KR20100045758A

KR20100045758A - 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스 ｐｌ-11 균주와 이를 이용한 어류용프로바이오틱스

Info

Publication number: KR20100045758A
Application number: KR1020080104846A
Authority: KR
Inventors: 박승춘; 이중수; 이태훈
Original assignee: 경북대학교 산학협력단; 전진바이오팜 주식회사
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2008-10-24
Publication date: 2010-05-04
Also published as: KR101073791B1

Abstract

본 발명은 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것으로, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주가 내담즙성 및 내산성 등의 생리활성, 그리고 항염증 효과와 효소분해능력을 가지고 있기 때문에 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로 이용할 경우, 어류 양식에 유용하지 않은 세균들로부터 어류를 보호하여 생존율을 향상시킬 뿐만 아니라 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시키는 효과가 있다.

락토바실러스 펜토서스, Lactobacillus pentosus, 프로바이오틱스, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성

Description

장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스 ＰＬ-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스{Lactobacillus pentosus PL-11 having the dietary enzyme activities, the resistance of bile acid and acid, and the probiotics for fishes using thereof}

본 발명은 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것으로, 좀 더 구체적으로는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주가 내담즙성 및 내산성 등의 생리활성, 그리고 항염증 효과와 효소분해능력을 가지고 있기 때문에 이를 어류용 프로바이오틱스(Probiotics)로 이용할 경우, 어류 양식에 유용하지 않은 세균들로부터 어류를 보호하여 생존율을 향상시킬 뿐만 아니라 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시키는 효과가 있는 신규 락토바실러스 펜토서스 PL-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스에 관한 것이다.

프로바이틱스(생균제 : Probiotics)는 여러 종류의 정상 장내 세균총에서 병원성균에 대해 증식을 억제하는 항균력이 있는 것으로 알려져 있고, 정상 장내 세 균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당한다[Fuller, R.(1989) Probiotics in man and animal. J. Appl. Bacteriol., 66, 365-378, Shahani, K. M. and A. D. Ayebo. 1980. Role of dietary lactobacilli in gastrointestinal microecology. Am. J. Clin. Nutr. 33: 2448-2457]. 그러나, 이러한 프로바이오틱스의 유용한 효과는 주로 사람과 가축에 대한 실험 보고 내용이 대부분을 차지하고 있고, 개발된 프로바이오틱스들도 사람과 가축에 적용되는 제품들로서[Tournut, J. 1989. Applications of probiotics to animal husbundary. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 8: 551-566.] 해수 양식어 특히, 뱀장어에 이들 제품을 그대로 사용하는데는 문제점이 있다. 사람 및 가축에 사용되는 프로바이오틱스는 최적발육온도가 37℃로서, 15 ~ 25℃에서 생육하는 양식어에는 부적절하며, 특히 해수 양식어의 경우 높은 염농도에도 견딜 수 있는 프로바이오틱스가 필수적이다.

날로 급증해 가는 어류 수산물의 양식에 따라 수질 환경은 점차 악화되고 어병를 일으키는 빈도가 증가함으로서 항생제를 대체할 수 있는 프로바이오틱스가 필수적이다.

일반적으로, 프로바이오틱스에 사용하는 유산균은 그람양성간균, 비운동성, 비포자성, 및 카탈라제(Catalase) 음성인 세균으로서 자연계에 널리 분포하고 있을 뿐만 아니라 동물의 장이나 발효식품 등에서도 쉽게 발견된다[Ringo, E. and F. J. Gatesoupe. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aquaculture. 160: 177-203.]. 이들 유산균들이 항균활성 등에 의해 장내균총을 개선시키는 중요한 미 생물이라는 것은 이미 많이 알려져 있으며 이러한 유산균의 항균활성 인자는 유기산과 과산화수소 및 박테리오신(bacteriocin)[Piard, J. C. and M. Desmazeaud. 1992. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 2. Bacteriocins and other antibacterial substances. Lait. 72: 113-142.] 등에 의한다. 또한, 유산균은 장내 상피세포에 부착하여 정착함으로써 병원균의 감염과 성장을 억제하게 된다. 유산균의 병원성 세균에 대한 항균활성에 대한 연구로는 리스테리아 모노사이토진스(Listeria monocytogenes), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 비브리오 안구이라룸(Vibrio anguillarum)등의 미생물에 대한 항균활성이 있다고 보고되어 있다. 그러나, 대부분의 어병세균 및 병원성 세균이 그람 음성인데 반하여 프로바이오틱스로서 유산균은 그 항균활성이 계통적으로 유사한 그람양성 세균에 대해서만 항균활성을 나타낸다는 한계점이 있다[Suma. K., M. C. Misra, and M. C. Varadaraj. 1998. Plantaricin LP84, a broad spectrum heat-stable bactriocin of L. plantarum NCIM 2084 produced in a simple glucose broth medium. Int. J. Food Microbiol. 40: 17-25.].따라서, 프로바이틱스 균주로서 산업적으로 응용하기 위해 분리된 균주는 그람 양성세균 뿐만 아니라 그람 음성 세균의 성장까지도 저해할 수 있는 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있어야 한다.

