CN105254767A - 一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白由所述佐剂蛋白通过接头(Linker)或直接连接的方式与肿瘤相关抗原的N端或C端连接形成；其中，所述佐剂蛋白包含流感嗜血杆菌(Haemophilus？influenzae，Hi)蛋白D或所述流感嗜血杆菌蛋白D的片段；所述肿瘤相关抗原包含氨基酸序列为SEQ？ID？NO：3的HER2蛋白质或其片段。本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法及其应用。本发明制备的重组蛋白，能够抑制Blab/c小鼠体内HER2阳性乳腺癌细胞的增殖，或者延缓乳腺肿瘤的增长速度。

Description

一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物学和医学领域，具体地，本发明涉及一种可制备HER2/neu抗原阳性肿瘤疫苗的融合蛋白，具体而言是一种包括流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)蛋白D(ProteinD，PD)与HER2/neu肿瘤抗原的融合蛋白。

背景技术

对于肿瘤的治疗，目前有手术疗法、化学疗法、放射疗法等。手术疗法对于多组织转移的患者来说，没有治疗意义。化学疗法和放射疗法由于特异性较差会对正常细胞造成损害。因此临床上需要一种特异性较强的药物，特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞不造成损害。肿瘤免疫疗法是激活体内针对肿瘤抗原的细胞毒性T淋巴细泡(cytotoxicTlymphocytes，CTL)，通过被激活的CTL去杀伤表达相应肿瘤抗原的肿瘤细胞，因而具有特异性。肿瘤特异抗原或相关抗原是研制具有特异性CTL激活作用的生物制品的关键。

HER2是一种肿瘤相关抗原，其编码基因位于人第17对染色体长臂21位(17q21)，编码跨膜受体样的磷酸化糖蛋白，分子量为185KD，故又被称为P185。P185由1255个氨基酸组成，其胞外段是由632个氨基酸组成的配体结合域，这个区域富含半胱氨酸；跨膜区是由22个氨基酸组成的强疏水区，作为膜锚定区而使整个蛋白质分子定位在细胞膜上；其胞内段由580个氨基酸构成，含酪氨酸激酶活性域(CoussensL，1985)。

通常情况下，HER2基因主要是在人类的胚胎发育时期表达，参与多种组织器官的生长发育。在人类成年后，只在一些特定组织中，如：肾脏、肝脏、乳腺组织、卵巢、胰脏、胃等组织中存在低水平表达。在人类肿瘤中，由于基因产物的过度表达使HER2/neu的分子表达发生改变，在20％～30％的侵袭性乳腺癌患者中有HER2的扩增。此外在卵巢癌(17-37％)，非小细胞肺癌(27-56％)，间质癌(37％)，膀胱癌(36％)，食道癌(60-73％)，唾液腺癌(32-62％)，原发性肾细胞癌(10％)，胰腺癌(＞50％)中都有其过表达(SlamonDJ，1989；SchneiderPM，1989；WeinerDB，1990；YokotaJ，1988；HouL，1992；ScheurleD，2000；SeligerB，2000；LipponenP，1994；TagliabueE，2000)。可见，HER2的过表达在肿瘤转化中起积极作用，是肿瘤病因之一。此外，出现在乳腺癌发生早期阶段的HER2蛋白质的高表达，也增加肿瘤细胞的转移能力，高表达的HER2通过启动多种转移相关机制包括提高：细胞迁移率、体外侵袭力、IV型胶原酶活性、影响某些粘附分子如上皮细胞钙粘蛋白等的合成而促进转移(Blume-JensenP，2001)。因此，HER2成为肿瘤治疗疫苗的重要标靶之一。

抗原的表位(epitope)又称为抗原决定簇，determinant)，它是T细胞抗原受体(Tcellreceptor，TCR)和B细胞抗原受体(Bcellreceptor，BCR)及抗体特异结合的基本单位。根据与TCR和BCR结合的区别，表位可分为T细胞表位和B细胞表位。由于表位疫苗缺乏三维结构的分子小、免疫原性差、半衰期短，其不能单独诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。

