PL233263B1

PL233263B1 - Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus reuteri

Info

Publication number: PL233263B1
Application number: PL422593A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Śliżewska; Agnieszka Chlebicz
Original assignee: Politechnika Lodzka; Politechnika Lódzka
Priority date: 2017-08-21
Filing date: 2017-08-21
Publication date: 2019-09-30
Also published as: PL422593A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych Lactobacillus reuteri, o właściwościach probiotycznych.

Preparaty probiotyczne podawane zwierzętom hodowlanym w paszy lub zaaplikowane oralnie, wpływają korzystnie na ich wzrost, poprzez stymulujące oddziaływanie na przewód pokarmowy i procesy w nim zachodzące. Odpowiednio dobrane bakterie probiotyczne determinują przyswajanie paszy, pełniąc jednocześnie rolę regulatora równowagi mikroorganizmów przewodu pokarmowego zwierząt. Efekty działania preparatów probiotycznych zbliżone są do efektów uzyskanych w wyniku zastosowania antybiotyków paszowych, bowiem jedne i drugie redukują liczbę bakterii patogennych, jednak sposób ich działania jest różny. Probiotyki nie powodują żadnych skutków ubocznych i nie implikują odkładania się szkodliwych substancji obcych, stąd nie mają okresu karencji i nie ma niebezpieczeństwa ich przedawkowania. Z punktu widzenia konsumenta i producenta żywności, ważne jest również, że stosowanie probiotyków dzięki możliwości obniżania, a nawet całkowitej eliminacji konieczności stosowania antybiotyków, jest sposobem otrzymywania bezpiecznej żywności.

Dotychczas są znane szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus reuteri, jak Lactobacillus reuteri INLA 4, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri M KKP 2048.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych z gatunku Lactobacillus reuteri, który oznaczono symbolem ŁOCK 1092 i który został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00123.

Szczep ŁOCK 1092 wyizolowano z treści jelitowej prosiąt.

Szczep ŁOCK 1092 jest to Gram-dodatnia pałeczka, nieruchliwa, nie przetrwalnikującą. Jest szczepem o właściwościach probiotycznych, stanowiącym homolog bakterii z gatunku Lactobacillus reuteri o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA przedstawionej na końcu opisu.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu Lactobacillus reuteri ŁOCK 1092 zsekwencjonowano region DNA kodujący gen 16S rRNA o długości 1379 pz. Otrzymaną sekwencję nukleotydową genu 16S rRNA porównano za pomocą programu BLASTN 2.6.0+ z sekwencjami dostępnymi w bazie National Center of Biotechnology Information (NCBI) oraz programie DNA Baser v4.36.0. Na podstawie porównania sekwencji nukleotydowych genów 16S rRNA bakterii z gatunku Lactobacillus reuteri JCM 1112 stwierdzono podobieństwo nowego szczepu bakterii do gatunku Lactobacillus reuteri z prawdopodobieństwem 99,71%.

Nowy szczep ŁOCK 1092 hoduje się na podłożu Rogosa stanowiącym wybiórcze medium przeznaczone do hodowli bakterii z rodzaju Lactobacillus sp., przejrzystym, o barwie żółto-brązowej, o składzie w g/l: pepton kazeinowy -10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80-1,0, octan sodu - 15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5-6, korzystnie 5,5, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. W podłożu tym szczep rośnie w postaci biało-kremowych, okrągłych kolonii, o gładkiej powierzchni i regularnych brzegach, o średnicy około 1-2 mm.

Szczep ŁOCK 1091 hoduje się także na podłożu płynnym MRS, stanowiącym modyfikację podłoża Rogosa, o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny -10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80-1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, korzystnie 5,5, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. W podłożu tym szczep rośnie tworząc jednorodne zmętnienie pożywki.

Do wzrostu szczep preferuje środowisko wzbogacone w 5% (v/v) CO2. Rośnie jednak zarówno w warunkach tlenowych, jak i względnie beztlenowych. Cechy morfologiczne szczepu ŁOCK 1092

W obrazie mikroskopowym bakterie mają kształt krótkich, prostych pałeczek o długości 4-5 ąm i o szerokości do 1 ąm. Pałeczki nie wytwarzają przetrwalników.

Cechy fizjologiczne i biochemiczne szczepu ŁOCK 1092

Szczep nie wytwarza katalazy oraz oksydazy cytochromowej. Wybarwia się na Gram (+).

Badanie metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych na pożywce Hugh-Leifsona w wysokich słupach wykazało, że szczep ŁOCK 1092 jest zdolny do rozkładu glukozy zarówno w obecności tlenu, jak i w warunkach beztlenowych, czyli na drodze fermentacji.

