KR20100038292A

KR20100038292A - 비침습적 산전 진단을 위한 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20100038292A
Application number: KR1020097025253A
Authority: KR
Inventors: 니콜로 마나레시; 안토니오 피티팔디; 쥬세페 죠르지니; 지아니 메도로
Original assignee: 실리콘 바이오시스템스 에스.피.에이.
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-05-02
Publication date: 2010-04-14
Also published as: JP5642537B2; EP2152859B1; EP2152859A2; WO2008135837A9; JP2014223082A; CA2686338A1; CN101715486B; US8383341B2; WO2008135837A2; CN101715486A; ES2398857T3; KR101558225B1; WO2008135837A3; ITTO20070307A1; US20100196897A1; JP2010525832A; JP6310804B2; CA2686338C

Abstract

비침습적 산전 진단 방법으로서: a. 임신한 여성으로부터 태아 세포를 포함할 확률이 높은 기관 체액(organic fluid)의 시료를 수득하는 단계, b. 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 집단으로 상기 기관 체액의 시료를 강화(enrich)시키는 단계, c. 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계, d. 상기 진단을 가능하게 하기 위해 적합한 상기 하나 이상의 태아 유핵 세포의 하나 이상의 유전적 특징을 확인(highlight)하기 위해 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포 중에서 분리된 상기 하나 이상의 세포에 대해 유전적 분석을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계는 상기 목적을 위해 설계된 미세유동 장치(microfluidic device)에서 단일 세포를 개별적으로 선택하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 비침습적 산전 진단 방법에 관한 것이다.

비침습적 산전 진단, 표면 항원, 태아 유핵 세포.

Description

비침습적 산전 진단을 위한 방법 및 장치{Method and device for non-invasive prenatal diagnosis}

본 발명은 비침습적 산전 진단(non-invasive prenatal diagnosis)을 위한 방법, 특히, 태아에서 유전적 질환 및 염색체 질환을 확인하기 위한 방법에 관한 것이다.

태아의 염색체 이상을 확인하기 위해 염색체 질환의 산전 진단이 도입되었다.

현재, 태아가 염색체 질환을 갖는지 여부에 대한 진단적 확인은 양수 천자(amniocentesis), 융모막 융모 생검(sampling of the chorionic villi) 또는 탯줄천자(cordocentesis)에 의해 핵형을 결정하기 위해 배아 세포를 검사하는, 침습적 진단 테스트에 의해서만 수득될 수 있다.

모든 이와 같은 테스트는 침습적이고 증가된 유산 위험을 동반한다. 따라서, 이들은 통상적으로 35세 이상의 여성, 또는 과거 임신에서 염색체 질환을 갖는 자녀를 가진 여성 또는 초음파 검사가 기형을 갖는 태아를 확인하는 경우에 권장된다.

드물기는 하나, 모체 혈액 순환(maternal circulation) 중 태아 세포의 발견 은 다수의 그룹이 비침습적 산전 진단을 가능하게 하는 태아 세포의 분리 및 회수를 위한 방법을 연구하고 개발하게 하였다. 특히, 태반 장벽을 통과할 수 있는 3개의 주요한 유형의 태아 세포들이 있다: 림프구, 영양막 세포(trophoblast), 및 적혈구 모세포(erythroblast). 이들 중에서, 연구는 무엇보다도 말초 산모 혈액으로부터의 태아 적혈구 모세포 및 태반으로부터 유래된 상피 세포인 영양막 세포의 분리 방법에 집중되었다. 말초 혈액으로부터 영양막 세포의 분리는 그들의 다핵 형태(multinucleate morphology)에 의해 제한되었으나, 이 세포들이 임신 6주차 내지 15주차에 경자궁경부(transcervical) 시료에 존재한다는 것이 확인되었다[8-13]. 태반으로부터 이동한 영양막 세포들은 종종 다른 영양막 세포 또는 모체 세포(maternal cell)에 부착되어 덩어리(clump)를 형성한다는 것에 주목해야 한다.

최근에 비-배양된(non-cultivated) 태아 세포에 직접적으로 적용된 분자 생물학 방법에 의해 태아 세포의 확인이 가능해졌다. 상기 방법은 예를 들면, 산전 FISH(Fluorescent In Situ Hybridization) 및 QF-PCR(Quantitative Fluorescent-Polymerase Chain Reaction)이다. QF-PCR은 개별적인 세포에 적용될 수 있어서, 매우 적은 수의 태아 세포에 기반한 유전적 분석을 가능하게 하는 염색체-특이적 DNA 서열을 확인하고 동시에 정량할 수 있는 방법이다. 산전 분석에서 QF-PCR의 이용에 대해, 단순한 참조를 위해 필요한 부분의 내용이 본 명세서에 포함된 일부 검토[1-6, 본 명세서의 마지막에 있는 참조문헌 참조]를 포함한 다수의 공개 문헌들이 있다.

D. W. Bianchi 및 동료들은 다중파라미터 평점(multiparametric scoring)에 근거하여 모체 혈액으로부터 태아 유핵적혈구(nucleated erythrocyte, NRBC)의 분리 시스템을 개발했다[14-27]; 파라미터들은 두 개의 형태적 특징(핵의 진원도(roundness) 및 형태) 및 태아 헤모글로빈 표지화(foetal haemoglobin marking)의 두 개의 특징(세포질의 형광 강도 및 주위 발광(peripheral luminosity))을 포함한다. 프로토콜은 밀도 구배(density gradient) 상에서의 단핵 세포(mononucleated cell)의 분리 및 백혈구의 고갈(depletion)에 의한 강화(enrichment)(CD15 및 CD45에 대한 항체에 의한 MACS) 및 감마 항-헤모글로빈 항체를 이용한 FACS 방법에 의한 세포형광측정기(cytofluorimeter) 상에서의 분리를 규정한다. 다중파라미터 평점을 통해 확인된 세포들은 현미경 관찰 하에 미세조작장치(micromanipulator)를 이용하여 회수된다.

평점 시스템은 매우 어렵고 미세조작장치의 이용이 세포의 일부 손실을 유발한다. 일반적으로, 이 방법은 5%의 위 양성(false positive)과 함께 태아 세포의 회수에서 74%의 민감도(senstivity)를 보였다.

밀도 구배 상에서 단핵 세포의 분리 및 감마 및 엡실론 태아 헤모글로빈 사슬에 대한 특이적 항체에 의해 더 표지(marking)된, CD71+ 세포의 고갈을 동반한 MACS에 의한 시료의 강화가 또한 다른 연구로부터 공지된다[7]. 그러나, 상기 표지화(marking)는 성체 세포에서 태아 헤모글로빈이 생성되는 경우가 있거나, 또는 헤모글로빈 사슬 간의 유사성에 의해 유발된, 태아 헤모글로빈과 성체 헤모글로빈에 대한 항체 간의 가교(cross-link) 때문에, 비특이성(aspecific)을 초래할 수 있다.

