮은 지지 필름상에 복수의 핵산 가닥(704)을 증착시키는 단일 바늘(706)이 도식적으로 설명된다 (바늘의 움직임을 두가지 위치의 타임-라인 통로에서 바늘을 나타냄).

도 9에서 설명된 것과 같이, 핵산 가닥은 방울 표면에 항상 정상적으로 있다. 지지 기질과 바늘 움직임에 대하여 용액 표면 각이 조절되어, 빈 공간에서 핵산(704)은 가닥이 기질에 배치되면 실질적으로 핵산 길이에 걸쳐 기질(708)과 접촉된다(도면 10). 핵산은 용액 밖으로 끌려나온 후에는 길게 연장될 것이다. 도 11, Panels I-IV에서는 전단을 내려 앉힌 후, 더 신장된 핵산의 연장을 보여준다. 도 11에서, 순수 메니스커스 힘보다는 기계적인 힘에 의해 더 신장되는 것을 설명하기 위하여 핵산이 과장되게 풀려있다. "A"와 "B"는 EM 격자(마이크로 규모) 내 두 개 막대와 같은 지지의 단면을 각각 나타내거나 또는 PDMS(마크로 스케일)의 두 개 스트립을 각각 나타낸다. "A" 와 "B"는 각각 평면 기질 상의 두 개 위치를 나타낼 수도 있다.

도 13과 14는 DNA 가닥 연장 및 배치에 있어서 몇 가지 변수들이 고려된다는 것을 설명한다. 한 가지 실패한 방식에서, 용액 표면/지지 기질/바늘 움직임 각의 부적절한 고려로 인하여 바늘-기질 접촉전, 지지 기질과 부유된 가닥 사이에 제어되지 않은 접촉이 유도될 것이고, 이는 다시 오버스트레칭(overstretching)을 통하여 가닥이 절단되는 원인이 될 것이다(도 13, Panel II). 또 다른 실패한 방식에서, 잘못 계산된 용액 표면/지지 기질/바늘 움직임 각으로 인하여, 가닥이 기질과 실질적으로 접촉되지 못하고, 가닥의 상당 부분이 용액 표면과 바늘-기질 접촉 점 사이의 빈 공간에 부유된 상태로 남아 있게 된다 (도 14).

갭 트레딩( gap threading )

또 다른 실시예에서, 지지 기질 상에 핵산 가닥을 배치시키기 위하여 갭 트레딩이 이용될 수 있을 것이다. 갭 트레딩은 다음의 방식으로 실시될 수 있는데, 도 15에서 도식적으로 설명된다. 도 15에서는 갭(1504)이 있는 PDMS 블록(1502), 갭(1504)을 가로 잇는 핵산 가닥(1506), 영상 기질인 경우, 탄소 필름 또는 다른 Z 번호가 낮은 필름으로 코팅된 울트라 플랫 실리콘 격자(1508)가 표시된다. 우선, 핵산 방울이 PDMS 소블럭내 갭 옆에 배치된다. 일반적으로, PDMS 블록은 약 3 mm의 길이와, 약 3 mm의 폭을 갖는다. 핵산은 상기에서 설명된 것과 같이, 뾰족한 바늘 트레딩에 의해 갭을 가로질러 이어져 있다. 핵산은 갭(1504) 전체에 이어져 있다. 탄소 필름, 다공성 금 필름, 또는 탄소 베릴륨의 연속 필름, 기타 Z 번호가 낮은 필름 또는 얇은 영상 필름(상기에서 정의된 바와 같은)으로 코팅된 울트라 플랫 실리콘 격자(1508)는 갭(1504) 사이에 신장된 핵산과 접촉되도록 배치되어, 핵산이 격자(1508)로 이동되게 된다(이를 "스와이프 프린팅"이라고도 칭함). 여기에서 사용된 바와 같이, "스와이프 프린팅"은 지지 구조상에 갭을 잇는 하나 이상의 핵산 가닥이 또 다른 지지 기질 또는 영상 기질 또는 영상 지지 얇은 필름이 될 수 있는 구조와 접촉되도록 하는 것이다. 갭(1504)에 이어진 DNA(1506)와 PDMS 블록(1502)이 뒤집혀서 하기에서 설명되는 이동 프린팅 방법에 의해 영상 지지 필름 (나타내지 않음)으로 이동될 수 있다.

이동 프린팅( transfer printing )

상기에서 논의된 바와 같이, DNA 가닥이 지지 기질에 배치되고, 후속적으로 영상 기질 또는 얇은 영상 필름으로 이동될 것이다. 이를 실행하는 한 가지 방식이 "이동 프린팅"이다. 이동 프린팅은 당 분야에 공지되어 있으며, Nakao, H., ET AL., 125 J. AM. CHEM. Soc. 7162~7163 (2003)에서 전반적으로 설명되어 있다. 이동 프린팅을 이용하여 지지 기질 또는 영상 지지 상에 핵산 가닥이 배치될 수 있을 것이다(도 16). 도 16에서는 길이 3mm, 폭 3mm의 PDMS 블록(1602), 핵산(1606)을 포함하는 방울(1604), 바늘(1608)이 도식적으로 설명되어 있다. 바늘(1608)이 방울(1604) 안으로 잠기고, 핵산(1606)의 가닥이 바늘(1608)의 팁(tip)에 결합된다. 바늘(1608)을 용액(1604) 밖으로 당겨, 핵산 가닥이 빈 공간으로 신장되도록 한다. 연장된 핵산 가닥(1610)이 PDMS 블록 (1602)에 부착된다. 복수의 핵산 가닥이 PDMS 블록 (Panel 6) 상에 배치될 때 까지 이 공정이 반복된다. 트레드된 한 개 가닥이 이미 트레드된 가닥을 방해하지 않도록(가령, 접촉, 통과) 추가적인 조치(더 큰 가닥간의 공간 형태로)가 취해져야 한다. 일단 원하는 수의 핵산 가닥이 PDMS 블록(1602) 상에 배치된 후, PDMS 블록(1602)이 역전되어 얇은 영상 필름 또는 다른 전달 기질(1612) 상에 배치된다. PDMS 블록(1602)이 필름(1612)으로부터 제거되어, DNA가 필름(1612) 상의 뒤에 머무르는 동안, 복수의 핵산 가닥이 필름(1612)으로 이동된다. 핵산이 이동되고, 추후 영상을 위해 TEM 격자 상에 얹혀질 때 필름은 탄소, 베릴륨, 또는 새로 쪼갠 결정 염에 증착된 다른 Z번호가 낮은 지지 또는 미카 시트(미도시됨)가 될 수 있다.

