KR20090101313A - 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 T 헬퍼 에피토프 예컨대, 헤로필루스 인플루엔자 B로부터의 단백질을 제공하는 면역학적 융합 파트너에 연결된 소위 종양 거부 항원 PRAME (또한, DAGE로서 공지됨)으로부터 유래된 항원을 포함하는 융합 단백질, 단백질 D의 단편을 포함하는 융합 파트너 단백질, 이를 제조하고 백신을 제형화시키는 방법, 및 다양한 암 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 T 헬퍼 에피토프 예컨대, 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) B로부터의 단백질 D를 제공하는 면역원성 융합 파트너에 연결된 소위 종양 거부 항원 PRAME (DAGE로서 공지됨)로부터 유래된 항원을 포함하는 융합 단백질, 이를 제조하고, 백신을 제형화시키기 위한 방법 및 비제한적으로, 흑색종 (melanoma), 유방암, 방광암, 폐암 예컨대, NSCLC, 육종 (sarcoma), 난소암, 두경부암 (head and neck cancer), 신장암 (renal cancer), 대장암종 (colorectal carcinoma), 다발골수종 (multiple myeloma), 급성 백혈병을 포함하는 백혈병 및 식도암종 (oesophageal carcinoma)를 포함하는 다양한 암을 치료하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 단백질 D 유도체를 포함하는 융합 파트너 단백질 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
다양한 군의 종양 관련 항원중에서, 암 고환 항원은 이들의 넓은 종양 특이적 발현 및 건강한 세포에서는 일반적으로 발현하지 않는다는 점으로 인해 면역치료학적으로 흥미롭다. 50개 이상의 암/고환 항원이 지금까지 기술되었으며, 이들중 많은 항원에 있어서, T 림프구에 의해 인지된 에피토프가 확인되었다. PRAME는 암 고환 항원이며, 잠재적인 면역치료법으로서 조사중에 있다.
면역치료법에서, 암 항원은 예를 들어, 단백질 또는 이의 면역원성 단편으로 서, 또는 이러한 단백질을 엔코딩하는 DNA, 또는 상기 DNA를 함유하는 벡터로서 항원을 함유하는 백신으로서 일반적으로 유입되며, 이는 동일한 항원을 발현하는 종양을 공격하는 환자의 면역 시스템을 자극한다.
적합한 반응이 자극되면, T 림프구 (T 세포)는 직접적으로 항원을 공격하고, 면역 반응을 조정한다. 하나의 항원 타입에 특이적인 B 세포 및 T 세포가 발생된다. 면역 시스템이 상이한 항원에 노출되는 경우, 상이한 B 세포 및 T 세포가 형성된다. 림프구가 발생하기 때문에, 이들은 일반적으로 자신의 조직 (자가)을 자체에서 정상적으로 발견되지 않는 조직 및 입자 (비자가)와 상이한 것으로서 인식하도록 학습된다. 일단 B 세포 및 T 세포가 형성되면, 이들 세포중 소수는 증식되며, 면역 시스템에 "메모리"를 제공한다. 이는 다음번에 동일한 항원에 노출될 경우 더욱 신속하고 효과적으로 면역 시스템이 반응하게 한다.
특정 실험은 암 고환 항원이 면역 시스템에서 메모리 메카니즘을 자극할 수 있음을 나타내는 것으로 보인다.
PRAME는 세포 치사 또는 세포 사이클과 관련있다는 가설이 있다. 일부 그룹에 의해 이는 골수종 및 폐, 신장 및 두경부를 포함한 다양한 종양에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 이는 또한, 40-60% 백혈병 예컨대, 급성 림프구 백혈병 및 급성 골수종 백혈병에서 발현되는 것으로 보인다 (예를 들어, 문헌 [Exp Hematol. 2000 Dec; 28(12):1413-22] 참조). 환자에서, PRAME의 과다 발현이 이러한 단백질을 과다 발현하지 않는 것과 비교하여 높은 생존율 및 더 낮은 재발율과 관련있는 것으로 여겨짐이 관찰되었다.
이러한 항원 및 이의 제조 방법은 US 특허 5,830,753에 기술되어 있다. PRAME는 에너테이티드 휴먼 진 데이타베이스 H-Inv DB (Annotated Human Gene Database H-Inv DB)에서 하기 수탁 번호로 찾아볼 수 있다: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1, 및 CR620272.1.
단백질 D는 그람-네거티브 박테리아, 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면 단백질이다. 단백질 D로부터 유래된 면역원성 융합 파트너에 대한 정보는 WO 91/18926으로부터 획득될 수 있다.
항원 일부와 이종성 융합 파트너의 융합 단백질은 때때로 항원의 면역원성을 증가시키고/거나 적합한 양 및/또는 순도로 단백질을 생성하는 것을 돕도록 제조되며, 예를 들어, WO 99/40188을 참조할 수 있으며, 이는 MAGE와 예를 들어, 단백질 D, 그람 네거티브 박테리아 헤모필루스 인플루엔자 B의 표면 단백질의 융합 단백질을 기술하고 있다. 융합 단백질은 재조합적으로 제조되며, 단백질 D 분비 서열이 융합 단백질에 혼입되어 최종 생성물의 분비 및 용해를 잠재적으로 도울 수 있다.
도면 및 작제물/서열의 간단한 설명
| 도 1 | 작제물 3 및 4의 SDS-page 분석 |
| 도 2 | 작제물 3a 및 4a의 SDS-page 분석 |
| 도 3 | CD4 반응 (AS01B 애주번트) |
| 도 4 | CD8 반응 (AS01B 애주번트 - 20070499) |
| 도 5 | CD4 반응 (AS15 애주번트) |
| 도 6 | CD8 반응 (AS15 애주번트) |
| 도 7 | 본 발명의 예시적 작제물의 마킹된 아미노산 서열 |
| 도 8 | LipoD-MAGE3-His (SEQ ID NO:43) 및 pD1/3-PRAME-His (SEQ ID NO:10) 사이의 정렬 |
| 도 9 | 헤모필루스 인플루엔자로부터의 오리지날 단백질 D (SEQ ID NO: 45)와 LipoD-MAGE3-His (SEQ ID NO: 43)의 공유된 서열간의 정렬 |
| 도 10 | 헤모필루스 인플루엔자로부터의 오리지날 단백질 D (SEQ ID NO: 41), pD-MAGE3-His (SEQ ID NO: 45) 및 아미노산 2-D 및 3-P를 포함하지 않는 pD1/3-PRAME-His의 작제물 (SEQ ID NO: 44) 사이의 공유된 서열의 정렬 |
| 도 11 | pET21 벡터에서 분비 시그널 (SS) 및 His-테일 (tail) (His)을 갖거나 갖지 않는 pD1/3-PRAME의 SDS page 분석 |
| 도 12 | 단백질 1/3 MAGE-A3-His의 서열 (SEQ ID NO: 44) |
| 작제물 1 (실시예 1) | MDP- 20-127 - 단백질 D -PRAME -TSGHHHHHH (플라스미드 TCMP14) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 1; 아미노산 서열 SEQ ID NO:2) |
| 작제물 2 (실시예 2) | MDP- 20-127 - 단백질 D -PRAME - His 테일 비함유 (플라스미드 TCMP14) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 3; 아미노산 서열 SEQ ID NO:4) |
| 작제물 3 (실시예 3) | MDP- 20-127 - 단백질 D -PRAME -LEHHHHHH (플라스미드 pET21) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 5; 아미노산 서열 SEQ ID NO:6) |
| 작제물 4 (실시예 4) | MDP- 20-127 - 단백질 D - PRAME - His 테일 비함유 (플라스미드 pET21) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 7; 아미노산 서열 SEQ ID NO:8) |
| 작제물 3a (실시예 3a) | MDP- 20-127 - 단백질 D - PRAME - HHHHHH (플라스미드 pET26) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 9; 아미노산 서열 SEQ ID NO:10) |
| 작제물 4a (실시예 4a) | MDP- 20-127 - 단백질 D - PRAME - His 테일 비함유 (플라스미드 pET26) (누클레오티드 서열 SEQ ID NO: 11; 아미노산 서열 SEQ ID NO:12) |
| 서열 1 (SEQ ID NO:1) | 실시예 1의 DNA 서열 |
| 서열 2 (SEQ ID NO:2) | 실시예 1의 아미노산 서열 |
| 서열 3 (SEQ ID NO:3) | 실시예 2의 DNA 서열 |
| 서열 4 (SEQ ID NO:4) | 실시예 2의 아미노산 서열 |
| 서열 5 (SEQ ID NO:5) | 실시예 3의 DNA 서열 |
| 서열 6 (SEQ ID NO:6) | 실시예 3의 아미노산 서열 |
| 서열 7 (SEQ ID NO:7) | 실시예 4의 DNA 서열 |
| 서열 8 (SEQ ID NO:8) | 실시예 4의 아미노산 서열 |
| 서열 9 (SEQ ID NO:9) | 실시예 3a에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열 |
| 서열 10 (SEQ ID NO:10) | 실시예 3a에 대한 아미노산 서열 |
| 서열 11 (SEQ ID NO:11) | 실시예 4a에 대한 코돈 최적화된 DNA 서열 |
| 서열 12 (SEQ ID NO:12) | 실시예 4a에 대한 아미노산 서열 |
| SEQ ID NO:13 | VLDGLDVLL (PRA100-108) |
| SEQ ID NO:14 | SLYSFPEPEA (PRA142-151) |
| SEQ ID NO:15 | ALYVDSLFFL (PRA300-309) |
| SEQ ID NO:16 | LYVDSLFFL (PRA301-309) |
| SEQ ID NO:17 | SLLQHLIGL (PRA425-433) |
| SEQ ID NO:18 내지 35 | 본 발명의 실시예에 사용된 올리고누클레오티드 |
| SEQ ID NO: 36 | TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826;) |
| SEQ ID NO: 37 | TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) |
| SEQ ID NO: 38 | ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) |
| SEQ ID NO: 39 | TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) |
| SEQ ID NO: 40 | TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456) |
| SEQ ID NO:41 | 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D의 AA 1 내지 127 |
| SEQ ID NO:42 | 1-Met; 2-Asp; 3-Pro; 이어서, 단백질 D의 AA 20 내지 127 |
| SEQ ID NO:43 | 단백질 D 1/3- MAGE-A3 -His의 아미노산 서열 |
| SEQ ID NO:44 | pD1/3-PRAME-His 서열에 사용하기 위한 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로부터의 아미노산 서열 |
| SEQ ID NO:45 | pD1/3-MAGE-His 서열에 사용하기 위한 헤모필루스 인플루엔자로부터의 단백질 D로부터의 아미노산 |
발명의 요약
본 발명은
a) PRAME 또는 이의 면역원성 단편, 및
b) 단백질 D로부터 유래된 이종성 융합 파트너를 포함하는 융합 단백질로서, 단백질 D의 분비 서열 (시그널 서열)을 포함하지 않는 융합 단백질을 제공한다.
본 발명은 추가로, 단백질 D로부터 유래된 본원에 기술된 바와 같은 융합 파트너 단백질로서, 단백질 D의 분비 서열 또는 시그널 서열을 포함하지 않는 융합 파트너 단백질을 제공한다.
본 발명은 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 및 항원 또는 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 추가로, 단백질 D로부터 유래된 융합 파트너 단백질로서, 단백질 D의 아미노산 20 내지 127을 포함하거나 이로 구성된 융합 파트너 단백질을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 단백질 D 융합 파트너 단백질로부터의 하나 이상의 아미노산은 치환에 의해 결실되거나 대체될 수 있다. 아미노산은 본원에 규정된 바와 같은 보전성 치환으로 치환될 수 있거나, 다른 아미노산이 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 치환될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 단백질 D 융합 파트너 단백질은 야생형 단백질 D 서열과 비교한 경우 아미노산 서열 내에 결실부 또는 삽입부를 추가적으로 또는 대안적으로 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 삽입되거나 결실될 수 있다.