MonaLiza Medical Ltd. (US patent 2005/0181429 Al)는 경자궁경부 세포를 이용한 산전 유전적 분석 방법을 개발하였다. 상기 방법은 경자궁경부 시료의 수집을 위해 자궁경부 세포진 검사용 솔(Pap smear cytobrush)의 이용에 기반하며, 상기 시료는 슬라이드의 제조를 위해 세포원심분리(cytocentrifugation)에 의해 처리된다. 경자궁경부 세포가 표지화되고 현미경 하에 분석되고, 슬라이드 상에 그들의 위치 및 좌표(coordinate)가 저장된다. 상기 슬라이드가 FISH로 분석되고 앞서 수득된 좌표를 이용하여 영양막 세포가 식별된다. 상기 방법의 단점은 슬라이드의 제조를 위한 처리 동안, 경자궁경부 세포의 일부가 소실되고, 영양막 세포의 부재 때문에 콜(call)이 없을 수 있다는 것이다.

AVIVA-Biosciences Corporation (예를 들면, EP-A-1439897 참조)은 모체 혈액으로부터 태아 세포를 분리하기 위해 바이오칩에 기반한 강화(enrichment) 시스템을 개발하였다. 이 방법은 적혈구의 대부분의 제거, 높은 특이성의 자성 비드와 태아 항원에 대한 특이적 항체들의 칵테일에 의한 분류(sorting) 및 분리대상 세포의 종류에 따라 가변(variable) 직경을 갖는 구멍을 갖는 고해상도 여과 챔버(high resolution filtering chamber)에 의한 강화를 가능하게 하는 시약을 이용한다.

그러나, 상기 방법은 시료의 강화에 의한 태아 세포의 선택에 한정되며, 이는 오염시키는 모체 세포 및 결과적으로 신뢰성없는 유전적 분석의 위험을 가질 가능성을 배제하지 않는다.

요약하면, 전술된 비침습적 방법 중 어느 것도 태아 이수성(foetal anenploidy) 및/또는 다른 염색체 결함의 진단을 위해 통상적인 시술로 이용될 수 있다는 것을 입증하지 못했다.

따라서, 본 발명의 목적은 순환 중의 태아 유핵 세포를 포함할 가능성이 높은 모체의 기관 체액(organic maternal fluid), 특히, 자궁, 자궁경관내액(endocervical fluid) 또는 경자궁경관액(transcervical fluid), 또는 모세혈관의 시료채취 및 그들의 뒤이은 분리에 기반한 기반한 비침습적 산전 진단 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 위 음성(false negative) 없이, 위 양성 및 노-콜(no-call)의 적은 수로 자동화될 수 있는 산전 진단 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 비침습적 산전 진단을 위한 방법 및 장치, 특히, 태아에서 유전적 이상(genetic abnormalities)을 확인하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.

따라서, 본 발명에 따르면, 태아 유핵 세포를 포함할 확률이 높은 모체의 기관 체액(organic maternal fluid) 및 뒤이은 그의 분리, 특히, 자궁, 자궁경관내액, 또는 경자궁경관액 또는 말초 모체 혈액으로부터의 분리, 그에 존재하는 태아 세포의 확인 및 분석에 근거하여, 제1항에 따른 방법에 따라 진행된다.

본 발명에 따르면, 자궁, 자궁경관내액, 또는 경자궁경관액 또는 말초 모체 혈액이 먼저 하나 이상의 태아 유액 세포의 강화 단계를 통해 처리된다. 상기 방법은 용이하게 자동화되고 반복가능한 방식으로, 강화된 시료에서 단일 세포를 개별적으로 선택할 수 있는 미세유동 시스템의 이용에 의해 수행된다. 단일 세포의 분리를 위한 미세유동 시스템에 의해, 유전적 진단을 수행하기에 충분한 순도로 일련의 태아 세포를 수득할 수 있다.

미세유동 장치(microfluidic device)에 의해, 본 발명자들은 층류(laminar flow)로 다량의 액체를 관리하기에 적합한 장치를 의미한다.

미세유동 장치에 의해, 본 발명자들은 또한 1 mm 보다 더 작은 하나 이상의 치수를 갖는 장치를 의미한다.

개별적으로 단일 세포를 선택할 수 있는 장치에 의해, 본 발명자들은 각 세포에 대해 개별적으로 평가된 파라미터에 근거하여, 한번에 하나씩 또는 동시에 하나 이상의 세포의 선택을 수행할 수 있는 장치를 의미한다.

그 후, 필요한 경우, 비교를 위해 모체 세포의 분석을 이용한 QF-PCR(Quantitative Fluorescent PCR), FISH, 핵형(karyotype) 또는 CGH(Comparative Genome Hybridization, CGH)와 같은 기법을 통해 유전적 분석이 수행될 수 있다.

미세유동 시스템의 이용은 상이한 분석 간의 오염의 위험 또는 장치의 완전한 세척의 필요성 없이, 일회용 시스템을 가질 수 있는 가능성을 포함한 다양한 장점을 제공한다. 또한, 미세유동 시스템은 높은 수준의 신뢰성을 특징으로 하는 자동 또는 반자동(semiautomatic) 시스템을 가질 가능성을 제공한다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 첨부된 도면의 도를 참조하여, 하기의 일부 비-한정적인 구현예의 설명으로부터 명확하게 보일 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 대상은 비침습적 산전 진단을 수행하는 방법이다.

경자궁경부 시료(transcervical sample)의 채취

경자궁경부 시료(TCC)가 다양한 기법에 의해 자궁의 상이한 수준(외뼈(external bone), 자궁경관의 하부(loweer part of cervical canal), 하부 자궁극(lower uterine pole), 자궁내강(intrauterine cavity))으로부터 채취될 수 있다: 자궁경부 점막(cervical muscus)의 흡인, 세포솔(cytobrush), 또는 면봉(swab), 자궁경관내 세척(endocervical lavage) 및 IUL(intrauterine lavage).

말초 혈액으로부터 개시된 강화(enrichment)

다양한 방법, 예를 들면, Ficoll 또는 Percoll과 같은 용액으로 구성된, 밀도 구배 상에서의 원심분리; nRBC를 선택하고 시료에서 RBC를 제거하는 미세가공 필터(microfabricated filter)에 기반한 기계적 강화; 특정한 장치, DACS(Dielectophoretic activated cell sorter)에 의한 유전영동 분리(dielectrophoretic separation)를 통한 강화; 선택적 용해(selective lysis), 예를 들면, 대상이 아닌 적혈구의 선택적 용해; 양성 선택(회수될 태아 집단에 대한 특이적 항체에 연결된 비드를 이용한 선택) 또는 음성 선택(대상이 아닌 세포 집단의 고갈)의 면역자기 비드(immunomagnetic bead)에 의한 면역자기적 분리로서, 방법의 특이성을 증가시키기 위해 상기 두 종류의 선택이 결합될 수 있는 면역자기적 분리(예를 들면, US2006/0051775 - Bianchi); 태아 항원에 대한 특이적 형광 항체로 표지화된 세포에 대한 FACS를 이용하여 태아 세포의 비율이 강화될 수 있다.

