EA016326B1 - Вакцина - Google Patents

Вакцина Download PDF

Info

Publication number
EA016326B1
EA016326B1 EA200900795A EA200900795A EA016326B1 EA 016326 B1 EA016326 B1 EA 016326B1 EA 200900795 A EA200900795 A EA 200900795A EA 200900795 A EA200900795 A EA 200900795A EA 016326 B1 EA016326 B1 EA 016326B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
agd
yee
rgo
run
azr
Prior art date
Application number
EA200900795A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200900795A1 (ru
Inventor
Норман Блэйс
Денис Мартин
Реми М. Палмантье
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39300029&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA016326(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from GB0700760A external-priority patent/GB0700760D0/en
Priority claimed from GB0701262A external-priority patent/GB0701262D0/en
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200900795A1 publication Critical patent/EA200900795A1/ru
Publication of EA016326B1 publication Critical patent/EA016326B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001189—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли PRAME (также известного как DAGE), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Т-хелперов, таким как, например, белок D из Haemophilus influenzae В, к белкам-партнерам слияния, содержащим фрагменты белка D, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний.

Description

Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли РКАМЕ (антиген, преимущественно экспрессирующийся в меланоме) (также известного как ИАСЕ), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Т-хелперов, таким как, например, белок И из НаеторЫ1и8 шПиепхае В, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний, включая, без ограничения, меланому, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легкого, такой как Ы8СЕС (немелкоклеточный рак легкого), саркому, рак яичника, рак в области головы и шеи, рак почки, колоректальную карциному, множественную миелому, лейкоз, включая острый лейкоз, и карциному пищевода.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к белкам-партнерам слияния, содержащим производные белка И, и к способам их получения.
Среди разных групп антигенов, ассоциированных с опухолями, раково-тестикулярные антигены представляют интерес для иммунотерапии благодаря их широкой опухолеспецифичной экспрессии и благодаря тому, что эти антигены обычно не экспрессируются в здоровых клетках. К настоящему времени описано более 50 раково-тестикулярных антигенов, и для многих из них были идентифицированы эпитопы, распознаваемые Т-лимфоцитами. РКАМЕ является раково-тестикулярным антигеном и исследуется в качестве потенциального иммунотерапевтического средства.
При иммунотерапии раковый антиген вводят пациенту обычно в виде вакцины, например вакцины, содержащей антиген в виде белка или его иммуногенного фрагмента, или в виде ДНК, кодирующей белок, или в виде вектора, содержащего указанную ДНК, который стимулирует иммунную систему пациента атаковать опухоли, экспрессирующие тот же самый антиген.
Если стимулируется соответствующий ответ, то Т-лимфоциты (Т-клетки) непосредственно атакуют антигены и обеспечивают контроль иммунного ответа. Развиваются В-клетки и Т-клетки, которые специфичны к одному типу антигена. Когда иммунная система подвергается воздействию другого антигена, образуются другие В-клетки и Т-клетки. По мере развития лимфоцитов они обычно учатся распознавать собственные ткани организма (свое) как отличающиеся от тканей и частиц, которые обычно не встречаются в организме (чужое). Как только В-клетки и Т-клетки образовались, некоторые из этих клеток будут размножаться и обеспечивать память иммунной системы. Это дает возможность иммунной системе отвечать быстрее и более эффективно в следующий раз, когда она подвергнется воздействию того же самого антигена.
Некоторые эксперименты указывают на то, что раково-тестикулярные антигены могут стимулировать механизмы памяти в иммунной системе.
Выдвинута гипотеза, что РКАМЕ вовлечен в гибель клеток или в клеточные циклы. Было показано, что он экспрессируется в меланоме и в различных опухолях, включая опухоли легкого, почки и в области головы и шеи. Интересно то, что он, по всей вероятности, также экспрессируется в 40-60% случаев лейкоза, такого как острый лимфоидный лейкоз и острый миелоидный лейкоз (см., например, Ехр. Нета1о1. 2000 Иее.; 28(12):1413-22). У пациентов наблюдалась сверхэкспрессия РКАМЕ, которая, по всей вероятности, связана с более высокой выживаемостью и с меньшими показателями рецидивов по сравнению с пациентами, у которых нет сверхэкспрессии данного белка.
Данный антиген и его получение описаны в патенте США № 5830753.
РКАМЕ находится в аннотированной базе данных человеческих генов Н-Ιην ИВ под инвентарными номерами И65011.0, ВС022008.1, АК129783.1, ВС014974.2, СК608334.1, АЕ025440.1, СК591755.1, ВС039731.1, СК623010.1, СК611321.1, СК618501.1, СК604772.1, СК456549.1 и СК620272.1.
Белок И представляет собой поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 шПиепхае В. Информацию по иммунологическим партнерам слияния, имеющим происхождение от белка И, можно получить в ЖО 91/18926.
Иногда получают слитые белки из участка антигена и гетерологичного партнера слияния для увеличения иммуногенности данного антигена, и/или для облегчения продуцирования белка в подходящих количествах, и/или для очистки (см., например, ЖО 99/40188), где описан слитый белок МАСЕ и, например, белок И, поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тПиеп/ае В. Слитый белок получают рекомбинантно, и в слитый белок может быть включена секреторная последовательность белка И для потенциального содействия секреции и солюбилизации конечного продукта.
- 1 016326
Краткое описание
Фиг. 1 Анализ 808-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) конструкции 3 и 4.
Фиг. 2 Анализ 808-РАСЕ конструкции За и 4а.
Фиг. 3 Ответ СО4 (адъювант А801 В)
Фиг. 4 Ответ Οϋ8 (адъювант А801В - 20070499)
Фиг. 5 Ответ СО4 (адъювант А815)
Фиг. 6 Ответ Οϋ8 (адъювант А315)
Фиг. 7 Размеченная аминокислотная последовательность примеров конструкций по настоящему изобретению
Фиг. 8 Выравнивание между 1_ίροΟ-ΜΑΟΕ3-Ηϊδ (8ЕО Ю N0:43) и ΡΟ1/3-ΡΚΑΜΕ-ΗΪ8 (8ЕО Ю N0:10)
Фиг. 9 Выравнивание между общей последовательностью исходного белка ϋ из Наетор11Ииз 1'пНиепгае (8ЕО Ю N0:45) и ЫроО-МАСЕЗ-Н|5 (8ЕО Ю N0:43)
Фиг. 10 Выравнивание между общей последовательностью исходного белка ϋ из НаеторНПиз /пЛиепгае (8Е0 Ю N0:41), ρϋ-ΜΑΟΕ3-ΗΪ5 (8ΕΩ Ю N0:45) и конструкцией ρΟΙ/3-ΡΡΑΜΕ-Ηίδ, которая не включает аминокислоты 2-Ώ и 3-Р (8Е0 Ю N0:44)
Фиг. 11 Анализ 808-РАСЕ ρϋ1/3-ΡΙ4ΑΜΕ с или без сигнала секреции (88) и Ηΐδ-хвоста (Ηίδ) в векторе рЕТ21.
Фиг. 12 Последовательность белка 0 1/3 ΜΑΘΕ3-Α3-Ηϊδ (8Е0 Ю N0:44)
Конструкция 1 ΜϋΡ-20-127 - Белок ϋ - РРАМЕ - Т8СНННННН
- 2 016326
(Пример 1) (плазмида ТСМР14) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 1; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 2)
Конструкция 2 (Пример 2) ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида ТСМР14) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 3; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 4)
Конструкция 3 (Пример 3) ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РПАМЕ - 1_ЕНННННН (плазмида рЕТ21) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 5; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 6)
Конструкция 4 (Пример 4) ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида рЕТ21) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 7; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 8)
Конструкция За (Пример За) ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РРАМЕ - НННННН (плазмида рЕТ26) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 9; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 10)
Конструкция 4а (Пример 4а) ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида рЕТ26) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 11; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 12)
Последовательность 1 (8ΕΩ ΙΩ N0: 1) представляет собой последовательность ДНК для Примера 1
Последовательность 2 (8ΕΩ ΙΩ N0: 2) представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 1
Последовательность 3 (8ΕΩ ΙΩ N0: 3) представляет собой последовательность ДНК для Примера 2
Последовательность 4 (8ΕΩ ΙΩ N0: 4) представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 2
Последовательность 5 (8ΕΩ ΙΩ N0: 5) представляет собой последовательность ДНК для Примера 3
- 3 016326
Последовательность 6 (8ΕΩ Ю N0: 6) Последовательность 7 (8ΕΩ Ю N0: 7) Последовательность 8 (8Е0 Ю N0: 8) Последовательность 9 (8Е0 Ю N0: 9) Последовательность 10(8ΕΟΙΟΝΟ: 10) Последовательность (8Е0 Ю N0: 11) Последовательность (8Е0 Ю N0: 12) (8Е0 Ю N0: 13) (8Е0 Ю N0: 14) (8Е0 Ю N0: 15) (8ΕΩ Ю N0: 16) (8Е0 Ю N0: 17) 8Е0 Ю N0: 18-35 представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 3 представляет собой последовательность ДНК для Примера 4 представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 4 представляет собой последовательность ДНК с оптимизированными кодонами для Примера За представляет собой аминокислотную последовательность для Примера За представляет собой последовательность ДНК с оптимизированными кодонами для Примера 4а представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 4а УЮОЮУкк (РКА100'108)
ЗкУбРРЕРЕА (РКА142'151) АкУУОЗкРРк (ρρΑ3ϋϋ'3υ9) кУУОЗкРРк (РКАзи™) ЗккОНЫСк (РКА426'433) Олигонуклеотиды, использованные в примерах по настоящему изобретению
ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826;)
8Е0 Ю N0: 36
8Е0 Ю N0: 37 ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758)
8Е0 Ю N0: 38 АСС САТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС АСС
8Е0 Ю N0: 39
8Е0 Ю N0: 40
8Е0 Ю N0:41
8ΕΩ Ю N0: 42
8Е0 Ю N0: 43
8ΕΩ Ю N0: 44 тсс тсс ттт тот сет ттт стс етт (СрС 2006)
ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668)
ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456) от АК (аминокислота) 1 до 127 Белка ϋ из НаеторМиз /пЛиепгае
-Ме1; 2-Азр; З-Рго; с последующими АК 20-127 Белка ϋ
Аминокислотная последовательность белка ϋ 1/3 МАСЕ-АЗ-Ηϊβ
Аминокислоты из Белка ϋ из НаеторРПиз ΐηίΙυβηζβΘ для применения в последовательности рО1/3-РКАМЕΗΪ5
8Е0 Ю N0:45
Аминокислоты из белка ϋ из НаеторМиз /пЛиепгае для применения в последовательности рО1/3-МАСЕΗΪ3
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен слитый белок, содержащий:
а) РКЛМЕ или его иммуногенный фрагмент и
б) гетерологичный партнер слияния, имеющий происхождение от белка Ό, где указанный слитый белок не включает в себя секреторную последовательность (сигнальную последовательность) белка Ό.
Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, как описано здесь, имеющий происхождение от белка Ό, в котором белок-партнер слияния не включает в себя секреторную последовательность или сигнальную последовательность белка Ό.
Согласно настоящему изобретению предложен также слитый белок, как описано здесь, и его антиген или фрагмент.
Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка Ό, в котором белок-партнер слияния содержит или состоит из аминокислот 20-127 белка Ό. В одном из воплощений настоящего изобретения одна или более аминокислот из белка-партнера слияния белка Ό, как описано здесь, может быть удалена или может быть заменена заменой. Аминокислоты могут быть заменены консервативными заменами, как определено здесь, или могут быть использо
- 4 016326 ваны другие аминокислоты. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот.
Белок-партнер слияния белка I), как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать делеции или вставки в аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью белка Ώ дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот.
В контексте этой заявки термины секреторная последовательность, или сигнальная последовательность, или сигнал секреции белка Ώ относятся к приблизительно аминокислотам 1-16, 17, 18 или 19 встречающегося в природе белка. В одном из воплощений секреторная или сигнальная последовательности или сигнал секреции белка I) относятся к Ν-концевым 19 аминокислотам белка Ώ. В настоящем описании изобретения термины секреторная последовательность, или сигнальная последовательность, или сигнал секреции используются взаимозаменяемо.
Белок-партнер слияния по настоящему изобретению может содержать остаточный полноразмерный белок I) или может содержать приблизительно остаточную Ν-концевую треть белка Ώ. Например, остаточная Ν-концевая треть белка Ώ может содержать приблизительно или примерно аминокислоты 20-127 белка Ώ. В одном из воплощений последовательность белка Ώ для использования в настоящем изобретении содержит аминокислоты 20-127 белка I). В другом воплощении настоящее изобретение включает или состоит из любой из последовательностей, начиная с любой из следующих аминокислот последовательности белка Ώ: 17, 18, 19, 20, 21 или 22 и заканчивая любой из следующих аминокислот последовательности белка I): 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
В контексте данного описания под остаточным(ой) подразумевается последовательность белка белка Ώ без секреторной или сигнальной последовательности, как описано здесь.
В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент, производное белка I) по настоящему изобретению содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, более конкретно аминокислоты 20-127. В альтернативном воплощении настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент, белок I) содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, в которой используются 109 Ν-концевых аминокислот белка Ώ. В одном из воплощений настоящего изобретения часть белка Ώ не включает в себя секреторную последовательность данного белка. В одном из воплощений настоящего изобретения производное белка I) является нелипидизированным.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена конструкция белка I), как описано здесь, в виде белка-партнера слияния. Данная конструкция белка Ώ может представлять собой белокпартнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей конструкцию РЕАМЕ или МАОЕ А3, как описано здесь, или может представлять собой белок-партнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей другой раковый антиген или любой другой антиген.
Представляется, что для слитых белков, содержащих РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент и белок I), или для слитых белков, содержащих белок Ώ, или для белка-партнера слияния, содержащего белок I), присутствие секреторной последовательности (или сигнальной последовательности) может вредно влиять на количество продуцированного слитого белка.
РЕАМЕ.
В одном аспекте слитый белок по настоящему изобретению содержит белок-партнер слияния, как описано здесь, и антиген РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент. Обычно белок РЕАМЕ имеет 509 аминокислот, и в одном из воплощений могут быть использованы все 509 аминокислот РЕАМЕ. На РЕАМЕ было идентифицировано несколько эпитопов цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ), например νΐ_ΟΘΙ_θνΐ± (РКА100'108; 5ΕΩ Ю N0:13);
8Ι_Υ8ΕΡΕΡΕΑ (РКА142’151; 8ΕΩ Ю N0:14); ΑΙ_Υν08Ι_ΕΕ1_ (РВА300’309: 8ЕО Ю N0:15); Ι_Υν08Ι_ΕΕΙ_ (РВА301'309; 8ΕΩ Ю N0:16) и ЗНОНЫСЬ (РВА425’433; 8ΕΩ Ю N0:17).
Обычно желательно включать в антиген как можно больше этих эпитопов для генерации сильного иммунного ответа и чтобы антиген был как можно более иммуногенным. Хотя существует возможность компенсировать пониженную иммуногенность данной конструкции за счет использования препарата с мощным иммунологическим адъювантом. Сильные адъюванты более подробно обсуждаются ниже.
В одном аспекте данного изобретения предложен участок РЕАМЕ слитого белка, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полноразмерного белка.
Тем не менее, данное изобретение также распространяется на конструкции РЕАМЕ с консервативными заменами. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот. Конструкция РЕАМЕ, как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать в аминокислотной последовательности делеции или вставки по сравнению с последовательностью РЕАМЕ дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или боль
- 5 016326 ше аминокислот.
Консервативные замены общеизвестны и обычно установлены по умолчанию в виде оценочных матриц в компьютерных программах выравнивания последовательностей. Эти программы включают РАМ250 (Наукой М.О. е! а1., (1978), А то!е1 οί еуоЫюпагу сйапдез ΐη рго1етз, Ιη Айаз οί Рго!ет зернепсе ап! зйисШге 5(3) М.О. Наукой (ей.), 345-352), \аОопа1 Вютей1са1 Еезеагсй Еоипйайоп, ХСазЬтд1оп и В1озит 62 (81еуеп Неткой ап! ,1ог|а О. Неткой (1992), Атто асМ зиЪзШийоп та!лсез Йот рго!ет Ыоскз) Ргос. N11. Аса!. 8ск ϋ8Α 89 (Вюсйет1з1гу): 10915-10919.
В общепринятом понимании замены в пределах указанных ниже групп представляют собой консервативные замены, но замены между группами считаются неконсервативными. Эти группы следующие:
1) аспартат/ аспарагин/ глутамат/глутамин,
2) серин/треонин,
3) лизин/аргинин,
4) фенилаланин/тирозин/триптофан,
5) лейцин/изолейцин/валин/метионин,
6) глицин/аланин.
Обычно последовательность/аминокислоты РЕАМЕ, используемые в слитых белках по изобретению, более чем на 80%, например на 85, 90, 95 и более конкретно на 99% идентичны природному РЕАМЕ. Однако специалистам в данной области известно, что аминокислотные остатки, образованные в результате процесса клонирования, могут сохраняться в рекомбинантно синтезированных белках. Если они не оказывают вредного влияния на характеристики продукта, то удалять или не удалять их является необязательным.
В одном аспекте изобретения предложен слитый белок, как описано здесь, включающий, состоящий из или по существу состоящий из полноразмерного белка РЕАМЕ. В другом аспекте часть РЕАМЕ слитого белка по настоящему изобретению включает, состоит или по существу состоит из одного или более из следующих эпитопов:
νΐ_ΟΟΙ_ϋνΐ_Ι_ (РКА100'108; 8ΕΩ Ю N0:13); δίΥδΕΡΕΡΕΑ (РКА142’151; 8ΕΩ Ю N0:14); ΑΙ_ΥνθδΙ_ΡΕΙ_ (РКА300'309; δΕΟ Ю N0:15); 1_Υνθδ!_ΕΕΙ_ (РКА301’309; δΕΩ Ю N0:16) и бИОНИбк (РВА425'433; δΕΩ Ю N0:17).
Слитые белки
В другом воплощении настоящего изобретения в слитом белке, как он описан здесь, можно использовать опухолевый антиген, отличающийся от РЕАМЕ или в дополнение к РЕАМЕ. В одном из воплощений предложен слитый белок, содержащий белок-партнер слияния, как он описан здесь, и один или более из следующих опухолевых антигенов, или производных опухолевых антигенов, или их иммуногенных участков, которые способны направлять иммунный ответ на данный антиген: антиген МАОЕ, например антиген МАОЕ А, такой как МАОЕ 1, МАОЕ 2, МАОЕ 3, МАОЕ 4, МАОЕ 5, МАОЕ 6, МАОЕ 7, МАОЕ 8, МАОЕ 9, МАОЕ 10, МАОЕ 11, МАОЕ 12. Эти антигены известны также как МАОЕ А1, МАОЕ А2, МАОЕ А3, МАОЕ А4, МАОЕ А5, МАОЕ А6, МАОЕ А7, МАОЕ А8, МАОЕ А9, МАОЕ А10, МАОЕ А11 и/или МАОЕ А12 (семейство МАОЕ А). В одном из воплощений может быть использован антиген из одного или двух других семейств МАОЕ: группа МАОЕ В и группа МАОЕ С. Семейство МАОЕ В включает МАОЕ В1 (также известный как МАОЕ Хр1 и ЭАМ 10), МАОЕ В2 (также известный как МАОЕ Хр2 и ЭАМ 6), МАОЕ В3 и МАОЕ В4, семейство Маде С в настоящее время включает МАОЕ С1 и МАОЕ С2.
Антиген МАОЕ для использования в настоящем изобретении может содержать полноразмерный антиген МАОЕ. Альтернативно, антиген МАОЕ может содержать иммуногенный участок МАОЕ, в котором 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из Ν-конца последовательности МАОЕ. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой МАОЕ А3 или его иммуногенный участок, последовательность МАОЕ А3 может состоять из аминокислот 3-314 МАОЕ А3.
В еще одном воплощении опухолевый антиген или его производное для использования в настоящем изобретении может представлять собой РЕАМЕ, ВАОЕ, ЕАОЕ 1, ЕАОЕ 2 (также известный как ΝΥЕ8О-1), 8АОЕ, НАОЕ, ХАОЕ, Р8А, РАР, Р8СА, Р5018 (также известный как простеин), НА8Н1, НА8Н2, Спр1о, В726, NΥ-ВЕ1.1, Р510, МиС-1, простазу, 8ТЕАР, тирозиназу, теломеразу, сурвивин, СА8В616, Р53 и/или Нег-2/пеи, или их иммуногенный участок, который способен направлять иммунный ответ на данный антиген.
В другом воплощении данного изобретения опухолевый антиген может включать или состоять из одного из следующих антигенов или его иммуногенного участка, который способен направлять иммун
- 6 016326 ный ответ на антиген: 88Х-2; 88Х-4; 88Х-5; ΝΑ17; МЕ1.АХ-А; Р790; Р835; Β305Ό; В854; СА8В618 (как описано в \\'О 00/53748); СА8В7439 (как описано в \\'О 01/62778); С1491; С1584 и С1585.
В одном из воплощений антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из Р5018. Р5018, также называемый простеином (Хи е! а1., Сапсег Век. 61, 2001, 1563-1568), известен как 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 113 в \УО 98/37814 и представляет собой белок из 553 аминокислот. Его иммуногенные фрагменты и участки, содержащие по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 заменимых аминокислот, как раскрыто в патентной заявке, ссылка на которую приведена выше, могут быть использованы в слитых белках по настоящему изобретению. Предпочтительные фрагменты раскрыты в \УО 98/50567 (антиген Р8108) в качестве белка, ассоциированного с раком простаты (8ΕΟ ΙΌ NΟ: 9 \УО 99/67384). Другими предпочтительными фрагментами являются аминокислоты 51553, 34-553 или 55-553 полноразмерного белка Р5018.
В одном из воплощений антиген может содержать или состоять из ^Т-1, экспрессируемого геном опухоли Вильма, или его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген, или Ν-концевого фрагмента ^Т-1Е, содержащего примерно или приблизительно аминокислоты 1249 фрагмента ЭД'Т-Е
В еще одном воплощении антиген может содержать или состоять из антигена, экспрессируемого геном Нег-2/пеи, или его фрагмента либо его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген. В одном из воплощений антиген Нег-2/пеи может представлять собой один из слитых белков, описанных в \УО 00/44899.
Антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из слитого белка Нег-2/пеи ΕΟΩ-ΙΟΩ. имеющего также название ΈΟΌ-ΙΟΩ или слитый белок ΕΟΩ-ΙΟΩ. который относится к слитому белку (или его фрагментам), содержащему внеклеточный домен (или его фрагменты) и внутриклеточный домен (или его фрагменты) белка НЕВ-2/пеи. В одном из воплощений этот слитый белок ЕСП-КП не включает в себя значительный участок трансмембранного домена НЕВ-2/пеи или вообще не включает в себя трансмембранный домен НЕВ-2/пеи.
В другом воплощении антиген может содержать или состоять из слитого белка НЕВ-2/пеи ЕСЭРО, имеющего также название ЕСЭ-РЭ или слитый белок ЕСЭ-РЭ, или слитый белок НЕВ-2/пеи ЕСО-АРЭ, также называемый ЕСЭ-АРЭ или слитый белок ЕСЭ-АРЭ, который относится к слитым белкам (или их фрагментам), содержащим внеклеточный домен (или его фрагменты) и домен фосфорилирования (или его фрагменты, например АРЭ) белка НЕВ-2/пеи. В одном из воплощений слитые белки ЕСЮ-РЭ и ЕСЭ-АРЭ не включают в себя значительную часть трансмембранного домена НЕВ-2/пеи или вообще не включают в себя трансмембранный домен НЕВ-2/пеи.
Слитые белки антигена РВАМЕ и белка-партнера слияния белка Ό, как описано здесь, могут быть химически конъюгированными, но они предпочтительно экспрессируются в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка РВАМЕ в системе экспрессии по сравнению с одним РВАМЕ без партнера слияния, такого как белок Ό или модифицированные белки белка Ό.
Дополнительно или альтернативно, описанные здесь опухолевые антигены и белок-партнер слияния по настоящему изобретению могут быть химически конъюгированными или могут экспрессироваться в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка РВАМЕ или другого опухолевого антигена в системе экспрессии по сравнению с одним РВАМЕ или одним другим опухолевым антигеном без партнера слияния, такого как белок Ό или модифицированные белки белка Ό.
Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и опухолевым антигеном или его иммуногенным участком, или между белком-партнером слияния и Нщ-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует), или между опухолевым антигеном или его иммуногенным участком и Н18-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует). Аминокислоты в линкерных последовательностях могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния.
Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Ме1-Акр-Рго на Ν-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Ме! может иметь происхождение от последовательности исходного белка Ό или может иметь происхождение от неродственной последовательности.
Партнер слияния может содействовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высокими выходами, чем нативный рекомбинантный белок. Белок Ό-партнер слияния благодаря его чужеродной природе может быть особенно иммуногенным ίη νίνο и может содействовать слитому белку, содержащему РВАМЕ или другой опухолевый антиген, предоставляя эпитопы Т-хелперов, предпочтительно эпитопы Т-хелперов, распознаваемые Т-клетками 0Ό4. Считается, что такие Т-клетки 0Ό4 могут вносить вклад в генерацию благоприятного иммунного ответа, в частности ответа цитолитических Т-клеток 0Ό8.
В одном из воплощений партнер слияния может действовать и как партнер, усиливающий экспрес
- 7 016326 сию, и как иммунологический партнер слияния.
В одном аспекте данного изобретения предложен слитый белок, где Ν-концевой участок белка Ό (как описано выше или здесь) слит с Ν-концом РКАМЕ или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка Ό и Ν-концом РКАМЕ осуществляется так, что РКАМЕ заменяет Сконцевой фрагмент белка Ό, который был вырезан. Таким образом, Ν-конец белка Ό становится Νконцом слитого белка.
В другом аспекте изобретения предложен слитый белок, где Ν-концевой участок белка Ό (как описано выше или здесь) слит с Ν-концом или с другим участком опухолевого антигена или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка Ό и Ν-концом или другим участком опухолевого антигена может быть осуществлено так, что РКАМЕ или другой опухолевый антиген или его производное, как они описаны здесь, заменяет С-концевой фрагмент белка Ό, который был вырезан. Таким образом, Ν-конец белка Ό становится Ν-концом слитого белка.
