CN111247427B

CN111247427B - 细胞分类芯片

Info

Publication number: CN111247427B
Application number: CN201880067937.7A
Authority: CN
Inventors: 久保知大; 绫野圆
Original assignee: TL Genomics Inc
Current assignee: TL Genomics Inc
Priority date: 2017-10-19
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2038-10-17
Also published as: KR102313468B1; CN111247427A; EP3699587B1; WO2019078277A1; US20200306756A1; US11666915B2; CA3076601C; SG11202002907RA; CA3076601A1; JP6582272B2; EP3699587A4; KR20200070315A; EP3699587A1; JPWO2019078277A1

Abstract

芯片(20)配备有用于对血液样品中的细胞进行水力学分类的微通道单元。在微通道单元中，从副通道流入主通道的液体将在主通道中流动的细胞挤压向排除通道和回收通道一侧。含有被挤压的细胞中的无核红细胞的流体进入排除通道，从而从血液样品中除去无核红细胞。具有相同图案的微通道单元在高度方向上彼此重复堆叠。在各自的微通道单元中，主通道入口(51)、副通道入口(61)、排除通道出口(54a)、回收通道出口(54d)和主通道出口(55)，分别连接到的柱通道(22、23、24a、24d和25)，该柱通道以贯穿方式穿透相应层(L01至L10)，使得它们通过相应柱通道(22、23、24a、24d和25)合并在一起。

Description

细胞分类芯片

技术领域

本发明涉及一种用于浓缩血液样品中稀少目的细胞的细胞分类芯片。

背景技术

为了解释根据背景技术的用于浓缩血液样品中的稀少目的细胞并将其从血液样品中分离的方法，描述了无创性产前遗传测试(NIPT)作为这种方法的实例。NIPT是测试胎儿染色体的方法之一。该检查方法的特征在于，其不涉及羊膜穿刺术。由于NIPT对母亲和胎儿产生的负担与涉及羊膜穿刺术的方法相比更小，NIPT已经迅速地普及世界。

作为NIPT的一个方面，用于诊断胎儿染色体的技术正在开发之中。因此，已经尝试通过使用微通道芯片从母体血液中分离衍生自胎儿的有核红细胞(NRBC)(下文中也简称为NRBC)，以便获得染色体。NRBC是一类稀少的目的细胞。

专利文献1公开了使用微通道芯片的浓缩方法。在该方法中，使血液通过宽度为1μm的狭缝，使红细胞(RBC)和白细胞(WBC)通过狭缝。NRBC滞留在狭缝之前。从芯片中除去滞留的NRBC。

专利文献2公开了一种方法，其中在通过使用配备有用于基于颗粒的水力学尺寸确定地引导颗粒的通道的装置来浓缩NRBC之后，改变它们的磁性，并且通过向其施加磁场来分离它们，使得NRBC被进一步浓缩(第[0083]和[0202]段)。注意，术语"水力学尺寸"是指当颗粒与流、阻挡结构(例如柱)或其他颗粒相互作用时的颗粒的有效尺寸(段落[0041])。

另外，在专利文献2中，对于其中NRBC经浓缩的血细胞群，通过荧光原位杂交(FISH)法观察其细胞核，从而鉴定NRBC。

引用列表

专利文献

专利文献1：日本专利第5311356号

专利文献2：日本未审查专利申请公开第2009-511001号

专利文献3：日本未审查专利申请公开第2005-205387号

专利文献4：日本未审查专利申请公开第2007-175684号

专利文献5：日本专利第4091123号

专利文献6：PCT国际专利申请公开第2007-530629号的公开的日文译文

专利文献7：日本专利第5857537号

专利文献8：日本专利第5308834号

非专利文献

非专利文献1：Taizan KAMIDE,Nagayoshi UMEHARA,Haruhiko SAGO,"New TrialsFor Efficient Erythroblast Isolation From Maternal Blood",Sei-i-Kai,TokyoJikeikai Medical Journal,2015,130(1):11-17。

发明内容

技术问题

在专利文献1中，芯片能够处理的样品液的体积不大于“μl”量级。因此，认为在使用芯片的浓缩处理之前，应该优选进行利用密度梯度离心法等的分离处理(同一文献，第[0040]段)。认为专利文献1中公开的芯片不适合处理含有大量WBC和无核RBC的全血。

在专利文献2中，通过使用装置基于水力学尺寸来浓缩NRBC。基于水力学尺寸的浓缩可以应用于全血。然而，它需要利用磁性进一步浓缩。

当进行产前诊断时，显而易见地，可以从对象收集到的母体血液样品的量是有限的。此外，产科上显而易见的是，每个孕妇，即产前诊断的每个对象仅具有有限的可进行诊断的时期。此外，血液中衍生自胎儿的NRBC的数量极其少。通过使用常规浓缩方法不能充分浓缩这些稀少细胞。这个问题不限于NIPT，当需要浓缩全血中的稀少目的细胞时，也会发生类似的问题。在NIPT中衍生自胎儿的NRBC的浓缩是其典型实例。

本发明的目的在于提供一种提高通过使用用于细胞分级的微通道芯片来浓缩全血中的稀少目的细胞的技术的效率的手段。

问题的解决方案

<1>

一种包含用于对血液样品中的细胞进行水力学分级的微通道单元的芯片，其中

微通道单元包含图案，在所述图案中，血液样品流经的主通道、与主通道的一侧连接的副通道、在副通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的排除通道、和在排除通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的回收通道是二维地展开的，

从副通道流入主通道的液体将在主通道中流动的细胞推向其上设置有排除通道和回收通道的主通道一侧，

含有被推动的细胞中的无核RBC的流体进入排除通道，从而从血液样品中除去无核RBC，

含有已经除去无核RBC的剩余细胞中的目的细胞的流体进入回收通道，从而从血液样品中获得目的细胞，

在每个回收通道中，每单位时间流过主通道和该回收通道之间的连接部分的横截面的体积大于在每个排除通道中，每单位时间流过主通道和该排除通道之间的连接部分的横截面的体积，

在高度方向上重复堆叠彼此具有相同图案的多个微通道单元，和

设置在微通道单元中的主通道的入口、副通道的入口、排除通道的出口、回收通道的出口和主通道的出口连接到以横穿方式穿透每层的相应柱通道，使得它们通过相应柱通道各自合并在一起。

<2>

根据条款<1>所述的芯片，其中在每个层中设置一个微通道单元。

<3>

根据条款<2>所述的芯片，其中，在芯片的平面视图中，所有层的微通道单元的图案的取向和位置彼此对齐。

<4>

根据条款<3>所述的芯片，其中

分别连接到主通道和副通道的入口的柱通道在芯片的顶表面上具有开口，且

分别连接到排除通道和回收通道的出口的柱通道在芯片的底表面上具有开口，

从而使血液样品从芯片的顶表面穿过芯片到其底表面。

<5>

根据条款<4>所述的芯片，其中设置有微通道单元的层以规则的间隔连续地堆叠。

<6>

根据条款<1>所述的芯片，其中

在主通道和排除通道之间的连接部分处的排除通道的内径是4μm至19μm，且

在主通道和回收通道之间的连接部分处的回收通道的内径是20μm至30μm。

<7>

根据条款<1>所述的芯片，其中，在微通道单元中，回收通道和排除通道中的至少一个的横截面面积沿其下游变大。

<8>

根据条款<4>所述的芯片用于通过对血液样品进行分级而获得其中目的细胞在细胞数方面被浓缩的级分的用途，其中

血液样品是未处理的全血本身，或是其中与全血相比，目的细胞在细胞数方面未浓缩的血液样品。

<9>

根据条款<8>所述的用途，其中血液样品流至与主通道连接的柱通道的流入量为8μl/min至25μl/min。

<10>

根据条款<9>所述的用途，其中每单位时间流入与副通道连接的柱通道的液体体积是每单位时间流入与主通道连接的柱通道的血液样品体积的1倍至2倍。

<11>

根据条款<8>所述的用途，其中，在将血液样品注入芯片中的同时，搅拌在注入芯片中之前保有的血液样品，并将经搅拌的血液样品连续地注入芯片中。

<12>

根据条款<8>所述的用途，其中

血液样品是母体血液的全血或通过简单稀释全血而获得的血液样品，且

目的细胞是衍生自胎儿的NRBC。

<13>

一种方法，其包括：

基于根据条款<12>所述的芯片的用途，获得其中NRBC经浓缩的级分A：

通过特异性标记级分A中的WBC和核酸并通过细胞分选来分选出级分A中的经标记的血细胞，而获得级分B，其中将标记有对WBC具有特异性的标记物的血细胞从级分B中除去，并使标记有对核酸具有特异性的标记物的血细胞在级分B中浓缩；和