이 방법들의 대부분은 또한 자동화될 수 있고 모든 분리 방법은 밀도 구배 상에서의 원심분리에 의한 전체 단핵 세포의 분리에 의해 선행될 수 있거나, 대안적으로 이들은 혈액에 전체로(in toto) 적용될 수 있다.

일반적으로, 강화 방법은 희석부터 개시되나, 모든 기법을 위해 반드시 필요한 것은 아니다.

기타 강화 기법

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 다른 기법은 Miltenyi Biotech에 의한 MACS, 또는 Stem-cell technologies에 의한 Easy-sep이라 불린다. 요약하면, 말초 모체 혈액으로 구성된 기관 체액(organic fluid)의 경우를 고려할 때, 혈액 시료의 한 종류 이상의 태아 세포를 포함하는 세포 집단에 의한 강화는 예를 들면, 전체 단핵 세포들이 이전에 PBS/EDTA에 희석된 모체 시료로부터 Ficoll 밀도 구배 원심분리에 의해 분리되는 제1 단계를 포함한 연속적인 단계의 방법을 통해 수득될 수 있다. 분명히, 대안으로서, 도 1에 요약된 다른 방법들 중 하나, 예를 들면, 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 또는 이들의 조합에 기반한 세포의 분리를 통한 모체 시료의 강화가 이용될 수 있다:

a. 밀도,

b. 형태,

c. 전기적 특성,

d. 화학적 특성,

e. 기계적 특성,

f. 표면 항원의 발현,

g. 세포질내 항원(intracytoplasmic antigen)의 발현,

h. 유전적(dielectric) 특성,

i. 자기적 특성.

뒤이어, 태아 세포의 강화가 제1 단계에서 회수된 단핵 세포로부터 세포, 예를 들면, CD71을 발현하는 세포의 양성 선택 또는 음성 선택이 이루어지는 것인 제2 단계에 의해 더 수득된다. 명확하게, 제2 강화 단계는 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 세포의 집단의 하기 특징 중 하나에 기반한 선택을 포함할 수 있다:

a. (전술되고, 본 발명의 바람직한 형태를 나타내는) CD71 표면 항원의 발현;

b. CD34 표면 항원의 발현,

c. GPA 표면 항원의 발현,

d. CD14 표면 항원의 발현 부재,

e. CD15 표면 항원의 발현 부재,

f. CD45 표면 항원의 발현 부재.

하기의 기법 중 하나를 통해 한 종류 이상의 세포를 포함하는 세포의 집단에서 시료를 강화시키는 상기 제2 단계가 수행될 수 있다:

a. MACS 또는 Magnetic Activated Cell Sorter;

b. DACS 또는 Dielectrophoretic Activated Cell Sorter;

c. FACS 또는 Fluorescence Activated Cell Sorter.

태아 세포의 표지화(Marking of the foetal cells)

영양막 세포의 면역 염색

시료가 TCC 시료인 경우, 표지화 전에, 시료가 아세틸-시스테인과 함께 인큐베이션되고 덩어리를 용해시키고 단일 세포의 현탁액을 수득하기 위해 강하게 교반된다.

태아 세포의 확인을 위해, 태아 세포에 대한 특이적(태아 세포를 모체 세포와 구별할 수 있는) 항체에 의한 표지화가 이용되어, 본 발명이 속하는 기술 분야에서와 같이 수행된다. 특정한 항원에 대한 다양한 항체를 이용하여 영양막 세포가 표지화될 수 있다:

융모외 영양막 세포(extravillous trophoblast)에 대해 특이적인, HLA-G, NDOG-5, BC1, 인자 XIII, FDO202N, JunD, Fra2, HASH2 및 PP5 (태반 단백질);

융합체 영양막세포(syncytium trophoblast)에 대해 특이적인, FT1.41.1, I03, NDOG-1 및 AB-154;

영양막 세포 상에서 발현되는, CK-7 (cytokeratin-7), CHL1 (CD146), CHL2, H315, HLA-C, aHCG, IGF-II, PAI-1 및 p57;

융합체 영양막세포(syncytium trophoblast) 및 세포 영양막 세포 (cytotrophoblast) 상에서 발현되는, PLAP (placental alkaline phosphatase), AB-340, 및 D6,

침윤성(invasive) 또는 융모외(extravillous) 영양막 세포에 대해 특이적이나 융모성(villous) 영양막 세포에 대해서는 특이적이지 않은, Tapasin 및 CAR,

태반 특이적, 특히, 영양막 세포 계통 세포(trophoblast lineage cell)의 태반 특이적, PLAC1, PLAC4, PLAC8 및 PLAC9,

임신 제7주 내지 제10주의 태반 세포 상에서 발현되는, PAR-1 (protease activated receptor),

임신 제10주 내지 제12주의 융합체 영양막세포 및 융모외(extravillous) 영양막 세포 상에서 발현되는, GLUT- 12 (glucose transporter protein);

임신의 첫 3개월 동안 융모외 영양막 세포 상에서 발현되는,NDPK-A (nucleoside diphosphate kinase A).

말초 모체 혈액의 시료로부터 적혈구 모세포의 면역염색

태아 세포의 확인을 위해, 전술된 바와 같이, 태아 세포에 대해 반드시 특이적이지 않아도 되는, 강화를 위해 이용된 항체와 상이한, 태아 세포에 대한 제2의 특이적(태아 세포를 모체 세포와 구별할 수 있는) 항체에 의한 표지화가 이용된다.

이 경우, 하기가 이용될 수 있다:

- (i-항원과 같은) 표면 항원을 인식하는 항체 ;

- 세포내 항원(예를 들면, 글로빈 사슬 Y 또는 e). 이 경우, 세포들은 바람직하게는 양호한 표지화를 가능하게 하기 위해, 바람직하게는 고정되고 투과화(permeabilise)된다.

이전의 연구들로부터, 태아 세포를 표지하기 위한 항-i-항원 항체의 이용이 공지되어 있으나, 상기 항체는 밀도 구배에 기반한 장치에서 직접 이용되었다는 점이 주목되어야 한다. CD71+ 세포의 강화에 뒤이은 i-항원 항체에 의한 태아 세포의 표지화는 태아 세포(태아 적혈구 모세포로 강화된 시료)의 예비-선택(pre-selection)을 수행하고, 목적 세포(cell of interest)의 확인을 촉진하고, 또한 매우 민감하고 특이적인 표지화를 수득하는 장점을 갖는다.

이미 표지화된 세포

태아 세포에 대해 특이적이고(태아 세포를 모체 세포로부터 구별할 수 있고) 형광이거나 또는 형광 비드 또는 형광 제2 항체 또는 형광 제3 항체와 접합된 항체가 강화에서 이용된 경우, 태아 세포는 이미 표지화된 상태일 수 있다. 이 경우, 이미 태아 세포를 식별할 수 있기 때문에, 강화된 시료가 직접 단일 세포를 선택할 수 있는 미세유동 장치로 주입될 수 있다.