대안적으로, 핵산 가닥이 지지 기질에 배치되고, 또 보관, 운반 또는 다른 목적을 위해 다른 지지 기질로 이동될 수 있다. 얇은 영상 필름은 영상 기질일 수 있고, 이는 탄소, 붕소, 베릴륨, 알루미늄, 또는 Z번호가 낮은-원소 및/또는 질화물 및 이의 산화물로 구성된 얇은 필름 또는 기존의 정의된 필름이다. 이들 필름은 공지의 기술에 의해 제조될 수 있는데, 예를 들어, 쪼개진 결정염 또는 미카상에 증착에 의해 제조될 수 있다. 한 가지 특이적 측면에서, 상당히 얇은(약 1.5nm) 탄소 필름이 이용된다. 또 다른 측면에서, 영상 기질은 얇은(약 1.5nm 두께) 탄소 지지 필름으로 덮인 울트라-플랫 실리콘 TEM 격자다. 얇은 영상 필름은 폼바 마이크로-메시-코팅된 TEM 격자 상에 배치되거나 규칙적인 또는 불규칙적인 구멍을 갖는 기계로 만든 실리콘 격자상에 배치될 수도 있다.

일 실시예에서, 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체 가닥은 평면 기질 상에 배치될 수 있다. 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체 가닥은 약 1000개 염기쌍 길이에 걸쳐 일관된 염기-염기 공간을 보유할 수 있다. 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체 상부에 필름이 배치되어 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체가 평면 기질과 필름 사이에 끼워지게 된다. 필름은 탄소 또는 Z 번호가 낮은-원소로 구성될 수 있다. 평면 기질은 PDMS, 탄소, 붕소 리튬, 수소, 베릴륨, 알루미늄 질화물, 산화 질화물 및 이의 복합물과 같은 물질로 구성될 수 있다.

상기에서 설명되는 방법이 핵산 중합체에 국한되는 것이 아니며, 다른 긴(분지를 이루지 않는) 고분자량의 많은 분자에도 이용될 수 있다. 예를 들어, 기타 고분자량 중합체에는 나노튜브(nanotubes)(가령, 탄소 질화물, 붕소, 붕소 질화물, 및 이와 유사물), 아미노산 쇄, 마이크로튜블(microtubules), 악틴 필라멘트, 기타 반복 단위가 있는 긴 선형 중합체, 적절한 수단상에 트레드되고 적절한 기질에 부착될 수 있는 기타 중합체가 포함되나 이에 국한되지 않는다. 특히, 이들 방법은 선형 중합체의 말단(단부)에서 바늘 또는 다른 결합 수단에 차등적으로 결합되는 중합체와 함께 이용될 수 있다. 일부 실시예에서, 선형 분자는 단부가 수단에 선호적으로 결합될 수 있도록 말단 또는 단부에 변형이 있을 수 있다. 예를 들어, 중합체의 단부는 당분야에 공지된 기술을 이용하여 DNA에 복합될 수 있고, 이로써 상기에서 설명된 것과 같이 말단에서 상기 수단에 선호적으로 결합될 수 있다.

안정화( Stabilization )

전자 현미경에 의해 발생되는 전자빔에 의해 핵산이 손상될 수 있다. 이와 같은 이유로, 일부 실시예에서, 영상 기질에 일단 배치되면, 라벨링된 핵산 가닥을 영상화 전에 안정시킬 수 있다. 예를 들어, 기화, 스퍼터링(sputtering) 또는 사전-만들어진 필름의 직접적 증착에 의해 추가적인 탄소 또는 기타 Z번호가 낮은-원소 또는 중합체가 샘플 상에 배치될 수 있다. 탄소 또는 기타 Z번호가 낮은 물질의 간접적 기화는 탄소 또는 베릴륨의 초고속 PLD-UHV에 의해 실시될 수 있다. 이와 같은 추가 층(가령, 상부코팅(topcoat))이 존재함으로써 아래에 있는 핵산의 안정성이 증가된다. 도면 17에서는 다공성 메시(1704), 염기 층(1706), 핵산(1708), 및 상부 층(1710)을 갖는 TEM 격자(1702)가 도면으로 설명된다.

일 실시예에서, 핵산 상부 코팅이 기화됨으로써 핵산이 안정화되는데, 라벨링된 핵산 중합체가 임베딩된(embedding) 고형의 균질한 필름을 제공하기 위해 최적화된 압력, 샘플을 표적하는 거리, 펄스 길이, 펄스 빈도, 펄스 영향의 조건을 가지고, 증착된 원자들을 식히는 기체 압력에서 펄스된 레이져 증착에 의해 상부코팅이 만들어진다. 이들 조건들로 인하여 증착 원자들이 기질로 가는 도중 서로 최소의 반응을 가지도록 하여 라벨이 완전하게 임베딩(embedding)된 조밀한 필름이 만들어질 것이다. 상부코팅의 목적은 서열 데이터가 결정되고, 움직임 또는 손상을 방지하는 방식으로 라벨 및/또는 DNA를 안정시키는 것이다.