본 출원의 문맥상 용어 "분비 서열" 또는 "시그널 서열" 또는 분비 시그널"은 천연 단백질의 대략적인 아미노산 1 내지 16, 17, 18 또는 19를 나타내는 것으로 의도된다. 일 구체예에서, 단백질 D의 분비 또는 시그널 서열 또는 분비 시그널은 단백질 D의 N-말단의 19개 아미노산을 나타낸다. 용어 "분비 서열" 또는 "시그널 서열" 또는 "분비 시그널"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 융합 파트너 단백질은 나머지 전장 단백질 D 단백질을 포함할 수 있거나, 단백질 D의 나머지 N-말단의 약 1/3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질 D의 나머지 N-말단의 1/3은 단백질 D의 대략적으로 또는 약 아미노산 20 내지 127을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 단백질 D 서열은 단백질 D의 아미노산 20 내지 127을 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 단백질 D 서열의 아미노산 17, 18, 19, 20, 21 또는 22번중 어느 하나로부터 출발하여 단백질 D 서열의 아미노산 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 140번중 어느 하나에서 종결되는 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
본 문맥상 용어 "나머지"는 본원에 기술된 분비 또는 시그널 서열을 갖지 않는 단백질 D 단백질의 서열을 의미한다.
융합 단백질이 PRAME 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 단백질 D 유도체는 단백질의 약 처음 1/3을 포함하며, 더욱 특정하게는, 아미노산 20 내지 127을 포함한다. 융합 단백질이 PRAME 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 본 발명의 대안적 구체예에서, 단백질 D는 단백질 D의 N-말단 109번 아미노산이 사용되는 단백질의 약 처음 1/3을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 단백질 D 부분은 단백질의 분비 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 일 구체예에서, 단백질 D 유도체는 리피드화되지 않는다.
일 구체예에서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 단백질 D 작제물을 융합 파트너 단백질로서 제공한다. 단백질 D 작제물은 본원에 기술된 바와 같은 PRAME 또는 MAGE-A3 작제물을 추가적으로 포함하는 작제물에 대한 융합 파트너 단백질일 수 있거나 또 다른 암 항원 또는 다른 항원을 추가로 포함하는 작제물에 대한 융합 파트너 단백질일 수 있다.
PRAME 또는 이의 면역원성 단편을 포함하는 융합 단백질 및 단백질 D에 있어서, 또는 단백질 D를 포함하는 융합 단백질에 있어서, 또는 단백질 D를 포함하는 융합 파트너 단백질에 있어서, 분비 서열 (또는 시그널 서열)의 존재는 생성된 융합 단백질의 양에 유해한 영향을 끼칠 수 있다.
PRAME
일 양태에서, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 융합 파트너 단백질 및 PRAME 항원 또는 이의 면역원성 단편을 포함한다. 일반적으로, PRAME 단백질은 509개 아미노산을 가지며, 일 구체예에서, PRAME의 모든 509개 아미노산이 사용될 수 있다. 수개의 세포독성 T 림프구 (CTL) 에피토프가 PRAME에서 확인되었으며, 예를 들어, 다음과 같다:
VLDGLDVLL (PRA100-108; SEQ ID NO:13);
SLYSFPEPEA (PRA142-151; SEQ ID NO:14);
ALYVDSLFFL (PRA300-309; SEQ ID NO:15);
LYVDSLFFL (PRA301-309; SEQ ID NO:16) 및
SLLQHLIGL (PRA425-433; SEQ ID NO:17).
일반적으로, 강한 면역 반응을 유도하고, 항원이 가능한 면역원성을 띠게 하기 위해서는 이러한 에피토프중 가능한 많은 에피토프가 항원에 포함되는 것이 바람직하다. 그러나, 주어진 작제물의 더 낮은 면역원성에 대해서는 잠재적인 면역학적 애주번트와의 제형화를 이용하는 것을 고려할 수 있다. 강한 애주번트는 하기에서 더욱 상세히 설명된다.
일 양태에서, 본 발명은 전장 단백질을 포함하거나, 전장 단백질로 구성되거나 필수적으로 구성되는 융합 단백질의 PRAME 부분을 제공한다.
그러나, 본 발명은 또한 보존적 치환부를 갖는 PRAME 작제물에 까지 확대된다. 일 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 치환될 수 있다. 본원에 기술된 PRAME 작제물은 야생형 PRAME 서열과 비교하여 아미노산 서열내에 결실부 또는 삽입부를 추가적으로 또는 대안적으로 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 삽입되거나 결실될 수 있다.
보존적 치환은 널리 공지되어 있으며, 일반적으로 서열 정렬 컴퓨터 프로그 램에서 디폴트 스코어링 매트릭스 (default scoring matrices)로서 세팅된다. 이들 프로그램은 PAM250을 포함한다 (Dayhoft M.O. et al, (1978), "A model of evolutionary changes in protein", In "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, and Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919).
일반적 용어에서, 하기 그룹내의 치환은 보존적 치환이나, 그룹간의 치환은 비보존적인 것으로 여겨진다. 그룹은 다음과 같다:
i) 아스파르테이트/아스파라긴/글루타메이트/글루타민
ii) 세린/트레오닌
iii) 리신/아르기닌
iv) 페닐알라닌/티로신/트립토판
v) 류신/이소류신/발린/메티오닌
vi) 글리신/알라닌
일반적으로, 본 발명의 융합 단백질에 사용된 PRAME 서열/아미노산은 천연 발생 PRAME와 80% 초과, 예컨대, 85, 90, 95, 더욱 특히 99% 초과로 동일할 것이다. 그러나, 당업자는 클로닝 공정의 결과로서 생성된 아미노산 잔기가 재조합적으로 합성된 단백질중에 유지될 수 있음을 알고 있을 것이다. 이들이 생성물의 특징에 유해한 영향을 끼치지 않는다면, 이들의 제거 여부는 선택적이다.
일 양태에서, 본 발명은 전장 PRAME 단백질을 포함하거나, 전장 PRAM 단백질로 구성되거나 필수적으로 구성되는 융합 단백질을 제공한다. 추가의 양태에서, 본 발명의 융합 단백질의 PRAME 부분은 하기 에피토프중 하나 이상을 포함하거나, 이들로 구성되거나 필수적으로 구성된다:
VLDGLDVLL (PRA100-108; SEQ ID NO:13);
SLYSFPEPEA (PRA142-151; SEQ ID NO:14);
ALYVDSLFFL (PRA300-309; SEQ ID NO:15);
LYVDSLFFL (PRA301-309; SEQ ID NO:16) 및
SLLQHLIGL (PRA425-433; SEQ ID NO:17).
융합 단백질
본 발명의 추가의 구체예에서, PRAME 이외의 또는 PRAME에 더하여 종양 항원이 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질에 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 파트너 단백질 및 하기 종양 항원 또는 종양 항원 유도체 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질이 제공된다: MAGE 항원, 예를 들어, MAGE-A 항원 예컨대, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12. 이들 항원은 때때로 MAGE A1, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE A11 및/또는 MAGE A12 (MAGE A 패밀리)로서 공지되어 있다. 일 구체예에서, 두개의 추가의 MAGE 패밀리중 하나로부터의 항원이 사용될 수 있다: MAGE B 및 MAGE C 그룹. MAGE B 패밀리는 MAGE Bl (또한, MAGE XpI, and DAM 10로서 공지되어 있음), MAGE B2 (또한, MAGE Xp2 및 DAM 6으로서 공지되어 있음) MAGE B3 및 MAGE B4 - Mage C 패밀리는 현재 MAGE Cl 및 MAGE C2를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위한 MAGE 항원은 전장 MAGE 항원을 포함할 수 있다. 대안적으로, MAGE 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산이 아미노산 서열로부터 결실되거나 치환될 수 있는 MAGE의 면역원성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 2개의 아미노산이 MAGE 서열의 N-말단으로부터 결실될 수 있다. 항원인 MAGE-A3 또는 이의 면역원성 부분인 본 발명의 일 구체예에서, MAGE-A3의 서열은 MAGE-A3의 아미노산 3 내지 314일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 종양 항원 또는 이의 유도체는 PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2 (또한, NY-ESO-I로서 공지됨), SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, P501S (또한, 프로스테인으로서 공지됨), HASHl, HASH2, 크립토, B726, NY-BRl.1, P510, MUC-1, 프로스타아제, STEAP, 티로시나아제, 텔로머라아제, 수르비빈, CASB616, P53, 및/또는 Her-2/neu 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분일 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 종양 항원은 하기 항원중 하나 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분을 포함하거나 이로 구성될 수 있다: SSX-2; SSX-4; SSX-5; NA17; MELAN-A; P790; P835; B305D; B854; CASB618 (WO00/53748에 기술된 바와 같음); CASB7439 (WO01/62778에 기술된 바와 같음); C1491; C1584; 및 C1585.
일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 항원은 P501S를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. P501S, 소위 프로스테인 (Xu et al., Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568)은 WO98/37814의 SEQ ID NO. 113으로서 공지되어 있으며, 553개 아미노산 단백질이다. 면역원성 단편 및 상기 참조 특허 출원에 기술된 바와 같은 적어도 20개, 바람직하게는, 50개, 더욱 바람직하게는, 100개의 연속 아미노산을 포함하는 이의 일부는 본 발명의 융합 단백질에 사용될 수 있다. 바람직한 단편은 WO98/50567 (PS108 항원)에 전립선암-관련 단백질 (WO 99/67384의 SEQ ID NO: 9)로서 기술되어 있다. 다른 바람직한 단편은 전장 P501S 단백질의 아미노산 51-553, 34-553 또는 55-553이다.
일 구체예에서, 항원은 윌림스 (Wilm's) 종양 유전자에 의해 발현되는 WT-1; 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분; 또는 WT-1의 아미노산 약 1-249를 포함하는 N-말단 단편 WT-1F을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
추가의 구체예에서, 항원은 Her-2/neu 유전자에 의해 발현된 항원, 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 단편 또는 면역원성 부분을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일 구체예에서, Her-2/neu 항원은 WO00/44899에 기술된 하기 융합 단백질중 하나일 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 항원은 또한 "ECD-ICD" 또는 "ECD-ICD 융합 단백 질"로서 불리는 "HER-2/neu ECD-ICD 융합 단백질"을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 이는 HER-2/neu 단백질의 세포외 도메인 (또는 이의 단편) 및 세포내 도메인 (또는 이의 단편)을 포함하는 융합 단백질 (또는 이의 단편)을 나타낸다. 일 구체예에서, 이러한 ECD-ICD 융합 단백질은 HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 실질적인 부분을 포함하지 않거나, HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인중 어느 것도 포함하지 않는다.
추가의 구체예에서, 항원은 "ECD-PD" 또는 "ECD-PD 융합 단백질"로 불리는 "HER-2/neu ECD-PD 융합 단백질" 또는 또한 "ECD-△PD" 또는 "ECD-△PD 융합 단백질"로서 불리는 "HER-2/neu ECD-△PD 융합 단백질"을 포함하거나 이로 구성될 수 있으며, 이는 HER-2/neu 단백질의 세포외 도메인 (또는 이의 단편) 및 포스포릴화 도메인 (또는 이의 단편 예를 들어, △PD)을 포함하는 융합 단백질 (또는 이의 단편)을 나타낸다. 일 구체예에서, ECD-PD 및 ECD-△PD 융합 단백질은 HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 실제적인 부분을 포함하지 않거나, HER-2/neu 트랜스멤브레인 도메인의 어느 것도 포함하지 않는다.
본원에 기술된 바와 같은 PRAME 항원 및 단백질 D 융합 파트너 단백질의 융합 단백질은 화학적으로 컨주게이팅될 수 있으나, 바람직하게는, 재조합 융합 단백질로서 발현되며, 이는 융합 파트너, 예컨대, 단백질 D 또는 변형된 단백질 D 단백질 없이 PRAME 단독과 비교하여 발현 시스템에서 생성되는 RPAME 단백질의 수준을 증가시킬 수 있다.