단일 태아 세포의 분리

뒤이어, 상기 세포를 포함하는 시료가 공지된 종류의, 단일 세포를 개별적으로 선택할 수 있는 장치에 배치된다. 상기 목적을 위해, 유전영동 분리(dielectrophoretic isolation)(DEPArray, 예를 들면, PCT/IB2007/000963 또는 PCT/IB2007/000751, 또는 [31] 및 [32]에 기재된 기법을 이용함), 또는 광전자 트랩(optoelectronic trap) 또는 광영동 분리(optophoretic isolation) 또는 레이저 집게(laser tweezer)[28-30]가 이용될 수 있다. 상기 문헌 [28-30] 및 [31-32]의 내용은 단순 참조를 위해 필요한 부분에 대해 본 명세서에 포함된다.

목적 세포의 확인은 예를 들면, 하기와 같은 센서에 의해 수행될 수 있다:

- 외부 센서

- 형광 현미경과 같은 광학적 센서, 또는

- 내부 센서

- 형광 세포 확인의 통합적 방법을 기술하는 특허 PCT/IB2006/000636 및 WO2007010367에 기재된 광학적 센서,

- 세포와 결합된 유전성 비드(dielectric bead)를 확인하기 위한 특허 PCT/IB2006/000636 및 WO2007010367에 기재된 교류저항측정형(impedentiometric) 센서.

유전적 분석(genetic analysis)

회수된 태아 세포에 대해 다양한 종류의 분석이 수행되어, 상이한 수준의 분해능(resolution) 및 민감도에서 본 연구의 진단 목적에 따라 유전적 특성 또는 염색체 특성 규명을 가능하게 한다.

추정되는 염색체 질환의 경우, 고전적 방법 또는 분자적 방법(FISH)에 의한 핵형 분석 또는 QF-PCR에 의한 염색체 마커의 연구가 수행될 수 있다. 유전적 물질의 획득 또는 소실이 또한 CGH(Comparative Genomic Hybridization)에 의해 연구될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 비침습적 산전 진단 방법의 요약 도면을 보여준다.

도 2는 DAPI의 형광에 대한 필터에 의해 10X 확대된 칩의 이미지를 보여준다. 세 개의 단일 세포에 대응되는, 세 개의 핵을 볼 수 있다.

도 3은 FITC의 형광에 대한 필터에 의해 10X 확대된 칩의 이미지를 보여준다. 촬영된 영역은 도 2에 도시된 영역과 동일하고, 두 개의 Hb-e 양성 세포 및 한 개의 Hb-e 음성 세포를 볼 수 있다.

도 4는 염색체 마커 AMXY, D21S11 및 HPRT의 분석에 대한 전기영동 결과(electropherogram)를 보여준다. 상단의 그래프는 모체 혈액으로부터 회수된 태아 세포에 대해 수행된 분석을 나타내고, 하단의 그래프는 모체 세포에 대해 수행된 분석을 나타낸다. 그래프는 태아에서 성 염색체 X 및 Y의 존재를 보여주고 D21S11에서 태아 세포가 모계(M)로부터 유전된 제1 대립인자(allele) 및 상이한 (부계(P)의) 제2 대립인자를 갖는다는 것을 보여준다.

도 5는 염색체 마커 D18S391, D13S631 및 D21S1411의 분석에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 상단의 그래프는 모체 혈액으로부터 회수된 태아 세포에 대해 수행된 분석을 나타내고, 하단의 그래프는 모체 세포에 대해 수행된 분석을 나타낸다. 그래프는 마커 D13S631 및 D21S1411에 대한 두 개의 대립인자(정상 이형접합체)의 존재를 보여주며 모체 세포에 의한 오염이 배제될 수 있다는 것을 보여준다.

도 6은 마커 D21S1437 및 D21S1446의 분석에 대한 전기영동 결과를 보여준 다. 상단의 그래프는 모체 혈액으로부터 회수된 태아 세포에 대해 수행된 분석을 나타내고, 하단의 그래프는 모체 세포에 대해 수행된 분석을 나타낸다. 그래프는 두 개의 대립인자(정상 이형접합체)의 존재를 보여주며 모체 세포에 의한 오염이 배제될 수 있다는 것을 보여준다.

도 7은 마커 D18S535의 분석에 대한 전기영동 결과를 보여준다. 상단의 그래프는 모체 혈액으로부터 회수된 태아 세포에 대해 수행된 분석을 나타내고, 하단의 그래프는 모체 세포에 대해 수행된 분석을 나타낸다. 그래프는 두 개의 no-call 대립인자(정상 이형접합체)의 존재를 보여준다.

도 8은 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예의 흐름도(flow chart)를 보여준다.

도 9는 케이지당 세포의 평균 밀도(mean density of cells per cage , ACPC)에 따른, 단일 케이지 내의 태아 세포의 갯수(NCISCC)의 경향을 보여준다.

도 10은 본 발명에 따른 방법(또는 그의 실질적이고 특징적인 부분)의 구현을 위한 장치의 예를 개략적으로 보여준다.

본 발명의 바람직한 구체예의 설명

본 발명의 대상의 비-한정적 예로서, 본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예가 도 8에 표시된 흐름도에 따라 설명된다.

시료의 채취

임신한 여성으로부터 10 ml의 말초 혈액을 채취하였다.

강화(enrichment)

본 발명의 바람직한 구체예는 전체 단핵 세포가 모체 시료로부터 분리되는 것인 제1 단계를 갖는 연속적인 단계의 방법을 포함했다.

상기 단계는 PBS pH 7.2에 의한 모체 혈액의 1:1 희석을 포함했다. 그 후, 희석된 시료를 단일 Ficoll 구배 1.077 g/ml 상에서 층화시키고(stratify) 22℃에서 30분간 300 g의 속도로 원심분리시켰다. Ficoll 상에 축적된 세포의 고리(ring)를 회수하고 무균 시험관으로 옮겼다.

본 발명의 특징에 따라, 혈액 또는 단핵 세포의 일부를 더 처리하지 않고 모체 DNA의 분석을 위해 이용하였다.

그 후, CD71을 발현하는 세포를 상기 제1 단계로부터 회수된 단핵 세포로부터 양성적으로(positively) 선택하는 제2 단계를 통해 태아 유핵 세포의 강화를 더 수득하였다. 양성 선택은 자성 비드에 접합된 항-CD71 항체의 이용을 포함하는 면역자기적 분리(immunomagnetic separation)(MACS Miltenyi Biotec)에 의해 수행하였다.

면역자기적 분리를 위해, 세포들을 10⁷개의 세포당 80 ㎕의 PBS로 재현탁시키고 10⁷개의 세포당 20 ㎕의 항-CD71 마이크로-비드(Miltenyi Biotec)를 첨가하였다. 4℃에서 15분의 인큐베이션 후에, 상기 세포들을 양성 CD71 세포를 보유하는 자기장에 연결된 컬럼을 통해 통과시켰다. 그 후, 보유된 세포들을 상기 컬럼으로 부터 용리시키고 다음 단계에서 이용하였다.