또한, 프로바이오틱스의 지속적인 항균작용과 유익한 효과를 갖기 위해서는 pH가 낮은 위와 담즙 그리고 여러 가지 소화효소 등의 환경 조건에서도 생존하여야 한다. 즉, 프로바이오틱스 균주가 갖추어야 할 또 다른 중요한 조건은 내산성 및 내담즙성 그리고 항생제에 대한 적절한 내성을 갖고 있어야 한다는 점이다[Verschuere L., G. Rombaut, P. Sorgeloos, and W. Verstraete. 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiol. Mole. Biol. Rev. 64: 655-656.].

따라서, 상기와 같은 문제점을 극복한 어류 특히, 뱀장어 전용 생균제가 국내 및 세계적으로 개발이 요구되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 pH 내성, 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있어 프로바이오틱스로 사용 가능하며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 목적의 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주를 이용하여 어류의 세균성 질병 예방 혹은 치료를 함으로서 양식 산업의 효율성을 증대시키고 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시키는 효과가 있는 프로바이오틱스를 제공하는 데 있다.

상술한 목적들 뿐만 아니라 용이하게 표출되는 다른 목적들을 달성하기 위하여 본 발명에서는 일본뱀장어인 안구일라 자포니카(Anguilla japonica)종으로부터 혈액한천배지(Blood agar), Trypticase soy agar(TSA), MRS agar(MRS, Difco, Detroit, USA)와 pH 4.2로 조절된 MRS agar를 사용하여 호기성 조건인 37℃에서 인큐베이터에서 24시간 이상 배양하였고, BBL Gaspak plus(Becton Dickinson, USA)을 이용하여 혐기성인 조건으로 맞춘 다음 30℃의 인큐베이터에서 48시간 이상 배양하여 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 pH 내성, 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있어 프로바이오틱스로 사용 가능하며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주를 분리하고, 이를 어류용 프로바이오틱스로 사용함으로써 어류의 세균성 질병 예방 혹은 치료를 함으로서 양식 산업의 효율성을 증대시키고 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시킬 수 있었다.

본 발명에 따른 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주는 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있으며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙염이 우수하고, 이를 어류용 프로바이오틱스로 사용함으로써 어류의 세균성 질병 예방 혹은 치료를 함으로서 양식 산업의 효율성을 증대시키고 어류의 증체율 및 사료의 효율을 개선시킬 수 있었다.

본 발명에 따른 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주는 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있어 프로바이오틱스로 사용 가능하며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙염이 우수하고, 그람 양성균이며, 통성혐기성(Facultative anaerobes)이고, 막대(rod)형태를 가지고 포자를 형성하지 않으며, 카탈라제(Catalase) 시험결과는 음성반응이고, 유산(Lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지고 있는 것으로 특징지워진다.

또한, 본 발명에 따른 프로바이오틱스는 유효 성분으로서 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주가 함유되어 있는 것으로 특징지워진다.

본 발명에 따른 신균주 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11 균주의 분리 및 동정 과정은 다음과 같다.

뱀장어는 일본뱀장어인 안구일라 자포니카(Anguilla japonica)종으로 선택하였으며, 전남 화순의 뱀장어 농장에서 살아있는 뱀장어를 급속 냉동하여 실험실로 가져와 실험에 사용하였다. 급속 냉동된 뱀장어와 살아있는 상태의 뱀장어에서 분리된 유산균의 수는 거의 동일한 것으로 알려져 있기 때문에 급속 냉동된 뱀장어를 사용했다.뱀장어 균주 배양배지로는 하기 조성과 같은 혈액한천배지(Blood agar), Trypticase soy agar(TSA), MRS agar(MRS, Difco, Detroit, USA)와 pH 4.2로 조절된 MRS agar를 사용하여 호기성 조건인 37℃에서 인큐베이터에서 24시간 이상 배양하였고, BBL Gaspak plus(Becton Dickinson, USA)을 이용하여 혐기성인 조건으로 맞춘 다음, 30℃의 인큐베이터에서 48시간 이상 배양하였다.