通过分析级分B中血细胞所含的染色体，获得无创性产前遗传测试中的诊断用数据。

<14>

根据条款<13>所述的方法，其中染色体的分析是根据荧光原位杂交法、下一代测序法或微阵列法的分析。

本发明的有益效果

根据本发明，可以提供一种提高通过使用用于细胞分级的微通道芯片来浓缩全血中的稀少目的细胞的技术的效率的方法。

附图说明

图1是血细胞分离芯片的平面图；

图2是血细胞分离芯片的示意图；

图3是细胞分选仪的示意图；

图4是显示密度梯度离心的结果的示意图；

图5显示出Hoechst33342的荧光强度分布；

图6显示出母体血液中免疫标记的荧光强度分布；

图7显示出免疫标记在普通血液中的荧光强度分布；

图8是扩增的SRY基因序列的DNA电泳图像；

图9是血细胞的染色图像；

图10是扩增的SRY基因序列的DNA电泳图像；

图11是血细胞分离芯片的平面图；

图12是多层血细胞分离芯片的透视图；

图13显示出Fr2的免疫标记的荧光强度分布；

图14显示出Fr2的免疫标记的荧光强度分布；

图15是扩增的SRY基因序列的DNA电泳图像；和

图16是血细胞分离芯片的透视图。

具体实施方案

在该实施方案中，特别地从其用途的角度描述了包括用于对血液样品中的细胞进行水力学分级的微通道单元的芯片的细节。具体而言，以使用这样的芯片浓缩血液样品中的目的细胞的方法为例进行说明。目的细胞是待浓缩的细胞株。在本说明书中，术语"浓缩"是指在细胞数方面增加细胞的频率。在该实施方案中，作为目的细胞的实例，将NRBC，即所谓的成红细胞浓缩。注意，血液样品可以是未处理的全血本身。血液样品可以是与全血相比NRBC在细胞数方面未浓缩的样品，即可以是所谓的未过滤/未浓缩样品。血液样品至少含有无核RBC，即成熟的RBC和目的细胞。

[采血]

在该实施方案中，起始材料是人类孕妇的母体血液样品。对于孕妇，月经后胎龄优选10周至33周。月经后胎龄由将最后月经期的第一天定义为第一天的满日数或满周数表示。月经后胎龄可通过受精后胎龄加两周来计算。血液样品的实例包括母体血液或通过稀释母体血液获得的血液样品。本实施方案的芯片及其用途可以适用于母体血液以外的物质。在以下对实施方案的描述中，母体血液可以被其他血液样品代替，并且可以对其技术内容进行相应地解释。

母体血液样品可以是未经处理的母体血液本身。母体血液样品可以是已经通过对原始母体血液执行某种类型的化学或物理处理而改变的母体血液，使得改变的母体血液变得适合于保存且适合于后续处理的效率化。这些方法包括，例如，加入防腐剂如细胞凋亡抑制剂、调节温度、加入试剂以防止血细胞沉淀、以及通过使用气垫保护血细胞免受由振荡引起的物理损伤。然而，这些方法并不限于这些实例。

在该实施方案中，母体血液是指从孕妇收集的血液。母体血液可以通过普通医学方法从孕妇收集。可以立即浓缩收集的母体血液中的NRBC。此外，NRBC可以在母体血液从收集血液的地方运输到浓缩血液的地方之后被浓缩。可以对母体血液进行期望的防腐处理。

母体血液的必需量如下所述。通常，已知在10ml母体血液中含有约3×10¹⁰个血细胞。另外，已知在相同体积的母体血液中含有约36个至2168个NRBC(非专利文献1)。

考虑到上述NRBC的比例，用作起始材料的母体血液的量可以是0.01ml至100ml。母体血液的量可以是0.01ml、0.02ml、0.03ml、0.04ml、0.05ml、0.06ml、0.07ml、0.08ml、0.09ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml或90ml。

[衍生自胎儿的细胞]

在该实施方案中，目的是获得浓缩的衍生自胎儿的细胞。作为衍生自胎儿的细胞的实例，在下文中描述包含在母体血液中的NRBC。

在本实施方案中，血细胞是指血液中的细胞。血液含有血细胞和血浆。根据一种理论，认为RBC占人血细胞的大部分。另外，血细胞中也包括WBC和血小板。母体血液含有衍生自胎儿的NRBC。

在该实施方案中，NRBC是成红细胞，优选是失去其细胞***能力的成红细胞。RBC是在造血干细胞分化和成熟时产生的。通过分化和成熟过程，从造血干细胞开始，依次出现骨髓祖细胞、RBC/巨核细胞前体细胞、前期红细胞前体细胞(BFU-E)、后期红细胞前体细胞(CFU-E)、原红细胞、嗜碱性成红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞、网织红细胞和红细胞。

成红细胞包括原成红细胞、嗜碱性成红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞。核在晚幼红细胞分化为网织红细胞的过程中从血细胞中丢失。通常，晚幼红细胞已经丧失了它们的细胞***能力。

NRBC通常存在于骨髓中。然而，如上所述，在血液中发现非常少量的NRBC。此外，在母体血液中发现了非常少量的母体来源的NRBC和衍生自胎儿的NRBC。母体血液中衍生自胎儿的NRBC的数量通常小于母体来源的NRBC的数量。

[NRBC的浓缩]

通过根据该实施方案的方法浓缩衍生自胎儿的细胞。衍生自胎儿的细胞的浓缩是指获得其中衍生自胎儿的细胞在全血细胞群体中，优选在来自母体血液样品的RBC群体中浓缩的级分。此外，在该实施方案中，衍生自胎儿的细胞经浓缩的事实意味着级分中衍生自胎儿的细胞与全血细胞的比已经增加。优选地，这意味着NRBC与RBC的比已经增加。

通过使用微通道芯片获得其中衍生自胎儿的细胞经浓缩的级分。在下文中，微通道芯片也称为血细胞分离芯片。注意，使用该名称仅仅是为了方便。血细胞分离芯片也可以基于其三维结构分离血液中除血细胞以外的悬浮细胞。尽管可以适当选择芯片的材料，但优选硅酮例如PDMS。

血细胞分离芯片基于细胞的性质例如细胞的尺寸、可塑性和形状，对母体样品中的血细胞进行分级。血细胞分离芯片的微通道单元中形成的图案基于专利文献3和4中描述的水力学分级的理论。

图1显示出作为血细胞分离芯片的实例的血细胞分离芯片50的平面图。血细胞分离芯片50包括入口51、主通道52、副通道53、出口54a-54d和55。主通道52包括从入口51至出口55连续布置的通道56a至56d。通道56a至56d从入口51至出口55一个接一个地连接。

图1中所示的入口51连接到包含母体血液的注射器57。母体血液以预定的流量从注射器57送到入口51。母体血液通过入口51进入通道56a。

可以搅拌母体血液。例如，将搅拌器***到液体供给容器中，例如图1中所示的注射器57，并且通过施加外力使搅拌器物理地移动，从而可以使容纳在容器中的稀释血液一直保持在搅拌状态。这样，可以防止由于血细胞在容器中的沉降而导致的血细胞分布的不均匀，从而可以在长时间保持恒定的血液浓度的情况下供给液体。搅拌可以周期性地进行。搅拌可以连续进行。至少在将血液样品的一部分注入到芯片中时，对注入到芯片中之前所保有的血液样品的一部分进行搅拌。将搅拌的血液样品连续注入芯片中。