분리(isolation)

수득된 CD71+ 세포들(CD71에 대해 양성인 세포)을 포름알데히드 3.7%로 22℃에서 15분 동안 고정시켰다. 상기 고정된 세포들을 PBS 중의 NP-40(Sigma Aldrich) 0.1% 용액으로 투과화시켰다. 형광단(fluorochrome) FITC에 접합된 태아 헤모글로빈의 감마 사슬을 인식하는 항체(1 ㎍/ml)를 상기 투과화된 세포에 첨가하였다.

본 발명의 중요한 양태에 따라, 상기 시료를 또한 모든 세포의 핵을 표시하기 위해 DAPI(또는 다른 적합한 마커)로 추가적으로 대조표지(countermark)화시켰다.

태아 세포의 유전영동 조작 및 분리를 위해 칩에 적재하기 전에, 상기 시료에 표지화의 형광 강도 및 총 세포량(total cellular content)을 확인하기 위한 품질 관리(quality control)를 수행하였다. 표지된 시료의 일부를 유동영동 조작을 위해 유용한 최소 특정 완충액 부피에 재현탁시키고 시료의 품질 관리를 위한 장치에 적재하고 형광 현미경 하에 관찰하였다: 다양한 채널에서 세포의 형광 강도를 관찰하고 DAPI로 표지된 세포들(전체 유핵 세포)의 계수를 수행하였다. 세포 농도가 단일 세포의 분리를 위한 장치의 올바른 작동을 위한 최적 농도보다 높은 경우, 원하는 농도를 수득하기 위해 시료를 희석하였다; 세포의 총수가 너무 낮아서 최소 수의 태아 세포의 회수가 가능하지 않은 경우, 태아 세포를 회수하지 않았다(no-call 결과).

세포의 최적 농도를 계산하기 위해, 본 발명자들은 휴대용 유전영동 케이지에 기반한 특정한 상업용 장치(DEPArray™, Silicon Biosystems SpA), WO0069565, 특히, 100,000개의 케이지를 포함하는 모델 CONV600k를 이용했다.

상기 장치를 이용하는 바람직한 방법은 하기의 단계를 포함한다:

1. 태아 세포(표지화에 대해 양성인 세포)를 포함하는 케이지를 선택한다.

2. 상기 세포가 덩어리(cluster)의 일부인 경우, 즉, 상기 세포가 다른 비-태아 세포와 상기 케이지를 공유하는 경우, 태아 세포들이 다른 비-태아 세포와 공유되지 않는 케이지로 분리될 때까지 상기 덩어리의 세포들을 별개의 케이지로 분리시킨다. 태아 세포가 다른 비-태아 세포들로부터 분리되지 않는 경우, 상기 태아 세포를 버린다.

3. 하나의 단일 케이지 내에 모든 태아 세포를 회수한다.

상기 장치를 이용하는 또 다른 대안적인 바람직한 방법은 하기 단계들을 포함한다:

2. 상기 세포가 덩어리의 일부인 경우, 상기 세포를 회수될 세포의 목록으로부터 제거한다.

3. 하나의 단일 케이지 내에 모든 태아 세포를 회수한다.

상기 두번째 경우에, 칩에서 주입될 케이지당 세포의 평균 밀도(ACPC)의 선택은 시료 내에 존재하는 전체 세포의 갯수(NCELLSTOT) 및 예상되는 태아 세포의 비율(PCI)를 고려하여 이루어졌다.

실제로, ACPC가 증가되면, 칩의 조작 챔버(manipulation chamber) 내에 존재하는 태아 세포의 갯수가 증가된다. 그러나, 각 세포가 단일 세포를 갖는 케이지에 속할 확률은 감소되고, 따라서, 단일 케이지 내의 태아 세포의 갯수(NCISCC)는 ACPC에 대한 최대값 ∼=1에 도달한다. 상기 값은 PCI와 독립적이고, ACPC=1에 대한 이론적 최대값에 대해 NCISCC의 정규화된 값(normalized value)으로 정의될 수 있고, 그 경향이 도 9의 그래프에 도시된다. 상기 농축은 조작 미세챔버(manipulation microchamber)로 시료의 각 플러싱(flushing)시 회수될 수 있는 세포의 갯수를 최대화한다. 이것은 회수될 수 있는 태아 세포의 총 갯수가 하류 부문의 유전적 분석을 위해 충분하다면 우수한 선택이다.

ACPC가 증가되면, 조작 미세챔버 내에 존재하는 태아 세포의 갯수에 대한 정규화된 값을 참조하여, 도 9에 도시된 바와 같이, 태아 세포들이 다른 비-태아 세포와 케이지를 공유한다는 사실 때문에 버려질 세포들의 비율의 점증하는 단조 증가(monotonic increase)가 있다(정규화된 세포-폐기(normalized cell-waste)).

회수될 수 있는 세포의 갯수가 하류 분석을 위해 요구되는 최소 갯수 미만인 경우, 시료가 희석되고 더 많은 수의 태아 세포를 회수하기 위해 보다 많은 횟수의 플러싱이 수행될 수 있다.

보다 작은 수의 플러싱으로 충분한 갯수의 태아 세포를 회수하기 위한 최적의 ACPC 값은 앞서 결정된 통계적 분석에 기반하여 계산될 수 있고, 예를 들면, 예상되는 태아 세포의 갯수 및 유전적 분석을 위한 세포의 최저 갯수에 기반한 계산으로, 따라서, 시료 내에 존재하는 태아 세포의 최저 회수 효율성(단일 케이지 내 의 세포/다른 세포들을 포함하는 케이지 내의 세포들의 비율)을 확인할 수 있다. 상기 효율성으로부터, ACPC의 최대 값이 차감되고, 따라서, 전체 시료를 상기 회수 효율성으로 처리하기 위해 필요한 플러싱의 최저 횟수가 수득된다.

그 후, 상기 시료를 휴대용 유전영동 케이지(DEPArray™ WO0069525, Silicon Biosystems SpA, 예를 들면, 도 10에 개략적으로 예시된 것과 같은 패키지 또는 전체 장치의 일부로서)에 의한 세포의 분리를 위한 칩에 적재하고 스캐닝, 태아 세포의 식별 및 선택, 분류(sorting) 및 회수를 수행하였다. 케이지에 담긴(caged) 세포들을 3개의 상이한 형광 채널로(또는 3개의 상이한 파장에서) 현미경 하에서 자동으로 또는 수동으로 관찰하였다: 본 명세서에 기재된 비-한정적인 케이스에서, 청색 채널(blue channel)은 핵의 존재 및 필요한 경우, 그의 형태(예를 들면, DAPI에 의한 표지화)를 확인할 수 있게 하고, 녹색 채널은 녹색 파장에서 방사하는 형광단(fluorophore)(예를 들면, FITC)에 접합된 특정한 태아 항체로 표지된 세포들을 표시했다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 상기 두 개와 상이한 제3 채널(예를 들면, TRITC의 형광을 검출하기 위해 이용되는 필터에 대한 것과 같이, 적색 파장에서 방사하는 채널)이 또한 이용되고, 그에 대한 형광 마커를 이용하지 않았으며, 이는 자가형광 세포의 식별을 가능하게 하고, 상기 세포에 대해, DAPI 및 녹색 채널에서 검출된 신호는 특이적이지 않을 것이다.

