KR20080030039A

KR20080030039A - 인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양

Info

Publication number: KR20080030039A
Application number: KR1020087001755A
Authority: KR
Inventors: 람쿠마 만달람; 얀 리; 이사벨 나듀-데머스
Original assignee: 제론 코포레이션
Priority date: 2005-06-22
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2008-04-03
Also published as: JP5560391B2; US20100144033A1; JP5770213B2; AU2006262369A1; CA2613369A1; GB0800365D0; CN107189980B; HK1122836A1; EP3599277A1; EP1910516B1; KR20130100221A; CN101233226B; IL188264A0; US20190017014A1; US20150307838A1; KR20160116024A; US20200399592A1; US9074181B2; CA2613369C; WO2007002086A3

Abstract

본 발명의 개시 내용은 인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위한 개선된 시스템을 제공한다. 상기 세포는, 배양 환경의 생산 능력을 최대화하도록 현탁 배양한다. 본 발명의 신규한 배양 시스템은 더 비용 효율적인 방식으로 hES 세포을 대량 증식시킬 수 있으며, 이는 인간 치료에 사용하기 위한 중요한 제품의 상업적 생산을 용이하게 한다.

Description

인간 배아 줄기 세포의 현탁 배양{SUSPENSION CULTURE OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}

다른 특허 출원

본 출원은 2005년 6월 22일 출원된 USSN 60/693,266호를 기초로 우선권을 주장한다.

배경기술

재생 의학은, 여러 가지 유형의 전구 세포의 분리, 배양 및 용도에 관련한 최근의 진보로 이득을 얻고 있다. 본 발명의 개시 내용은 인간 만능 줄기 세포 및 이의 유도체의 상업적 개발에 추가의 개선점을 제공한다.

배아 줄기 세포는 2 가지 아주 특별한 특성을 갖는다. 첫째로, 다른 보통의 포유류 세포 유형과는 달리, 이들은 배양물에서 거의 무한히 증식되면서, 사실상 무제한의 공급을 제공할 수 있다. 둘째로, 이들은, 조직 치료 또는 약제의 선별에 사용하기 위한 대용 세포 및 조직의 공급원으로서 관심있는 다양한 조직 유형을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

Thomson 등(미국 특허 5,843,780호; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995)은 최초로, 영장류로부터 만능 줄기 세포를 성공적으로 분리하고 증식시켰다. 이들은 이후 인간 배반포로부터 인간 배아 줄기(human Embryonic Stem; hES) 세포 주를 유도하였다(Science 282:114, 1998). Gearhart 및 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 생식(human Embryo Germ; hEG) 세포주를 유도하였다(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998; 및 미국 특허 6,090,622호). hES 및 hEG 세포 모두는 만능 줄기 세포의 장기 수득(long-sought) 특성을 갖는데, 즉, 이들은 분화하지 않고 대규모로 배양될 수 있고, 보통의 핵형을 가지며, 다수의 중요한 세포 유형을 생성할 수 있다.

치료에 만능 줄기 세포를 사용하는 것에 대한 중요한 과제는, 분화를 방지하기 위해 이들을 영양 공급자(feeder) 세포의 층에 종래 방식으로 배양하는 것이다(U.S. 5,843,780호; U.S. 6,090,622호). Thomson 등(Science 282:114, 1998)에 따르면, 영양 공급자 없이 배양된 hPS 세포는, 곧 죽거나 수임 세포의 이종 군집으로 분화한다. 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor; LIF)는 마우스 ES 세포의 분화를 억제하나, 인간 ES 세포의 분화를 방지하는 영양 공급자 세포의 역할을 대신하지는 않는다.

미국 특허 6,800,480호(Geron Corp.)는 발명의 명칭이 "영장류에서 유도한 원시 줄기 세포의 성장을 위한 방법 및 물질(Methods and materials for the growth of primate - derived primordial Stem cells)"이다. 국제 특허 공개 공보 WO 01/51616호(Geron Corp.)는 발명의 명칭이 "인간 만능 줄기 세포의 성장 및 분화를 위한 기법(Techniques for growth and differentiation of human pluripotent stem cells)"이다. Xu 등의 논문(Nature Biotechnology 19:971, 2001)은 명칭이 "미분화된 인간 배아 줄기 세포의, 영양 공급자 무함유 성장(Feeder - free growth of undifferentiated human embryonic stem cells)"이다. Lebkowski 등의 논문(Cancer J. 7 Suppl. 2:S83, 2001)은 명칭이 "인간 배아 줄기 세포: 재생 의학 적용을 위한 배양, 분화, 및 유전적 변형(Human embryonic stem cells : culture , differentiation, and genetic modification for regenerative medicine applicaions)"이다. 국제 특허 공개 공보 WO 03/020920호는 발명의 명칭이 "인간 배아 줄기 세포의 신속한 증식을 위한 배양 시스템(culture System for Rapid Expansion of Human Embryonic Stem Cells)"이다. Li 등의 논문(Biotechnology and Bioengineering, Published Online: 21 Jun 2005)은 명칭이 "인간 배아 줄기 세포의 증식(Expansion of human embryonic stem cells)"이다. 이 공보들은 미분화된 상태로 배아 줄기 세포를 증식시키는 예시적인 배양 시약 및 기법, 그리고 인간 치료를 위한 세포의 제조에서의 이의 용도를 기재한다.

하기에 제공되는 정보는, 미분화된 만능 줄기 세포의 성장 및 조절을 용이하게 할 hES 세포 배양의 과학을 더 발전시키고, 배아 세포 치료의 충분한 상업적 잠재력을 실현하는 데 도움이 된다.

발명의 개요

본 개시 내용은 영장류 만능 줄기(hES) 세포를 배양하고 증식시키기 위한 개선된 시스템을 제공한다. 본 발명의 현탁 배양 시스템은, 치료 및 신약 개발에 사용하기 위해, 사용자가 신속하고 부피 효율이 좋은 방식으로 고품질의 배아 줄기 세포를 제조할 수 있게 한다.

본 발명의 한 양상은 현탁액 중의 인간 배아 줄기(hES) 세포의 배양물이며, 여기서 hES 세포는 실질적으로 미분화되어 있다. 상기 배양물은, 고농도의 섬유아세포 성장 인자, 다른 배지 첨가제, 예컨대 TGFβ, 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor; SCF), 또는 Flt3 리간드(Flt3L), 1 종 이상의 가용성 또는 현탁형 세포외 기질 성분, 예컨대 라미닌 및/또는 피브로넥틴, 또는 임의로 사실상 다공성이거나 세포외 기질로 코팅된, 여러 가지 종류의 고체 극미립자 중 하나 이상을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 양상은, 세포를 영양 배지에 현탁하는 단계, 상기 세포를 상기에 설명한 바와 같은 시스템에서 배양하면서 현탁액 중에서 유지하는 단계, 배지를 주기적으로 교체하는 단계, 임의로, 세포 밀도를 감소시키기 위해 배양물을 때때로 분할하는 단계, 및 최종적으로 배양물로부터 세포를 회수하는 단계를 포함하는, hES 세포의 배양 방법이다.

본 발명의 다른 양상은, 전술한 또는 후술하는 성분들 중 하나 이상을 포함하는, 현탁액에서 hES 세포를 배양하기 위한 시스템 또는 키트이다.

본 발명의 상기 양상들 및 다른 양상들은 이어지는 상세한 설명으로 인해 명백해질 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 성장 인자를 보충한 비조절 배지의 고체 표면상에서 6 회 계대 배양한 후의 hES 세포의 콜로니를 도시한다. (A) mEF 조절 ES 배지(대조군) + bFGF(8 ng/mL); (B) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL); (C) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자)(15 ng/mL); (D) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL); (E) QBSF^TM-60 + bFGF(40 ng/mL). 모든 3 가지 기본 배지(ES 배지, X-VIVO^TM 10, 및 QBSF^TM-60)는 영양 공급자 무함유 배양물에서 hES 세포를 증식시키기 위해 이용될 수 있다. 이 도면에서, (C)에 도시된, 결합하여 성장하는 세포들은 계대 배양마다 8.2 배 증식되었으며, 조절 배지의 것들은 2.2 배 증식되었다.

도 2는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 실시간 RT-PCR로 측정한, hTERT 및 Oct3/4의 유전자 발현 프로필을 도시한다.

도 3은 비조절 배지에서 배양된 세포가 그의 다능성을 보유하고 있음을 입증한다. hES 세포는 mEF 조절 배지, 또는 bFGF 및 SCF를 함유하는 비조절 X-VIVO^TM 10 배지에서 7 회 계대 배양하였다. 이어서 상기 세포를 배상체로 분화시키고, 평판에 분주하여, 면역 세포 화학법으로 각각의 3 가지 배엽을 나타내는 표현형 마커에 대해 분석하였다. 상기 세포들의 α-태아단백질(내배엽에 해당함), 근육 액틴(중배엽에 해당함), 및 β-튜불린 III(외배엽에 해당함)을 염색하였다.