母体血液可以预先稀释。稀释率可以适当选择。然而，稀释率优选为2至500，优选为4至50，且优选为5至10。用磷酸盐缓冲盐水稀释母体血液。例如，可以在一次分级中处理5ml至15ml稀释的母体血液。

可以适当地选择稀释的母体血液的每单位时间的流量。但是，在每个微通道单元中每单位时间的流量优选为0.1μl/min至500μl/min，更优选为0.5μl/min至50μl/min，特别优选为1μl/min至25μl/min。该流量可以是2μl/min、3μl/min、4μl/min、5μl/min、6μl/min、7μl/min、8μl/min、9μl/min、10μl/min、11μl/min、12μl/min、13μl/min、14μl/min、15μl/min、16μl/min、17μl/min、18μl/min、19μl/min、20μl/min、21μl/min、22μl/min、23μl/min和24μl/min中的任何一个。该流量是流至主通道的血液样品流入量。

在稍后所述的使用包括多个微通道单元的血细胞分离芯片的情况下，能够根据微通道单元的数量适当地增加流量。但是，流量优选是将上述流量乘以血细胞分离芯片的数量而得到的流量。

图1所示的血细胞分离芯片50包含副通道53。副通道53连接到注射器58。注射器58包含PBS(磷酸盐缓冲盐水)。通过对注射器58施加压力，PBS通过副通道53流入通道56b。PBS仅仅是一个实例。也就是说，任何渗透压或pH不太可能破坏血液样品中细胞的液体都可以用作PBS的替代物。

副通道53的流量优选为流至主通道的每单位时间的血液样品流量的1倍至10倍，更优选1倍至5倍，特别优选1倍至2倍。副通道53中的流量是流至副通道53的液体流入量，所述液体例如该实例中的PBS。

图1所示的分支通道59a至59d是从主通道52分支的通道。在通道56c中，分支通道59a、59b、59c和59d从上游的一侧依次从主通道52一个接一个地分支出来。分支通道59a至59d位于与副通道53所在侧相对的主通道52一侧。

图1中所示的每个分支通道59a至59d包括从主通道52分支出的多个窄通道。这些窄通道组从主通道52的上游至下游布置。分支通道59a至59d分别延伸到出口54a至54d。分支通道59a至59d中的每一个的窄通道分别在紧邻出口54a至54d之前汇合在一起。通道56d延伸到出口55。

图2示意性地显示了通过使用血细胞分离芯片50分级血细胞的过程。如图1所示，分支通道59a至59d中的每一个包括多个窄通道。在图2中，为了简化说明，对于分支通道59a至59d中的每一个，仅示出一个窄通道。

母体血液从图2所示的主通道52的上游的一侧流入。母体血液含有大量的血细胞。血细胞到达通道56b。同时，从副通道53流出的PBS从主通道52的一侧推动血细胞流动通过主通道52。在通道56b、56c中，血细胞被推向分支通道59a至59d侧。在副通道中流动的液体通过挤压来约束母体血液。

在图2所示的通道56a中，分支通道59a至59d布置在与其上设置副通道53的一侧相对的主通道52一侧上。分支通道59a至59d的窄通道的内径根据它们在布置中的位置而增加。注意，窄通道的内径是窄通道的正交截面上的内切圆的直径。例如，分支通道59a至59d的窄通道的内径可以分别是8μm、12μm、15μm和25μm。窄通道的横截面可以是方形的、其他多边形的或圆形的。然而，横截面优选是方形的。

在图1和图2所示的血细胞分离芯片50中，设置有四个分支通道。图1中所示的分支通道59a至59d对应于这些分支通道。

对分支通道的数量没有特别限制，只要该数量不少于两个。例如，可以提供至少两个分支通道。这两个分支通道分为由设置在上游的一侧的窄通道形成的分支通道和由设置在下游的一侧的窄通道形成的分支通道。上游的一侧的窄通道的内径可以是4μm至19μm，优选是12μm至19μm。上游的一侧的窄通道的内径可以是13μm、14μm、15μm、16μm、17μm和18μm中的任何一个。但是，内径优选为14μm、15μm和16μm中的任何一个，更优选为15μm。内径是主通道52与窄通道之间的连接部分处的内径。窄通道的横截面面积可以沿其下游变大。此外，窄通道的最下游可具有最大的横截面积。图11中的分支通道59a对应于由上游的一侧的窄通道形成的分支通道。上游的一侧的窄通道可以被认为是用于无核RBC的排除通道。在由副通道推动的血细胞中，无核RBC进入排除通道，从而将这些无核RBC从血液样品中除去。

同时，设置在下游的一侧的窄通道的内径可以是20μm至30μm。设置在下游的一侧的窄通道的内径可以是21μm、22μm、23μm、24μm、25μm、26μm、27μm、28μm、29μm和29μm中的任何一个。但是，内径优选为23μm、24μm、25μm、26μm和27μm中的任何一个，更优选为24μm、25μm和26μm中的任何一个，特别优选为25μm。内径是主通道52与窄通道之间的连接部分处的内径。窄通道的横截面面积可以沿其下游变大。此外，窄通道的最下游可具有最大的横截面积。图11中的分支通道59d对应于由下游的一侧上的窄通道形成的分支通道。下游的一侧的窄通道可以被认为是用于NRBC的回收通道。在已经除去无核RBC的剩余血细胞中，NRBC进入回收通道，从而这些NRBC作为血液样品的级分而被获得。

被副通道53推压的血细胞流入图2中所示的分支通道59a至59d。流入各分支通道的血细胞的直径略小于该分支通道的窄通道的内径。在图中，颗粒39显示为略小于分支通道59a的窄通道的内径的血细胞。颗粒39到达至出口54a。在图中，无核RBC 42显示为略小于分支通道59b和59c的窄通道的内径的血细胞。无核RBC 42到达至出口54b和54c。

考虑到NRBC的直径为11μm至13μm。在图中，NRBC 41显示为略小于分支通道59d的窄通道的内径的血细胞。此外，示出了WBC 43。NRBC 41和WBC 43到达至出口54d。

未进入图2所示的分支通道59a至59d的血细胞与血浆一起作为流路(FT)通过通道56d，到达图15所示的出口55。例如，聚集的血细胞等包含在流路中。在出口54a至54d和出口55中的每一个中设置用于接收流体的贮存器。

如图2所示，将级分Fr1至Fr4分别分选到与出口54a至54d连接的各个贮存器中。流路作为Fr5级分被分选出进入与图1所示出口55连接的贮存器中。

本实施方案的血细胞分离芯片可以包括多个微通道单元。每个微通道单元具有图案。如图2所示，主通道52、副通道53、排除通道59a至59c和回收通道59d在该图案中二维地展开。

图12所示的芯片20是具有十个层(即层L01至L10)的多层芯片。每层都包括微通道单元。芯片20的最上层是作为最上层的层L01的盖。层L01至L10以规则间隔连续堆叠。在附图中，层L01至L03之间的间隙较大。然而，这仅仅是在附图中且为了使得易于在视觉上理解微通道单元的图案的形状。同样的情况适用于层L09和L10之间的间隙。芯片20的层的数量仅仅作为实例。芯片20中的层通道的数量为2至200，优选为5至50，更优选为5至20，特别优选为8至10，其中每个层都包含微通道单元。层的数量可以为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的任一个。

在各层的微通道单元中设置的主通道的入口、副通道的入口、排除通道的出口、回收通道的出口和主通道的出口可以在该层中单独连接。如图12所示，这些入口和出口可以连接到以横穿方式穿透每层的相应柱通道，使得它们各自合并在一起。柱通道可以穿透所有层。

在图12中，每个柱通道22和23在芯片的顶表面中具有开口。柱通道22连接到主通道的入口51。柱通道23连接到副通道的入口61。此外，柱通道24a、24d和25中的每一个在芯片的底表面中具有开口。柱通道24a连接到排除通道的出口54a。柱通道24d连接到回收通道的出口54d。柱通道25连接到回收通道的出口55。血液样品从芯片20的顶表面穿过芯片20到达其底表面。