표준 TEM에서 취해지는 단일 원자의 우수한 영상을 위해 얇은 영상 필름은 매우 얇아야 한다. 표준 기술에 의해 만들어지는 필름은 종종 실험실 대기에 노출후 오염되기도 한다. 이와 같은 오염물이 쌓이면 필름이 두꺼워지게 되고 단일 원자 및 클러스트의 영상화가 방해된다. 필름이 두꺼워지는 것 이외에, 공기로부터 오염은 전자빔과 상호작용될 때, 필름이 구조적으로 불안정하게 만드는 원인이 된다. 이와 같은 오염물 축적이 일어나지 않도록 필름의 청결 및 취급이 엄격해야 한다. 여기에서 설명된 모든 방법에서, 모든 단계들은 탄화수소 없는 제어된환경(가령, 순수 질소, 아르곤 또는 다른 비활성 기체)에서 실시되는 것이 바람직할 것이다. 일단 DNA가 부유되고, 영상 기질에 배치되거나 PDMS와 같은 기질로 이동되고, 용액으로부터 빼낸 후, 모든 추가 단계들은 제어된 환경, 바람직하게는 탄화수소 없는 깨끗한 가스, 바람직하게는 UHV(10^-10torr)에서 지속되는 것이 좋다. 조절된 대기 환경에서 트레딩이 실시되고, UHV내 필름위에 DNA 가닥이 배치되는 것이 포함될 수 있으며, 나노기술, 반도체 제조등의 분야의 당업자에 공지된 기타 클린 기술이 포함될 수 있다(Krishnan, S; Laparra, O "Contamination issues in gas delivery for semiconductor processing" Semiconductor Manufacturing, IEEE Transactions on Volume 10, Issue 2, May 1997 Page(s): 273 ~ 278; William Whyte, Clean room Technology; Fundamentals of Design, Testing and Operation; Dorothy Hoffman, Handbook of Vacuum Science and Technology).

현미경 자체의 오염이 단일 원자들의 가시성(visibility)을 제한시키는 주요인자가 되기도 한다. 영상화를 위하여 매우 깨끗한 건조된 시스템이 보유되도록 주의를 기울여야 한다. 이러한 것들에는 콜드 트랩(cold traps), 다중 이온 펌프(multiple ion pumps), 터보 펌프(turbo pumps), 티타늄 승화 펌프(titanium sublimation pumps), 수착 펌프(sorption pumps), 스테이지 히터(stage heaters), 및 로드 락(load locks)(Dorothy Hoffman, Handbook of Vacuum Science and Technology)를 보유하는 것이 포함된다.

단계 112는 본 발명의 실시예를 설명하는데, TEM 격자상의 라벨링된 핵산이 전자 현미경에 의해 영상화된다. 본 발명은 이 단계에서 TEM 격자로 한정시키고자 하는 의도로 해석되지 않아야 하고, 당업자에 공지된 임의의 영상 기질이 이용될 수도 있다. 또한, 임의의 적절한 전자 현미경이 이용될 수 있는데(가령, Titan-80-300, Nion UltraSTEM, 또는 VG 501 전자 현미경) 라벨 위치가 보이도록 HAADF STEM을 이용하는 적절한 변형 수정기(aberration corrector)를 갖춘 전자 현미경이 바람직하다.

단계 114에서, 핵산 서열 데이터가 생성되고, 분석된다. 본 발명의 일 실시예에 따라, 도 18에서는 핵산 서열을 분석하는 시스템이 도시되고, 시스템에는 전자 현미경(2202), 프로세스 모듈(processor modules)(2204), 적어도 하나의 메모리 모듈(memory modules)(2206), 분석기 모듈(analyzer modules)(2208), 사용자 인터페이스(user interface)(2210), 그리고 네트워크 경계면(network interface)(2212)이 포함될 수 있다. 전자 조밀 부분을 나타내는 전자 시그널이 생성되도록 전자 현미경(2202)이 설정될 수 있다. 전자 현미경(2202)에 의해 생성된 전자 시그널에 근거하여 핵산 서열이 분석되도록 분석기 모듈(2208)이 설정된다. 적어도 하나의 메모리 모듈(2206)은 전자 현미경에 의해 생성된 핵산 서열을 나타내는 적어도 하나의 전자 시그널의 저장 및/또는 분석에 적합하다. 사용자 인터페이스(2210)은 사용자가 분석할 수 있도록 설정된다. 특정 실시예에서, 적어도 하나의 메모리 모듈에는 분석을 저장하기 위한 그리고, 핵산 서열을 나타내는 전자 시그널을 저장하기 위한 별도 메모리가 포함될 수 있다. 추가 실시예에서, 분석기(2208)와 적어도 하나의 메모리 모듈(1806)은 전자 현미경으로부터 떨어져 있으며, 네트워크를 통하여 전자 현미경에 연결된다. 하나 이상의 모듈은 다양한 기능이 실행되도록 하기 위해 컴퓨터 또는 프로세서와 같은 동일 장치내 위치된다. 대안으로, 모듈은 다양한 기능이 수행되도록 별도 피스(pieces) 구조가 될 수도 있다.