도 4는 스피너 플라스크(spinner flask)에서 현탁 배양으로 성장한 hES 세포(실시예 3)의 세포수를 도시한다. 배양물이 확립된 후, 세포는 동일한 밀도로 계속 증식한다(윗 그림). 표준 표면 배양으로 다시 계대 배양되었을 때, 이들은 미분화된 표현형의 전형적인 형태, 즉, 전형적인 hES 세포 형태를 갖는 세포들의 별개의 콜로니로 복귀하였다(아래 그림).

도 5는 현탁액에서 성장한 세포(도 4)를 배상체로 분화시키고, 평판에 분주한 다음, 면역 세포 화학법으로 특정 세포 유형에 대해 분석한 실험으로부터 얻은 결과이다(윗 열). 표준 표면 배양으로 내내 유지된 세포 역시 도시하였다(아랫 열). 현탁 배양된 세포는 완전한 다능성을 유지하였으며, 이는 미분화된 hES 세포의 중요한 특성을 유지하는 데 있어서 현탁 배양 시스템의 유효성을 입증한다.

도 6은 스피너 플라스크에서의 다른 현탁 배양물 중의 세포수를 도시한다.

도 7은 쉐이커(shaker) 장치상에서 현탁 배양으로 유지된 상이한 hES 세포주로부터의 세포를 도시한다. 4 주 후, 세포는 고체 표면에 다시 분주되고, 도 7에 도시된 바와 같이 전형적인 미분화 hES 세포 형태를 보였다. 배양은 이 방식으로 3 개월에 걸쳐 지속되었으며, 이는 세포가 현탁액 중에서 상당히 증식하였음을 보여준다.

상세한 설명

영장류 만능 줄기(hES) 세포를 성장시키는 이전의 기법은 고체 표면, 즉, 섬유아세포 영양 공급자 세포(미국 특허 6,200,806호) 또는 세포외 기질(미국 특허 6,800,480호) 상에서 배양하는 것을 수반하였다. 영양 공급자를 이용하지 않는 기법은, 신속한 증식이 가능하도록 최적화하여(WO 03/020920호) 상업적 목적의 hES 세포 제조 비용을 상당히 감소시킬 수 있다.

하기에 개시된 정보는, hES 세포 배양 기법을 더 진보시키는 신규한 시스템을 제공한다. 구체적으로, 배양물의 생산 능력은 배양 표면의 2차원 크기에 의해 더 이상 한정되지 않으며, 전체 배양 용기의 3차원을 더 충분히 사용할 수 있게 된다. 성장 조건은 hES 세포가 현탁액에서 3 개월에 걸쳐 배양되도록 설정되었다(실시예 4). 현탁액에서 배양된 hES 세포는 미분화된 세포의 표현형 특성을 유지하며, 3 가지 배엽 중 임의의 것을 나타내는 조직 유형으로 분화하는 완전한 잠재력을 유지한다(실시예 3).

3차원 공간에서 hES 세포를 배양하는 능력은, hES 세포의 부피를 키우는 것을 좀 더 비용 효율적 공정으로 만들고, hES 세포 배양물의 생산 능력 및 성장률을 최적화할 추가의 기회를 제공해야 한다. 또한, 현탁 배양의 이용은 폐쇄 시스템에 hES 세포 배양 방법을 응용하는 것을 용이하게 하며, 여기서 세포 및 배지가 도입되고 무균 방식으로 시스템으로부터 회수되거나, 그렇지 않으면 상기 시스템은 덜 면밀한 환경에서 다뤄질 수 있다.

본 발명의 추가의 장점은 이어지는 섹션들에서 이해될 것이다.

정의

원형 "영장류 만능 줄기 세포"(primnate Pluripotent Stem cells; pPS cells)는 수정 후 임의의 시간에서의 전배아, 배아, 또는 태아 조직으로부터 유도된 만능 세포이며, 적당한 조건 하에서 몇몇의 상이한 세포 유형의 자손을 생산할 수 있는 특성을 갖는다. pPS 세포는, 적합한 숙주(host)에서 기형종을 형성하는 능력, 또는 배양물에서 3 가지 배엽 모두의 조직 유형에 대한 마커를 갖는 세포로 분화화는 능력과 같은, 표준 기법 허용 시험에 따라, 3 가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽, 및 외배엽 각각의 유도체인 자손을 생산할 수 있다.

pPS 세포의 정의에는 여러 가지 유형의 배아 세포, 예를 들어, 다른 영장류로부터의 배아 줄기 세포, 예컨대 붉은털원숭이 또는 명주원숭이 줄기 세포(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995; Developmental Biology 38:133, 1998), 및 인간 배아 생식(hEG) 세포(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998)로 한정되는 hES 세포가 포함된다. 다른 유형의 만능 세포 역시 상기 용어에 포함된다. 3 가지 배엽 모두의 유도체들인 자손을 생산할 수 있는 영장류 기원의 임의의 세포는, 이들이 배아 조직, 태아 조직, 또는 다른 근원에서 유도되었는지 아닌지와 관계없이 포함된다. 핵형적으로 보통이고 악성 근원으로부터 유도되지 않은 pPS 세포를 사용하는 것이 유익하다.

원형 "인간 배아 줄기 세포"(hES 세포)는 Thomson 등(Science 282:1145, 1998; 미국 특허 6,200,806호)에 의해 설명되어 있다. 상기 용어의 범위는 배반포기의 인간 배아 또는 세포가 3 가지 배엽으로 실질적으로 분화되기 전의 인간 배아로부터 유도된 만능 줄기 세포를 포괄한다. 당업자들은, 명백하게 달리 필요하지 않은 경우를 제외하고는, 상기 용어가 1차 조직과 hES 세포의 표현형 특성을 지닌 확립된 세포주, 및 3 가지 배엽 각각의 자손을 여전히 생산할 수 있는 상기 세포주의 유도체를 포함한다는 것을 인식하게 될 것이다.

hES 세포 배양물은, 줄기 세포 및 군집 내의 이의 유도체의 실질적인 비율이 미분화된 세포의 형태학적 특성을 나타내는 경우 "미분화된" 것으로 설명되며, 배아 또는 성체 기원의 분화된 세포와는 분명하게 구별한다. 미분화된 hES 세포는, 당업자에 의해 용이하게 분간되며, 일반적으로는, 높은 핵/세포질 비 및 두드러진 인을 갖는 현미경도의 2차원으로 나타난다. 군집 내의 미분화된 세포의 콜로니는 종종 분화된 이웃 세포에 의해 둘러싸인다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 미분화된 콜로니는, 군집이 적절한 조건 하에서 배양되거나 계대 배양되는 경우 존속하며, 개개의 미분화된 세포는 세포 군집의 실질적인 비율을 구성한다. 실질적으로 미분화된 배양물은, 진행중의 기준으로 20% 이상의 미분화된 hES 세포를 함유하며, 증가하는 선호의 순으로 40%, 60% 또는 80% 이상(미분화된 동일한 유전자형을 갖는 세포의 백분율로임)을 함유할 수 있다.

본 발명의 개시 내용에서 배양물 또는 세포 군집이 "분화 없이" 증식된다고 일컬어질 때에는, 이전의 정의에 따라, 증식 후에 조성물이 실질적으로 미분화된 상태임을 의미한다. 4회 이상의 계대 배양을 통해 분화 없이 증식(20배)하는 군집은, 최초 배양물과 동일한 정도의 융합 상태(confluence)에서 평가하는 경우, 실질적으로 동일한 비율의 미분화된 세포(또는 어쩌면 더 높은 비율의 미분화된 세포)를 함유할 것이다.

"영양 배지"는 증식을 촉진하는 영양분을 함유하는 세포 배양용 배지이다. 영양 배지는 일반적으로 등장성 염수, 완충제, (1 이상의 첨가된 단백질 또는 아미노산의 형태인) 단백질원, 및 잠재적으로 다른 외생적으로 첨가된 영양분과 성장 인자를 함유한다.

"조절 배지"는 배지에서 제1 세포 군집을 배양한 다음, 그 배지를 회수함으로써 제조한다. 이어서 (세포에 의해 배지에 분비된 임의의 물질과 함께) 조절 배지는 제2 세포 군집의 성장을 지지하기 위해 사용될 수 있다. 특정 성분 또는 인자를 배지에 첨가하였다고 설명하는 것은, 인자(또는 인자를 분비하도록 처리된 세포 또는 입자)를 신중한 조작으로 배지에 혼합하였음을 의미한다.