流感嗜血杆菌PD蛋白是高度保守的表面脂蛋白，作为Hi的一种特征性毒力决定因子，流感嗜血杆菌PD蛋白在Hi引起呼吸道感染过程中起重要作用。人们最初是在研究Hi与人IgD骨髓瘤蛋白4490结合时确认流感嗜血杆菌PD蛋白的。对流感嗜血杆菌PD蛋白编码区DNA进行的序列分析显示，流感嗜血杆菌PD蛋白的成熟蛋白有1092bp的开放读框编码，由346个氨基酸组成，相对分子质量42000。研究显示，各Hi菌株中PD蛋白仅存在很小的变异。核酸和氨基酸水平序列分析显示，各菌株PD具有高度的保守性，并且基因置换均匀分布于整个基因。分析分离于慢性支气管炎患者不同感染期的Hi显示，各菌株的流感嗜血杆菌PD蛋白的基因仅发生很小的突变。采用3种不同的鼠抗PD单克隆抗体进行蛋白印迹分析发现，PD蛋白存在于所有127株Hi中，每株细菌表面的PD分子数量约为2800个。这些研究均证实，流感嗜血杆菌PD蛋白是位于菌体表面的外膜蛋白，具有高度的抗原保守性，是极具潜力的疫苗候选蛋白。

流感嗜血杆菌PD蛋白是一种具有甘油磷酸二酯酶活性的细菌毒力因子，能导致宿主上皮细胞释放磷酸胆碱。以PD蛋白作为载体蛋白的肺炎链球菌多糖结合疫苗，能预防肺炎链球菌性耳炎。PD蛋白是迄今为止第一种能在人类机体中诱导保护性应答的不可分型流感嗜血杆菌抗原，也是最具潜力的多糖结合疫苗候选载体蛋白。

流感嗜血杆菌PD蛋白是新型的结合疫苗蛋白载体之一，2009年由葛兰素史克公司研发的十价肺炎结合疫苗Synflorix在欧洲上市，这个疫苗将1，5和7F三个血清型的肺炎球菌荚膜多糖连接到流感嗜血杆菌PD蛋白上，临床数据表明了其良好的免疫原性和安全性。

引起急性中耳炎疾病的两大病源菌是肺炎球菌和无荚膜流感嗜血杆菌，二者都被认为是下呼吸道感染的主要因素。虽然肺炎球菌荚膜多糖的疫苗应用了很多年，但是对于儿童的保护性很差。后来，一七价肺炎多糖疫苗用CRM₁₉₇作为载体的结合疫苗，能够对儿童起到保护作用，预防肺炎球菌引起的侵袭性疾病和急性中耳炎。而缺点是CRM₁₉₇这个载体同样也用于了Hib和脑膜炎的结合疫苗，因此，同样的载体可能就会对疫苗的免疫力产生负面的影响。基于以上的原因和流感嗜血杆菌PD蛋白本身的优点，比如说膜定位，序列保守，分布广泛，致病性和良好的临床前实验结果，都使得流感嗜血杆菌PD蛋白成为了肺炎十价多糖疫苗的载体蛋白，并可以预防肺炎球菌和无荚膜Hib的双重感染。同时在本实验室的前期工作中以证明利用Hi蛋白作为载体佐剂蛋白，携带外源性表位在添加或者不添加佐剂后能够诱导动物产生良好的免疫应答。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于制备HER2抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的融合蛋白。