대안적으로, 상기 제3 채널이 폐기될 세포를 식별하기 위해, 형광단에 결합된, 예를 들면, CD45에 대한 항체와 접합된 세포를 표시하기 위해 이용될 수 있다.

따라서, 세포의 선택은 하나의 단일 유핵 세포(DAPI에 대해 양성, 도 2)를 포함하고, 강한 특이적 태아 항체 신호(FITC/Alexa에 대해 양성, 도 3)를 가지며, 다른 채널(예를 들면, 적색 채널)에서 검출된 낮은 또는 0의 자가형광(autofluorescence)을 갖는 케이지를 선택하는 것에 의해 이루어졌다.

상기 방법의 선택성을 더 개선하기 위해, 단순한 형광 분자로 구성되는 것 대신에, 형광 마커, 특히, 태아 마커는 목적 세포, 이 경우, 태아 세포를 인식할 수 있는 항체에 접합된 형광 비드로 구성될 수 있다.

상기 세포를 0.2 밀리리터 PCR 튜브 내에 수 마이크로리터(< 40 마이크로리터)로 회수하였다.

유전적 분석

따라서, 상기와 같이 수득된 세포로부터, 증폭되어 염색체 이수성(chromosomic aneuploidies)의 존재에 대해 분석될 DNA를 추출하고, 바람직하게는 선택을 위해 이용되고, 필요한 경우, 강화 방법의 적어도 일부로서 이전에 이미 사용되었던(예를 들면, DACS 기술의 사용의 경우) 것과 동일한 미세유동 장치에서 작업하였고, 이 경우 상기 장치는 도 10에 예시된 것과 유사할 수 있다.

장치는 본 발명이 속하는 분야에서 공지된 바와 같이 전극의 배열을 포함하나, 활성화될 수 있는 전극의 배열을 갖는, 모두 단일 칩당, 또는 복수 개의 별개의 칩당 하나 이상의 면(face) 상에 한정된 주요 미세챔버(main microchamber, CHM) 및 복수 개의 이차 미세챔버(CHJ)를 특징으로 한다. 상기 주요 미세챔버는 상대적 유입구(IM1) 및 유출구(OM1)을 통해 하나 이상의 세포를 포함하는 시료로 충 진될 수 있다. 각각의 이차 미세챔버(CHJ)는 바람직하게는 세포의 크기보다 실질적으로 더 큰 크기이나, 세포의 크기와 유사하다. 바람직하게는, 각각의 이차 미세챔버는 분석을 위해 필요한 시기에 확산 및 다른 미세챔버로의 호염에 의한 시료의 분산을 방지(예방 또는 적어도 한정)하기 위해 충분한 구성 채널(configuration channel)(길이 및/또는 형태)을 통해 주요 미세챔버에 연결된다. 예시된 예에 따르면, 칩 상의 모세관 전기영동을 위한 채널에, 예를 들면, 십자 조인트(cross joint)로 연결된 복수 개의 용해용 이차 미세챔버가 있다. 대안적으로, 공지된 기술에 따라, 이중 T 접합부(double T junction)을 갖는 모세관 전기영동을 위한 일련의 채널들이 제공될 수 있다. 선택적으로, 모세관 전기영동용 채널의 말단에, 교차점(intersection)(십자 또는 이중 T)으로부터 센서까지 분석된 화합물의 이동 시간에 근거한 전기영동 결과를 생성할 수 있는, 교류저항측정형(impedentiometric) 및/또는 광학형의 통합된 센서(integrated sensor)가 있다. 도 10에 따르면, 특히, 복수 개의 미세 챔버의 각 미세챔버는 각각의 이차 미세 챔버의 유동 유출구(fluidic outlet)(OJ)를 통해 전기영동용 모세관(CAPJ)에 연결된다.

회수된 태아 세포의 DNA의 추출은 알칼리 열 용해(thermolysis)에 의해 수행하였다.

염색체 변형의 결정은 STR (Short Tandem Repeat)의 분석 또는 QF-PCR에 의한 마이크로새털라이트(microsatellite)의 분석을 통해 수행하였다. 형광 모세관 전기영동 기술은 상이한 형광 분자로 표지된 DNA의 단편들의 적합한 선택을 통해 여러 STR의 동시 분석을 가능하게 했다.

집단 내에서 높은 이형접합(heterozygosis) 빈도를 가지며, 각각 염색체 13, 18 및 21에 있는 3개 이상의 상이한 STR 및 성 염색체상의 3개의 마커들을 다중-PCR(multiplex-PCR)로 증폭시켰다. no-call의 경우, 예를 들면, 동종접합(homozygosis)에서 STR의 존재 때문에, 동일한 염색체의 다른 STR을 증폭시켰다. 분석된 STR은 염색체 21의 분석을 위한 D21S11, D21S1410, D21S1411, D21S1412, D21S1435 및 D21S1446; 염색체 13에 대한 D13S631, D13S634, D13S258, D13S305 및 D13S742; 염색체 18에 대한 D18S535, D18S386, D18S391, D18S858 및 D18S51였고; 성 염색체의 분석을 위해, 마커 AMXY와 SRY, 및 STR X22, DXYS218, DXS6803, DXS6809, DXS8377, HPRT 및 SBMA를 분석하였다.

태아 세포의 DNA의 증폭과 병행하여, 본 발명의 일 양태에 따라, 태아 세포의 가능한 모체 오염의 존재 또는 QF-PCR의 가능한 외부 오염의 존재를 인식하기 위해 모체 DNA를 분석하였다(도 4-7).

자동 시퀀서(automatic sequenser)(예를 들면, ABI prism 310)에 의한 PCR 산물의 모세관 전기영동으로부터 수득된 전기영동 결과에서, 증폭된 마이크로새털라이트의 다양한 대립인자에 상응하는 영역 및 피크의 크기를 분석하였다. 모체 DNA의 동시 분석은 대조군으로서, 실험실 오염 및 회수된 태아 세포의 모체 세포에 의한 오염의 가능한 케이스를 확인할 수 있도록 하여, 유전적 분석의 결과를 해석하는 것을 보조할 수 있다.

유전적 분석 단계는 또한 본 발명의 가능한 변형에 따라, 핵형에 의해 수행될 수 있고, 이 경우, 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세 포 집단의 강화 단계는 하기 단계들을 더 포함한다:

I. 중기(metaphase) 세포의 차단(blocking).

중기의 세포들을 중단시킨 후에, 세포질내 항체(intra-cytoplasmic antibody)에 의한 태아 세포의 식별을 위해 고정 및 투과화(permabilisation)를 수행한다.

참조 문헌

[1] van Zwieten MC, Willems DL, Litjens LL, Schuring-Blom HG, Leschot N. How unexpected are unexpected findings in prenatal cytogenetic diagnosis? A literature review. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2005 May 1 ; 120 (1) : 15-21. Review.

[2] Nicolini U, Lalatta F, Natacci F, Curcio C, Bui TH. The introduction of QF-PCR in prenatal diagnosis of foetal aneuploidies : time for reconsideration. Hum Reprod Update. 2004 Nov-Dec;10(6) :541-8. Review.