* 혈액한천배지(Blood agar) 조성

판크레아틴으로 소화시킨 카제인(Pancreatic Digest of Casein) 15g

파파인으로 소화시킨 대두분(Papaic Digest of Soybean Meal) 5g

염화나트륨(Sodium Chloride) 5g

한천(Agar) 15g

혈액(Blood) 50㎖

* Trypticase soy agar(TSA) 배지 조성

트립톤(Tryptone) 17g

소이톤(Soytone : 효소로 소화시킨 대두분(enzymatic digest of soybean meal) 3g

덱스트로스(Dextrose) 2.5g

염화나트륨(Sodium Chloride) 5g

K₂HPO₄ 2.5g

한천(Agar) 15g

* MRS 한천 배지 조성

펩톤(Peptone) 10g

미트 익스트렉트(Meat extract) 8g

이스트 추출물(Yeast extract) 4g

글루코오스(Glucose) 20g

소듐 아세테이트 3수화물(Sodium acetate 3H ₂ O) 5g

트윈 80(Tween 80) 1g

디포타슘 하이드로겐 포스페이트(Dipotassium hydrogen phosphate) 2g

트리암모니움 시트레이트(Triammonium citrate) 2g

마그네슘 설페이트 7수화물(Magnesium sulfate 7H₂O) 0.2g

마그네슘 설페이트 4수화물(Manganese sulfate 4H₂O) 0.05g

한천(Agar) 10g

유산균의 특징인 그람 양성의 간균으로서 카탈라제가 음성인 균주를 최종 선별한 16개 균주를 분리하여 선정하였다.

* 분리된 균주의 형태 및 배양학적 특성

최적 생육배지(MRS agar)에서 배양한 균주를 그람염색을 행한 결과, 그람 양성균이었다. 배양학적인 특징은 통성혐기성(Facultative anaerobes)이며, 도 1에 도시된 바와 같이 막대(rod) 형태를 가지고 포자를 형성하지 않았으며, 카탈라제(Catalase) 시험 결과는 음성반응을 나타내었고, 유산(Lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지고 있는 바, 전형적인 락토바실러스가 갖는 형태 및 배양학적 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

* 뷴리된 균주의 동정 및 명명

형태적, 배양학적 특성을 분석한 결과, 본 발명에서 분리된 균주는 락토바실러스에 속하는 미생물이며, 분리한 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석함으로써, 균주를 최종적으로 동정하였다. 게놈 DNA 추출 키트(Genomic DNA extraction kit(Qiagen))를 이용하여 분리 균주로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출한 다음, 진정박테리아(eubacterial) 16S rDNA 클로닝을 위하여 전진프라이머(forward primer : 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')와 역전사 프라이머(reverse primer : 5'-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3') 세트(set)를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction(PCR))을 수행하였다. 50 pmole의 프라이머(primer), 50 ng 템플레이트(template) DNA, 10ㅧTay DNA 폴리머라아제 완충용액(polymerase buffer) 5㎕, Taq DNA 폴리머라제(Takara, Japen) 1U가 포함된 PCR 혼합액을 95℃에서 5분간 변성시킨 후에 95℃에서 1분, 55 ∼ 60℃에서 1분, 72℃에서 1분간 유 지시키는 공정을 30회 반복하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 pSTBlue-1(Novagen, USA)에 클로닝한 다음, BigDyeTM-terminator sequencing Kit과 ABI PRISM377 sequencer(Perkin-Elmer, USA)로 염기서열을 분석한 결과, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)와 99.93% 유사한 것으로 판명되었다.