Другие партнеры слияния или их фрагменты могут быть включены в слитые белки по изобретению или могут заменять элемент белка Ό по настоящему изобретению, например, в воплощениях, включающих антиген РКАМЕ или его фрагмент или участок, как описано здесь. Примеры других партнеров слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа, Ν81 (гемагглютинин) - обычно используются Ν-концевые 81 аминокислот, хотя могут быть использованы и другие фрагменты при условии, что они включают эпитопы Т-хелперов;
БУТА, имеющий происхождение от 81тер1ососсик рпеишошае, который синтезирует Ν-ацетил-Баланинамидазу, амидазу БУТА (кодируемую геном 1у1А (Сепе, 43 (1986) с. 265-272)), например повторяющаяся область молекулы Бу1а, находящаяся на С-конце, например, начиная с остатка 178, например остатки 188-305.
Очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-БУТА на их аминоконцах, была описана (Вю1ес1то1оду 10, (1992) с. 795-798).
Слитые белки по изобретению могут включать в себя аффинную метку, такую как, например, гистидиновый хвост, содержащий от 5 до 9, например 6, гистидиновых остатков. Эти остатки могут находиться, например, на концевом участке белка Ό (например, на Ν-конце белка Ό) и/или они могут быть слиты с концевым участком антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Как правило, однако, гистидиновый хвост будет находиться на концевом участке антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как они описаны здесь, например на С-конце антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Гистидиновые хвосты могут быть полезны в очистке.
Согласно настоящему изобретению предложена также нуклеиновая кислота, кодирующая белки по настоящему изобретению. Такие последовательности могут быть вставлены в подходящий вектор экспрессии и использованы для ДНК/РНК-вакцинации или могут быть экспрессированы в подходящем хозяине. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, могут быть использованы в качестве вакцин. Такие векторы включают, например, вирус оспы, аденовирус, листерию и монофаг.
Последовательность ДНК, кодирующая белки по настоящему изобретению, может быть синтезирована с использованием стандартных методик синтеза ДНК, таких как ферментативное лигирование, как описано Э.М. КоЬейк е! а1. в ВюсйетШгу 1985, 24, 5090-5098, методами химического синтеза, ферментативной полимеризации ίη νίΙΐΌ или ПЦР-технологии (полимеразная цепная реакция) с использованием, например, термостабильной полимеразы или с использованием комбинации этих методов.
Ферментативная полимеризация ДНК может быть осуществлена ίη νίΙΐΌ с использованием ДНКполимеразы, такой как ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова), в подходящем буфере, содержащем нуклеозидтрифосфаты бАТР, бСТР, бСТР и бТТР, как требуется, при температуре 10°-37°С, обычно в объеме 50 мкл или менее. Ферментативное лигирование фрагментов ДНК может быть осуществлено с использованием ДНК-лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4, в подходящем буфере, таком как 0,05 М Тпк (рН 7,4), 0,01 М МдС12, 0,01 М дитиотрейтола, 1 мМ спермидина, 1 мМ АТР и 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, при температуре от 4°С до температуры окружающей среды, обычно в объеме 50 мл или менее. Химический синтез ДНК-полимера или фрагментов может быть осуществлен в результате традиционной фосфотриэфирной, фосфитной или фосфорамидитной химической реакции с использованием твердофазных технологий, таких как технологии, описанные в Сйеш1са1 апб Еп/утабс 8упШек1к оГ Сепе ЕгадтегИк - А БаЬога1огу Мапиа1 (еб. Н.С. Саккеп апб А. Бапд), Ует1ад Сйетэе, ХУешйеип (1982) или в других научных публикациях, например М.1. Саб, НАУ.Э. Мабйек, М. 8шдй, В.8. 8ртоа1, апб К.С. Тйшак, М.1с1е1с Ас1бк Кекеатсй, 1982, 10, 6243; В.8. 8ртоа1 апб ВаптсаПк Те1га11ебгоп Бебетк, 1983, 24, 5771; М.Э. Майеисс1 апб М.Н. СатиШегк, Те1гайебгоп Бебетк, 1980, 21, 719; М.Э. Мабеиса апб М.Н. СатиШегк, 1оитпа1 оГ 1Пе Атепсап СЬет1са1 8оае!у, 1981, 103, 3185; 8.Р. Абатк е! а1., 1оигпа1 оГ 1Пе Атепсап Сйетэса1 8ос1е!у, 1983, 105, 661; Ν.Ό. 8шба, 1. В1егпа1, 1. МсМаппик апб Н. Коек!ег, №с1ею Ас1бк Кекеатск, 1984, 12, 4539 апб Н.^.Э. Маббек е! а1., ЕМВО 1оитпа1, 1984, 3, 801.
Способ по изобретению может быть осуществлен с использованием традиционных рекомбинантных технологий, таких, которые описаны в Машабк е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд - А БаЬота1оту Мапиа1; Со1б
- 8 016326
8рйид НагЬог, 1982-1989.
В частности, способ может включать следующие стадии:
1) получение реплицируемого или интегрирующего вектора экспрессии, способного экспрессировать в клетке-хозяине ДНК-полимер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или его иммуногенное производное;
2) трансформирование клетки-хозяина указанным вектором;
3) культивирование указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного ДНК-полимера с продуцированием указанного белка; и
4) выделение указанного белка.
Используемый здесь термин трансформирование означает введение чужеродной ДНК в клеткухозяин. Этого можно достичь, например, в результате трансформации, трансфекции или инфицирования подходящей плазмидой или вирусным вектором с использованием, например, общепринятых методов, как описано в Сеиейс Епщпссппд; Ебк. 8.М. Кшдктаи апб ЛЭ. Кшдктаи; В1аск\\'е11 8οίοηΙίΓίο РиЬНсайоик; ОхГогб. Еид1аиб, 1988. Термин трансформированный или трансформант далее применяется к образующейся клетке-хозяину, содержащей и экспрессирующей интересующий чужеродный ген.
Векторы экспрессии являются новыми и также являются частью данного изобретения.
Реплицируемые векторы экспрессии могут быть получены в соответствии с изобретением путем расщепления вектора, совместимого с клеткой-хозяином, с получением линейного сегмента ДНК, имеющего интактный репликон, и объединения указанного линейного сегмента с одной или более молекулами ДНК, которые вместе с указанным линейным сегментом кодируют целевой продукт, такой как ДНК-полимер, кодирующий белок по изобретению или его производное в лигирующих условиях.
Таким образом, ДНК-полимер может быть образован заранее или может быть образован в процессе конструирования вектора, по желанию.
Выбор вектора отчасти будет определяться клеткой-хозяином, которая может быть прокариотической или эукариотической, но обычно представляет собой клетки Е. сой или СНО (клетки яичника китайского хомячка). Подходящие векторы могут включать плазмиды, например ТМСР14, или рЕТ21, или рЕТ26, рсЭ№А3, бактериофаги, космиды и рекомбинантные вирусы.
Получение реплицируемого вектора экспрессии может быть осуществлено традиционно с использованием подходящих ферментов для рестрикции, полимеризации или лигирования ДНК по методикам, описанным, например, в Машайк е! а1., процитированном выше.
Рекомбинантную клетку-хозяин получают в соответствии с изобретением путем трансформирования клетки-хозяина реплицируемым вектором экспрессии по изобретению в условиях трансформации. Подходящими условиями трансформации являются общепринятые условия, описанные, например, в Маи1аЙ8 е! а1., процитированном выше, или в ΌΝΑ С1ошид νο1. II, Э.М. С1отег еб., 1ВЬ Ргекк Ыб., 1985.
Выбор условий трасформации определяется клеткой-хозяином. Так, бактериальный хозяин, такой как Е. сой, может быть обработан раствором СаС12 (Сойеи е! а1., Ргос. №а1. Асаб. 8ск, 1973, 69, 2110) или раствором, содержащим смесь КЬС1, МиС12, ацетата калия и глицерина, и затем 3-[Νморфолино]пропансульфоновой кислотой, КЬС1 и глицерином. Клетки млекопитающих в культуре могут быть трансформированы соосаждением с кальцием векторной ДНК на клетки. Изобретение также распространяется на клетку-хозяина, трансформированную реплицируемым вектором экспрессии по изобретению.
ДНК может быть кодон-оптимизирована по стандартным методикам с целью дальнейшего облегчения экспрессии у релевантного хозяина. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена ДНК, кодирующая слитый белок, содержащий антиген РКАМЕ или его участок или фрагмент, как они описаны здесь, в котором нуклеотидная последовательность антигена РКАМЕ или его участка либо фрагмента кодон-оптимизирована. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность белка Ό не является кодон-оптимизированной.
Культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию ДНК-полимера, обычно проводят, как описано, например, в Машайк е! а1. и в ΌΝΑ С1ошид, процитированных выше. Так, предпочтительно клетку помещают в питательную среду и культивируют при температуре менее 50°С.
Белки по настоящему изобретению могут экспрессироваться в прокариотах или в эукариотах, таких как дрожжи, но часто экспрессируются в Е. сой. Можно использовать конкретные штаммы Е. сой, такие как АК58 и ВЬВ ΌΕ3.
Обычно для облегчения идентификации успешного включения рекомбинантного гена/конструкции в систему экспрессии включают маркер селекции, например устойчивости к канамицину или устойчивости к ампициллину.
Продукт выделяют общепринятыми способами согласно клетке-хозяину и согласно локализации продукта экспрессии (внутриклеточный или секретируемый в культуральную среду или в периплазму клетки). В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является внутриклеточным. В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является нерастворимым белком. Таким образом, когда клетка-хозяин является бактериальной клеткой, такой как клетка Е. сой, тогда
- 9 016326 она может быть лизирована, например, физически, химически или ферментативно, и белковый продукт может быть выделен из полученного лизата. Если клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, то обычно продукт может быть выделен из питательной среды или из экстрактов, не содержащих клеток. Общепринятые методы выделения белков включают селективное осаждение, адсорбционную хроматографию и аффинную хроматографию, включая хроматографию на аффинной колонке с моноклональными антителами.
В одном из воплощений изобретения предложен способ получения слитого белка, как он описан здесь, включающий стадию экспрессии в клетке слитого белка, содержащего белок-партнер слияния, как он описан здесь. Клеткой может быть бактерия. В одном из воплощений, в котором клеткой является бактерия, этой бактерией может быть Е. сой. Способ по настоящему изобретению может включать стадию экспрессии слитого белка, как он описан здесь, в клетке в виде нерастворимого белка. Способ может дополнительно включать стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток.
В одном из воплощений изобретения предложен слитый белок, полученный или получаемый методом или способом, описанным здесь.
Белки по настоящему изобретению предоставляются либо в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме.
Ожидается, что каждая доза для человека будет содержать от 1 до 1000 мкг белка и предпочтительно 30-300 мкг.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, такая как вакцина, содержащая слитый белок по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом эксципиенте.
Вакцина, возможно, может содержать один или более других ассоциированных с опухолью антигенов или полипептидов или предпочтительно может быть объединена с другими противораковыми вакцинами на основе ассоциированного с опухолью антигена. Например, эти ассоциированные с опухолью антигены могут представлять собой антигены, как они описаны здесь, и/или могут быть членами семейств МЛОЕ, ЬЛОЕ и СЛОЕ или νΤ-1. В одном из воплощений ассоциированный с опухолью антиген может содержать или состоять из антигена МАСЕ А3.
Получение вакцин, в общем, описано в Уассте Эс5щп (Тйе киЬипй апб афщуаШ арртоасй (ебк. Ро\ге11 М.Б. & Ые^тап М.1). (1995) Р1епит Рге55 Ыете Уогк). Инкапсулирование в липосомах описано в патенте США 4235877, БиНейоп.
В вакцинном препарате по изобретению белки по настоящему изобретению предпочтительно могут присутствовать вместе с адъювантами. Подходящие адъюванты могут включать соль алюминия, такую как гидроксид алюминия в виде геля (алюм) или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные полисахариды, или полифосфазены. Другие известные адъюванты включают СрС-содержащие олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды характеризуются тем, что динуклеотид СрС не метилирован. Такие олигонуклеотиды общеизвестны и описаны, например, в νθ 96/02555.
Может быть желательным, чтобы в препарате по изобретению адъювантная композиция индуцировала иммунный ответ предпочтительно ТН1-типа. В одном из воплощений предложена адъювантная система, включающая, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-Оацилированного монофосфориллипида А (30-МРБ). вместе с солью алюминия. С целью индуцирования ТН1-ответа адъювант предпочтительно, возможно, может включать также олигонуклеотиды СрС.
Улучшенная система, которая может быть использована в настоящем изобретении, содержит комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, конкретно комбинацию 0821 и 3П-МРЬ, как раскрыто в νθ 94/00153, или, например, менее реактогенную композицию, где 081 гасится холестерином, как описано в νθ 96/33739.
Композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, содержащая 0821, 30-МРБ и токоферол, например, в виде эмульсии масло-в-воде, описана в νθ 95/17210.
Другая адъювантная композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, представляет собой 0821, 30-МРБ и СрС или его эквивалент, например, в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата.
Соответственно в одном из воплощений настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая слитый белок или белок-партнер слияния, как описано здесь, и адъювант, например, как описано выше.
Комбинация РЕАМЕ и МАСЕ.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая: (а) антигенный компонент, содержащий антиген РЕАМЕ или слитый белок, как описано здесь, и (б) антигенный компонент, содержащий антиген МАСЕ или слитый белок, как описано здесь. В одном из воплощений композиция дополнительно может содержать адъювант, как описано здесь.
Антиген МАСЕ для использования в комбинации может содержать полноразмерный антиген МАСЕ. Альтернативно, антиген МАСЕ может содержать иммуногенный участок МАСЕ, в котором 1, 2,
- 10 016326
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из Ν-конца последовательности МАОЕ. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой МЛОЕ А3 или его иммуногенный участок, последовательность МЛОЕ А3 может состоять из аминокислот от 3 до 314 МАОЕ А3.
Для комбинации, описанной выше, любой из или оба антигена РКАМЕ и/или МАОЕ могут быть частью слитого белка или белков, как описано здесь, или эти антигены могут присутствовать в других слитых белках или могут присутствовать как один антиген.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая слитый белок, содержащий антиген РКАМЕ и белок-партнер слияния, как описано здесь, и слитый белок, содержащий антиген МАОЕ А3 и белок-партнер слияния, как описано здесь. В альтернативном воплощении слитый белок, содержащий антиген МАОЕ А3, содержит или состоит из антигена МАОЕ А3 и белкапартнера слияния, содержащего приблизительно первые 109 аминокислот белка Ό, в котором одна или две либо более аминокислот из белка Ό, возможно, заменены и в котором, возможно, присутствует сигнальная последовательность белка Ό в дополнение к первым 109 аминокислотам белка Ό.
Слитые белки по настоящему изобретению дополнительно, возможно, могут содержать одну или более аминокислот в качестве линкеров между последовательностями антигена и белка-партнера слияния или между антигеном и Ηίδ-хвостом, если он присутствует. Данные аминокислоты могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния.
Слитые белки по настоящему изобретению, как описано здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Ме!-Азр-Рго на Ν-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Ме! может иметь происхождение от исходной последовательности белка Ό или может иметь происхождение от неродственной последовательности.
В одном из воплощений последовательность слитого белка, содержащего МАОЕ А3 и белок Ό для использования в настоящем изобретении, показана на фиг. 12, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 43.
Настоящее изобретение также распространяется на способы получения указанных вакцин/композиций.
Примеры
Были получены четыре слитых конструкции, и здесь они будут называться примеры/конструкции 1, 2, 3 и 4. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 3, и здесь она обозначена как пример 3 а. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 4, и здесь она обозначена как пример 4а.
В примерах 3 а и 4а последовательность, относящаяся к участку белка Ό молекулы, одна и та же. Однако некоторые кодоны в области РКАМЕ были модифицированы для дальнейшего улучшения экспрессии и в примере 3а линкер между РКАМЕ и Н18-хвост были удалены.
Таблица А
Структуры слитых белков и плазмиды примеров/конструкций 1-4
Ν-конец---------------------------------------------------С-конец
№ Примера/ Конструкции аминокислоты, вставленные в процессе клонирования партнер слияния раковый антиген аминокислотная последовательность линкера/Ηΐδхвоста использованная плазмида
1 ΜϋΡ 20-127 белок β РКАМЕ Т8СНННННН ТСМР14
2 ΜβΡ 20-127 белок β РКАМЕ ТСМР14
3 ΜβΡ 20-127 белок β РКАМЕ ЬЕНННННН рЕТ21
4 ΜβΡ 20-127 белок β РКАМЕ рЕТ21
За ΜβΡ 20-127 белок β РКАМЕ НННННН рЕТ26
4а ΜβΡ 20-127 белок β РКАМЕ рЕТ26
Слитые белки в приведенных выше примерах содержат аминокислоты 20-127 белка Ό. Аминокислоты Ме!, Азр и Рго были включены на Ν-конце фрагмента белка Ό (т.е. аминокислоты МОР-20-127 бел- 11 016326 ка Б). Считается, что эти три дополнительные аминокислоты могут способствовать стабильности белка и/или увеличивать уровень экспрессии белка. Аминокислота 127 белка Б слита с Ν-концом полноразмерного РКАМЕ (т.е. аминокислота 127 белка Б слита с Ν-концом РКАМЕ). В трех из шести белков включена метка гистидиновый хвост для способствования очистке. Точная последовательность этого хвоста зависит от использованной плазмиды.
Было сконструировано три разных типа плазмид, ТСМР14 и рЕТ21 или рЕТ26: для каждой плазмиды была включена ДНК, кодирующая слитый белок с гистидиновым хвостом и без него.
Если не указано иное, для получения каждого из примеров/конструкций использовали общую стратегию, приведенную ниже.
Стратегия клонирования для образования рекомбинантного белка РБ1/3-РКАМЕ (с или без Н18метки) с использованием вектора ТСМР14.
Амплификацию последовательностей, присутствующих в плазмиде ТСМР14, выполняли с использованием стратегии трехстадийной ПЦР. Вектор рН1С348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую целый ген белка Б, был получен от Бг. А. Богадгеп, Берайшеп! οί Меб1са1 М1сгоЬю1оду, Ишуег5Йу οί Ьипб, Ма1шб Сепега1 Но5рйа1, Ма1шб, 8^ебеп. Последовательность ДНК белка Б была опубликована 1ап5оп е! а1. (1991) (Н. 1ап8оп, Ь.О. Небеп, А. СгиЬЬ, М. Риап. & А. Богадгеп, 1991, 1пГес1. 1ттип. 59:119-125). Вектор экспрессии рМС81 представляет собой производное рВК322, в который были введены контрольные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных вставленных генов, являющиеся производными бактериофага λ (811з1/1изп е! а1., 1983) (А. 81131/111311 Υ.8. Но, & М. КозепЬегд, 1983, Ехрептеп1а1 МашрикШоп оГ Сепе Ехргеббюп. 1поиуа (еб), р. 1-14. Асабетю ΝΥ). Кроме того, ген устойчивости к ампициллину заменяли геном устойчивости к канамицину. Кодирующую последовательность для участка белка Ν81 (аминокислоты 4-81) заменяли множественными клонирующими сайтами с получением рМС81 МС8. Кодирующую последовательность для 1/3 белка Б (аминокислоты 20-127) клонировали в рМС81 МС8, используя сайты рестрикции ВатН1 и №о1, с получением рМС81-1/3РБ. Сначала выполняли ПЦР-амплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам 20-127 белка Б, с использованием вектора рМС81-1/3РБ в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида
5' АТАТААСАТАТССАТССААССАСССАТТСАТСАААТ 3' (САЖ08; 81Т) 1Б N0: 18) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАСАААССССТТССТТССАТССТТТСАААСТТТТСТСТС 3' (САЖ37; 8ЕС 1Б N0: 19).
кДНК РКАМЕ, полученную из Еиб\ущ 1пбШи1е, Вшббек, Ве1дшт, вставляли в сайты В81х1-№11 вектора рС^NА1 Цпуйтодеп) для образования рекомбинантного вектора рС^NА-1-ΡКАМΕ. ПЦРамплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам белка РКАМЕ, выполняли с использованием вектора рс^NА-1-ΡКАМΕ (С8КВю) в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида
5' САСАСААААСТТТСАААССАТССААССААССССТТТСТСС 3' (САЖ36; 8ЕС 1Б N0: 20) и антисмыслового олигонуклеотида
5' АСАСАСАСТАСТСТАСТТАСССАТСАААСАСССССАСАС 3' (САЖ29; 8ЕС 1Б N0: 21) или
5' ССАССААСТАСТСТТАСССАТСАААСАСССССАСАС 3' (САЖ02; 8ЕС 1Б N0: 22) в зависимости от того, был добавлен Н18-хвост (САМ)02) или нет (САМ)29). Конечную последовательность РКАМЕ, вставленную в плазмиду ТСМР14, получали после ПЦР-амплификаций с использованием матриц генов 1/3РБ и РКАМЕ, которые образовывались на предварительных стадиях для матрицы и смыслового олигонуклеотида САМ)08 и антисмыслового олигонуклеотида САМ)29 или САННА в зависимости от того, присутствовал Н18-хвост (САМ)02) или нет (САМ)29). Для клонирования фрагмента в вектор ТСМР14 также добавляли сайты №е1 на 5'-конце и 8ре1 на 3'-конце.
Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного белка 1/3РБ-РКАМЕ с или без Н18метки с использованием вектора рЕТ21.
Использовали рекомбинантную кДНК плазмиду, названную рс^NА1 -РКАМЕ (как описано в предыдущей стратегии), содержащую кодирующую последовательность гена РКАМЕ, и вектор РМС811/3РБ (как описано в предыдущей стратегии), содержащий Мконцевую часть кодирующей последовательности белка Б. Стратегия клонирования включала следующие стадии.
а. Сначала последовательность 1/3РБ без сигнала секреции (секреторная или сигнальная последовательность) ПЦР-амплифицировали из плазмиды РМС81-1/3РБ с использованием смыслового олигонуклеотида
5' АСАСАССАТАТСАССАСССАТТСАТСАААТАТСССС (САЖ40; 8ЕС 1Б N0: 22) и антисмыслового олигонуклеотида
5' АССТССССССССССССТТТСАААСТТТТСТСТСАТТТСТАА (САЖ32; 8ЕС 1Б N0: 23); добавляли также сайты №е1 на 5'-конце и №11 на 3'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ21Ь(+).
б. Последовательность РКАМЕ ПЦР-амплифицировали из плазмиды рс^NА1-ΡКАМΕ с использованием смыслового олигонуклеотида
5' ТТСТТСССССССССААТССААССААССССТТТСТССССТ (САМАу 8ЕС 1Б N0: 25) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАССАСТССАССТТАСССАТСАААСАСССССАСАС (СА№34; 8ЕС 1Б N0: 26);
- 12 016326 добавляли также сайты Νο!1 на 5'-конце и Х1ю1 на З'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ21Ь. Эта амплификация привела к добавлению на С-конце белка из двух аминокислот, Ьеи и С1и. с последующими 6 Ηίδ в плазмиде рЕТ21Ь(+). Для образования белка без Ηίδ-метки на З'-конце гена РКАМЕ добавляли стоп-кодон (ТАС) с использованием ΟΑΝ033 и ΟΑΝ035 (антисмысловой 5' ССАС6АСТС6А6СТА6ТТА66САТ6АААСА6666САСА6 (ΟΑΝ035; 8ЕО ΙΌ ΝΟ: XX) вместо ΟΑΝ033 и ΟΑΝ034.
в. Клонирование в плазмиду рЕТ21Ь(+) (Ιπνίίτο^π) вышеуказанных амплифицированных фрагментов.
г. Удаление сайта Νοΐ1 между 1/3ΡΌ и РКАМЕ с использованием набора ОшкСНапде II 8йе-01тес!еб Ми!а§епе818 Κίΐ (81га1адепе) и смыслового олигонуклеотида
5' СА6ААААСТТТ6АААССАТ66ААС6АА66С6 (САМ06; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' С6ССТТС6ТТССАТ66ТТТСААА6ТТТТСТ6 (САЫ107; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
д. Добавление двух аминокислот А8р и Рго, затем Ме! по положению 1 на Ν-конце белка Ό 1/3 посредством мутагенеза и с использованием смыслового олигонуклеотида
5' 66А6АТАТАСАТАТ66АТССАА6СА6ССАТТСАТСАААТАТ66 (САХ 104; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАТАТТТСАТСААТСССТССТТССАТССАТАТСТАТАТСТСС (САЫ 105; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
Конструирование вектора для экспрессии кодон-оптимизированного рекомбинантного белка 1/3ΡΌРКАМЕ (с или без Ηίδ-метки) в векторе РЕТ26.
Ген РКАМЕ кодон-оптимизировали и клонировали в каркас рСА4 с добавлением сайтов Νοΐ1 и X11ο1 соответственно на 5'-конце и 3'-конце оптимизированного гена.
Эту плазмиду, названную 0606420рСА4, использовали для клонирования гена в слиянии с РЭ1/3 в векторе рЕТ26 с использованием приведенных ниже стадий.
а. Удаление фрагмента Νοί 1^^1, соответствующего оптимизированной последовательности РКАМЕ со стоп-кодоном на 3'-конце гена, из плазмиды 0606420рСА4.
б. Клонирование оптимизированного фрагмента РКАМЕ в плазмиду рЕТ26Ь(+), которая содержит 1/3РЭ, ранее клонированный Nάе1/Nο!1, с использованием олигонуклеотидов САМ)40 и СА^32, как описано выше, и где аминокислоты Αδр и Рго добавляли в Ν-конец методом мутагенеза с использованием олигонуклеотидов ί.ΆΝ104 и ί.ΆΝ105.
в. Удаление сайта Νοΐ1 посредством мутагенеза с использованием олигонуклеотидов:
смыслового
5' САСАСААААСТТТСАААССАТССААССТССТССТСТСТСС (САЫ123; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового
5' ССАСАСАССАССАССТТССАТССТТТСАААСТТТТСТСТС (САЫ124; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
Это дало слитый кодон-оптимизированный белок 1/3РЭ-РКАМЕ без Ηίδ-хвоста.
г. Плазмиду затем использовали в качестве матрицы для образования кодон-оптимизированного 1/3РЭ-РКАМЕ с 6 Ηίδ. ПЦР-амплификацию слитого белка выполняли с использованием смыслового олигонуклеотида
5' ССААТТССАТАТССАТССААССАСССАТТС (САЫ199; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАССТСТССАСТСАСТССТССТССТССТССТССТТССССАТАААССАССССС (САЫ198; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX);
добавляли также сайты ΝώΠ на 5'-конце, X1ю1 на 3'-конце, затем 6 Ηίδ и стоп-кодон для клонирования фрагмента в вектор рЕТ26Ь(+).
д. Клонирование амплифицированного фрагмента в плазмиде рЕТ26Ь(+) от Ιπνίίτο^π.