더욱 특이적 실시예에서, 데이터 분석은 도 19에서 나타낸 바와 같이, 시판되는 시스템 또는 사용자 시스템(custom system)으로부터 집합될 수 있다. 도 19의 시스템에는 전자 현미경(1902)(시판되는 또는 사용자 현미경), 프로세스 감지기(1904), 영상 인지 컴퓨터(image recognition computer)(1906), 적어도 하나의 메모리 모듈(1908), 분석기 모듈(1910), 사용자 인터페이스(1912) (스크린 상에 개념적 뷰), 그리고 선택적 네트워크 경계면(인터넷 또는 인트라넷)이 포함될 수 있다. 핵산 서열을 나타내는 전자 시그널을 생성시키도록 전자 현미경이 설정될 수 있다. 전자 현미경(1902)에 의해 생성된 전자 시그널에 근거하여 핵산 서열이 분석되도록 분석기 모듈(1910)이 설정된다. 일부 실시예에서, 메모리는 하드 또는 플로피 디스켓, 광학 매체, 콤팩트 디스크(CD), 디지털 비디오 디스크(DVD), 반도체 매체 및 플래시 메모리로 이루어진 군에서 선택된 매체가 된다.

수작업으로 또는 바람직하게는 영상 인지 시스템을 이용하여 최종 서열 정보가 어셈블리된다. CCD 감지기, CMOS 또는 PMT와 같은 데이터 고출력 감지기로부터 핵산의 공간 정보가 생성된다. 데이터 고출력 CCD 감지기로부터 수신된 정보로부터 예를 들어, 오스뮴 라벨의 공간이 결정되고, 따라서 주어진 라벨링 반응 배치에 대해 특이적 염기 서열을 결정하기 위해 알고리즘이 이용된다. CCD로부터 수신된 정보는 메모리에 저장되고, 분석된다. 메모리에는 통상의 하드 또는 플로피 디스크와 같은 자성 매체, 콤팩트 디스크(CD), 디지털 다기능 디스크(DVD) 및 이와 유사한 광학 매체, 및/또는 플래시 메모리와 같은 반도체 매체 등이 포함될 수 있다. 서열을 위한 알고리즘(컴퓨터 프로그램)은 잘 공지되어 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 또는 본 발명에 사용하기에 적합한 프로그램에는 DNA Naser 및 Cap3이 포함되는데, 이들은 당분야에 이용되는 가장 통상적인 서열 어셈블리 소프트웨어 프로그램이며, U.S 특허 6,760 668 "Method for Alignment of DNA Sequence with Enhanced Accuracy and Read Length" 및 U.S 특허 No 6,988,039 "Method for Determining Sequence Alignment Significance"에서도 설명되어 있으며, 이 내용은 참고문헌으로 전문 첨부된다. worldwide web at dnabaser.com/index. html (Heracle Software, Lihenthal, Germany); Huang, X, and Madan, A., 9 GENOME RES. 868~877 (1999) 참고. 어셈블리의 특정 변수들은 이용되는 라벨들의 성질에 일부 의존될 것이다. 일 실시예에서, 예를 들어, 영상화되는 각 가닥의 경우, 라벨링된 염기에 대한 위치 서열을 결정하기 위하여 라벨링된 각 염기 그리고 라벨링되지 않은 각 염기의 상대적 위치가 포함된 정보는 라벨의 특이성(모든 라벨링된 T, 모든 T 및 모든 C)과 관련되며, 그리고 정보는 저장된다. 가닥에 대해 그리고 이의 유추된 상보성에 대해 저장된 정보는 다른 가닥 및 이 가닥의 상보성에 대해 생성된 정보와 비교되어 일치되는 점이 확인된다. 완전한 서열을 만들기 위해 연속 서열이 확인되고, 어셈블리된다.

시퀀싱되는 핵산이 기존의 시퀀싱된 게놈(가령, 생쥐, 인간, 세균, 바이러스)으로부터 기인되는 경우, 초기 서열 데이터(다양한 가닥 내 위치 서열)를 공지의 기준 서열에 매치시켜 분석이 가속화될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 메모리에 저장된 핵산 서열(A, T, G, C)을 분석하는 것이 포함되는데, 이때 서열은 상기에서 설명된 방법들에 의해 결정되었다. 한 측면에서 본 발명에는 영상 데이터(가령, 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치), 위치 서열 (적어도 하나의 염기가 결정되지 않은 선택적 위치 서열) 또는 기타 서열 정보가 수신되고, 핵산 샘플의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 데이터가 프로세싱되는 것을 포함한다. 일반적으로 데이터는 전자형으로 수신된다. 일 실시예에서, 핵산 서열은 인간 개체의 게놈 서열이다. 일 실시예에서, 분석에는 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성의 존부, 복사체 수, 변이체, 삽입-결실(indel), 재배열 또는 전체 게놈 서열이 결정되는 것이 포함된다.

라벨링된 T를 갖는 단일 가닥 DNA의 예시적인 영상이 도면 19에 제공되는데, 중(heavy) 라벨링된 패턴이 영상화되는 부위의 부분적, 염기-특이적 서열 정보에 어떻에 대응되는지를 설명하는 도면이다. 상이한 라벨 및/또는 반응 조건들에 의해 동일한 서열의 다중 영상을 복합시킨 정보로 매우 정확한 서열 결정이 가능하다.

가닥이 신장되어 있기 때문에 핵산 골격을 추적할 필요가 없고, 독특한 중(heavy) 라벨로 모든 염기를 라벨링시킬 필요도 없다. 도 20에서는 대안 준비 방법의 고유한 모호성이 설명된다. 상기에서 설명된 그리고 하기 특정 실시예에서 본 발명의 방법을 이용함으로써, 유실된(missing) 라벨은 빈 점(blank spot)로 "판독"되기 때문에 단계 실행 오류(phasing errors)가 유입되지는 않을 것이다.