분리된 균주 중에서 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 pH 내성, 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있어 프로바이오틱스로 사용 가능하며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 균주를 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11로 명명하고, 2008년 07월 03일자로 대한민국 특허 균주 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호(KFCC11427P)를 부여받았다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 분리 균주의 효소분해능 실험

효소 분해능 실험은 탄수화물, 단백질, 인을 분해할 수 있는 효소를 가지고 있는 유산균인지의 여부를 확인하기 위해 행하였다. 프로테아제(Protease)활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천 배지에 스킴 밀크(skim milk) 0.5%를 첨가하였고, 셀룰라아제(Cellulase) 활성이 있는지의 여부를 알기 위해서는 MRS 한천배지에 메틸 셀룰로오스(Methyl cellulose)를 0.2% 첨가하였으며, α-아밀라아제(α-amylase)활성이 있는지의 여부를 알기 위해서 MRS 한천배지에 옥수수 전분(corn starch) 0.2%를 넣었으며, 파이타제(Phytase) 활성을 알기 위해 파이테이트 칼슘염(Ca-phytate)을 0.5% 첨가한 배지를 각각 제조하였다.

상기에서 제조된 각각의 배지에 분리된 균주들을 도말(streaking)한 다음, 24시간 배양한 후 관찰하였다.

α-아밀라아제와 셀룰라아제 활성은 24시간 배양한 배지에 2% 콩고 레드(congo red) 시약을 처리한 후, 1M 염화나트륨(Nacl)을 이용하여 세척(washing)한 다음, 색깔 여부에 의해 분해효소여부를 확인하였다. 또한, 프로테아제와 파이타제 활성 여부 판정은 투명환의 여부에 의해 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 기재하였다.

분리된 균주들의 효소활성

균주 번호	프로테아제	셀룰라아제	α-아밀라아제	파이타제
PL1	-	+	+	-
PL2	-	-	+	-
PL3	+	-	+	+
PL4	-	-	-	-
PL5	+	-	-	+
PL6	-	-	-	+
PL7	+	-	+	+
PL8	+	-	-	-
PL9	+	-	+	-
PL10	-	-	+	-
PL11	+	+	+	+
PL12	+	-	+	-
PL13	+	+	+	+
PL14	+	+	+	-
PL15	+	+	-	+
PL16	+	+	+	+

실시예 2 : 항염증 효과 유무 확인

NO assay 방법(NO production quantitative analysis : in vitro 상에서 cell supernatant에 녹아있는 NO의 양을 정량하는 것)을 이용하여 항염증 효과 유무를 확인하였다. 일반적인 NO assay 방법에 있어서 Raw 264.7 세포주(한국세포주은행으로부터 분양)로부터 생성된 NO는 세포 배양액 중에 NO^2-의 형태로서 존재하고 이것을 Griess(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine in H₂O) 시약을 이용하여 NO의 양을 측정한다.

본 실시예에서는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11, 13, 16의 세포 배양액(시료 1(pH 3.5), 시료 2(pH 7.0), 시료 3(LPS(lipopolysaccharide)처리), 시료 4(시료 1 + LPS), 시료 5(시료 2 + LPS), 대조군(control)) 100㎕와 Griess 시약 100㎕를 혼합하여 96 웰 플레이트(well plate)에서 10분간 반응시킨 후 540nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. NO^2-의 농도는 질산나트륨(sodium nitrate)를 희석하여 흡광도를 측정하고 표준곡선을 그린 후 그 표준곡선으로 농도를 계산하였다.

3개의 유산균 후보군을 이용하여 면역활성을 보기 위해 NO시험을 측정한 결과 P11균주의 상층액에 LPS와 같이 처리하였을 때 가장 좋은 NO억제를 보인 P11균주를 최종 후보군으로 선택하였다.

실시예 3 : 어류 병원성 미생물에 대한 억제능 실험

어류 병원성 미생물 균주에 대한 억제능의 효과를 확인하기 위하여 상기 실시예에서 최종 선발된 락토바실러스 펜토서스 PL-11균주를 이용하여 실험을 행하였다.

락토바실러스 팬토서스 PL11의 최소억제농도(Minimum inhibition concentration, MIC) 측정은 microtitire plate assay를 통하여 확인하였다. 피검균으로는 어류세균인 Escherichia coli, Edwardsiella tarda, Streptococcus iniae, Vibrio anguillarum, Vibrio alginolyticus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi를 사용하였다. 배지(BHI, LB broth)와 Lactobacillus pentosus PL11(pH3.5, pH7) 상층액(100%, 50%, 25%, 12.5%, 6%, 3%, 1.5%)을 혼합한 후, 피검균을 10⁵CFU/ml의 농도로 50㎕ 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고 MRS 고체배지에 microtitire plate assay 방법을 통해서 희석한 후 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균수를 측정한다.