추가적으로 또는 대안적으로, 본원에 기술된 종양 항원 및 본 발명의 융합 파트너 단백질은 화학적으로 컨주게이팅될 수 있거나, 재조합 융합 단백질로서 발현될 수 있으며, 이는 융합 파트너, 예컨대, 단백질 D 또는 변형된 단백질 D 단백질이 없는 PRAME 또는 다른 종양 항원과 비교하여 발현 시스템에서 생성될 PRAME 단백질 또는 또 다른 종양 항원의 수준을 증가시킬 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질은 추가적으로 융합 파트너 단백질과 종양 항원 또는 이의 면역원성 부분 사이; 또는 융합 파트너 단백질과 His 테일 또는 기타 친화성 태그 (tag) (존재하는 경우) 사이의; 또는 종양 항원 또는 이의 면역원성 부분 및 His 테일 또는 기타 친화성 태그 (존재하는 경우) 사이의 하나 이상의 링커 서열을 추가로 포함할 수 있다. 링커 서열중의 아미노산은 항원 및/또는 융합 파트너의 서열과 비관련될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질 서열의 N-말단에서 아미노산 Met-Asp-Pro를 추가로 포함할 수 있다. Met 아미노산은 오리지날 단백질 D 서열 또는 비관련된 서열로부터 유래될 수 있다.
융합 파트너는 천연 재조합 단백질보다 더 높은 수율로 단백질 발현을 보조할 수 있다 (발현 인핸서). 융합 파트너 단백질 D는 이의 외래 특성으로 인해 생체내에서 특히 면역원성일 수 있으며, T 헬퍼 에피토프 바람직하게는, CD4 T-세포에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공함으로써 PRAME 또는 다른 종양 항원을 포함하는 융합 단백질을 보조할 수 있다. 이러한 CD4-T 세포는 유익한 면역 반응 특히, CD8 세포용해 T-세포 반응을 생성하는데 기여하는 것으로 여겨질 수 있다.
일 구체예에서, 융합 파트너는 발현 향상 파트너 및 면역학적 융합 파트너 둘 모두로서 작용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 단백질 D의 N-말단 부분 (상기 또는 본원에 기술된 바와 같음)이 PRAME의 N-말단 또는 이의 면역원성 단편으로 융합되는 융합 단백질을 제공한다. 더욱 특히, 단백질 D 단편 및 PRAME의 N-말단과의 융합은 PRAME가 절제되었던 단백질 D의 C-말단-단편을 대체하도록 수행된다. 이와 같이, 단백질 D의 N-말단은 융합 단백질의 N-말단이 된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 단백질 D의 N-말단 부분 (상기 또는 본원에 기술된 바와 같음)이 종양 항원 또는 이의 면역원성 단편의 N-말단 또는 또 다른 부분에 융합된 융합 단백질을 제공한다. 더욱 특히, 단백질 D 단편과 종양 항원의 N-말단 또는 다른 부분과의 융합은 PRAME 또는 본원에 기술된 바와 같은 다른 종양 항원 또는 이의 유도체가 절제되었던 단백질 D의 C-말단-단편을 대체하도록 수행된다. 이와 같이, 단백질 D의 N-말단은 융합 단백질의 N-말단이 된다.
다른 융합 파트너 또는 이의 단편이 본 발명의 융합 단백질에 포함될 수 있거나, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 PRAME 항원 또는 이의 단편 또는 부분을 포함하는 구체예에서 본 발명의 단백질 D 엘리먼트를 대체할 수 있다. 다른 융합 파트너의 예는 하기를 포함한다:
ㆍ 인플루엔자 바이러스로부터의 비구조적 단백질, NS1 (헤마글루티닌) - 전형적으로, N 말단의 81개 아미노산이 사용되었으나, T-헬퍼 에피토프를 포함하기만 한다면 다른 단편이 사용될 수도 있다.
ㆍ N-아세틸-L-알라닌 아미다아제, 아미다아제 LYTA (lytA 유전자에 의해 코 딩됨 {Gene, 43 (1986) page 265- 272}), 예컨대, 잔기 178번에서 출발하는 C 말단부 예컨대, 잔기 188-305에서 발견된 Lyta 분자의 반복부를 합성하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된 LYTA.
C-LYTA 단편을 아미노 말단에서 함유하는 하이브리드 단백질의 정제는 문헌 [Biotechnology: 10, (1992) page 795-798]에 기술되어 있다.
본 발명의 융합 단백질은 친화성 태그 예를 들어, 5 내지 9 예컨대, 6 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 테일을 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 예를 들어, 단백질 D의 말단 부분 (예컨대, 단백질 D의 N-말단)에 위치할 수 있고/거나 PRAME 항원 또는 이의 유도체의 말단 부분, 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원 또는 이의 유도체에 융합될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 히스티딘 테일은 PRAME 항원 또는 이의 유도체, 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원 또는 이의 유도체의 말단부 예컨대, PRAME 항원 또는 이의 유도체 또는 본원에 기술된 바와 같은 종양 항원 또는 이의 유도체의 C-말단부에 위치할 것이다. 히스티딘 테일은 정제를 보조하는데 유리할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단백질을 엔코딩하는 핵산을 제공한다. 이러한 서열은 적합한 발현 벡터로 삽입될 수 있으며, DNA/RNA 백신화에 사용되거나 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 핵산을 발현하는 미생물 벡터는 백신으로서 이용될 수 있다. 이러한 벡터는 예를 들어, 폭스바이러스, 아데노바이러스, 알파바이러스, 리스테리아 (listeria) 및 모노파아지 (monophage)를 포함한다.
본 발명의 단백질을 엔코딩하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기법 예컨대, 문 헌 [D.M. Roberts et al in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098]에 기술된 효소 결찰, 화학 합성, 실험관내 효소 중합, 또는 예를 들어, 열 안정성 중합효소를 이용하는 PCR 기법, 또는 이들 기법의 조합을 이용하여 합성될 수 있다.
DNA의 효소적 중합화는 일반적으로 50㎕ 이하의 부피에서 10℃ 내지 37℃의 온도에서 필요에 따라 누클레오시트 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적합한 완충제중의 DNA 중합효소 예컨대, DNA 중합효소 I (클레노우 단편)을 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. DNA 단편의 효소적 결찰은 일반적으로 50㎕ 이하의 부피에서 4℃ 내지 실온의 온도에서 적합한 완충제 예컨대, 0.05M 트리스 (pH 7.4), 0.01M MgCl2, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스페르미딘, 1mM ATP 및 0.1mg/ml 소 혈청 알부민중의 DNA 리가아제 예컨대, T4 DNA 리가아제를 사용하여 수행될 수 있다. DNA 중합체 또는 단편의 화학 합성은 문헌 ['Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982)], 또는 기타 과학 문헌 예를 들어, [M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al, Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al, EMBO Journal, 1984, 3, 801]에 기술된 바와 같은 고체상 기법을 이용하여 통상적인 포스포트리에스테르, 포스파이트 또는 포스포로아미다이트 화학작용에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 공정은 문헌 [Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기술된 바와 같은 통상적인 재조합 기법에 의해 수행될 수 있다.
특히, 본 공정은
i) 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 복제가능한 또는 인테그레이션 발현 벡터를 제조하는 단계;
ii) 숙주 세포를 상기 벡터로 형질변환시키는 단계;
iii) 상기 DNA 중합체의 발현을 허용하여 상기 단백질을 생성시킬 수 있는 조건하에 상기 형질변환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
iv) 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
용어 "형질변환"은 외래 DNA의 숙주 세포로의 유입을 의미하는 것으로서 본원에 사용된다. 이는 예를 들어, 문헌 [Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and AJ. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에 기술된 바와 같은 통상적인 기법을 사용하여 적합한 플라스미드 또는 바이러스 벡터로의 예를 들어, 형질변환, 트랜스펙션 또는 감염으로 달성될 수 있다. 이하 용 어 "형질변환된" 또는 "형질변환체"는 대상 외래 유전자를 함유하고 발현하는 생성된 숙주 세포에 적용될 것이다.
발현 벡터는 신규하며, 본 발명의 일부를 형성한다.
복제가능한 발현 벡터는 숙주 세포와 양립가능한 벡터를 절단하여 본래의 레플리콘을 갖는 선형의 DNA 세그먼트를 제공하고, 상기 선형의 세그먼트와 함께 목적 단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 DNA 분자, 예컨대, 본 발명의 단백질 또는 이의 유도체를 엔코딩하는 DNA 중합체와 상기 선형 세그먼트를 결찰 조건하에서 조합시킴으로써 본 발명에 따라 제조될 수 있다.
이와 같이, DNA 중합체는 필요에 따라, 미리 형성되거나 벡터의 작제 동안 형성될 수 있다.
벡터의 선택은 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있으며, 일반적으로, E.coli 또는 CHO 세포일 수 있는 숙주 세포에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 적합한 벡터는 플라스미드 예를 들어, TMCP14 또는 pET21 또는 pET26, pcDNA3, 박테리오파아지, 코스미드 및 재조합 바이러스를 포함할 수 있다.
복제가능한 발현 벡터의 제조는 DNA의 제한, 중합화 및 결찰에 적합한 효소로 예를 들어, 상기 언급된 문헌 [Maniatis et al.]에 기술된 바와 같은 공정에 의해 통상적으로 수행될 수 있다.
재조합 숙주 세포는 형질변환 조건하에서 숙주 세포를 본 발명의 복제가능한 발현 벡터로 형질변환시킴으로써 본 발명에 따라 제조된다. 적합한 형질변환 조건은 통상적인 것이며, 예를 들어, 상기 언급된 문헌 [Maniatis et al.] 또는 문헌 ["DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 기술되어 있다.
형질변환 조건의 선택은 숙주 세포에 의해 결정된다. 따라서, 박테리아 숙주 예컨대, E.coli는 CaCl2 용액 (Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) 또는 RbCl, MnCl2, 칼륨 아세테이트 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리된 후, 3-[N-모르폴리노]-프로판-설폰산, RbC1 및 글리세롤로 처리될 수 있다. 배양물중의 포유동물 세포는 세포상으로 벡터 DNA의 칼슘 공동-침전에 의해 형질변환될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 복제가능한 발현 벡터로 형질변환된 숙주 세포로 확대된다.
DNA는 관련 숙주의 발현을 추가로 촉진하기 위한 표준 기법에 의해 최적화된 코돈일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 PRAME 항원 또는 이의 부분 또는 단편을 포함하는 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA가 제공되며, 여기서 PRAME 항원 또는 이의 부분 또는 단편의 누클레오티드 서열은 코돈-최적화된다. 일 구체예에서, 단백질 D 누클레오티드 서열은 코돈-최적화되지 않는다.
DNA 중합체의 발현을 허용하는 조건하에서 형질변환된 숙주 세포를 배양하는 것은 통상적으로 예를 들어, 상기 언급된 문헌 [Maniatis et al.] 및 문헌 ["DNA Cloning"]에 기술된 바와 같이 수행된다. 이와 같이, 바람직하게는, 세포는 영양소가 공급되고, 50℃ 미만의 온도에서 배양된다.
본 발명의 단백질은 원핵세포 또는 진핵세포 예컨대, 효모에서 발현될 수 있 으며, 종종 E.coli에서 발현될 수 있다. E.coli의 특정 균주, AR58 및 BLR DE3이 사용될 수 있다.
일반적으로, 예를 들어, 카나마이신 내성 또는 암피실린 내성의 선택 마커가 재조합 유전자/작제물의 발현 시스템으로의 성공적인 혼입 확인을 돕기 위해 혼입된다.