다중 라벨링 패턴은 기본 핵산 서열을 결정하기 위해 생체정보적으로(bioinformatically) 복합될 것이다. 본 발명의 방법은 단일 분자의 배치 조절로 효과적인 고처리량을 제공한다. 개별적으로(가령, 일관된 염기-염기 공간) 뿐만 아니라 단일 가닥의 예측가능한 평행한 조밀한 배열에 의해 매우 예측가능한 방식으로 가닥이 배열됨으로써 매우 효과적인 영상분석이 될 것이다. 본 발명의 방법에서 신장하는 힘의 조절이 가능하게 함으로써, 염기-염기 공간 정도가 최적화된다.

추가 설명 없이도, 당업자는 상기 설명에 의해 본 발명을 완전하게 이용할 수 있을 것으로 간주된다. 다음의 예는 오로지 설명을 위함이며, 어떠한 방식으로든 명세서 설명에 제한을 두고자 함은 아니다.

예 1

당분야에 공지된 기술을 이용하여 샘플로부터 관심 DNA를 분리한다. 관심 DNA는 4개 용액, 가령, 용액 1, 용액 2, 용액 3, 용액 4로 분배된다. 각 용액은 서로 상이한 시간과 서로 상이한 Os-bipy로 반응시켜, 상이한 염기-특이적 라벨링 밀도가 얻어지도록 한다.

용액 1과 용액 2는 26℃, 20시간 동안 100 mM Tris 및 10 mM EDTA가 포함된 TE 완충액, pH 8.0 오스뮴 테트라옥시드와 2,2'-비피리딘 4배 몰 초과량과 반응되며, 이 조건에서는 T는 약 100%, C는 약 85%, G는 약 7%, 그리고 A는 약 0% 라벨링된다. 용액 3과 용액 4는 용액 1과 용액 2와 동일한 조건에서 반응시키지만, 단, 반응은 15분간만 진행되며, 오스뮴 테트라옥시드와 2,2'-비피리딘 2.5배 몰과량이 이용되는 점이 서로 상이하고, 이 조건에서 T는 약 90%, C는 약 8%, G는 약 5%, 그리고 A는 약 0% 라벨링된다. 그러나, Os-bipy와 반응전, 메틸화되지 않은 C 잔기를 U로 전환시키기 위하여 용액 2와 용액 4는 중아황산염 처리를 먼저 받게 된다. 중아황산염 프로토콜은 당분야에 공지되어 있으나, 이 프로토콜의 매우 압축된 버전을 여기에서 설명한다: 최종 농도가 0.05 mM 하이드로퀴논, 3.3 M 중아황산나트륨염, 3 ng/㎕ 변성된 DNA을 원심분리 튜브에 넣고, 튜브 뚜껑을 닫고, 알루미늄 호일로 빛을 차단하고, 55℃에서 8시간 동안 항온처리시킨 후, 표준 방법에 의해 DNA를 정제시키고, 후속 중 원자 라벨링을 위해 TE 완충액(pH 8.0, 100 mM Tris 10 mM EDTA)에 DNA를 재부유시킨다. 이과정에 의해 중아황산염으로 처리되지 않은 것과 처리된 용액의 서열을 비교함으로써, 메틸화 패턴이 결정된다. 참고문헌, Jelen ET AL., 10 GEN. PHYS. AND BIOPHYS. at 461. 라벨링 반응 후, 라벨링되지 않은 오스뮴은 한외 여과에 의해 제거되어 영상 과정 동안 외부 중 원자 오염이 최소화되며, DNA 중합체는 TE 완충액 pH 8에서 약 0.1 ng/㎕으로 희석된다.

에탄올 불꽃에서 유리 화이버를 가열시키고, 분리를 위해 잡아당기면 곡면 반경이 약 200nm 미만인 두 개의 뾰족한 바늘이 만들어진다. 한 개 바늘은 아세톤 0.5% 용액에 담그고, 아세톤 대기에서 건조시킴으로써 PMMA로 코팅된다. 그 다음 홀딩 피스에 붙이거나 피에조 작동기(가령, 프로그램가능한 AFM 실리콘 캔틸레버)와 같은 포지셔너 암(arm)위에 바늘을 고정시켜 바늘의 위치 및 이동이 조절된다.

관심 DNA 중합체가 포함된 DNA 중합체 용액에 바늘을 담그고, 그 다음 꺼내면 DNA 중합체 용액으로부터 DNA 가닥이 빈 공간으로 연장 또는 "당겨지게(pull out)"된다. 연장된 DNA 중합체 가닥은 DNA 중합체 용액 표면에 수직이 되도록 유지되어야 한다.

얇은 탄소 필름(약 1.5nm 내지 약 5nm 범위의 두께를 갖는)으로 덮인 울트라-플랫 실리콘 TEM 격자에 DNA 중합체가 부착된다. 실리콘 피스의 한 측면상에서 탄소를 기화시키고, 뒷면은 에칭시켜, 미세가공 산업의 당업자에 공지된 기술을 이용하여 탄소 필름이 편편하도록 함으로써 실리콘 TEM 격자가 만들어진다.

격자는 DNA 중합체 용액 방울 옆에 배치되어 DNA 중합체 용액이 완전하게 빼내기 전에 방울과 뾰족한 바늘 사이에 부유된 DNA 중합체 가닥이 격자와 접촉되게 된다. 빈 공간으로 연장된 DNA 중합체는 가닥이 격자 상에 배치되었을 때만 TEM 격자와 접촉하게 된다. 이렇게 되도록 하기 위하여, 격자와 바늘의 움직임에 대해 DNA 중합체 용액의 각이 고려되어야 한다. 이와 같은 트레딩(threading) 기술이 이용됨으로써, 수천 내지 수백만 가닥이 TEM 격자 상에서 서로 평행하게 배열될 수 있다.