피검균에 대한 증식억제작용 혹은 살균작용을 나타내었으며, 이를 하기 표 3에 기재하였다. 이러한 결과는 락토바실러스 펜토서스 PL-11균주 균주가 생성하는 유산균에 의하여 기인하는 것으로 생균제로 적용시 매우 유용한 결과를 얻을 수 있음을 나타내는 것이다.

어류 병원성 미생물에 대한 락토바실러스 팬토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11의 항균력

strains	Supernatant concentration(%)
strains	100	50	25	12.5	6.2	3.1	1.5	0.7
V. anguillarum	---	--	-	-	++	++	+++	+++
V. alginolyticus	---	---	--	+	++	+++	+++	+++
V. parahaemolyticus	---	---	--	+	++	+++	+++	+++
V. harveyi	--	--	-	++	+++	+++	+++	+++
E. coli	---	--	-	+	+	+++	+++	+++
E. tarda	---	--	-	-	++	++	+++	+++
S. iniae	--	--	-	++	+++	+++	+++	+++
--- : No growth, -- : <10² CFU/ml, - : <10³ CFU/ml, + : <10⁵ CFU/ml, ++ : <10⁷ CFU/ml, +++ : >10⁸ CFU/ml

실시예 4

내산성 프로바이오틱스로서 적합한 균주인지를 확인하기 위하여 5ml의 MRS 배지에 1N HCl을 첨가하여 pH 2,3,4,5, 대조군(pH 7.0)으로 조절한 후, 10⁷cfu/ml 이상인 L. pentosus PL11 균주와 L. pentosus KCCM 35472 균주 0.1%를 넣고 0시, 0.5시, 1시, 2시, 3시, 8시 간격으로 성장을 확인하였다.

L. pentosus PL11 균주가 생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3이하의 조건인 위를 통과하여야 한다. 1N HCl로 pH 2, 3, 4, 5, 대조군(pH 7.0)으로 각각 조정한 MRS 액체배지에 L. pentosus PL11 균주를 접종한 후에 37℃에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰하였다. pH 4, 5, 7에서는 8시간의 배양시간이 되었을 때 10⁵이상 균수가 증가하였고, pH 3에서는 균이 증식 되지 않았지만 유지되었으며, 강산성인 pH 2에서는 3시간 이상 균이 생존하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 음식물의 섭취량이나 종류에 따라 차이가 있겠지만 음식물이 위를 통과하는데 2 ~ 3시간이 소요되며, 위산의 pH가 2 ~ 3으로 희석되는 점을 고려할 때 내산성을 가진 L. pentosus PL11이 실제로 위를 통과한 이후의 생존률은 실험치보다 더 높을 가능성을 배제할 수 없다.

산에 대한 내성 실험

Lactobacillus pentosusPL11	0시	0.5시	1시	3시	8시
Blank	2.5X10⁷cells/㎖	5X10⁷cells/㎖	2X10⁸cells/㎖	2.5X10⁸cells/㎖	7.5X10¹⁰cells/㎖
pH 5	2.15X10⁷cells/㎖	4X10⁷cells/㎖	1X10⁸cells/㎖	5.5X10⁸cells/㎖	2.95X10¹⁰cells/㎖
pH 4	2X10⁷cells/㎖	5.5X10⁷cells/㎖	7.15X10⁷cells/㎖	3.5X10⁸cells/㎖	4X10¹⁰cells/㎖
pH 3	2.35X10⁷cells/㎖	5X10⁷cells/㎖	6X10⁷cells/㎖	1X10⁸cells/㎖	4X10⁸cells/㎖
pH 2	3.5X10⁷cells/㎖	1X10⁶cells/㎖	2X10⁵cells/㎖	5X10³cells/㎖	-
Lactobacillus pentosusKCCM 35472	0시	0.5시	1시	3시	8시
Blank	3.55X10⁷cells/㎖	7.5X10⁷cells/㎖	2X10⁸cells/㎖	6X10⁸cells/㎖	2.35X10¹⁰cells/㎖
pH 5	3.8X10⁷cells/㎖	7X10⁷cells/㎖	1X10⁸cells/㎖	2.5X10⁸cells/㎖	1.8X10⁹cells/㎖
pH 4	3.7X10⁷cells/㎖	5X10⁷cells/㎖	7.15X10⁷cells/㎖	5.5X10⁸cells/㎖	2X10⁹cells/㎖
pH 3	3.5X10⁷cells/㎖	1X10⁷cells/㎖	2X10⁷cells/㎖	4.75X10⁷cells/㎖	1.4X10⁸cells/㎖
pH 2	2.95X10⁷cells/㎖	1.5X10³cells/㎖	-	-	-