Для получения слитого белка конструкцию ДНК клонировали в вектор экспрессии ТСМР14. В этой плазмиде используются сигналы из ДНК фага лямбда для стимуляции транскрипции и трансляции вставленных чужеродных генов. Вектор содержит промотор РЬ лямбда РЬ, оператор ΟΕ и два сайта утилизации (МаБ и ΝιιΐΒ) для ослабления эффектов транскрипционной полярности, когда предусмотрен белок Ν (Οτοδδ е! а1., 1985. Мο1. & Се11. ΒίοΙ. 5:1015).
Плазмиду, экспрессирующую слитый белок рП-РКАМЕ, конструировали так, чтобы аминокислоты РКАМЕ были добавлены к С-концу 108-аминокислотного производного рО без его сигнальной последовательности (секреторная или сигнальная последовательность) (т.е. остатки 20-127). В эту конструкцию в Ν-конец производного рО добавляли три неродственные аминокислоты (Ме!, Αδр и Рго), и для некоторых конструкций включали Ηίδ-хвост на С-конце аминокислот РКАМЕ (см. табл. А, приведенную выше). Альтернативно, эта конструкция может быть описана как содержащая производное рО из 109 аминокислот, если Ν-концевой Ме! рассматривать как Ме! из последовательности рЭ.
Штамм клеток-хозяев и трансформация.
Клетки-хозяева из штамма АК58 Е. отН ^οΙΙ е! а1., Ргос. Ναίΐ. Асаб. 8с1. И8А, νοί. 82, р. 88-92, 1апиагу 1985, Β^οсйет^δ!^у) трансформировали плазмидной ДНК для примеров/конструкций 1 и 2.
Лизогенный штамм АК58 Е. той, использованный для получения примеров/конструкций 1 и 2,
- 13 016326 представляет собой производное стандартного штамма N99 Е. сой К12 ΝΙΗ (Национальный институт здоровья (США)) (Е- ки- да1К2. 1ас2- 1йт-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (даШ::ТМ0.
К11- с1857 ΌΗ1). Фенотип К11 предотвращает выключение макромолекулярного синтеза. Мутация с1857 дает чувствительное к температуре повреждение репрессора с1. Делеция ΌΗ1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы Ью. иут3 и сй1А хозяина. Штамм АК58 генерировали путем трансдуцирования N99 исходным раствором фага лямбда Р. ранее выращенного на производном 8А500 (β;·ι1Ε::ΤΝ1(). 1 Кй- с1857 ΌΗ1). Выбирали введение дефектного лизогена в N99 с тетрациклином в силу присутствия транспозона ΤΝ10. кодирующего устойчивость к тетрациклину. в соседнем гене даШ. N99 и 8А500 представляют собой штаммы Е. сой К12. полученные из лаборатории доктора Мартина Розенберга в Национальном институте здоровья (США).
Векторы. содержащие промотор РЬ. вводят в лизогенные клетки-хозяева Е. сой для стабилизации плазмидной ДНК. Лизогенные штаммы клеток-хозяев содержат ДНК фага лямбда. дефектного по репликации. интегрированную в геном (81ι;·ιΙζιη;·ιη с1 а1.. 1983; Ιη Ехрсптсп1а1 Машри1айоп οί Оепе Бхргеккюп. 1поиуа (ей) р. 1-14. Асайеиис Ргекк NΥ). ДНК фага лямбда управляет синтезом белка-репрессора с1. который связывается с репрессором ОБ вектора и предотвращает связывание РНК-полимеразы с промотором РБ и соответственно транскрипцию вставленного гена. Ген с1 штамма экспрессии АК58 содержит чувствительную к температуре мутацию так. что РБ-направленная транскрипция может регулироваться температурным сдвигом. т. е. увеличение температуры культуры инактивирует репрессор и синтез чужеродного белка инициируется. Эта система экспрессии обеспечивает контролируемый синтез чужеродных белков. особенно белков. которые могут быть токсичными для клетки (8Ыта1ака & КокепЬегд. 1981. №Иие 292:128).
Клетки-хозяева из штамма Е. сой ВБК (ΌΕ3) Шсадеп. ^1. И8А (каталожный номер: 69053-4). который является гесА- производным ВБ21. который улучшает выход плазмидных мономеров и может способствовать стабилизации целевых плазмид. содержащих повторяющиеся последовательности. или чьи продукты могут вызвать потерю профага ΌΕ3 (1. 2). трансформировали плазмидной ДНК из примеров/конструкций 3 и 4.
Каждую трансформацию проводили стандартными способами с СаС12-обработанными клетками Щапайап Ό. Р1акт1й йапкГоттайоп Ьу 81ташк 1п О1оуег. Ό.Μ. (Ей). ^NА с1ошпд. 1КБ Ргекк Бопйоп. (1985): р. 109-135).
Культивирование и индуцирование штамма бактериальных клеток-хозяев.
Культура.
Бактерии выращивали на 20 мл бульона Луриа-Бертани (Била-ВеПаш) (БВ) (ΒΌ) + 1% (мас./об.) глюкозы (БаЬотайэйе МАТ. каталожный номер: СК-0101) + антибиотик (карбенициллин 100 мкг/мл для рЕТ21Ь. канамицин 40 мкг/мл для ТСМР14). Культуры инкубировали при 33°С для клеток АК58 и при 37°С для клеток ВБК (ΌΕ3) до достижения О.Э.600НМ (оптическая плотность при длине волны 600 нм) около 0.8.
Индукция.
При Ο.Ό.600ΗΜ около 0.8 культуры ВБК (ΌΕ3) индуцировали 1 мМ изопропил-3-Э-1тиогалактопиранозидом (1РТС; ΕΜΌ Сйет1са1к 1пс.. каталожный номер: 5815) и инкубировали в течение или 3 ч при 37°С. хотя растворимость может быть увеличена. если использовать более низкую температуру.
При Ο.Ό.600ΗΜ около 0.8 культуры АК58 индуцировали путем активации нагреванием при 37°С и инкубировали в течение 7 ч.
Для двух систем экспрессии бактериальный рост был адекватным.
Экстракция и очистка белка.
При экспрессии полипептида в культуре клетки обычно собирают центрифугированием. затем разрушают физическими или химическими методами (если экспрессируемый полипептид не секретируется в среду) и полученный неочищенный экстракт сохраняют. чтобы выделить интересующий полипептид. Реактив для экстракции белка ВидВик1ег™ используют в условиях. рекомендованных поставщиками (№уадеп).
Очистка белка Р^1/3-РКАΜΕ-Η^к.
Пасту из клеток Е. сой ресуспендировали в 20 мМ Тпк буфере. рН 8.5. затем пропускали через систему гомогенизатора (Рапйа от №то 8оау1 8.р.А. - 2 пропускания - 750 бар (75 МПа)). После добавления 2 мМ МдС12 и бензоназы (Ве^опаке) (50 Ед./мл) гомогенат инкубировали 1 ч при комнатной температуре при слабом перемешивании. затем центрифугировали 30 мин при 15900 д и при комнатной температуре. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ Тпк буфере. рН 8.5. содержащем 1% додецилсульфата натрия (8Ό8) и 60 мМ глутатиона. и инкубировали 30 мин при комнатной температуре при слабом перемешивании. После центрифугирования в течение 30 мин при 15900 д и комнатной температуре осадок отбрасывали.
Супернатант после центрифугирования 10-кратно разводили в 20 мМ Тпк буфере. содержащем 6.66 М мочевины. 0.333 М хлорида натрия (№1С1) и 11.11 мМ имидазола и затем подвергали хроматографиче
- 14 016326 скому разделению на никель-ионной аффинной колонке (1МАС ЗерЕагозе 6 ЕЕ - СЕ НеаИЕсаге), уравновешенной в 20 мМ Тп8 буфере, рН 8,5, содержащем 0,1% 8И8, 6,0 М мочевины, 0,3 М ИаС1 и 10 мМ имидазола. После промывки колонки 20 мМ Тп8 буфером, рН 8,5, содержащим 0,5% саркозила, 6,0 М мочевины, 0,3 М №1С1 и 10 мМ имидазола, антиген элюировали из колонки, увеличивая концентрацию имидазола до 40 мМ в том же самом промывочном буфере. После добавления фосфата до 50 мМ антигенпозитивный элюат пропускали через колонку Масго-Ргер с керамическим гидроксиапатитом типа II (В1о-Каб), уравновешенную в 20 мМ Тп8 буфере, рН 8,5, содержащем 50 мМ фосфата, 0,5% саркозила, 6,0 М мочевины и 0,3 М ИаС1. Элюат с гидроксиапатитовой колонки, содержащий антиген, затем подвергали диафильтрации против 5 мМ боратного буфера, рН 9,8, содержащего 3,15% сахарозы, на мембране Отеда 30 кДа (Ра11). Ультраконцентрат стерилизовали фильтрацией через мембрану из ацетата целлюлозы 0,45/0,22 мкм (Зайогшз). Очищенное вещество хранили при -70°С.
Был использован также альтернативный способ очистки, который отличается от приведенного выше способа следующим:
нет обработки бензоназой, нет перехода от 8И8 к саркозилу на колонке 1МАС (8И8 от экстракции до стадии пропускания через гидроксиапатит), буфер, используемый для диафильтрации, представлял собой 5 мМ Тп8 буфер, рН 8,5-0,5 М аргинин.
Результатом этого альтернативного способа очистки было неполное удаление 8И8 с остаточным значением около 0,05 и 0,085%.
Очистка.
Экспрессируемые рекомбинантные белки очищали из фракций супернатантов, полученных после центрифугирования индуцированной Е. со11, с использованием металл-хелатирующей смолы Н18-Вшб (О1Адеп. С11а18\\'ог111. СА) согласно инструкциям производителя этой смолы.
Характеризация белка.
8И8-РАСЕ.
Гель: ИиРАСЕ 4-12% В18-Тп8 Се1, 1,0 мм, 15 или 26 лунок (каталожный номер ЕгхНгодеп: ИР0323ВОХ).
На фиг. 1 и 2 ниже показан анализ 8И8-РАСЕ соединений примера 3 и 4 и 3а и 4а соответственно, где разные рекомбинантные белки 1/3рИ-РКАМЕ с Н18-меткой или без нее мигрируют на геле с кажущейся молекулярной массой ~70 кДа. Рекомбинантные белки обнаружены в виде тел включения в клеточном лизате Е. сой после индукции.
Подготовка образцов, буферов и условий миграции была выполнена в соответствии с рекомендациями поставщиков (1п\'бгодеп). По 10 мкл всех препаратов загружали (до индукции (ДИ) и после индукции (ПИ)) в лунки, что соответствует 100 мкл культурального эквивалента.
Пояснения к фиг. 1: анализ 8И8-РАСЕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3РИРКАМЕ после 1РТС-индукции штамма ВЬК ИЕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ21. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме ВЬК ИЕ3 1 мМ с использованием 1РТС (изопропил-бета-б-тиогалактопиранозид) при 25, 30 или 37°С наносили на гель. Клон #3 (1/3РИРКАМЕ/рЕТ21) и клон #4 (1/3РИ-РКАМЕ-Н18/рЕТ21) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожки 1 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 2 (клон #3, ДИ, супернатант), дорожка 3 (клон #3, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон #3, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 5 (клон #3, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 6 (клон #3, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 7 (клон #3, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 8 (клон #3, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 9 (клон #3, ПИ, 37°С, осадок), дорожка 11 (клон #4, ДИ, супернатант), дорожка 12 (клон #4, ДИ, осадок), дорожка 13 (клон #4, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 14 (клон #4, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 15 (клон #4, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 16 (клон #4, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 17 (клон #4, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 18 (клон #4, ПИ, 37°С, осадок).
Пояснения к фиг. 2: анализ 8И8-РАСЕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3РИРКАМЕ после 1РТС-индукции штамма ВЬК ИЕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ26. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме ВЬК ИЕ3 1 мМ 1РТС при 25, 30 или 37°С наносили на гель. Клон #3а (кодон-оптимизированный 1/3РИ-РКАМЕ/рЕТ26) и клон #4а (кодоноптимизированный 1/3РИ-РКАМЕ-Н18/рЕТ26) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 2 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 1 (клон #3а, ДИ, супернатант), дорожка 3 (клон #3а, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон #3а, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 5 (клон #3а, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 6 (клон #3а, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 7 (клон #3а, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 8 (клон #3а, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 9 (клон #3а, ПИ, 37°С, осадок), дорожка 11 (клон #4а, ДИ, супернатант), дорожка 12 (клон #4а, ДИ, осадок), дорожка 13 (клон #4а, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 14 (клон #4а, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 15 (клон #4а, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 16 (клон #4а, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 17 (клон #4а, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка
- 15 016326 (клон #4а, ПИ, 37°С, осадок).
Вестерн- блоттинг.
Мембраны блокировали в течение 30 мин при 37°С, 60 об/мин, используя свежий раствор 3% молока/РВ8 1Х (фосфатно-солевой буферный раствор). После блокирующей инкубации добавляли первичные антитела (кроличьи антитела против РВАМЕ, Θ8Κ Вю1од1еа18 8Ά) в разведении 1:5000 или а-6Х Ηΐδметку (АЪСаш) в разведении 1:3000 в свежем растворе 3% молока/РВ8 IX в течение 1 ч при 37°С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02% Т^ееп20/РВ8 1Х. Добавляли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена антитела осла против 1§О (Н+Ь) кролика (1аекзоп 1аЪога1огу) в разведении 1:20000, используя свежий раствор 3% молока/РВ81Х. Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02% Т^ееп20/РВ8 1Х, затем мембраны подвергали воздействию пероксидазного субстрата (КН2РО4, 10 мМ; (ΝΗ4)28Θ4, 10 мМ; О-дианизидин, 0,01% и перекись водорода, 0,045%) или щелочного фосфатазного субстрата (Вщша Раз!), следуя рекомендациям поставщика.
Молекулярный анализ.
Пример/конструкция^___________________________________________
Анализ Целый белок
Длина 629 АК
Молекулярная масса 71629,96
1 микрограмм= 13,961 пмоль
Молярный коэффициент экстинкции 67680
1 А[280] соответствует 1,06 мг/мл
А[280] 1 мг/мл 0,94 а.е.
Изоэлектрическая точка 6,41
Заряд при рН 7 -5,84
Пример/конструкция 2
Анализ Целый белок
Длина 620 АК
Молекулярная масса 70561,90
1 микрограмм= 14,172 пмоль
Молярный коэффициент экстинкции 67680
1 А[280] соответствует 1,04 мг/мл
А[280] 1 мг/мл 0,96 а.е.
Изоэлектрическая точка 6,28
Заряд при рН 7 -6,36
Пример/конструкция 3
Анализ Целый белок
Длина 628 АК
Молекулярная масса 71627,01
1 микрограмм= 13961 пмоль
Молярный коэффициент экстинкции 67680
1 А[280] соответствует 1,06 мг/мл
А[280] 1 мг/мл 0,94 а.е.
Изоэлектрическая точка 6,34
Заряд при рН 7 -6,84
- 16 016326
Пример/конструкция 4
Анализ Целый белок
Длина 620 АК
Молекулярная масса 70561,90
1 микрограмм= 14,172 пмоль
Молярный коэффициент 67680
экстинкции
1 А[280] соответствует 1,04 мг/мл
А[280] 1 мг/мл 0,96 а.е.
Изоэлектрическая точка 6,28
Заряд при рН 7 -6,36
Пример 5.
Оценка продуцирования белков с или без секреторного сигнала (секреторная или сигнальная последовательность) белка И 1/3 в слитом белке
Таблица Б Белок Уровень экспрессии
РО1/3-РКАМЕ с секреторным сигналом +
РО1/3-РКАМЕ без секреторного сигнала +++
Фиг. 11: анализ 8Ώ8-ΡΆΘΕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3ΡΏ-ΡΚΆΜΕ с или без секреторного сигнала (88) после ΙΡΤΘ-индукции штамма ВЕ21 ΏΕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ21. Эквивалент 100 мкл культуры после 3 ч индукции в штамме ВЕ21 ΏΕ3 1 мМ ΙΡΤΘ при 37°С наносили на гель. Эти конструкции присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 1: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 2 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ДИ, супернатант), дорожка 3 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ДИ, осадок), дорожка 4 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ПИ, супернатант), дорожка 5 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ПИ, осадок), дорожка 6 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ДИ, супернатант), дорожка 7 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ДИ, осадок), дорожка 8 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ПИ, супернатант), дорожка 9 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ПИ, осадок), дорожка 10 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ДИ, супернатант), дорожка 11 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ДИ, осадок), дорожка 12 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ПИ, супернатант), дорожка 13 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ПИ, осадок), дорожка 14 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ДИ, супернатант), дорожка 15 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ДИ, осадок), дорожка 16 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ПИ, супернатант), дорожка 17 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ПИ, осадок).
Пример 6.
Иммуногенность ΡΏ-ΡΚΆΜΕ-Ηΐδ, приготовленного в А801В или в А815: дозовый диапазон антигена в постоянной дозе адъюванта.
Цель: дозовый диапазон антигена для выбора наилучшей дозы для использования в доклинических экспериментах.
Протокол: 6 группам по 12 мышей СВ6Е1 в день 0 и день 14 делали внутримышечные (ВМ) инъекции:
1) ΡВ8,
2) ΡΚΑΜΕ (50* мкг) в А801В или в А815,
3) ΡΚΛΜΕ (10 мкг) в А801В или в А815,
4) ΡΚΛΜΕ (2 мкг) в А801В или в А815,
5) ΡΚΛΜΕ (0,4 мкг) в А801В или в А815,
6) Ρ^ΜΕ (0,08 мкг) в А801В или в А815, * в действительности вводили 44,7 мкг вместо запланированной дозы 50 мкг.
А801В представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий Р821 и 3Ώ-ΜΡΕ; А815 представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий Р821, 3Ώ-ΜΡΕ и СρΘ.
Конструкция, использованная в этом примере, представляла собой пример/конструкцию 3а (рЕТ26 с Ηΐδ-хвостом), представленную в 5 мМ Ττΐδ буфере с 0,5М аргинином. Можно использовать также белок, представленный в боратном буфере с сахарозой.
Выдаваемые данные.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов (18С) через 14 суток после 2 инъекций после ΐπ νίίτο рестимуляции клеток селезенки (4 пула по 3 мыши на группу) с использованием пула пептидов ΡΚАΜΕ в концентрации 1 мкг/мл/пептид (15-мер).
Ответ СИ4 (адъювант А801В).
Результаты 1С8 для цитокинов СИ4 для адъюванта А801В показаны на фиг. 3. Из этого экспери
- 17 016326 мента можно сделать вывод, что наилучшая доза антигена РЕАМЕ для индукции ответа СЭ4 в А801В в этих условиях по всей вероятности составляет 2 мкг.
Ответ СЭ8 (адъювант А801В).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ8 для адъюванта А801В показаны на фиг. 4. Данные демонстрируют весьма низкий ответ СЭ8 и низкую гетерогенность ответа внутри группы.
Ответ СЭ4 (адъювант А815).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ4 для адъюванта А815 показаны на фиг. 5. Видно, что аналогичный ответ СЭ4 был индуцирован с использованием 44, 10, 2 и 0,4 мкг РЕАМЕ, приготовленного в А815; с пониженным ответом, индуцированным 0,08 мкг РЕАМЕ.
Ответ СЭ8 (адъювант А815).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ8 для адъюванта А815 показаны на фиг. 6. Эти данные показывают отсутствие ответа СЭ8 (фон в группе РВ8).
Пример 7.
В итоге, для описанных здесь изобретений можно применить следующее обобщенное описание конкретных конструкций РЭ1/3-РЕАМЕ, которые были получены.
Конструкции, использованные для РЭ1/3-РЕАМЕ.
Сигнальная последовательность белка Ό не включена (аминокислоты 2-19 белка Ό).
Включен метионин белка Ό (АК 1 белка Ό).
Две неродственные аминокислоты (Азр и Рго) заменяют аминокислоты 2-Ьуз и 3-Ьеи белка Ό.
Включены первые 109 аминокислот белка Ό после сигнальной последовательности белка Ό (109 аминокислот, включая первый Ме! в Ν-конце + аминокислоты 20-127 белка Ό).
Включены аминокислоты 1-509 РЕАМЕ (полноразмерная исходная последовательность РЕАМЕ).
С или без Ηίδ-хвоста, состоящего из одного из следующих:
три неродственные аминокислоты (ТЬг, 8ег и О1у) + 6 остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде ТСМР14; или две неродственные аминокислоты (Ьеи и О1и) + 6 остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде рЕТ21; или остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде рЕТ26.
Белок рЭ1/3-РЕАМЕ +/- Ηίδ-хвост
ρβ 1/3 20-127 ΡΕΑΜΕ 1-509
Ν-конец ΜβΡ ρβ 1/3 ΡΕΑΜΕ С-конец
Ν-конец ΜβΡ ρβ 1/3 ΡΕΑΜΕ Т8С 6χΗΐδ (в ТСМР14) С-конец
Ν-конец ΜβΡ ρβ 1/3 ΡΕΑΜΕ Ι_Ε 6χΗΐδ (в ρΕΤ21) С-конец
Ν-конец ΜβΡ ρβ 1/3 ΡΕΑΜΕ 6χΗΐ3 (в ρΕΤ26) С-конец
На фиг. 7 показана размеченная аминокислотная последовательность примеров конструкций по настоящему изобретению.
На фиг. 8-10 показано выравнивание следующих конструкций: выравнивание между ЫроЭМАΟЕ3-Η^8 и ^1/3-РЕАМЕ-Η^8 (фиг. 8); выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ό из ΗаеторЫ1и8 тйиеп/ае и ^^ро^-МАОЕ3-Η^8 (фиг. 9); выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ό из ΗаеторЫ1и8 тйиеп/ае, ^^ро^-МАОЕ3-Η^8 и р^1/3-РЕАМЕ-Η^8 (фиг. 10).
Приготовление вакцинного препарата с использованием слитых белков.
Слитые белки по изобретению могут быть приготовлены в виде вакцинных препаратов с добавлением адъюванта или без адъюванта. В одном из воплощений в качестве адъюванта препарат может содержать смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А (3В-МРЬ) и ^821 в эмульсии типа масло-в-воде. Адъювантная система 8ВА82 была ранее описана в ШО 95/17210. Альтернативно, адъювант для использования в настоящем изобретении может содержать 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3В-МРЬ), ^821 и СрО в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата.
3В-МРЬ представляет собой иммуностимулятор, имеющий происхождение от липополисахарида (ЬР8) грамотрицательной бактерии 8а1топе11а ттпезо!а. МРЬ деацилирован и не имеет фосфатной группы на группировке липида А. Эта химическая обработка значительно снижает токсичность при сохранении иммуностимулирующих свойств (Е1Ы, 1986).
Считается, что 3В-МРЬ совместно с различными носителями может сильно увеличивать как гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет ТН1-типа.
^821 представляет собой молекулу природного сапонина, экстрагированного из коры южноамериканского дерева ^и^11а^а заропапа МоНпа. Методика очистки, разработанная для выделения индивидуальных сапонинов из неочищенных экстрактов коры, позволила выделить конкретный сапонин, ^821, который представляет собой тритерпеновый гликозид, демонстрирующий более сильную адъювантную активность и меньшую токсичность по сравнению с родительским компонентом. Было показано, что ^821 активирует СТЬ (цитотоксические Т-лимфоциты), ограниченные классом I МНС (главного ком
- 18 016326 плекса гистосовместимости), к нескольким антигенам, а также стимулирует антигенспецифичную пролиферацию лимфоцитов (Кепзй, 1992).
Представляется, что может иметь место синергетический эффект комбинаций МНР и ^821 в индуцировании как гуморальных, так и клеточных иммунных ответов ТН1-типа.
Эмульсия типа масло/вода содержит органическую фазу из 2 масел (токоферол и сквален) и водную фазу из РВ8, содержащего Тмееп 80 в качестве эмульгатора. Эта эмульсия содержала 5% сквалена, 5% токоферола, 0,4% Тмееп 80 и имела средний размер частиц 180 нм, и она известна как 8В62 (см. νθ 95/17210). Образовавшиеся капельки масла должны иметь размер приблизительно 180 нм.
Адъювант для использования в настоящем изобретении может быть приготовлен в виде комбинации МРР и ^821 в эмульсии масло/вода или в липосомном препарате. Этот препарат следует поставлять в сосудах 0,7 мл для смешивания с лиофилизированным антигеном или слитым белком (сосуды, содержащие от 30 до 300 мкг антигена).
Также можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды. Примеры олигонуклеотидов для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению включают олигонуклеотиды, содержащие СрС, обычно содержащие два или более динуклеотидных мотива СрС, разделенных по меньшей мере тремя, чаще по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. Олигонуклеотиды СрС обычно являются дезоксинуклеотидами. В одном из воплощений промежуточным нуклеотидом в данном олигонуклеотиде является фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатная связь, хотя фосфодиэфирная связь и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. В объем изобретения также входят олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в И8 5666153, И8 5278302 и νθ 95/26204.
Примерами олигонуклеотидов являются следующие олигонуклеотиды:
ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 36)
ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 37)
АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ
СТС СТТ (СрС 2006; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 38)
ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 39)
ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456; 8ЕО Ю ΝΟ: 40), и эти последовательности могут содержать межнуклеотидные связи, модифицированные фосфоротиоатом.
Альтернативно, олигонуклеотиды СрС могут содержать одну или более вышеуказанных последовательностей, в которых они имеют несущественные делеции или добавки.
Олигонуклеотиды СрС могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области (см., например, ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды удобно синтезировать, используя автоматический синтезатор.
В одном из воплощений настоящего изобретения адъювантная комбинация для использования в изобретении включает один или более из следующих компонентов: 3О-МРЬ и ^821 (ЕР 0671948 В1); эмульсии типа масло-в-воде, содержащие 3В-МРЬ и ^821 (νθ 95/17210, νθ 98/56414); или 3В-МРЬ, приготовленный с другими носителями (ЕР 0689454 В1). Другие адъювантные системы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат комбинацию 3В-МРЬ, ^821 и олигонуклеотида СрС, как описано в И8 6558670 и И8 6544518.
Конечная вакцина может быть получена после растворения лиофилизированного препарата. Ссылки.
1. А.Еоса (и. о£ V^8соη8^η), личные контакты.
2. 81иб1ег, Б/ν (1991) I. Мо1. Вю1. 219, 37-44.
3. 1ап Н. Ке881ега е! а1. ТНе 1оигпа1 о£ Ехрег1теп1а1 Мебкте, уо1. 193, ЫитЬег 1, 1апиагу 1, 2001, 7388.
4. !кеба Н. е! а1. !ттипйу, БеЬ.; 6(2): 1997, 199-208.
- 19 016326
81-'Ο ΙΌ N0: 1.