肿瘤治疗性疫苗设计初衷是打破由肿瘤细胞引起的机体免疫耐受，由于机体免疫耐受的影响，使机体免疫***不能识别非己成分，免疫***无法识别肿瘤相关抗原，最终导致免疫抑制。研究报道发现免疫全序列的HER2蛋白并不能打破免疫耐受，激发免疫应答，申请人在研究中发现由于全序列HER2蛋白包含有造成免疫耐受的表位，因而，在肿瘤治疗性疫苗的设计中，选择截取的部分序列代替全长序列更利于打破免疫耐受，如HER2胞外区、跨膜区、胞内区或者一些Tcell表位和Bcell表位。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种融合蛋白，所述融合蛋白由所述佐剂蛋白通过接头(Linker)或直接连接的方式与肿瘤相关抗原的N端或C端连接形成；其中，

所述佐剂蛋白包含流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)蛋白D或所述流感嗜血杆菌蛋白D的片段；

所述肿瘤相关抗原包含氨基酸序列为SEQIDNO：3的人HER2蛋白质或其片段；

优选地，所述肿瘤相关抗原由人HER2抗原胞外区片段和HER2表位肽片段组合形成，所述HER2抗原胞外区片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4，所述HER2表位肽片段的氨基酸序列为SEQIDNO：5。

优选地，所述接头的氨基酸序列为-GGGGSGGGGSGGGGS-；优选地，所述佐剂蛋白通过直接连接的方式与所述肿瘤相关抗原的N端连接。

在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：6。

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由编码如权利要求1或2所述的融合蛋白的核苷酸序列连接商业化载体以及任选地加入酶切识别位点序列和/或编码蛋白质标签的序列构建而成，所述商业化载体选自美国Merk公司pET载体***如pET-28a-c(+)、pET29a、pET-30a-c(+)、pET39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)以及pET-43.1a(+)中的一种或多种；优选地，所述核苷酸序列为SEQIDNO：7。

在根据本发明的一个实施方案中，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列5’端的依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应的编码核酸序列，优选地，所述依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应编码核酸序列SEQIDNO：8。

在根据本发明的一另一个实施方案中，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列3′端的终止密码子序列和酶切识别位点序列；优选地，所述终止密码子序列和酶切识别位点序列为SEQIDNO：9；更优选地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：10。

本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS或TB1。

本发明进一步提供了上述融合蛋白的制备方法，将上述的宿主细胞经IPTG(Merk，美国)诱导融合蛋白表达，收集包涵体，提取包涵体中的融合蛋白，纯化得到融合蛋白；

优选地，所述纯化是通过下述方法实现的：

将融合蛋白通过螯合层析柱进行纯化。

在本发明的一个实施方案中，所述纯化步骤还包括：

以肠激酶酶切融合蛋白，然后将酶切后的融合蛋白上样于酶切目的蛋白上样于Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow，再以浓度为50mM的咪唑洗脱。

本发明提供的融合蛋白可用于制备HER2抗原阳性肿瘤疫苗，所述疫苗包含如上所述的融合蛋白；优选地，所述疫苗为HER2抗原阳性肿瘤治疗性疫苗；优选地，所述抗原阳性肿瘤为乳腺肿瘤。

进一步地，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂选自GM-CSF和GM-CSF+CpG中的一种或多种；优选地，所述疫苗的剂型为注射剂。

本发明ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗的制备方法及应用包括如下步骤：

以构建重组pET-30a(+)原核表达载体为例：①构建pET-30a(+)原核表达载体；②含有编码Hi的PD蛋白19-129aa核酸序列、HER2蛋白41-560aa的核酸序列，HER2蛋白774-790aa的核酸序列，以及Linker的核酸序列的重组原核表达载体；③提供一种用于表达的大肠杆菌，将含有编码Hi的PD蛋白19-129aa核酸序列、HER2蛋白41-560aa的核酸序列，HER2蛋白774-790aa的核酸序列，Linker的核酸序列的重组原核表达载体转化用于表达的大肠杆菌，经转化后可以稳定表达ProteinD与HER2融合蛋白；④提供用于纯化ProteinD与HER2融合蛋白的方法。