PL 233 263 B1

Zgodnie z testem API 50 CHL szczep ŁOCK 1092 jest zdolny do fermentacji sacharydów i ich pochodnych, jak ryboza, ksyloza, galaktoza, glukoza, maltoza, laktoza, melibioza, sacharoza, rafinoza.

Szczep ŁOCK 1092 charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Glukozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 10,79 ąmol/ml, kwasu octowego (4,04 ąmol/ml), kwasu masłowego (0,47 ąmol/ml), aldehydu octowego (0,08 ąmol/ml) i etanolu (0,15 ąmol/ml).Test API ZYM wykazał, iż szczep ŁOCK 1092 wykazuje aktywność następujących enzymów: fosfatazy alkalicznej, esterazy, a-galaktozydazy, β-galaktozydazy, a-glukozydazy, β-glukozydazy, kwaśnej fosfatazy, fosfoamidazy, arylamidazy leucyny, arylamidazy waliny, arylamidazy cystyny.Ponadto stwierdzono, że szczep ŁOCK 1092 nie wytwarza siarkowodoru, ani amoniaku z argininy, nie wykazuje zdolności rozkładu H2O2.

Zdolność do wykorzystywania prebiotyków szczepu ŁOCK 1092

Szczep ŁOCK 1092 jest zdolny do wzrostu w podłożu zawierającym jako jedyne źródło węgla prebiotyki, jak skrobia, β-glukan, maltodekstryna, inulina, pektyna, jednak wzrost jest zróżnicowany i zależny od rodzaju i stężenia sacharydu. Najlepszym źródłem węgla jest inulina w stężeniu 2%. Porównując natomiast wzrost szczepu ŁOCK 1092 w obecności prebiotyków ze wzrostem w obecności glukozy (próba odniesienia) stwierdzono, że w przypadku wszystkich przebadanych prebiotyków wzrost jest lepszy, co obrazuje wykres 1 przedstawiony na rysunku.Również w wyniku fermentacji inuliny szczep ŁOCK 1092 wytwarza najwyższe ilości kwasu mlekowego, przy najwyższym udziale kwasu L(+) mlekowego wynoszącym 88%. Oprócz kwasu mlekowego produktami fermentacji prebiotyków (skrobi, β-glukanu, maltodekstryny, inuliny i pektyny) są kwas octowy, kwas masłowy, aldehyd octowy i etanol.

Cechy probiotyczne szczepu ŁOCK 1092

Szczep ŁOCK 1092 spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.Nowy szczep wykazuje wysoką odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie pH od 2,0 do 3,0. Szczep ŁOCK 1092 wykazuje również wysoką odporność na sole żółci w stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin.Szczep ŁOCK 1092 wykazuje oporność w stosunku do antybiotyków najczęściej stosowanych u zwierząt hodowlanych, jak penicylina, kanamycyna, amoksycylina, doksycyklina, erytromycyna, tetracyklina.Szczep ten wykazuje również oporność w stosunku do kokcydiostatyków, takich jak diclazuril, decoquinat, narazyna-nikrabazyn.

Nadto nowy szczep wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do patogenów jelitowych zwierząt i odpowiedzialnych za zoonozy ludzi, takich jak Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Listeria monocytogenes.

Szczep ŁOCK 1092 posiada niewielką aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów: β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Szczep wykazuje także zdolności detoksyfikacyjne mykotoksyn, jak aflatoksyny Bi, ochratoksyny A, fumonizyny, toksyny T-2, zearalenonu, deoksyniwalenolu, które najczęściej mogą stanowić zanieczyszczenie zbóż i pasz dla zwierząt.

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1092

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1092 określono w trzech pożywkach fermentacyjnych (mieszankach paszowych (P1, P2 i P3) o następującym składzie zmielonych ziaren: pasza P1 - 50% pszenicy, 30% jęczmienia i 20% kukurydzy, pasza P2 - 40% pszenicy, 30% jęczmienia, 20% kukurydzy i 10% żyta, pasza P3 - 40% pszenicy, 30% jęczmienia, 20% kukurydzy i 10% soi. Kompozycję pożywek fermentacyjnych ustalono na bazie ziaren stosowanych w żywieniu zwierząt monogastrycznych. Mieszanki paszowe roztworzono w wodzie w proporcjach: 1:1,0; 1:1,5; 1:2,0. Pożywki fermentacyjne zaszczepiono zawiesiną bakterii w ilości 106 jtk/ml. Dynamikę wzrostu w pożywkach fermentacyjnych (jtk/g paszy) oznaczono w 4, 8, 12, 16, 24 i 30 godzinie hodowli, a próbą odniesienia była hodowla w pożywce MRS (jtk/ml pożywki). Dynamikę wzrostu przedstawiono w postaci wykresu 2 na rysunku, zaś plon biomasy oraz produktywność hodowli w poniższej tablicy.