[3] Leung WC, Lau ET, Lao TT, Tang MH. Rapid aneuploidy screening (FISH or QF-PCR) : the changing scene in prenatal diagnosis? Expert Rev MoI Diagn. 2004 May;4 (3) : 333-7. Review.

[4] Hulten MA, Dhanjal S, Pertl B. Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction. 2003 Sep; 126 (3) : 279-97. Review.

[5] Adinolfi M, Pertl B, Sherlock J. Rapid detection of aneuploidies by microsatellite and the quantitative fluorescent polymerase chain reaction. Prenat Diagn. 1997 Dec ; 17 (13) : 1299-311. Review.

[6] Adinolfi M, Sherlock J. First trimester prenatal diagnosis using transcervical cells: an evaluation. Hum Reprod Update. 1997 Jul-Aug; 3 (4) : 383-92. Review

[7] Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, Elias S, Holzgreve W, Evans MI, Dukes KA, Sullivan LM, Klinger KW, Bischoff FZ, Hahn S, Johnson KL, Lewis D, Wapner RJ, de Ia Cruz F. Foetal gender and aneuploidy detection using foetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Foetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn. 2002 Jul;22 (7) :609-15.

[8] Shettles, LB (1971) Use of the Y chromosome in prenatal sex determination. Nature, 230, 52.

[9] Adinolfi, M, Davies, A, Sharif, S et al . (1993) Detection of trisomy 18 and Y-derived segurnces in foetal nucleated cells obtained by transcervical flushing, Lancet, 342, 403-404.

[10] Adinolfi, M and Sherlock, J (1997) First trimester prenatal diagnosis using transcervical cells: an evaluation, Human Reproduction Update, 3 (4), 383-392.

[11] Miller, D, Briggs, J, S.Rahman, M, et al . (1999) Transcervical recovery of foetal cells from the lower uterine pole: reliability of recovery and histological/ immunocytochemical analysis of recovered cell populations, Human Reproduction, 14 (2), 521-531

[12] Bussani, C, Cioni, R, Scarselli B, et al. (2002) Strategies for the isolation and detection of foetal cells in transcervical samples, Prenatal Diagnosis, 22, 1098-1101.

[13] Bussani,- C, Scarselli, B, Cioni, R, et al . Use of the quantitative fluorescent-PCR assay in the study of foetal DNA from micromanipulated transcervical samples, MoI Diagn, 8 (4), 259-263

[14] Wang JY, Zhen DK, Falco VM, Farina A, Zheng YL, Delli- Bovi LC, Bianchi DW. Foetal nucleated erythrocyte recovery: fluorescence activated cell sorting-based positive selection using anti-gamma globin versus magnetic activated cell sorting using anti-CD45 depletion and anti-gamma globin positive selection. Cytometry. 2000 Mar 1 ; 39 (3) : 224-30.

[15] Samura 0, Sekizawa A, Zhen DK, Falco VM, Bianchi DW. Comparison of foetal cell recovery from maternal blood using a high density gradient for the initial separation step: 1.090 versus 1.119 g/ml . Prenat Diagn. 2000 Apr; 20 (4) : 281-6.

[16] Sekizawa A, Farina A, Zhen DK, Wang JY, Falco VM, Elmes S, Bianchi DW. Improvement of foetal cell recovery from maternal blood: suitable density gradient for FACS separation. Foetal Diagn Ther. 1999 Jul-Aug; 14 (4 ) : 229-33.

[17] Sekizawa A, Samura 0, Zhen DK, Falco V, Bianchi DW. Foetal cell recycling: diagnosis of gender and RhD genotype in the same foetal cell retrieved from maternal blood. Am J Obstet Gynecol. 1999 Nov;181(5 Pt l):1237-42.

[18] Zheng YL, Zhen DK, DeMaria MA, Berry SM, Wapner RJ, Evans MI, Copeland D, Williams JM, Bianchi DW. Search for the optimal foetal cell antibody: results of immunophenotyping studies using flow cytometry. Hum Genet. 1997 JuI; 100 (1) : 35-42.

[19] Geifman-Holtzman 0, Bernstein IM, Berry SM, Holtzman EJ, Vadnais TJ, DeMaria MA, Bianchi DW. Foetal RhD genotyping in foetal cells flow sorted from maternal blood. Am J Obstet Gynecol. 1996 Mar; 174 (3) : 818-22.

[20] Bianchi DW, Klinger KW, Vadnais TJ, Demaria MA, Shuber AP, Skoletsky J, Midura P, Diriso M, Pelletier C, Genova M, Erikson MS, Williams JM. Development of a model system to compare cell separation methods for the isolation of foetal cells from maternal blood. Prenat Diagn. 1996 Apr; 16 (4) : 289- 98.

[21] DeMaria MA, Zheng YL, Zhen D, Weinschenk NM, Vadnais TJ, Bianchi DW. Improved foetal nucleated erythrocyte sorting purity using intracellular antifoetal hemoglobin and Hoechst 33342. Cytometry. 1996 Sep 1 ; 25 (1) : 37-45.

[22] Zheng YL, Craigo SD, Price CM, Bianchi DW. Demonstration of spontaneously dividing male foetal cells in maternal blood by negative magnetic cell sorting and fish. Prenat Diagn. 1995 Jun;15 (6) : 573-8.

[23] Zheng YL, Demaria M, Zhen D, Vadnais TJ, Bianchi DW. Flow sorting of foetal erythroblasts using intracytoplasmic antifoetal haemoglobin: preliminary observations on maternal samples. Prenat Diagn. 1995 Oct; 15 (10) : 897-905.

[24] Bianchi DW, Yih MC, Zickwolf GK, Flint AF. Transferrin receptor (CD71) expression on circulating mononuclear cells during pregnancy. Am J Obstet Gynecol. 1994 Jan,-170(l Pt 1) :202-6.

[25] Bianchi DW, Shuber AP, DeMaria MA, Fougner AC, Klinger KW. Foetal cells in maternal blood: determination of purity and yield by quantitative polymerase chain reaction. Am J Obstet Gynecol. 1994 Oct ; 171 (4) : 922-6.

[26] Bianchi DW, Mahr A, Zickwolf GK, Houseal TW, Flint AF, Klinger KW. Detection of foetal cells with 47,XY, +21 karyotype in maternal peripheral blood. Hum Genet. 1992 Dec,- 90 (4) : 368- 70.

[27] Bianchi DW, Stewart JE, Garber MF, Lucotte G, Flint AF. Possible effect of gestational age on the detection of foetal nucleated erythrocytes in maternal blood. Prenat Diagn. 1991 Aug;ll(8) : 523-8.

[28] Reichle C, Sparbier K, Muller T, Schnelle T, Walden P and Fuhr G, Electrophoresis, 2001; 22:272-82.

[29] Fiedler S, Shirley SG, Schnelle T and Fuhr G, Anal. Chem. 1998 ; 70 : 1909 - 15 .