방울에 놓여있는 염기를 움직이기 위해 피펫 팁 또는 마이크로포지셔너를 이용하여 스패닝 위치(spanning position)로부터 DNA 중합체 용액을 떼어낸다. 약 0.5nm 내지 약 6nm 탄소가 기화되어 DNA 중합체를 안정화시킨다. 스패닝은 제어된 환경방에서 실시되어 기화 및 먼지를 최소화시킨다.

시판되는 Z-조영 STEM 방식으로 변형 수정기(aberration corrector)를 갖춘Titan 80-300 (FEI Company, Hillsboro, OR) 또는 다른 적절한 고해상 전자 현미경으로 영상화가 실행된다. 감지지로부터 수신된 정보를 이용하여 오스뮴 라벨 공간이 결정되고, 따라서 관심 DNA의 서열이 결정된다.

예 2

상기 특정 예 1과 동일한 방식으로 실행되나, DNA 중합체 자체를 도면 17에서 나타낸 것과 같이 PDMS 피스 위에 스팬다운(spann down)시킨다. 그 다음 미카 상에서 PDMS는 탄소 필름과 접촉되고, DNA 중합체가 탄소로 이동된다. PDMS 피스를 끌어내어, DNA 중합체는 남아있게 만든다. 약 1nm 내지 약 5nm의 탄소는 미카 상의 탄소 필름 상에 DNA 중합체 위에서 기화된다. 탄소 필름은 물에 뜨고, TEM 격자로 들어낸다(pick up). 그 다음 DNA 중합체는 특이적 예 1 또는 특이적 예 2에서 설명된 것과 같이 영상화되어, 서열 정보가 결정된다.

상기 제공된 예는 설명을 위한 것이며, 본 발명의 모든 가능한 실시예, 응용 또는 변형을 총망라한 목록을 의미하지는 않는다. 따라서, 본 발명의 설명된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 수정도 본 발명의 범주 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에 명백할 것이다. 본 발명은 특정 실시예들에 연계되어 설명되었지만, 청구되는 본 발명은 이와 같은 특정 실시예에 국한시키는 것이 아님을 인지해야 한다. 또한, 분자 생물학, 면역학, 화학, 생화학 또는 관련 분야 당업자들에 명백한 본 발명을 실시하기 위해 설명된 방식의 다양한 변형 또한 본 발명의 첨부된 청구범위 내에 있다.

상기에서 언급된 모든 문헌들 및 공개 내용은 개별적으로 언급된 것과 같은 정도로 전문이 명시적으로 참고문헌으로 포함된다.