생성물은 숙주 세포 및 발현 생성물의 위치 (세포내 또는 배양 배지로 또는 원형질막 공간으로 분비됨)에 따라 통상적인 방법으로 회수된다. 본 발명의 일 구체예에서, 발현 생성물은 세포내 위치한다. 본 발명의 일 구체예에서, 발현 생성물은 불용성 단백질이다. 따라서, 숙주 세포가 박테리아 예컨대, E.coli인 경우, 이는 예를 들어, 물리적, 화학적 또는 효소적으로 용해되어, 생성된 용해물로부터 분리된 단백질 생성물일 수 있다. 숙주 세포가 포유동물인 경우, 생성물은 일반적으로 세포 비함유 추출물 또는 배양 배지로부터 분리될 수 있다. 통상적인 단백질 분리 기법은 선택 침전, 흡착 크로마토그래피, 및 모노클로날 항체 친화 칼럼을 포함한 친화 크로마토그래피를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 생성하는 방법으로서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 세포는 박테리아일 수 있다. 세포가 박테리아인 일 구체예에서, 박테리아는 E.coli일 수 있다. 본 발명의 공정은 불용성 단백질로서 세포에서 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 단계를 포함할 수 있다. 공정은 세포를 용해하고, 용해된 세포로부터 발현 된 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 방법 또는 공정에 의해 수득되거나 수득가능한 융합 단백질이 제공된다.
본 발명의 단백질은 액체 형태 또는 동결건조된 형태로 용해가능하게 제공된다.
일반적으로, 각 인간 용량은 단백질 1 내지 1000㎍, 바람직하게는, 30-300㎍을 포함할 것이다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제중에 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 약제 조성물 예컨대, 백신을 제공한다.
백신은 선택적으로, 하나 이상의 다른 종양-관련 항원 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 바람직하게는, 종양-관련 항원을 기재로 하는 다른 암 백신과 조합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 종양 관련 항원은 본원에 기술된 바와 같은 항원일 수 있고/거나 MAGE, LAGE 및 GAGE 패밀리 또는 WT-1에 속하는 일원일 수 있다. 일 구체예에서, 종양-관련 항원은 MAGE-A3 항원을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
백신 제조 방법은 문헌 [Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman MJ). (1995) Plenum Press New York)]에 일반적으로 기술되어 있다. 리포좀내로의 캡슐화는 플러톤 (Fullerton)에 의해 US 특허 4,235,877에 기술되어 있다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는 본 발명의 백신 제형중에 애주번트될 수 있다. 적합한 애주번트는 알루미늄 염 예컨대, 알루미늄 히드록시드 겔 (알룸) 또는 알루미늄 포스페이트를 포함할 수 있거나, 칼슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나, 아실화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드, 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다. 기타 공지된 애주번트는 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 CpG 디누클레오티드가 비메틸화됨을 특징으로 한다. 이러한 올리고누클레오티드는 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 96/02555에 기술되어 있다.
본 발명의 제형에서, 애주번트 조성물이 TH1 타입의 면역 반응을 우선적으로 유도하는 것이 바람직할 수 있다. 일 구체예에서, 예를 들어, 모노포스포릴 리피드 A, 바람직하게는, 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)과 알루미늄 염의 조합물을 포함하는 애주번트 시스템을 제공한다. 애주번트는 임의적으로, 또한, TH1 반응을 우선적으로 유도하는 CpG 올리고누클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 개선된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A 및 사포닌 유도체의 조합물, 특히 WO 94/00153에 기술된 바와 같은 QS21 및 3D-MPL의 조합물, 또는 예를 들어, WO 96/33739에 기술된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 켄칭되는 덜 반응성인 조성물을 포함한다.
예를 들어, 수중유 에멀션중의 QS21 3D-MPL & 토코페롤을 포함하는 본 발명의 제형에 사용될 수 있는 제형은 WO 95/17210에 기술되어 있다.
본 발명의 제형에 사용될 수 있는 또 다른 애주번트 제형은 예를 들어, 수중유 에멀션중의 또는 리포좀 제형으로서 QS21, 3D-MPL & CpG 또는 이의 등가물이다.
따라서, 본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 또는 융합 파트너 단백질과 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 애주번트를 포함하는 백신이 제공된다.
PRAME과 MAGE의 조합
본 발명의 일 구체예에서, (a) 본원에 기술된 바와 같은 PRAME 항원 또는 융합 단백질을 포함하는 항원 성분 및 (b) 본원에 기술된 바와 같은 MAGE 항원 또는 융합 단백질을 포함하는 항원 성분을 포함하는 조성물이 제공된다. 일 구체예에서, 조성물은 추가로 본원에 기술된 바와 같은 애주번트를 포함할 수 있다.
조합물에 사용하기 위한 MAGE 항원은 전장 MAGE 항원을 포함할 수 있다. 대안적으로, MAGE 항원은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 아미노산이 아미노산 서열로부터 결실되거나 치환될 수 있는 MAGE의 면역원성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 2개의 아미노산이 MAGE 서열의 N-말단으로부터 결실될 수 있다. 항원이 MAGE-A3 또는 이의 면역원성 부분인 본 발명의 일 구체예에서, MAGE-A3의 서열은 MAGE-A3의 아미노산 3 내지 314일 수 있다.
상기 기술될 조합물에 있어서, PRAME 및/또는 MAGE 항원중 어느 하나 또는 둘 모두는 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질 또는 단백질들의 일부일 수 있거나, 항원은 다른 융합 단백질중에 존재할 수 있거나 항원으로서 단독으로 존재할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 PRAME 항원 및 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 본원에 기술된 바와 같은 MAGE-A3 항원 및 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 대안적인 구체예에서, MAGE-A3 항원을 포함하는 융합 단백질은 MAGE-A3 항원 및 단백질 D의 처음 약 109개 아미노산을 포함하는 융합 파트너 단백질을 포함하거나 이들로 이루어지며, 여기서 단백질 D로부터의 1 또는 2개 이상의 아미노산이 임의적으로 치환되며, 단백질 D의 처음 109개 아미노산 이외에 단백질 D의 시그널 서열이 임의적으로 존재한다.
본 발명의 융합 단백질은 항원과 융합 파트너 단백질 또는 존재하는 경우, 항원과 His 테일의 서열 사이에 "링커"로서 하나 이상의 아미노산을 추가로 임의로 포함할 수 있다. 아미노산은 항원 및/또는 융합 파트너의 서열과 관련되지 않은 것일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질 서열의 N-말단부에서 아미노산 Met-Asp-Pro를 추가로 포함할 수 있다. Met 아미노산은 오리지날 단백질 D 서열로부터 유래될 수 있거나, 비관련된 서열로부터 유래될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 MAGE-A3 및 단백질 D를 포함하는 융합 단백질의 서열은 도 12에 도시되어 있으며, SEQ ID NO:43이다.
본 발명은 또한 상기 백신/조성물을 제조하는 방법에 까지 확대된다.
4개의 융합 작제물을 제조하였으며, 실시예/작제물 1, 2, 3, 및 4로서 본원에 언급될 것이다. 코돈 최적화된 작제물이 실시예 3으로부터 제조되었으며, 본원의 실시예 3a로서 나타내었다. 코돈 최적화된 작제물을 실시예 4로부터 제조하였 으며, 본원에서 실시예 4a로서 나타내었다.
실시예 3a 및 4a에서, 분자의 단백질 D 부분에 대한 서열은 동일하다. 그러나, PRAME 영역에서 특정 코돈이 발현을 추가로 증대시기키 위해 변형되었으며, 실시예 3a에서는, PRAME와 his 테일사이의 링커가 제거되었다.
표 A 실시예/작제물 1 내지 4의 융합 단백질 구조 및 플라스미드 세부사항
상기 실시예의 융합 단백질은 단백질 D의 아미노산 20-127을 포함한다. 아미노산 Met, Asp 및 Pro는 단백질 D 단편의 N-말단에 포함되었다 (즉, 아미노산 MDP-20-127 단백질 D). 이러한 3개의 추가적인 아미노산은 단백질의 안정도에 도움이 될 수 있으며/거나 이의 단백질 발현 수준을 증가시키는 것으로 여겨진다. 단백질 D의 아미노산 127번은 전장 PRAME의 N-말단에 융합된다 (즉, 단배질 D의 아미노산 127번은 PRAME의 N-말단에 융합된다). 정제를 돕기 위해 히스티딘 태그 테일은 6개 단백질중 3개에 포함되었다. 테일의 정확한 서열은 사용된 플라스미드에 의해 좌우된다.
3개의 상이한 유형의 플라스미드 TCMP13 및 pET21 또는 pET26을 작제하였다; 각각의 플라스미드에 있어서, 히스티딘 테일을 갖거나 갖지 않는 융합 단백질을 엔코딩하는 DNA이 포함되었다.
다른 언급이 없는 한, 하기 일반적 기법은 실시예 각각의 제조에 이용되었다.
TCMP14 벡터를 이용한 PD1/3-PRAME (His-태그를 갖거나 갖지 않음) 재조합 단백질의 생성을 위한 클로닝 기법
플라스미드 TCMP14에 존재하는 서열의 증폭은 3단계의 PCR 기법을 이용하여 수행하였다. 전체 단백질 D 유전자를 엔코딩하는 DNA 서열을 함유하는 벡터 pHIC348은 닥터. 에이. 포스그렌 (Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmoe General Hospital, Malmoe, Sweden)으로부터 수득하였다. 단백질 D의 DNA 서열은 존슨 등 (1991)에 의해 공개되었다 (Janson H, LO Heden, A Grubb, M Ruan, & A Forsgren. 1991. Infect Immun 59:119-125). 발현 벡터 pMG81은 pBR322의 유도체이며, 여기서 외래의 삽입된 유전자의 전사 및 번역을 위한 박테리오파아지 λ 유래된 조종 엘리먼트가 유입되었다 (Shatzman et al., 1983) {Shatzman A, YS Ho, & M Rosenberg. 1983. Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic NY}. 또한, 암피실린 저항 유전자는 카나마이신 내성 유전자로 교체되었다. NS1 단백질의 일부 (아미노산 4 내지 81)의 코딩 서열을 다중 클로닝 부위에 대해 치환하여 pMG81 MCS를 얻었다. 1/3 단백질 D (아미노산 20 내지 127)에 대한 코딩 서열을 BamHI 및 NcoI 제한 부위를 사용하여 pMG81 MCS로 클로닝하여 pMG81-1/3PD를 얻었다. 먼저, 단백질 D의 아미노산 20-127번에 상응하는 섹션의 PCR 증폭을 주쇄로서 pMG81-1/3PD 벡터 및 올리고누클레오티드 센스 (5' ATA TAA CAT ATG GAT CCA AGC AGC CAT TCA TCA AAT 3' (CAN008; SEQ ID NO:18)) 및 안티센스 (5' CCA CAA ACG CCT TCG TTC CAT GGT TTC AAA GTT TTC TGT C 3' (CAN037; SEQ ID NO: 19))를 사용하여 수행하였다.