Последовательность ДНК для примера 1 аеддаессаадсадссаЬЪсаЪсаааеаЬддсдааЪасссаааедааабсадасаааабсабЪаЬедсЪс ассдЬддедсеадсддеЬаееЬассададсаеасдебадааесЬааадсасеедсдьеЬдсасаасаддс ЪдаеЕаг.геададсаадаЕЪЬадсааг.дасеааддаПддСсдЬЪЪадЬддеЕаЪЪсасдаесасЕС'еьЪа даеддсеьдаседаСдеедсдааааааЪЬсссасаесдЪсаЬсдЪааадаеддссдгЬасбаЬдбсаЪсд асееЬассЬСаааадаааеесааадбЬЬадаааедасадаааасеьсдааассаЬддаасдааддсдЪЫ: ЗбддддЬЬссаеЕсададссдаЪасаЪсадсаедадедедбддасаадсссасддадасЕЪдЬддадсЬд дсадддсададссЬдсбдааддаЬдаддсссЬддссаЬгдссдссседдадеьдседсссадддадсесЕ ЬсссдссасЬсЬЬсаЪддсадссЫЛдасдддадасасадссадасссЪдааддсаагддЬдсаддссЪд дсссЬгсассЬдссЕсссбсЬдддадЕдсгдаЕдаадддасаасабсСбсассСддадассСЪсааадсб дЬдсегдаеддасеЬдабдЕдсЬссЬЪдсссаддаддЬЬсдссссаддаддЬддааасЬЕсаадЪдсЬдд аЬЬеасддаадаасЬсСсаЬсаддасЬЬсЪддасЬдЪаИддЪсЪддааасадддссадбсЬдсасбсасе ЬссададссадаадсадсесадсссаСдасааадаадсдаааадбадабддбеЬдадсасададдсадад садсссЬесаеессадбададдкдсгсдСадасседССссбсааддааддЬдссбдЬдаЪдааеъдбЬсе ссгассгсаЬЬдадааадедаадсдааадаааааЪдгасЬасдссгдЬдсЬдЕаадаадсСдаадаЬЪЫ: гдсааедсссаСдсаддаеаесаадаедаЪсседааааъддЪдсадсгддасЪсеаеСдаадасхсддаа дЬдасеьдеассЬддаадсеасссассЪСддсдаааегсссЪссЬЬассБдддссадаЬдаСЬааесСдс дгадасЪссЪссИсесссасагссаедсаЬсСПссеасаЬсессссддадааддаададсадбаЪаСсдс ссадСЬсассЪсЬсадеессесадЬсЪдсадЬдсседсаддсесЬсгабдбддасбсебгаСССбессЫ: ададдссдссЬддаЬсадЫхдсЬсаддсасдЬдаЬдаассссбЬддааасссЪсЬсааЬаасгаасЬдсс ддсЕЬЬсддааддддаЬдЬдаЪдсаЬсЬдЬсссададЕсссадсдгсадЬсадсЬаадСдгссЪдадгсъ аадгддддесаЬдсЬдассдаЬдЬаадЬсссдадссссЬссаадсЪсбдсбддадададссЕсЬдссасс сгссаддасседдгсЬеедаЬдадЬдЬдддаЬсасддаСдаесадсбссббдсссЬссЬдссгесссЬда дссасЕдсесссадсееасаассЬЪаадсЕЬсгасдддааЬСссаХсЬссаЕагсЪдссесдсададЬсг ссЬдсадсассЬсаЬсдддсЬдадсааЬсЬдасссасдгдсЬдЁаЪссЬдСсссссЬддададгьаьдад дасаЬссаЪддеасссессассЬддададдссСдссбаСсСдсабдссаддсесадддадСсдсСдбдед адсСддддсддсссадсаеддесЪддсбСадЬдссаассссбдСссбсаседЪддддасадаассЪесеа едасссддадсссаесседгдссссЬдЬегсаСдссСаасасеадеддссассаИсассагсассаЬ 8ЕЛ II) N0: 2.
Аминокислотная последовательность для примера 1 МПРЗЗНЗЗМГ4АЦТОМКЗОК111АНРСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЪАЕАООАОУЬЕОПЬАМТЮЗСКЬУУ1НОНРЬ ϋαΕΤϋνΑΚΚΡΡΗΚΗΚΚθαΚΥΥνΐ0ΡΤΕΚΕΙ03ΕΕΜΤΕΝΡΕΤΜΕΚΚΚΕΗα5Ι03ΚΥΙ3Μ3νΚΤ3ΡΚΡϋνΞ6 АаСЗЫиКОЕАЬА1ААЬЕЫ>РРЕЬЕРРСРМААРПаННЗОТЬКАМУОАНРРТСЬРЬС7ЬМКСОНЬНЬЕТРКА УЬОаЬОУЬЬАОЕУРРРКИКЬОУЬОЬНКЫЗНОПРИТУИЗСЫЯАЗЬУЗРРЕРЕААОРМТККККУПСЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕ7ЬУОЬРЬКЕаАСОЕЕЕЗУЫЕК7ККККМУЬКЕССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬС31ЕПЬЕ 7ТСТИКЬРТЬАКЕЗРУЬа0М1М1Лг&ЬЬЬ8Н1НА38У13РЕКЕЕ<ЭУ1А<ЭЕТ30РЬ8Ъ0СЬ0АЬ¥УО8ЬРЕЪ РайЬЕОЬШНУМЫРЬЕТЬЗХТЫСРЦЗЕвОУМНЬЗОЗРЗбЗОЬЗУЬЗЬЗаУМСТОУЗРЕРИЗАСЬЕЯАЗАТ ЬОСЬУГОЕСа1ТПССЬЕАЬЬР8ЬЗНС80ЬТТЕЗРУО№1818АЬОЗЬЬОНЫСЬЗМЬТН7ЬУРУРЬЕЗУЕ ОТНСТЪНЬЕКЪАУЪНАНЪНЕЬЬСЕЬСВРЗМУИЪЗАНРСРНССОЙТРУПРЕРШСРСРМРПТЗаНННННН
- 20 016326
8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3.
Последовательность ДНК для примера 2 аЬддаессаадсадссаЪЬсаЬсаааЪаЬддсдааЬасссаааЬдааайсадасааааЬсаЬЬаседсЪс ассдЪддедсЬадсддеЬаЬеЬассададсаЪасдЬеадааЬсЬааадсасЪЬдсдЬЪЬдсасаасаддс ЪдаЪЪакЬЬададсаадаЬЬЪадсааЪдасСааддабддбсдйЬЪадЪддЬйаЫгсасдаЬсасееЕЬЬа даеддсЬЪдасЪдаедЬЕдсдааааааССсссасаЬсдесаЬсдЬааадаеддссдеЬасйаЕдЪсаЕсд асЬЕЬассЬЪаааадаааЬСсааадЬЬЬадаааЬдасадаааасЬЬЬдааассаЬддаасдааддсдьЫ: дЬддддЬЬссаЕЬсададссдаьасаЬсадсаСдадЬдьдЬддасаадсссасддадасСЬдЬддадсЬд дсадддсададссЬдсЕдааддаЕдаддсссЪддссаЬЬдссдсссЬддадЪСдсЬдсссадддадсЪсй ЬсссдссасЬсЫхсаЬддсадссиъЪдасдддадасасадссадасссЪдааддсааЬддЬдсаддссСд дсссЕЬсасседссСсссСсЬдддадЬдсСдаСдаадддасаасаЬсЕбсассйддадассЪЬсааадсЪ дЕдсЬЪдаСддасСйдаЬдЬдсЕсскЬдсссаддаддЫгсдссссаддаддЕддааасЕксаадЪдсЪдд а!:ееасддаадаасЬсСса1:саддасЫ:с1:ддас1:д1:а<:дд1:сгддааасадддссад1:с1:дЬас<:са1:1: ессададссадаадсадсСсадсссаЬдасааадаадсдаааадеадаЬддЬЬЬдадсасададдсадад садсссЬйсаЪЬссадеададдедсЬсдЪадассЬдЬЬссЕсааддааддЬдссСдЬдаЬдааЪЬдЪЬсе ссЬассЬсаЪЕдадааадЪдаадсдааадаааааЬдЪасЕасдссСдСдсЬдСаадаадсЬдаадаЬЬСС ЬдсааедсссаЬдсаддаЬаксаадаедаЬссЬдааааеддЬдсадсЪддасесЪаеЬдаадаЪЬЪддаа дСдасйСдсасседдаадсЬасссассеъддсдааайЫХссссСЪассЬдддссадаЕдаЬЬааЬсЪдс дЬадасЬссЬссЬсЕсссасаессаЬдсаЬсеьссЪасаСЬЪссссддадааддаададсадеаЬаЬсдс ссадьесассйсЬсадеЬссЬсадЬсЬдсадЪдссЬдсаддсЬсЬсЪаЬдЬддасЪсЪЬкакЬЫзЬссЬЬ ададдссдссЪддаЬсадЬЪдаЬсаддсасдЬдаСдаассссъеддааасссесКсааеаасеаасЬдсс ддсС+ЪсддааддддаЬдЕдаЕдсаЬседЕсссададЬсссадсдЕсадЪсадсЕаадкдЪссЕдадксЪ аадЬддддЬсаЕдсЪдассдаЬдЪаадЕсссдадссссЬссаадсЬсЪдСЬддадададссЪсЕдссасс сЬссаддассЬддЬсЪЬЬдаЬдадЬдСдддаЬсасддаЬдаЬсадсЪссЬЪдсссСссЬдсссЬссседа дссасЬдсгсссадсеЬасаассеЬаадсЬЬсЬасдддааЫзссаЕсессаЪаЬсЬдссЕЬдсададЬсЬ сседсадсассЬсаЬсдддсЪдадсааЬсСдасссасдЬдсЪдЬаЬссЬдбсссссЬддададЬЬаЬдад дасаЕссаЬддЕасссЬссассЬддададдсЕЬдссИаЕсЬдсаЬдссаддсЪсадддадььдсЬдЬдЬд адесддддсддсссадсаЕддЪсЪддсеЪадЬдссаасссседЪссЬсасЕдЕддддасадаассЬЬсЪа едасссддадсссаЬссбдЬдссссЬдеьесаЬдссеаас
8ΕΟ II) ΝΟ: 4.
Аминокислотная последовательность для примера 2
ΜΟΡ38Η33ΝΜΑΝΤ0ΜΚ3ΟΚΙ11АНКСА8СУЬРЕНТЬЕ8КАЬАГАООАСУЬЕООЬАМТКоаКЬУ71НОНЕЬ ОСЬТОУАККРРНйННгаЗОЯУУУШРТЬКЕЮЭЬЕМТЕКРЕТМЕКННЬМСЗЮЗНУТЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АЗОЗЬЬГОЕА11А1ААЬЕЬЬРЙЕЬГРРЕРМААГОСЙНЗОТЬКАМУОАНРЕТСЬРЬ<Э7ЬМКС<2НЬНГ1ЕТБ’КА УЬОаЬОУЕЬАОЕУКРЙНИКЬатЬПЬККПЗНаОГНТТтезаЫКАЗЬУЗГРЕРЕААОРМТККВКУЕСЪЗТЕАЕ ОРР1РУЕ7ЬУСЬГЪКЕаАСПЕЬЕЗУЫЕКУКйКЮЛ7ЫгЬССККЬК1РАМРМ0Е1КМ1ЬКМУ0ЬО31ЕОЬЕ 7ТСТМКЬРТЬАКГЗРУЬа0М1МЬЙКЬЬЬЗН1НА38У13РЕКЕЕ0У1А0ЕТ30РЬ8Ь0С1,0АЬУУ1)ЗЬГГЬ вайЬСОЬЕЙНТММРЬЕТЬЗХТЫСКЬЗЕСПУМНЬЗОЗРЗУЗОЬЗУЬЗЬЗаТМЬТОУЗРЕРЬОАЬЪЕКАЗАТ Ь00Ь7ГОЕСС1ТОСаЫАЬЬР8ЬЗНС50ЬТТЬЗРУСМ31813АЬ05ЬЬ0НЫОЬЗМЬТНУЬУР7РЬЕ8УЕ 01НСТЬНЬЕКЬАУЬНАКЬЙЕЬЬСЕЬСЙР8М7ИЬЗАНРСРНСС0КТРУ0РЕР1ЬСРСРМРЫ
- 21 016326
Μ-'Ο ΙΌ ΝΟ: 5.
Последовательность ДНК для примера 3 аЕддаЕссаадсадссаЕЕсаЬсаааЕаЕддсдааЪасссаааЪдаааЕсадасааааЕсаЪЬаЕЪдсЕс ассдЪддЕдсЪадсддеъаеЕЬассададсаЕасдсеадааксеааадсасЫхдсдЕЪкдсасаасаддс ЕдаЪЪаЫхЕададсаадаЪЪЕадсааедасЪааддаЕддЕсдЕЪЪадЬддСЬаСЕсасдаЕсасеьъеЕа даЪддсЕЕдасЕдаЕдЕЕдсдааааааЕЪсссасаЕсдЬсаЪсдЪааадакддссдЕЕаСкаЕдЕсаЪсд асЕЪЕассЕСаааадаааСЬсааадПИСадаааСдасадаааасСГЕдааассаЕддаасдааддсдЬЕС дЕддддеЕссаЕЪсададссдаЪасаесадсаЕдадЕдЕдеддасаадсссасддадасЕЬдЕддадсЕд дсадддсададссСдсЕдааддаСдаддсссЕддссаЬЕдссдсссЕддадЕЕдсЕдсссадддадс^сЪ ЕсссдссасЕсЪЕсаСддсадссеекдасдддадасасадссадасссЕдааддсааЬддЬдсаддссйд дсссСЕсассЪдссЕсссСсЪдддадЕдсЕдаЪдаадддасаасаьсЬЕсассЬддадассессааадс!: дЕдсЕЕдаЬддасеедаЪдЕдсЕссЕЕдсссаддаддСЕсдссссаддаддкддааас^ксаадЕдсЕдд аЕЬСасддаадаасЪсксаксаддаскесЕддаседЪаеддСсЪддааасадддссадЕсЕдЪасесаЕЪ ^ссададссадаадсадсЕсадсссаЕдасааадаадсдаааадЪадаЪддЪЕЬдадсасададдсадад садсссЪЕсаСЕссадЁададдкдсСсдЪадасскдкЪссксааддааддЕдсскдЪдаЪдааЕЕдЕЕс!: ссЕассЕсаЕЕдадааадЕдаадсдааадааааакдЬасЕасдссЕдЕдсЕдЕаадаадсЬдаада!:!:!:»: ЕдсааЕдсссаЕдсаддаЕаесаадаЕдаСссЕдааааЕддЪдсадсЕддасЕсЕаЕЕдаадаЪеЪддаа дЕдасЪедЪассСддаадсСасссассЕЪддсдаааееекскссесассЬдддссадаедаебааесЕдс дЬадасЕссЬссЕсЕсссасаЕссаЬдсаСсЕЬссЬасаЫЛссссддадааддаададсадИаЕаЬсдс ссадСЬсассесЕсадЕйссесадЕсЬдсадЬдссЕдсаддсксЪсСаЪдЕддасЕсЕЪЕаЪСЫхЪссее ададдссдсс1:дда1:сад<:1:дс1:саддсасд1:даЕдаасссс4±ддааасссЪсЕсааС.аас1:аас£.дсс ддсЕеЪсддааддддаЕдЕдакдсаСсЕдСсссададЕсссадсдЕсадЕсадсЕаадЕдЕссЕдадСсС аадЕддддЕсаЕдсЕдассдакдЕаадЕсссдадссссЬссаадсЕсЪдскддадададссЕскдссасс сЕссаддассЕддСсСЕЕдаЕдадЕдЬдддаЪсасддаЕдаЕсадсЪссЕСдсссЕссЕдссЕЕсссЕда дссасЬдсЬсссадсСЪасаассГХаадсЕЕсЕасдддааЕСссаесЬссаЕаЕсЕдссЫздсададЕсЕ сседсадсассЕсаЕсдддсЕдадсааЬсбдасссасдЕдсЬдЕаЪссЪдСсссСсЪддададЕЕаСдад дасаессаЪддЕасссЪссассЕддададдскЕдссЕаЕсЕдсаСдссаддсЪсадддадЕкдсЬдЕдЕд адЕЕддддсддсссадсаЕддСсЕддсЕЕадЕдссаассссБдЬссСсасЕдЕддддасадаассЬЬСЕа едасссддадсссаЬссЕдЬдссссЕдЕЪЕсаЕдссСаассСсдадсассассассассассас
М'Л ΙΌ ΝΟ: 6.
Аминокислотная последовательность для примера 3
МОР35Н55ЫМАИТОМКЗСКИ1АНЙСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКА1<АРАООАОУЬЕ<201АМТКОСЙЬУУ1НОНРЬ ОСЬТОУАККЕРНЙНККСаКУУУГПЕТЬКЕЮЗЬЕМТЕМЕЕТМЕКККЬНОЗЮЗПУТЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АСОЗЬЬКОЕАЬА1ААЬЕЬЬРЙЕЬРР₽ЬГМААГООКНЗОТЬКАМУОАНРРТСЬРЬОУЬМК<ЗОНЬНЬЕТРКА УЬОаЬЕУЬЬАОЕУКРНЙИКЬОУ1Д)ЬККМЗНаСРИТУИ5С№АЗЬУ8РРЕРЕААОРМТКККК7ЛОЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕУЬУСЪГЬКЕСАСЕЕЬГ8УЪ1ЕКУККККЫУЬКЬССККЬК1ЕАМРМ0П1КМ1ЬКМУ<21|О31ЕОЬЕ 7ТСТИКЪРТЪАКР5РУЬС0тКЬКЯЬЪЬ5Н1НАЗЗУ18РЕКЕЕ0У1А0РТ50ГЪЗЬ0СЬ0А11УУСЭЪРРЪ НСКЬООЬЬКНУТШРЬЕТЬЗ1ТКСКЬЗЕОПУМНЬЗОЗ Р 8 УЗОЬЗ УЬЗЬЗОУМЬТОУЗ РЕРЬОАЬЬЕКАЗ АТ ЬООЬУГСЕСаГТОСОЬЬАЪЬРЗЬЗНСЗОЬТТЬЗГУСНЗХЗГЗАЬОЗЬЬОНЫСЬЗЫЬТНУЬУРУРЬЕЗУЕ ОТНаТЬНЬЕКЬАУЬНАЯЬКЕЬЬСЕЬаКРЗМУИЬЗАЫРСРНСОПКТГУОРЕРТЬСРСГМРКЬЕНННННН
- 22 016326
8ЕО ΙΌ \О: 7.
Последовательность ДНК для примера 4 аСддаессаадсадссаЬЬсаСсаааЪаБддсдааЪасссаааСдаааЪсадасааааЕсаЬБаЬЕдсЬс ассдбддЬдсЬадсддЪЬаЪЬСассададсаеасдкЬадааЬсеааадсасеедсдйЪЬдсасаасаддс ЬдаЬЪаЬееададсаадаеьеадсааЕдасЬааддаеддЬсдЬЪЪадЪддЬеаЕЪсасдаЬсасеЕЪЕЬа даеддсеедасЬдаЬдЕЪдсдааааааЬЬсссасаесдЬсаЬсдЬааадаЬддссдЬЬасЬаСдЬсаесд асеЬБассеЪаааадаааеЪсааадЪьеадаааедасадаааасЫХдааассаеддаасдааддсдЫхЪ дСддддЪессаЬесададссдаЬасаЪсадсаЪдадедЬдЪддасаадсссасддадасЬЬдЬддадсЪд дсадддсададссЪдсЪдааддаЬдаддсссЬддссаСЪдссдсссЪддадЪЪдсЪдсссадддадсЪсЬ ЬсссдссасСсексаЪддсадссеЫхдасдддадасасадссадасссйдааддсааЬддЬдсаддссЬд дсссЬесассЪдссесссесЪдддадЕдс(:да!:даадддасаасаес!:ЬсассС.ддадасс1:Бсааадс1: дЬдсьедаЪддасЬЬдаЪдЬдсЬссЫхдсссаддаддсесдссссаддаддСддааасЬЪсаадЬдскдд аьЬЪасддаадаасбсЬсаЬсаддаскксЬддасБдеаЪддЪсЬддааасадддссадЬсЬдЬасЪсаЬЪ ЬссададссадаадсадсйсадсссаЪдасааадаадсдаааадЕадаЬддСЪЬдадсасададдсадад садсссБЪсаЬЕссадЬададдЪдсЬсдкадассЬдЕСссесааддааддСдссСдьдабдааСИдЪЬсС ссбассЪсаЬЬдадааадЬдаадсдааадаааааСдеасЕасдссБдЬдсСдЬаадаадскдаадаЬесе. СдсааедсссакдсаддаЬаЪсаадасдаЪссЕдааааЪддедсадсСддасесЬаЕедаадаееьддаа дедасекдкассЪддаадсЪасссассЕеддсдаааеьеъсЬсссеассЬдддссадаЪдаЬЕааЬседс дЬадасЬссЕссЬсЪсссасакссаЬдсаесеЬссеасаЬъессссддадааддаададсадЬаЬаесдс ссадеесасс1:с1:сад1:есс1:садЬс1:дсадЬдсседсаддсЬс!:с1:аедг:ддас1:сес1:аееЫ:1-сс!:с ададдссдссЬддаесадБЬдсесаддсасдЪдаедаассссЪЪддааасссесесааЬаасБааседсс ддсСЬСсддааддддаЬдедаедсаЕсЕдЪсссададЕсссадсдисадЕсадсЬаадЪдЪссБдадЪсЬ аадбддддЬсаЬдсЬдассдаСдСаадесссдадссссЪссаадсеседседдадададссЬседссасс сЬссаддассЪддЕсЕЪЬдаЬдадБдЬдддаЬсасддаСдаЬсадсЕссЩ-дсссЪссЪдссЬЪСссЬда дссаседсЪсссадсебасаассЪЬаадсЬЪсЪасдддааЬЬссаЪсЬссаЬаСскдсскЪдсададЪсС сседсадсассесассдддсЪдадсааесЬдасссасдедсЪдЬаессЬдСссссседдададЬЪаБдад дасаЪссаЪддЕасссессасседдададдсЪедссеаЪсЬдсаедссаддсЪсадддадЪЬдсЬдедед адЬЪддддсддсссадсаеддесЬддсЪЪадедссаассссЪдЪссЪсасЕдЬддддасадаассЬЬсЬа СдасссддадсссаесссдЬдссссЬдСБЬсаЬдсскаас
81-'О II) \О: 8.
Аминокислотная последовательность для примера 4
МОР55Н35ЫМАЫТ0МК5ОК111АНКаА5аУЬРЕНТЬЕЗКАЬАРА<2<аАСУЬЕасЬАМТК0СЯЬУУ1НОНРЬ
ВСЬТаУАККРРНВННга)СКУУ71ПРТЬКЕ1СЗЬЕМТЕНРЕТМЕРКЙЬИС31<23КУ13МЗУИТЗРЙКЕУЕЬ
АЗОЗЬЬКОЕАЬА1ААЬЕЬЬРКЕЬРРРЬРМААРСС1гнЗСТЬКАМУаАИРРТСЬРЬаУЬМКа(ЭНЕНЬЕТРКА
УЬОаьОУЬЬАОЕУКРВКИКЫЭУЬОЬККЫЗНаПРМТУИЗбЫКАЗЪУЗРРЕРЕААаРМТККККУРОЬЗТЕАЕ
0РГ1РУЕ7ЬТОЬРЬКЕаАСОЕЬР5¥ЫЕК7КйКЮЛ7ЫгЬССККЬК1РАМРМаО1КМ1ЬКМУ0ЬП31ЕОЬЕ
1/ТСТ«КЪРТЬАКРЗРУЬ<ЗаМ1НЪККЬЪЬЗН1НА88УГЗРЕКЕЕОУ1АОРТЗОЕЪЗЬОСЕОАЬУ71)5ЬРРЬ
К<ЗйЬО2ЬЬЕН7МИРЬЕТЬ31ТЫСЕЬЗЕСПУМНЬЗОЗРЗУЗОЬЗУЬЗЬЗаУМЬТОУЗРЕРЬаАЬЬЕЙАЗАТ
Ь00ЬУР0ЕС<31ТСП0ЬЬАЬЬРЗЬЗНС50ЬТТЪЗРУ(Зи31318АЬОЗЬЬ0НЫОЬЗЫЪТНУЪУРУРЬЕЗ¥Е
Б ПКЗТЬНЬЕКЪ АУЬНАЕЬНЕЬЬСЕЫЗЕ РЗМУИЬЗАЙРСРНССОЕТРТО РЕРIЬС ΡΟΡΜΡΝ
- 23 016326
8Е9 ΙΌ ΝΟ: 9.
Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 3 а аЕддаессаадсадссаеЪсаесаааеаЕддсдааеасссаааСдаааесадасааааЕсаеЕаеедсЪс ассдеддедсеадсддееаЫхЪассададсаЬасдеьадааЬсЕааадсасЕЕдсдЕЪЪдсасаасаддс Еда1:1:аЪ!:1:ададсаада1:1;еадсаа1:дас1:ааддаЬдд1:сдееьадЪддеъа1:1:сасда!:сас1:1:еЫ:а даЕддсЕЬдаседаедЬЬдсдааааааеесссасаесдЪсаЪсдЬааадаеддссдеъасеаЬдЪсаЬсд асЕЕЕассеЪаааадаааеЪсааадЕЬЕадаааЕдасадаааасЬЬЬдааассаЕддаасдЪсдЕсдСсЬ д^ддддсадсаеЕсададссдеГаЪаЪЕадсаЪдадсдЪдьддассадсссдсдЬсдЪсЪддЪЕдадсЬд дссддссададссЬдсЪдааадаЪдаадсдсЪддссаСЪдсддсдседдадсЪдсЪдссдсдедадседЬ еесСдссдседЬЬЬаеддсддсдЬЪЬдаЕддссдЪсаЕадссадассседааадсдаЬддЪдсаддсдЬд дссдеееасседеседссдсбдддсдЪдседаСдаааддссадсаесЪдсаесЪддааассеъеааадсд дЬдсЪддаЬддссЕддаЕдЪдсЬдсЬддсссаддаадЕЕсдессдсдЪсдеЕддааасЕдсаадЪдсЕдд аесЕдсдеааааасадссаесаддаееееЪддассдЕдеддадсддсааЕсдЪдсдадссЕдеаЬадсее ессддаассддаадсддсдсадссдаЕдаСсаааааасдЬааадЬддаЪддссЬдадсассдаадсддаа садссдЪЬЕаЕессддЕддаадЕдсЕддЕЕдассЕдЕЕЕседааадааддсдссЪдсдасдадсЪдЬЪеа дсЕаеседаесдааааадедааасдсаааааааасдедсЬдсдЪсЬдЬдсСдсаааааасЪдааааСсЕЕ сдсдаедссдаСдсаддаеаЪЪааааедаСсседааааЪддЪдсадсЪддаЕадсаССдаддассЕддаа дИдассЬдсассЕддааасЪдссдасссЪддссаааСЬЕадсссдеаесЪдддссадаедаЬЕаассЕдс десдеседсЪдсЪдесесаеаЪесаЪдсдадсадсЪаЪаьеадсссддааааадаадаасадеаеаСсдс дсадЕЕЬассадссадЕЪЕсЕдадссЕдсааедссЪдсаадсдсЪдЬаЕдЕддаеадссЬдЕЕеЬЕСсЪд сдЕддссдЬсЬддаесадседсЪдсдЬсаедЕдаЬдааЬссдседдааасссЬдадсаеЕассаасЕдсс десЕдадсдааддсдаЕдЬдаЬдсаСсЕдадссададсссдадсдееадссадсЕдеседЬСсЬдадссЪ дадсддсдЪдаедсЬдассдаЪдедадсссддаассдседсаадсссЕдседдаасдЕдсдадсдсдасс сЬдсаадассЬддЬдеЕедаЕдааЕдсддсаЕЬассдаЪдаесадседседдссседсГдссдадссЬда дссаеЕдсадссадсЬдассасссЕдадсЕЪЬеаеддсаасадсаеЕадсаЕЕадсдсдседсааадсс!: дседсаасаеседагеддссЪдадсаассЬдасссасдЕдседеаЕссддЕдссдседдааадсеаедаа даСаЕесаеддсасссЕдсаесЬддаасдбсЕддссЬаесЕдсасдсдсдесЬдсдЬдадсЕдсбдЪдсд адсЬдддссдбссдадсаеддееъддседеседсдааСссдедсссдсаеедсддсдаЬсдЪассЬЪЬЬа ЕдаЬссддаассдаеьсЕдЬдсссдбдсЬЫгабдссдаассассассассассассас
8Е9 ΙΌ ΝΟ: 10.