本发明产品及方法中所述的百分含量均为质量体积百分含量。

本发明涉及一种ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗。该疫苗包含有PD蛋白的19-129aa，HER2蛋白的41-560aa，HER2蛋白的774-790aa，可以激发良好的机体免疫应答，打破免疫耐受。本发明制备的ProteinD与HER2融合蛋白可在体外刺激巨噬细胞大量分泌表达TNF-α。同时对本发明制备的ProteinD与HER2融合蛋白进行了药效实验，分别通过免疫注射经此形成的融合蛋白治疗性疫苗加入或不加入佐剂，可在50天内抑制4T1-HER2细胞在Balb/c小鼠的乳腺癌动物模型增殖，肿瘤生长抑制率达到90％以上，由ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗激活的细胞免疫明显高于PBS对照组。由此表明研发的ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗在含有或不含有佐剂的情况下，对抑制4T1-HER2细胞在Balb/c小鼠乳腺癌动物模型增殖具有良好的免疫治疗性作用。其中所述4T1-HER2细胞为携带人源HER2的cDNA经逆转录病毒转染小鼠乳腺癌4T1细胞株构建而成的；其中所述4T1-HER2乳腺癌动物模型为注射4T1-HER2到雌性BALB/C小鼠皮下建立的动物模型。

本发明的有益效果是：

通过筛选抗原表位，并串联表达，避开HER2蛋白免疫耐受表位，打破肿瘤患者自身的免疫耐受，激活机体抗肿瘤免疫。

通过将抗原表位与PD蛋白偶联表达，利用PD蛋白的高免疫原性作为佐剂蛋白制备的重组蛋白，能够提高重组蛋白免疫原性，促进抗原提呈，增强机体抗肿瘤免疫应答。

本发明制备的重组蛋白，能够抑制Blab/c小鼠体内HER2阳性乳腺癌细胞的增殖，或者延缓乳腺肿瘤的增长速度。

本发明制备的重组蛋白对人HER2阳性乳腺癌术后防治复发，化疗放疗治疗的辅助治疗具有很大应用前景，能够激发机体免疫应答，利用自身免疫***对癌细胞的杀伤。

本发明制备的重组蛋白对人HER2阳性肿瘤术后防治复发，化疗放疗治疗的辅助治疗具有很大应用前景，能够激发机体免疫应答，利用自身免疫***对癌细胞的杀伤。

本发明制备的ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗可不含有佐剂，也可以含有如下佐剂中的一种或几种：①GM-CSF；②CpG；③GM-CSF+CpG等。

本发明制备的ProteinD与HER2融合蛋白治疗性疫苗可制成多种临床适用的剂型，包含但不限于注射剂型。

附图说明

图1pET30-a(+)-PD-HER2表达载体构建示意图；

图2pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)工程菌诱导表达SDS-PAGE电泳图；

图3PD-HER2融合蛋白疫苗体外细胞测活曲线；

图4PD-HER2融合蛋白疫苗小鼠体内试验肿瘤生长曲线；

图5PD-HER2融合蛋白疫苗小鼠体内试验生存率曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1重组PD-HER2融合蛋白治疗性疫苗工程菌构建

1.pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)工程菌构建

选择来源于Hi的PD蛋白(GenBank登录号：CAA84716)，全长364个氨基酸，如SEQIDNO：1所示。选取PD蛋白19-127位氨基酸作为佐剂蛋白，如SEQIDNO：2所示。肿瘤相关抗原人HER2(GenBank登录号：AAA75493.1)全长1255个氨基酸，如SEQIDNO：3所示。选取HER2抗原胞外区片段(41-560aa)和HER2表位肽片段(774-788aa)作为疫苗分子抗原。HER2抗原胞外区片段(41-560aa)氨基酸序列如SEQIDNO：4，HER2表位肽片段(774-788aa)如SEQIDNO：5所示。