"신선한 배지"는, 궁극적으로 지지하도록 디자인된 세포 유형과 함께 사용하기 전에 상이한 세포 유형과 함께 배양함으로써 고의로 조절하지 않은 배지이다. 아니면, 제조, 보관, 또는 사용의 방식이 한정되지 않은 것이다. 이는 최종 배양물에 신선하게 첨가(교환 또는 주입에 의함)되며, 여기서 소모되거나, 아니면 존재하는 세포 유형에 의해 처리된다.

일반적 기법

분자 유전학 및 유전 공학에서의 일반적인 방법은 문헌들[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook et al., Cold Spring Harbor)의 최신판, Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos eds.) 및 Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel et al. eds., Wiley & Sons)]에 기재되어 있다. 세포 생물학, 단백질 화학 및 항체 기법은 문헌들[Current Protocols in Protein Science(J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons), Current Protocols in Cell Biology(J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) 및 Current Protocols in Immunology(J. E. Colligan et al. eds., Wiley & Sons.)]에서 찾아볼 수 있다. 본 개시 내용에 인용된 유전적 조작을 위한 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 상업적 판매자, 예컨대 BioRad, Stratagene, Invitrogen, ClonTech 및 Sigma-Aldrich Co.로부터 입수 가능하다.

세포 배양 방법은 일반적으로 문헌들[Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Technique(R.I. Freshney ed., Wiley & Sons)의 최신판, General Techniques of Cell Culture(M.A. Harrison & I. F. Rae, Cambridge Univ. Press), 및 Embryonic Stem Cells : Methods and Protocols(K. Turksen ed., Humana Press)에 기재되어 있다. 다른 관심 있는 참고 문헌으로는 Culture Is Our Business(M. McLuhan, Ballantine Books, 1970) 및 Understanding Media(M. McLuhan, Signet, 1970)가 있다. 조직 배양 공급물 및 시약은 상업적 판매자, 예컨대 Gibco/BRL, Nalgene-Nunc International, Sigma Chemical Co., 및 ICN Biomedicals로부터 입수 가능하다.

줄기 세포의 공급원

배아 줄기 세포는 영장류 종의 구성원의 배반포로부터 분리할 수 있다(미국 특허 5,843,780; Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아 줄기(hES) 세포는, Thomson 등(미국 특허 6,200,806호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998) 및 Reubinoff 등(Nature Biotech. 18:399,2000)이 설명한 기법에 따라 1차 마우스 섬유아세포 영양 공급자 세포를 사용하여 인간 배반포 세포로부터 제조할 수 있다. 또한, hES 세포주는, 인간 영양 공급자(미국 특허 6,642,048호) 상에서, 또는 영양 공급자 세포를 완전히 함유하지 않는 조건(US 2002/0081724 A1호)에서 유도될 수 있다. hES 세포와 동등한 세포 유형은 WO 01/51610호(Bresagen)에 개설된 바와 같이, 이들의 만능 유도체, 예컨대 원시 외배엽형(EPL) 세포를 포함한다.

실시예 섹션에 제공된 예시들은 hES 세포로 실시한 작업에 기인한다. 그러나, 달리 필요한 경우를 제외하고, 본 발명은 영장류 만능 줄기 세포의 정의에 부합하는 다른 세포를 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 실시는, 본 발명의 실시를 위한 hES 또는 배아 줄기 세포를 생산하기 위해 인간 배반포를 분해하는 것을 전혀 필요로 하지 않는다. hES 세포는, 공공 보관소(예를 들어, WiCell Research Institute, Madison WI U.S.A., 또는 American Type Culture Collection, Manassas VA, U.S.A.)로부터 얻을 수 있는 확립된 세포주로부터 얻을 수 있다. 인간 배아 생식(hEG) 세포는 문헌(Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:13726, 1998 및 미국 특허 6,090,622호)에 기재된 바와 같이 원시 배종 세포로부터 제조할 수 있다. 미국 특허 공개 공보 2003/0113910 A1호는 배아 또는 태아 조직을 사용하지 않고 유도한 만능 줄기 세포를 보고한다. 만능 표현형을 유도하는 인자를 사용하여 다른 전구 세포를 hES 세포로 재프로그램하는 것도 역시 가능하다(Chambers et al., Cell 113:643, 2003; Mitsui et al., Cell 113:631 , 2003). 적절한 조건 하에서, 적절한 증식 능력 및 분화 능력을 갖는 임의의 세포는, 본 발명에 따라 사용하기 위해 분화된 조직의 유도에 사용할 수 있다.

hES 세포의 증식

초기에, 이 분야의 대부분의 과학자들은, Thomson(U.S. 5,843,780호; U.S. 6,090,622호)에 의해 최초로 설명된 바와 같이, 분화를 방지하기 위해 hES 세포를 영양 공급자 세포의 층에서 배양하는 것을 선호하였다.

초기에, Geron의 과학자들은, 미분화된 표현형의 증식을 촉진하기 위해 영양 공급자 세포에 의해 제공된 성분이 다른 형태로 제공될 수 있는 배양 시스템을 발견하였다. 미국 특허 6,800,480호, WO 01/51616호(Geron Corp.), 및 Xu 등(Nature Biotechnology 19:971, 2001)은 분화 없이 증식을 돕는 영양 공급자 무함유 배양 환경을 설명한다.

영양 공급자 무함유 배양 방법의 한 양상은, 세포외 기질상에 배양함으로써 hES 세포를 원조하는 것이다. 상기 기질(matrix)은 기질 형성 세포주, 예컨대 STO 마우스 섬유아세포주(ATCC Accession No. CRL-1503) 또는 인간 태반 섬유아세포를 예비 배양하고 용해함으로써 적층시킬 수 있다(U.S. 6,800,480호). 또한 상기 기질은 분리된 기질 성분으로 배양 용기에서 직접 코팅될 수 있다. Matrigel^®은, 실온에서 겔화되어 재구성된 기저막을 형성하는 Engelbreth-Holm-Swarm 종양 세포로부터의 가용성 제제이다. 다른 적합한 세포외 기질 성분은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 엔탁틴, 황산헤파란 등을 단독으로 또는 여러 가지 조합으로 포함할 수 있다. 기질 성분은, 인간으로부터의 성분 및/또는 재조합 발현으로 제조한 성분일 수 있다. 본원에 설명된 실험 절차를 사용하여 시험할 수 있는 기질은 다른 세포외 기질 성분뿐만 아니라, 폴리아민, 히드로겔, 및 다른 상업적으로 입수 가능한 코팅도 포함할 수 있다.

영양 공급자 무함유 배양 시스템의 다른 양상은 영양 배지이다. 상기 배지는 일반적으로, 등장성 완충제(즉, 작용 농도로 조절되는 경우 등장성인 완충제), 필수 미네랄, 및 혈청 또는 몇몇 종류의 혈청 대체물을 비롯한, 세포 생존을 향상하기 위한 통상적인 성분을 함유할 것이다.

hES 지지성 인자를 도입하는 직접적인 방식은, 배지를 미국 특허 6,200,806호 또는 WO 01/51616호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있는 1차 마우스 배아 섬유아세포(mEF)로 미리 처리하는 것이다. 텔로머화된(telomerized) 세포주, 및 분화하는 hES 세포로부터 얻어지는 인간 세포주(미국 특허 6,642,048) 또는 다른 원시 세포 유형들이 영양 공급자 세포로서 또한 적합하다. hES 세포 배지는, 영양 공급자 세포(일반적으로 조사되거나 아니면 비활성화됨)를 배양함으로써 조작할 수 있다. 37℃에서 1∼2 시간 동안 배양하여 조작한 배지는 hES 세포 배양을 약 1∼2일간 지지하는 인자의 농축물을 함유한다. 그러나, 조작 기간은, 적당한 기간을 구성하는 것을 경험적으로 결정하면서 위아래로 조절될 수 있다.

조절 배지의 대안으로서, hES 세포는, 미분화된 세포에서 적절한 신호 전달 경로를 유발하는 첨가된 인자를 함유하는 신선한 (비조절) 배지에서 성장시킬 수 있다. 조작 없이 사용하는 적합한 기초 배지는 경험적으로 확인될 수 있다. 배지는 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유한다. 또한 배지는 일반적으로, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유한다.