如图12所示，设置在各层中的微通道单元在垂直方向上彼此叠置，从而形成微通道堆叠体。此外，当设置在各层的微通道单元中的主通道的入口、副通道的入口、排除通道的出口、回收通道的出口和主通道的出口连接到以横穿方式穿透每层的各个柱通道，使得它们各自合并在一起时，底层中的主通道的入口是关闭的，或者主通道的出口之一可以是关闭的。最上层或最下层中的主通道的出口可以是关闭的。

血细胞分离芯片可以在一层中包含多个微通道单元。在这种情况下，在层中设置的微通道单元的数量可以是1至200，优选5至50，并且更优选10至20。

对于每个微通道单元，设置在每层中的微通道单元中的主通道的入口、副通道的入口和主通道的出口可以单独连接。或者，多个微通道单元的入口和出口可以以集合方式连接。所有层的微通道单元的图案的取向和位置优选在芯片的平面视图中彼此对齐。

当设置在所有层中的主通道的入口连接到一个柱通道时，可以适当地选择血液样品的每单位时间的流量。该流量优选为0.8μl/min至500μl/min，更优选为4μl/min至200μl/min，特别优选为8μl/min至25μl/min。该流量可以为1μl/min、2μl/min、3μl/min、4μl/min、5μl/min、6μl/min、7μl/min、8μl/min、9μl/min、10μl/min、11μl/min、12μl/min、13μl/min、14μl/min、15μl/min、16μl/min、17μl/min、18μl/min、19μl/min、20μl/min、21μl/min、22μl/min、23μl/min和24μl/min中的任何一个。该流量是流入柱通道的血液样品流入量。

此外，当设置在所有层中的副通道的入口连接到一个柱通道时，可以如下调节供给到副通道的柱通道的液体的每单位时间的流量。流量优选为供给到主通道的血液样品的每单位时间的流量的1倍至10倍，更优选为其1倍至5倍，特别优选为其1倍至2倍。流量可以是1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍和1.9倍中的任何一个。液体可以是PBS。

与使用密度的方法相比，根据该实施方案的浓缩方法具有优点。优点之一是，虽然采血后经过的时间对血细胞密度的影响大，但其对血细胞尺寸的影响小。这意味着即使当采血位置远离分级血细胞的位置时，也可以容易地实施根据该实施方案的方法。另一个优点是，通过简单的操作，例如通过上述血细胞分离芯片的操作，可以进行基于尺寸的分级。

[级分A的荧光标记]

级分中的NRBC(以下也称为级分A)也可以通过细胞分选进一步浓缩，在该级分中NRBC已通过使用根据本实施方案的血细胞分离芯片进行了浓缩。

在级分A中，至少WBC和核酸被特异性标记。RBC可以被特异性标记。标记(或标识)可以是磁性标记或荧光标记，尽管荧光标记是优选的。标记可以是直接标记或间接标记。间接标记可以是通过标签和二抗进行的标记，或者可以是通过生物素-亲和素结合进行的标记。

对WBC具有特异性的标记可以是免疫标记。这种标记可以是针对特异于WBC的抗原如CD45进行的标记。抗原可以是糖链抗原。

对RBC具有特异性的标记可以是对RBC表面具有特异性的标记。对RBC具有特异性的标记可以是免疫标记。免疫标记可以是由抗体进行的标记。免疫标记的靶抗原可以是糖链抗原。标记可以是通过针对特异于RBC的抗原如CD71和CD235A(GPA，血型糖蛋白A)的抗体进行的标记。

对RBC具有特异性的免疫标记可以是对未成熟的RBC具有特异性的标记。其可以是免疫标记，该免疫标记的靶抗原是特异于未成熟的RBC的肽链，例如血红蛋白的胚胎ε珠蛋白链。在专利文献5中提到了用于免疫标记的此类抗体。

通过对核酸具有特异性的标记物对NRBC中所含的细胞核进行特异性标记。对核酸具有特异性的标记可以是染料标记。待标记的核酸优选是DNA。染料可以是荧光染料。细胞核可以被荧光染料荧光标记。荧光染料可以是Hoechst33342。

此外，可以使用与胎儿NRBC上存在的表面抗原反应但不与母体RBC上存在的表面抗原反应的抗体。抗体可以是单克隆抗体。例如，其可以是专利文献6中记载的抗体4B9。上述抗体可以与上述对RBC具有特异性的免疫标记或对核酸具有特异性的标记一起使用。通过使用这种抗体，可以进行对NRBC具有特异性的标记而不依赖于对核酸具有特异性的标记。

注意，在进行上述标记过程之一之前，可以对级分A中的血细胞进行组织学交联固定。或者，可以在进行上述任何标记过程之前对级分A中的血细胞进行交联固定。另外，在该状态下，也可以进行之后描述的通过细胞分选进行的分级。通过交联/固定血细胞可以防止血细胞聚集。因此，可以准确地进行通过细胞分选而进行的分选。

可以在不对级分A中的血细胞进行组织学交联/固定的情况下进行下述分级，即通过细胞分选进行的分级。

例如，可以同时进行对核酸具有特异性的标记和对RBC具有特异性的标记，而不进行血细胞的交联/固定。此外，在进行这些标记过程之后，血细胞可以被交联/固定。此外，可以对交联/固定的血细胞进行对WBC具有特异性的免疫标记。

[通过细胞分选进一步浓缩NRBC]

可通过细胞分选法分选出级分A中的经标记血细胞而进一步浓缩NRBC。在细胞分选中，例如，使用用于分选出细胞的装置(例如，细胞分选仪)。在标记是荧光标记的情况下，通过细胞分选进行的分选方法可以是荧光激活细胞分选(FCM)法。通过细胞分选进行的分选方法可以是通过使用磁性标记进行的细胞分选方法。在本实施方案中，对细胞分选的原理和细胞分选仪的类型没有特别限制。

在一个方面，FCM通过配备有分选装置的细胞分析仪，例如通过细胞分选仪进行。在一个方面，细胞分选仪使连续流动的流体携带细胞，并且基于通过用激发光照射细胞而产生的细胞的荧光来鉴定单个细胞的特征。这种鉴定也是细胞分析仪的功能。基于通过鉴定获得的信息，细胞分选仪进一步将细胞限制在液滴中并且收集含有特定细胞的液滴。通过这样做，细胞分选仪分选出特定细胞

在一个方面，细胞分选仪使连续流动的流体携带细胞，并且基于通过用激发光照射细胞而产生的细胞的荧光来鉴定单个细胞的特征。根据通过该鉴定而得到的信息，在细胞被连续流动的流体连续地输送的状态下，细胞分选仪分选出含有特定细胞的级分。

作为不使用液滴的上述细胞分选仪，如后述的图3所示并且如专利文献7所公开的那样，已知有使用脉冲流进行分选的细胞分选仪。另外，如专利文献8所公开的那样，已知有利用流体的溶胶-凝胶转变进行分选的细胞分选仪。

在不使用液滴的上述细胞分选仪的情况下，由于可以在保持细胞由流体携带的同时将细胞引导到分选容器中，因此细胞不太可能被损坏。此外，在将细胞引导至容器的过程中，通过将流体限制在通道芯片中，容易防止由于流体的飞溅而污染设备和环境。

在细胞分选中，优选地，分选出血细胞以获得已经用对RBC具有特异性的标记物标记的血细胞。由于NRBC是RBC，因此可以通过对RBC具有特异性的标记将NRBC与包含WBC的其他血细胞区分开。可以从级分A中除去通过对WBC具有特异性的标记物标记的WBC。

在细胞分选中，优选地，分选出血细胞以获得已经用对有核血细胞具有特异性的标记物标记的血细胞。由于NRBC具有细胞核，因此可以通过对核酸具有特异性的标记NRBC与包含无核RBC的其他血细胞区分开。