루드빅 인스티튜트 (Ludwig Institute, Brussels, Belgium)로부터 수득된 PRAME cDNA를 pCDNA1 벡터 (Invitrogen)의 Bstx1-Not1 부위에 삽입하여 pCDNA-1-PRAME 재조합체 벡터를 생성시켰다. PRAME 단백질의 아미노산에 상응하는 섹션의 PCR 증폭을 주쇄로서 pcDNA-1-PRAME 벡터 (GSKBio) 및 올리고누클레오티드 센스 (5' GAC AGA AAA CTT TGA AAC CAT GGA ACG AAG GCG TTT GTG G 3' (CAN036; SEQ ID NO: 20)) 및 안티센스 (5' AGA GAG ACT AGT CTA GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3 ' (CAN029; SEQ IDNO: 21) 또는 5' GGA GGA ACT AGT GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3 ' (CAN002; SEQ ID NO: 22))를 사용하여, his-테일의 첨가 (CAN002) 비첨가 (CAN029) 여부에 따라 수행하였다. TCMP14 플라스미드에 삽입된 최종 PRAME 서열을, his-테일의 존재 (CAN002) 또는 비존재 (CAN029) 여부에 따라, 1/3PD 및 PRAME 유전자 주쇄 (이는 주쇄에 대한 예비 단계에서 생성되었음) 및 올리고누클레오티드 센스 (CAN008) 및 안티센스 (CAN029 또는 CAN002)를 사용한 PCR 증폭에 따라 수득하였다. 5' 말단에서의 NdeI 및 3' 말단에서의 SpeI 부위를 단편의 클로닝을 위해 TCMP14 벡터에 부가하였다.
pET21 벡터를 이용한 재조합 단백질 1/3PD-PRAME (His-태그를 갖거나 갖지 않음)의 발현을 위한 벡터 설계물의 작제
재조합 cDNA 플라스미스 소위, PRAME 유전자에 대한 코딩 서열을 함유하는 pcDNA1-PRAME (상기 방법에 기술된 바와 같음) 및 단백질 D 코딩 서열의 N-말단부를 함유하는 벡터 PGM81-1/3PD (상기 방법에 기술된 바와 같음)을 사용하였다. 클로닝 방법은 하기 단계를 포함한다.
a) 먼저, 분비 시그널 (분비 또는 시그널 서열)이 없는 1/3PD 서열을 올리고누클레오티드 센스 (5'AGAGAGCATATGAGCAGCCATTCATCAAATATGGCG (CAN040; SEQ ID NO: 22)), 및 안티센스 (5' ACGTGGGCGGCCGCGGTTTCAAAGTTTTCTGTCATTTCTAA (CAN032; SEQ ID NO: 23))를 사용하여 플라스미드 PMG81-1/3PD로부터 PCR 증폭하였다; 5' 말단부에 NdeI 및 3' 말단부에 Not1를 pET21b(+) 벡터로의 단편의 클로닝을 위해 부가시켰다.
b) PRAME 서열을 올리고누클레오티드 센스 (5' TTGTTGGCGGCCGCAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGT (CAN033; SEQ ID NO: 25)), 및 안티센스 (5' GGAGGACTCGAGGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN034; SEQ ID NO: 26))를 사용하여 플라스미드 pcDNA1-PRAME로부터 PCR 증폭하였다; 5' 말단부에 Not1 및 3' 말단부에 Xho1을 pET21b 벡터로의 단편의 클로닝을 위해 부가하였다. 이러한 증폭은 pET21b(+) 플라스미드에서 두개의 아미노산 Leu 및 Glu의 단백질의 C-말단에서의 첨가에 이어 6His 첨가를 유도하였다. His-태그가 없는 단백질 생성을 위해, 정지 코돈 (TAG)을 CAN033 및 CAN034 대신에 CAN033 및 CAN035 (안티센스: 5' GGAGGACTCGAGCTAGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN035; SEQ ID NO: XX))를 사용하여 PRAME 유전자의 3' 말단에 첨가하였다.
c) 상기 증폭된 단편을 pET21b(+) 플라스미드 (Invitrogen)으로 클로닝하였다.
d) 퀵체인지 II 부위 특이적 돌연변이유발 키트 (QuikChange II Site- Directed Mutagenesis Kit) (Stratagene) 및 올리고누클레오티드 센스 (5' CAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCG (CAN 106; SEQ ID NO: XX)), 및 안티센스 (5' cgccttcgttccatggtttcaaagttttctg (CAN107; SEQ ID NO: XX))를 사용하여 1/3PD 및 PRAME 사이의 Not1 부위를 제거하였다.
e) 돌연변이 유발 및 올리고누클레오티드 센스 (5' GGAGATATACATATGGATCCAAGCAGCCATTCATCAAATATGG (CAN 104; SEQ ID NO: XX)) 및 안티센스 (5' CCATATTTGATGAATGGCTGCTTGGATCCATATGTATATCTCC (CAN 105; SEQ ID NO: XX))를 사용함으로써 단백질 D 1/3의 N-말단의 1번 위치에서 Met 뒤에 두개의 아미노산 Asp 및 Pro를 첨가하였다.
pET26 벡터에서 코돈 최적화된 재조합 단백질 1/3PD-PRAME (His 태그 함유 또는 비함유)의 발현을 위한 벡터 설계물의 작제
PRAME 유전자를 코돈 최적화시키고, 최적화된 유전자의 5' 말단 및 3' 말단 각각에 Not1 및 Xho1 부위를 첨가하여 pGA4 백본에 클로닝하였다.
하기 단계를 이용하여 pET26 벡터에서 PD1/3과의 융합에 이러한 플라스미드 0606420pGA4를 사용하여 유전자를 클로닝하였다.
a) 0606420pGA4 플라스미드로부터의 유전자의 3' 말단에서 종료 코돈을 갖는 최적화된 PRAME 서열에 상응하는 Not1/Xho1 단편을 제거하였다.
b) 최적화된 PRAME 단편을 pET26b(+) 플라스미드로 클로닝시켰으며, 이러한 플라스미드는 상기 기술된 바와 같이 CNA040 및 CAN032 올리고누클레오티드, Nde1/Not1, 이전에 클로닝된 1/3PD를 함유하는 플라스미드이며, 여기서 Asp 및 Pro 아미노산은 CAN104 및 CAN105 올리고누클레오티드와의 돌연변이유발 방법에 의해 N-말단에 부가되었다.
c) 올리고누클레오티드 센스 (5' GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGTCGTCGTCTGTGG (CAN 123; SEQ ID NO: XX)) 및 안티센스 (5' CCACAGACGACGACGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC (CANl 24; SEQ ID NO: XX))로의 돌연변이유발에 의해 Not1 부위를 제거하였다. 이는 His-테일을 갖지 않는 1/3PD-PRAME 코돈 최적화된 융합 단백질을 생성시켰다.
d) 그 후, 플라스미드를 6 His 플라스미드와 코돈 최적화된 1/3PD-PRAME 생성을 위해 주쇄로서 사용하였다. 융합 단백질의 PCR 증폭은 올리고누클레오티드 센스 (5' GGAATTCCATATGGATCCAAGCAGCCATTC (CAN199; SEQ ID NO: XX)) 및 안티센스 (5' GGAGCTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCGGCATAAAGCACGGGC (CAN198; SEQ ED NO: XX))를 사용하여 수행하였다; pET26b(+) 벡터로의 단편의 클로닝을 위해 5' 말단에서의 Ndel 및 3' 말단에서의 Xho1을 6 His 및 종료 코돈 다음에 첨가하였다.
e) 인비트로겐으로부터 pET26b(+) 플라스미에서 증폭된 단편을 클로닝하였다.
융합 단백질의 생성에 있어서, DNA 작제물을 발현 벡터 TCMP14로 클로닝하였다. 이러한 플라스미드는 람다 파아지 DNA로부터의 시그널을 사용하여 삽입된 외래 유전자의 전사 및 번역을 유도한다. 벡터는 람다 PL 프로모터 PL, 오퍼레이터 OL 및 두개의 이용 부위 (NutL 및 NutR)을 함유하여 N 단백질이 제공되는 경우 전사적 극성 효과를 완화시킨다 (Gross et al., 1985. MoI. & Cell. Biol. 5:1015).
pD-PRAME 융합 단백질을 발현하는 플라스미드는 PRAME 아미노산이 이의 시그널 서열 (분비 또는 시그널 서열) (즉, 잔기 20-127)없이 pD의 108개 아미노산 유도체의 C-말단에 첨가되도록 설계하였다. 이러한 작제를 위해, 세개의 비관련 아미노산 (Met 및 Asp 및 프롤린)을 pD 유도체의 N-말단에 첨가하고, 특정 작제에 있어서는, PRAME 아미노산의 C-말단에 his 테일을 포함시켰다 (상기 표 A 참조). 이러한 작제물은 대안적으로, N-말단 Met가 pD 서열로부터 유래된 것으로 여겨지는 경우, pD의 109개 아미노산 유도체를 함유하는 것으로서 기술될 수 있다.
숙주 균주 및 형질변환
E.Coli 균주 AR58로부터의 숙주 (Mott et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol 82, pp 88-92, January 1985, Biochemistry)를 실시예/작제물 1 및 2에 대한 플라스미드 DNA로 형질변환시켰다.
실시예/작제물 1 및 2의 생성을 위해 사용된 AR58 용원성 (lysogenic) E.coli 균주는 표준 NIH E.coli K12 균주 N99의 유도체이다 (F-su-galK2, lacZ-thr-). 이는 결손 용원성 람다 파아지 (galE::TN10, 1 Kil-cI857 DH1)을 함유한다. Kil-표현형은 숙주 거대분자 합성의 차단을 억제한다. cI857 변이는 cI 억제제에 온도 민감성 병변을 부여한다. DH1 결실은 람다 파아지 라이트 오페론 및 숙주 bio, uvr3 및 ch1A 로커스를 제거한다. AR58 균주는 SA500 유도체에서 이미 성장한 P 람다 파아지 스톡으로 N99를 형질도입시켜 생성되었다 (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). N99로의 결손 리소겐 (lysogen)의 유입은 인접한 galE 유전자에서 테트라시클린 내성부를 코딩하는 TN10 트랜스포존의 존재에 의해 테트라시클린으로 선택하였다. N99 및 SA500은 네셔널 인스티튜트 오브 헬스 (National Institutes of Health)의 닥터 마틴 로젠버그 실험실 (Dr. Martin Rosenberg's laboratory)로부터 유래된 E.coli K12 균주이다.
PL 프로모터를 함유하는 벡터는 E.coli 용원성 숙주로 유입되어 플라스미드 DNA를 안정화시킨다. 용원성 숙주 균주는 게놈으로 삽입된 복제-결함 람다 파아지 DNA를 함유한다 (Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NY). 람다 파아지 DNA는 cI 억제제 단백질의 합성을 유도하는데, 이는 벡터의 OL 억제제에 결합하고 RNA 중합효소의 PL 프로모터로의 결합을 억제하여, 삽입된 유전자의 전사를 억제한다. 발현 균주 AR58의 cI 유전자는 PL 유도된 전사가 온도 조정에 의해 조절되도록, 즉, 배양 온도를 증가시켜 억제제를 불활성화시켜 외래 단백질의 합성을 개시하도록 온도 민감성 변이부를 함유한다. 이러한 발현 시스템은 외래 단백질 특히, 세포에 독성일 수 있는 외래 단백질의 합성을 제어할 수 있다 (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).
E.coli 균주 BLR (DE3) Novagen, WI, USA (catalogue number: 69053-4) BLR (DE3) Novagen, WI, USA (catalogue number: 69053-4)의 숙주 BLR은 BL21의 recA - 유도체이며, 이는 플라스미드 단량체 수율을 증대시키고, 반복 서열을 함유하는 표적 플라스미드의 안정화를 도울 수 있거나 이의 생성물은 DE3 프로파아지 (1,2)의 손실을 초래할 수 있으며, 실시예/작제물 3 및 4로부터의 플라스미드 DNA로 형질변환되었다.
각각의 형질변환은 CaCl2-처리된 세포를 이용한 표준 방법에 의해 수행될 수 있다 (Hanahan D. ≪ Plasmid transformation by Simanis. ≫ In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135).
박테리아 숙주 균주의 성장 및 유입
ㆍ 배양
박테리아를 20ml의 루리아-버타니 (Luria-Bertani) (LB) 브로쓰 (BD) + 1% (w/v) 글루코오스 (라보라토리 MAT (Laboratorie MAT), 카탈로그 넘버: GR-0101) + 항생제 (pET21b에 있어서, 카르베니실린 (Carbenicillin) 100㎍/ml, TCMP14에 있어서 카나마이신 40㎍/ml)에서 성장시켰다. 배양물을 AR58 세포에 있어서는 33℃에서, BLR (DE3) 세포에 있어서는 37℃에서 O.D.600nm가 약 0.8이 될 때까지 인큐베이 션시켰다.
ㆍ 유입
O.D.600nm 약 0.8에서, 배양물 BLR (DE3)을 1mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG; EMD 케미칼스 인크. (EMD Chemicals Inc.), 카탈로그 넘버: 5815)에서 인큐베이션시키고, 37℃에서 2시간 또는 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 그러나, 더 낮은 온도를 이용하는 경우 안정도를 증가시킬 수 있다.