실시예 5

생균제의 조건으로서의 가장 중요한 요인은 담즙산에 대한 내성이다. 이를 위해 담즙산 0%, 0.1%, 0.3%, 1%를 MRS 액체배지 5ml에 넣고 10⁵CFU/ml으로 희석된 L. pentosus PL11 균주 0.1%를 넣고 0시, 1시, 5시, 12시, 24시, 48시 간격으로 균수 측정하여 성장을 확인하였다.

37℃에서 24시간 배양한 다음, 균수를 측정한 결과를 다음 표 4에 기재하였다. 표 4로부터 알 수 있는 바와 같이 담즙산 1%에서도 균이 억제되지 않고 유지되는 것으로 보아 담즙산에 내성이 있다고 판단할 수 있다.

담즙산에 대한 내성 실험

Lactobacillus pentosus PL11	0시	3시	6시	12시	24시	48시
Blank	5.5X10⁵cells/㎖	6X10⁶cells/㎖	8.2X10⁸cells/㎖	2X10⁹cells/㎖	2.3X10¹⁰cells/㎖	3X10⁸cells/㎖
0.1% Oxgall	8X10⁵cells/㎖	8.1X10⁶cells/㎖	9X10⁸cells/㎖	4.7X10⁹cells/㎖	3.5X10¹⁰cells/㎖	4X10⁸cells/㎖
0.3% Oxgall	4.5X10⁵cells/㎖	1X10⁶cells/㎖	2.5X10⁶cells/㎖	3X10⁷cells/㎖	3X10⁸cells/㎖	4.23X10⁶cells/㎖
1% Oxgall	5X10⁵cells/㎖	5.5X10⁵cells/㎖	6X10⁵cells/㎖	6X10⁵cells/㎖	7X10⁵cells/㎖	7X10⁵cells/㎖
Lactobacillus pentosus KCCM 35472	0시	3시	6시	12시	24시	48시
Blank	7X10⁵cells/㎖	3.5X10⁶cells/㎖	4X10⁶cells/㎖	9X10⁹cells/㎖	7.5X10¹⁰cells/㎖	1.75X10⁸cells/㎖
0.1% Oxgall	4.5X10⁵cells/㎖	5X10⁶cells/㎖	5X10⁶cells/㎖	7X10⁸cells/㎖	4X10⁷cells/㎖	5X10⁸cells/㎖
0.3% Oxgall	6X10⁵cells/㎖	7X10⁵cells/㎖	8X10⁵cells/㎖	8.5X10⁵cells/㎖	3X10⁴cells/㎖	1X10⁴cells/㎖
1% Oxgall	6X10⁵cells/㎖	2.5X10⁴cells/㎖	5X10³cells/㎖	5X10³cells/㎖	-	-

실시예 6

항생제 내성 시험어류 및 동물의 사료 첨가 및 치료용으로 많이 사용되는 항생제의 내성을 조사하기 위하여 하룻밤 배양한 락토바실러스 펜토서스 PL-11를 10⁶ CFU/ml로 조절한 후, 100㎕를 96well plate에 넣고, 미리 희석된 시험하고자 하는 항생제를 100㎕ 첨가한 다음, 37℃ 인큐베이터에 넣고 24시간 후에 균의 생육을 조사하여 최소발육 억제농도와 최저 살균농도를 측정하고, 그 결과를 하기 표 5에 기재하였으며, 대부분의 항생제에 대하여 내성을 보유하고 있는 것으로 나타났고, 종래의 유산균들과 항생제의 내성을 비교한 결과 동등하거나 보다 우수한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 L. pentosus PL11 균주를 항생제가 포함된 사료에 사용해도 프로바이오틱스로서의 효과를 가질 수 있다는 사실을 확인해주는 것이다.