다수의 적합하고 상업적으로 입수 가능한 기본 배지는, 조혈모세포와 같은 증식 세포 유형을 배양하기 위해 개발되어 왔다. X-VIVO^TM 10 증식 배지(Biowhittaker) 및 QBSF^TM-60(Quality Biological Inc.)(실시예 1)이 예시적이다. WO 98/30679호(Life Technologies Inc.) 및 U.S. 5,405,772호(Amgen)도 참조하라. X-VIVO^TM 10 제제는 약학 등급 인간 알부민, 재조합 인간 인슐린 및 저온 살균된 인간 트랜스페린을 함유한다. 외인성 성장 인자, 세포 증식의 인공 자극제 또는 미정의 보충물은 X-VIVO^TM 10 배지에 포함되지 않는다. 또한 이들은 임의의 단백질-키나아제 C 자극제가 결여되어 있다. QBSF^TM-60은 재조합 또는 저온 살균된 인간 단백질을 함유하는 혈청 무함유 제제이다. 다른 잠재적 대안은 JRH Biosciences사가 제조한 Ex-Cell VPRO^TM 배지 및 Hyclone사가 제조한 HyQ CDM4^TM이다.

기초 배지는 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충된다. 고농도의 섬유아세포 성장 인자는, 분화 없이 hES 세포 증식을 촉진하는 데 특히 효과적이다. 염기성 FGF(FGF-2) 및 FGF-4가 예시적이나, 그 종류의 다른 구성원도 역시 사용할 수 있다. 동등한 형태는 각각의 FGF 수용체에 대한 종 동족체, 인공 유사체, 항체, 및 다른 수용체 활성화 분자이다. 유전자 발현 분석으로, 미분화된 hES 세포가 산성 FGF(FGF-1)에 대한 수용체를 발현함이 측정되었다. 고농도에서, FGF 단독은, 미분화된 상태의 hES 세포의 성장을 촉진하기에 충분하다(실시예 1 및 2). 미분화된 hES 세포 성장을 자력으로 촉진하는 데 효과적인 FGF의 농도는, 통상적으로 약 20, 30, 또는 40 ng/mL의 더 낮은 한계를 가지며, 이때 실제적인 상한은 약 200, 500, 또는 1000 ng/mL이다. 60, 80, 또는 100 ng/mL 이상의 bFGF 농도는 신뢰성 있고 비용 효율적이다. FGF의 다른 형태 및 유사체의 동등한 농도는, 배양물을 bFGF로부터 제안된 대체물로 떼어놓고 배양물의 분화를 하기에 설명된 마커 시스템에 따라 모니터링함으로써 경험적으로 측정할 수 있다.

현탁액에서의 hES 세포의 배양

본 발명에서는, hES 세포를, 고체 기재에서 성장하게 하는 것이 아니라 현탁 배양으로 성장시킬 수 있다는 것을 발견하였다.

다른 배양 방법으로 증식된 (또는 1차 근원으로부터 얻은) hES 세포는 현탁액에 세포를 유지하기 위해 적합화한 용기에 접종한다. 용기벽은 미분화된 hES 세포의 접착에 대해 일반적으로 비활성이거나 내성이 있다. 또한, 세포가 떨어져 나가는 것을 방지하는 수단, 예컨대 자석으로 또는 기계적으로 작동되는 교반 막대 또는 패들과 같은 교반 장치, 진탕 장치(일반적으로 용기의 외부에 부착됨), 또는 인버팅(inverting) 장치(즉, 세포 상의 중력 방향이 변화하도록 용기를 회전시키는 장치)가 있다.

공정 개발을 위한 현탁 배양에 적합한 용기는 상업적으로 입수 가능한 스피너 또는 쉐이커 플라스크의 통상적인 범위를 포함한다. 상업적 제조에 적합한 발효기는 Celligen Plus^TM(New Brunswick Scientific Co.) 및 Stirred-Tank Reactor^TM(Applikon Inc.)이다. 이 생물 반응기들은 배지가 연속적으로 채워지거나 유가 방식으로 사용될 수 있으며, 여러 가지 크기로 제조된다.

미분화된 표현형을 유지하는 데 조력하고 성장을 돕는 영양 배지는 필요한 만큼 교체된다(예를 들어, 세포가 떨어져 나가게 두고, 배지를 교체한 다음, 세포를 재현탁함에 의함). 성장은 모니터링되고, 배양물은 필요한 경우 분할되어 추가의 성장을 위한 장소를 내어준다. 적합한 배양 기간 후, 세포는 회수되어 의도된 목적으로 사용된다.

고체 표면에서 영양 공급자 없이 hES 세포를 성장시키기 위해 설계된 배지 및 다른 성분 역시 현탁 배양에서 사용될 수 있다. 조절 배지 또는 신선한 배지가 사용될 수 있다(실시예 4). 그러나, 현탁 배양의 역학은 사용자에게 배양 시스템의 여러 가지 성분을 최적화할 추가의 기회를 제공한다. 이론에 구속되고자 하는 바는 아니나, hES 세포가 작은 미분화 다발(고체 표면상의 미분화된 콜로니의 3차원 등가물)을 형성하게 허용되면서, 혹은 기질 세포로 부분적으로 분화된 세포에 의해 둘러싸이는 경우, 또는 hES 세포가 분산되나, 달리 분화를 야기할 수 있는 동적 유체력으로부터 보호되는 경우, 현탁 배양이 증진된다는 것이 본 발명의 가설이다.

현탁 배양 시스템의 최적화는 경험적 시험으로 성취할 수 있다. 이전의 표면 또는 현탁 배양으로부터 미분화된 세포는 시험 조건으로 계대 배양되고, 1 주 이상 동안 배양된다. 세포는, 예를 들어 다음 섹션에 설명할 마커 시스템을 사용하여 hES 세포의 특성에 대해 주기적으로 검사되고, 실시예 1에 예시될 수 있다. 또한, 세포는, 양호하게 확립된 배양 시스템으로 다시 계대 배양되고, 미분화된 세포의 전형적인 형태학적 특징에 대해 평가될 수 있다(실시예 3). hES 세포가 궁극적으로 특정 조직 유형으로 분화하도록 의도된 경우에는, 최종 시험은 미분화된 배양의 마커 프로필이 아니라, 필요한 만큼 분화하는 세포의 능력일 것이다. hES 현탁 배양의 다능성은, 세포를 샘플링하고 또한 SCID 마우스에서 기형종을 생성함에 의해서, 또는 3 가지 배엽 모두를 나타내는 마커를 위해 EB-유도된 세포를 염색함에 의해 확증될 수 있다(실시예 3). 사용자는 이로써 시스템을 최적화하여, 세포의 완전한 다능성(또는 적어도 의도한 관심있는 조직으로 분화하는 세포의 능력)을 보유하면서 높은 성장률을 성취할 수 있다.

추가의 최적화로 이득을 얻을 수 있는 배양 시스템의 양상은 영양 배지를 포함한다. 대안적인 기본 배지 및 대안적인 FGF 첨가제는 이전 섹션에 열거되어 있다. 또한, 1 이상의 추가의 첨가제, 예컨대 하기의 것들을 사용하는 것이 유리할 수 있다:

ㆍ 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제

ㆍ 다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예컨대 혈소판-유도된 성장 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드

ㆍ 환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예컨대 포르스콜린

ㆍ gp130을 유도하는 인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M

ㆍ 조혈모 성장 인자, 예컨대 트롬보포이에틴(TPO)

ㆍ 변형성 성장 인자, 예컨대 TGFβ1

ㆍ 다른 성장 인자, 예컨대 표피 성장 인자(EGF)

ㆍ 뉴로트로핀, 예컨대 CNTF

세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제(anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.

세포는 한정된 정도로 자신의 세포외 기질을 형성하는 능력을 갖긴 하나, 배지에 용해되거나 현탁된 1 종 이상의 세포외 기질 성분을 포함하는 것도 유익할 수 있다. 현탁액에 라미닌을 유지하기 위한 적합한 작용 범위는 약 10∼33 ㎍/mL이다. 현탁 배양을 위한 다른 후보 기질 성분은, 위에 열거한 것들 중 일부, 특히 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 비트로넥틴, 및 이의 인공 등가물을 포함한다. 세포외 기질은 세포가 적절한 크기의 작은 응집물을 형성하는 데 조력할 수 있다.

대안으로 또는 추가로, 현탁액 배양물은 현탁액 중에서 표면을 형성하는 미립자 담체를 함유할 수 있으나, 3차원 공간에서 세포를 배양하는 이득을 여전히 제공한다. 세포는, 배지 교체 동안 입자들을 용기에 보유하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양되고 계대 배양되고, 세포가 분할되는 경우 더 많은 입자들이 첨가된다.

미세담체의 한 유형은, 세포 부착을 증가시키기 위해 양전하는 갖는 유리, 플라스틱, 덱스트런 등으로부터 제조한 고체 구형 또는 반구형 입자(Cytodex)이다. 다른 유형은 원반형 배양 플라스틱, 예컨대 New Brunswick Scientific Co, Inc.가 판매하는 Fibra-cel Disks^TM이다. 이 원반들의 그램은 1200 cm²의 표면적을 제공한다. 고체 담체는, 부착된 세포가 고체 표면 위에 분주된 세포와 동일한 미소 환경을 갖도록 hES 세포 친화적 세포외 기질, 예컨대 라미닌으로 임의로 코팅한다.