在细胞分选中，通过组合上述标记方法获得NRBC纯度增加的级分。通过对RBC具有特异性的标记进行的分选和通过对核酸具有特异性的标记进行的分选可以同时进行。或者，一个分选工序可以在另一个分选之前执行。例如，通过首先用对RBC具有特异性的磁性标记进行分选，然后用对核酸具有特异性的荧光标记进行分选，可以获得级分B。

[附加的细胞选择]

当级分A中的血细胞被荧光标记时，优选使用FACS(商标)作为细胞分选。此外，由于荧光标记即使在细胞分选过程之后仍保留，因此可有效使用该荧光标记。

例如，通过另外使用荧光用于通过细胞分选获得的第一级分，可以进一步分选细胞。例如，第二级分和随后的级分可以通过对获得的第一级分进一步重复通过细胞分选进行的分选而获得。以此方式，最终可以获得上述级分B。

[诊断用数据的提供]

通过本实施方案的方法，能够在短时间内从血液样品中高效地浓缩NRBC。特别是，当将母体血液用作血液样品时，可以在短时间内浓缩衍生自胎儿的NRBC。可以通过荧光原位杂交(FISH)法、下一代测序(NGS)法和微阵列法之一对衍生自胎儿的NRBC的核基因组进行分析。通过分析，可以获得染色体数量、染色体结构和核基因组DNA碱基序列的数据。这些数据可用于胎儿染色体疾病的测试或诊断。这种检测是无创性产前遗传测试。

在原位杂交法中，使用以荧光物质或酶标记的寡核苷酸探针。通过将寡核苷酸探针与目的基因杂交，然后检测该探针来分析目的基因的表达。在这些方法中，探针用荧光物质标记的方法被称为荧光原位杂交法。诊断用数据可通过荧光原位杂交法获得。诊断用数据可用于确定存在/不存在染色体数量异常或由染色体小片段缺失引起的病症，例如唐氏综合征、爱德华综合征和22q11.2缺失综合征。

诊断用数据可以通过原位杂交法分析浓缩的NRBC而获得。例如，通过使用基于对染色体21具有特异性的DNA序列的荧光探针进行FISH，可以获得用于诊断唐氏综合征的数据。

下一代测序法是高速读取DNA的碱基序列的方法。诊断用数据可通过NGS读取浓缩的衍生自胎儿的NRBC中所含的核基因组DNA的碱基序列来获得。诊断用数据可用于确定存在/不存在染色体数量异常或由染色体小片段缺失引起的病症，例如唐氏综合征、爱德华综合征和22q11.2缺失综合征。

诊断用数据可通过用微阵列法分析衍生自胎儿的NRBC的核基因组DNA而获得。微阵列法是通过使预先进行了例如荧光标记的各基因组DNA或其扩增DNA杂交，对基板上的微小斑点进行的。在该斑点上预先吸附了具有基因序列的合成DNA。诊断用数据可用于确定存在/不存在染色体数量异常或由染色体小片段缺失引起的病症例如唐氏综合征、爱德华综合征和22q11.2缺失综合征。

衍生自胎儿的NRBC的一半染色体与母体的相同。因此，母体染色体序列的背景信号对通过FISH、NGS和微阵列法进行的分析有很大影响。同时，母体血液中所含NRBC的数量非常少。同时，根据该实施方案的方法可以有效地浓缩NRBC。因此，根据该实施方案的方法适于制备用于这些分析手段的衍生自胎儿的NRBC。

[实施例]

以下，通过示出实施例，对本实施方案进行更详细的说明。这些实施例不是为了限制本发明。

[参考例1]

<采血>

在该参考例和后述的实施例中，母体血液和普通血液是通过合法的操作得到的。母体血液由怀孕第33周的孕妇提供以用于测试和研究。胎儿的性别是男性。在该实施例中使用的普通血液由没有怀孕的人提供以用于测试和研究。在医疗机构(设施)中收集母体血液和普通血液。这些血液样品在适当的管理下运输到发明人等的实验室。

在本实施例中，使用20ml母体血液作为起始材料，并且在收集血液两小时后开始其过程。

根据全自动细胞计数器TC20(BIORAD)的测量，每10ml母体血液中含有3.16×10¹⁰个血细胞。用相同体积的PBS(磷酸盐缓冲盐水)稀释母体血液。

<NRBC的浓缩>

通过密度梯度离心法浓缩母体血液中的NRBC。注意，浓缩是指除去NRBC以外的血细胞。在浓缩过程中从母体血液中除去的血细胞优选是无核RBC。更优选地，在浓缩期间还从母体血液中除去血小板。

通过密度梯度分层离心法获得其中NRBC经浓缩的级分A。浓缩后，级分A中NRBC与所有血细胞的比高于母体血液样品中NRBC与所有血细胞的比。

通过密度梯度分层离心法的分级如下进行。通过使用percoll和盐水制备密度为1.085g/ml和1.075g/ml的等渗溶液。在离心管中将它们一个接一个地叠层后，将10ml母体血液进一步分层。将离心管在20℃下以1750G离心30分钟。

图4是表示密度梯度分层离心的结果的示意图。从离心管46的顶部开始，一个接一个地形成层45a至45f。血浆浓缩在层45a中。WBC43浓缩在层45b中。推测层45a和45b的密度小于1.075g/ml。层45c是具有1.075g/ml密度的等渗溶液的层。

NRBC 41浓缩于图4所示的层45d中。推测层45d的密度大于1.075g/ml且小于1.085g/ml。通过从层45d中分选出血细胞并洗涤血细胞，而获得含有NRBC的级分。该级分被称为样品1。通过使用全自动细胞计数器TC20测定样品1中的血细胞数量。血细胞数量为约9.95×10⁶。

图4中所示的层45e是具有1.085g/ml的密度的等渗溶液的层。无核RBC42浓缩在层45f中。推测层45f的密度大于1.085g/ml。

将样品1的一半用作级分A，并进行以下荧光标记步骤。

<荧光标记>

将级分A中的血细胞同时用Hoechst33342(Sigma-Aldrich制造)、抗CD45-PE标记的抗体(Miltenyi-Biotec制造，克隆名：5B1)和抗CD235a-FITC标记的抗体(Miltenyi-Biotec，克隆名：REA175)染色。在染色过程中不进行血细胞的交联/固定。染色在4℃进行10分钟。染色后，通过在4℃下用300G离心血细胞的悬浮液10分钟来收集经标记的血细胞。

关于抗体的稀释，抗CD45-PE标记的抗体和缓冲溶液之间的体积比(即稀释比)是1:10。另外，抗CD235a-FITC标记的抗体与缓冲液的体积比(即稀释比)为1:1099。

通过细胞分选对级分A进一步分级。对于细胞分选仪，使用了图4的示意图中所示的细胞分选仪。该细胞分选仪用于检测血细胞的荧光。

首先，在图4所示的主通道47中，产生含有荧光标记级分A的稳定液流。对液流中的血细胞48a施加激发光，根据荧光检测标记的信号的存在或不存在。副通道49与主通道47相交。血细胞48a向主通道47和副通道49的交叉部流动。

图4所示的血细胞48b是被检测了信号的血细胞。该血细胞流过主通道47并进入交叉部。在副通道49中，能够在与液流交叉的方向上产生脉冲流。基于上述信号，以血细胞48b为其靶标产生脉冲流。

通过使图4所示的血细胞48b由脉冲流携带通过副通道49，将血细胞48b与通过主通道47的液流分离。连续收集分离的血细胞48b。以此方式，生成由收集的血细胞48b构成的级分B。

在图4中，对于没有检测到信号或信号弱的血细胞48c，不产生脉冲流。血细胞48c被液流连续地携带并且流过主通道47。

上述细胞分选仪的细节描述于专利文献7中。此外，在该实施例中，使用可从On-chip Biotechnologies Co.,Ltd.获得的细胞分选仪(细胞分选仪型号：On-chip-SortMS6)。在该参考例中，用于细胞分选的细胞分选仪的运行条件如下。