Claims

DNA 중합체 가닥(polymer strand)의 서열 정보를 얻는 방법에 있어서,
a) 상기 DNA 중합체 가닥을 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 상기 DNA 중합체 가닥은 복수의 DNA 염기가 염기 특이성(base specificity) 또는 염기 선택성(base selectivity)을 갖는 조영제(contrast agent)로 라벨링되도록 처리된, 상기 DNA 중합체 가닥을 포함하는 용액을 제공되는 단계와,
b) 상기 용액에 DNA 결합 수단(DNA binding tool)을 도입하고, 상기 DNA 중합체의 단편을 상기 수단에 결합하는 단계와,
c) 상기 수단을 상기 용액으로부터 제거하는 단계와,
d) 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥이 공기/용매 경계면과 상기 수단 사이에 부유되도록, 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 공간에 신장하는 단계와,
e) 상기 신장된 라벨 DNA 중합체 가닥을 기질에 증착하는 단계와,
f) 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되도록, 전자 현미경을 이용하여 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 영상화하는 단계와,
g) 상기 라벨링된 염기 및 라벨링되지 않은 염기의 위치와 상기 DNA 중합체의 서열을 서로 관련시키는 단계를
포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 신장된 라벨링된 DNA 중합체 가닥은 단일 가닥인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조영제로 라벨링하기 전에 단일 가닥 핵산을 생성하기 위해 상기 DNA 중합체 가닥을 변성시키는 단계를 더 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 변성 단계는 열 변성인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 영상화 단계 전에 상기 DNA 중합체 가닥의 상부에 탄소 층을 증착시키는 단계를 더 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 중합체 가닥은 약 100 kb 이상의 고분자량 DNA인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 신장 단계는 상기 DNA 중합체 가닥에 일정한 염기-염기 공간을 생성하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å의 범위 내에 있는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 염기-염기 공간은 약 5Å인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 공기/용매 경계면과 상기 수단 사이에서 상기 DNA 중합체 가닥의 부유된 영역(suspended region)의 길이는 적어도 약 2㎛인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 DNA 중합체 가닥의 염기 부분집합(subset)만이 라벨링된, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 염기 부분 집합은 티민(thymine)과 시토신(cytosine)을 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 염기 부분 집합은 아데닌(adenine)과 구아닌(guanine)을 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 도입 단계에서 상기 수단은 DNA 가닥에 결합되는 제 1 코팅으로 기능화된 팁(tip)을 구비한 바늘(needle)인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택된 물질을 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 제 1 코팅은 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 바늘은 DNA에 결합되지 않는 제 2 코팅으로 기능화된, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 17항에 있어서, 상기 제 2 코팅은 옥탄티올, 헥산티올, 노난티올, 데칸티올, 및 셉탄티올로 이루어진 군에서 선택된 화합물인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 바늘의 팁은 약 200nm 미만의 곡률 반경을 갖는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 바늘은 초당 약 1nm 내지 초당 약 100m의 속도로 상기 용액 안과 밖으로 이동하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 바늘은 약 1Å 내지 약 20㎛ 범위의 깊이로 상기 용액 안으로 이동하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조영제는 Z 번호가 큰 원자(high-Z atom)를 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 22항에 있어서, 상기 조영제는 Os-bipy, 아세트산 수은 또는 디메틸설폭시드 백금인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 조영제는 Z 번호가 큰 원자 클러스터 라벨(high-Z atom cluster label)인, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 증착 단계는 셸프 트레딩(shelf threading)을 이용하여 영상 기질(imaging substrate)에 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 부착하는 단계를 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 증착 단계는 셸프 트레딩을 이용하여 지지 기질(support substrate)에 적어도 하나의 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 부착하고, 이동 프린팅(transfer printing)을 이용하여 상기 지지 기질 위의 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 영상 기질로 이동시키는 단계를 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 증착 단계는 갭 트레딩(gap threading)을 이용하여 지지 기질에 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 부착하는 단계를 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 증착 단계는 갭 트레딩을 이용하여 지지 기질에 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 부착하고, 스와이프 프린팅(swipe printing)을 이용하여 상기 지지 기질 위의 상기 라벨링된 DNA 중합체 가닥을 영상 기질로 이동시키는 단계를 포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서, 복수의 개별 DNA 중합체 가닥은 공간으로 신장되고, 기질에 증착되며, 각 가닥이 영상화되는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 29항에 있어서, 상기 복수의 DNA 중합체 가닥은 상기 기질 위에 평행한 가닥의 배열로 위치하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
제 1항에 있어서,
단계 (a) 전에, 복수의 DNA 중합체 가닥을 포함하는 용액을 동일한 개체로부터 적어도 두 개의 소샘플(subsample)로 나누고, 상기 소샘플을 DNA 중합체 가닥이 서로 상이한 염기 특이성 또는 선택성을 갖도록 처리하는 단계와,
단계 (g) 후에, 서열 정보를 얻기 위하여 상기 DNA 중합체의 다중 가닥의 상기 영상 단계로부터 얻은 데이터를 편집하는 단계를
포함하는, DNA 중합체 가닥의 서열 정보를 얻는 방법.
핵산 서열 정보를 얻는 방법에 있어서,
전자 현미경을 이용하여 복수의 라벨링된 핵산 가닥 각각의 적어도 1000개의 연속 염기의 영역 내에 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치를 .결정하는 단계를 포함하는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 위치는 적어도 1000개의 연속 염기에 대해 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 위치는 핵산 가닥의 적어도 10,000개의 연속 염기에 대해 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 적어도 20개의 개별 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 적어도 100개의 개별 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 적어도 1000개의 개별 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 적어도 10,000개 개별 가닥의 라벨링된 염기와 라벨링되지 않은 염기의 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 35항에 있어서, 핵산 가닥의 적어도 200개의 연속 염기의 서로 상이하게 라벨링된 핵산 중합체 가닥에 대해 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 35항에 있어서, 핵산 가닥의 적어도 500개의 연속 염기의 서로 상이하게 라벨링된 핵산 중합체 가닥에 대해 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 35항에 있어서, 핵산 가닥의 적어도 10,000개 연속 염기의 서로 상이하게 라벨링된 핵산 중합체 가닥에 대해 위치가 결정되는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 핵산 가닥은 연장시 적어도 약 100㎛의 길이를 갖는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 핵산 가닥은 DNA 서열인, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 43항에 있어서, 상기 DNA는 단일 가닥인, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 32항에 있어서, 상기 핵산은 염기 사이에 약 3Å 내지 약 7Å의 염기-염기 공간을 갖는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