미세담체의 다른 유형은, 세포가 내부뿐만 아니라 외부에도 존재하게 허용하여 보호 효과를 잠재적으로 증진하는 여러 가지 기공 크기의 거대다공성 입자이다. hES 세포를 최소로 분열되게 회수하기 위해서, 부드러운 기계적 또는 효소적 작용에 의해 용이하게 용해되거나 분산됨으로써 세포를 회수 또는 추가의 배양을 위해 방출할 수 있는 아가로스와 같은 물질로 제조된 입자를 사용함으로써 하는 것이 유익하다.

미분화된 hES 세포의 특성

본 발명에 따라 배양된 인간 ES 세포는 미분화된 줄기 세포의 특징적인 형태학적 특징을 갖는다. 2차원의 표준 현미경 화상에서, hES 세포는, 화상면에서의 높은 핵/세포질 비, 두드러진 인, 및 세포 연접의 식별이 곤란한 밀집된 콜로니 형성을 나타낸다. 세포주는 표준 G-분염 기법을 사용하여 핵형을 분석할 수 있고(일상적인 핵형 분석 편의를 제공하는 다수의 임상 진단 연구실, 예컨대 미국 캘리포니아주 오클랜드에 소재하는 Cytogenetics Lab에서 가능함), 공개된 인간 핵형과 비교될 수 있다. 세포가 정배수체임을 의미하는 "보통의 핵형"을 갖는 세포를 얻는 것이 바람직하며, 상기 핵형에서 모든 인간 염색체는 존재하고 현저하게 대체되지 않는다.

hES 세포는 항체(유세포 분석 또는 면역 세포 화학법) 또는 역전사효소 PCR에 의해 검출 가능한 발현된 세포 마커를 특징으로 할 수 있다. hES 세포는 일반적으로 항체-검출 가능한 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81을 가지나, SSEA-1는 거의 갖지 않으며, 알칼리 포스파타아제 활성을 갖는다. mRNA 수준에서 검출 가능한 적합한 마커의 패널은 출원 US 2003/0224411 A1호(Geron Corp.)에 열거되어 있다. Cripto, 가스트린-방출 펩티드(GRP) 수용체, 포도칼릭신형 단백질(PODXL), 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT), 및 POU 전사 인자 Oct 3/4가 예시적이다.

이미 설명한 바와 같이, 증식된 hES 세포의 중요한 특징은 모든 3 가지 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 분화될 잠재력이다. hES 세포의 다능성은, SClD 마우스에서 기형종을 형성하고, 모든 3 가지 배엽의 대표적인 조직에 대해 시험함으로써 확증할 수 있다. 대안으로, hES 세포가 비특이적으로 분화하게 둔 다음(예를 들어, 배상체를 형성함), 면역 세포 화학법으로 배양물에 표시된 세포 유형을 측정하여 다능성을 측정할 수 있다(실시예 3). 특정 세포주로 분화하는 hES 세포의 잠재력은 다음 섹션에 설명한 절차에 따라 측정할 수 있다.

증식된 hES 세포의 용도

본 발명은, 다수의 만능 세포를 상업적 규모로 제조할 수 있는 방법을 제공한다. 세포는 미분화된 형태에서 다수의 연구 및 상업적 목적에 유용하거나, 특정 세포 유형으로 분화하도록 유도될 수 있다.

미분화된 hES 세포는, 인자들(예컨대 작은 분자 약물, 펩티드, 폴리뉴클레오티드 등) 또는 배양물 중의 hES 세포의 특성에 영향을 주는 조건(예컨대 배양 조건 또는 조작)을 선별하는 데 사용될 수 있다. 또한, hES 배양물은 약물 연구에서 약학적 화합물을 시험하는 데 사용될 수 있다. 후보 약학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로, 본 발명의 분화된 세포를 후보 화합물과 배합하고, 임의의 결과적 변화를 측정한 다음, 화합물과 관찰된 변화의 효과를 상호 관련시키는 것을 포함한다. 세포 독성 또는 대사 작용의 효과는, 세포 생존도, 형태, 특정 마커의 발현 또는 방출, 수용체 또는 효소, DNA 합성 또는 복구 등으로 측정할 수 있다.

본 발명에 따라 배양된 hES 세포는, 여러 가지 상업적으로 및 치료상으로 중요한 조직 유형의 분화된 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.

간 세포

간세포는, 미국 특허 6,458,589호 및 PCT 공보 WO 01/81549호(Geron Corporation)에 기재된 바와 같이, 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제제를 이용하여 hES 세포로부터 분화시킬 수 있다. 미분화된 hES 세포는 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제제의 존재 하에 배양된다.

hES 세포를 간세포로 분화시키기 위한 단계적 프로토콜이 US 2005/0037493 A1호(Geron Corp.)에 기재되어 있다. 세포는 차례로 몇몇의 분화 및 성숙 제제와 함께 배양되면서, hES 세포가 먼저 초기의 내배엽 또는 간세포 전구체로 분화되게 한 다음, 간세포 유형 세포를 성숙시킨다. 간단히, 내배엽형 세포로의 분화는 부티르산염, DMSO 또는 우태아 혈청을, 임의로 섬유아세포 성장 인자와 함께 사용하여 개시할 수 있다. 이어서, 인자, 예컨대 간세포 성장 인자(HGF), 표피 성장 인자(EGF), 및/또는 골 형성 단백질(예를 들면, BMP-2, 4, 또는 7)을 여러 가지 조합으로 포함하는, 상업적으로 입수 가능한 간세포 배양 배지를 사용하여 분화를 지속한다. 최종 성숙은, 제제, 예컨대 덱사메타존 또는 Oncostatin M의 존재에 의해 증진될 수 있다. 아시알로당단백질, 글리코겐 보관, 사이토크롬 p450 효소 발현; 글루코스-6-포스파타아제 활성, 및 간세포의 형태학적 특징을 나타내는 세포가 얻어진다.

신경 세포

신경 세포는, 미국 특허 6,833,269호, 문헌[Carpenter et al., Exp Neurol. 2001;172(2):383-97] 및 WO 03/000868호(Geron Corporation)에 기재된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 미분화된 hES 세포 또는 배상체 세포는 1 이상의 뉴로트로핀 및 1 이상의 마이토젠을 함유하는 배지에서 배양되어, 세포 군집을 생성하며, 상기 세포 군집에서 60% 이상의 세포가 A2B5, 폴리시알릴화 NCAM, 또는 Nestin을 발현하고, 상기 세포 군집은 배양물에서 20 이상의 배가가 가능하다. 예시적인 마이토젠은 EGF, 염기성 FGF, PDGF 및 IGF-1이다. 예시적인 뉴로트로핀은 NT-3 및 BDNF이다. TGF-β Superfamily 길항제의 이용, 또는 cAMP와 아스코르브산의 조합이 티로신 수산화효소, 도파민성 뉴런의 특성에 양성인 뉴런 세포의 비율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이어서 세포를 증식시키는 것이, 마이토젠의 존재 하에 뉴로트로핀과 배양함으로써 최종 분화를 일으키기 위해 실시될 수 있다.

희돌기교세포는 이들을 마이토젠, 예컨대 FGF, 및 희돌기교세포 분화 인자, 예컨대 트리요도티로닌, 셀레늄 및 레티노산을 함유하는 배지에 현탁된 세포 응집물로서 배양함으로써 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서, 세포를 고체 표면 위에 분주하며, 레티노산은 배출시키고, 군집은 증식시킨다. 최종 분화는 폴리-L-리신 위에 분주하고, 모든 성장 인자를 제거함으로써 실시할 수 있다. 80% 초과의 세포가 희돌기교세포 마커 NG2 프로테오글리칸, A2B5, 및 PDGFRα에 양성이고, 뉴런 마커 NeuN에 음성인 군집을 얻을 수 있다. PCT 공보 WO 04/007696호 및 문헌[Keirstead et al., J Neurosci. 2005;25(19):4694-705]을 참조하라.

심장 세포

심근아세포(cardiomyocyte) 또는 심근아세포 전구체는, WO 03/006950호에 제공된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 세포는 우태아 혈청 또는 혈청 대체물, 및 임의로 DNA-메틸화에 영향을 주는 심장 친화성(cardiotrophic) 인자, 예컨대 5-아자시티딘과 함께 현탁액에서 배양한다. 대안으로, 심근아세포 다발은 액티빈 A 및 골 형성 단백질 4의 조합을 사용하여 고체 기질 위에 직접 분화시킬 수 있다. 즉, 이어서 자연발생적으로 수축성이 있는 세포가 밀도 원심분리에 의해 군집 내의 다른 세포로부터 분리될 수 있다.