<细胞分选分析>

图5显示Hoechst33342的荧光强度分布。纵轴表示血细胞出现的频率。横轴表示Hoechst的荧光信号强度。存在两个峰值。观察到最低频率出现在强度40至50。基于该范围确定边界值，推测信号强度高于该边界值的血细胞是有核血细胞。此外，推测信号强度低于该边界值的血细胞是无核血细胞。

图6显示了母体血液中免疫标记的荧光强度分布。图7显示在普通血液中免疫标记的荧光强度分布。纵轴表示与抗CD235a抗体结合的FITC(异硫氰酸荧光素)的发光信号强度。横轴表示与抗CD45抗体结合的PE(藻红蛋白)的发光信号强度。

图6和图7中的Ar1表示CD235a-FITC的信号强的细胞的组。Ar2表示用CD45标记的WBC的组。

基于母体血液的结果和普通血液的结果之间的比较，发现母体血液中属于组Ar1的血细胞数量大于普通血液中的血细胞数量。

在图6中，选择组Ar1中FITC(异硫氰酸荧光素)的发光信号强度高于1×10³的细胞作为NRBC的候选物。该阈值是根据背景噪声，即基于预备实验中WBC的FITC的发光信号强度为1×10³或小于1×10³的事实所确定的。

<分子生物学分析>

使用Nucleospin Tissue XS(购自Takara Bio Inc.)从整个级分B中提取DNA。

在本实施例中，通过使用经由DNA提取得到的DNA作为模板进行PCR反应。在PCR反应中，使用Ex-Taq聚合酶。图14显示分子生物学分析的结果。图8所示电泳图像中的泳道1至11表示通过针对SRY基因序列进行PCR获得的长度为270bp的扩增产物。模板如下。

在泳道1的左侧显示200bp DNA ladder。

泳道1：人类男性的标准DNA，200拷贝。

泳道2：人类女性的标准DNA，200拷贝。

泳道3：人类男性的标准DNA，0拷贝。

泳道4：人类男性的标准DNA，1拷贝。

泳道5：人类男性的标准DNA，4拷贝。

泳道6：人类男性的标准DNA，8拷贝。

泳道7：人类男性的标准DNA，16拷贝。

泳道8：人类男性的标准DNA，64拷贝。

泳道9：人类男性的标准DNA，100拷贝。

泳道10：样品1

从图8所示的电泳图像，发现样品1含有具有4个至16个拷贝的SRY基因序列的DNA。因此，样品1中含有来自胎儿的染色体DNA。

[实施例1]

<血细胞分离芯片的NRBC浓缩>

在实施例1中，通过在收集血液后两到三小时使用0.3ml母体血液，通过使用图1和2所示的血细胞分离芯片浓缩NRBC。

将母体血液预先稀释至50倍。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释母体血液。将每个血细胞分离芯片中的稀释母体血液流到主通道的每单位时间的流量和PBS流到副通道的每单位时间的流量都调节到25μl/min。使用血细胞分离芯片进行分级，持续10小时。

在该实施方式中，如图2所示，设置四个分支通道(59a至59d)。此外，这些分支通道的窄通道的内径分别为8μm、12μm、15μm和25μm。在该实施例中，窄通道的横截面是方形的。

<分级>

表1显示使用上述血细胞分离芯片对15ml稀释母体血液进行分级的结果。母体血液含有300μl母体全血。推测在母体全血中含有1.43×10⁹个血细胞。使用全自动细胞计数器TC20进行测定。表1显示了通过分支通道1-4和流路5的级分的血细胞数量。

[表1]

在表1中所示的级分Fr4中的血细胞数量是3.29×10⁷。考虑到密度梯度分层离心的结果，认为该级分含有对应于NRBC和WBC的血细胞。将级分Fr4用作上述级分A，并通过细胞分选进行分析。

按照与参考实施例1类似的方式分选出级分B。首先，用Hoechst33342和PE标记的抗-CD45抗体对级分A进行染色。染色是在不进行包括对细胞交联/固定的固定过程的情况下进行的。然后，用FITC标记的抗CD235a抗体进行染色。以与参考例1相似的方式优化抗体的浓缩。

然后，用可从On-chip Biotechnologies Co.,Ltd.获得的细胞分选仪分选出级分Fr4的3.29×10⁷个血细胞。分选出对Hoechst33342和CD235a为阳性而对CD45为阴性的血细胞。通过上述过程，获得了含有661个血细胞的级分。

<单细胞水平的分离>

图9显示如上所述染色的血细胞。如图所示，防止了聚集体的形成。因此，已经表明血细胞可以在单细胞水平上彼此分离。认为在本实施例中，由于对用于使血细胞染色的抗体的浓缩进行了优化，因此防止了聚集。

<染色体DNA的提取>

将上述级分B分成三个级分，每个级分含有200个血细胞。这些级分中的每一个都预期含有一个或两个衍生自胎儿的NRBC。

从每个级分中提取染色体DNA。通过MALBAC(多重退火环状循环扩增)法对染色体DNA进行全基因组扩增。通过这样做，扩增了衍生自胎儿的Y染色体，从而使得可以在以后的过程中容易地检测SRY基因。使用扩增的染色体DNA作为模板，进行对SRY基因序列具有特异性的PCR扩增。图10显示SRY基因的PCR产物的电泳图像。模板如下。

在泳道1的左侧显示200bp DNA ladder。

泳道1：蒸馏水。

泳道2：人类男性的标准DNA，20ng。

泳道3：人类女性的标准DNA，20ng。

泳道4：通过MALBAC法得到的扩增产物1，450ng。

泳道5：通过MALBAC法得到的扩增产物2，610ng。

泳道6：通过MALBAC法得到的扩增产物3，700ng。

在泳道4中观察到SRY条带，其中以扩增产物1作为模板进行PCR。在以其他扩增产物为模板的PCR中没有观察到SRY条带。从上述内容可以发现，可以对级分B进行分级，并由此将其分成含衍生自胎儿的血细胞的级分和不含衍生自胎儿的血细胞的级分。

从上述事实可以确认，NRBC可以通过根据本实施方案的血细胞分离芯片进行浓缩。

[实施例2]

<NRBC通过血细胞分离芯片浓缩>

将由43岁的怀孕26周妇女(胎儿为男性)提供的母体血液用PBS稀释至五倍，并通过使用血细胞分离芯片浓缩NRBC。使用采血后约69小时稀释的母体血液。

所使用的血细胞分离芯片是对实施例1中使用的血细胞分离芯片进行了改造而得到的。虽然实施例1中使用的芯片具有四个分支通道和一个流路，但在该实施例中使用了其中十个彼此堆叠的层，其中每层具有两个内径分别为15μm和25μm的分支通道，和一个流路(图11中的59a和59d)。也就是说，使用以下芯片，即，其中：所有通道二维地布置在微通道单元中；该分离芯片包含十层，每层包含微通道单元；在垂直方向上将设置在各层中的微通道单元彼此叠置，从而形成微通道堆叠体；在分层通道中，设置在各层的微通道单元中的主通道的入口、副通道的入口、排除通道的出口、回收通道的出口和主通道的出口连接到穿透所有层的各个柱通道，使得它们各自合并在一起；并且底层中的主通道的入口是关闭的，主通道的出口之一是关闭的(图12)。

将稀释的母体血液的每单位时间的流量和流至每个血细胞分离芯片中的副通道的每单位时间的PBS流量都调节到50μl每分钟，并通过使用血细胞分离芯片进行分级，持续60分钟。表2显示了分别通过分支通道1(Fr1)、分支通道2(Fr2)和流路3(Fr3)的级分的血细胞数。

[表2]

级分	细胞数(细胞)	比率(％)
			Fr1	1.19×10<sup>9</sup>	96.00％
Fr2	3.11×10<sup>7</sup>	2.52％
			Fr3	1.83×10<sup>7</sup>	1.48％
总计	1.24×10<sup>9</sup>	100.00％