O.D.600nm 약 0.8에서, 배양물 AR58을 37℃에서의 열 활성화에 의해 유도하고 7시간 동안 인큐베이션하였다.
두 발현 시스템에 있어서 박테리아가 충분히 성장하였다.
ㆍ 단백질의 추출 및 정제
배양물중의 폴리펩티드의 발현시, 세포를 원심분리에 의해 전형적으로 채집하고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴시키고 (발현된 폴리펩티드가 배지로 분비되지 않는 경우), 생성된 미정제 추출물을 관심 폴리펩티드를 분리한채 유지시켰다. 버그버스트 프로테인 익스트렉션 리에이젼트 (BugBusterTM Protein Extraction Reagent)을 공급업자 (Novagen)에 의해 권고된 조건하에 사용하였다.
PD1/3-Prame-his 단백질 정제
E.coli 세포 페이스트를 20mM Tris 완충액 pH8.5에 재현탁시킨 후, 균질화 시스템 (Panda from Niro Soavi S.p.A. - 2회 - 750 bar)를 통해 통과시켰다. 2mM MgCl2 및 벤조나아제 (50 U/ml)의 첨가 후, 균질화물을 완만한 교반하에서 실온에서 (RT)에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 30분 동안 15900g 및 RT에서 원심분리하였다. 생성된 펠렛을 1% 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 및 60mM 글루타티온을 함유하는 20mM Tris 완충액 pH 8.5에서 재현탁시키고, RT에서 완만한 교반하에 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 동안 15900g 및 RT에서 원심분리 후, 펠렛을 버렸다.
원심분리 상청액을 6.66M 우레아, 0.333M 염화나트륨 (NaCl) 및 11.11mM 이미다졸을 함유하는 20mM 트리스 완충액에 희석시킨 후, 0.1% SDS, 6.0M 우레아, 0.3M NaCl 및 10mM 이미다졸을 함유하는 20mM 트리스 완충액 pH 8.5에 균질화된 니켈 이온 금속 친화성 칼럼 (IMAC 세파로오스 6 FF - GE 헬스케어)상에서 크로마토그래피 분리하였다. 칼럼을 0.5% 사르코실, 6.0M 우레아, 0.3M NaCl 및 10mM 이미다졸을 함유하는 20mM 트리스 완충액 pH 8.5로 세척한 후, 이미다졸의 농도를 동일한 세척 완충액으로 40mM 까지 증가시킴으로써 항원을 칼럼으로부터 용출시켰다. 인산염을 50mM까지 첨가한 후, 항원 양성 용출물을 50mM 인산염, 0.5% 사르코실, 6.0M 우레아 및 0.3M NaCl을 함유하는 20mM 트리스 완충액 pH 8.5중에 균질화된 마크로-프렙 세라믹 히드록시아파타이트 타입 II 칼럼 (Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite type II column (Bio-Rad))를 통해 통과시켰다. 항원을 함유하는 히드록시아파타이트 유통물 (flow-through)을 오메가 30 kDa 멤브레인 (Pall)상에서 3.15% 수크로오스를 함유하는 5mM 보레이트 완충액 pH 9.8에 대해 초여과시켰다. 초여과 투석유물을 0.45/0.22㎛ 셀룰로오스 아세테이트 멤브레인 (Satorius)을 통한 여과에 의해 멸균시켰다. 정제된 물질을 -70℃에서 저장하였다.
하기 단계에서 상기 공정과 상이한 대안적인 정제 공정을 이용하였다:
- 벤조나아제를 처리하지 않음
- SDS로부터 IMAC 칼럼상의 사르코실로 이동시키지 않음 (추출부터 HA 단계까지 SDS)
- 초여과에 사용된 완충액은 5mM 트리스 완충액 pH 8.5 - 0.5M 아르기닌이다.
이러한 대안적인 정제 공정은 약 0.05 내지 0.085%의 잔여값으로 불완전 SDS 제거를 유도하였다.
ㆍ 정제
발현된 재조합 단백질을 수지 제조업자의 설명에 따라 His-Bind 금속 킬레이트화 수지 (QIAgen, Chatsworth, CA)를 사용하여 유도된 E.coli의 원심분리 후 수득된 상청액 분획으로부터 정제하였다.
단백질의 특징화
SDS-페이지:
Gel: NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 1.0mm 15 또는 26 웰 (Invitrogen catalog number: NP0323BOX)
하기 도 1 및 2 참조하길 바라며, 이는 각각 실시예 3과 4 및 3a와 4a의 SDS 페이지 분석을 나타내며, 여기서 his-태그를 갖거나 갖지 않는 상이한 재조합체 1/3pD-PRAME 단백질은 ~70KDa의 명백한 분자량으로 겔상에서 이동한다. 재조합 단백질은 유도 후 E coli 세포 용해물에서 봉입체로서 발견되었다.
샘플 제조물, 완충액 및 이동 상황은 공급업자 (Invitrogen)에 의해 권고된 조건에 따라 수행되었다. 10㎕의 모든 제조물을 (유입전 (BI) 및 유입후 (AI)) 100㎕의 배양 등가물에 상응하도록 웰에 로딩하였다.
도 1 설명: 재조합 pET21로 형질변환된 E.coli BLR DE3 균주의 IPTG 유입 후 재조합 1/3PD-PRAME의 코마시에-블루 염색 후 SDS 페이지 분석. 25, 30 또는 37℃에서 1mM IPTG를 BLR DE3 균주에 유입하고 2시간 후 100㎕ 등량의 배양물을 겔상에 로딩하였다. 클론 #3 (1/3PD-PRAME/pET21) 및 클론 #4 (1/3PD-PRAME-His/pET21)은 가용성 (상청액) 및 불용성 (펠렛) 분획물중의 유입 전 (BI) 및 유입 후 (AI) 겔상에 존재한다. 레인 1 및 10: 스탠다드 브로드 레인지 프레스테인 (Standard Broad Range prestain) (BioRad Cat#161-0318), 레인 2 (클론 #3, BI, 상청액), 레인 3 (클론 #3, BI, 펠렛), 레인 4 (클론 #3, AI, 25℃, 상청액), 레인 5 (클론 #3, AI, 25℃, 펠렛), 레인 6 (클론 #3, AI, 30℃, 상청액), 레인 7 (클론 #3, AI, 30℃, 펠렛), 레인 8 (클론 #3, AI, 37℃, 상청액), 레인 9 (클론 #3, AI, 37℃, 펠렛), 레인 11 (클론 #4, BI, 상청액), 레인 12 (클론 #4, BI, 펠렛), 레인 13 (클론 #4, AI, 25℃, 상청액), 레인 14 (클론 #4, AI, 25℃, 펠렛), 레인 15 (클론 #4, AI, 30℃, 상청액), 레인 16 (클론 #4, AI, 30℃, 펠렛), 레인 17 (클론 #4, AI, 37℃, 상청액), 레인 18 (클론 #4, AI, 37℃, 펠렛).
도 2 설명: 재조합 pET26으로 형질변환된 E.coli BLR DE3 균주의 IPTG 유입 후 재조합 1/3PD-PRAME의 코마시에-블루 염색후 SDS 페이지 분석. 25, 30 또는 37℃에서 1mM IPTG를 BLR DE3 균주에 유입하고 2시간 후 100㎕ 등량의 배양물을 겔상에 로딩하였다. 클론 #3 (코돈 최적화된 1/3PD-PRAME/pET26) 및 클론 #4 (코돈 최 적화된 1/3PD-PRAME-His/pET26)은 가용성 (상청액) 및 불용성 (펠렛) 분획물중의 유입 전 (BI) 및 유입 후 (AI) 겔상에 존재한다. 레인 2 및 10: 스탠다드 브로드 레인지 프레스테인 (BioRad Cat#161-0318), 레인 1 (클론 #3a, BI, 상청액), 레인 3 (클론 #3a, BI, 펠렛), 레인 4 (클론 #3a, AI, 25℃, 상청액), 레인 5 (클론 #3a, AI, 25℃, 펠렛), 레인 6 (클론 #3a, AI, 3O℃, 상청액), 레인 7 (클론 #3a, AI, 30℃, 펠렛), 레인 8 (클론 #3a, AI, 37℃, 상청액), 레인 9 (클론 #3a, AI, 37℃, 펠렛), 레인 11 (클론 #4a, BI, 상청액), 레인 12 (클론 #4a, BI, 펠렛), 레인 13 (클론 #4a, AI, 25℃, 상청액), 레인 14 (클론 #4a, AI, 25℃, 펠렛), 레인 15 (클론 #4a, AI, 30℃, 상청액), 레인 16 (클론 #4a, AI, 30℃, 펠렛), 레인 17 (클론 #4a, AI, 37℃, 상청액), 레인 18 (클론 #4a, AI, 37℃, 펠렛).
웨스턴 블롯
멤브레인을 3% 밀크/PBS 1X 프레쉬 용액을 사용하여 37℃, 60RPM에서 30분 동안 차단하였다. 차단 인큐베이션 후, 37℃, 60RPM에서 1시간 동안 3% 밀크/PBS 1X 프레쉬 용액중에, 일차 항체 (래빗 항-PRAME; GSK Biologicals SA)를 1:5000 희석비로 첨가하거나, α-6X His 태그 (AbCam)를 1:3000 희석비로 첨가하였다. 그 후, 멤브레인을 0.02% 트윈20/PBS 1X를 사용하여 실온에서 5분 동안 3회 세척하였다. 이차 항체를 3% 밀크/PBX 1X 프레쉬 용액을 이용하여 1:20000 희석비로 첨가하였다 (퍼옥스 동키 항-IgG (H+L) 래빗 (Jackson laboratory)). 그 후, 멤브레인을 0.02% 트윈20/PBS 1X를 사용하여 실온에서 5분 동안 3회 세척한 후, 공급업자의 권고에 따라 멤브레인을 퍼옥시다아제 기질 (KH2PO4, 10mM; (NH4)2SO4, 10mM; O-디아니시딘, 0.01% & 과산화수소 0.045%) 또는 알칼리성 포스파타아제 기질 (Sigma Fast)에 노출시켰다.
분자 분석:
실시예/작제물 1
실시예/작제물 2
실시예/작제물 3
실시예/작제물 4
실시예 5
융합 단백질에서 단백질 D 1/3의 분비 시그널 (분비 또는 시그널 서열)을 갖거나 갖지 않는 단백질 생성 평가
표 B
| 단백질 | 발현 수준 |
| 분비 시그널이 있는 PD1/3-PRAME | + |
| 분비 시그널이 없는 PD1/3-PRAME | +++ |
도 11: 재조합 pET21로 형질변환된 E.coli BL21 DE3 균주의 IPTG 유입 후 분비 시그널이 있거나 없는 재조합 1/3PD-PRAME의 코마시에-블루 염색후 SDS 페이지 분석. 37℃에서 1mM IPTG를 BL21 DE3 균주에 유입하고 3시간 후 100㎕ 등량의 배양물을 겔상에 로딩하였다. 이들 작제물은 가용성 (상청액) 및 불용성 (펠렛) 분획물중의 유입 전 (BI) 및 유입 후 (AI) 겔상에 존재한다. 레인 1: 스탠다드 브로 드 레인지 프레스테인 (BioRad Cat#161-0318), 레인 2 (pD1/3-PRAME + SS, BI, 상청액), 레인 3 (pD1/3- PRAME + SS, BI, 펠렛), 레인 4 (pD1/3-PRAME + SS, AI, 상청액), 레인 5 (pD1/3- PRAME + SS, AI, 펠렛), 레인 6 (pD1/3-PRAME + SS + His, BI, 상청액), 레인 7 (pD1/3-PRAME + SS + His, BI, 펠렛), 레인 8 (pD1/3-PRAME + SS + His, AI, 상청액), 레인 9 (pD1/3-PRAME + SS + His, AI, 펠렛), 레인 10 (pD1/3-PRAME w/o SS, BI, 상청액), 레인 11 (pD1/3-PRAME w/o SS, BI, 펠렛), 레인 12 (pD1/3-PRAME w/o SS, AI, 상청액), 레인 13 (pD1/3-PRAME w/o SS, AI, 펠렛), 레인 14 (pD1/3- PRAME w/o SS + His, BI, 상청액), 레인 15 (pD1/3-PRAME w/o SS + His, BI, 펠렛), 레인 16 (pD1/3-PRAME w/o SS + His, AI, 상청액), 레인 17 (pD1/3-PRAME w/o SS + His, AI, 펠렛).