추가의 가공 단계는, 단일 세포를 제거하면서 cardiac body^TM으로 공지된 다발을 형성하도록 세포를 배양한 다음, cardiac body^TM를 연속적 반복으로 분산 및 개질하는 것을 포함할 수 있다. cTnl, cTnT, 심장 특이적 미오신 중연쇄(MHC), 및 전사 인자 Nkx2.5에 양성으로 염색되는 세포의 비율이 높은 군집을 얻는다. WO 03/006950호, 문헌[Xu et al., Circ Res. 2002;91(6):501-8] 및 PCT/US2005/009081호(Geron Corporation)을 참조하라.

기타 세포 유형

도세포는 ES 세포를, 액티빈 A, 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제(예컨대 부티르산염), 마이토젠(예컨대 bFGF), 및 TGF-β Superfamily 길항제(예컨대 노긴)로부터 선택되는 몇몇의 인자들의 조합을 함유하는 배지에서 배양함으로써 분화를 개시하여 hES 세포로부터 분화시킬 수 있다. 이어서 세포는 니코틴아미드와 함께 배양함으로써 성숙시켜, 5% 이상의 세포가 Pdx1, 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드를 발현하는 세포 군집을 산출할 수 있다. WO 03/050249호(Geron Corp.)를 참조하라.

조혈모세포는 hES 세포를 쥣과 골수 세포 또는 조혈모 마커를 갖는 세포를 생성하는 데 사용된 난황낭 내피 세포와 공동배양하여 제조할 수 있다(미국 특허 6,280,718호). 또한, 조혈모세포는, US 2003/0153082 A1호 및 WO 03/050251호(Robarts Institute)에 기재된 바와 같이 hES 세포를 혈행성(hematogenic) 시토킨 및 골 형성 단백질과 함께 배양하여 제조할 수 있다.

중간엽 원종은 WO 03/004605호에 기재된 방법에 따라 hES 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서 hES 유도된 중간엽 세포는, 골원성 인자, 예컨대 골 형성 단백질(특히 BMP-4), 인간 TGF-β 수용체를 위한 리간드, 또는 인간 비타민 D 수용체를 위한 리간드를 함유하는 배지에서 골아세포 계통 세포로 더 분화될 수 있다(WO 03/004605호; Sotile et al., Cloning Stem Cells 2003;5(2):149-55). 연골 세포 또는 이의 원종은, 미세응집물 중의 hES 세포를 WO 03/050250호(Geron Corp.)에 열거된 분화 인자들과 효과적으로 조합하여 배양함으로써 생성할 수 있다.

업계에 공지되거나 차후에 개발된 다른 분화 방법을 본 발명에 따라 배양된 hES 세포에 이용할 수 있다. hES 유도된 세포는 약물 선별, 약학적 조성물 제조, 연구, 및 다수의 다른 가치있는 목적에 사용할 수 있다.

상업적 유통

본 발명의 배양 시스템의 성분들은 판매용으로 제공되거나, 아니면 임의의 목적으로 다른 실재에 의해 사용되기 위해 제조지로부터 유통될 수 있다. 성분들은 여러 가지 유용한 조합, 예컨대 하기 중 2 이상으로 함께 판매 및 유통될 수도 있다:

ㆍ 현탁 인자에서 hES 세포를 배양하기에 적합한 배지

ㆍ 배지에 존재하거나 첨가될 세포외 기질 성분 또는 증점제

ㆍ 배지에 존재하거나 첨가될 미세담체

ㆍ 현탁 배양에 적합화한 용기

ㆍ 배양 시스템에서 성장하거나, 다른 형태로 저장되었으나 배양 시스템에 사용하기 위한 hES 세포 자체

생산품 및 생산품 조합물은, 임의로 키트 형태로, 적합한 용기에 포장될 수 있고, 본 발명에 따른 물질의 용도에 관해 작성된 정보, 예컨대 hES 세포를 유지하거나 증식시키는 정보가 동봉될 수 있다. 상기 정보는 의도된 사용자가 접근하기 쉽고 이해할 수 있는 임의의 통신 매체에 임의의 언어로 작성될 수 있다. 용기 또는 키트 상의 라벨의 형태를 취하거나, 용기와 함께 포장되어 함께 유통되는 제품 삽입물의 형태를 취할 수 있다. 동등한 형태는, 사용자 또는 의도된 사용자에게 상업적으로 유통된 생산품과 연관된 참고 또는 방편 자료로서 입수 가능한, 하드 카피에 또는 전자 양식으로 쓰여진 설명서, 지침서, 또는 해설서이다.

이어지는 실시예들은 청구하는 발명을 한정할 의도가 아닌 예시이다.

실시예 1 : 신속 증식 배지에서의 만능 줄기 세포의 배양

마우스 배아 섬유아세포 영양 공급자 세포에서 본래 성장한 hES 세포주를 얻은 다음, 미국 특허 6,800,480호에 따라 문헌[Xu et al., Stem Cells 2005;23(3):315-23]에 상술된 바와 같이, Matrigel® 세포외 기질 및 조절 배지를 포함하는 영양 공급자 무함유 환경에서 20 회의 계대 배양 동안 증식시켰다.

그 다음, 상기 hES 세포를 Biowhittaker사의 X-VIVO^TM 10 증식 배지 또는 Quality Biological Inc사의 QBSF^TM-60에서 배양하였다. 본 실험에서 사용하기 위해, X-VIVO^TM 10 배지를 통상적인 물질, 즉, 2 mM L-글루타민, 1% 비필수 아미노산(Gibco), 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 및 8 ng/mL bFGF로 보충하였다. 상기 배지를 8 ng/mL 또는 40 ng/mL의 bFGF(Gibco); 40 ng/mL의 bFGF 및 15 ng/mL의 SCF(R & D System); 또는 40 ng/mL의 bFGF 및 75 ng/mL의 Flt3 리간드(R & D System)로 더 보충하였다. QBSFTM-60 배지는 0.1 mM β-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노 산(Gibco) 및 40 ng/mL의 bFGF으로 보충하였다. mEF 조절 배지에서 배양된 hES 세포들은 본 실험들에서 대조군으로 사용하였다.

hES 세포를 먼저 콜라게나제 IV를 사용하여 Matrigel® 코팅된 평판 위에 계대 배양하고, 조절 배지로 2일간 배양하였다. 2 번째 날, 조절 배지를 80% 비조절 ES 배지 ＋ 20% 증식 배지로 교체하였다. 세포에 매일 신선하게 공급하고 매주 계대 배양하였다. 증식 배지의 비율을, 세포들을 완전히 떼어놓을 때까지 대략 2일 마다 20%까지 증가시킨 다음, 이들을 6 회 더 계대 배양될 때까지 성장시켰다.

도 1은 하기의 배지들에서의 6 회의 계대 배양(완전한 적응에 충분함)의 종결시의 hES 세포 콜로니를 도시한다: (A) mEF 조절 배지 + bFGF(8 ng/mL); (B) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL); (C) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + 줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자)(15 ng/mL); (D) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL); (E) QBSF^TM-60 + bFGF(40 ng/mL).

하기의 표는, mEF 조절 배지에서 4 회 계대 배양으로, 또는 X-VIVO^TM 10 또는 QBSF^TM-60에서 7 회 계대 배양으로 배양된 미분화 hES 세포에 대한, 계대 배양당 평균 총 세포 증식을 나타낸다.

ES 세포 배양의 성장률

배지	계대 배양당 평균 세포 증식
mEF 조절 배지	2.2 배
X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL)	6.0 배
X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + SCF(15 ng/mL)	8.2 배
X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + Flt3 리간드(75 ng/mL)	5.0 배
QBSF^TM 60 + bFGF(40 ng/mL)	6.4 배

X-V1VO^TM 10 및 QBSF^TM-60에서 계대 배양당 세포의 평균 증식은 mEF 조절 배지 배양물에서 배양된 세포보다 더 컸다. mEF 조절 배지의 세포는 평균 7일마다 계대 배양한 반면, X-VIVO^TM 10 및 QBSF^TM-60의 세포는 평균 5일마다 계대 배양하였다. 따라서, 비조절 X-VIVO^TM 10 또는 QSF^TM-60에서의 증식률은 mEF 조작 ES 배지에서보다 3.2∼5.2 배 더 빨랐다.