重组PD-HER2融合蛋白治疗性疫苗分子为，将PD蛋白19-127位氨基酸通过Linker序列-GGGGSGGGGSGGGGS-连接至HER2抗原胞外区片段(41-560aa)N端，再将HER2表位肽片段(774-788aa)直接连接于HER2抗原胞外区片段(41-560aa)C端。设计的PD-HER2融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO：6所示，其对应编码核酸序列如SEQIDNO：7所示。

为了纯化方便，在PD-HER2融合蛋白核酸序列(SEQIDNO：7)5’端依次加上6×His标签和肠激酶位点(HHHHHHDDDDK)对应编码核酸序列，和NdeI识别位点，如SEQIDNO：8CATATGCACCACCACCACCACCACGACGACGACGATAAA，其中下划线处为NdeI识别位点，CACCACCACCACCACCACGACGACGACGATAAA-为HHHHHHDDDDK对应的编码核酸序列。同时在PD-HER2融合蛋白核酸序列(SEQIDNO：7)3’端依次加上两个终止密码子序列和NotI识别序列，如SEQIDNO：9TAATGAGCGGCCGC，下划线为两个终止密码子序列，GCGGCCGC为NotI识别序列。将该设计的PD-HER2融合蛋白核苷酸序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成(核苷酸序列为SEQIDNO：10)。通过NdeI/NotI位点(TAKARA，大连)亚克隆至表达载体，其载体选自商业化载体pET-30a-c(+)(Merk，美国)，构建获得表达载体pET30-a(+)-PD-HER2，构建示意图如图1所示。

将构建的表达载体用化学转染法，转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)，利用LB+kan固体平板筛选，获得重组表达工程菌pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)。

2.工程菌诱导筛选

随机挑取上述pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)工程菌接种至10mlLB培养基(100ug/mlkan)，100ml锥形瓶培养，37℃220rpm摇床培养过夜。第二天取过夜培养的母液按1％比例转接于40mlLB液体培养基(100ug/mlkan)，在250ml锥形瓶中，37℃，220rpm培养2.5h，至OD₆₀₀值约0.6-1.0。加入终浓度1mMIPTG，30℃诱导4h。

SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，泳道1-3：pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)1-3号工程菌诱导4h总蛋白；对照：未诱导总蛋白；泳道M：蛋白质分子量Marker；泳道S1、S2：1、2号工程菌破菌上清；泳道P1、P2：1、2号工程菌破菌沉淀。与对照比较，在理论分子量74kD处3株工程菌实现特异表达。对其中2株诱导表达菌体进行破菌分析，表明全部为包涵体表达。

实施例2重组PD-HER2融合蛋白工程菌发酵

将上述实施例1中构建的pET30-a(+)-PD-HER2/BL21(DE3)工程菌划线LB平板(kan100mg/L)，37℃恒温培养箱(博迅，上海)培养约16-18h，至单菌落长出。挑工程菌单菌落接种20mlLB培养基中(kan100mg/L)，37℃，230rpm培养8h。0.1％转接至250mlLB(kan100mg/L)，1L锥形瓶，37℃，230rpm培养13h。平行培养4瓶，制备菌液1000ml，5％接种至发酵罐NLF-2220L上罐培养基中，接种前用氨水将pH调至7.0，发酵过程控制温度为36℃。培养基的pH值和溶氧通过流加氨水和增加搅拌速度和通气量来控制，溶氧大余30％。约5h后培养基中的碳源耗尽，OD₆₀₀达到20，之后以240mL/h/20L培养基的速度开始流加补料培养基(40％甘油+20％酵母粉)继续培养，OD₆₀₀达到35，以60mL/h/20L培养基的速度流加补料培养基开始诱导，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Merk)，终浓度1mM。并保持此流加速度，维持DO在30％以上。诱导4h，下罐。