실시예 6: AS01B 또는 AS15에서 제형화된 PD-PRAME-His의 면역원성: 일정량의 애주번트중의 항원 용량 범위
목적: 임상전 실험에 사용하기 위한 최상의 용량을 선택하기 위한 항원 용량 범위
프로토콜:
0일 및 14일에 근내 (IM) 주입한 6군의 12 CB6F1 마우스:
1. PBS
2. AS01B 또는 AS15중의 PRAME (50*㎍)
3. AS01B 또는 AS15중의 PRAME (10㎍)
4. AS01B 또는 AS15중의 PRAME (2㎍)
5. AS01B 또는 AS15중의 PRAME (0.4㎍)
6. AS01B 또는 AS15중의 PRAME (0.08㎍)
* 의도된 용량 50㎍ 대신에 44.7㎍이 실제적으로 투여됨
AS01B는 QS21 및 3D-MPL을 포함하는 리포좀 애주번트 제형이다; AS15는 QS21, 3D-MPL 및 CpG를 포함하는 리포좀 애주번트 제형이다.
본 실시예에 사용된 작제물은 5mM 트리스 완충액 pH 8.5 - 0.5M 아르기닌중에 제공된 실시예/작제물 3a (His 테일을 갖는 pET26)이다. 수크로오스와 보레이트 완충액에 제공된 단백질이 또한 사용될 수 있다.
판독:
ㆍ 1㎍/ml/펩티드 (15-mer)의 펩티드 PRAME의 풀로 비장 세포 (군당 3마리 마우스의 4개 풀)의 실험관내 재자극 후 2회 주입 후 14일 세포내 사이토킨 염색 (ICS).
CD4 반응 (AS01B 애주번트)
AS01B 애주번트에 대한 CD4 사이토킨에 대한 ICS의 결과는 도 3에 도시되어 있다. 본 실험에서, 이러한 조건하에서 AS01B에서 CD4 반응을 유도하기 위한 최상의 PRAME 항원의 용량은 2㎍인 것으로 결론내려질 수 있다.
CD8 반응 (AS01B 애주번트)
AS01B 애주번트에 대한 CD8 사이토킨에 대한 ICS의 결과는 도 4에 도시되어 있다. 데이타는 반응 내부-그룹의 매우 낮은 CD8 반응 및 불균일성을 나타내는 것으로 보인다.
CD4 반응 (AS15 애주번트)
AS15 애주번트에 대한 CD4 사이토킨에 대한 ICS 결과는 도 5에 도시되어 있다. 이들 데이타는 유사한 CD4 반응이 AS15에서 제형화된 44㎍, 10㎍, 2㎍ 및 0.4㎍의 PRAME로 유도된 것과 유사한 것으로 나타났으며; 0.08㎍ PRAME로 유도된 반응은 저하되었다.
CD8 반응 (AS15 애주번트)
AS15 애주번트에 대한 CD8 사이토킨에 대한 ICS의 결과는 도 6에 도시되어 있다. 이들 데이타는 CD8 반응을 나타내지 않는 것으로 보인다 (PBS 그룹에서 배경).
실시예 7
요약하면, 본원에 기술된 발명에 있어서, 하기 요약이 지금까지 생성되었던 PD1/3-PRAME의 기술된 특이적 작제물에 사용될 수 있다:
PD1/3-PRAME에 사용된 작제물
- 단백질 D의 시그널 서열이 포함되지 않았다 (단백질 D의 아미노산 2 내지 19).
- 단백질 D의 메티오닌이 포함되었다 (단백질 D의 AA 1).
- 2개의 비관련된 AA (Asp 및 Pro)가 단백질 D의 아미노산 2-Lys 및 3-Leu에 대해 치환되었다.
- 단백질 D의 시그널 서열 후 단백질 D의 처음 109개 AA이 포함되었다 (단백질 D의 N-말단의 처음 Met + AA20 내지 127을 포함하는 109개 아미노산).
- PRAME의 AA 1-509가 포함되었다 (PRAME의 전장 오리지날 서열)
- 하기중 하나로 이루어진 His 테일을 갖거나 갖지않음:
ㆍTCMP14 플라스미드에서 클로닝하기 위한 3개의 비관련된 아미노산 (Thr, Ser 및 Gly) + 6 His 잔기; 또는
ㆍ pET21 플라스미드에서 클로닝하기 위한 2개의 비관련된 아미노산 (Leu 및 Glu) + 6 His 잔기; 또는
ㆍ pET26 플라스미드에서 클로닝하기 위한 6 His 잔기.
pD1/3 - PRAME +/- His 테일 단백질:
본 발명의 작제물의 예의 마킹된 아미노산 서열은 도 7에 도시되어 있다.
하기 작제물 정렬은 도 8, 9 및 10에 도시되어 있다:
LipoD-MAGE3-His와 D1/3-PRAME-His 사이의 정렬 (도 8)
헤모필루스 인플루엔자로부터의 오리지날 단백질 D와 LipoD-MAGE3-His의 공유된 서열의 정렬 (도 9)
헤모필루스 인플루엔자로부터의 오리지날 단백질 D, LipoD-MAGE3-His 및 pD1/3-PRAME-His의 공유된 서열의 정렬 (도 10)
융합 단백질을 이용한 백신 제조물의 제형화:
본 발명의 융합 단백질은 애주번트 처리되거나 처리되지 않은 백신으로 제형화될 수 있다. 일 구체예에서, 애주번트로서, 제형은 유/수 에멀션중의 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)와 QS21의 혼합물을 포함할 수 있다. 애주번트 시스템 SBAS2는 WO95/17210에 이미 기술되어 있다. 본 발명에 사용하기 위한 애주번트는 대안적으로, 수중유 제형 또는 리포좀 제형중에 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL), QS21 및 CpG를 포함할 수 있다.
3D-MPL: 그람-네거티브 박테리아 살모넬라 미네소타의 리포폴리사카라이드 (LPS)로부터 유래된 면역자극제이다. MPL은 데아실화되었으며, 리피드 A 부분상에 포스페이트 기가 결여되어 있다. 이러한 화학적 처리는 독성을 현저하게 저하시키면서 면역자극제 특성을 보존시킨다 (Ribi, 1986).
다양한 비히클과 조합된 3D-MPL은 세포성 면역의 TH1 타입 및 체액성 면역 둘 모두를 강하게 증강시킬 수 있다.
QS21: 사우스 아메리카 나무 퀼리야 사포나리아 몰리나의 껍질로부터 추출된 천연 사포닌 분자이다. 껍질의 미정제 추출물로부터 개별적인 사포닌을 분리하기 위해 개발된 정제 기법으로 특정 사포닌, 즉 트리테르펜 글리코시드인 QS21의 분리가 가능하며, 이는 어미 성분과 비교할 경우 더욱 강한 애주번트 활성 및 더 낮은 독성을 나타낸다. QS21은 MHC 클래스 I 제한된 CTL을 활성화시켜 수개의 서브유닛 Ag를 자극할 뿐만 아니라, Ag 특이적 림프구 증식을 자극하였다 (Kensil, 1992).
체액성 및 TH1 타입 세포성 면역 반응 둘 모두의 유도시 MPL과 QS21의 조합은 상승작용적 효과를 나타내는 것으로 여겨진다.
유/수 에멀션은 2개의 오일 (토코페롤 및 스쿠알렌)로 이루어진 유기상과 에멀션화제로서 트윈 80을 함유하는 PBS의 수성상을 포함한다. 에멀션은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 0.4% 트윈 80을 포함하며, 180nm의 평균 입자 크기를 가지며, SB62로서 공지되어 있다 (WO 95/17210 참조). 생성된 오일 소적은 약 180nm의 크기를 가진다.
본 발명에 사용하기 위한 애주번트는 유/수 에멀션 또는 리포좀 제형중에서 MPL과 QS21의 조합물로서 제형화될 수 있다. 이러한 제조물은 0.7ml의 바이알로 전달되어 동결건조된 항원 또는 융합 단백질과 혼합된다 (30 내지 300㎍의 항원을 함유하는 바이알).
면역자극 올리고누클레오티드가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 애주번트 또는 백신에 사용하기 위한 예시적인 올리고누클레오티드는 3개 이상, 더욱 종종 6개 이상의 누클레오티드에 의해 분리되는 2개 이상의 디누클레오티드 CpG 모티프를 일반적으로 함유하는 CpG 함유 올리고누클레오티드를 포함한다. CpG 모티프는 시토신 누클레오티드에 이어서 구아닌 누클레오티드가 위치한다. CpG 올리고누클레오티드는 전형적으로 데옥시누클레오티드이다. 일 구체예에서, 올리고누클레오티드내의 누클레오티드 사이에는 포스포로디티오에이트, 또는 더욱 바람직하게는, 포스포로티오에이트 결합이 존재하며, 포스포디에스테르 및 그밖의 누클레오티드간 결합이 본 발명의 범위내에 포함된다. 혼합된 누클레오티드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드는 본 발명의 범위내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생성하는 방법은 US5,666,152, US5,278,302 및 WO95/26204에 기술되어 있다.
올리고누클레오티드의 예는 하기와 같다:
서열은 포스포로티오에이트 변형된 누클레오티드간 결합을 함유할 수 있다.
대안적인 CpG 올리고누클레오티드는 상기 하나 이상의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 이들은 중요치 않은 결실 또는 첨가를 갖는다.
CpG 올리고누클레오티드는 당해분야에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP 468520 참조). 편리하게는, 이러한 올리고누클레오티드는 자동화된 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 애주번트 조합물은 하기 성분중 하나 이상을 포함한다: 3D-MPL 및 QS21 (EP 0671 948 B1); 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀션 (WO 95/17210, WO 98/56414); 또는 그 밖의 담체로 제형화된 3D-MPL (EP 0 689 454 B1). 본 발명에 사용될 수 있는 다른 애주번트 시스템은 US6558670 및 US6544518에 기술된 바와 같은 3D-MPL, QS21 및 CpG 올리고누클레오티드의 조합물을 포함한다.
최종 백신은 동결건조된 제형의 재구성 후 수득될 수 있다.