[30] Enger J, Goksor M, Ramser K, Hagberg P and Hantstorp D, Lab Chip, 2004; 4:196-200.

[31] Manaresi N, Romani A, Medoro G, Altomare L, Leonardi A, Tartagni M and Guerrieri R, IEEE J. Solid-State Circuits, 2003; 38:2297-2305.

[32] Romani A, Manaresi N, Marzocchi L, Medoro G, Leonardi A, Altomare L, Tartagni M and Guerrieri R, Proceedings of the International Solid State Circuit Conference, 2004; 1:224-225.

Claims

비침습적 산전 진단 방법으로서:

a. 임신한 여성으로부터 태아 유핵 세포(foetal nucleated cell)를 포함할 확률이 높은 기관 체액(organic fluid)의 시료를 수득하는 단계,

b. 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 집단으로 상기 기관 체액의 시료를 강화(enrich)시키는 단계,

c. 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계,

d. 상기 진단을 가능하게 하기 위해 적합한 상기 하나 이상의 태아 유핵 세포의 하나 이상의 유전적 특징을 확인(highlight)하기 위해 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 분리된 상기 하나 이상의 세포에서 유전적 분석을 수행하는 단계를 포함하고,

상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계는 상기 목적을 위해 설계된 미세유동 장치(microfluidic device)에서 단일 세포를 개별적으로 선택하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 비침습적 산전 진단 방법.
제1항에 있어서, 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계는 단일 세포를 바람직하게는 상기 미세유동 장치에 어레 이(array)에 따라 위치된 상기 미세유동 장치의 복수의 부위의 특정한 부위에 각각 포획(capture)하고, 뒤이어 상기 미세유동 장치의 내부 또는 외부에 있는 센서에 의해 검출될 수 있는 하나 이상의 파라미터에 기반하여, 포획된 세포들 중으로부터 단일 세포를 선택하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기관 체액의 시료를 강화시키는 단계는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 파라미터 또는 이들의 조합에 기반한 세포의 선택을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

a. 밀도,

b. 형태,

c. 전기적 특성,

d. 화학적 특성,

e. 기계적 특성,

f. 표면 항원의 발현,

g. 세포질내 항원(intracytoplasmic antigen)의 발현,

h. 유전적(dielectric) 특성, 및

i. 자기적 특성.
제3항에 있어서, 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 집단으로 상기 기관 체액의 시료를 강화시키는 단계는 상기 유핵 세포를 분리하고 결과적으로 상기 기관 체액을 유핵 세포로 강화시키기 위해 상기 기관 체액의 시료를 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 유핵 세포를 분리하고 결과적으로 상기 기관 체액을 유핵 세포로 강화시키기 위해 상기 기관 체액의 시료를 처리하는 단계는 상기 기관 체액의 시료를 밀도 구배로 원심분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강화 단계는 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 상기 세포 집단의 하기 중 하나 이상의 특징에 기반한 선택을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

a. 표면 항원 CD71의 발현,

b. 표면 항원 CD34의 발현,

c. 표면 항원 GPA의 발현,

d. 표면 항원 CD14의 발현 부재,

e. 표면 항원 CD15의 발현 부재,

f. 표면 항원 CD45의 발현 부재.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 강화 단계 후 및 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 단계 전에 상기 기관 체액의 시료를 희석하는 단계를 포함하고, 상기 희석은 상기 강화 단계 직후에 상기 기관 체액의 시료로부터 분리된, 상기 시료의 미리 정해진(pre-established) 부피 중에 존재하는 유핵 세포의 수의 계수(count)에 기반하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 강화 및 유전적 분석의 수행 단계 중 하나 이상 또는 두 단계 모두는 상기 분리 단계를 수행하기 위해 이용된 상기 미세유동 장치 내에서 상기 분리 단계와 조합되어 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 상호 간에 분리되고 수압으로(hydraulically) 연결되고, 단일 칩 또는 복수 개의 별개의 칩에 의해 하나 이상의 면(face) 상에 한정된 복수 개의 상이한 챔버가 제공된 미세유동 장치가 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 태아 세포를 모체 세포로부터 구별하기에 적합한 태아 세포에 대한 특이적 항체로 태아 세포를 표지화하며, 바람직하게는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 특이적 항원에 대한 다양한 항체를 이용하는 것에 의해 수행되는 것인 단계를 포함하는 단계를 특징으로 하는 방법:

- HLA-G와 같은 태아 영양막 세포 항원을 인식하는 항체,

- i 항원과 같은 태아 표면 항원을 인식하는 항체,

- 헤모글로빈 사슬 γ 및 ε과 같은 태아 세포내 항원을 인식하는 항체.
제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 태아 세포를 분리하는 단계는 상기 미세유동 장치에 존재하는, 미리 상기 하나 이상의 마커로 표지된 단일 세포를 개별적으로 선택하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 마커는 형광 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 하나 이상의 마커는 상기 태아 세포에 대한 하나 이상의 특이적 항체와 접합된 형광 비드(fluorescent bead)인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 태아 세포를 분리하는 단계에서 제1 마커 및 제2 마커 모두의 존재를 보이는 단일 세포만을 선택하기 위해, 상기 혈액 시료의 유핵 세포를 세포 핵에 대해 특이적인 제1 마커로 표지화하는 단계, 및 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 상기 하나 이상의 세포 집단을 상기 제1 마커와 구별가능한, 제2 마커로 표지하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 제1 마커 및 제2 마커는 각각 상호 간에 상이한, 제1 파장 및 제2 파장, 바람직하게는 각각 청색 파장 및 녹색 파장에서 방사(emission)를 갖는 형광 마커인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 태아 세포를 분리하는 단계에서 단일 세포를 개별적으로 선택하는 단계는 상기 제1 파장 및 제2 파장 모두에서 방사하나, 동시에 제3 파장에서는 방사하지 않는 세포만을 선택하기 위해, 상기 기관 체액의 시료 중의 상기 세포에 의한 자가형광(autofluorescence)에 의해 생성될 수 있는, 제3 파장, 바람직하게는 적색 파장의 방사를 검출하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은, 상기 세포의 표지화(marking) 후에, 세포질내 항체에 의해 태아 세포의 확인을 위한 고정(fixing) 및 투과화(permeabilisation) 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전적 분석 단계는 QF-PCR에 의해 수행되고, 상기 하나 이상의 태아 유핵 세포에 담긴 유전적 정보와 하나 이상의 모체 유핵 세포에 담긴 유전적 정보 간의 비교를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 집단으로 상기 기관 체액의 시료를 강화시키는 단계는 상기 한 종류 이상의 태아 유핵 세포를 포함하는 하나 이상의 세포 집단으로 강화된 기관 체액의 시료를 배양시키는 단계 및 뒤이어 상기 시료에 대해 강화 단계를 반복하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기관 체액의 시료는 자궁세포, 경자궁경관(transcervical) 세포 또는 자궁경관내(endocervical) 세포 또는 말초 모체 혈액으로 구성된 군으로부터 선택된 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 세포의 선택을 위한 미세유동 장치는 일회용 장치인 것을 특징으로 하는 방법.