도 2는 hTERT 및 Oct3/4의 유전자 발현 프로필을 도시한다. RNA는 High Pure RNA Isolation Kit(Roche Diagnostics)를 사용하여 세포로부터 분리하고 Taqman^TM 시험(실시간 RT-PCR)으로 평가하였다. 각각의 시험 조건에서의 유전자 발현을 대조군 배양물에서의 발현과 관련하여 플롯한다. 계기 오류 및 시험 가변성을 고려하면, 시험 및 대조군 샘플 간의 발현의 차이는 오직 2 배 초과인 경우에만 현저하다. 분석은, hTERT 및 Oct-3/4의 발현이 비조절 X-VIVO^TM 10 또는 QBSF^TM-60 배지(각각의 세트에서 첫째 넷째 막대)에 적응시 다소 감소하나, 세포가 mEF 조절 배지(각각의 세트에서 마지막 세 막대)로 다시 계대 배양되는 경우 표준 수준으로 되돌아옴을 도시한다.

비조절 배지에서 배양된 세포가 그의 다능성을 보유하고 있음을 확증하기 위해, 배상체를 형성하고, 이를 각각의 3 가지 배엽을 나타내는 표현형 마커에 대해 면역 세포 화학법으로 분석하였다. 증식 배지에서 7회 계대 배양 후, 200 U/mL 콜라게나제 IV를 37℃에서 10 분간 사용하여 세포를 작은 덩어리로 해리시키고, 분화 배지(DMEM + 10% FBS)에서 4일간 현탁 배양으로 둔 다음, 폴리-L-오르니틴 브롬화수소산염 코팅된 평판 위에 추가의 10일간 이송하였다. 이들을 4% 파라포름알데히드에 고정시키고, 침투화하며, 면역 세포 화학법으로 분류하였다.

도 3은 그 결과를 도시한다. 비조절 X-VIVO^TM 10 배지에서 7회 계대 배양된 hES 세포는 α-태아단백질(내배엽에 해당함), 근육 액틴(중배엽에 해당함) 및 β-튜불린 III(외배엽에 해당함)를 염색하였다.

이렇게, hES 세포는 영양 공급자 무함유 환경의 신선한 (비조절) 배지에서, 상업적 생산에 적합한 신속한 속도, 즉 2배∼5배 더 빠르게 증식시키거나, 조절 배지 또는 영양 공급자 세포에서의 성장과 더 비교할 수 있다. 세포는 미분화된 hES 세포의 형태를 보유하며, 모든 3 가지 배엽을 나타내는 유도체 세포로 분화될 수 있다.

실시예 2: 동물성 생성물을 함유하지 않는 규정 시스템에서의 hES 세포의 배양

Matrigel® 상의 MEF-CM에 배양된 hES 세포는 신선한 (비조절) 혈청 무함유 배지인, 글루타민, 비필수 아미노산 및 β-메르캅토에탄올, 게다가 80 ng/mL Matrigel® 상의 인간 염기성 FGF로 보충된 X-VIVO^TM 10 에 계대 배양한 다음, 인간 라미닌으로 코팅된 표면에 적응시켰다. 대안으로, 저온 보존한 세포를 80 ng/mL hbFGF를 함유하는 동일한 배지에 직접 해동하였다. 상기 세포는 콜라게나제 IV를 사용하여 5∼6일마다 계대 배양하였다.

이 조건들에서 성장한 배양물은 Matrigel® 상의 배양물과 유사하거나 그보다 더 우수하였다. (A) mEF 조절 배지에서 성장한 세포의 형태; (B) 라미닌 상의 규정 배지의 형태; (C) mEF-CM(H1p62) 또는 규정 배지(H1p34+28)에서의 표면 마커 SSEA-4 발현; (D) mEF-CM 또는 규정 배지에서의 표면 마커 Tra-1-60의 발현. 라미닌 상의 규정 배지에서의 배양 수행이 우수하였는데, 즉, 아주 큰 ES 세포 콜로니가 관찰되었으며, 이때 콜로니는 배양물의 약 80%에 상당하였다. 마커 발현의 정도는 하기와 같았다:

규정된 배양 조건에서의 마커 발현

계대 배양 번호	배양 배지	표면 마커 발현		상대적 유전자 발현
계대 배양 번호	배양 배지	SSEA-4	Tra-1-60	hTERT	Oct3/4	Cripto
실험 1: H1p41 H1p31+10	조작 규정	79% 92%	93% 87%	1.00 2.85 + 0.58^*	1.00 0.74 ± 0.04	1.00 1.82 ± 0.62
실험 2: H1p44 H1p34+11	조작 규정	81% 77%	91% 84%	1.00 1.11 ± 0.38	1.00 0.57 ± 0.24	1.00 0.76 ± 0.39
실험 3: H1p47 H1p35+12	조작 규정	78% 80%	92% 86%	1.00 2.00 ± 0.15	1.00 0.86 ± 0.20	1.00 3.12 ± 0.91
* RT-PCR 측정을 위한 평균 ± SD

미분화된 hES 세포의 다른 마커 특성의 발현도 비슷하였다: 실시간 PCR로 측정한 바에 의하면, hTERT 및 Cripto의 수준은 mEF-CM과 비교하여 규정 배지에서 동일하거나 더 큰 반면, Oct 3/4의 발현은 약 28%(세 실험의 평균)까지 더 낮았다. TRAP 분석은 세포가 텔로머라아제 효소 활성을 보유함을 나타냈다.

p34+11에서의 완전히 규정된 배양 시스템에서 성장한(75일) 세포를 회수하고, SCID 마우스에서 기형종을 제조하여 다능성을 평가하는 데 사용하였다. 기형종은 염색된 상피(내배엽); 신장 조직(내배엽); 중간엽 조직(중배엽); 및 신경관(외배엽)의 흔적을 보였다. 이는, 세포가 그의 다능성을 보유하였음을 확증한다.

실시예 3: hES 세포의 현탁 배양

배양물 부피당 hES 세포의 수율을 증가시킬 목적으로, 세포를 현탁액에서 배양한 다음, 형태 및 모든 3 가지 배엽에 해당하는 분화된 세포들을 형성하는 능력을 평가하였다.

Matrigel® 상에서 성장한 H9 hES 세포를 6-웰 평판으로부터 회수하고 하기의 조건들 하에서 스피너 플라스크에 접종하였다:

ㆍ 용기: 100 mL 스피너 플라스크

ㆍ 접종(심기) 밀도: 3.6 × 10⁵ 세포/mL

ㆍ 배지 부피: 스피너 플라스크당 50 mL

ㆍ 사용한 배지: bFGF(8 ng/mL)를 함유하는 mEF 조절 배지

ㆍ 교반 속도: 20 rpm(Bellco 캐리어 자석 교반기)

ㆍ 대기: 37℃ CO₂ 배양기

ㆍ 배지 교체: 격일(세포를 침전시키고 상청액을 교환함으로써 교체함)

H9 hES 세포는 스피너 플라스크에서 상기 조건들 하에 6일간 유지하였다.

도 4(위 그림)는 그 결과를 도시한다. 배양물이 확립되는 동안의 초기 감소에 이어서, 세포수는 2일째부터 6일째까지 증가하기 시작하였다.

이 시점에서, 세포를 Matrigel®로 코팅된 6-웰 평판에 다시 분주하여, 이들이 미분화된 세포의 표현형을 여전히 갖는지 여부를 측정하였다. bFGF(8 ng/mL)를 함유하는 mEF-CM 배지를 사용하여 배양을 지속하였다.

도 4(아래 그림)는 그 결과를 도시한다. 단일 계대 배양 후, 세포는 성장하고 미분화된 세포의 형태를 나타냈다.

세포의 다능성을 배상체를 형성함으로써 평가하였다. 콜라게나제 IV를 사용하여 혼탁 배양물로부터 세포를 회수하고, DMEM + 20% FBS 중 낮은 부착 6-웰 평판에 이송하였다. EB가 형성되었고, 이를 4일간 유지하였다. 이어서 EB를 폴리오르니틴 코팅된 챔버 슬라이드에 재분주하였다. 추가의 11일 후, EB 증식물의 α-태아단백질(내배엽), 근육 액틴(중배엽) 및 뉴런 형태를 갖는 β-튜불린(외배엽)을 염색하였다.

도 5는 그 결과를 도시한다. 상부 열은, 현탁 배양으로 유지된 hES 세포로부터 분화된 다음, 표준 조건 하에 라미닌으로 다시 평판에 분주된 세포들을 도시한다. 하부 열은 평판에 분주된 세포로서 내내 유지된 동일한 hES 세포주로부터 분화된 세포들을 도시한다. 이 도면에서 도시된 바와 같이, 현탁액에서 유지된 hES 세포는 모든 3 가지 배엽의 유도체로 분화하는 완전한 능력을 유지하였다.