Аминокислотная последовательность для примера 3 а
МОР85Н53ЫМАМТ0МК8ОК111АННОА8СУЪРЕНТЪЕ8КАЪАРА00АЕУЬЕ0ПЪАМТ1ФСЭНЬУУ1НОНРЬ ООЬТОУАККРРНКНККСОКУУУХСРТЬКЕКЭЗЬЕМТЕМРЕТМЕКйКЬНаЗПЭЗКУХЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АС08ЬЬКЕЕАЬА1ААЬЕЬЬРКЕЬГРРЬРМААГОСКН50ТЬКАМУ0АИРРТСЪ₽ЬСУЬМК<3<ЭНЬНЬЕТРКА УЬССЬОУЫАОЕУКРККНКЬОУЬОЬКККЗНООРИТУНЗСЗЫКАЗЬУЗГРЕРЕААСРМТККВКУОСЬЗТЕАЕ 0РР1Р7ЕУЬ7ЕЬРЬКЕОАСОЕЬР5УЫЕКУККККМУЪНЬССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬО31ЕОЬЕ 7ТСТИКЬРТЬАКР8РУЬа0М1ЫЬККЬЬЬЗН1НА88У13РЕКЕЕ(ЭУ1АаРТЗСРЬ8Ь0СЬ0АЬУУЦ5ЬРРЪ НОКЬСОЬЬННУМЫРЬЕТЬЗХТКСНЬЗЕСПТМНЬЗОЗРЗУЗСЬЗУЬЗЬЗаУМЬТОУЗРЕРЪОАЬЬЕКАЗАТ ЬС0ЬУРОЕСО1ТОО0ЫЛЫ,Р8Ь8НС30ЬТТЬ8РУСН81315АЬ05ЬЬаНЫСЬЗМЬТНУЬУРУРЬЕ5УЕ ОТНОТЬНЬЕНЬАУЬНАЙЬЯЕЬЬСЕЬСКРЗМУНЬЗАЫРСРНСаПНТРУОРЕРХЬСРСРМРКНННННН
- 24 016326
8ЕЛ ΙΌ N0: 11.
Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 4а аеддаЬссаадсадссаЪбсаЪсаааЬаЬддсдааСасссаааЪдааабсадасааааЪсаСбаЪЪдсбс ассдСддЪдсСадсддСБаЪССассададсабасдЬСадаабсЪааадсасеЪдсдЪбедсасаасаддс СдаЬСаЬЪЪададсаадаСбСадсаабдасЪааддаСддЬсдЬбЁадкддССаСксасдаБсасЬСкЬЬа даЪддсЫгдасЪдаСдСбдсдааааааРЬсссасаЪсдЪсабсдЬааадабддссдЪбасбаЬдЬсаЬсд аск^еасскБаааадаааЪЪсааадЬБСадаааЪдасадааааскЪЬдааассаЪддаасдесдЬсдксЬ дЬддддсадсаЪСсададссдббабаЬБадсаЬдадсдСдЕддассадсссдсдксдЪсСддЪЪдадсСд дссддссададссСдсЬдааадаЬдаадсдскддссаЬЬдсддсдскддадсбдсЬдссдсдЪдадсЪдЪ еессдссдседессаСддсддсдьеедаЬддссдСсаСадссадассскдааадсдаЬддЪдсаддсдед дссдРЫгассЬдЪсЪдссдсЪдддсдбдсЪдаЬдаааддссадсаЪсЪдсабсбддааассЬЪЬааадсд дСдседдаБддссСддаедСдсЪдскддсссаддаадБЪсдИссдсдксдЬкддаааскдсаадкдсЬдд аеседсдИааааасадссаСсаддаЪебЪЬддассдедбддадсддсааесдЪдсдадссбдЪаЬадсЕС СссддаассддаадсддсдсадссдаЬдассаааааасдЪааадЪддаБддссСдадсассдаадсддаа садссдРСБаеессддсддаадЪдсЬддЪбдассЪдЬЬЪсЪдааадааддсдсссдсдасдадсЪдбЕЬа дсСаесСдаСсдааааадЬдааасдсаааааааасдЪдсЬдсдЪсЪдЬдсЬдсаааааасЪдааааЪсЫ: сдсдаЬдссдаСдсаддаЬабеааааедаЪсседааааЪддЪдсадсбддаЬадсаеЪдаддассБддаа дЬдассЪдсассбддааасбдссдасссЪддссааасебадсссдГабсЬдддссадаСдабСаассСдс дЬсдЪсЪдскдскдЬсбсаЬаЪбсаЬдсдадсадсЬабабеадсссддааааадаадаасадеаЪабсдс дсадкЫзассадссадеъЬсЬдадссбдсааЬдсседсаадсдсЕдЬаБдеддаСадссЪдЬЬЬЪЬСсЬд сдСддссдЬскддаЬсадсЬдсЬдсдЬсаСдЬдабдааЬссдсСддааассскдадсаЬСассааскдсс дксЪдадсдааддсдаЬдедаЪдсаесЬдадссададсссдадсдЬСадссадсЪдкседГбсЬдадссб дадсддсдЬдабдсЪдассдаЬдбдадсссддаассдсбдсаадсссРдседдаасдСдсдадсдсдасс сГдсаадассЪддБдЬЬЪдаЬдааЪдсддсаЬБассдаЪдаЪсадскдсЕддсссЪдсЬдссдадссЪда дссаеЬдсадссадсЁдассасссЁдадссссСаЬддсаасадсаееадсабСадсдсдсЪдсааадсс!: дседсаасаЪседаееддссЬдадсаасседасссаЬдСдсСдеаессддедссдседдааадсеаСдаа даЬаСЬсаеддсасссЪдсаРсСддаасдессддссеаЪсСдсасдсдсдСсЬдсдЪдадсЪдсСдЬдсд адсбдддссдессдадса1:ддег:(:ддс»:д<:с1:дсдааессдедсссдсаС1:дсддсда1:сд1:асс1:1:е1:а едаессддаассдаБЪседЬдсссдбдсЬЬеаедссдаас
8ЕЛ II) N0: 12.
Аминокислотная последовательность для примера 4а
МОРЗЗНЗЗММАЫТСМКЗОКШАНРСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЬАРАООАОУЬЕОПЬАМТКССКЬУУХНСНГЬ ОСЬТОУАККРРНКНККОСНУУУЮРТЬКЕЮЗЬЕМТЕМРЕТМЕКККЬИСЗЮЗКУХЗМЗУ^ТЗРККЬУЕЬ АССЗЬЬКСЕАЬАХААЬЕЬЬРРЕЬРРРЬГМААРВСРНЗОТЪКАМУОАМРРТСЬРЬОУЪМКеОНЬНЪЕТРКА УЬПСЬОУЪЬАОЕУРРКНИКЬСУЬОЬКгаЯ5НООРКТУНЗС*1НАЗЬУ8РРЕРЕААСРМТККККУО(ЗЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕУЬ7ПЬРЬКЕОАСПЕЬРЗУЫЕКУККККЫУЬРЬССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬП31ЕПЬЕ \П'СТИКЬРТЕАКРЗРУ14ССМ1ЫЬККЬЬЬЗН1НАЗЗУ13РЕКЕЕ0У1А0РТЗСРЬЗЬ0СЬ0АЪУУОЗЬРРЬ РаКЬО0ЬЪКН7МКРЬЕТЬ31ТКСЙЬЗЕСС¥МНЕ503РЗУ30ЬЗУЬЗЬЗаУМЬТПУ8РЕРЬ0АЬЬЕИА8АТ ЬООЬУРОЕССХТЕЕОЬЬАЬЕРЗЬЗНСЗОЬТГЬЗРУСЫЗХЗХЗАЬОЗЕЬОНЫСЗЬЗКЬТНУЬУРУРЬЕЗУЕ П1Н0ТЬНЬЕР14АУЬНАЯЬНЕЪЬСЕЬСКРЗМУМЬЗАМРСРНССС1гТРУПРЕР1ЬСРСРМРЫ

Claims (20)

1. Слитый белок, содержащий:
(а) РКЛМЕ (антиген, преимущественно экспрессирующийся в меланоме);
(б) гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка И, где белокпартнер слияния содержит аминокислоты 20-127 белка И; и (в) дополнительные аминокислоты МеЕАзр-Рго на Ν-терминальном конце последовательности слитого белка, где гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка И (б), слит с Νконцом РКАМЕ.
2. Слитый белок по п.1, дополнительно содержащий аффинную метку.
3. Слитый белок по п.2, где аффинная метка представляет собой гистидиновый хвост.
4. Слитый белок по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и РКАМЕ; или между белком-партнером слияния и аффинной меткой; или между РКАМЕ и другой аффинной меткой.
5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-4.
6. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.5.
7. Выделенная клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.6.
8. Вакцина, содержащая слитый белок по любому из пп.1-4.
9. Вакцина, содержащая нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6.
10. Вакцина по п.8 или 9, дополнительно содержащая адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.
11. Вакцина по п.10, где адъювант содержит 3О-МРЕ, 0821 и/или олигонуклеотид СрО.
12. Применения вакцины по любому из пп.8-11 в медицине.
13. Применение белка по любому из пп.1-4, или нуклеиновой кислоты по п.5, или вектора по п.6
- 25 016326 для изготовления вакцины для иммунотерапевтического лечения пациента, страдающего раковым заболеванием.
14. Применение по п.13, где раковое заболевание выбрано из меланомы, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака легкого, такого как №СЬС (немелкоклеточный рак легкого), саркомы, рака яичника, рака в области головы и шеи, рака почки, колоректальной карциномы, множественной миеломы, лейкоза, включая острый лейкоз, и карциномы пищевода.
15. Способ получения слитого белка, включающий стадию экспрессии в выделенной клетке слитого белка по любому из пп.1-4.
16. Способ по п.15, в котором клетка представляет собой бактерию.
17. Способ по п.16, в котором бактерия представляет собой Е. со11.
18. Способ по любому из пп.15-17, дополнительно включающий стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток.
19. Слитый белок, полученный или получаемый способом по любому из пп.15-18.
Анализ 8Ο8-ΡΑΘΕ 1/ЗРО-РРАМЕ с или без Ηϊδ-хвоста в векторе рЕТ21 (Примеры/конструкции №№ 3 и 4)
1 2 3 4 5 6 7 8 5 1011 12 13 14 15 16 17 18
I» 195 >
Фиг. 1
Анализ 808-РАСЕ кодон-оптимизированного 1/ЗРО-РКАМЕ с или без ΗΪ8хвоста в векторе рЕТ26 (Примеры/конструкции №№ За и 4а)
1 2 3 4 3 6 7 8 9 ΙΟ 11 12 13 14 15 16 17 18
Фиг. 2
Фиг. 3
- 26 016326
Ответ СО8 (адъювант А801В - 20070499)
Фиг. 4
Ответ 0ϋ4 (адъювант А815 - 20070502)
Фиг. 5
Ответ Οϋ8 (адъювант А315 - 20070502)
0070502 Иммуногенность Ρϋ РКАМЕ, приготовленного в виде прел антигена после 2 инъекцш .....' ! “он·' ” арата в А315, у СВ6Р1: дозовый диапазон . а ί ί I 0 25 435 РВРКАМЕ 47МКГ/А816 РО РКАМЕ 10 МКГ/А815 ротдме 5мкг/А815 ронине 0,4 ΜΚΓ/Α915 РогадмЕ 0,08 ΜΚΓ/Α515 | 0.2 ...... ---- --------- ..... .......- ~..........._ - - -- 1 01 - е 0.05 0 лЬ ΙΖΓΓ 1£. 1 .1 0 ·~ΠΠ □Ί Г Я — м 5? ... ... 01 О1 01 Θ1 <3202 02 02 03 03 03 03 04 04 04 04 05 05 050506080668 пул пул пул пул пул пул пул пул пул пул пул пул пул пул пуп пул пул пул пул пул пул пул пул пул 1 234123412 3 4 12 34 12341 234
Фиг. 6
-27016326
ΜΠί>3ΞΗ53ΝΜ ΑΝΤ0ΜΚ3ΡΚΙ
ЕОЛЬАМТХЛО КЪУУПЮНРЪ
ОЗЬЕМТЕИРЕ ТМЕКЙКЬИОЗ
101
151
ИАНКСАЗСУ ЬРЕНТЬЕЗКА ЬАРАООАОУЬ ЛСЗЬТОУАККР ΡΗΚΗΚΚϋΟΗΥ ΥνίυΡΊΊ,ΚΕΙ ЮЗКУТЗМЗУ ИТЗРННЬУЕЬ АСОЗЬЬКРЕА
ЬА1ААЬЕЪЬР НЕЬРРРЬРМА АРРСННЗОТЬ КАМУОАИРРТ СЬРЬОУЬМКС
251 ΚΑ5Ι/Υ5ΡΡΕΡ ЕААОРМТККК КУРОЬЗТЕАЕ ОРРТРУЕУЬУ РЬРЬКЕОАС!
351 УТСТМКЬРТЬ АКРЗРУЬСОМ ГЫЬКНЬЬЬЗН ΙΗΆ53ΥΙ5ΡΕ ΚΕΕΟΥΙΑΟΡΤ
401 ЗОРЬЗЬОСЬО АЬУУРЗЬРРЬ КСКЬРОЬЬРН УМЫРЬЕТЬЗ! ТЫСКЬЗЕСРУ
451 МНЬЗОЗРЗУЗ ОЬЗУЬЗЬЗСУ МЬТРУЗРЕРЬ ОАЬЬЕЯАЗАТ ЬОРЬУРРЕСО
501 1ТРР0Ы.АЫ. РЗЬЗНСЗОЬТ ТЬ5РУС№13 15АТ.05Ы.0Н ЫСЬЗМЬТНУ
551 ЬУРУРЬЕЗУЕ РТНСТЬНЬЕЯ ЬАУЬНАКЬКЕ ЬЬСЕЬОКРЗМ УМЬЗАКРСРН
601 ССРЯТРУРРЕ РГЬСРСРМРЫ (ТЗС) / (ЬЕ) / НННННН
Для этих конструкций сигнальная последовательность не использовалась
Черный = АК (аминокислоты) 20-127 белка ϋ
Выделено черным = 1-Ме(, 2-Азр и З-Рго
Двойное подчеркивание = белок РКАМЕ; аминокислоты 1-509 РКАМЕ (всего
509 АК)
Подчеркнуто черной линией = хвост из 6 Ηΐδ с линкерной последовательностью, показанной в скобках, которая варьировала или присутствовала в зависимости от клона.
Фиг. 7
Выравнивание между Ι_ϊροΟ-ΜΑ(3Ε3-Ηίδ (ЗЕО Ю N0:43) и ρΟ1/3-ΡΚΑΜΕ-Ηίδ (ЗЕО Ю N0:10)
1 60
МОРКТ1ЛРЗЬ1ЛАСУЬАОСЙЗНЯ.'?НМА'ЫТдМК90Х111ЛНН(ЗА80УЬргКТЬг:я.ЧЛЬ1РЛ МОР- ------- ЯЯНЗЯМГЛАОТ^МУЯПКГГГГЗЗШЗАЯСПРЕЛТПЕЯКЛЫРА
61 120 ^ΡΥυ3ςυ^νΐΤΚΙΧ3ΒΙάννΐΗΕίΐΡΐ4ΧϊΜ15νΛΚΚΡΡΗΗ1!ΚΚβ(3ΒΥΥνΐΕΡΤ1,ΚΕΧ051/3 СО;и>'ЛЕ00£ЛЕ'Л’КРс;ПЬУУГНРНР1ДХ1Х.ТОУАК?Й’РНКНйКПСНУ¥У1аР'ГЬХЕ1«Я1П«
121 180 даИЧРЕТИДЬЕ...... ОНЗОНСКРЕЕбДЙАНаЕЯГХЗЬУСАОАРАТЕЗ- - -ОБ- Ш.’ЕЫРЕ’1^|КЕКЬК<3 51 <23 ΚΥIЗМЯУЧТЗ РЯКЬДЕГАООЙШаЭ ΕΑΟΑΙ ААБЕЫ.Р ЯЕЬ?
181240
- - .....аДЗЗЯЗТЬУеЭт-.....-13...... 3νΡΑΑΕ3₽β
РРЬРМААРРдкНвОТЬКАВУОАИРРТСЬРЬОУЬМКСОНЬНЬЕТРКАУЬРСЬвУЫАаЕУВ
241300
Р-----------Р0-ЦРДОА8^₽|ТМЫУРТ1803УЕ]§И|ЭЕЕ----- -----ЕДРЙТРР
РНЙИКЪ0'УЪСЬЯКЫЙН<{ОРН|НидвМНАаГ^|ЙРРЕРД8®РМТККНКТО<ЗЬ8Т’^|Е0РРГ
301360
Е1КЗЕЕ0ААЬЗЯКУА|141НГЬЬДКУЙАКЕР- - гР^ЙУЬУРЬР1(КЕаАСЙЕДГЗУ1^ЕКУКЙКЮтлКЬССККЬК1РАМРМдО1КМ1ЬКМУ0ЬО
361420
--------νχ.χ------А-ЕМ1ЙЗ^СЫИ0¥ГЕРу1Е^кДзЗё------1431АДГб1ЕЬД 31ЕОЬЕУТСТИКЬРТ1ЛКЕЯРУЫ10{^ЬКК1ЬЪ8Н1Н||53У13РЕКЕЕОУ1М!ЕТ80Г| 421480
Е5ррЗСНЫ^г8тСЬСЬЗУРСЫХЗОЫО1МРКАСЬЫ1УЬА31АКЙСРСАРЕЕК1ИЕ31<87 зЯОСЙОАЫфаЕГЕЕКСНЕООЬЬКНУЗыРЬЕТЬЗ.ТТЫСкДЗЕСДУМНЕЗОЗРЗУЗОЬЗУ
481540
ЬЕдрЕОКЕСЗДиэЙРККЬЬТС}--------------НРУрайУЬЕУЙОУРаЗОРАСУЕРЬЯ
Т1535СУМЬТОЙЗРДрЬ0А11ЬЕВА5АТЕ<}ПГ1УРПЕСа1ТРЙ|иАЬЬРЗЬЗНС50ЬТТЬЗД
541600 арк^УЕ.?3¥Укдьннй|к1^асрн38Урр......-..... ьнхидьк
УСК^£1а|Ьр35Ь0Н|ЯсД5ЫЫТ1||ЕТРУРЕЕЗ¥ЕП1НСТЕНЕЕКЬА¥1,НАК11КЕЬЙСЕ
601642
ЫроВ-МАСЕЗ-Нхз ¢1) рВ1/3-РКАМЕ-Нхз (1) ЬхроВ-МАСЕЗ-Н1з (61) рО1/3-РКАМЕ-Нхз (45) ЫроО-МАНЕЗ-Нхз (121) рО1/3-РКАМЕ-Нхз (105) ЫроО-МАОЕЗ-Нхз (165) ρΒΙ/3-РКАМЕ-Нхз (165) ЬхроВ-МАСЕЗ-Нхз (188) рО1/3-РКАМЕ-Нхз (225) Ыров-маоез-нхз (227) рВ1/3-РКАМЕ-Нхз (285) ЫроО-МАСЕЗ-Нхв (257) рО1/3-РНАМЕ-Н1а (345) ЬхроО-МАСЕЗ-Нхз (295) рЩ/З-РКАМЕ-Нхз (405) ЫроВ-МАСЕЗ-Нхз (355) рВ1/3-РЙАМЕ-Нхэ (465) ЫроО-МАСЕЗ-Нхв (401) рВ1/3-РНАМЕ-Нхз (525) ЫрсВ-МАСЕЗ-Нхя (438) ρθΙ/3-ΡΚΑΜΕ-ΗΪΒ (585)
Е
БОЕ..........-......Е------------(ЗСНИННИЯН
ЬаКР8МУИЬ8АЫРСРНСОТНТРУПРЕР1ЬСРСГМР«ННИННН
Фиг. 8
- 28 016326
Выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ω из
НаеторМиз тПиепгае (8ΕΩ Ю N0:41), Ι_ΐροϋ-ΜΑΟΕ3-Ηΐδ (8ЕО Ю N0:45) для применения в качестве белков-партнеров слияния по настоящему изобретению
Белок Б_Н 1пЯиепгае (1) ЫроР-МАСЕЗ-Н18 (1) Консенсус (1) Белок О_Н тЯиепгае (51) υροϋ-ΜΑΘΕ3-Ηί8 (51) Консенсус (51) Белок Б_Н тЯиепгае (101) ИроР-МАСЕЗ-Н18 (101) Консенсус (101)
М КТЬАЬЗЫААСУЬАаСЗЗНЗЗЫМАИТОМКЗОК! 11АНКСАЗаУЬРЕН
100
ТЬЕ9КМЛРАООАГ1¥1ЕОП1АМТИЗОВ1>з«йг1Л1ЙГ!Д:ОЬТ131/АРКГРННН
ТЬЕЗКАЬАРА<20АПУЬЕ0О1ЛМТКПаНЬУУ1НОНРЬПСЬТСУАККРРНКН
101
127
ККГЮКУУУ101П’БКЕХ®1.ЕИГЕМЕЕТ
ΗΚ0αΚΥΥνΐΠΡΤΙ.ΚΕΙ<23ΕΕΜΤΕΝΡΕΤ
Фиг. 9
Выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ω из
НаеторЬИиз /пПиетае (8ЕО Ю N0:41), ЫроО-МАОЕЗ-Ηίδ (8ЕО Ю N0:45) и ρΩΙ/3-ΡΚΑΜΕ-Ηΐδ (8ЕО Ю N0:44) для применения в качестве белков-партнеров слияния по настоящему изобретению
Белок Б_Н тЯиепгае (1) Ι_ίροΡ-ΜΑΘΕ3-Ηί3 (1) рР1/3-РКАМЕ (1) Консенсус (1) Белок Р_Н тЯиепгае (51) ИроР-МАСЕЗ-Н18 (51) рР1/3-РКАМЕ (33) Консенсус (51) Белок Р_Н тЯиепгае (101) ίίροΡ-ΜΑΘΕ3-Η18 (101) рР1/3-РРАМЕ (83) Консенсус (101)
ОАЗЯУЬРВН
-------------------М3 3433ΝΜΑΝΤ0?«<3ΐ2ΚΙΪΪΑί·Π?ΰΑ3Ο1ΓΙ.ΡΕΗ М КТЬАЬЗШААаУГЛаСЗЗНЗЗММАЙТОМКЗОК! 11 АНааАЗСУЬ РЕН 51 100 ттдатаодАооАсхпвопммтквсйЪУ-и'.тйснрг.орхлптахкррнйн Т1.ЙакАЬАрад’АСУ1ЛСПЩМйТКГХ!ШдуУТЯ0£Й;12Ю1/Гй№КМ,Р!НЕП ТЬЕЗКАЬАРА00А£ГГЬ20ОМИТКПСНШ.У1НЕНгги®ЬТПУЛККРР1£ЙН ТЬЕЗКАГАРАОаАОУЬЕОПМОТКПСНЬУУТНдаРЬГЮЬТОУАККГРНПН 101 127
ПЧТЮНУГ/ЦЗИЪКЗГЧЗЬРМТгЫР?!’!!
НКЙСК’/У УХВРТЬКЕ ГдвЬЕМСЕМГЕ·®
ΕΚΙΧ3ΡΛ’Ύνΐυί-ΓΕΚΕΧ08ΕΕΜΤ3ΝΡ®ή
ΚΚΙΧ3ΚΥΥνΐΟΡΤΕΚΕΙ05Ι,ΕΜΤΕΝΡΕΤ
Фиг. 10
Анализ δϋδ-ΡΑΟΕ ρΩΙ/3-ΡΗΑΜΕ с или без секреторного сигнала (88) и Ηΐδхвоста (Ηΐδ) в векторе рЕТ21
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17
Фиг. 11
- 29 016326
Последовательность белка ϋ 1/3 МАСЕ-АЗ-Ηΐδ (8ΕΩ Ю ΝΩ:43) | Ν-конец МРР) белок Р 1/3 | Ме1А5р | Ма§еЗ | О1уО1у7хН15 С-конец{
2 124 3 314
МР РКТЬАЬ 8 ЬЬААСУЫкССЗ ЗН5 5^1ΑΝΤΩΜΚ3ρΚΙ II АН_4 О
ЕСАЗОТЬРЕНТЬЕЗКадРАйОАРУЬЁСрТ^ТКРСКруУ 8 0
1НРНРЬРСЬТРУАККРРНКНККЬОЕУУУ1РРТЪКЁ10'ЗЬЕ 12 0
МТЕЦЕЕТмрЪЁОЕЗСНСКРЁЕСЬЁАЁОЕАЬОЬУСАСАРАТ......1(50
ЁЁдЕААЗЗЗЗТЪУЁУТЬОЕУР^
ΤΜΝΥΡίΝ3Ω3ΫΕ^
АЁЬУНРЬЪЬКУКАкЁРУТ&кЕМШ^
А335Ь0ЬУЁО1ЁЬМЁУРР1СНЬУ1РАТСЬОРЗ¥РСЬЬСРЦ''32б
01МР^ОЬЬ11У1А11АЕЁёРСАРЁЁК1НЁЁЬЗУЬЁУРЁёЗбО
ЁЁР31'ьдРРККЬЬТ0НРУ0ЁЫ¥ЬЁУЁ0УРаЗРРАСУЁРЬН4б0
СРЁАЬУЁТЗУУкУЬННМУК18ОёРН13УРРЪНЁМУЬЁЁСЁ''440
Ёсёшшйннн 451.............................................................................................