최소발육억제농도 및 최소살균농도의 비교

항생제	락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)
항생제	MIC(㎍/ml)	MBC(㎍/ml)
Cephalexin	4	8
Colistin sulfate	>256	>256
Enrofloxacin	8	16
Cefalonium	16	16
Amoxicillin trihydrate	<0.5	2
Penicillin G procaine	<0.5	2
Norfloxacin	>256	>256
Spectinomycin	128	>256
Tylosin base	>256	>256
Cefuroxine sodium	1	16
Florfenicol	4	32
Penicillin G Benzathine	4	8
Gentamicin sulfate	128	128
Streptomycin sulfate	128	>256
Dihydrostreptomycin	256	>256

실시예 7 : 락토바실러스 펜토서스( Lactobacillus pentosus )PL-11 균주의 급성독성시험

락토바실러스 펜토서스 (Lactobacillus pentosus)PL-11 균주의 안전성을 평가하기 위해 급성독성시험을 실시하였다.

시험군은 대조군(control, 0.85% NaCl), 저용량군(10⁷ CFU/ml), 중용량군(10⁹ CFU/ml) 그리고 고용량군 (10¹¹ CFU/ml)으로 구성하였으며, 7주령 Sprague-Dawley 계통의 특정병원균 부재(Specific pathogen free, SPF) 랫트을 투여 전에 하룻밤 절식시킨 후 랫드용 존대 부착한 주사관을 이용하여 1회 경구 투여하고 14일 동안 관찰을 실시하고, 그 결과를 하기 표 6에 기재하였다.

L. pentosus PL11을 경구 투여 시 10¹¹ CFU/ml인 고용량군을 포함한 모든 암수 시험군에서 시험기간 동안 L. pentosus PL11에 기인한 사망은 관찰되지 않았다. 또한, L. pentosus PL11에 의한 독성 증상과 특이할 만한 임상증상도 나타나지 않았다. 이상의 결과로 L. pentosus PL11의 암수 모두에서의 LD₅₀은 10¹¹ CFU/ml 이상으로 추정된다.

락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11균주를 경구투여 시 쥐의 사망률

성별	투여량 (㎎/㎏)	투여후 경과일							사망율 (%)	LD₅₀
성별	투여량 (㎎/㎏)	1	2	3	4	5	6	7
수	고용량군 (10¹¹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	대조군	0	0	0	0	0	0	0	0
암	고용량군 (10¹¹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	대조군	0	0	0	0	0	0	0	0

성별	투여량 (㎎/㎏)	투여후 경과일							사망율 (%)	LD₅₀
성별	투여량 (㎎/㎏)	8	9	10	11	12	13	14
수	고용량군 (10¹¹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	대조군	0	0	0	0	0	0	0	0
암	고용량군 (10¹¹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0	>10¹¹ CFU/㎖
	중용량군(10⁹ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	저용량군(10⁷ CFU/ml)	0	0	0	0	0	0	0	0
	대조군	0	0	0	0	0	0	0	0

실시예 8 : 락토바실러스 펜토서스( Lactobacillus pentosus )PL-11이 뱀장어 생육에 미치는 영향

락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11을 뱀장어 사료에 1% 수준(10⁸CFU/g)으로 처리한 사료와 균주을 첨가하지 않은 사료를 체중이 평균 200 ~ 300g인 뱀장어에 급여하면서 1개월 사양한 후, 뱀장어의 증체율 및 사료 효율을 조사하고, 그 결과를 표 7에 기재하였다.

락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)PL-11의 증체량 및 사료효율

구분	개체 무게증가량(g)	사료효율(%)
처리(1%처리)	84.37	1.56
무처리	75.91	2.55

도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11균주의 전자현미경 사진이다.

Claims

넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있으면서 pH 내성, 저장성 및 항생제 내성 등을 갖고 있어 프로바이오틱스로 사용 가능하며, 장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수하고, 그람 양성균이며, 통성혐기성(Facultative anaerobes)이고, 막대(rod)형태를 가지고 포자를 형성하지 않으며, 카탈라제(Catalase) 시험결과는 음성반응이고, 유산(Lactic acid) 및 유기산을 생산하는 특성을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주(KFCC11427P).
청구항 1에 있어서, pH 2.0에서 2시간동안 생육할 수 있는 내산성을 갖는 것을 특징으로 하는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주(KFCC11427P).
청구항 1에 있어서, 담즙산 1%의 조건에서 생육할 수 있는 것을 특징으로 하는 신규한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) PL-11 균주(KFCC11427P).
락토바실러스 펜토서스 PL-11(KFCC11427P)이 유효성분으로 함유된 것임을 특징으로 하는 어류용 프로바이오틱스.
청구항 4에 있어서, 어류는 뱀장어인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스.