离心收集菌体，将菌体悬浮在破菌缓冲液中(20mmTris-HCl，5mMEDTA，PH8.0)，菌体与破碎缓冲液的比例为：1g菌体：10ml缓冲液。充分混悬后，用高压均质机破碎(ATSENGINEERINGINC生产，型号AH-PILOT)，压力80Mpa，循环破菌三次，用高速冷冻离心机(日立，CR21GIII)，分离包涵体与破菌液。离心条件为10℃8000g，离心15min。收集沉淀，弃上清液。

实施例3重组PD-HER2融合蛋白分离纯化

1、包涵体洗涤

(1)第一次洗涤

取实施例2中收集的沉淀，主要成分为包涵体(IB)。用洗涤缓冲液(20mMTris-HCl、2M尿素(国药，上海)、1％TritonX-100(sigma，美国)、5mMEDTA(国药，上海)、0.2MNaCl(国药，上海)，pH8.0)洗涤。IB∶洗涤缓冲液＝1g∶20ml，室温下，磁力搅拌30min，8000g离心10min去上清。

(2)第二次洗涤

将第一次洗涤后收集的包涵体沉淀，用洗涤缓冲液(20mMTris-HCl、2M尿素、5mMEDTA、0.2MNaCl，pH8.0)洗涤。IB∶洗涤缓冲液＝1g∶20ml，室温下，磁力搅拌30min，8000g离心10min去上清。

(3)第三次洗涤

将第三次洗涤后收集的包涵体沉淀，用洗涤缓冲液(20mMTris-HCl、5mMEDTA、0.2MNaCl，pH8.0)洗涤。IB∶洗涤缓冲液＝1g∶20ml，室温下，磁力搅拌30min，8000g离心10min去上清。

2、包涵体溶解与层析复性

(1)IB溶解

溶解缓冲液：20mMTris-HClpH8.0+8M尿素(国药，上海)+5mMDTT(sigma，美国)。IB(g)∶溶解缓冲液(ml)＝1g∶10ml，磁力搅拌器搅拌，室温溶解6小时。

(2)复性

取包涵体溶解样品100ml，以0.2ml/min的流速加入到900ml稀释复性缓冲液中(1M尿素、5％甘油、0.1MNaCl、50mMTris-HCl，pH8.0)，进行稀释复性，缓冲液用磁力搅拌器以低转速搅拌(60rpm/min)，样品添加完成后再搅拌4h左右，然后放入4℃层析柜中过夜复性(12小时)，稀释复性后样品中变性剂浓度为1.5-2M之间。

(3)螯合层析纯化

柱规格与处理：Φ3.5cm×H10cm(螯合填料80ml，GE，美国)；用0.1M硫酸镍缓冲处理层析柱4倍柱体积再dH2O实验用水冲洗层析柱10柱体积。

螯合层析平衡：平衡缓冲液(2.0M尿素、0.1MNaCl、50mMTris-HCl，pH8.0)，流速20ml/min，平衡时间30min。

用蠕动泵泵入层析柱，流速20ml/min。进样完成后，继续平衡20min。用缓冲液(20mMPB、0.2MNaCl、5％甘油，pH8.0)洗脱，流速20ml/min。再用缓冲液(20mMPB、0.2MNaCl+、％甘油、40mM咪唑，pH8.0)洗脱，流速20ml/min。再用缓冲液(20mMPB、0.2MNaCl、5％甘油、200mM咪唑，pH8.0)洗脱，流速20ml/min，收集目的峰。

收集的目的融合蛋白经脱盐处理，按每1mg融合蛋白加入0.5U肠激酶(sigma，美国，50mMTris-HCl，2mMCaCl2，0.1％Tween-20，pH8.0)在6-8℃条件下酶切融合蛋白约17h。

酶切目的蛋白上样于Ni²⁺-ChelatingSepharoseFastFlow(GE，美国)，目的蛋白和融合标签同时挂柱。但目的蛋白挂柱结合力低，用50mM浓度咪唑(上海生工，批号：B421BA0025)洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。再经过CMFF精纯化获得高纯度目的蛋白。SDS-PAGE检测分子量约72kD，纯度大于95％。