Подчеркнуто = сигнальная последовательность белка Ω, включая 1-Ме1 и замены 2-Азр и З-Рго вместо нативных АК 2-1_уз и З-ТЬг белка Р.
Подчеркнуто двумя линиями = аминокислоты 20-127 белка Ω.
МР = неродственные аминокислоты Ме1-Азр в положениях АК 128-129 для создания сайта клонирования.
СС = неродственные аминокислоты С1у-С1у в положениях 442-443. .Прдчеркнуто..пунюгирной..лиш®й = фрагмент ΜΑΩΕ3; аминокислоты 3-314 МАСЕЗ (всего 312 АК)
ННННННН = хвост из 7 Ηίδ.
Фиг. 12
- 30 016326
Список последовательностей <110> с1ахо5пп’гЬк11пе В1о1од1са1з БА <120> Вакцина <130> νΒ62293 <150> 0700760.2 <151> 2007-01-15 <150> 0701262.8 <151> 2007-01-23 <160> 45 <170> Ра515Е0 для 1Л/1 ηάονν$ уегзтоп 4.0 <210> 1 <211> 1887 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - Т5СНННННН (плазмида ТСМР14) <400> 1 агддаТссаа дсадссаТТс аТсаааТаТд дсдаатассс ааагдааатс адасааааТс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат тгассададс аТасдТТада аТсгааадса120 сггдсдтггд сасаасаддс гдатгагтта дадсаадаТТ тадсаатдас ТааддаТддг180 сдтгтадтдд ттаттсасда ГсасТИТТа датддсттда стдагдтгдс дааааааттс240 ссасатсдтс агсдгааада тддссдГГас татдтсатсд астттасстт аааадааагг300 сааадтттад ааагдасада ааасГЬЬдаа ассатддаас дааддсдтгг дтддддгтсс360 аггсададсс дагасатсад сатдадгдтд тддасаадсс сасддадаст тдгддадстд420 дсадддсада дсстдстдаа ддаГдаддсс сТддссаггд ссдсссгдда дттдстдссс480 адддадсгст гсссдссаст сттса1ддса дсстттдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд ТдсаддссТд дсссттсасс тдсстссстс ТдддадТдсТ датдааддда600 саасатсттс асстддадас стгсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дстссттдсс660 саддаддттс дссссаддад дгддааасгг саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттсг ддастдтагд дтстддааас адддссадтс гдтастсатт Тссададсса780 даадсадстс адсссатдас ааадаадсда ааадтадатд дгттдадсас ададдсадад840 садсссттса ТТссадТада ддгдсЬсдта дасстдттсс Тсааддаадд гдсстдтдат900 дааттдттст сстасстсат гдадааадгд аадсдааада аааагдтасг асдсстдтдс960 тдтаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссасстгд1080 дсдааатттт сгссттасст дддссадатд атгаатстдс дтадастсст сстсгсссас1140 атссатдсат стгсстасат тгссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадтгсс тсадтсгдса дтдссьдсад дстстсгагд гддастсттт атттттссгг1260 ададдссдсс ТддаТсадГГ дстсаддсас дтдатдаасс ссТГддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддагдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадг1380 садсгаадтд тсстдадтст аадтддддтс атдстдассд атдтаадтсс сдадссссгс1440 саадстстдс гддадададс сгстдссасс сгссаддасс тддтсгттда гдадтдгддд1500 атсасддатд атсадстсст тдссстсстд ссттссстда дссастдсгс ссадсттаса1560 ассттаадст ТсТасдддаа ттссатстсс ататсгдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс гдадсаагст дасссасдтд сгдгатссЬд ТсссссТдда дадттатдад1680 дасатссатд дтасссгсса сстддададд сттдссгатс Гдсатдссад дстсадддад1740 ттдсгдтдгд адттддддсд дсссадсагд дгстддстта дтдссаассс стдтссгсас1800 тдтддддаса даассттста гдасссддад сссагссгдг дссссгдгтт сатдсстаас1860 асгадгддсс ассагсасса гсассаг1887 <210> 2 <211> 629 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РЯАМЕ - Т5СНННННН (плазмида ТСМР14)
- 31 016326 <400> 2
мег А5р РГО Бег Бег нтз Бег Бег АЗП мег А1а Азп ТЬг 61 η мег ьуз 1 5 10 15 5ег Азр ьуз 11е 11е Не А1а НТ 5 Агд 61 у а! а Бег 61у туг Ьеи РГО 20 25 30 61 и Н15 тЬг ьеи 61 и Бег ьуз А1а ьеи А1а РЬе А1а 61 п 61 η А1а Азр 35 40 45 туг ьеи С1и 61 η Азр Ьеи А1а мег тЬг ьуз Азр б1у Агд ьеи Уа! Уа1 50 55 60 11 е НТЗ Азр нтз РЬе ьеи А5р 61 у ьеи тЬг Азр Уа1 А1 а ьуз ьуз РЬе 65 70 75 80 РГО нтз Агд Нт 5 Агд ьуз Азр 61 у Агд туг туг Уа1 Не Азр РЬе ТЬг 85 90 95 ьеи ьуз 61 и Не 61п Бег Ьеи 61 и мег тЬг 61 и АЗП РЬе 61 и тЬг мег 100 105 110 61 и Агд Агд Агд ьеи тгр 61 у Бег Не 61 η Бег Агд туг 11 е Бег мег 115 120 125 Бег Уа! тгр тЬг Бег Рго Агд Агд ьеи Уа1 61 и ьеи А1а 61 у 61 п Бег 130 135 140 ьеи Ьеи ьуз Азр 61 и А1а ьеи А1а Не А1а А1а ьеи 61 и ьеи ьеи РГО 145 150 155 160 Агд С1и ьеи рНе РГО РГО ьеи РЬе мег А1а А1а рЬе Азр б!у Агд нтз 165 170 175 Бег с! ή тЬг ьеи ьуз А1а мег Уа! 61 η А1а тгр РГО РЬе тЬг Суз ьеи 180 185 190 РГО ьеи б! у Уа! Ьеи мег ьуз 61у 61 η НТ 5 ьеи НТЗ Ьеи 61 и ТЬг РЬе 195 200 205 ьуз а! а Уа! Ьеи Азр 61 у ьеи Азр Уа! Ьеи ьеи А1а 61 п 61 и Уа1 АГу 210 215 220 Рго Агд Агд тгр ьуз ьеи 61 η Уа! Ьеи Азр ьеи Агд ьуз Азп Бег НТЗ 225 230 235 240 61 η Азр РЬе тгр тЬг Уа! тгр Бег 61 у Азп Агд А1а Бег ьеи туг Бег 245 250 255 РЬе РГО 61 и Рго 260 61 и А1а А1а 61 η РГО 265 мег тЬг ьуз ьуз ьуз Уа! Азр С1у ьеи Бег тЬг 61 и А1а 61 и 61 η РГО РЬе Не Рго Уа! 61 и Уа1 275 280 285 Ьеи Уа1 Азр ьеи РЬе Ьеи ьуз 61 и 61 у А1а суз Азр 61 и ьеи РЬе Бег 290 295 300 Туг Ьеи Не 61 и ьуз Уа1 ьуз Агд ьуз ьуз А5П Уа! ьеи Агд Ьеи суз 305 310 315 320 Суз ьуз ьуз Ьеи ьуз Не РЬе А1а мег Рго Мег 61 η Азр 11 е Ьуз мег 325 330 335 Не Ьеи ьуз мег уа! 61 η Ьеи Азр Бег Не 61 и Азр ьеи 61 и Уа1 тЬг 340 345 350 Суз тЬг тгр ьуз ьеи РГО тЬг ьеи А1а ьуз РЬе Бег Рго туг Ьеи 61 у 355 360 365 61 η мег Не АЗП Ьеи Агд Агд Ьеи ьеи ьеи Бег нтз Не Нтз А1а Бег 370 375 380 Бег Туг 11 е Бег РГО 61 и ьуз 61 и 61 и 61 п Туг Не А1а 61 п РЬе тЬг 385 390 395 400 Бег с! η РЬе ьеи Бег Ьеи 61 η суз ьеи 61 η А1а ьеи туг Уа! Азр Бег 405 410 415 ьеи РЬе Рпе ьеи Агд 61 у Агд ьеи Азр 61п Ьеи ьеи Агд нтз Уа1 мег 420 425 430 Азп Рго Ьеи 61 и тЬг ьеи Бег 11 е тЬг АЗП суз Агд ьеи Бег 61 и 61 у 435 440 445 Азр Уа1 мег нтз Ьеи Бег 61 η Бег Рго Бег Уа1 Бег 61 η Ьеи Бег Уа! 450 455 460 ьеи 5ег Ьеи Бег б1у Уа! мег Ьеи тЬг Азр Уа! Бег Рго 61 и Рго Ьеи 465 470 475 480 С1п А1а ьеи Ьеи 61 и Агд А1а Бег А1а тЬг Ьеи 61 п Азр ьеи Уа1 РЬе 485 490 495 Аэр С1 и Суз 61 у Не ТЬг Азр Азр 61 η ьеи ьеи А1а ьеи Ьеи Рго Бег 500 505 510 ьеи Бег НТЗ Суз Бег 61 η Ьеи ТЬг ТЬг ьеи Бег РЬе туг 61у Азп Бег 515 520 525 Не Бег Не 5ег А1а Ьеи 61 η Бег Ьеи Ьеи 61η Нтз Ьеи Не б!у Ьеи 530 535 540
- 32 016326
Бег А5П ьеи тЬг НТ 5 Уа1 ьеи Туг РГО Уа1 Рго ьеи 61 и Бег туг 61и 545 550 555 560 А5р Не НТ 5 С1у тЬг Ьеи НТ 5 Ьеи 61 и Агд Ьеи А1а туг ьеи ΗΪ 5 А1а 565 570 575 Агд ьеи Агд 61 и Ьеи ьеи СУ5 61 и Ьеи 61 у Агд РГО Бег ме! Уа! тгр 580 585 590 Ьеи Бег А1а 595 А5П Рго СУ5 РГО НТ 5 600 СУ5 б!у А5р Агд тЬг слег РЬе туг А5р Рго 61 и РГО 11е ьеи Суз Рго Суз РЬе ме! Рго А5П ои □ тЬг Бег 61 у НТ 5 610 615 620 Н1 5 НТ 5 НТ5 Нт 5 НТ 5
625 <210> 3 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МРР- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида ТСМР14) <400> 3 а!дда!ссаа дсадсса!!с а!сааа!а!д дсдаа!ассс ааа!дааа!с адасаааа!с60 а«а!!дс!с ассд!дд!дс тадсддттат «ассададс атасдггада атсгааадса120 с!!дсд!!!д сасаасаддс !да!!а!!!а дадсаадатт !адсаа!дас !аадда!дд!180 сд!!!ад!дд !!а!!сасда !сас!!!!!а да!ддс!!да с!да!д!!дс дааааааттс240 ссасатсдгс атсдгааада гддссдггас !а!д!са!сд ас!!!асс!! аааадааа!!300 сааадгттад ааатдасада ааас!!!даа асса!ддаас дааддсд!!! д!дддд!!сс360 аИсададсс дагасагсад са!дад!д!д Тддасаадсс сасддадас! !д!ддадс!д420 дсадддсада дсс!дс!даа дда!даддсс с!ддсса!!д ссдссс!дда д!!дс!дссс480 адддадс!с! тсссдссас! с!!са!ддса дсс!!!дасд ддадасасад ссадасссгд540 ааддсаа!дд !дсаддсс!д дсссТТсасс !дсс!ссс!с !дддад!дс! датдааддда600 сааса!с!!с асс!ддадас с!!сааадс! д!дс!!да!д дас!!да!д! дс!сс!!дсс660 саддаддггс дссссаддад д!ддааас!! саад!дс!дд атттасддаа даас!с!са!720 саддастгст ддасгдгатд д!с!ддааас адддссадгс !д!ас!са!! !ссададсса780 даадсадс!с адссса!дас ааадаадсда ааад!ада!д д!!!дадсас ададдсадад840 садсссГТса !!ссад!ада дд!дс!сд!а дассТдГТсс тсааддаадд !дсс!д!да!900 даа!!д!!с! сс!асс!са! !дадааад!д аадсдааада аааа!д!ас! асдсс!д!дс960 !д!аадаадс тдаада!!!! тдсаагдссс агдсаддага !саада!да! сс!даааа!д1020 д!дсадс!дд ас!с!а!!да ада!!!ддаа д!дас!!д!а сс!ддаадс! асссассТГд1080 дсдааа!!!! с!сс!!асс! дддссадатд а!!аа!с!дс д!адас!сс! сс!с!сссас1140 а!сса!дса! с!!сс!аса! !!ссссддад ааддаададс ад!а!а!сдс ссадгтсасс1200 !с!сад!!сс !сад!с!дса д!дсс!дсад дс!с!с!а!д !ддас!с!!! аПШссИ1260 ададдссдсс 1дда!сад!! дс!саддсас д!да!даасс сс!!ддааас сс!с!саа!а1320 ас!аас!дсс ддсггтсдда аддддатд!д а!дса!с!д! сссадад!сс садсд!сад!1380 садс!аад!д !сс!дадтс! аад!дддд!с а!дс!дассд а!д!аад!сс сдадсссс!с1440 саадсгсгдс гддадададс сгсгдссасс стссаддасс !дд!с!!!да !дад!д!ддд1500 а!сасдда!д а!садс!сс! !дссс!сс!д сс!!ссс!да дссасгдсгс ссадсттаса1560 ассттаадс! тстасдддаа !!сса!с!сс агатстдсст !дсадад!с! сстдсадсас1620 с!са!сдддс !дадсаа!с! дасссасд!д с!д!а!сс!д !ссссс!дда дадТТаТдад1680 даса!сса!д дгасссгсса сс!ддададд с!!дсс!а!с !дса!дссад дсгсадддад1740 !!дс!д!д!д адТГддддсд дсссадса!д д!с!ддс!!а дтдссаассс с!д!сс!сас1800 !дтддддаса даасс!!с!а тдасссддад ссса!сс!дт дсссс!д!!! са!дсс!аас1860 <210> 4 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида ТСМР14) <400> 4 мен Авр рго Бег Бег нтв Бег Бег Азп Ме1 А1а А5П тЬг б1п ме! Ьув 15 10 15
Бег А5р Ьу5 11е 11е 11е А1а нт‘5 Агд С1у А1а Бег С1у туг 1_еи Рго
- 33 016326
20 25 30
61 и нтз тйг Беи б!и 35 Зег Буз А1а Беи А1а 40 Рйе А1а 61 п 45 61 п А1а Азр Туг Беи б! и 61п Азр Беи А1а мет Тйг Буз Азр 61у Агд Беи Уа! Уа! 50 55 60 Не НТЗ Агр Нтз Рйе Беи Азр 61 у Беи ТЙГ Азр Уа1 А1а Буз Буз Рйе 65 70 75 80 РГО нтз Агд Нтз Агд Буз Азр 61у Агд туг Туг Уа1 11 е Азр Рйе тйг 85 90 95 Беи Буз 61 и Не 61 п Зег Беи 61 и мет Тйг 61 и АЗП Рйе 61 и тйг мет 100 105 110 61 и Агд Агд Агд Беи тгр б!у Зег Не 61 п Зег Агд туг Не Зег мет 115 120 125 5ег Уа! 1 чп тгр ТЙГ Зег РГО Агд η э ς Агд Беи Уа! 61 и Беи т ап А1а б1у 61 п зег Беи Беи Буз Азр 61 и А1а Хэ Э Беи А1а Не А1а А1а хя-и Беи 61 и Беи Беи Рго 145 150 155 160 Агд 61 и Беи РИе Рго Рго Беи РЬе мет А1а А1а Рйе Азр 61 у Агд нтз 165 170 175 Зег 61 п тйг Беи Буз А1а мет Уа1 61 п А1а тгр рго Рйе Тйг Суз Беи 180 185 190 Рго Беи б1у Уа1 Беи мет Буз 61у 61 п Нтз Беи Нтз Беи 61 и Тйг Рйе 195 200 205 Буз А1а Уа! Беи Азр 61 у Беи Агр Уа! Беи Беи А1а 61 п 61 и Уа1 Агд 210 215 220 Рго Агд Агд тгр Буз Беи 61 п Уа! Беи Азр Беи Агд Буз Азп Зег нтз 225 230 235 240 61п Азр Рйе тгр Т1тг Уа1 тгр 5ег б1у АЗП Агд А1а зег Беи туг Зег 245 250 255 Рйе РГО 61 и РГО 61 и А1а А1а 61 п РГО мет ТЙГ Буз Буз Агд Буз Уа1 260 265 270 Азр 61 у Беи Зег Тйг 61 и А1а 61 и 61 п РГО Рйе 11 е Рго Уа! 61 и Уа1 275 280 285 Беи Уа1 Азр Беи Рйе Беи Буз 61 и 61 у А1а Суз Азр 300 61 и Беи Рйе Зег Туг Ζ -?м Беи Не 61 и Буз Уа1 43 4 БУЗ Агд Буз Буз АЗП Уа1 Беи Агд Беи Суз 305 310 315 320 СУ5 Буз Буз Беи Буз □ 7 с 11 е РНе А1а мет рго зчл мет 61 п Азр Не Буз ээ с мет Не Беи Буз мет Уа1 61 п Беи Азр 5ег оои Не 61 и Азр Беи 61 и □ 0 Э Уа1 тйг 340 345 350 суз тйг тгр Буз Беи Рго тН г Беи А1а Буз Рйе Зег РГО Туг Беи 61 у 355 360 365 61 η мет 11 е АЗП Беи Агд Агд Беи Беи Беи Зег Нтз 11 е Нтз А1а зег 370 375 380 Зег Туг 11е Зег РГО 61 и Буг 61 и 61 и 61п туг 11 е А1а 61 п Рйе тйг 385 390 395 400 Зег 61 п Рйе Беи Зег Беи 61 п суз Беи 61п А1а Беи туг Уа! Азр Зег 405 410 415 Беи РИе Рйе Беи Агд 61 у Агд Беи Азр 61 п Беи Беи Агд нтз Уа! мет 420 425 430 Азп РГО Беи 61 и тйг Беи зег Не тйг Азп Суз Агд Беи зег 61и 61у 435 440 445 Азр Уа! мет Нтз Беи Зег 61 п зег Рго Зег Уа1 зег 61 п Беи Зег Уа1 450 455 460 Беи Зег Беи Зег 61 у Уа1 мет Беи ТЙГ Азр Уа1 Зег Рго 61 и Рго Беи 465 470 475 480 61 п А! а Беи Беи 61 и Агд А1а зег А1а ТЙГ Беи 61 п Азр Беи Уа1 Рйе 485 490 495 Азр 61 и Суз 61 у 11е ТЙГ Азр Азр 61 п Беи Беи А1а Беи Беи РГО Зег 500 505 510 Беи Зег Нтз Суз Зег 61 п Беи ТЙГ ТЙГ Беи Зег Рйе Туг 61 у Азп Зег 515 520 525 Не Зег Не зег А1а Беи 61п Зег Беи Беи 61 п нтз Беи Не б1у Беи 530 535 540 Зег АЗП Беи тН г Нтз Уа1 Беи туг РГО Уа1 РГО Беи 61 и зег туг 61 и 545 550 555 560 А5р 11 е нтз 61у тйг Беи нтз Беи 61 и Агд Беи А1а туг Беи нтз А1а 565 570 575 Агд Беи Агд б!и Беи Беи суз 61 и Беи 61 у Агд Рго Зег мет Уа! Тгр
- 34 016326
580 585590 ьеи 5ег А1а азп Рго суз Рго Нтз суз С1у Азр Агд тНг РНе туг Азр
595 600605
Рго 01 и Рго 11е Ьеи Суз Рго суз РНе Мег Рго Аэп
610 615620 <210> 5 <211> 1884 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МДР- 20-127 - Белок Д - РКАМЕ - Ι.ΕΗΗΗΗΗΗ (плазмида рЕТ21) <400> 5 атддатссаа дсадссаттс атсааататд дсдааТассс аааТдаааТс адасааааТс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат ттассададс атасдттада атстааадса120 сттдсдтттд сасаасаддс тдаттаттта дадсаадатт тадсаатдас ТааддаТддТ180 сдтттадтдд ТТаТТсасда тсасттттта датддсттда стдатдттдс дааааааттс240 ссасатсдтс атсдтааада тддссдттас татдтсатсд астттасстт аааадааатт300 сааадтттад ааатдасада ааасТТТдаа ассатддаас дааддсдттт дтддддттсс360 аттсададсс датасатсад сатдадтдтд тддасаадсс сасддадаст ТдТддадсТд420 дсадддсада дсстдстдаа ддатдаддсс стддссаттд ссдссстдда дттдстдссс480 адддадстст тсссдссаст сТТсаТддса дссТТТдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд тдсаддсстд дсссттсасс тдсстссстс тдддадтдст датдааддда600 саасатсттс асстддадас сттсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дсТссТТдсс660 саддаддттс дссссаддад дтддааастт саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттст ддастдтатд дтстддааас адддссадтс тдтастсатт тссададсса780 даадсадстс адсссатдас ааадаадсда ааадтадатд дтттдадсас ададдсадад840 садсссттса ттссадтада ддтдстсдта дасстдттсс тсааддаадд тдсстдтдат900 дааттдттст сстасстсат тдадааадтд аадсдааада аааатдтаст асдсстдтдс960
ТдТаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссассттд1080 дсдааатттт стссттасст дддссадатд аттаатстдс дтадастсст сстстсссас1140 атссатдсат сттсстасат ттссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадттсс тсадтстдса дтдсстдсад дстстстатд тддастсттт атттттсстт1260 ададдссдсс тддатсадтт дстсаддсас дтдатдаасс ссТТддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддатдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадт1380 садстаадтд тсстдадтст аадтддддтс атдстдассд атдтаадтсс сдадсссстс1440 саадстстдс тддадададс стстдссасс стссаддасс тддтстттда тдадтдтддд1500 атсасддатд атсадстсст тдссстсстд ссттссстда дссастдстс ссадсТТаса1560 ассттаадст тстасдддаа ттссатстсс ататстдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс тдадсаатст дасссасдтд стдтатсстд тссссстдда дадттатдад1680 дасатссатд дтассстсса сстддададд сттдсстатс тдсатдссад дстсадддад1740 ттдстдтдтд адттддддсд дсссадсатд дтстддстта дтдссаассс стдтсстсас1800 тдтддддаса даассттста тдасссддад сссатсстдт дсссстдттт сатдсстаас1860 стсдадсасс ассассасса ссас1884 <210> 6 <211> 628 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МДР- 20-127 - Белок Д - РКАМЕ - ЬЕНННННН (плазмида рЕТ21) <400> 6
мет Азр Рго Бег Бег нтз Бег Бег А5П мет А1а АЗП ТНг С1п мет ьуз 1 5 10 15 Бег АЗр ьуз Не Не Не А1а нтз Агд С1у А1а Бег б!у туг Ьеи Рго 20 25 30 С1и Нтз тНг 1_еи 61 и Бег ьуз А1а Ьеи а! а РНе А! а С1п 61 п А1а А5р 35 40 45 туг Теи с! и 61 η Азр Теи а! а мет тНг ьуз Азр С1у Агд Ьеи Уа! Уа! 50 55 60 11 е НТ 5 Азр НТЗ РНе Ьеи Азр б!у Теи тНг Азр Уа! А1а ЬУ5 ьуз РНе 65 70 75 80
- 35 016326
Рго Н15 Агд Нт 5 Агд ьуз Азр 61 у Агд туг туг Уа! Не Аэр РЬе 95 ТЬг 85 90 ьеи ьуз С1 и Не с!п Зег Ьеи 61 и мет ТЬг 61 и АЗП РЬе 61 и тЬг мет 100 105 110 61 и Агд Агд Агд Ьеи тгр 61 у Зег 11 е 61 п 5ег Агд туг Не Зег мет 115 120 125 5ег Уа! тгр тЬг Зег Рго Агд Агд ьеи Уа1 61 и ьеи А1а 61 у 61 п зег 130 135 140 ьеи ьеи ьуз Азр С1и А1а Ьеи А1а Не А1а А1а Ьеи 61 и ьеи ьеи Рго 145 150 155 160 Агд С! и Ьеи РЬе Рго РГО ьеи РЬе мет А1а А1а РЬе Азр 61у Агд нтз 165 170 175 зег С1п тЬг ьеи Ьуз А! а мет Уа! 61 п А1а тгр Рго РЬе тЬг Суз ьеи 180 185 190 Рго Ьеи б1у Уа! ьеи мет ьуз б!у 61 п Нтз ьеи нтз ьеи 61 и тЬг РЬе 195 200 205 ьуз А1а Уа! ьеи Азр с! у ьеи Азр Уа! ьеи ьеи А1а 61 п 61 и Уа! Агд 210 215 220 рго Агд Агд тгр ьуз ьеи 61 п Уа1 Ьеи А5р ьеи Агд ьуз Азп Зег нтз 225 230 235 240 61 η Азр РЬе тгр тЬг Уа1 тгр зег 61у АЗП Агд А1а зег Ьеи туг Зег 245 250 255 РНе Рго с! и РГО б! и А1 а А1а 61 п Рго мет тЬг Ьуэ ЬУ5 Агд Ьуз Уа1 260 265 270 А5р 61у Ьеи 5ег тЬг 61 и А1а 61 и 61 п Рго РЬе Не РГО Уа1 61 и Уа1 275 280 285 1_еи Уа! Азр ьеи РЬе ьеи ьуз 61 и 61 у А1 а суз Азр 61 и ьеи РЬе зег 290 295 300 туг Ьеи Не С1и ьуз Уа! ьуз Агд ьуз ьуз А5П Уа1 Ьеи Агд ьеи суз 305 310 315 320 Суз ьуз ьуз ьеи ьуз гэс Не РЬе А1а мет РГО Мет 61 п А5р 11 е ьуз мет Не ьеи ьуз мет □ с. Э уа! 61 п Ьеи А5р зег э эи Не б1и А5р Ьеи 61 и э э э Уа! тЬг 340 345 350 Суз тЬг тгр ьуз ьеи РГО тЬг ьеи А1а ьуз РЬе Зег Рго туг Ьеи б1у 355 360 365 С1п МеТ Не АЗП Ьеи Агд Агд ьеи ьеи ьеи Зег Нтз 11е НТЗ А1а 5ег 370 375 380 Зег Туг Не Зег РГО 61 и ьуз 61 и 61 и б1п туг Не А1а 61 п РЬе тЬг 385 390 395 400 5ег 61 п РЬе ьеи Зег Ьеи 61 п суз ьеи 61 п А1а Ьеи Туг Уа! Азр 5ег 405 410 415 Ьеи РЬе РЬе ьеи Агд 61 у Агд ьеи А5р 47 Ч 61 п ьеи ьеи Агд нтз Уа! мет Азп Рго ьеи теи С! и тЬг Ьеи Зег Не ча ι тЬг АЗП Суз Агд Ьеи чэи Зег б!и 61 у 435 440 445 Азр Уа1 мет нтз ьеи Зег 61 п Зег рго Зег Уа1 Зег 61п ьеи Зег Уа! 450 455 460 ьеи 5ег Ьеи Зег С1у Уа1 мет Ьеи тЬг Азр Уа! Зег Рго 61 и Рго Ьеи 465 470 475 480 С1п а! а ьеи ьеи 61 и Агд А1а Зег А1 а ТЬг ьеи 61 п Азр ьеи Уа! РЬе 485 490 495 А5р С1 и Суз с!у 11 е тЬг Азр Азр 61 п ьеи ьеи А1а ьеи Ьеи РГО Зег 500 505 510 Ьеи Зег нтз Суз 5ег 61 п ьеи ТЬг ТЬг Ьеи Зег РЬе Туг 61у АЗП Зег 515 520 525 Не 5ег 11 е Зег А1 а ьеи 61 п ьег ьеи ьеи 61 п нтз ьеи 11 е 61 у ьеи 530 535 540 Зег АЗП ьеи тЬг нтз Уа1 ьеи Туг РГО Уа1 РГО Ьеи 61 и Зег туг 61 и 545 550 555 560 Азр Не нтз с! у тЬг Ьеи Нт 5 Ьеи 61 и Агд Ьеи А1а Туг ьеи нтз А1а 565 570 575 Агд ьеи Агд С1и ьеи Ьеи Суз 61 и Ьеи б1у Агд РГО Зег мет Уа1 Тгр 580 585 590 Ьеи Зег А1 а АЗП Рго суз РГО Нтз суз 61 у А5р Агд ТЬг РЬе туг Азр 595 600 605 Рго С1 и Рго Не ьеи суз Рго Суз РЬе мет Рго АЗП ьеи 61 и НТВ Нтз
610 615 620
НТЗ НТЗ НТЗ Ηΐ 2
625