认为所获得的级分2含有3.11×10⁷个血细胞。使用全自动细胞计数器TC20进行测定。

<通过细胞分选确认NRBC的浓缩>

与实施例1相同，通过使用细胞分选仪，分选出从母体血液得到的包含在Fr2级分中的3.11×10⁷个血细胞的八分之一(0.40×10⁶个血细胞)。分选出对Hoechst33342和CD235a为阳性而对CD45为阴性的血细胞。通过上述过程，获得含有15429个血细胞的级分(图13中的区域Ar)。

通过使用细胞分选仪从级分Fr2中新分离出八分之一的血细胞，获得了含有21981个血细胞的级分(图14中的区域Ar)。

与实施例1相同，从各级分中提取染色体DNA。通过MALBAC法对染色体DNA进行全基因组扩增。在通过使用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up(购自Takara Bio Inc.)对扩增的染色体DNA进行纯化后，通过使用经扩增和纯化的染色体DNA的一部分作为模板进行对SRY基因序列具有特异性的PCR扩增。图15显示SRY基因的PCR产物的电泳图像。模板如下。

[模板]

在泳道5的右侧显示100bp DNA ladder。

泳道1：蒸馏水。

泳道2：可商购获得的人类男性的标准DNA，20ng。

泳道3：可商购获得的人类女性的标准DNA，20ng。

泳道4：通过MALBAC法得到的包含在母体血液Fr2中的染色体DNA的扩增产物，10ng。

泳道5：通过MALBAC法得到的包含在母体血液Fr2中的染色体DNA的扩增产物，10ng。

在使用通过MALBAC法得到的包含在母体血液Fr2级分中的染色体DNA的扩增产物作为模板的PCR中，观察到SRY条带。在以其他扩增产物作为模板的PCR中没有观察到SRY条带。如上所述，发现使用血细胞分离芯片持续60分钟的过程可以浓缩衍生自胎儿的细胞。

此外，如参考例所示，在密度梯度离心法中，需要收集漂浮在离心管中的级分。与此相对，在使用血细胞分离芯片的本实施例中，可以分离其中衍生自胎儿的细胞通过血细胞分离芯片本身浓缩的级分。

[实施例3]

如图16所示，对实施例2中使用的血细胞分离芯片进行了改造，并且使用了改造的血细胞分离芯片。也就是说，在使用具有10层的血细胞分离芯片时，根据实施例2浓缩NRBC，其中在具有上述微通道单元的层中形成四个上述微通道单元。由于每层中形成两个或多于两个微通道单元，因此在血细胞分离芯片中形成并布置多个垂直微通道堆叠体。连接到入口的柱通道被集成为单个集成柱通道。

分支通道的内径与实施例2中所示的相同。此外，将稀释的母体血液每单位时间的流量和流至每个血细胞分离芯片中的副通道的每单位时间的PBS流量都调节到200μl每分钟。另外，通过使用该血细胞分离芯片进行分级，持续60分钟。

结果，可以像实施例2的情况那样浓缩NRBC。

在上述实施方案和实施例中，已通过使用NRBC作为目的细胞的实例来描述本发明。注意，目的细胞可以不是血细胞。例如，目的细胞可以是CTC(循环肿瘤细胞)。在这种情况下，可以从需要接受癌症测试的对象、癌症患者或已经进行癌症治疗的患者收集血液样品。

[实施例4]<多层芯片的性能评价>

多层芯片的性能评价如下。如实施例2中那样，通过使用多层芯片对全血进行分级，在所述多层芯片中，以规则间隔连续堆叠具有微通道单元的每个层。全血是没有怀孕的普通成人的全血。将全血的稀释液分级。稀释比为5。

多层芯片具有与实施例2中所述相同的微通道单元。然而，在该实施例中使用的多层芯片与实施例2的多层芯片不同，因为具有微通道单元的每个层的数量是八。此外，将包含相同微通道单元的单层芯片用作对照。

将流至与主通道的入口共同连接的柱通道的稀释血液的流入速率调节为20μL每分钟。流入多层芯片的稀释血液被分开，并流至每一层中的每个副通道。在单层芯片中，将流至仅有一个的主通道的稀释血液流入速率调节至20μl每分钟。在每个芯片中分级的血液体积为600μl。

通过如上所述使PBS通过副通道，PBS通过压入主通道中而约束血液流动。与芯片的层数无关，将流至与副通道的入口共同连接的柱通道的PBS流入速率调节为20μl每分钟(弱挤压)或40μl每分钟(强挤压)。在单层芯片中，将流至仅有一个的副通道的PBS流入速率调节到20μl每分钟。流入多层芯片的PBS被分开，并流入每一层中的每个副通道。供给至每个芯片中的PBS的体积为600μl或1200μl。

从分支通道1(Fr1，宽度15μm，对应于图12的柱通道24a)中得到级分F1。从分支通道2(Fr2，宽度25μm，对应于图12中的柱通道24d)获得级分F2。从流路中获得级分F3(Fr3，对应于图12中的柱通道25)。分析各级分中所含的血细胞，结果如表3所示。

[表3]

对分析进行说明。通过使用全自动细胞计数器TC20(BIORAD)来测量收集至级分F1至F3中每一个的细胞数(C1)。应注意，首先将级分F1稀释到400倍，然后测量细胞数。这是因为F1级分含有大量细胞，主要是无核的成熟RBC。稀释率可以是100至200。

对级分F1进行溶血处理。结果，级分F1中的成熟RBC发生溶血。即使在溶血后仍保留包括WBC在内的有核细胞。通过FCM分析一些残留的细胞。对于级分F2，通过FCM分析了一些收集的细胞。对溶血的级分F1和对级分F2进行荧光核染色。通过FCM测定核染色的阳性率(p)(％)。

在级分F1的分析中，溶血处理后残留细胞数(C2)用作分母(C3)。在分析级分F2时，用多层芯片收集的细胞数(C1)用作分母。通过将分母(C3)乘以阳性率(p)(％)而计算每个级分中有核细胞数(C4)。基于有核细胞数(C4)，获得有核细胞与级分F1和F2中每一个的分配比。换算级分F1和F2的分配比，以使得它们的总和为100。此外，有核细胞数(C4)与通过芯片收集的细胞数的比定义为分级效率(％)，并示于表中。

当施加弱挤压(20μl/min)时，在单层芯片中的级分F2的阳性率(p)为4.86％。与此相对，在多层芯片中的阳性率(p)为28.6％。这些结果表明，大量成熟的RBC进入单层芯片中的厚分支通道2。此外，它们表明进入分支通道2的成熟RBC数在多层芯片中减少。

当施加弱挤压(20μl/min)时，在单层芯片中有核细胞的分配比(F1:F2)为42.4:57.6。与此相对，在多层芯片中的分配比为7.9:92.1。这些结果表明，在单层芯片中大量有核细胞进入窄分支通道1。此外，它们表明在多层芯片中进入分支通道1的有核细胞数减少。

基于上述结果，已经发现，成熟RBC和有核细胞的水力学分类的精度在多层芯片中比在单层芯片中更高。

此外，进行了利用强挤压(40μl/min)的分级以提高分类的精度。在单层芯片中级分F2的阳性率(p)提高到55.3％。甚至在多层芯片中提高到66.6％。这些结果表明，通过使挤压和约束更强，进入分支通道2的成熟RBC数减少。

当施加强挤压(40μl/min)时，在单层芯片中有核细胞的分配比(F1:F2)为21.5:78:5。甚至在多层芯片中为4.6:95.4。这些结果表明，通过使挤压和约束更强，可以提高分类的精度。

通过施加强挤压(40μl/min)获得的分配比的改善在单层芯片中非常大。然而，在多层芯片中，分配比没有显著提高。考虑到这是因为，即使在弱挤压(20μl/min)时，分配比也已经充分地向级分F2侧移动。如上所述，已经发现，芯片的多层结构提供了能够提高分类精度的手段，而与挤压和约束的强度无关。