참조:
SEQUENCE LISTING
<110> GlaxoSmithKline Biologicals SA
<120> Vaccine
<130> VB62293
<150> 0700760.2
<151> 2007-01-15
<150> 0701262.8
<151> 2007-01-23
<160> 45
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 1887
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MDP- 20-127 - Protein D - PRAME - TSGHHHHHH
(plasmid TCMP14)
<400> 1
atggatccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60
attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120
cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt 180
cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240
ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300
caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360
attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420
gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480
agggagctct tcccgccact cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 540
aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc tgcctccctc tgggagtgct gatgaaggga 600
caacatcttc acctggagac cttcaaagct gtgcttgatg gacttgatgt gctccttgcc 660
caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720
caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780
gaagcagctc agcccatgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag 840
cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc tcaaggaagg tgcctgtgat 900
gaattgttct cctacctcat tgagaaagtg aagcgaaaga aaaatgtact acgcctgtgc 960
tgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020
gtgcagctgg actctattga agatttggaa gtgacttgta cctggaagct acccaccttg 1080
gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg attaatctgc gtagactcct cctctcccac 1140
atccatgcat cttcctacat ttccccggag aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200
tctcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag gctctctatg tggactcttt atttttcctt 1260
agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320
actaactgcc ggctttcgga aggggatgtg atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1380
cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 1440
caagctctgc tggagagagc ctctgccacc ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg 1500
atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctga gccactgctc ccagcttaca 1560
accttaagct tctacgggaa ttccatctcc atatctgcct tgcagagtct cctgcagcac 1620
ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag 1680
gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcatgccag gctcagggag 1740
ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtctggctta gtgccaaccc ctgtcctcac 1800
tgtggggaca gaaccttcta tgacccggag cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac 1860
actagtggcc accatcacca tcaccat 1887
<210> 2
<211> 629
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MDP- 20-127 - Protein D - PRAME - TSGHHHHHH
(plasmid TCMP14)
<400> 2
Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
100 105 110
Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser Met
115 120 125
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro
145 150 155 160
Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
180 185 190
Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe
195 200 205
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His
225 230 235 240
Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val
260 265 270
Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu Val
275 280 285
Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser
290 295 300
Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys
305 310 315 320
Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys Met
325 330 335
Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 365
Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr
385 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 415
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly
435 440 445
Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser Val
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser
515 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu
545 550 555 560
Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 585 590
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
595 600 605
Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Thr Ser Gly His
610 615 620
His His His His His
625
<210> 3
<211> 1860
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MDP- 20-127 - Protein D - PRAME - no His tail
(plasmid TCMP14)
<400> 3
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caggaggttc gccccaggag gtggaaactt caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720
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<210> 4
<211> 620
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MDP- 20-127 - Protein D - PRAME - no His tail
(plasmid TCMP14)
<400> 4
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165 170 175
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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(plasmid pET21)
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caggacttct ggactgtatg gtctggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780
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50 55 60
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
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100 105 110
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Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro
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Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 170 175
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 365
Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr
385 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 415
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly
435 440 445
Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser Val
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser
515 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu
545 550 555 560
Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 585 590
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
595 600 605
Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn
610 615 620
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu
1 5
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
1 5
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN008
<400> 18
atataacata tggatccaag cagccattca tcaaat 36
<210> 19
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN037
<400> 19
ccacaaacgc cttcgttcca tggtttcaaa gttttctgtc 40
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN036
<400> 20
gacagaaaac tttgaaacca tggaacgaag gcgtttgtgg 40
<210> 21
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN029
<400> 21
agagagacta gtctagttag gcatgaaaca ggggcacag 39
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN002
<400> 22
ggaggaacta gtgttaggca tgaaacaggg gcacag 36
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN040
<400> 23
agagagcata tgagcagcca ttcatcaaat atggcg 36
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN032
<400> 24
acgtgggcgg ccgcggtttc aaagttttct gtcatttcta a 41
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN033
<400> 25
ttgttggcgg ccgcaatgga acgaaggcgt ttgtggggt 39
<210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN034
<400> 26
ggaggactcg aggttaggca tgaaacaggg gcacag 36
<210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN035
<400> 27
ggaggactcg agctagttag gcatgaaaca ggggcacag 39
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN106
<400> 28
cagaaaactt tgaaaccatg gaacgaaggc g 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN107
<400> 29
cgccttcgtt ccatggtttc aaagttttct g 31
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN104
<400> 30
ggagatatac atatggatcc aagcagccat tcatcaaata tgg 43
<210> 31
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN105
<400> 31
ccatatttga tgaatggctg cttggatcca tatgtatatc tcc 43
<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN123
<400> 32
gacagaaaac tttgaaacca tggaacgtcg tcgtctgtgg 40
<210> 33
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN124
<400> 33
ccacagacga cgacgttcca tggtttcaaa gttttctgtc 40
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense oligonucleotide CAN199
<400> 34
ggaattccat atggatccaa gcagccattc 30
<210> 35
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense oligonucleotide CAN19
<400> 35
ggagctctcg agtcagtggt ggtggtggtg gtggttcggc ataaagcacg ggc 53
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunostimulatory oligonucleotide CpG 1826
<400> 36
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunostimulatory oligonucleotide CpG 1758
<400> 37
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 38
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunostimulatory oligonucleotide CpG2006
<400> 38
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 54
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunostimulatory oligonucleotide CpG1668
<400> 39
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 40
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> immunostimulatory oligonucleotide CpG5456
<400> 40
tcgacgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 41
<211> 127
<212> PRT
<213> Haemophilus influenzae b
<400> 41
Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr
115 120 125
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1-Met; 2-Asp; 3-Pro; followed by AA 20 to 127 of
Protein D
<400> 42
Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr
100 105 110
<210> 43
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein D-MAGE-A3-His
<400> 43
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
115 120 125
Asp Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu Glu
130 135 140
Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr
145 150 155 160
Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thr
165 170 175
Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser Pro
180 185 190
Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser
195 200 205
Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr
210 215 220
Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val
225 230 235 240
Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro
245 250 255
Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr
260 265 270
Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val
275 280 285
Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr Ile
290 295 300
Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn
305 310 315 320
Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile Ile
325 330 335
Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu Leu
340 345 350
Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp
355 360 365
Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu
370 375 380
Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp
385 390 395 400
Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His
405 410 415
Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His
420 425 430
Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu Gly Gly His His His His His
435 440 445
His His
450
<210> 44
<211> 109
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> the aa from protein D from Haemophilus influenzae
for use in a pD1/3-PRAME-His sequence
<400> 44
Met Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys Ser Asp
1 5 10 15
Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Leu
35 40 45
Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His
50 55 60
Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His
65 70 75 80
Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr
100 105
<210> 45
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> the aa from protein D from Haemophilus influenzae
for use in a pD1/3-MAGE-His sequence
<400> 45
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
65 70 75 80
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr
115 120 125
Claims (35)
- (a) PRAME 또는 이의 면역원성 단편, 및(b) 단백질 D로부터 유래된 이종의 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질로서,상기 융합 파트너 단백질이 단백질 D로부터의 분비 서열 또는 시그널 서열을 포함하지 않는 융합 단백질.
- 단백질 D로부터 유래된 융합 파트너 단백질로서, 융합 파트너 단백질이 융합 단백질 서열의 N-말단에서 또는 N-말단 이내에서 아미노산 Met-Asp-Pro를 포함하며, 단백질 D의 분비 서열 또는 시그널 서열을 포함하지 않는 융합 파트너 단백질.
- 제 2항에 있어서, 단백질 D 서열은 단백질 D의 대략적으로 또는 정확히 아미노산 17번 내지 127번, 18번 내지 127번, 19번 내지 127번 또는 20번 내지 127번을 포함하거나 이로 구성되는 융합 파트너 단백질.
- 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 단백질 D 융합 파트너 단백질로부터의 하나 이상의 아미노산이 치환에 의해 결실되거나 대체되는 융합 파트너 단백질.
- 제 4항에 있어서, 아미노산이 보존적 치환에 의해 치환되는 융합 파트너 단 백질.
- 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 아미노산이 치환되는 융합 파트너 단백질.
- 제 2항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 D의 분비 서열 또는 시그널 서열이 대략적으로 천연 단백질의 대략적으로 아미노산 1번 내지 16번, 17번, 18번 또는 19번를 나타내는 융합 파트너 단백질.
- 제 2항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, 단백질 D의 분비 또는 시그널 서열이 단백질 D의 N-말단 19개 아미노산인 융합 파트너 단백질.
- 제 2항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질.
- 제 2항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 융합 파트너 단백질 및 하나 이상의 종양 항원 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 융합 단백질.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 종양 항원 PRAME 또는 이의 면역원성 부분을 포함하는 융합 단백질.
- 제 1항 또는 제 11항에 있어서, PRAME의 면역원성 단편 또는 부분이 하기 에피토프중 하나 이상을 포함하거나 이들로 구성되는 융합 단백질:VLDGLDVLL (PRA100-108; SEQ ID NO:XX);SLYSFPEPEA (PRA142-151; SEQ ID NO:XX);ALYVDSLFFL (PRA300-309; SEQ ID NO:XX);LYVDSLFFL (PRA301-309; SEQ ID NO:XX) 및SLLQHLIGL (PRA425-433; SEQ ID NO:XX).
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 하기 종양 항원 또는 종양 항원 유도체 또는 이의 면역원성 부분중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질:MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, MAGE B1, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE C1, MAGE C2.
- 제 13항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산이 MAGE 항원의 아미노산 서열로부터 결실되거나 치환될 수 있는 융합 단백질.
- 제 14항에 있어서, 2개의 아미노산이 MAGE 서열의 N-말단으로부터 결실되는 융합 단백질.
- 제 13항 내지 제 15항중의 어느 한 항에 있어서, 항원이 MAGE-A3 또는 이의 면역원성 부분이며, 여기서 MAGE-A3 항원은 MAGE-A3의 아미노산 3 내지 314를 포함하거나 이로 구성되는 융합 단백질.
- 제 10항에 있어서, 종양 항원 또는 이의 유도체가 하기 항원중 하나 또는 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 면역원성 부분으로부터 선택되는 융합 단백질: WT-1, WT-1F, BAGE, LAGE 1, LAGE 2 (NY-ESO-1로서 공지됨), SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, P501S (프로스테인 (prostein)으로서 공지됨), HASH1, HASH2, 크립토 (Cripto), B726, NY-BR1.1, P510, MUC-1, 프로스타아제 (Prostase), STEAP, 티로시나아제 (tyrosinase), 텔로머라아제 (telomerase), 수르비빈 (survivin), CASB616, P53, 및/또는 Her-2/neu, SSX-2; SSX-4; SSX-5; NA17; MELAN-A; P790; P835; B305D; B854; CASB616 (WO00/53748); CASB7439 (WO01/62778); C1491; C1584; 및 C1585.
- 제 1항 또는 제 9항 내지 17중 어느 한 항에 있어서, 친화성 태그 (affinity tag)를 추가로 포함하는 융합 단백질.
- 제 1항 또는 제 10항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너 단백질과 종양 항원 또는 이의 면역원성 부분 사이; 및/또는 융합 파트너 단백질과 His 테일 (tail) 또는 기타 친화성 태그 사이; 및/또는 종양 항원 또는 이의 면역원성 부분과 His 테일 또는 다른 친화성 태그 사이에 하나 이상의 링커 서열을 추가로 포함하는 융합 단백질.
- 제 1항 내지 제 19항중의 어느 한 항에 따란 청구된 융합 단백질 또는 융합 파트너 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열.
- 제 20항에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
- 제 21항에 따른 벡터로 형질변환된 숙주 세포.
- 제 1항 내지 제 19항중의 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 융합 파트너 단백질 또는 제 20항에 따른 핵산 또는 제 21항에 따른 벡터를 함유하는 백신.
- 제 23항에 있어서, 애주번트 (adjuvant), 및/또는 면역자극성 사이토킨 (cytokine) 또는 케모킨 (chemokine)을 추가로 포함하는 백신.
- 제 24항에 있어서, 애주번트가 3D-MPL, QS21 및/또는 CpG 올리고누클레오티 드를 포함하는 백신.
- 제 23항 내지 제 25항중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 백신.
- 암 환자를 면역치료학적으로 치료하기 위한 백신의 제조시 본원에 청구된 바와 같은 단백질 또는 핵산 또는 벡터의 용도.
- 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 따른 융합 파트너 단백질을 포함하는 융합 단백질을 세포에서 발현시키는 단계를 포함하여, 융합 단백질을 생성하는 방법.
- 제 28항에 있어서, 세포가 박테리아인 방법.
- 제 29항에 있어서, 박테리아가 E.coli인 방법.
- 제 28항 내지 제 30항중의 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 불용성 단백질로서 세포에서 발현되는 방법.
- 제 31항에 있어서, 세포를 용해시키고, 용해된 세포로부터 발현된 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 28항 내지 제 32항중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되거나 수득가능한 융합 단백질.
- 본원에 청구된 바와 같은 단백질, 핵산, 벡터 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하여 암 환자를 치료하는 방법.
- 제 27항 또는 제 34항에 있어서, 암이 흑색종, 유방암, 방광암, 폐암 예컨대, NSCLC, 육종, 난소암, 두경부암, 신장암, 대장선암 (colorectal carcinoma), 다발골수종, 급성 백혈병을 포함하는 백혈병 및 식도암종으로부터 선택되는 용도 또는 방법.
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