- 36 016326 <210> 7 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет нт 5-хвоста (плазмида ρΕΤ21) <400> 7 атддатссаа дсадссаттс атсааататд дсдаатассс ааатдааатс адасаааатс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат ТТассададс атасдттада атстааадса120 сттдсдтттд сасаасаддс тдаттаттта дадсаадаТТ тадсаатдас тааддатддт180 сдтттадтдд ттаттсасда тсасттттта датддсттда стдатдттдс дааааааттс240 ссасатсдтс атсдтааада тддссдттас татдтсатсд астттасстт аааадааатт300 сааадтттад ааатдасада ааастттдаа ассатддаас дааддсдттт дтддддттсс360 аттсададсс датасатсад сатдадтдтд тддасаадсс сасддадаст тдтддадстд420 дсадддсада дссТдсТдаа ддатдаддсс стддссаттд ссдсссТдда дттдстдссс480 адддадстст ТсссдссасТ сттсатддса дссТТТдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд тдсаддсстд дсссттсасс тдсстссстс тдддадтдст датдааддда600 саасатсттс асстддадас сттсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дстссттдсс660 саддаддттс дссссаддад дтддааастт саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттст ддастдтатд дтстддааас адддссадтс тдтастсатт тссададсса780 даадсадсТс адсссаТдас ааадаадсда ааадтадатд дТТТдадсас ададдсадад840 садсссТТса ттссадтада ддтдстсдта дасстдттсс тсааддаадд тдсстдтдат900 дааТТдТТсТ ссТассТсаТ тдадааадтд аадсдааада ааааТдТасТ асдсстдтдс960 тдтаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссассттд1080 дсдааатттт стссттасст дддссадатд аттаатстдс дтадастсст сстстсссас1140 атссатдсат сттсстасат ттссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадттсс тсадтстдса дтдсстдсад дстстстатд тддастсттт атттттсстт1260 ададдссдсс тддатсадтт дстсаддсас дтдатдаасс ссТТддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддатдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадт1380 садсТаадТд тсстдадтст аадтддддтс атдсТдассд атдтаадтсс сдадссссТс1440 саадстстдс тддадададс сТсТдссасс сТссаддасс тддтстттда ТдадТдТддд1500 аТсасддаТд аТсадсТссТ тдссстсстд ссттссстда дссастдстс ссадсТТаса1560 ассттаадст тстасдддаа ттссатстсс ататстдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс тдадсаатст дасссасдтд стдтатсстд тссссстдда дадттатдад1680 дасатссатд дтассстсса сстддададд сттдсстатс тдсатдссад дстсадддад1740 ттдстдтдтд адттддддсд дсссадсатд дтстддстта дтдссаассс стдтсстсас1800
ТдТддддаса даассттста тдасссддад сссатсстдт дссссТдТТТ сатдсстаас1860 <210> 8 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида рЕТ21) <400> 8
мет А5р РГО Бег Бег НТ 5 Бег Бег А5П мет А1а А5П ТНг 61 η мет Ьуз 1 5 10 15 Бег А5р ЬУ5 11е 11е 11е А1а Нт 5 Агд б!у А1а Бег б!у Туг Ьеи Рго 20 25 30 б!и НТ 5 тЬг Ьеи 61 и Бег ЬУ5 А1а Ьеи А1а РНе А1а 61п 61 η А1а А5О 35 40 45 Туг ьеи ГЛ 61 и 61 η А5р Ьеи А1а с с мет тНг ЬУ5 А5р 61 у Агд ьеи Уа1 Уа1 11 е □и НТ 5 А5р НТ 5 РКе Ьеи э Э А5р б!у ьеи тНг А5р ои Уа1 А1а ьуз 1_У5 РНе 65 70 75 Уа! 80 РГО НТ 5 Агд НТ 5 Агд ЬУ5 А5р 61 у Агд туг туг 11е А5р РНе тНг 85 90 95 |_еи 1_У5 61 и 11е 61 η Бег Ьеи 61 и мет тНг 61 и А5П РНе 61 и ТНг мет 100 105 110 С1и Агд Агд Агд Ьеи тгр б!у Бег Не 61 η Бег Агд Туг 11е Бег мет
- 37 016326
115 120 125 Бег Уа1 тгр ТЬг Бег Рго Агд Агд теи Уа1 61 и геи А1а 61 у 61 п Бег 130 135 140 ьеи Теи ьуз Азр 61 и А1а теи А1а 11 е А1а А1а геи 61 и Реи геи РГО 145 150 155 160 Агд С1и Теи РЬе Рго РГО геи РЬе мет А1а А1а РЬе Азр 61 у Агд Н1 5 165 170 175 Бег 61 η тНг Теи ЬУЗ А1а мет Уа1 61η А1а Тгр РГО РЬе ТЬг Суз Реи 180 185 190 РГО ьеи б!у Уа1 Теи мет ьуз б1у б1п Нтз геи Н1 5 Реи 61 и ТЬг рЬе 195 200 205 ьуз А1а Уа1 Теи Азр б1у Реи Азр Уа1 Реи Реи А1а 61 п 61 и Уа1 Агд 210 215 220 Рго Агд Агд тгр ьуз геи 61 п Уа1 Реи Азр Реи Агд ЬУЗ Азп Бег Ηί з 225 230 235 240 с! η Азр РЬе тгр тЬг Уа1 Тгр Бег 61 у Азп Агд А1а Бег Реи Туг Бег 245 250 255 РЬе Рго 61 и Рго б1и А1а А1а 61 п РГО мет тЬг ьуз ьуз Агд ЬУЗ Уа1 260 265 270 Азр 61у Теи Бег ТЬг 61 и А1а 61 и 61 п Рго РЬе 11 е рго Уа! 61 и Уа1 275 280 285 Ьеи Уа1 Азр Теи РЬе Реи Ьуз 61 и 61у А1а Суз Аэр 61 и Реи РЬе Бег 290 295 300 туг Ьеи 11е 61 и Туз Уа1 ьуз Агд ЬУЗ Ьуз Азп Уа! Реи Агд Реи Суз 305 310 315 320 Суз ьуз ьуз Теи ьуз 11 е РЬе А1а мет Рго мет 61 п Азр 11е Туз мет 325 330 335 11е Реи ьуз мет Уа1 61 п Реи Азр Бег 11 е 61 и Аэр Реи 61 и Уа1 ТЬг 340 345 350 суз тЬг тгр ьуз теи Рго тЬг Реи А1а ьуз РЬе Бег Рго Туг Реи б1у 355 360 365 С1п мет 11е АЗП теи Агд Агд Реи Реи Реи Бег Н1 5 11е Н1 5 А1а Бег 370 375 380 Бег Туг 11е Бег Рго 61 и ьуз 61 и 61 и 61 п туг 11 е А1а 61 п рЬе тЬг 385 390 395 400 Бег 61 η РЬе Теи Бег Реи 61 п суз Реи 61 п А1а Реи туг Уа! Азр Бег 405 410 415 Ьеи РЬе РЬе теи Агд 61 у Агд теи Азр 61 п Реи Реи Агд Н1 5 Уа1 мет 420 425 430 АЗП РГО Теи 61 и тЬг Реи Бег 11е ТЬг АЗП Суз Агд геи Бег 61 и 61 у 435 440 445 Азр Уа1 мет Н1 5 Теи Бег 61 п Бег Рго Бег Уа1 Бег 61 п Реи Бег Уа! 450 455 460 ьеи Бег Теи Бег б1у Уа1 мет Реи ТЬг Азр Уа1 Бег Рго 61 и РГО Реи 465 470 475 480 С1п А1а теи Теи б!и Агд А1а Бег А1а тЬг Реи 61 п Азр Реи Уа1 РЬе 485 490 495 Азр 61 и Су5 61 у 11е ТЬг Азр А5р 61п геи геи А1а геи Реи Рго Бег 500 505 510 Реи Бег ΗΊ5 Суз Бег 61п геи тЬг ТЬг Реи Бег РЬе туг 61 у Азп Бег 515 520 525 11 е Бег 11е Бег А1а Реи 61 п Бег Реи Реи 61 п Н1 8 Реи 11 е б1у Реи 530 535 540 Бег Азп Теи тЬг Нт з Уа1 Реи Туг Рго Уа1 Рго Реи 61 и Бег туг 61 и 545 550 555 560 АЗр 11 е Н1 5 61 у тЬг Реи Ηί 5 Реи 61 и Агд геи А1а туг Реи Ηί з А1а 565 570 575 Агд Ьеи Агд 61 и теи Реи суз 61 и Реи б1у Агд РГО Бег мет Уа1 Тгр 580 585 61у 590 Ьеи Бег А1а АЗП Рго Суз Рго Ηί з Суз Азр Агд тЬг РНе туг Азр 595 600 605 Рго 61 и РГО 11 е Реи Суэ Рго Суз РЬе мет РГО Азп 610 615 620
<210> 9 <211> 1878 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 38 016326 <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нннннн (плазмида
РЕТ26) <400> 9 а!дда!ссаа дсадсса!!с а!сааа!а!д дсдаа!ассс ааа!дааа!с адасаааа!с60 а!!а«дс!с ассд!дд!дс гадсддггаг «ассададс а!асд!!ада аисгааадса120 с!!дсд!!!д сасаасаддс !да!!а!!!а дадсаада!! !адсаа!дас !аадда!дд!180 сд!!!ад!дд !!а!!сасда !сас!!!!!а да!ддс!!да с!да!д!!дс даааааа!!с240 ссаса!сд!с а!сд!ааада !ддссд!!ас !а!д!са!сд ас!!!асс!! аааадааа!!300 сааад!!!ад ааа!дасада ааас!!!даа асса!ддаас д!сд!сд!с! д!ддддсадс360 а!!сададсс д!!а!а!!ад са!дадсд!д !ддассадсс сдсд!сд!с! дд!!дадс!д420 дссддссада дсс!дс!даа ада!даадсд с!ддсса!!д сддсдс!дда дс!дс!дссд480 сд!дадс!д! «ссдссдс! д!!!а!ддсд дсд!!!да!д дссд!са!ад ссадассс!д540 ааадсда!дд !дсаддсд!д дссд!!!асс !д!с!дссдс !дддсд!дс! да!даааддс600 садса!с!дс а!с!ддааас с!!!ааадсд д!дс!дда!д дсс!дда!д! дс!дс!ддсс660 саддаад!!с д!ссдсд!сд !!ддааас!д саад!дс!дд а!с!дсд!аа ааасадсса!720 садда!!!!! ддассд!д!д дадсддсаа! сд!дсдадсс !д!а!адс!! !ссддаассд780 даадсддсдс адссда!дас саааааасд! ааад!дда!д дсс!дадсас сдаадсддаа840 садссд!!!а !!ссдд!дда ад!дс!дд!! дасс!д!!!с !дааадаадд сдсс!дсдас900 дадс!д!!!а дс!а!с!да! сдааааад!д ааасдсаааа аааасд!дс! дсд!с!д!дс960 !дсаааааас !даааа!с!! сдсда!дссд а!дсадда!а !!аааа!да! сс!даааа!д1020 д!дсадс!дд а!адса!!да ддасс!ддаа д!дасс!дса сс!ддааас! дссдассс!д1080 дссааа!!!а дсссд!а!с! дддссада!д а!!аасс!дс д!сд!с!дс! дс!д!с!са!1140 а!!са!дсда дсадс!а!а! !адсссддаа ааадаадаас ад!а!а!сдс дсад!!!асс1200 адссад!!!с !дадсс!дса а!дсс!дсаа дсдс!д!а!д !дда!адсс! д!!!!!!с!д1260 сд!ддссд1с !дда!садс! дс!дсд!са! д!да!даа!с сдс!ддааас сс!дадса!!1320 ассаас!дсс д!с!дадсда аддсда!д!д а!дса!с!да дссададссс дадсд!!адс1380 садс!д!с!д !!с!дадсс! дадсддсд!д а!дс!дассд а!д!дадссс ддаассдс!д1440 саадссс!дс !ддаасд!дс дадсдсдасс с!дсаадасс !дд!д!!!да !даа!дсддс1500 а!!ассда!д а!садс!дс! ддссс!дс!д ссдадсс!да дсса!!дсад ссадс!дасс1560 ассс!дадс! !!!а!ддсаа садса!!адс а!!адсдсдс !дсааадсс! дс!дсааса!1620 с!да!!ддсс !дадсаасс! дассса!д!д с!д!а!ссдд !дссдс!дда аадс!а!даа1680 да!а!!са!д дсассс!дса !с!ддаасд! с!ддсс!а!с !дсасдсдсд !с!дсд!дад1740 с!дс!д!дсд адс!дддссд !ссдадса!д д!!!ддс!д! с!дсдаа!сс д!дсссдса!1800 !дсддсда!с д!асс!!!!а !да!ссддаа ссда!!с!д! дсссд!дс!! !а!дссдаас1860 сассассасс ассассас1878 <210> 10 <211> 626 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок э - РКАМЕ - нннннн (плазмида рЕТ26) <400> 10
ме! Азр Рго Бег Бег Нтз Бег Бег АЗП ме! А1а А5П тЬг 61п ме! ьуз 1 5 10 15 зег А5р ьуз Не 11 е 11е А1а нтз Агд б1у А1а Бег б1у туг ЧП ьеи Рго 61 и ΗΊ5 тЬг ζυ ьеи 61 и Бег ьуз А1а Ζ э ьеи А1а рЬе А1а 61 η □ и б1п А1а Азр 35 40 45 Туг Ьеи 61 и 61п Азр ьеи А1а ме! ТЬг Ьуз Азр б!у Агд ьеи Уа1 Уа! 50 55 60 Не Н18 Азр Нтз РЬе ьеи Азр 61 у ьеи тЬг Азр Уа1 А1а Ьуз ьуз РЬе 65 70 75 80 РГО НТВ Агд нтз Агд 85 Ьуз Азр 61 у Агд Туг Туг Уа1 Не Азр РЬе ας ТЬг ьеи ьуз 61 и 11е 61 η Бег Ьеи 61 и ме! ОТМ тЬг 61 и АЗП РЬе б!и ТЬг ме! 100 105 110 61 и Агд Агд Агд Ьеи тгр 61 у Бег 11 е 61 η Бег Агд Туг Не Бег ме! 115 120 125 5ег Уа1 тгр тЬг Бег Рго Агд Агд Ьеи Уа! 61 и ьеи А1а б1у 61 η Бег 130 135 140 ьеи ьеи ьуз Аэр 61 и А1а Ьеи А1а Не А1а А1а Ьеи 61 и Ьеи Ьеи Рго 145 150 155 160 Агд 61 и ьеи РЬе РГО Рго ьеи РЬе ме! А1а А1а РЬе Азр б1у Агд Нтз 165 170 175
- 39 016326
Бег б1п тКг Беи 180 Ьуз А1а меБ Уа1 61 η А1а тгр 185 Рго РКе ТКг 190 суз ьеи Рго ьеи 61 у Уа! ьеи меБ ьуз 61 у 61л Ηί з ьеи Н18 ьеи 61 и ТКг РКе 195 200 205 Уа1 БУ5 А1а Уа! ьеи А5р б1у ьеи Азр Уа! ьеи ьеи А1а 61 η б!и Агд 210 215 220 Рго Агд Агд Тгр ьуз ьеи 61 η Уа1 ьеи Азр ьеи Агд ьуз Азп зег Ηί з 225 230 235 240 61η Азр РКе Тгр тКг Уа1 тгр Зег 61 у АЗП Агд А1а зег ьеи Туг Зег 245 250 255 РКе РГО 61 и рго 260 61 и А1а А1а 61 η РГО 265 меБ тКг ьуз ьуз £8 Ьуз Уа! Азр б1у Ьеи зег тКг 61и А1а 61 и 61л Рго рКе 11е РГО Уа! 61 и Уа1 275 280 285 Беи Уа1 А5р ьеи РКе Ьеи Ьуз 61 и 61 у А1а суз Азр 61 и Ьеи РКе Зег 290 295 300 Туг Беи Не 61 и ьуз Уа1 Ьуз Агд ьуз ьуз АЗП Уа1 Ьеи Агд Ьеи суз 305 310 315 320 Суз БуЗ ьуз ьеи ьуз Не РКе А1а меБ Рго меБ 61 п АЗр Не ьуз меБ 325 330 335 Не Беи ьуз меБ 340 ьуз уа! 61 η Ьеи Азр зег 345 А1а 11 е 61 и Азр ьеи 61 и 350 туг Уа! тКг Суз ТКг тгр ьеи Рго тКг ьеи Ьуз РКе Зег Рго Ьеи б1у 355 360 365 61 η меБ 11 е АЗП ьеи Агд Агд ьеи ьеи Ьеи зег Н15 11 е Н18 А1а зег 370 375 380 Зег туг 11 е зег Рго 61и Ьуз 61 и 61 и 61л туг 11 е А1а 61 η РКе ТКг 385 390 395 400 зег 61 η РКе ьеи Зег Ьеи 61 η суз Ьеи 61 п А1а Ьеи туг Уа! Азр зег 405 410 415 Беи РКе РКе ьеи Агд 61 у Агд ьеи Азр 61 п Ьеи Ьеи Агд Н15 Уа! меБ 420 425 430 АЗП РГО ьеи 61 и тКг ьеи Зег Не тКг АЗП Суз Агд ьеи Зег 61 и б!у 435 440 445 Азр Уа! меБ ΗΊ5 ьеи Зег 61 η зег Рго Зег Уа1 Зег 61 η Ьеи Бег Уа! 450 455 460 Беи Зег ьеи Зег б1у уа! МеБ Ьеи тКг Азр Уа! зег РГО 61 и Рго Ьеи 465 470 475 480 С1п А1а ьеи ьеи 61 и Агд А1а зег А1а тКг Ьеи 61 п Азр ьеи Уа! РКе 485 490 495 Азр 61 и Суз 61 у 11е ТКг Азр Азр 61 п Ьеи ьеи А1а ьеи Ьеи Рго Зег 500 505 510 Беи зег Нт з суз Зег 61 η Ьеи тКг ТКг ьеи Зег РКе Туг 61у А5П Зег 515 520 525 11е Зег 11 е зег А1а ьеи 61 η зег Ьеи ьеи 61 п Н15 ьеи 11е 61у ьеи 530 535 540 зег АЗП Ьеи тКг Н15 Уа! Ьеи туг Рго Уа! Рго ьеи б1и Бег Туг 61 и 545 550 555 560 АЗр 11 е Н1 8 61 у тКг ьеи Ηί з Ьеи 61 и Агд Ьеи А1а туг Ьеи ΗΊ8 А1а 565 570 575 Агд Беи Агд 61 и Ьеи ьеи суз 61 и ьеи 61у Агд Рго зег меБ Уа1 тгр 580 585 590 Беи зег А1а АЗП Рго Суз Рго Н15 Суз 61 у Азр Агд тКг РКе Туг Азр 595 600 605 РГО 61 и Рго 11 е ьеи суз Рго суз РКе меБ Рго АЗП ΗΊ5 Нт з Ηί з ΗΊ5
610 615 620
Ηί 5 Ηί 5
625 <210> 11 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - ΡΚΑΜΕ - нет Ηί5-хвоста (плазмида ρΕΤ26) <400> 11
- 40 016326 агддагссаа дсадссаггс аггаггдсгс ассдгддгдс сггдсдгггд сасаасаддс сдгггадгдд ггаггсасда ссасагсдгс агсдгааада сааадгггад ааагдасада аггсададсс дггагаггад дссддссада дссгдсгдаа сдгдадсгдг ггссдссдсг ааадсдагдд гдсаддсдгд садсагсгдс агсгддааас саддаадггс дгссдсдгсд саддаггггг ддассдгдгд даадсддсдс адссдагдас садссдггга ггссддгдда дадсгдггга дсгагсгдаг гдсаааааас гдаааагсгг дгдсадсгдд агадсаггда дссаааггга дсссдгагсг аггсагдсда дсадсгагаг адссадгггс гдадссгдса сдгддссдгс гддагсадсг ассаасгдсс дгсгдадсда садсгдгсгд ггсгдадссг саадсссгдс гддаасдгдс аггассдагд агсадсгдсг асссгдадсг гггагддсаа сгдаггддсс гдадсаассг дагаггсагд дсасссгдса сгдсгдгдсд адсгдддссд гдсддсдагс дгассгггга агсааагагд дсдаагассс гадсддггаг ггассададс гдаггаггга дадсаадагг гсасггггга дагддсггда гддссдггас гагдгсагсд ааасгггдаа ассагддаас сагдадсдгд гддассадсс адагдаадсд сгддссаггд дгггагддсд дсдгггдагд дссдгггасс гдгсгдссдс сгггааадсд дгдсгддагд ггддааасгд саадгдсгдд дадсддсааг сдгдсдадсс саааааасдг ааадгддагд адгдсгддгг дассгдгггс сдааааадгд ааасдсаааа сдсдагдссд агдсаддага ддассгддаа дгдассгдса дддссадагд аггаассгдс гадсссддаа ааадаадаас агдссгдсаа дсдсгдгагд дсгдсдгсаг дгдагдаагс аддсдагдгд агдсагсгда дадсддсдгд агдсгдассд дадсдсдасс сгдсаадасс ддсссгдсгд ссдадссгда садсаггадс аггадсдсдс дасссагдгд сгдгагссдд гсгддаасдг сгддссгагс гссдадсагд дгггддсгдг гдагссддаа ссдаггсгдг ааагдааагс агасдггада гадсаагдас сгдагдггдс асгггассгг дгсдгсдгсг сдсдгсдгсг сддсдсгдда дссдгсагад гдддсдгдсг дссгддагдг агсгдсдгаа гдгагадсгг дссгдадсас гдааадаадд аааасдгдсг ггаааагдаг ссгддааасг дгсдгсгдсг адгагагсдс гддагадссг сдсгддааас дссададссс агдгдадссс гддгдгггда дссаггдсад гдсааадссг гдссдсгдда гдсасдсдсд сгдсдаагсс дсссдгдсгг адасаааагс 60 агсгааадса 120 гааддагддг 180 дааааааггс 240 аааадааагг 300 дгддддсадс 360 ддггдадсгд 420 дсгдсгдссд 480 ссадасссгд 540 дагдаааддс 600 дсгдсгддсс 660 ааасадссаг 720 гссддаассд 780 сдаадсддаа 840 сдссгдсдас 900 дсдгсгдгдс 960 ссгдаааагд 1020 дссдасссгд 1080 дсгдгсгсаг 1140 дсадгггасс 1200 дггггггсгд 1260 ссгдадсагг 1320 дадсдггадс 1380 ддаассдсгд 1440 гдаагдсддс 1500 ссадсгдасс 1560 дсгдсаасаг 1620 аадсгагдаа 1680 гсгдсдгдад 1740 дгдсссдсаг 1800 гагдссдаас 1860 <210> 12 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Н15-хвоста (плазмида рЕТ26) <400> 12
мег Азр Рго Бег Бег нтз Бег Бег АЗП мег А1а Азп ТЬг 61 η мег ьуз 1 5 10 15 Бег Азр ьуз 11 е 11е 11е А1а нтз Агд 61 у А1а Бег 61 у Туг ьеи РГО 20 25 30 61 и НТЗ тЬг Ьеи 61 и Бег ьуз А1а ьеи А1а РЬе А1а 61 η 61 η А1а Азр 35 40 45 туг ьеи 61 и 61 η Азр Ьеи А1а мег тЬг ьуз Азр б1у Агд Ьеи Уа1 Уа1 50 55 60 Не Н13 Азр Нтз РЬе Ьеи Азр 61у ьеи тЬг Азр Уа1 А1а ьуз ьуз РЬе 65 70 75 80 РГО НТЗ Агд нтз Агд ьуз Азр 61 у Агд туг туг Уа1 11 е Азр РЬе тЬг 85 90 95 ьеи ьуз 61 и 11е 61 η Бег Ьеи 61 и мег тЬг 61 и АЗП РЬе 61 и ТЬг мег 100 105 110 С1и Агд Агд 115 Агд ьеи тгр б1у Бег 11 е 61 η Бег Агд Туг 11 е Бег мег Бег Уа1 Тгр тЬг Бег Рго Агд хх и Агд ьеи Уа! 61 и ьеи XX э А1а 61у 61 η Бег 130 135 140 ьеи Ьеи ьуз Азр 61 и А1а Ьеи А1а 11е А1а А1а Ьеи 61 и ьеи ьеи Рго 145 150 155 160 Агд 61 и Ьеи РЬе Рго Рго Ьеи РЬе мег А1а А1а РЬе Агр 61 у Агд НТ 5 165 170 175 Бег 61 η тЬг Ьеи ьуз А1а мег Уа1 61 η А1а тгр РГО РЬе тЬг суз ьеи 180 185 190 Рго Ьеи 61 у Уа1 Ьеи мег ьуз С1у 61 η Нтз ьеи нтз ьеи 61 и тЬг рЬе 195 200 205 1_у5 А1а уа! Ьеи Азр 61 у ьеи Азр Уа! Ьеи ьеи А1а 61 η 61 и Уа1 Агд
- 41 016326
210 215 220 рго Агд Агд Тгр ьуз ьеи 61 η Уа1 ьеи Азр ьеи Агд ьуз АЗП Зег Ηί з 225 230 235 240 61 η Азр РНе тгр тНг Уа1 тгр зег С1у Азп Агд А1а зег Ьеи туг Зег 245 250 255 РНе Рго 61 и Рго 61 и А1 а А1а 61 η РГО мет ТНг ьуз ьуз Агд ьуз Уа1 260 265 270 Азр 61 у ьеи Зег ТНг 61 и А1а 61 и 61 η Рго РНе 11 е Рго Уа1 61 и Уа1 275 280 285 Ьеи Уа1 Азр Ьеи рНе Ьеи ьуз 61 и б!у А1а Суз АЗр 61 и Ьеи РНе Зег 290 295 300 Туг ьеи 11е 61 и ьуз Уа1 Ьуз Агд ьуз ьуз Азп Уа1 Ьеи Агд Ьеи Суз 305 310 315 320 Суз ьуз ьуз Ьеи Ьуз 11 е РНе А1а мет Рго мет 61 η Аэр 11е ьуз мет 325 330 335 11е Ьеи ьуз мет Уа1 61 η ьеи Азр зег 11е 61 и Азр Ьеи 61 и Уа1 тНг 340 345 350 суз тНг тгр ьуз Ьеи РГО тНг ьеи А1а ьуз РНе Зег Рго Туг ьеи 61 у 355 360 365 С1п мег 11е АЗП ьеи Агд Агд ьеи ьеи ьеи Зег Н1 5 11е Н1 5 А1а Зег 370 375 380 Зег туг Не Зег Рго 61 и ьуз 61 и 61 и 61 η туг 11е А1а 61 η РНе ТНг 385 390 395 400 5ег 61 η рНе ьеи зег Ьеи 61 η суз Ьеи 61 η А1а ьеи туг Уа1 Азр Зег 405 410 415 ьеи РНе РНе Ьеи Агд 61 у Агд ьеи Азр 61η ьеи ьеи Агд Н1 5 Уа1 мет 420 425 430 АЗП Рго ьеи 61 и тНг Ьеи Зег 11е ТНг Азп Суз Агд ьеи зег б1и 61 у 435 440 445 А5р Уа1 мет Ηί 5 ьеи Зег 61 η Зег Рго Зег Уа1 Зег 61 η ьеи Зег Уа1 450 455 460 Ьеи зег Ьеи Зег 61 у Уа1 мег ьеи тНг Азр Уа1 Зег Рго 61 и РГО ьеи 465 470 475 480 61 η А1а Ьеи Ьеи 61 и Агд А1а Зег А1а ТНг Ьеи 61 η Азр Ьеи Уа1 РНе 485 490 495 Азр 61 и Суз 61 у 11е тНг Азр Азр 61 η Ьеи ьеи А1а ьеи ьеи Рго Зег 500 505 510 ьеи Зег Н1 8 Суз Зег 61 η ьеи тНг ТНг ьеи Зег РНе туг 61у АЗП зег 515 520 525 11 е зег 11 е Зег А1а Ьеи 61 η зег Ьеи ьеи 61 η Н1 8 Ьеи 11е 61 у ьеи 530 535 540 Зег АЗП Ьеи тНг ΗΊ 5 Уа1 Ьеи туг Рго Уа1 РГО ьеи 61 и Зег туг 61 и 545 550 555 560 Азр 11 е Н1 5 б1у тНг Ьеи Ηί 5 ьеи 61 и Агд Ьеи А1а Туг Ьеи Н1 5 А1а 565 570 575 Агд ьеи Агд 61 и ьеи ьеи суз 61 и Ьеи 61у Агд РГО Зег мет Уа1 Тгр 580 585 590 ьеи Зег А1а АЗП Рго Суз РГО Ηί 5 Суз 61у Азр Агд ТНг РНе Туг Аэр 595 600 605 РГО 61 и РГО 11 е ьеи суз РГО Суз РНе мет РГО АЗП 610 615 620
<210> 13 <211> 9 <212> ПРТ пиши οαμίΕΐιο <400> 13
Уа1 ьеи Азр С1у Ьеи Азр Уа1 ьеи ьеи
1 5 <210> 14 <211> 10 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 14
5ег ьеи Туг Зег РНе Рго С1и Рго С1и А1а
- 42 016326
1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> ПРТ <213> ното зартепз <400> 15 А1а Деи Туг Уа1 Азр Зег Деи РЬе РЬе Деи 1 5 10 <210> 16 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ното эартепз <400> 16 Деи туг Уа! Азр Зег Деи РЬе РЬе Деи 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> ПРТ <213> Ното гартепз <400> 17 5ег Деи Деи 61 η Нтз Деи Не 61 у Деи 1 5
<210> 18 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САЫ008 <400> 18 ататаасата тддадссаад садссаттса тсааат 36 <210> 19 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид СА1\1037 <400> 19 ссасааасдс сгтсдттсса тддттдсааа дттттстдтс 40 <210> 20 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САЫОЗб <400> 20 дасадаааас ГТТдааасса гддаасдаад дсдДДТдддд 40 <210> 21 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 43 016326 <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САЫ029 <400> 21 адададаста дтстадгТад дсатдаааса ддддсасад 39 <210> 22 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САЫ002 <400> 22 ддаддааста дтдттаддса тдааасаддд дсасад 36 <210> 23 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> смысловой олигонуклеотид саи040 <400> 23 адададсата тдадсадсса ттсатсааат агддсд 36 <210> 24 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид саиОЗ?