实施例4重组PD-HER2融合蛋白治疗性疫苗体外活性测定

PMA刺激THP-1分化的巨噬细胞检测重组蛋白免疫原性

1、该方法使用由THP-1细胞(ATCC，美国)分化来的巨噬细胞对重组PD-HER2融合蛋白的活性进行测定，能够在体外环境下直接真实的反映重组蛋白的免疫原性。

2、实验方法

添加佛波酯(PMA，sigma)刺激THP-1细胞分化为巨噬细胞，利用巨噬细胞对抗原的摄取与提呈的能力，通过TNF-α检测试剂盒(MABTECH，货号3510-1H-6)检测巨噬细胞在添加抗原之后产生的TNF-α含量，测定重组PD-HER2融合蛋白的活性。

2.1PMA刺激THP-1分化

2.1.1收获THP-1细胞，离心(300g，5分钟)收集细胞，弃去上清液；

2.1.2用含10％FBS的1640培养基重悬细胞并混匀；

2.1.3镜下进行细胞计数1，并用培养基调整细胞密度为7×105/ml；

2.1.4设置PMA刺激剂的浓度为100ng/ml；

2.1.5将上述混匀好的含PMA的THP-1细胞液，加入到24孔细胞培养板中，500μl/well；将细胞培养板置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养37h；

2.2抗原刺激巨噬细胞

2.2.1无血清处理24h，吸弃24孔板中培养基，用无血清1640培养基洗一遍，随后添加每孔添加500μl无血清培养基继续培养24h。

2.2.2将稀释好的500μl抗原按上述分组添加至对应的孔，继续培养24h，收集上清，使用试剂盒检测TNF-α水平。

2.2.3TNF-αELISA检测

包被取28μl加PBS至7ml.100μl/孔4℃过夜。

洗板用PBS洗2次。

用含0.1％BSA的PBS37℃封闭1小时。

洗板5次，PBS+0.05％吐温20；

加样standard1μg/ml加含0.1％BSA的PBS稀释至10ng/ml，再做7个2倍稀释；从细胞培养板中吸取培养上清，100μl/孔。37℃作用2小时。

洗板5次。

加mAbTNF5-biotin：取14μl加含0.1％BSA的PBS至7ml。100μl/孔。37℃作用1小时。

洗板5次。

取streptavidin-HRP7μl加含0.1％BSA的PBS至7ml，100μl/孔。37℃作用1小时。

洗板5次。

显色：每孔加100μlTMB底物液，26℃作用。

650nm动态读板(每隔1min检测一次，中度振荡3sec)

用GraphPrism5.0软件计算舒张度EC₅₀和半效稀释倍数，以下式计算：

3、实验结果

本发明制备的PD-HER2融合蛋白生物活性的EC₅₀为8μg/ml，见图3。

实施例5重组PD-HER2融合蛋白治疗性疫苗小鼠体内抑瘤活性测定

1、该方法使用Balb/c小鼠4T1-HER2转移动物模型，测定本发明制备的PD-HER2融合蛋白抑瘤活性。其中所述4T1-HER2细胞为携带人源HER2的cDNA经逆转录病毒转染小鼠乳腺癌4T1细胞株(ATCC，美国)构建而成的；其中所述4T1-HER2乳腺癌动物模型为注射4T1-HER2到雌性BALB/C小鼠皮下建立的动物模型。

2、实验方法

2.14T1-HER2Balb/c小鼠动物模型建立

取BALB/c小鼠40只，原位皮下接种1×10⁵细胞/只的肿瘤4T1-HER2悬液。

2.2重组PD-HER2融合蛋白免疫动物

接种肿瘤的同时，将小鼠分为4组给予药物治疗，每组10只，共2-3次免疫注射，两次免疫之间间隔1周，即分别在接种肿瘤的0、7、14天给药。分组如下：

①对照组：注射PBS缓冲；

②疫苗组：疫苗用量100μg/只；

③佐剂组：注射佐剂；

④疫苗+佐剂组：疫苗100μg+佐剂混合液，摇匀后注射。

2.3实验周期

自肿瘤接种之日计，实验周期为50个自然日。实验期间，每周测量2次小鼠肿瘤体积和体重，做成瘤率及肿瘤体积动态记录，同时记录生存率.