PL 233 263 Β1

Tablica

Szczep	Plon komórek N [Jtk/g; jtk/ml]	Produktywność P [jtk/kgx\|i; jtk/hh]	Właściwa szybkość wzrostu JLlh±	Faza adaptacyjna [h]
Pożywka fermentacyjna
PI P2 P3	PI P2 P3	PI P2 P3	PI P2 P3
Lb. reuteri LOCK 1092	1,10 3,13 4,96 χ!θ’ xlO¹⁰ xl0^s	3,65 1,04 1,65 χΙΟ¹⁰ χΙΟ¹² xlO¹⁰	0,15 0,16 0,21	8,42 5,80 4,18

Pożywka kontrolna MRS

Lb. reuteri LOCK 1092

1,95x10’ _

6,48xlO¹⁰ _

0,09

0,95

Okazało się, że dynamika wzrostu oraz plon biomasy są uzależnione od składu pożywki fermentacyjnej i najwyższe wartości, w odniesieniu do podłoża kontrolnego MRS, otrzymano dla hodowli w pożywce fermentacyjnej P2. Plon komórek w tej pożywce wynosił 3,13 x 10¹⁰ jtk/g, a produktywność szczepu wzrosła do poziomu 1,04 χ 10¹² jtk/kgxh. Stwierdzono ponadto, że optymalną pożywką dla wzrostu szczepu LOCK 1092 jest pożywka o stosunku zmielonych ziaren (mąki) do wody 1:1,5. W tych warunkach bakteria osiąga najwyższy przyrost biomasy, również produktywność jest wyższa w porównaniu do proporcji mąki do wody 1:1,0 oraz 1:2,0.

Szczep LOCK 1092 wykazuje także trwałość przechowalniczą w postaci liofilizatu w warunkach chłodniczych (4-5°C) oraz w temperaturze pokojowej (25°C) w trakcie 4 miesięcy przechowywania.

Szczep LOCK 1092 znajduje zastosowanie jako dodatek do pasz dla zwierząt monogastrycznych w profilaktyce występowania chorób bakteryjnych i zatruć wywołanych mykotoksynami oraz poprawiający bezpieczeństwo chowu zwierząt.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I

Szczep LOCK 1092 hodowano w podłożu płynnym Rogosa (firmy Difco) o składzie w g/l: pepton kazeinowy -10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80 -1,0, octan sodu -15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5,5, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C w warunkach tlenowych.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 1,9 x 10⁹ komórek/ml.

Przykład II

Szczep LOCK 1092 hodowano w podłożu płynnym MRS (firmy Merck), o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny - 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny-0,20, siarczan magnezu 4-wodny- 0,05, o pH 5,5, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C w warunkach względnie beztlenowych.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 1,95 x 10⁹ komórek/ml.

Przykład III

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I umieszczono w środowisku o pH 2 i 3. W pH 3,0 przeżywalność komórek po 60 minutach wynosi 95%, a po 240 minutach 90%. Natomiast w pH 2,0 po 60 minutach przeżywa 93% komórek, a po 240 minutach 88%.

Przykład IV

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I poddano działaniu żółci o stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin. Po 4 godzinach inkubacji w obecności 2% żółci przeżywalność komórek wynosi 92%, a przy stężeniu żółci 1% przeżywa 98% komórek bakterii.

PL 233 263 B1

P r z y k ł a d V

Liofilizat bakterii otrzymanych jak w przykładzie I przechowywano w temperaturze 4-5°C oraz w temperaturze pokojowej 25°C w ciągu 4 miesięcy. Temperatura chłodnicza zapewniła większą stabilność i trwałość. Przechowywanie szczepu ŁOCK 1092 przez 4 miesiące spowodowało obniżenie liczby żywych komórek o 8% dla temperatury chłodniczej i o 15% dla temperatury pokojowej.

Wykaz sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA szczepu bakterii Lactobacillus reuteri ŁOCK 1092, która określa jego przynależność gatunkową:

TGATTGTATGGTGCTTGCACCTGATTGACGATGGATCACCAGTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCCGGAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACAAAAGCCACATGGCTTTTGTTTGAAAGATGGCTTTGGCTATCACTCTGGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGAACTGAGACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTGGAGAAGAACGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGCAGTGACGGTATCCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTGCTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACCGGGCGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCTAACCTTAGAGATAAGGCGTTCCCTTCGGGGACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGCTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTA w której: A - oznacza adeninę, G - guaninę, C - cytozynę, T - tyminę.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

1. Szczep bakterii mlekowych Lactobacillus reuteri LOCK 1092 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00123, o właściwościach probiotycznych.