제 45항에 있어서, 상기 핵산은 약 5Å의 염기-염기 공간을 갖는, 핵산 서열 정보를 얻는 방법.
기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법에 있어서,
복수의 핵산 가닥을 포함하는 용액을 제공되는 단계와,
상기 용액에 바늘의 팁(tip)을 삽입하는 단계와,
복수의 핵산 가닥을 포함하는 용액 밖으로 바늘의 팁을 당기는 단계로서, 상기 바늘의 팁은 핵산에 결합되는 제 1 코팅으로 기능화되는 단계와,
핵산의 단일 가닥이 공기/용매 경계면과 바늘 팁 사이에 부유되도록 상기 핵산 가닥을 신장하는 단계와,
적어도 하나의 신장된 핵산 가닥을 기질에 부착하는 단계를
포함하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 담금 단계(dipping step)에서 상기 바늘은 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택된 물질로 제조되는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 제 1 코팅은 PMMA, 폴리스티렌, PVB, 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 바늘은 핵산에 결합되지 않는 제 2 코팅으로 기능화된, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 50항에 있어서, 상기 제 2 코팅은 옥탄티올(octanethiol), 헥산티올(hexanethiol), 노난티올(nonanethiol), 데칸티올(decanethiol), 및 셉탄티올(septanethiol)로 이루어진 군에서 선택되는 화합물인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 담금 단계에서 상기 바늘의 팁은 약 200nm 미만의 곡률 반경을 갖는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 담금 단계에서 상기 바늘의 팁은 초당 약 1nm 내지 초당 약 100m의 속도로 상기 용액의 안과 밖으로 이동하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 담금 단계에서 상기 바늘의 팁은 약 10nm 내지 약 20nm 범위의 깊이로 상기 용액으로 이동하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 담금 단계에서 상기 바늘은 단일 나노포지셔너-구동 지지체(single nanopositioner-driven support) 상에 바늘이 배치되는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 복수의 바늘은 나노포지셔너 구동 지지체와 동시에 상기 용액 안에 삽입되는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 핵산은 고분자량 DNA인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 신장 단계는 상기 핵산 가닥에 일정한 염기-염기 공간을 생성하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 58항에 있어서, 상기 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å의 범위 내에 있는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 59항에 있어서, 상기 염기-염기 공간과 상기 라벨-라벨 공간은 약 5Å인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 신장 단계에서 상기 핵산은 약 100㎛ 길이로 신장되는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 기질에 부착된 적어도 두 개의 핵산 가닥은 실질적으로 서로 평행하게 배향된, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 부착 단계는 상기 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 부착하기 위해 셸프 트레딩을 사용하는 단계를 포함하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 부착 단계는 상기 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 부착하기 위해 갭 트레딩을 사용하는 단계를 포함하는, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 부착 단계에서 상기 기질은 영상 기질인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제 47항에 있어서, 상기 부착 단계에서 상기 기질은 지지 기질인, 기질에 적어도 하나의 핵산 가닥을 조절 배치하기 위한 방법.
제조 물품으로서,
복수의 핵산 중합체 가닥을 포함하는 액체와,
수단(tool)과,
상기 액체에 제 1 단부와 상기 수단에 부착된 제 2 단부를 갖는 단일 핵산 중합체 가닥으로서, 상기 단일 핵산 중합체 가닥의 적어도 일부는 상기 수단과 상기 액체 사이의 공간에 부유되어 있는, 상기 단일 핵산 중합체 가닥을
포함하는, 제조 물품.
제 67항에 있어서, 상기 염기의 일정한 염기-염기 공간이 존재하도록 상기 핵산 중합체 가닥의 염기가 연장되는, 제조 물품.
제 68항에 있어서, 상기 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å의 범위 내에 있는, 제조 물품.
제 68항에 있어서, 상기 핵산 중합체 가닥은 상기 부유 영역에서 선형이 되도록 연장되는, 제조 물품.
제 67항에 있어서, 공간에서 연장된 핵산 가닥의 일부는 약 100㎛의 길이를 갖는, 제조 물품.
제조 물품으로서,
평면 기질과,
상기 평면 기질에 배치된 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체 가닥으로서, 상기 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체 가닥은 약 1000개의 염기 쌍 길이에 걸쳐 일정한 염기-염기 공간을 갖는, 상기 핵산 중합체 가닥을
포함하는, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 상기 기질은, PDMS 블록, PMAA 블록, 얇은 필름, 울트라-플랫 실리콘 격자, 영상 기질, 지지 기질 및 TEM 격자로 이루어진 군에서 선택되는, 제조 물품.
제 73항에 있어서, 상기 울트라-플랫 실리콘 격자는 탄소 필름, 다공성 격자 필름(holey grid film), 또는 탄소의 연속 필름으로 덮인, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체가 상기 평면 기질과 상기 필름 사이에 끼워지도록 상기 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 중합체의 상부에 배치된 필름을 더 포함하는, 제조 물품.
제 75항에 있어서, 상기 필름은 탄소, 베릴륨, 또는 Z 번호가 낮은-원소로 구성된, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 가닥의 염기-염기 공간은 약 3Å 내지 약 7Å 범위 내에 있는, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 상기 평면 기질은, PDMS, 탄소, 붕소, 리튬, 베릴륨 알루미늄, 질화물, 산화 질화물, 및 이의 복합물로 이루어진 군에서 선택된 물질로 이루어진, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 중합체 가닥은 적어도 하나의 Z 번호가 높은 라벨링 화합물로 라벨링되는, 제조 물품.
제 79항에 있어서, 상기 Z 번호가 높은-원자는, 오스뮴, 수은 및 백금으로 이루어진 군에서 선택되는, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 상기 기질에 배치된 복수의 길게 연장된 핵산 가닥을 포함하고, 상기 가닥은 실질적으로 서로 평행한, 제조 물품.
제 81항에 있어서, 상기 복수의 길게 연장된 핵산 가닥은 약 1×10⁶ 핵산 가닥을 포함하는, 제조 물품.
제 72항에 있어서, 상기 적어도 하나의 길게 연장된 핵산 가닥은 적어도 약 2㎛의 길이로 신장되는, 제조 물품.
메모리에 저장된 핵산 서열을 분석하는 단계를 포함하는 방법에 있어서,
상기 서열은 제 1항에 기재된 방법에 의해 결정되는, 방법.
제 84항에 있어서, 상기 핵산 서열은 인간의 게놈 서열(genomic sequence)인, 방법.
제 85항에 있어서, 상기 분석 단계는, 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성(polymorphism)의 존재 또는 부존재, 복사체 수(copy number), 변이체(variant), 삽입-결실(indels), 재배열 또는 전체 게놈 비교 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제 84항에 있어서, 상기 메모리는 하드 또는 플로피 디스크, 광학 매체, 콤팩트 디스크(CD), 디지털 다기능 디스크(DVD) 및 반도체 매체, 그리고 플래시 메모리로 이루어진 군에서 선택된 자성 매체인, 방법.
바늘(needle)로서,
말단부(distal end)와,
인접 단부(proximal end)와,
상기 말단과 상기 전단 사이에서 연장되고 상기 말단 및 상기 전단과 유체가 통하는 샤프트(shaft)를
포함하고,
상기 인접 단부는 약 200nm 미만의 곡률 반경을 갖는 팁 부재를 포함하고, 상기 팁 부재는 핵산의 단부에 결합되는 화합물로 기능화되는, 바늘.
제 88항에 있어서, 핵산에 결합 친화력을 갖지 않는 제 2 화합물로 코팅된, 바늘.
제 88항에 있어서, 상기 탭 부재는, PMMA, 폴리스티렌, PVB, 실란화(silanization), 및 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 화합물로 기능화되는, 바늘.
제 88항에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 DNA인, 바늘.
제 88항에 있어서, 상기 바늘은, 유리, 금, 텅스텐, PMMA, 폴리스티렌, PVC, 및 실리콘으로 이루어진 군에서 선택된 화합물로 구성된, 바늘.
제 88항에 있어서, 상기 바늘은 단일 나노포지셔너-구동 지지체 상에 배치된, 바늘.