다른 실험에서는, H9 hES 세포를 하기의 조건들 하에서 배양하였다:

ㆍ 용기: 100 mL 스피너 플라스크

ㆍ 접종(심기) 밀도: 3.5 × 10⁵ 세포/mL

ㆍ 배지 부피: 스피너 플라스크당 50 mL

ㆍ 사용한 배지: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL)

ㆍ 교반 속도: 20 rpm(전과 같음)

ㆍ 배지 교환: 3일에 1회

도 6은 그 결과를 도시한다. 일단 배양물이 확립되면, 세포는 완전한 12일의 기간 동안 순조롭게 유지되었다.

실시예 4: 장기 현탁 배양

이 실험은 다른 hES 세포주로 실시하였다. 세포를 몇몇의 상이한 배양 조건 하에서 스피너 플라스크 대신에 쉐이커 플라스크를 사용하여 배양하고, 배양을 2 개월 이상 동안 연장하였다.

ㆍ H1 hES 세포는 6-웰 평판으로부터 회수하고(mEF 조절 배지 중 Matrigel® 상에서 성장함), 하기의 조건들 하에서 쉐이커 플라스크에 접종하였다:

ㆍ 용기: 100 mL 쉐이커 플라스크

ㆍ 접종(심기) 밀도: 5.0 × 10⁵ 세포/mL

ㆍ 배지 부피: 쉐이커 플라스크당 15 mL

ㆍ 교반 속도: 80 rpm(37℃ CO₂ 배양기에서의 Labline 회전자/쉐이커)

ㆍ 배지 교환: 처음에는 격일로, 이후에는 2∼3일에 1회

사용한 배지 및 배양 기간은 하기와 같았다:

A: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL). 98일간 유지함.

B: mEF-CM + bFGF(8 ng/mL) + 라미닌(개시에는 33 ㎍/mL, 그 이후 나머지 배양에는 10 ㎍/mL 이하). 49일간 유지함.

C: X-VIVO^TM 10 + FGF(40 ng/mL) + Flt-3(75 ng/mL). 11일간 유지함.

D: X-VIVO^TM 10 + FGF(40 ng/mL) + Flt-3(75 ng/mL) + 라미닌(개시에는 33 ㎍/mL, 그 후 나머지 배양에는 10 ㎍/mL 이하). 11일간 유지함.

배양 기간에 걸친 세포수를 하기의 표에 기재한다.

현탁 배양에서의 hES 세포의 성장률

배양 일수	배지 A (10⁵ 세포/mL)	배지 B (10⁵ 세포/mL)	배지 C (10⁵ 세포/mL)	배지 D (10⁵ 세포/mL)
0 1 3 11 32 98	5.0 (세지 않음) 5.9 2.7 0.3 14	5.0 7.5 5.0 2.3 0.15 -	5.0 6.9 2.8 2.5 - -	5.0 7.3 2.8 2.4 - -

세포가 미분화된 표현형을 유지하였는지 여부를 측정하기 위해, 배지 A에서 4 주간 배양된 세포를, bFGF를 함유하는 mEF 조절 배지 중 Matrigel® 위에 다시 분주하였다.

도 7은 그 결과를 도시한다. 계대 배양 후, 현탁 배양으로부터 유도된 세포는 성장하고 특징적인 미분화 hES 세포 콜로니를 나타내는 것으로 보였다.

이 데이터들은 hES 세포가 3 개월 이상 동안(잠재적으로는 배양물이 완전히 확립된 후에는 3∼40 배 증대될 수 있음) 현탁 배양으로 유지될 수 있음을 나타낸다.

실시예 5: 신선한 배지를 사용하는 현탁 배양

다음의 실험은, 현탁 배양에서 신선한 (비조절) 배지와 함께 사용하는 대안 첨가제를 평가한다.

hES 세포는 표준 조건(6-웰 평판에 2 ㎍/cm²으로 코팅된, Sigma로부터의 인간 라미닌의 기질; 80 ng/mL bFGF 및 0.5 ng/mL TGFβ1을 함유하는 X-VIVO 10^TM 배지) 하에 신선한 배지 중 표면 배양물로부터 회수한다. 회수된 세포는, 5 × 10⁵ 세포/mL 이하의 초기 밀도로 플라스크당 50 mL를 사용하여, 100 mL 스피너 플라스크에서 현탁 배양으로 계대 배양한다. 하기의 배지 대체물을 평가한다:

1) X-VIVO^TM 10 + bFGF(80 ng/mL)

2) X-VIVO^TM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL)

3) X-VIVO^TM 10 + bFGF(40 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL)

4) X-VIVO^TM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL) + 10 ㎍/mL 인간 라미닌

5) X-VIVO^TM 10 + bFGF(80 ng/mL) + TGFβ1(0.5 ng/mL) + 50 ㎍/mL 인간 혈청 알부민

각각의 스피너 플라스크를, 37℃ CO₂ 배양기 내의 Bellco 캐리어 자석 교반기(미국 뉴저지주 Vineland 소재의 Bellco Biotechnology사) 위에, 20 rpm까지의 초기 교반 속도로 둔다. 교반 속도는, 전단력을 최소로 하면서 세포가 현탁 상태를 유지하도록 조절하고 충분한 통기를 제공한다. 배지를 전과 같이 2∼3일 마다 교체하고, 세포수를 모니터링하며, 플라스크를 필요한 만큼 분할한다.

규칙적인 간격으로, 세포를 각각의 플라스크로부터 샘플링하고, 라미닌 코팅된 표면에 다시 분주하여 형태를 평가한다. 표면 배양물로 되돌아온 세포 및 현탁 배양으로부터 직접 취한 세포는, 실시예 3에서와 같이, EB 유도된 세포의 면역 세포 화학적 염색에 의해 다능성에 대해서 시험한다.

상기에 설명한 조성물 및 절차는, 청구된 본 발명 및 그의 등가물에서 벗어남 없이 유효하게 변형할 수 있다.

Claims

현탁액 중의 인간 배아 줄기(human Embryonic Stem; hES) 세포의 배양물로서, 상기 hES 세포는 실질적으로 미분화된 것인 배양물.
제1항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포 성장 인자를 약 40 ng/mL 이상의 농도로 함유하는 배지에서 배양되는 것인 배양물.
제2항에 있어서, 상기 배지는 변형성 성장 인자 베타(Transforming Growth Factor beta; TGFβ), 줄기 세포 인자(Stem Cell Factor; SCF) 또는 Flt3 리간드(Flt3L)를 더 함유하는 것인 배양물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1 종 이상의 가용성 또는 현탁형 세포외 기질 성분을 함유하는 배지에서 배양되는 것인 배양물.
제4항에 있어서, 상기 세포외 기질 성분(들)은 인간 라미닌 및/또는 인간 피브로넥틴을 포함하는 것인 배양물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 고체 극미립자를 함유한 현탁액에서 배양되는 것인 배양물.
제6항에 있어서, 상기 극미립자는 1 종 이상의 가용성 또는 현탁형 세포외 기질 성분으로 코팅되는 것인 배양물.
hES 세포를 배양하는 방법으로서,

a) 상기 세포를 영양 배지에 현탁하는 단계,

b) 상기 세포를 배양하면서 현탁액 중에서 유지하는 단계,

c) 배지를 주기적으로 교체하는 단계,

d) 임의로, 세포 밀도를 감소시키기 위해 배양물을 때때로 분할하는 단계, 및 최종적으로

e) 배양물로부터 세포를 회수하는 단계

를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포 성장 인자를 약 40 ng/mL 이상의 농도로 함유하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 배지는 변형성 성장 인자 베타(TGFβ), 줄기 세포 인자(SCF) 또는 Flt3 리간드(Flt3L)를 더 함유하는 것인 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 1 종 이상의 가용 성 또는 현탁형 세포외 기질 성분을 함유하는 배지에서 배양하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 세포외 기질 성분(들)은 인간 라미닌 및/또는 인간 피브로넥틴을 포함하는 것인 방법.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 고체 극미립자를 함유한 현탁액에서 배양하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 극미립자는 1 종 이상의 가용성 또는 현탁형 세포외 기질 성분으로 코팅되는 것인 방법.
제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 2 개월 이상 동안 현탁액에서 배양하는 것인 방법.
제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 현탁 배양하는 동안 3 배 이상 증식하는 것인 방법.
제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 회수한 세포를 고체 표면 위에 다시 분주(plating)하고, 실질적으로 미분화된 세포 군집을 유지하도록 세포의 배양을 지속하는 단계를 더 포함하는 방법.
제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 회수한 세포를 분화시키는 단계를 더 포함하는 방법.
40 ng/mL 이상의 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 영양 배지를 포함하는, hES 세포를 현탁 배양하기 위한 시스템 또는 키트.
제19항에 있어서, 배지에 첨가하기 위한 세포외 기질 성분 또는 극미립자를 더 포함하는 시스템 또는 키트.