本申请基于并要求在2017年10月19日提交的日本专利申请2017-202907的优先权权益，其公开内容通过引用整体并入本文。

本发明的其他方面将在下文中描述。

[1]一种用于通过使用血细胞分离芯片分级包含在血液样品中的血细胞而获得级分的方法，其中在全血细胞群中浓缩了有核红细胞(NRBC)，其中

血液样品是未处理的血液样品本身，或是其中与血液样品相比NRBC未在全血细胞群中浓缩的未过滤/未浓缩的样品，

血细胞分离芯片包含微通道单元，该微通道单元包含血液样品流经的主通道、与主通道的一侧连接的副通道、在副通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的排除通道、以及在排除通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的回收通道，

从副通道流出的液体将在主通道中流动的血细胞推向其上设置有排除通道和回收通道的主通道一侧，

被推动的血细胞中的无核RBC进入排除通道，从而从血液样品中除去无核RBC，

在已经除去无核RBC的剩余血细胞中，NRBC进入回收通道，从而从血液样品中获得NRBC作为级分，和

排除通道和回收通道具有不同的内径，并且排除通道在主通道和排除通道之间的连接部分处的内径小于回收通道在主通道和回收通道之间的连接部分处的内径。

[2]如条款[1]中所述的方法，其中血液样品是母体血液样品，并且NRBC是衍生自胎儿的NRBC。

[3]如条款[1]中所述的方法，其中

排除通道在主通道和排除通道之间的连接部分处的内径是4μm至19μm，并且

回收通道在主通道和回收通道之间的连接部分处的内径是20μm至30μm。

[4]如条款[1]中所述的方法，其中血液样品每分钟流至主通道的体积为0.5μl至50μl。

[5]如条款[1]中所述的方法，其中血液样品每分钟流至副通道的体积是流至主通道的体积的1倍至10倍。

[6]如条款[1]中所述的方法，其中

所有通道二维地布置在微通道单元中，并且分离芯片包含2个层至200个层，每个层包含微通道单元，

设置在各层中的微通道单元在垂直方向上彼此叠置，从而形成微通道堆叠体，以及

在分层的通道中，设置在各层中的微通道单元中的主通道的注入口、副通道的注入口、排除通道的排出口、回收通道的排出口和主通道的排出口连接到穿透所有层的相应垂直通道，使得它们各自合并在一起。

[7]如条款[6]中所述的方法，其中底层中的主通道的注入口是关闭的，并且最上层或最下层中的主通道的排出口是关闭的。

[8]如条款[6]中所述的方法，其中

在包含微通道单元的各层中形成至少两个微通道单元，从而在血细胞分离芯片中形成并布置多个垂直微通道堆叠体，以及

与注入口连接的垂直通道被集成为单个集成垂直通道。

[9]如条款[1]中所述的方法，其中在注入血液样品的同时，定期地搅拌血液样品。

[10]如条款[1]中所述的方法，其中，

在微通道单元中，

回收通道的内径在回收通道的中间部分增加，以及

排除通道的内径在排除通道的中间部分增加。

[11]一种用于获得在无创性产前遗传测试中的诊断用数据的方法，其包括：

通过使用血细胞分离芯片分级包含在血液样品中的血细胞而获得级分A，其中在全血细胞群中浓缩了有核红细胞(NRBC)，其中血液样品是未处理的血液样品本身，或是其中与血液样品相比NRBC未在全血细胞群中浓缩的未过滤/未浓缩的样品，

通过特异性标记级分A中的白细胞(WBC)和核酸并使用细胞分选来分选出级分A中的经标记的血细胞，而获得级分B，其中已经从级分B中除去使用对WBC具有特异性的标记物标记的血细胞，并且在级分B中浓缩使用对核酸具有特异性的标记物标记的血细胞；以及

通过分析级分B中血细胞所含染色体，获得用于无创性产前遗传测试中的诊断用数据，其中

从副通道流出的液体将在主通道中流动的细胞推向其上设置有排除通道和回收通道的主通道一侧，

被推动的细胞中的无核RBC进入排除通道，从而从血液样品中除去无核RBC，

[12]如条款[11]中所述的方法，其中染色体的分析是根据荧光原位杂交法、下一代基因组测序法或微阵列法的分析。

[13]如条款[11]中所述的方法，其中血液样品是母体血液样品，并且NRBC是衍生自胎儿的NRBC。

[14]如条款[11]中所述的方法，其中

回收通道在主通道和回收通道之间的连接部分处的内径为20μm至30μm。

[15]如条款[11]中所述的方法，其中血液样品每分钟流至主通道的体积为0.5μl至50μl。

[16]如条款[11]中所述的方法，其中血液样品每分钟流至副通道的体积为流至主通道的体积的1倍至10倍。

[17]如条款[11]中所述的方法，其中

[18]如条款[17]中所述的方法，其中底层中的主通道的注入口是关闭的，并且最上层或最下层中的主通道的排出口是关闭的。

[19]如条款[17]中所述的方法，其中

与注入口连接的垂直通道被集成为单个集成垂直通道。

[20]如条款[11]中所述的方法，其中在注入血液样品的同时，定期地搅拌血液样品。

[21]如条款[11]中所述的方法，其中，

在微通道单元中，

回收通道的内径在回收通道的中间部分增加，以及

排除通道的内径在排除通道的中间部分增加。

附图标记

20 芯片

22 与主通道的入口共同连接的柱通道

23 与副通道的入口共同连接的柱通道

24a 与排除通道的出口共同连接的柱通道

24d 与回收通道的出口共同连接的柱通道

25 与主通道的出口共同连接的柱通道

39 颗粒

41 有核红细胞(NRBC)

42 无核红细胞(无核RBC)

43 白细胞(WBC)

45a-45f 层

46 离心管

47 主通道

48a-48c 血细胞

49 副通道

50 血细胞分离芯片

51 入口

52 主通道

53 副通道

54a-54d 出口

55 出口

56a-56d 通道

57 注射器

58 注射器

59a-59d 分支通道

61 入口

Fr1-Fr5 级分

FT 流路

L01-L10 层

Claims

1.一种包含用于对血液样品中的细胞进行水力学分类的微通道单元的芯片，其中

所述微通道单元包含图案，在所述图案中，血液样品流经的主通道、与主通道的一侧连接的副通道、在副通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的排除通道、以及在排除通道下游连接至与副通道连接侧相对的主通道一侧的回收通道是二维地展开的，

在每个回收通道中，每单位时间流过主通道和所述回收通道之间的连接部分的横截面的体积大于在每个排除通道中，每单位时间流过主通道和所述排除通道之间的连接部分的横截面的体积，

2.根据权利要求1所述的芯片，其中在每个层中设置一个微通道单元。

3.根据权利要求2所述的芯片，其中，在芯片的平面视图中，所有层的微通道单元的图案的取向和位置彼此对齐。

4.根据权利要求3所述的芯片，其中

从而使血液样品从芯片的顶表面穿过芯片到其底表面。

5.根据权利要求4所述的芯片，其中设置有微通道单元的层以规则的间隔连续地堆叠。

6.根据权利要求1所述的芯片，其中

7.根据权利要求1所述的芯片，其中，在微通道单元中，回收通道和排除通道中的至少一个的横截面面积沿其下游变大。

8.根据权利要求4所述的芯片用于通过对血液样品进行分级而获得其中目的细胞在细胞数方面被浓缩的级分的用途，其中

所述血液样品是未处理的全血本身，或是其中与全血相比，目的细胞在细胞数方面未浓缩的血液样品。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述血液样品流至与主通道连接的柱通道的流入量为8μl/min至25μl/min。

10.根据权利要求9所述的用途，其中每单位时间流入与副通道连接的柱通道的液体体积是每单位时间流至与主通道连接的柱通道的血液样品流入量的1倍至2倍。

11.根据权利要求8所述的用途，其中，在将所述血液样品注入所述芯片中的同时，搅拌在注入芯片中之前保有的血液样品，并将经搅拌的血液样品连续地注入芯片中。

12.根据权利要求8所述的用途，其中

所述血液样品是母体血液的全血或通过简单稀释全血而获得的血液样品，且

所述目的细胞是衍生自胎儿的NRBC。