2.4实验结果

通过统计肿瘤大小得出，重组ProteinD与Her2融合蛋白可在50天内抑制4T1-HER2细胞在Balb/c小鼠的乳腺癌动物模型增殖，肿瘤生长抑制率达到90％以上，见图4。由此表明研发的ProteinD与Her2融合蛋白治疗性疫苗在含有或不含有佐剂的情况下，对抑制4T1-Her2细胞在Balb/c小鼠乳腺癌动物模型增殖具有良好的免疫治疗性作用，能够提高Balb/c小鼠乳腺癌动物模型的生存率，见图5。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由所述佐剂蛋白通过接头(Linker)或直接连接的方式与肿瘤相关抗原的N端或C端连接形成；其中，

所述佐剂蛋白包含流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)蛋白D或所述流感嗜血杆菌蛋白D的片段；

所述肿瘤相关抗原包含氨基酸序列为SEQIDNO：3的HER2蛋白质或其片段；优选地，所述肿瘤相关抗原由人HER2抗原胞外区片段和HER2表位肽片段组合形成，所述HER2抗原胞外区片段的氨基酸序列为SEQIDNO：4，所述HER2表位肽片段的氨基酸序列为SEQIDNO：5；

优选地，所述佐剂蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：2；

优选地，所述接头的氨基酸序列为-GGGGSGGGGSGGGGS-；优选地，所述佐剂蛋白通过直接连接的方式与所述肿瘤相关抗原的N端连接。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：6。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体由编码如权利要求1或2所述的融合蛋白的核苷酸序列连接商业化载体以及任选地加入酶切识别位点序列和/或编码蛋白质标签的序列构建而成，所述商业化载体选自pET-28a-c(+)、pET29a、pET-30a-c(+)、pET39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)以及pET-43.1a(+)中的一种或多种；优选地，所述核苷酸序列为SEQIDNO：7。

4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列5’端的依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应的编码核酸序列，优选地，所述依次排列的酶切识别位点、组氨酸标签和肠激酶位点对应编码核酸序列SEQIDNO：8。

5.如权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包含位于所述核苷酸序列3′端的终止密码子序列和酶切识别位点序列；优选地，所述终止密码子序列和酶切识别位点序列为SEQIDNO：9；更优选地，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为SEQIDNO：12。

6.含有如权利要求3～5中任一项所述的表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌；优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)、BL21(DE3)PlysS或TB1。

7.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，将权利要求6所述的宿主细胞经IPTG诱导融合蛋白表达，收集包涵体，提取包涵体中的融合蛋白，纯化得到融合蛋白；

优选地，所述纯化是通过下述方法实现的：

将融合蛋白通过螯合层析柱进行纯化。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化步骤还包括：

以肠激酶酶切融合蛋白，然后将酶切后的融合蛋白上样于酶切目的蛋白上样于Ni2+-ChelatingSepharoseFastFlow，再以浓度为50mM的咪唑洗脱。

9.一种HER2抗原阳性肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1或2所述的融合蛋白；优选地，所述疫苗为HER2抗原阳性肿瘤治疗性疫苗；优选地，所述抗原阳性肿瘤为乳腺肿瘤。

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包含佐剂，所述佐剂选自GM-CSF、CpG和GM-CSF+CpG；优选地，所述疫苗的剂型为注射剂。