<400> 24 асдтдддсдд ссдсддмтс ааадттттст дТсаТТГста а 41 <210> 25 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САНОЗЗ <400> 25 ттдттддсдд ссдсаатдда асдааддсдт ттдтддддт 39 <210> 26 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САМ034 <400> 26 ддаддастсд аддттаддса гдааасаддд дсасад 36 <210> 27 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид СДК1О35
-44016326 <400> 27 ддаддасгсд адсьадььад дсагдаааса ддддсасад 39 <210> 28 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид СА1Ч106 <400> 28 садаааасгг тдааассабд даасдааддс д 31 <210> 29 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САМ107 <400> 29 сдссХИсдтг ссатддбттс ааадььгюг д 31 <210> 30 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> смысловой олигонуклеотид СА1М104 <400> 30 ддадатагас аьагддатсс аадсадссаь Хсагсааата Ьдд 43 <210> 31 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ105 <400> 31 ссатагттда гдаабддсгд ст1дда1сса 1а1дга1а1с 1сс 43 <210> 32 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид СА1Ч123 <400> 32 дасадаааас ттгдааасса тддаасдтсд 1сдГстдГдд 40 <210> 33 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ124 <400> 33 ссасадасда сдасдггсса тддшсааа дттттсгдтс 40 <210> 34
- 45 016326 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САИ199 <400> 34 ддааттссат атддагссаа дсадссаттс 30 <210> 35 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ 19 <400> 35 .
ддадстстсд адтсадтддт ддгддгддгд дтддттсддс атааадсасд ддс 53 <210> 36 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб 1826 <400> 36 тссатдасдт тсстдасдгг 20 <210> 37 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб 1758 <400> 37 тстсссадсд гдсдссат 18 <210> 38 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб2006 <400> 38 ассдатдасд тсдссддтда сддсассасд тсдтсдтттт дтсдттттдт сдТТ 54 <210> 39 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб1668 <400> 39 тссатдасдт тсстдатдст 20 <210> 40 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 46 016326 <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб5456 <400> 40 тсдасдтттт сддсдсдсдс сд 22 <210> 41 <211> 127 <212> ПРТ <213> НаеторНПиз тпЛиепгае Ь <400> 41
мет Ьуз Ьеи ьуз тЬг Ьеи А1а ьеи Бег ьеи Ьеи А1а А1а 61у Уа1 ьеи 1 5 10 15 А1а 61 у Суз Бег Бег нтз Бег Бег А5П мет А1а АЗП тЬг 61 η мет ЬУ5 20 25 30 Бег Азр ьуз 11е Не 11 е А1а нтз Агд б!у А1а Бег б!у туг Ьеи Рго 35 40 45 б!и Н15 тЬг Ьеи 61 и Бег 1_уз А1а Ьеи А1а РЬе А1а 61 η 61п А1а Азр 50 55 60 туг 1_еи 61 и 61 η Азр ьеи А1а мет тЬг 1.У5 Азр б1у Агд Ьеи Уа! Уа1 65 70 75 80 Не нтз Аэр нтз рЬе ьеи Азр 61 у ьеи тЬг Азр Уа! А1а ьуз ьуз РЬе 85 90 95 Рго нтз Агд нтз 1 пп Агд ьуз Азр 61 у Агд 1 пч туг туг Уа! 11 е Азр 11 п РЬе ТЬг ьеи ьуз 61 и хии 11е б1п Бег ьеи 61 и хи э Ме1 тЬг 61 и АЗП РЬе ххи 61 и тЬг 115 120 125
<210> 42 <211> 111 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 1-мет; 2-Азр; З-Рго; с последующими аминокислотами 20-127 Белка ϋ <400> 42
МеТ Азр Рго Бег Бег Нтз Бег Бег АЗП мет А1а А5П тЬг 61 η МеТ ЬУ5 1 5 10 15 Бег Азр ьуз 11 е 11е Не А1а НТ 5 Агд 61 у А1а Бег б1у туг ЗН Ьеи РГО 61 и нтз тЬг ζυ Ьеи 61 и Бег ьуз А1а Ζ э Ьеи А1а РЬе А1а 61 η ои 61 η А1а Азр 35 40 45 туг ьеи 61 и 61 η Азр Ьеи А1а мет ТЬг ьуз Азр 61 у Агд Ьеи Уа1 Уа1 50 55 60 Не нтз Азр Нтз РЬе Ьеи Азр 61у Ьеи тЬг Азр Уа1 А1а ьуз ьуз РЬе 65 70 75 80 РГО Нтз Агд Нтз Агд Ьуз Азр 61у Агд туг Туг Уа! Не АЗр РЬе ТЬг 85 90 95 1_еи ьуз 61 и 11е 61 η Бег ьеи 61 и мет тЬг 61 и АЗП РЬе 61 и тЬг 100 105 110
<210> 43 <211> 450 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Белок ϋ-ΜΑ6Ε-Α3-ΗΤ5 <400> 43
мет Азр РГО ьуз ТЬг ьеи А1а ьеи Бег ьеи Ьеи А1а А1а 61 у Уа! Ьеи 1 5 10 15 А1а б1у Суз Бег Бег НТ 5 Бег Бег Азп мет А1а АЗП тЬг 61 η МеТ ьуз 20 25 30 Бег Азр 1_уз 11е Не 11е а! а нтз Агд б1у А1 а Бег 61 у туг ьеи рго
- 47 016326
35 40 45 б!и Нт 5 сп тЬг Деи 61 и зег 5Г А1а Деи А1а РЬе А1а СП 61 п б1п А1а Азр Туг эи Деи б!и 61 η А5р деи А1а Мед тЬг Дуз Азр ои С1у Агд деи Уа1 Уа1 65 70 75 80 Не Нтз Азр нтз РНе деи АЗр 61 у деи ТЬг Азр Уа1 А1а дуз Дуз РЬе 85 90 95 ТЬг Рго Нтз Агд нтз Агд дуз Азр 61у Агд туг Туг Уа! 11 е Азр РЬе 100 105 110 деи дуз б1и Пе 61 η Зег Деи б1и Мед тЬг 61 и Азп рЬе 61 и ТЬг мед 115 120 125 А5р деи 61 и 61л Агд Зег 61 η Нтз Суз дуз Рго 61 и 61 и б!у Деи 61 и 130 135 140 А1а Агд б1у 61 и А1а деи б!у Деи Уа! б1у А1а 61 п А1а РГО А1а тЬг 145 150 155 160 61 и 61 и 61 η 61 и А1а А1а Зег Зег Зег Зег ТЬг Деи Уа1 61 и Уа! тЬг 165 170 175 деи б1у 61и Уа1 Рго А1а А1а 61 и Зег РГО Азр Рго Рго 61 п зег РГО 180 185 190 б1п б!у А1а зег Зег Деи Рго ТЬг ТЬг мед Азп Туг Рго Деи тгр Зег 195 200 205 61 η зег Туг 61 и Азр зег зег АЗП 61 п 61 и 61 и 61 и 61 у РГО зег тЬг 210 215 220 РЬе Рго Азр Деи 61 и Зег 61 и РЬе 61 п А1а А1а Деи Зег Агд дуз Уа1 225 230 235 240 А1а б1и Деи Уа1 Нтз РЬе Деи деи деи дуз Туг Агд А1а Агд 61 и рго 245 250 255 уа! тЬг Дуз А1а 61 и мед Деи б1у Зег Уа1 Уа1 61у АЗП тгр 61п туг 260 265 270 РЬе РЬе Рго Уа1 Не РНе Зег Дуз А1а зег Зег Зег деи 61 п Деи Уа! 275 280 285 рЬе б1у 11 е 61 и Деи мед 61 и Уа1 АЗр Рго Не 61 у Нтз Деи Туг Не 290 295 300 РНе А1а тЬг Суз Деи б1у Деи Зег Туг Азр 61 у Деи Деи б!у Азр А5П 305 310 315 320 61 η Не мед Рго дуз А1а 61 у Деи деи Не Не уа! Деи А1а Не Не 325 330 335 А1а Агд 61 и 61 у АЗр Суз А1а Рго 61 и 61 и Дуз Не Тгр 61 и 61 и деи 340 345 350 5ег Уа1 Деи □ ςς 61 и Уа! РЬе 61 и б1у ЧАП Агд 61 и А5р зег 11 е Деи б!у Азр РГО дуз 0 Э Э дуз Деи деи ТЬг 61 η □ ои НТ 5 рЬе уа! 61 п 61 и эоэ АЗП туг Деи 61 и 370 375 380 туг Агд 61 η Уа1 Рго 61 у Зег Азр Рго А1а суз Туг 61 и РЬе Деи тгр 385 390 395 400 б!у РГО Агд А1а деи Уа1 61 и ТЬг зег туг Уа1 дуз Уа1 Деи НТ 5 Нтз 405 410 415 мед Уа! Дуз Не зег 61 у 61 у Рго НТЗ Не зег туг Рго Рго Деи нтз 420 425 430 61 и тгр Уа! Деи Агд б!и б!у 61 и 61 и 61у б!у нтз Нтз нтз нтз нтз 435 440 445
Ηΐ5 НТ 5
450 <210> 44 <211> 109 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> аминокислота из Белка ϋ из наеторЫ1и5 тпЕТиепгае для использования в последовательности ρϋ1/3-ΜΑ6Ε-Ητ5
<400> 44 МеД Зег зег Нтз зег Зег Азп мед А1а АЗП ТНг 61 п мед дуз зег Азр 1 5 10 15 Дуз 11 е Не Не А1а нтз Агд б!у А1а Зег 61 у туг деи РГО 61 и Нтз 20 25 30
- 48 016326
тНг ьеи 61 и Зег Буз А1а Беи А1а РНе А1а 61 п 61 η А1а АЗр туг Беи 35 40 45 61 и 61 η А5р Беи А1а мег ТНг Буз Азр 61 у Агд Беи Уа! уа! Не НТ 8 50 55 60 А5р Н15 РНе Беи Азр С1у 7П Беи тНг Азр Уа1 А1а 7Е Буз Буз РНе Рго НТЗ ОА и □ Агд НТЗ Агд Буз Азр / и с1у Агд туг туг Уа1 / Э Не Азр РНе ТНг Беи ου Буз 85 90 95 С1и 11е 61 η Зег Беи 61 и мет тНг 61 и АЗП РНе 61 и тНг 100 105
<210> 45 <211> 127 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> аминокислота из Белка ϋ из наеторНПиз ιггНиепгае для использования в последовательности ροΐ/3-МАбЕ-нт5 <400> 45
мет Азр Рго Буз ТНг Беи А1а Беи 5ег Беи Беи А1а А1а 61 у Уа! Беи 1 5 10 15 А1а 61 у суз Зег Зег НТ 5 Зег Зег Азп мет А1а Азп ТНг 61 п мет ьуз 20 25 30 зег Азр Буз 11е 11е И е А1а НТЗ Агд б!у А1а Зег 61 у Туг Беи Рго 35 40 45 61 и НТ 5 тНг Беи 61 и Зег Буз А1а Беи А1а РНе А1а 61 п 61 п А1а Азр 50 55 60 туг Беи 61 и 61η Азр Беи А1а мет ТНг туз Азр 61у Агд Беи Уа! Уа! 65 70 75 80 11е нтз А5р нтз РНе Беи Азр 61у Беи тНг Азр Уа1 А1а Буз Буз РНе 85 90 95 РГО Нтз Агд нтз Агд Буз Азр 61у Агд туг туг Уа1 Не Азр РНе тНг 100 105 110 Беи БУ5 61 и 11е 61 η Зег Беи 61 и мет тНг 61 и АЗП РНе б!и тНг 115 120 125
О Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA200900795A 2007-01-15 2008-01-11 Вакцина EA016326B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0700760A GB0700760D0 (en) 2007-01-15 2007-01-15 Vaccine
GB0701262A GB0701262D0 (en) 2007-01-23 2007-01-23 Vaccine
PCT/EP2008/050290 WO2008087102A1 (en) 2007-01-15 2008-01-11 Vaccine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200900795A1 EA200900795A1 (ru) 2010-02-26
EA016326B1 true EA016326B1 (ru) 2012-04-30

Family

ID=39300029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200900795A EA016326B1 (ru) 2007-01-15 2008-01-11 Вакцина

Country Status (32)

Country Link
US (1) US20080187535A1 (ru)
EP (1) EP2114993B1 (ru)
JP (1) JP5391080B2 (ru)
KR (1) KR20090101313A (ru)
CN (1) CN101668770B (ru)
AR (1) AR064862A1 (ru)
AU (1) AU2008207025B2 (ru)
BR (1) BRPI0806463A2 (ru)
CA (1) CA2674552A1 (ru)
CL (1) CL2008000104A1 (ru)
CO (1) CO6210757A2 (ru)
CR (1) CR10971A (ru)
CY (1) CY1113760T1 (ru)
DK (1) DK2114993T3 (ru)
DO (1) DOP2009000167A (ru)
EA (1) EA016326B1 (ru)
ES (1) ES2393812T3 (ru)
HK (1) HK1138853A1 (ru)
HR (1) HRP20120828T1 (ru)
IL (1) IL199663A0 (ru)
JO (1) JO2840B1 (ru)
MA (1) MA31093B1 (ru)
MX (1) MX2009007571A (ru)
MY (1) MY153679A (ru)
NZ (1) NZ578285A (ru)
PE (2) PE20130324A1 (ru)
PL (1) PL2114993T3 (ru)
PT (1) PT2114993E (ru)
SI (1) SI2114993T1 (ru)
TW (1) TWI434697B (ru)
WO (1) WO2008087102A1 (ru)
ZA (1) ZA200904923B (ru)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0806501A2 (pt) * 2007-01-15 2014-04-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Proteína de fusão, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, vacina ou composição imunogênica, e, uso da proteína de fusão.
MX2011009597A (es) 2009-03-17 2012-05-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Deteccion mejorada de la expresion del gen.
JP2012529269A (ja) * 2009-06-05 2012-11-22 ジ オハイオ ステイト ユニヴァーシティ リサーチ ファウンデーション 生体材料、組成物及び方法
GB0910046D0 (en) 2009-06-10 2009-07-22 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel compositions
GB201008682D0 (en) * 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
GB201101331D0 (en) * 2011-01-26 2011-03-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions and uses
JP2014529338A (ja) * 2011-07-22 2014-11-06 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｐｒａｍｅの精製
GB201114919D0 (en) * 2011-08-30 2011-10-12 Glaxosmithkline Biolog Sa Method
GB201116248D0 (en) 2011-09-20 2011-11-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Liposome production using isopropanol
RU2590701C2 (ru) * 2013-04-29 2016-07-10 Общество с ограниченной ответственностью "ГеноТехнология" Антигенная композиция и ее терапевтическое применение для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, а также способ получения белка
EP3053592A4 (en) 2013-10-01 2017-09-06 Mie University T cell-inducing vaccine containing interepitope sequence promoting antigen presentation
CN105254767A (zh) * 2015-11-17 2016-01-20 重庆科润生物医药研发有限公司 一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用
SG10202105561PA (en) 2016-11-30 2021-07-29 Advaxis Inc Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof
CN108264550B (zh) * 2017-01-04 2021-04-23 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别源自于prame抗原短肽的tcr
CN108948184B (zh) * 2017-05-22 2021-04-23 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别衍生自prame抗原短肽的t细胞受体
CN109400697B (zh) * 2017-08-17 2021-04-23 香雪生命科学技术（广东）有限公司 一种识别prame抗原短肽的tcr及其相关组合物
WO2019061297A1 (zh) * 2017-09-29 2019-04-04 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗
US20210177955A1 (en) * 2017-11-08 2021-06-17 Advaxis, Inc. Immunogenic heteroclitic peptides from cancer-associated proteins and methods of use thereof
CN109879957B (zh) * 2017-12-06 2022-03-18 香雪生命科学技术（广东）有限公司 针对prame的高亲和力t细胞受体
US20230190902A1 (en) * 2020-05-29 2023-06-22 Children's National Medical Center Identification of hla-restricted prame peptide epitopes, prame-specific t cells suitable for "off-the-shelf" treatment of cancer expressing prame
JP2024518378A (ja) 2021-05-05 2024-05-01 イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー Ｐｒａｍｅに特異的に結合する抗原結合タンパク質

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999010375A2 (en) * 1997-08-22 1999-03-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against hpv
WO1999040188A2 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccinations
WO2000050077A1 (en) * 1999-02-25 2000-08-31 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d
WO2001000232A2 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE466259B (sv) * 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
CA2156718A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Bruno Gander Immunological response potentiation process
US5830753A (en) * 1994-09-30 1998-11-03 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor dage and uses thereof.
EP1196772A2 (en) * 1999-07-08 2002-04-17 Stressgen Biotechnologies Corporation Induction of a th1-like response in vitro

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999010375A2 (en) * 1997-08-22 1999-03-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccine against hpv
US20020182221A1 (en) * 1997-08-22 2002-12-05 Smithkline Beecham Biologicals Recombinant papillomavirus vaccine and method for production and treatment
WO1999040188A2 (en) * 1998-02-05 1999-08-12 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccinations
EP1584685A2 (en) * 1998-02-05 2005-10-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
WO2000050077A1 (en) * 1999-02-25 2000-08-31 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d
WO2001000232A2 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HALLEZ SOPHIE ET AL.: "Phase I/II trial of immunogenicity of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7 protein-based vaccine in women with oncogenic HPV-positive cervical intraepithelial neoplasia", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY: CII JUL. 2004, vol. 53, no. 7, July 2004 (2004-07), pages 642-650, XP002477749, ISSN: 0340-7004, the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090101313A (ko) 2009-09-24
NZ578285A (en) 2011-12-22
CA2674552A1 (en) 2008-07-24
JO2840B1 (en) 2014-09-15
PE20081686A1 (es) 2008-12-25
ZA200904923B (en) 2012-12-27
PL2114993T3 (pl) 2013-01-31
PE20130324A1 (es) 2013-03-05
EP2114993A1 (en) 2009-11-11
AU2008207025A1 (en) 2008-07-24
PT2114993E (pt) 2012-11-28
US20080187535A1 (en) 2008-08-07
DK2114993T3 (da) 2012-10-22
BRPI0806463A2 (pt) 2011-09-06
JP5391080B2 (ja) 2014-01-15
AU2008207025B2 (en) 2012-08-23
CN101668770B (zh) 2013-06-12
HK1138853A1 (en) 2010-09-03
CR10971A (es) 2009-09-09
CL2008000104A1 (es) 2008-07-18
MY153679A (en) 2015-03-13
MX2009007571A (es) 2009-07-22
EP2114993B1 (en) 2012-08-29
TW200902048A (en) 2009-01-16
MA31093B1 (fr) 2010-01-04
CY1113760T1 (el) 2016-07-27
AR064862A1 (es) 2009-04-29
IL199663A0 (en) 2010-04-15
JP2010515444A (ja) 2010-05-13
CN101668770A (zh) 2010-03-10
CO6210757A2 (es) 2010-10-20
SI2114993T1 (sl) 2012-12-31
ES2393812T3 (es) 2012-12-28
EA200900795A1 (ru) 2010-02-26
HRP20120828T1 (hr) 2012-11-30
WO2008087102A1 (en) 2008-07-24
TWI434697B (zh) 2014-04-21
DOP2009000167A (es) 2009-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016326B1 (ru) Вакцина
JP4768121B2 (ja) Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用
ES2675825T3 (es) Vacunación tumoral que involucra una respuesta inmunitaria contra la proteína propia CLDN18.2
ES2398492T3 (es) Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1
CN101321781A (zh) 一种核苷酸疫苗
JP2019013229A (ja) 異種ポリペプチドを含むＣｙａＡベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用
CN109575142B (zh) 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗
US8309096B2 (en) Fusion protein
EA020617B1 (ru) Конструкции casb7439
Wang et al. Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase
US20160136287A1 (en) Conjugated vaccine
WO2009127766A1 (es) Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana
AU2008206463B2 (en) Fusion proteins comprising the tumor rejection antigens NY-ESO-1 and LAGE-1
ES2367998T3 (es) Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación.
PL203499B1 (pl) Sposób oczyszczania lub wytwarzania bia lka MAGE albo jego pochodnej oraz sposób wytwarzania szczepionki

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU