KR20070090890A

KR20070090890A - Ｈｍｇｂ1에 대한 고 친화성 항체 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20070090890A
Application number: KR1020077011657A
Authority: KR
Inventors: 헤렌 우; 크리스찬 비. 앨런; 장슈 가오; 링-링 안; 피터 키에너; 수-야우 마오; 앤소니 코일
Original assignee: 메디뮨 인코포레이티드
Priority date: 2004-10-22
Filing date: 2005-10-21
Publication date: 2007-09-06
Also published as: CA2585043A1; CN101132811A; AU2005333602B2; AU2005333602A1; US8153131B2; WO2007001422A3; WO2007001422A2; EP1812065A4; US20060099207A1; CN102731654A; CN101132811B; JP2008520552A; US20100061987A1; EP1812065A2; US7585504B2

Abstract

본 발명은 척추 동물 세포로부터 전 염증 시토킨의 방출을 억제하고, 환자의 체 내에서 염증 시토킨 연쇄 반응을 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들어, HMG1과 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체를 포함한다. 본 발명의 고 친화성 항체 및 이를 포함하는 약학 조성물은 여러 목적으로서 예를 들어, 광범위한 염증성 질병 및 질환 예를 들어, 부패증, 류머티즘성 관절염, 복막염, 크론병, 재관류 손상, 패혈증, 내독소 쇼크, 낭포성 섬유증, 심내막염, 건선, 건선성 관절염, 관절염, 과민성 쇼크, 기관 허혈, 재관류 손상 및 동종 이식 거부 반응에 대한 치료제로서 유용하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체는 진단용 항체로서도 유용하다.

Description

ＨＭＧＢ1에 대한 고 친화성 항체 및 이의 사용 방법{HIGH AFFINITY ANTIBODIES AGAINST HMGB1 AND METHODS OF USE THEREOF}

염증은 종종 전 염증 시토킨(proinflammatory cytokine) 예를 들어, 종양 괴사 인자(TNF), 인터루킨(IL)-1α, IL-1β, IL-6, 혈소판-활성화 인자(PAF), 대식 세포 이동 억제 인자(MIF) 및 기타 화합물에 의해 유발된다. 이와 같은 전 염증 시토킨은 몇몇 상이한 세포 류, 가장 중요하게는 면역 세포(예를 들어, 단핵구, 대식 세포 및 호중구)에 의해 생산될 뿐만 아니라, 비-면역 세포 예를 들어, 섬유 아세포, 조골 세포, 평활근 세포, 상피 세포 및 뉴런에 의해서도 생산된다. 이러한 전 염증 시토킨은 염증 시토킨 연쇄 반응(inflammatory cytokine cascade)의 초기 단계에 발생하는 다양한 질환에 관여한다.

염증 시토킨 연쇄 반응은 다양한 질환의 유해한 특성 예를 들어, 염증 및 세포 자살에 관여한다. 국소화 및 전신 반응 둘 다를 특징으로 하는 만성 및 급성 질환으로서는, 위장관계 및 관련 조직과 관계된 질병(예를 들어, 충수염, 소화성 궤양, 위궤양 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 무이완증, 담관염, 담낭염, 소아 지방 변증, 간염, 크론병, 장염 및 휘플병); 전신 또는 국소 염증 질환 및 병상(예를 들어, 천식, 알레 르기, 과민성 쇼크, 면역 복합체 질환, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 고초열, 부패증(sepsis), 패혈증(septicemia), 내독소 쇼크, 악액질, 초 이상 고열, 호산성 육아종, 육아종증 및 유육종증); 비뇨생식계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염 및 요도염); 호흡계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 기관지염, 기종, 비염, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴, COPD, 성인 호흡 장애 증후군, 진폐증(pneumoultramicroscopicsilicovolcanoconiosis), 폐포염, 세기관지염, 인두염, 늑막염 및 부비강염); 다양한 바이러스(예를 들어, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스, HIV, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 헤르페스 바이러스)에 의한 감염으로부터 발생하는 질병, 박테리아에 의한 감염으로부터 발생하는 질병(예를 들어, 산재성 균혈증, 댕기열), 진균에 의한 감염으로부터 발생하는 질병(예를 들어, 칸디다증) 및 원생 기생충 및 다세포 기생체에 의한 감염으로부터 발생하는 질병(예를 들어, 말라리아, 사상충증, 아메바증 및 포충낭); 피부과학적 질병 및 피부 병상(예를 들어, 건선, 화상, 피부염, 피부근염, 햇볕 화상, 담마진성 사마귀 및 팽진); 심혈관계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 혈관염, 맥관염, 심내막염, 동맥염, 죽상 동맥경화증, 혈전 정맥염, 심막염, 울혈성 심부전, 심근염, 심근 허혈증, 결절성 동맥 주위염, 재발 협착증 및 류머티즘열); 중추 또는 말초 신경계 및 관련 조직에 관계된 질병(예를 들어, 알츠하이머병, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길라메-바 증후군(Guillame-Barre syndrome), 신경염, 신경통, 척수 외상, 마비 및 포도막염); 뼈, 관절, 근육 및 결합 조직 관 련 질병(예를 들어, 다양한 관절염 및 관절통, 골수염, 근막염, 패젯병, 통풍, 치주 질환, 류머티즘성 관절염 및 윤활막염); 기타 자가 면역성 질환 및 염증 질환(예를 들어, 중증 근무력증, 갑상선염, 전신 홍반성 루프스병, 구드패스츄어 증후군, 버셋 증후군, 동종 이식 거부 반응, 이식편 대 숙주 병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거씨병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거씨병 및 레티어 증후군(Retier's syndrome)); 그리고 다양한 암, 종양 및 증식성 질환(예를 들어, 호지킨병); 또한 임의의 1차적 질병에 대한 염증 반응 또는 면역 숙주 반응을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

초기의 전 염증 시토킨(예를 들어, TNF 및 IL-1 등)은 염증 반응을 매개하며, 고 이동성 제1 단백질 군(high mobility group protein 1; HMG1)(HMG-1, HMG1 및 HMGB1이라고도 알려짐) 즉, 혈청에 축적되며 지발성 치사(delayed lethality)와 초기 전 염증 시토킨의 추가 유도를 매개하는 단백질을 후반부에 방출시킨다.

처음에, DNA 구조와 안정성에 중요한 역할을 하는, 고 이동성 군(HMG)이라고 칭하여지는 DNA-결합 단백질 군을 이루는 최초 일원(founding member)으로서 HMG1이 동정되었다. 이는 지금으로부터 거의 40년 전에 서열 특이성 없이도 이중 가닥 DNA에 결합하는, 편재형 발현 핵 내 단백질로서 동정되었다.

HMG1이 결합함에 따라서 DNA는 구부러지며, 이로써 핵 단백질 복합체의 형성을 촉진하고 이 복합체의 안정성을 강화하여, 예를 들어, 글루코코르티코이드 수용체와 RAG 재조합 효소의 유전자 전사를 촉진하게 된다. HMG1 분자는 3개의 도메인을 가진다[이 중, 2개는 DNA 결합 모티프로서 HMG A 및 HMG B 박스라고 칭하여지 며, 나머지 하나는 산성 카복실 말단부라 칭하여짐]. 상기 2개의 HMG 박스는 고도로 보존된 80개 아미노산의 L-형 도메인이다. HMG 박스는 또한 기타 전사 인자 예를 들어, RNA 중합효소 I 전사 인자, 인간 상류-결합 인자 및 림프성-특이 인자에서 발현되기도 한다.

최근 들어, HMG A 박스는 HMG 전 염증 작용의 경쟁적 억제 인자로서 작용하고, HMG B 박스는 HMG의 우세한 전 염증 활성을 보유한다는 사실이 밝혀졌다(예를 들어, US20040005316 참조). HMG1은 염증을 유발하는 세포 자살 세포와는 반대로, 괴사에 의해 수동적으로 방출되는 핵내 위험 신호로서 오랫동안 연구되어 그 특성이 입증되었다. 뿐만 아니라, HMG1은 또한 분자를 아세틸화시킬 필요가 있는 과정 즉, HMG1을 핵으로부터 분비형 리소좀으로 이동시켜 이 HMG1의 아세틸화된 형태를 분비하도록 만들 수 있는 과정에 있어서, 자극된 대식 세포 또는 단핵구에 의해 능동적으로 분비될 수도 있는 것으로 밝혀졌다. PCT/IB2003/005718을 참조하시오. 그러므로, 괴사 세포로부터 수동적으로 방출되는 HMG1과 염증 세포에 의해 능동적으로 분비되는 HMGB1은 분자적 측면에 있어서 상이하다.

또한, HMG1은 내독소 혈증에 있어서 지발성 치사의 시토킨 매개 인자로서 관련되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,468,533호 및 동 제6,448,223호를 참조하시오. 더욱 구체적으로, 박테리아 내독소(리포다당류(LPS))는 단핵구/대식 세포를 활성화하여, 이러한 활성화에 대한 후기 반응으로서 HMG1을 방출하고, 따라서 혈청 HMG1 수치를 독성을 띨 정도로 상승시킨다는 것이 입증되었다. HMG1에 대한 항체는 항체 투여가 지연될 때조차도 초기 시토킨 반응이 발생하는 이후까지 내독소의 치 사성을 예방하는 것으로 나타났다. 기타 전 염증 시토킨과 같이, HMG1은 단핵구의 유력한 활성 인자이다. HMG1을 기관 내에 투여하면 급성 폐 손상을 유발하고, 항-HMG1 항체는 내독소-유도성 폐부종에 대해 보호해준다. 뿐만 아니라, 부패증 또는 출혈성 쇼크를 동반하는 중증 환자에 있어서 혈청 HMG1 수준은 상승하게 되며, 그 수준은 생존자에 비하여 사망자의 경우 훨씬 높다.

세포외 HMG1은, 고급 글리케이트화 최종 생산물(advanced glycated end-products; RAGE) 및 톨-유사 수용체(Toll-like receptor;TLR) 군의 일원을 통한 신호 전달에 의하는 염증 연쇄 반응의 유력한 매개 인자로서 작용을 한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 US20040053841을 참조하시오.

고 이동성 제2 단백질 군(HMG2)(HMGB2 및 HMG-2라고도 알려짐)은 유전자 복제로부터 기원하는 것으로 여겨지는 HMG1과 매우 가까운 관계에 있는 것이다. 이는 다수의 세포 류에 존재하며, HMG1의 생화학적 특성의 대부분을 공유한다[Bustin, 1999, Mol. Cell. Biol. 19, 5237-6 및 Thomas외 다수, 2001, Trends Biochem. Sci. 26, 167-74]. 비록 HMG2는 성체 마우스 조직 내에 보다 적게 존재하고 HMG1 보다 더욱 제한적으로 분포되어 있지만, HMG2는 그것이 염증 매개 인자로서의 역할을 할 수도 있는 림프양 기관, 고환 및 폐에 비교적 풍부하게 존재한다. HMG1과 유사하게, HMG2는 또한 다수의 자가 면역 질환 예를 들어, 전신 류머티즘성 질환(Uesugi외 다수, 1998, J Rheumatol. 25:703-9), 궤양성 대장염(Sobajima외 다수, 1998, Clin Exp Immunol. 111 :402-7) 및 연소성 특발 관절염(Wittemann외 다수, 1990, Arthritis Rheum. 33:1378-83; Rosenberg외 다수, 2000, J Rheumatol. 27, 2489-93)에 있어서 자가 항체(예를 들어, 핵 주위 항-호중구 세포질 항체)의 중요한 표적 항원이기도 하다.

HMG1에 결합하는 항체와 이의 폴리펩티드 단편(예를 들어, HMG A 및 HMG B 박스)은 HMG1의 활성(예를 들어, 전 염증 활성)을 조절하고, 인간에 있어서 HMG1 활성을 조절하면 다수의 질병 및 질환을 치료하는데에 유효할 수 있다는 사실에 따라서, 당 업계에는 HMG1과 특이적으로 결합하는 항체와, HMG1에 대한 고 친화성과 저 면역원성을 보유하는 이 항체의 폴리펩티드 단편을 동정할 필요성이 요망되고 있다. 이와 유사하게, HMG2의 활성을 조절하는 분자(예를 들어, HMG2에 특이적으로 결합하는 항체 및 폴리펩티드 단편) 또한 다수의 질병 및 질환에 대한 유용한 치료제일 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 부분적으로는, HMG1(본원에서는 "HMGB1"이라고도 칭함)과 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체의 발견을 바탕으로 한다. 본 발명의 고 친화성 항체 및 이를 포함하는 약학 조성물은 다양한 용도 예를 들어, 광범위한 염증성 질병 및 질환 예를 들어, 부패증, 류머티즘성 관절염, 복막염, 크론병, 재관류 손상, 패혈증, 내독소 쇼크, 낭포성 섬유증, 심내막염, 건선, 관절염(예를 들어, 건선성 관절염), 과민성 쇼크, 기관 허혈증, 재관류 손상, 척수 외상 및 동종 이식 거부 반응의 치료제로서 유용하다. 뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체는 진단용으로서도 유용하다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는, 인간 또는 기타 동물 예를 들어, 포유 동물 및 무척추 동물의 HMG1 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간의 HMG1 폴리펩티드(서열 번호 1 또는 서열 번호 2)를 포함하거나 또는 이로써 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 전장 HMG1 폴리펩티드는 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, US20040005316; 미국 특허 제6,468,533호 및 동 제6,448,223호 참조].

인간 HMGB1 아미노산 서열( GenBank 승인 번호 NP 002119)

MGKGDPKKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWK

TMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRPPS

AFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK

LKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEEEDEEDEDEEEDDDDE

(서열 번호 1)

인간 HMGBl 아미노산 서열( GenBank 승인 번호 AAA64970 )

MGKGDPKKPTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWK

TMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGETKKKFKDPNAPKRLPS

AFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEMWNNTAADDKQPYEKKAAK

LKEKYEKDIAAYRAKGKPDAAKKGVVKAEKSKKKKEEEEDEEDEEDEEEE

EDEEDEEDEE DDDDE

(서열 번호 2)

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 또는 기타 동물 예를 들어, 포유 동물 및 무척추 동물의 HMG2(본원에서는 "HMGB2"라고도 칭함) 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간의 HMG2 폴리펩티드(서열 번호 21)를 포함하거나 또는 이로써 이루어진 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 전장 HMG2 폴리펩티드에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Majumdar외 다수, 1991, Nucleic Acids Res. 19:6643; Shirakawa외 다수, 1992, J Biol Chem 267:6641-6645]을 참조하시오.

인간 HMGB2 아미노산 서열( GenBank 승인 번호 AAA58659 )

MGKGDPNKPRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAK

EKSKFEDMAKSDKARYDREMKNYVPPKGDKKGKKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRP

KIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQSAKDKQPYEQKAAKLKEKYEKDIAAYRAKGK

SEAGKKGPGRPTGSKKKNEPEDEEEEEEEEDEDEEEEDEDEE

(서열 번호 21)

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 포유 동물(또는 기타 동물)의 HMG1 A 박스 또는 HMG1 B 박스를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 HMG1 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 HMG1 A 박스 및 HMG1 B 박스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 고도로 보존되어 있으며, 이에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, US20040005316; 미국 특허 제6,468,533호; 동 제 6,448,223호 및 US20040053841 참조].

인간 HMGB1 A 박스(서열 번호 3)

PTGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDASVNFSEFSKKCSERWKTMSAKEKGKFEDMAKADKARYEREMKTYIPPKGET

인간 HMGB1 B 박스(서열 번호 4)

FKDPNAPKRLPSAFFLFCSEYRPKIKGEHPGLSIGDVAKKLGEM

WNNTAADDKQPYEKKAAKLKEKYEKDIAAY

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 포유동물(또는 기타 동물)의 HMG2 A 박스 또는 HMG2 B 박스를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 HMG2 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 HMG 박스 폴리펩티드의 아미노산 서열은 매우 보존적이며, 이에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Jantzen외 다수, 1990, Nature 344:830-6; Kolodrubetz 1990, Nucleic Acids Res. 18:5565; Laudet외 다수, 1993, Nucleic Acids Res. 21:2493-501 및 Thomas외 다수, 2001, Trends Biochem Sci. 26:167-74]을 참조하시오.

인간 HMGB2 A 박스(서열 번호 22)

PRGKMSSYAFFVQTCREEHKKKHPDSSVNFAEFSKKCSERWKTMSAKEKSKFEDMA

KSDKARYDREMKNYVPPKGDK

인간 HMGB2 B 박스(서열 번호 23)

KKKDPNAPKRPPSAFFLFCSEHRPKIKSEHPGLSIGDTAKKLGEMWSEQSAKDKQPY

EQKAAKLKEKYEKDIAAY

본 발명은 HMG1 및/또는 HMG2의 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래하는 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체도 포함한다. 상기 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래하는 아미노산 잔기로부터 유래하는 에피토프는, A 및 B 박스의 접합부로부터 유래하는 선형 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 상기 A 및 B 박스 둘 다로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 3차원 형태에서 유래할 수도 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간(또는 기타 동물) HMGB1의 폴리펩티드 단편을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 항원성 HMGB1 폴리펩티드 단편에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간(또는 기타 동물) HMGB2의 폴리펩티드 단편을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 항원성 HMGB2 폴리펩티드 단편에 특이적으로 결합한다.

본 발명의 고 친화성 항체는 특히 아세틸화된/아세틸화되었거나 아세틸화되지 않은 HMG1 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 생각된다. 또한 본 발명의 고 친화성 항체는 특히 이 두 가지 형태를 구별할 수 있는 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체는 아세틸화된/아세틸화되었거나 아세틸화되지 않은 HMG2 및 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 고 친화성 항체는 이 두 가지 형태를 구별할 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 특정 구체예에서, HMG1과 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 인간화된 항체이거나 또는 인간의 항체이다. 본 발명의 다른 특정 구체예에서, HMG2와 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체는 인간화된 항체 또는 인간의 항체이다.

본 발명의 다른 구체예는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 항체로서, 해리 상수 즉, K_d(K_off _/ _on)가 10^-5M 미만, 또는 10^-6M 미만, 또는 10^-7M 미만, 또는 10^-8M 미만, 또는 10^-9M 미만, 또는 10^-10M 미만, 또는 10^-11M 미만, 또는 10^-12M 미만, 또는 10^-13M 미만이다.

본 발명의 또 다른 구체예는 HMG2 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 항체로서, 해리 상수 즉, K_d(K_off _/ _on)가 10^-5M 미만, 또는 10^-6M 미만, 또는 10^-7M 미만, 또는 10^-8M 미만, 또는 10^-9M 미만, 또는 10^-10M 미만, 또는 10^-11M 미만, 또는 10^-12M 미만, 또는 10^-13M 미만이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1 및/또는 이의 항원성 단편과 K_off가 1×10^-3s^-1 미만, 또는 3×10^-3s^-1 미만으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 K_off가 10^-3s^-1 미만, 5xlO^-3s^-1 미만, 10^-4s^-1 미만, 5xlO^-4s^-1 미만, 10^-5s^-1 미만, 5xlO^-5s^-1 미만, 10^-6s^-1 미만, 5xlO^-6s^-1 미만, 10^-7s^-1 미만, 5xlO^-7s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5xlO^-8s^-1 미만, 10^-9s^-1 미만, 5xlO^-9s^-1 미만, 또는 10^-10s^-1 미만으로 결합한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG2 및/또는 이의 항원성 단편과 K_off가 1×10^-3s^-1 미만, 또는 3×10^-3s^-1 미만으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 HMG2 및 이의 항원성 단편과 K_off가 10^-3s^-1 미만, 5xlO^-3s^-1 미만, 10^-4s^-1 미만, 5×1O^-4s^-1 미만, 10^-5s^-1 미만, 5xlO^-5s^-1 미만, 10^-6s^-1 미만, 5xlO^-6s^-1 미만, 10^-7s^-1 미만, 5xlO^-7s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5xlO^-8s^-1 미만, 10^-9s^-1 미만, 5xlO^-9s^-1 미만, 또는 10^-10s^-1 미만으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1 및/또는 이의 항원성 단편과 결합 속도 상수 즉, K_on 속도가 10⁵ M^-1s^-1 이상, 5×10⁵ M^-1s^-1 이상, 10⁶ M^-1s^-1 이상, 5×10⁶ M^-1s^-1 이상, 10⁷ M^-1s^-1 이상, 5×10⁷ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁸ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁹ M^-1s^-1 이상으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG2 및/또는 이의 항원성 단편과 결합 속도 상수 즉, K_on 속도가 10⁵ M^-1s^-1 이상, 5×10⁵ M^-1s^-1 이상, 10⁶ M^-1s^-1 이상, 5×10⁶ M^-1s^-1 이상, 10⁷ M^-1s^-1 이상, 5×10⁷ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁸ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁹ M^-1s^-1 이상으로 결합한다.

본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1에는 특이적으로 결합하되 HMG2에는 결합하지 않을 수 있거나, 또는 HMG2에는 특이적으로 결합하되 HMG1에는 결합하지 않을 수 있는 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체(예를 들어, HMG1 및 HMG2 둘 다에 존재하는 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체)는 HMG1 및 HMG2 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 생각된다. 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 또는 HMG2와 특이적으로 결합할 수 있으며, 또한 HMG2 또는 HMG1과 각각 교차 반응할 수 있는 것으로 생각된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 및 HMG2와 동일하거나 또는 상이한 결합 친화도로 결합하는 것으로 생각된다.

본 발명의 고 친화성 항체로서는 합성 항체, 모노클로날 항체, 재조합 생산된 항체, 인트라바디(intrabody), 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 단일 사슬 Fv(scFv), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화물 결합 Fv(sdFv)(예를 들어, 이중 특이적 sdFv) 및 항유전자형(항-Id) 항체 및 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 부가 비 제한적 구체예는 임의의 바람직한 생화학적 특성 예를 들어, 특정 등전점(pI) 또는 용융 온도(Tm)를 갖는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 5.5∼9.5이다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 약 65∼약 120℃이다.

본 발명의 특정 구체예는 또한 고 친화도로 HMG1에 특이적으로 결합하는 특정 항체(및 이의 단편)를 포함하며, 이 항체는 미국 모식균 배양 수집소(버지니아주 20110-2209 매너사 10801 유니버시티 불레바드 소재)에 ATCC 기탁 번호 PTA-6142(2004년 8월 4일 기탁), PTA-6143(2004년 8월 4일 기탁), PTA-6259(2004년 10월 19일 기탁) 및 PTA-6258(2004년 10월 19일 기탁)(본원에서는 각각"S2", "S6", "S16" 및 "G4"로도 칭함)로 기탁되어 있다. 이와 같은 기탁물은 특허 절차용인 미생물의 국제 기탁에 관한 부다페스트 조약의 조건하에 유지될 것이다. 상기 언급된 기탁물들은 부다페스트 조약의 조건하에 유지되고 있으므로, 부다페스트 조약에 입각하여 특허청에 서명한 자가 입수 가능할 것이다.

본 발명의 기타 특정 구체예는 또한 고 친화도로 HMG1에 특이적으로 결합하는 특정 항체(및 이의 단편)을 포함하며, 또한 본원에 개시된 다양한 부위 중 하나 이상의 부위를 포함한다[예를 들어, 도 2a∼도 2j 및 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73 참조]. 본원에 개시된 항체의 CDR을 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상 보유하는 항체는 본 발명의 특정 구체예에 해당한다[예를 들어, 도 2a∼도 2j의 밑줄 친 CDR 부분 및 서열 번호 74∼103 참조]. 기탁된 항체의 CDR을 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 전부를 보유하는 항체는 본 발명의 특정 구체예에 해당한다. 이와 같은 항체들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(및 이의 단편)는 또한 본 발명의 구체예로서 간주된다.

뿐만 아니라, 동일한 에피토프(예를 들어, HMG1 펩티드 91∼169 또는 150∼183 내에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 항체 즉, 본원에 항-HMG1 항체로서 개시되어 있는 항체도 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 기탁된 항체의 경우와 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 특히, 이러한 항체들은 기탁된 항체들의 경우와 동일한 에피토프에 동일한 친화도 이상, 또는 더 높은 친화도 또는 더 낮은 친화도로 결합할 것으로 생각된다. 이러한 항체들을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드(및 이의 단편)도 또한 본 발명의 특정 구체예에 해당한다.

본 발명의 고 친화성 항체 중 임의의 것을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 구체예로서 포함된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 부형제 중에 본 발명의 고 친화성 항체를 포함하는 조성물 예를 들어, 약학 조성물에 관한 것이다.

특정 구체예에 있어서, 본 조성물은 HMG1의 A 박스(예를 들어, 서열 번호 3에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 조성물은 HMG1의 B 박스(예를 들어, 서열 번호 4, 28, 29에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 조성물은 HMG1 및/또는 HMG2의 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래된 에피토프에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 본 발명의 고 친화성 항체의 조합체 예를 들어, A 박스에 특이적으로 결합하는 항체와 B 박스에 특이적으로 결합하는 항체의 조합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 고 친화성 항체만을 포함할 수 있거나, 또는 이 항체와 기타 활성 치료제 분자 및/또는 애쥬반트 예를 들어, 스테로이드, 기타 소염 분자, 또는 기타 항체 치료제를 함께 포함할 수도 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은 초기 부패증 매개 인자의 길항제를 포함할 수 있다. 초기 부패증 매개 인자의 길항제는 본 발명의 하나의 구체예에 해당하는 것으로서, TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 시토킨 길항제이다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본원에 개시된 조성물은 급성 및 만성 염증 병상 둘 다를 포함하는, 염증 시토킨 연쇄 반응의 활성화에 의해 매개되거나 또는 이를 특징으로 하는 병상을 억제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 동물 CLP 부패증 모델(예를 들어, 마우스 또는 새끼 돼지 CLP 모델)에 있어서 대조구 조성물보다 보호 효능이 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 더욱 뛰어나다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 동물 관절염 모델(예를 들어, 래트 AIA, 마우스 수동 또는 능동 CIA 모델)에 있어서 대조구 조성물보다 보호 효능이 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 더욱 뛰어나다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 동물 관절염 모델(예를 들어, 래트 AIA, 마우스 수동 또는 능동 CIA 모델)에 있어서 대조구 조성물보다 골 상실률 및/또는 연골 손상률을 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 감소시킨다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 인간에 있어서 대조구 조성물보다 골 상실률 및/또는 연골 손상률을 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 감소시킨다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본원에 개시된 조성물은 설치류 관절염 모델에 있어서 (메토트렉세이트와 함께 사용되거나 또는 함께 사용되지 않을 경우) 렌브렐(Renbrel)®보다 보호 효능이 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 더욱 뛰어나다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본원에 개시된 조성물은 인간에 있어서 (메토트렉세이트와 함께 사용되거나 또는 함께 사용되지 않을 경우) 엔브렐(Enbrel)®보다 보호 효능이 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 더욱 뛰어나다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 개시된 조성물은 마우스 복막염 모델에 있어서 대조구 조성물보다 보호 효능이 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 더욱 뛰어나다.

본 발명의 기타 구체예는 본원에 개시된 항체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 예를 들어, 류머티즘성 관절염, 파골 세포 매개성 질병, 또는 관절에 관한 기타 염증성 질병의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 항체의 결합 친화도와는 상관없이, HMG1 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, HMG B 박스)에 특이적으로 결합하는 임의의 항체(또는 항체 조성물)를 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 예를 들어, 류머티즘성 관절염, 파골 세포 매개성 질병, 또는 기타 염증성 질병의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 항체의 결합 친화도와는 상관없이, HMG2 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, HMG B 박스)에 특이적으로 결합하는 임의의 항체(또는 항체 조성물)를 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 예를 들어, 류머티즘성 관절염, 파골 세포 매개성 질병, 또는 기타 염증성 질병의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

다른 구체예에 있어서, 본 발명은 항체의 결합 친화도와는 상관없이, HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 항원성 단편(예를 들어, HMG B 박스)에 특이적으로 결합하는 항체(또는 항체 조성물)를 조합하여 투여하는 단계를 포함하는, 관절염 예를 들어, 류머티즘성 관절염, 파골 세포 매개성 질병, 또는 기타 염증성 질병의 치료 또는 예방 방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 본원에 개시된 조성물은 인간 또는 설치류 SCI 모델에 있어서 대조구 조성물보다 척수 외상(SCI)의 중증도를 (10% 이상 또는 15 % 이상, 또는 20 % 이상, 또는 30 % 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70 % 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상) 경감시킨다.

기타 특정 구체예에서, 본 발명은 만성 및 급성 병상 예를 들어, 충수염, 소화성 궤양, 위궤양 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 무이완증, 담관염, 담낭염, 간염, 크론병, 장염, 휘플병, 천식, 알레르기, 과민성 쇼크, 면역 복합체 질환, 기관 허혈, 재관류 손상, 기관 괴사, 고초열, 부패증, 패혈증, 내독소 쇼크, 악액질, 초 이상 고열, 호산성 육아종, 육아종증 및 유육종증, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 기종, 비염, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴, 진폐증, 폐포염, 세기관지염, 인두염, 늑막염, 부비강염, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스 감염, 헤르페스 감염, HIV 감염, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 산재성 균혈증, 댕기열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바증, 포충낭, 화상, 피부염, 피부근염, 햇볕 화상, 담마진성 사마귀, 팽진, 혈관염, 맥관염, 심내막염, 동맥염, 죽상 동맥경화증, 혈전 정맥염, 심막염, 심근염, 심근 허혈증, 결절성 동맥 주위염, 류머티즘열, 알츠하이머병, 소아 지방 변증, 울혈성 심부전, 재발 협착증, COPD, 성인 호흡 장애 증후군, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길라메-바 증후군, 신경염, 신경통, 척수 외상, 마비, 포도막염, 다수의 관절염, 관절통, 골수염, 근막염, 패젯병, 통풍, 치주 질환, 류머티즘성 관절염, 윤활막염, 중증 근무력증, 갑상선염, 전신 홍반성 루프스병, 구드패스츄어 증후군, 버셋 증후군, 동종 이식 거부 반응, 이식편 대 숙주 병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거씨병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거씨병, 레티어 증후군 및 호지킨병을 포함하는 광범위한 염증성 병상을 치료 및 예방하는 본 발명의 항체 및 조성물을 투여 및 사용하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 포유동물 세포로부터 전 염증 시토킨이 방출되는 것을 억제하는 방법에 관한 것이기도 하다. 이 방법은 본 발명의 항체 또는 항체 조성물을 세포에서 전 염증 시토킨이 방출되는 것을 억제하는데에 충분한 양으로 세포에 처리하는 단계를 포함한다. 이러한 구체예에서, 세포는 전 염증 시토킨 예를 들어, 말초 혈액 단핵구 및 대식 세포를 방출할 수 있는 임의의 세포이다. 뿐만 아니라, 전 염증 시토킨은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 세포는 대식 세포이고 전 염증 시토킨은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 염증 시토킨 연쇄 반응을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 병상이 발병한 환자 또는 이의 발병 위험이 있는 환자의 세포를 치료하는데에 사용된다. 구체적 병상에 관하여는 본원에 열거되어 있다.

관련 구체예에 있어서, 본 발명은 염증 시토킨 연쇄 반응을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 병상이 발병한 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 항체 또는 항체 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 구체적 병상에 관하여는 이미 나열한 바 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 부분적으로 임의의 생화학적 특성, 결합 특성 및 기능적 특성을 나타내며, HMG1(본원에서는 "HMGB1"이라고도 함)과 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는 항체의 발견을 바탕으로 한다. HMG1에 특이적으로 결합하는 항체를 본원에서는 구체적으로 "본 발명의 고 친화성 항체", "고 친화성 항체"라고 칭하기로 하며, 광의로는 "본 발명의 항체", "항-HMG1 항체"라는 용어와, 그냥 간단하게 "HMG 항체"라는 용어도 본 발명의 항체에 포함된다. 본 발명은 또한 부분적으로는 HMG1과 HMG2 둘 다와 결합하는 항체의 발견을 바탕으로 한다.

본 발명의 항체의 생화학적 특성으로서는 등전점(pI) 및 용융 온도(Tm)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체의 결합 특성으로서는, 결합 특이성, 해리 상수(K_d), 에피토프, HMG1의 다양한 형태 및/또는 제제(예를 들어, 재조합체, 천연 형태, 아세틸화된 형태) 및 가용성 및/또는 고정화 항원에 결합하는 능력을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체의 기능상 특성으로서는 HMG1-유도성 시토킨 방출, 하나 이상의 수용체와 HMG1의 결합의 억제, 세포 표면과 HMG1의 결합의 억제 및 하나 이상의 염증 질환(예를 들어, 부패증, 관절염, 급성 폐 손상, 복막염) 모델에서의 보호 효능을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 및 이 항체를 포함하는 조성물은 다양한 용도 예를 들어, 광범위한 만성 및 급성 염증 질병 및 질환 예를 들어, 부패증, 류머티즘성 관절염, 복막염, 크론병, 재관류 손상, 패혈증, 내독소 쇼크, 낭성 섬유증, 심내막염, 건선, 관절염(예를 들어, 건선성 관절염), 과민성 쇼크, 기관 허혈, 재관류 손상, 척수 외상 및 동종 이식 거부 반응에 대한 치료제로서 유용하다.

뿐만 아니라, 본 발명의 고 친화성 항체는 진단 분야에서도 유용하다. 본 발명의 항체는 예를 들어, 시험관 내 및 생체 내 진단 및 치료 방법에 있어서, 본 발명의 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드를 정제, 검출 및 표적화하는데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 항체는 생물학적 시료 중 본 발명의 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드의 수준을 분석적으로 그리고 정량적으로 측정하기 위한 면역 검정법에 사용된다. 예를 들어, 문헌[Harlow외 다수, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988]을 참조하시오.

1. 본 발명의 항체

본원에서 사용되는, "HMG1 및 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합하는" 고 친화성 항체 또는 이의 단편이라는 용어는, 예를 들어, HMG1 폴리펩티드 또는 HMG1 폴리펩티드의 단편(예를 들어, HMG1 A 박스 및 HMG1 B 박스) 또는 HMG1 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합하고(특이적 항체-항원 결합에 대하여 당 업계에 널리 공지된 면역 검정법에 의해 측정) 다른 폴리펩티드와는 특이적으로 결합하지 않는, 고 친화성 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 하나의 구체예에서, HMG1 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체 또는 단편은 다른 항원과 비특이적으로 교차 반응하지는 않는다(예를 들어, 결합 면에 있어서, 비-HMG1 단백질 예를 들어, BSA와 경쟁할 수는 없다). 본 발명은 또한 HMG2 폴리펩티드 또는 HMG2 폴리펩티드의 단편(예를 들어, HMG2 A 박스 및 HMG2 B 박스) 또는 이 HMG2 폴리펩티드의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체 또는 이의 단편을 포함한다.

HMG1과 HMG2 단백질은 각각 상동성을 갖는 부위를 보유한다는 사실은 당업자에 의하여 인식될 것이다(도 1 참조). 그러므로, 고 친화성 항체 또는 이의 단편은 HMG1과 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합할 수 있고, HMG2 또는 이의 항원성 단편에는 결합할 수 없다는 사실을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 고 친화성 항체 또는 이의 단편은 HMG2와 이의 항원성 단편에 특이적으로 결합할 수 있으며, HMG1 또는 이의 항원성 단편에는 결합할 수 없다는 사실도 알 수 있다. 또한, 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1과 HMG2 둘 다에 공통적으로 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다는 사실도 알 수 있다. 공통된 에피토프는 HMG1 및 HMG2 둘 다에 있어서 동일할 수 있는데, 이러한 경우, 이 에피토프를 포함하는 아미노산 서열은 HMG1 및 HMG2 둘 다에서 동일하다. 그러므로, 본 발명의 고 친화성 항체(예를 들어, HMG1과 HMG2 둘 다에 존재하는 동일 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체)는 HMG1과 HMG2 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 공통의 에피토프는 HMG1과 HMG2 둘 다에 있어서 유사할 수 있다. 예를 들어, 유사한 에피토프는 상동성이 유의적 수준(예를 들어, 60∼99% 상동성)일 수 있으며/있거나, HMG1과 HMG2 사이에서 유사한 3차원적 형태를 취하므로, 본 발명의 고 친화성 항체는 공유 에피토프와 교차 반응을 하게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 또는 HMG2와 특이적으로 결합할 수 있으며, 각각 HMG2 또는 HMG1과 교차 반응을 할 수 있다. 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 및 HMG2 상에 존재하는 유사한 에피토프에 대한 친화도가 상이할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 고 친화성 항체는 동일하거나 또는 상이한 결합 친화도로 HMG1 및 HMG2와 결합함을 알 수 있다. 특정 구체예에서, 고 친화성 항체 또는 이의 단편은 다른 항원에 비하여 HMG1 및/또는 HMG2와 더 특이적으로 결합한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 및/또는 HMG2의 A 박스(예를 들어, 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 22)를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 HMG1 및/또는 HMG2의 B 박스(예를 들어, 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 23)를 포함하거나, 또는 이로써 이루오져 있는(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

또한, HMG1 및/또는 HMG2의 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 상기 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래된 아미노산 잔기로부터 유래된 에피토프는, A 박스 및 B 박스의 접합부로부터 유래된 선형 폴리펩티드일 수 있거나, 또는 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래된 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 3차원 형태로부터 생성될 수 있다.

본 발명은 또한 구체적으로 다중적 특이성을 갖는 항체(예를 들어, 2개 이상의 개별 항원에 대한 특이성을 갖는 항체; Cao외 다수, 2003, Adv Drug Deliv Rev 55:171; Hudson외 다수, 2003, Nat Med 1:129)를 포함하기도 한다. 예를 들어, 이중 특이적 항체는 상호 융합된 형태로서, 상이한 2개의 결합 특이성을 보유하는 것이다. 가장 간단한 경우, 이중 특이적 항체는 단일의 표적 항원 상에 존재하는 2개의 인접한 에피토프에 결합하는데, 이러한 항체는 다른 항원과 교차 반응을 하지는 않는다(상동). 대안적으로, 이중 특이적 항체는 2개의 상이한 항원과 결합할 수 있는데, 이러한 항체는 2개의 상이한 분자(예를 들어, HMG1 및 HMG2)와 특이적으로 결합하지만, 기타 관련 없는 분자(예를 들어, BSA)와는 결합하지 않는다. 뿐만 아니라, HMG1 및/또는 HMG2와 특이적으로 결합하는 항체는 관련 HMG 단백질과 교차 반응할 수 있다.

본원에 기술된 HMG1 및/또는 HMG2 "단편"이란 용어에는, HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드(예를 들어, 인간 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드)의 아미노산 서열 중, 5개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 10개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 15개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 80개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 90개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 100개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 125개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 150개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 175개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 200개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열 또는 250개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) HMG1 및/또는 HMG2 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.

본원에 기술된 HMG1 및/또는 HMG2 "단편"이란 용어에는 또한 구체적으로 HMG A 박스(예를 들어, 인간 HMG1 및/또는 HMG2 A 박스) 또는 HMG B 박스(예를 들어, 인간 HMG1 및/또는 HMG2 B 박스)의, 5개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 10개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 15개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 20개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 25개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 40개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 50개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 60개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열, 70개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열 또는 80개 이상의 연속 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 "고 친화성 항체"(본원에서는 "본 발명의 고 친화성 항체", "고 친화성 항체"라고도 칭하며, 광의의 용어인 "본 발명의 항체"에도 포함되고, 간단히 "HMG 항체"라고도 칭함)로서는, 합성 항체, 모노클로날 항체, 재조합 생산 항체, 인트라바디, 다중 특이적 항체(예를 들어, 이중 특이적 항체), 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 단일 사슬 Fv(scFv), Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화 결합 Fv(sdFv)(예를 들어, 이중 특이적 sdFv), 그리고 항-유전자형(항-Id) 항체, 그리고 전술한 것들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체는 단일 특이적, 이중 특이적, 삼중 특이적 또는 그 이상의 다중 특이적일 수 있다. 다중 특이적 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적일 수 있거나, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 이종 에피토프 예를 들어, 이종 폴리펩티드 또는 고형 지지체 물질에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 문헌[PCT 공보 WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt,외 다수, J. Immunol. 147:60-69 (1991); 미국 특허 제4,474,893호; 동 제4,714,681호; 동 제4,925,648호; 동 제5,573,920호; 동 제5,601,819호; Kostelny외 다수, J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조하시오.

다중 특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 이러한 분자는 보통 2개의 항원에만 결합하며(즉, 이중 특이적 항체, BsAbs), 부가적 특이성을 갖는 항체 예를 들어, 삼중 특이적 항체도 본 발명에 포함된다. BsAbs의 예로서는, 한쪽 팔은 HMG1 및/또는 HMG2 에피토프와 결합할 것이고, 다른 한쪽 팔은 임의의 기타 항원과 결합할 것인 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이중 특이적 항체를 제조하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 전장 이중 특이적 항체의 전통적인 생산 방법은, 2개의 사슬이 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시 발현시키는 것을 바탕으로 한다[Millstein외 다수,1983, Nature, 305:537-539]. 면역 글로불린의 중쇄 및 경쇄의 랜덤한 분류로 인하여, 이와 같은 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 상이한 항체 분자들의 유효한 혼합물(이 중 하나만이 올바른 이중 특이적 구조를 보유함)을 생산한다. 올바른 분자의 정제 방법 즉, 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계들을 통하여 수행되는 정제 방법은 오히려 복잡하며 수율도 낮다. 유사한 방법에 관하여는 문헌[WO 93/08829, 및 Traunecker외 다수, 1991, EMBO J., 10:3655- 3659]에 개시되어 있다. 보다 직접적인 접근법은 디-디아아바디(Di-diabody) 즉, 4가의 이중 특이적 항체를 생산하는 것이다. 이 디-다이아바디를 생산하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다[예를 들어, Lu외 다수, 2003, J Immunol Methods 279:219-32; Marvin외 다수, 2005, Acta Pharmacolical Sinica 26:649 참조].

상이한 접근법에 따라서, 목적으로 하는 결합 특이성을 갖는(항체-항원 결합 위치를 보유하는) 항체 가변 도메인은 면역 글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 부위의 최소한의 일부를 포함하는 면역 글로불린 중쇄 불변 도메인을 통하여 이루어진다. 융합체 중 하나 이상의 부위에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 위치를 포함하는 제1 중쇄 불변부(CH1)를 보유하는 것이 바람직하다. 면역 글로불린 중쇄 융합부와, 원한다면 면역 글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 개별 발현 벡터에 삽입되어, 적당한 숙주 유기체에 공동 형질 감염된다. 이로써, 융합체의 구성에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 비율이 균등하지 않아 최적의 수율을 제공하게 될 때, 본 발명의 구체예에 속하는 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 맞추는데에 있어서 상당한 융통성을 발휘할 수 있게 된다. 그러나, 균등한 비율로 이루어진 2개 이상의 폴리펩티드 사슬이 고 수율로 발현되거나 또는 이와 같은 비율이 그다지 중요하지 않을 때에는, 하나의 발현 벡터 내에 폴리펩티드 사슬 중 2개 또는 이 폴리펩티드 사슬 3개 모두를 암호화하는 서열을 삽입할 수 있다.

이와 같은 접근법의 하나의 구체예에서, 이중 특이적 항체는 한쪽 팔에 제1 결합 특이성(예를 들어, HMG1 및/또는 HMG2 에피토프 예를 들어, A 박스, B 박스)을 보유하는 혼성체 면역 글로불린 중쇄를 포함하며, 다른 쪽 팔에는 혼성체 면역 글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성 제공)을 포함한다. 이중 특이적 분자의 절반 부에만 면역 글로불린 경쇄가 존재함으로 인하여 분리가 용이하게 이루어지므로, 이러한 비대칭적 구조는 원치 않는 면역 글로불린 사슬 조합체로부터 목적으로 하는 이중 특이적 화합물의 분리를 촉진하는 것으로 파악된다. 이러한 접근법에 관하여는 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중 특이적 항체를 생산하는 방법에 관한 보다 상세한 설명은 문헌[예를 들어, Suresh외 다수, 1986, Methods in Enzymology, 121 :210]에 기술되어 있다. WO 96/27011에 개시되어 있는 다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍은 재조합 세포 배양액으로부터 회수되는 이종 이량체의 비율을 최대화시키도록 조작될 수 있다. 바람직한 경계면은 항체 불변 도메인 중 CH3 도메인의 최소한 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자 경계면으로부터 유래된 하나 이상의 소 아미노산 측쇄는 더욱 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기를 갖는 보상(compensatory) "공동(cavity)"은 큰 아미노산 측쇄와 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)을 치환함으로써 제2 항체 분자의 경계면 상에 형성된다. 이로써 기타 원치 않는 최종 생산물 예를 들어, 동종 이량체에 비하여 이종 이량체의 수율을 증가시키는 기작을 제공한다.

이중 특이적 항체는 가교형 또는 "이종 컨쥬게이트(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종 컨쥬게이트 항체 중 어느 하나의 항체는 아비딘과 커플링될 수 있으며, 다른 하나의 항체는 바이오틴과 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원치 않는 세포에 표적화시켜(미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염을 치료하는 것(WO 91/00360, WO 92/200370 및 EP 03089)이라고 제시된 바 있다. 이종 컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교 방법에 의해 생산될 수 있다. 적당한 가교제에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 다수의 가교 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에도 개시되어 있다.

하나 이상의 힌지가 변형되어 2 이상의 가수를 보유하는 본 발명의 항체도 생각할 수 있다. 예를 들어, 삼중 특이적 항체를 생산할 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Tutt외 다수 J. Immunol. 147: 60 (1991)]을 참조하시오.

특히 고려되는 다른 항체들로서는 "올리고클로날" 항체가 있다. 본원에 사용된 "올리고클로날" 항체란 용어는, 개별 모노클로날 항체들의 소정 혼합체를 의미한다. 올리고클로날 항체를 생산하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[PCT 공보 WO 95/20401의 "실시예" 부분, 실시예 1; 미국 특허 제5,789,208호 및 동 제6,335,163호]을 참조하시오. 임의의 구체예에서, 하나 이상의 에피토프에 대한 항체의 소정 혼합체로 이루어진 올리고클로날 항체는 단일 세포 내에서 생산된다. 다른 구체예에서, 올리고클로날 항체는 공통의 경쇄와 쌍을 이룰 수 있는 중쇄를 복수 개 포함하여, 다중 특이성을 갖는 항체를 생산한다(예를 들어, PCT 공보 WO 04/009618). 올리고클로날 항체는 단일의 표적 분자(예를 들어, HMG1) 상에 존재하는 복수 개의 에피토프를 표적화하고자 할 때에 특히 유용하다. 당 업자들은 의도로하는 목적과 바람직한 요구에 부응하는 항체 또는 항체 혼합체의 유형이 무엇인지 알거나 또는 알아낼 수 있을 것이다. 특히, 본 발명의 항체는 면역 글로불린 분자 즉, HMG1 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 위치(예를 들어, 항-HMG1 항체의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR))를 함유하는 분자와 이 면역 글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 포함한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항체는 면역 글로불린 분자 즉, HMG2 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 위치(예를 들어, 항-HMG2 항체의 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR))를 함유하는 분자와 이 면역 글로불린 분자의 면역학적 활성 부분을 포함한다. 본 발명의 면역 글로불린 분자는 임의의 유형의 것(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 군에 속하는 것(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있거나 또는 면역 글로불린 분자의 하위 군에 속하는 것일 수 있다. 면역 글로불린은 중쇄 및 경쇄를 둘 다 보유할 수 있다. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 중쇄의 어레이는 카파 또는 람다 형태의 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 면역 글로불린 분자 즉, 항원 결합 위치를 포함하는 면역 글로불린 분자 및 이 면역 글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편을 포함하며, 이 단편들은 다른 면역 글로불린 도메인 예를 들어, Fc 부위 또는 이의 단편에 융합될 수 있거나 또는 융합될 수 없다. 본원에 개략적으로 기술되어 있는 바와 같이, "항체" 및 "항체들"이란 용어는 본원에 기술된 HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 항체, 전장 항체 및 Fc 부위를 포함하는 이의 Fc 변이체, 또는 이의 단편을 포함하며, 이 항체들에 있어서 본원에 기술된 신규 아미노산 잔기 중 하나 이상은 면역 글로불린의 면역학적으로 활성인 단편에 융합되어 있거나, 또는 본원에 기술된 다른 단백질에 융합되어 있다. 이러한 변이 Fc 융합체로서는 scFv-Fc 융합체, 가변부(예를 들어, V_L 및 V_H)-Fc 융합체, scFv-scFv-Fc 융합체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 면역 글로불린 분자는 임의의 유형의 것(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 군에 속하는 것(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)일 수 있거나 또는 면역 글로불린 분자의 하위 군에 속하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 포유동물(예를 들어, 인간) 내 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)가 5일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 20일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 또는 5개월 이상인 항체를 포함한다. 본 발명의 항체의 포유동물(예를 들어, 인간) 내 반감기가 증가함으로 인하여, 포유동물 내 상기 항체들 또는 항체 단편들의 혈청 역가는 더욱 증가하게 되며, 그 결과, 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 횟수를 줄일 수 있고/있거나, 상기 투여될 항체 및 항체 단편의 농도도 낮출 수 있게 된다. 생체 내 반감기가 증가한 항체는 당 업자에게 공지된 기술에 의하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 생체 내 반감기가 증가한 항체는 Fc 도메인 및 FcRn 수용체 사이의 상호 작용에 관여하는 것으로 확인된 아미노산 잔기를 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)시켜 생산할 수 있다[예를 들어, 국제 특허 공보 WO 97/34631 ; WO 04/029207; 미국 특허 제6,737056호 및 미국 특허 공보 제2003/0190311호 참조; 자세한 사항은 이하에 설명함].

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 변형/치환을 포함할 수 있으며/있거나 Fc 도메인 내에 신규의 아미노산을 포함할 수 있다[예를 들어, Ghetie외 다수, 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan외 다수, 1988, Nature 332:563-564; Lund외 다수, 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund외 다수, 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre외 다수, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins외 다수, 1995, Proc Natl. Acad Sci USA 92:11980-11984; Jefferis외 다수, 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund외 다수, 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis외 다수, 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund외 다수, 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour외 다수, 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie외 다수, 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy외 다수, 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu외 다수, 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie외 다수, 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields외 다수, 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis외 다수, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta외 다수, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); 미국 특허 제5,624,821호; 동 제5,885,573호; 동 제5,677,425호; 동 제6,165,745호; 동 제6,277,375호; 동 제5,869,046호; 동 제6,121,022호; 동 제5,624,821호; 동 제5,648,260호; 동 제6,194,551호; 동 제6,737,056호; 동 제6,821,505호; 동 제6,277,375호;미국 특허 출원 제10/370,749호 및 PCT 공보 WO 94/2935; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919, WO 04/029207 참조]. 기타 Fc 도메인의 변형/치환에 관하여 당 업자는 용이하게 파악할 수 있을 것이다.

변형/치환이 발생하였고/발생하였거나 항체의 Fc 부위에 신규의 아미노산 잔기가 존재하는 본 발명의 항체는 당 업자에게 널리 공지된 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다. 비 제한적 예로서는, (예를 들어, 하이브리도마로부터) 항체 암호화 부위를 분리하는 단계 및 이 분리된 항체 암호화 부위의 Fc 부위 내에 치환을 원하는 바대로 1회 이상 발생시키는 단계를 포함한다. 대안적으로, 본 발명의 항체의 가변부는 1회 이상의 변형/치환이 발생하였고/발생하였거나 신규의 아미노산 잔기가 포함된 Fc 부위를 암호화하는 벡터 내에 서브클로닝될 수 있다.

본 발명의 항체는 또한 글리코실화 방식이 바뀌도록 변형될 수도 있으며, 또한 항체의 하나 이상의 기능적 특성이 바뀌도록 변형될 수도 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 비 글리코실화된 항체(aglycosylated antibody)(즉, 글리코실화되지 않은 항체)가 생산될 수 있다. 글리코실화는 예를 들어, 표적 항원에 대한 항체의 친화성이 증가하도록 변형될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 항체 서열 내에 존재하는 하나 이상의 글리코실화 위치를 변형시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 아미노산이 1회 이상 치환되면, 하나 이상의 가변부 구조틀 글리코실화 위치가 제거되고, 이로써 이 위치에 글리코실화가 일어날 수 없게 된다. 이러한 비 글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법에 관하여는 미국 특허 제5,714,350호 및 동 제6,350,861호에 보다 상세히 기술되어 있다.

부가적 또는 대안적으로, 본 발명의 항체는 글리코실화 방식이 변형되어 생산될 수 있으며, 그 예로서는 푸코실 잔기의 수가 감소된 저 푸코실화 항체(hypofucosylated antibody), 또는 이등분 GlcNAc 구조(bisecting GlcNAc structure)를 보다 많이 보유하는 항체가 있다. 이와 같이 변형된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력이 증가된 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은 예를 들어, 글리코실화 기작이 변형된 숙주 세포 내에서 항체를 발현시킴으로써 이루어질 수 있다. 글리코실화 기작이 변형된 세포에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 본 발명의 재조합 항체를 발현하는 숙주 세포로서 사용되어 글리코실화가 변형되어 발생한 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Shields, R.L.외 다수 (2002) J Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana외 다수 (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 및 유럽 특허 EP 1,176,195; PCT 공보 WO 03/035835; WO 99/54342]을 참조하시오.

이하에 보다 상세히 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명의 항체는 단독으로 사용될 수 있거나 또는 기타 조성물과 함께 사용될 수도 있다. 이 항체는 또한 N- 또는 C-말단에서 이종 폴리펩티드에 재조합적으로 융합될 수 있거나 또는 폴리펩티드나 기타 조성물에 화학적으로 컨쥬게이트화(공유적 및 비 공유적 컨쥬게이트화 포함)될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 검출용 검정법에서 표지로서 유용한 분자 및 효과기 분자 예를 들어, 이종 폴리펩티드, 약물, 방사성 핵종 또는 독소에 재조합적으로 융합될 수 있거나 또는 컨쥬게이트화될 수 있다. 예를 들어, 문헌[PCT 공보 WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EP 396,387]을 참조하시오.

본 발명의 항체는 변형된 유도체 즉, 항체에 임의의 유형의 분자를 공유 결합시켜, 이 공유 결합이 항체가 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합하고/결합하거나 원하는 반응을 유발시키는 것을 방해하지 않도록 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어, (제한적인 것은 아님) 상기 항체의 유도체로서는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페그화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백 분해 절단, 세포 리간드 또는 기타 단백질과의 결합 등에 의하여 변형된 항체를 포함한다. 다수의 화학적 변형법 중 임의의 변형법은 공지의 기술 예를 들어, 특이적 화학 절단법, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신(tunicamycin)의 대사 합성 등에 의해 수행될 수 있다. 뿐만 아니라, 유도체는 하나 이상의 비-전통적 아미노산을 함유할 수 있다. 이하 섹션 5의 "항체의 유도체 및 컨쥬게이트" 편을 참조하시오.

본 발명의 항체는 또한 항체의 교차 반응성에 따라서 기술 또는 특정될 수 있다. 기타 본 발명의 폴리펩티드의 임의의 유사체, 상동 분자체(ortholog) 또는 상동체에 결합하지 않는 항체도 본 발명에 포함된다. 본 발명의 인간 HMG1 폴리펩티드(예를 들어, 인간 HMG1 A 박스 또는 B 박스)와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상 상동성인[당 업계에 공지되었고 본원에 기술된 방법을 이용하여 측정] 폴리펩티드(및 폴리펩티드 단편)와 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 HMG1 단백질의 쥣과 동물, 래트 및/또는 토끼 상동체 및 이와 상응하는 에피토프와 교차 반응한다. 인간 HMG2 폴리펩티드(예를 들어, 인간 HMG2 A 박스 또는 B 박스)와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상 및 50% 이상 상동성인[당 업계에 공지되었고 본원에 기술된 방법을 이용하여 측정] 폴리펩티드(및 폴리펩티드 단편)와 결합하는 항체도 본 발명에 포함된다. 인간 HMG2 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합하는 항체도 인간 HMG1 단백질의 쥣과 동물, 래트 및/또는 토끼 상동체 및 이와 상응하는 에피토프와 교차 반응할 수 있다.

본 발명의 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 이상 및 50% 이상 상동성인[당 업계에 공지되었고 본원에 기술된 방법을 이용하여 측정] 폴리펩티드에 결합하지 않는 항체도 본 발명에 포함된다.

하나의 구체예에서, HMG1 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편은 다음의 것들 중 하나 이상을 방해/길항/억제한다: HMGB1과 RAGE의 결합, HMGB1과 하나 이상의 톨(Toll)-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합, HMGB1과 세포(예를 들어, THP-1 세포) 표면의 결합, 전 염증 시토킨의 HMG1-매개성 방출, HMG1-매개성 염증 반응, HMG1-매개성 부패증, (예를 들어, 관절의) HMG1-매개성 염증 반응, 그리고 HMG1-매개성 관절염. 이와 같은 활성은 당 업계에 공지된 하나 또는 다수의 방법에 의해 검정 될 수 있다. 예를 들어, US20040005316, 미국 특허 제6,468,533호 및 동 제6,448,223호, 그리고 이하 "실시예" 부분을 참조하시오.

"억제 농도 50%"(축약하여 "IC₅₀")이란 용어는, 분자 즉, 억제 인자 표적(예를 들어, HMG1)의 소정 활성을 50% 억제하는데에 필요한 억제 인자(예를 들어, 본 발명의 항체)의 농도를 의미하는 것이다. IC₅₀ 값이 낮다는 것은 억제 인자의 효능이 더욱 우수하다는 것을 의미한다는 사실은 당 업자에 의해 이해될 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 전 염증 시토킨의 HMG1-매개성 방출을 IC₅₀ 5000 ng/㎖ 미만, 또는 4000 ng/㎖ 미만, 또는 3000 ng/㎖ 미만, 또는 2000 ng/㎖ 미만, 또는 1000 ng/㎖ 미만, 또는 500 ng/㎖ 미만, 또는 250 ng/㎖ 미만, 또는 100 ng/㎖ 미만, 또는 50 ng/㎖ 미만, 또는 10 ng/㎖ 미만, 또는 5 ng/㎖ 미만으로 억제한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 전 염증 시토킨의 HMG1-매개성 방출을 IC₅₀ 1000 nM 미만, 또는 500 nM 미만, 또는 250 nM 미만, 또는 100 nM 미만, 또는 50 nM 미만, 또는 25 nM 미만, 또는 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만, 또는 0.25 nM 미만, 또는 0.1 nM 미만, 또는 0.01 nM 미만으로 억제한다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 RAGE의 결합을 방해/길항/억제하지만, 실질적으로는 HMG1과 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합에 영향을 미치지 않는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1이 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)와 결합하는 것을 방해/길항/억제하지만, 실질적으로는 HMG1과 RAGE의 결합에 영향을 미치지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 RAGE의 결합을 방해/길항/억제하고, HMG1과 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합도 억제한다. 이러한 활성은 당 업계에 공지된 하나 또는 다수의 방법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, US20040005316, 미국 특허 제6,468,533호 및 동 제6,448,223호, 그리고 이하 "실시예" 부분을 참조하시오.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 RAGE의 결합을 약 10% 이상, 또는 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 100%까지 억제한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합을 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100%까지 억제한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 RAGE의 결합을 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 까지 억제한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1과 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합을 10% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상, 또는 100% 까지 억제한다.

본원에 기술된 바와 같이, 항체는 상이한 공급원으로부터 분리된 동일한 폴리펩티드들을 구별할 수 있다. 어떠한 특정 이론에 국한되지 않았을 때, 상이한 공급원으로부터 분리된 유사하거나 또는 동일한 아미노산 서열의 폴리펩티드는 다수의 차이점 예를 들어, 번역 후 변형(예를 들어, 인산화, 아세틸화, 메틸화, 글리코실화 등), 전체 구조의 변화(예를 들어, 이황화 결합 및/또는 폴딩의 변화), 그리고 폴리펩티드가 결합할 수 있는 기타 임의의 분자(예를 들어, 염, 부가 서브유닛 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 및/또는 기타 폴리펩티드) 간 차이에 의해 구별될 수 있는 것이다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 (예를 들어, 포유동물 세포 또는 조직으로부터 분리된) 천연 HMG1과 동일하거나 또는 이보다 더 높은 친화도로 이.콜라이 내에서 재조합적으로 생산된 HMG1과 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 이.콜라이 내에서 생산된 재조합 HMG1과 동일하거나 또는 이 보다 더 높은 친화도로 (예를 들어, 포유동물 세포 또는 조직으로부터 분리된) 천연 HMG1과 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 천연 HMG1 예를 들어, (예를 들어, 해동에 의해 세포로부터 분리된) 핵 내 HMG1, (예를 들어, 과사적 세포의 상청액으로부터 분리된) 방출형 HMG1 및 (예를 들어, 자극된 세포 예를 들어, LPS 자극 세포로부터 분리된) 활성화 HMG1의 하나 이상의 형태와 결합할 것이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 천연 HMG1 예를 들어, (예를 들어, 해동에 의해 세포로부터 분리된) 핵 내 HMG1, (예를 들어, 과사적 세포의 상청액으로부터 분리된) 방출형 HMG1 및 (예를 들어, 자극된 세포 예를 들어, LPS 자극 세포로부터 분리된) 활성화 HMG1의 하나 이상의 형태와 결합할 것이다. 천연의 그리고 재조합 HMG1을 생산하는 구체적인 방법에 관하여는 본원에 기술되어 있다(이하, 실시예 2 참조).

하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 가용성 HMG1 및/또는 HMG2와 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 고정된 HMG1 및/또는 HMG2와 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 가용성 및 불용성 HMG1 및/또는 HMG2와 특이적으로 결합한다.

전술한 바와 같이, HMG1 및 HMG2는 폴리뉴클레오티드(즉, DNA 및 RNA) 결합 단백질인 것으로 공지되어 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1 및/또는 HMG2와 결합하는데, 여기서 상기 HMG1 및/또는 HMG2는 폴리뉴클레오티드 분자와 결합되어 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 다음의 경우 중 하나 이상을 방해/길항/억제한다: HMGB1과 RAGE의 결합, HMGB1과 하나 이상의 톨-유사 수용체(예를 들어, TLR2 및 TLR4)의 결합, HMGB1과 세포(예를 들어, THP-1 세포) 표면의 결합, 전 염증 시토킨의 HMG1-매개성 방출, HMG1-매개성 염증 반응, HMG1-매개성 부패증, (예를 들어, 관절의) HMG1-매개성 염증 반응, 그리고 HMG1-매개성 관절염[여기서, 상기 HMG1은 폴리뉴클레오티드에 결합되어 있음]. 특정 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염증 반응을 촉진하는 분자이다(예를 들어, 미생물 또는 괴사적 세포로부터 유래된 폴리뉴클레오티드).

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 아세틸화된 HMG1과, 아세틸화되지 않은 HMG1보다 높은 친화도로 결합한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 아세틸화된 HMG1보다 높은 친화도로, 아세틸화되지 않은 HMG1과 결합한다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 실질적으로 동일한 친화도로, 아세틸화된 HMG1 및 아세틸화되지 않은 HMG1 둘 다와 결합하는 것을 막는다.

다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 또는 기타 동물 예를 들어, 포유동물 및 무척추동물의 HMG1 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG1 폴리펩티드(서열 번호 1 또는 서열 번호 2)를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 HMG1 폴리펩티드에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, US20040005316, 미국 특허 제6,468,533호 및 동 제6,448,223호].

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG1 폴리펩티드인 서열 번호 1 또는 서열 번호 2와 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 HMG1 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG1 A 박스 폴리펩티드인 서열 번호 3과 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG1 B 박스 폴리펩티드인 서열 번호 4 및/또는 서열 번호 28 및/또는 서열 번호 29와 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 또는 기타 동물 예를 들어, 포유동물 및 무척추 동물의 HMG2 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 임의의 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG2 폴리펩티드(서열 번호 21)을 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다. 인간 및 기타 동물의 HMG2 폴리펩티드에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Jantzen외 다수, 1990, Nature 344:830-6; Kolodrubetz 1990, Nucleic Acids Res. 18:5565; Laudet외 다수, 1993, Nucleic Acids Res. 21:2493-501 and Thomas외 다수, 2001, Trends Biochem Sci 26 : 167-74]을 참조하시오.

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG2 폴리펩티드인 서열 번호 21과 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 HMG2 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG2 A 박스 폴리펩티드인 서열 번호 22와 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체는 인간 HMG2 B 박스 폴리펩티드인 서열 번호 23과 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상, 또는 99% 이상, 또는 100% 상동성인 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진(또는 필수적으로 이루어진) 폴리펩티드와 특이적으로 결합한다.

2개의 아미노산 서열(또는 2개의 핵산 서열)의 상동성 %는 예를 들어, 최적 비교용으로 서열을 정렬함으로써(예를 들어, 제1 서열의 서열에 갭을 도입하여 정렬함으로써) 측정될 수 있다. 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 또는 뉴클레오티드는 이후 비교되며, 이 2개의 서열 간 상동성 %는 서열이 공유하는 동일한 위치의 수에 관한 함수이다[즉, 상동성 % = (동일한 위치의 수/위치의 총수)×100]. 2개 서열의 비교는 실제로 널리 공지된 방법 예를 들어, 수학적 알고리즘을 사용하는 방법에 의하여 수행될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘에 관한 특정의 비-제한적 예에 관하여는 문헌[Karlin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993)]에 기술되어 있다. 이러한 알고리즘은 문헌[Schaffer외 다수, Nucleic Acids Res., 29:2994-3005 (2001)]에 기술된 바와 같이 BLASTN 및 BLASTX 프로그램(2.2 버젼)에 적용된다. BLAST 및 갭 형성 BLAST(Gapped BLAST) 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램(예를 들어, BLASTN)의 디폴트 매개 변수가 사용될 수 있다. 웹 사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov(2002년 4월 10일자로 입수 가능)를 참조하시오. 하나의 구체예에서, 검색된 데이터베이스는 예측 불가능한(non-redundant; NR) 데이터베이스로서, 서열 비교용 매개 변수는 다음과 같이 설정된다: 무 필터링; 기대치 = 10; 글자 크기 = 3; 매트릭스는 BLOSUM62; 그리고 갭 코스트(Gap Cost)는 실존시 = 11 및 연장시 = 1.

뿐만 아니라, 서열 비교에 사용된 수학적 알고리즘의 비 제한적인 예로서는 마이어스 및 밀러의 알고리즘인 CABIOS(1989)가 있다. 이 알고리즘은 ALIGN 프로그램(2.0 버젼)에 적용되며, 이 프로그램은 GCG(Accelrys) 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부이다. 아미노산 서열을 비교하는데에 ALIGN 프로그램을 사용할 경우, PAM 120 가중치 잔기 표(weight residue table), 갭 길이 패널티(12) 그리고 갭 패널티(4)를 적용할 수 있다. 서열 분석용인 부가의 알고리즘에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 그 예로서는 ADVANCE 및 ADAM[Torellis and Robotti, Comput. Appl. Biosci., 10: 3-5 (1994)]; 및 FASTA[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85: 2444-8 (1988)]를 포함한다.

다른 구체예에서, 2개의 아미노산 서열 간 상동성 %는 Blossom 63 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 이용하고, 갭 가중치 = 12, 10, 8, 6 또는 4이며, 길이 가중치 = 2, 3 또는 4인, GCG 소프트웨어 패키지 중 GAP 프로그램(http://www.accelrys.com, 2001년 8월 31일자로 입수 가능)을 이용하여 구할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 2개의 핵산 서열 간 상동성 %는 갭 가중치가 50이고 길이 가중치가 3인, GCG 소프트웨어 패키지 중 GAP 프로그램(http://www.cgc.com에서 입수 가능)을 이용하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 다른 구체예로서는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 해리 상수 즉, K_d(K_off/on)가 10^-5M 미만, 또는 10^-6M 미만, 또는 10^-7M 미만, 또는 10^-8M 미만, 또는 10^-9M 미만, 또는 10^-10M 미만, 또는 10^-11M 미만, 또는 10^-12M 미만, 또는 10^-13M 미만, 또는 5×10^-13M 미만, 또는 10^-14M 미만, 5×1O^-14M 미만, 또는 10^-15M 미만, 또는 5×10^-15M로 특이적으로 결합하는 항체가 있다. 또 다른 구체예에서, HMG1 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 해리 상수 즉, K_d(K_off/on)는, 약 10^-7∼10^-8M, 약 10^-8∼10^-9M, 약 10^-9∼10^-10M, 약 10^-10∼10^-11M, 약 10^-11∼10^-12M, 약 10^-12∼10^-13M, 약 10^-13∼10^-14M이다. 또 다른 구체예에서, HMG1 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 해리 상수 즉, K_d(K_off _/ _on)는, 10^-7∼10^-8M, 10^-8∼10^-9M, 10^-9∼10^-10M, 10^-10∼10^-11M, 10^-11∼10^-12M, 10^-12∼10^-13M, 10^-13∼10^-14M이다.

본 발명의 다른 구체예로서는 HMG2 및 이의 항원성 단편과 해리 상수 즉, K_d(K_off/on)가 10^-5M 미만, 또는 10^-6M 미만, 또는 10^-7M 미만, 또는 10^-8M 미만, 또는 10^-9M 미만, 또는 10^-10M 미만, 또는 10^-11M 미만, 또는 10^-12M 미만, 또는 10^-13M 미만, 또는 5×10^-13M 미만, 또는 10^-14M 미만, 5×1O^-14M 미만, 또는 10^-15M 미만, 또는 5×10^-15M로 특이적으로 결합하는 항체가 있다. 또 다른 구체예에서, HMG2 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체의 해리 상수 즉, K_d(K_off/on)는, 약 10^-7∼10^-8M, 약 10^-8∼10^-9M, 약 10^-9∼10^-10M, 약 10^-10∼10^-11M, 약 10^-11∼10^-12M, 약 10^-12∼10^-13M, 약 10^-13∼10^-14M이다. 또 다른 구체예에서, HMG2 및 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 해리 상수 즉, K_d(K_off/on)는, 10^-7∼10^-8M, 10^-8∼10^-9M, 10^-9∼10^-10M, 10^-10∼10^-11M, 10^-11∼10^-12M, 10^-12∼10^-13M, 10^-13∼10^-14M이다.

평형 해리 상수(K_d)가 K_off _/ _on로서 정의된다는 사실은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로 K_d가 낮은(즉, 친화성이 큰) 결합 분자(예를 들어, 항체)는 K_d가 높은(즉, 친화성이 작은) 결합 분자(예를 들어, 항체)와 결합하는 것이 바람직한 것으로 생각된다. 그러나, 몇몇 경우 K_on 또는 K_off 값은 K_d값보다 더욱 적절할 수 있다. 당 업자는 어떤 동력학적 매개 변수가 소정의 항체 사용시 가장 중요한지를 알 수 있다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 항체는 어느 항원에 대한 K_d가 가 다른 항원에 대한 K_d에 비하여 낮다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 K_off가 1×10^-3s^-1 미만, 또는 3×10^-3s^-1 미만으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 K_off가 10^-3s^-1 미만, 5xlO^-3s^-1 미만, 10^-4s^-1 미만, 5xlO^-4s^-1 미만, 10^-5s^-1 미만, 5xlO^-5s^-1 미만, 10^-6s^-1 미만, 5xlO^-6s^-1 미만, 10^-7s^-1 미만, 5xlO^-7s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5xlO^-8s^-1 미만, 10^-9s^-1 미만, 5xlO^-9s^-1 미만 또는 10^-10s^-1 미만으로 결합한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG2 및 이의 항원성 단편과 K_off가 1×10^-3s^-1 미만, 또는 3×10^-3s^-1 미만으로 결합한다. 다른 구체예에서, 항체는 HMG2 및 이의 항원성 단편과 K_off가 10^-3s^-1 미만, 5xlO^-3s^-1 미만, 10^-4s^-1 미만, 5XlO^-4s^-1 미만, 10^-5s^-1 미만, 5xlO^-5s^-1 미만, 10^-6s^-1 미만, 5xlO^-6s^-1 미만, 10^-7s^-1 미만, 5xlO^-7s^-1 미만, 10^-8s^-1 미만, 5xlO^-8s^-1 미만, 10^-9s^-1 미만, 5xlO^-9s^-1 미만 또는 10^-10s^-1 미만으로 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 HMG1 및 이의 항원성 단편과 결합 속도 상수(association rate constant) 즉, K_on 속도가 10⁵ M^-1s^-1 이상, 5×10⁵ M^-1s^-1 이상, 10⁶ M^-1s^-1 이상, 5×10⁶ M^-1s^-1 이상, 10⁷ M^-1s^-1 이상, 5×10⁷ M^-1s^-1 또는 10⁸ M^-1s^-1 이상, 또는 10⁹ M^-1s^-1 이상으로 결합한다.

모든 폴리펩티드와 마찬가지로 항체는, 일반적으로 폴리펩티드의 순 전하량(net charge)이 0인 때의 pH로서 정의되는 등전점(pI)을 갖는다. 단백질 용해도는 통상적으로 용액의 pH가 단백질의 등전점(pI)과 같을 때 가장 낮다고 당 업계에 알려져 있다. 본원에 사용된 pI 값은 우세한 전하 형태의 pI로서 정의한다. 단백질의 pI는 다양한 방법 예를 들어, 등전초법 및 다수의 컴퓨터 알고리즘에 의하여 측정될 수 있다[예를 들어, Bjellqvist외 다수, 1993, Electrophoresis 14:1023]. 뿐만 아니라, 항체의 Fab 도메인의 열 용융점(Tm)은 항체의 열 안정성에 대한 훌륭한 지표가 될 수 있으며, 또한 저장 수명(shelf-life)에 대한 지표도 될 수 있다. Tm이 낮다는 것은 보다 응집성이 크고/안정성이 떨어진다는 의미이며, 반면에 Tm이 높다는 것은 응집성이 떨어지고/안정성이 크다는 것을 의미한다. 그러므로, 임의의 구체예에서, Tm이 높은 항체가 바람직하다. 단백질 도메인(예를 들어, Fab 도메인)의 Tm은 당 업계에 공지된 임의의 표준적인 방법 예를 들어, 시차 주사 열량계를 이용하는 방법을 통하여 측정될 수 있다[예를 들어, Vermeer외 다수, 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer외 다수, 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154 참조].

그러므로, 본 발명의 배타적이지 않은, 즉, 부가적인 구체예는, 임의의 바람직한 생화학적 특성 예를 들어, 특정 등전점(pI) 또는 특정 용융 온도(Tm)를 보유하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다.

더욱 구체적으로, 하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 5.5∼9.5이다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 약 5.5∼약 6.0, 또는 약 6.0∼약 6.5, 또는 약 6.5∼약 7.0, 또는 약 7.0∼약 7.5, 또는 약 7.5∼약 8.O, 또는 약 8.0∼약 8.5, 또는 약 8.5∼약 9.0, 또는 약 9.0∼약 9.5이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 5.5∼6.0, 또는 6.0∼6.5, 또는 6.5∼7.0, 또는 7.0∼7.5, 또는 7.5∼8.0, 또는 8.0-8.5, 또는 8.5∼ 9.0, 또는 9.0∼9.5이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 5.5 이상, 또는 6.0 이상, 또는 6.3 이상, 또는 6.5 이상, 또는 6.7 이상, 또는 6.9 이상, 또는 7.1 이상, 또는 7.3 이상, 또는 7.5 이상, 또는 7.7 이상, 또는 7.9 이상, 또는 8.1 이상, 또는 8.3 이상, 또는 8.5 이상, 또는 8.7 이상, 또는 8.9 이상, 또는 9.1 이상, 또는 9.3 이상, 또는 9.5 이상이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 pI는 약 5.5 이상, 또는 약 6.0 이상, 또는 약 6.3 이상, 또는 약 6.5 이상, 또는 약 6.7 이상, 또는 약 6.9 이상, 또는 약 7.1 이상, 또는 약 7.3 이상, 또는 약 7.5 이상, 또는 약 7.7 이상, 또는 약 7.9 이상, 또는 약 8.1 이상, 또는 약 8.3 이상, 또는 약 8.5 이상, 또는 약 8.7 이상, 또는 약 8.9 이상, 또는 약 9.1 이상, 또는 약 9.3 이상, 또는 약 9.5 이상이다.

pI를 맞추기 위해, 항체 내 이온화 가능한 잔기 들의 수와 위치를 바꿈으로써 용해도를 최적화할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 pI는 아미노산을 적절히 치환(예를 들어, 하전된 아미노산 예를 들어, 리신을 하전되지 않은 잔기 예를 들어, 알라닌으로 치환)시켜 조절할 수 있다. 어떠한 이론에도 국한되지 않을 경우, 상기 항체의 pI가 변화한 항체를 아미노산 치환하면 항체의 용해도 및/또는 안정성을 개선할 수 있다. 당 업자는 원하는 pI를 얻기 위해 특정 항체에 가장 적절한 아미노산 치환이 무엇인지 알 것이다. 하나의 구체예에서, pI를 변화시키기 위한 치환은 일반적으로 본 발명의 항체 내에서 유발된다. FcγR(전술함)과의 결합을 변형시키는 Fc 부위의 치환은 또한 pI도 변화시킬 수 있는 것으로 생각된다. 다른 구체예에서, Fc 부위의 치환은 특히 FcγR 결합을 의도하는 바와 같이 변형시키고 pI를 목적으로 하는 수준으로 만드는 것으로 선택하여 수행된다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 65∼120℃이다. 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 약 75∼약 12O℃, 또는 약 75∼약 85℃, 또는 약 85∼약 95℃, 또는 약 95∼약 105℃, 또는 약 105∼약 115℃, 또는 약 115∼약 120℃이다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 75∼120℃, 또는 75∼85℃, 또는 85∼95℃, 또는 95∼105℃, 또는 105∼115℃, 또는 115∼120℃이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 약 65℃ 이상, 또는 약 7O℃ 이상, 또는 약 75℃ 이상, 또는 약 80℃ 이상, 또는 약 85℃ 이상, 또는 약 90℃ 이상, 또는 약 95℃ 이상, 또는 약 100℃ 이상, 또는 약 105℃ 이상, 또는 약 110℃ 이상, 또는 약 115℃ 이상, 또는 약 120℃ 이상이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체의 Tm은 65℃ 이상, 또는 70℃ 이상, 또는 75℃ 이상, 또는 80℃ 이상, 또는 85℃ 이상, 또는 90℃ 이상, 또는 95℃ 이상, 또는 100℃ 이상, 또는 105℃ 이상, 또는 11O℃ 이상, 또는 115℃ 이상, 또는 120℃이다.

특정 구체예에서, 본 발명의 고 친화성 항체 또는 이의 단편은 인간의 항체 또는 인간화된 항체이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 또한 고 친화도로 HMG1과 특이적으로 결합하는 특정 항체(및 이의 단편)을 포함하기도 한다. 특히, 본원에서 "S2", "S4", "S 16" 및 "G4"라고 칭하여지는 항-HMG1 항체는 각각 미국 모식균 배양 수집소(ATCC, 버지니아 20110-2209 매너사 10801 유니버시티 불레바드 소재)에 ATCC 기탁 번호 PTA-6142, PTA-6143, PTA-6259 및 PTA-6258로 각각 기탁되어 있다. 상기 기탁물들은 특허 절차용인 미생물의 국제 기탁에 관한 부다페스트 조약의 조건하에 유지될 것이다. 상기 언급된 기탁물들은 부다페스트 조약의 조건하에 유지되고 있으므로, 부다페스트 조약에 입각하여 특허청에 서명한 자가 입수 가능할 것이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 개시된 가변부 중 하나 이상을 포함하는 HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73).

본 발명은 또한 경쇄 가변부(V_L) 도메인 및/또는 중쇄 가변부(V_H) 도메인에 존재하는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 치환된 변이체인 G2, GA, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)을 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 V_L CDR 및/또는 하나 이상의 V_H CDR에 부가적으로 아미노산 잔기가 하나 이상 치환된 변이체인 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)을 포함한다. V_H 도메인, V_H CDR, V_L 도메인 및/또는 V_L CDR에 치환이 발생하여 생산된 항체인 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)은 시험관 내 및 생체 내에서 예를 들어, HMG1 및/또는 HMG2에 결합하는 능력에 대하여 시험될 수 있거나(예를 들어, 면역 검정법 예를 들어, ELISA 및 BIAcore), 또는 HMG1-유도성 시토킨 방출을 억제하고, 염증성 질환 또는 이로 인한 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 경감하는 능력에 대하여 시험될 수 있다.

본원에 언급된 상보성 결정 부위(CDR)의 잔기 번호들은 문헌[Kabat외 다수 (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, 버지니아주 스프링필드)]에 따라 메겨진다. 특히, 경쇄 가변 도메인 내 24∼34번 잔기(CDR1), 50∼56번 잔기(CDR2) 및 89∼97번 잔기(CDR3)와, 중쇄 가변 도메인 내 31∼35번 잔기(CDR1), 50∼65번 잔기(CDR2) 및 95∼102번 잔기(CDR3)와 같이 번호가 메겨진다. CDR은 항체와 항체 간에 상당히 상이하다는 점(그리고 Kabat 공통 서열과의 상동성이 없다는 점)에 주목하여야 할 것이다. Fv 부위에 대하여 사용될 구조틀 잔기를 최대로 정렬할 경우에는 종종 계수 체계에 "스페이서"라고 하는 잔기들을 삽입하여야 한다. 본원에 언급된 CDR은 Kabat외 다수(상동)에 의한 것이라는 사실을 이해할 것이다. 뿐만 아니라, 임의의 특정 Kabat 위치 번호에 존재하는 특정 잔기의 상동성은 종간 다양성 또는 대립 형질간 다양성으로 인하여 항체 사슬과 항체 사슬 간에 다양할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본원에 개시된 CDR을 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상 보유하는 항체를 포함한다(도 2a∼2j, 밑줄쳐 표시한 CDR 참조). 또 다른 구체예에서, 본 발명은 표 3에 나열된 V_H CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지며/가지거나 표 3에 나열된 항체 중쇄 가변부 중 임의의 것의 중쇄 가변부로부터 유래된 V_H CDR을 포함하며, HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 본 발명은 표 3에 나열된 V_L CDR 중 임의의 것의 아미노산 서열을 가지며/가지거나 표 3에 나열된 항체 경쇄 가변부 중 임의의 것의 경쇄 가변부로부터 유래된 V_L CDR을 포함하며, HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다.

본 발명은 본원에서 HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합한다고 기술되어 있는 V_H 도메인, V_H CDR, V_L 도메인 또는 V_L CDR의 유도체를 포함하며, HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 당 업자에게 공지된 표준적 기술은 본 발명의 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 돌연 변이(예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)를 도입하는데에 사용될 수 있는데, 이때 사용되는 표준적 기술로서는 아미노산을 치환하는데에 주로 사용되는 위치-배향 돌연변이 유발법 및 PCR-매개 돌연변이 유발법이 있다. 하나의 구체예에서, V_H 및/또는 V_L CDR 유도체는 원래 V_H 및/또는 V_L CDR에 비하여, 25개 미만의 아미노산 치환, 20개 미만의 아미노산 치환, 15개 미만의 아미노산 치환, 10개 미만의 아미노산 치환, 5개 미만의 아미노산 치환, 4개 미만의 아미노산 치환, 3개 미만의 아미노산 치환, 또는 2개 미만의 아미노산 치환을 포함한다. 다른 구체예에서, V_H 및/또는 V_L CDR 유도체에는 하나 이상의 예측 불필수 아미노산 잔기(즉, 항체가 HMG1 및/또는 HMG2에 특이적으로 결합하는 데에 있어서 중요하지 않은 아미노산 잔기) 위치에 보존적 아미노산 치환(예를 들어, 상동)이 일어난다. 대안적으로, 돌연변이는 V_H 및/또는 V_L CDR 암호화 서열의 전부 또는 일부에 거쳐서 예를 들어, 포화 돌연변이 유발법에 의해 랜덤하게 발생할 수 있으며, 결과로 생성된 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위하여 생물 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이를 유발시킨 후, 암호화된 항체를 발현시켜 이 항체의 활성을 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체는 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 중쇄 가변부 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열과 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 중쇄 가변부 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체는 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 중쇄 가변부 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열과 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 중쇄 가변부 및/또는 경쇄 가변부의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체 또는 항체 단편은 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열과 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체 또는 항체 단편은 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열과 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 99% 이상 상동성인 하나 이상의 CDR의 아미노산 서열을 포함한다. 2개의 아미노산 서열 간 상동성 %는 당 업자에게 공지된 임의의 방법 예를 들어, BLAST 단백질 검색법에 의하여 측정될 수 있다.

본 발명은 또한 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체는 엄중한 조건 하에서 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 다른 구체예에서, 본 발명은 HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는데, 이 항체는 엄중한 조건 하에서 G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11(도 2a∼2j, 서열 번호 5∼20, 24∼27 및 30∼73)의 하나 이상의 CDR의 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는, 하나 이상의 CDR을 포함한다. 엄중한 혼성화 조건으로서는, 약 45℃의 6×염화나트륨/구연산나트륨(SSC) 중에서 필터-결합 DNA에 혼성화시킨 후, 약 50∼65℃의 0.2 × SSC/0.1% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것; 약 45℃의 6×SSC 중에서 필터-결합 DNA에 혼성화시킨 후, 약 60℃의 0.1 × SSC/0.2% SDS 중에서 1회 이상 세척하는 것(고도로 엄중한 혼성화); 또는 당 업자에게 공지된 기타 임의의 엄중 혼성화 조건을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[예를 들어, Ausubel, F.M.외 다수, eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol.1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY, pages 6.3.1∼6.3.6 및 2.10.3 참조].

기탁된 항체의 CDR을 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 6개 전부 보유하는 항체는 본 발명의 특정 구체예에 해당한다. 이러한 항체(및 이의 단편)를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 특정 구체예에 해당한다. 본 발명의 "S2", "S4", "S16" 및 "G4", 그리고 기타 몇몇 특정 항-HMG1 항체의 결합 특성 및 기능적 특성에 관하여는 이하 표 1a∼1b에 나열하였다.

[상기 표 1a∼1b에 있어서,

a는 그 결과가 아직 얻어지지 않았는데, 이는 곧, 검정 되지 않았거나 또는 아직 측정되지 않았음을 의미함.

b는 재조합 HMG1을 사용하여 BIAcore 분석법을 통해 측정된 값으로서(실시예 부분의 "실시예 1" 참조), E11과 S12에 대한 K_d 값은 아직 측정되지 않았음에 주의할 것.

c는 등전 초점 겔 전기 영동법에 의해 측정된 값임(실시예 부분의 "실시예 1" 참조).

d는 시차 주사 열량계로써 측정된 값임(실시예 부분의 "실시예 1" 참조).

f는 mMφ와 TLR4에 있어서는 상대적 억제율을, 그리고 Thp-1 결합에 있어서는 IC₅₀(nM)을 나타냄(실시예 부분의 "실시예 4" 참조).

g는 재조합 HMG1을 사용하여 시토킨 방출 억제 분석법에 의해 측정된 값으로서(실시예 부분의 "실시예 3" 참조), IL-6에 대한 IC₅₀ 값은 nM 단위로 나타내었으며, 나머지는 ng/㎖ 단위로 나타냄.

h는 동 기준 표본형 대조구를 제외하고 계산한 보호%를 나타냄(실시예 부분의 "실시예 5∼11" 참조).]

본 발명의 다른 구체예는 전술한 바와 같은, 목적 항-HMG1 항체의 임의의 부분에 보존적 아미노산 치환을 도입시키는 것을 포함한다(표 1 참조). "보존적 아미노산 치환"이란, 기능상 동등한 아미노산을 치환하는 아미노산 치환을 의미한다는 사실은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 아미노산을 보존적으로 변화시키면, 결과로 생성되는 펩티드의 아미노산 서열에 침묵 변이가 발생하게 된다. 예를 들어, 유사한 극성을 갖는 하나 이상의 아미노산은 기능상 균등체로서의 역할을 하며, 이로써 이 펩티드의 아미노산 서열 내에 침묵 변이가 일어나게 되는 것이다. 잔기들이 상이한 군에 속할지라도, 전하가 0이고, (예를 들어, 페닐알라닌을 이보다 작은 이소루신으로 치환시키는 것과 같이) 더욱 작은 잔기로 치환되는 치환도 또한 "보존적 치환"으로 간주될 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 군에 관하여는 당 업계에 정의되어 있다. 보존적 아미노산 치환의 몇몇 군들을 이하 표 2에 나타내었다.

보존적 아미노산 치환군
군	아미노산
비극성	Trp, Phe, Met, Leu, Ile, Val, Ala, Pro
비하전 극성	Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys
산성/음 하전	Asp, Glu
염기성/양 하전	Arg, Lys, His
베타-분지형	Thr, Val, Ile
사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기	Gly, Pro
방향성	Trp, Tyr, Phe, His

"보존적 아미노산 치환"이란 용어는 또한 아미노산 유사체 또는 변이체를 사용하는 경우를 의미하기도 한다. 아미노산 치환에 의한 표현형이 발현되지 않도록 만드는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie외 다수, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," (1990, Science 247:1306-1310)]에 제시되어 있다.

2. 본 발명의 항체를 생산 및 스크리닝하는 방법

HMG1 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체 또는 이의 단편은 예를 들어, 면역 검정법, BIAcore 또는 기타 당 업자에게 공지된 방법에 의하여 확인될 수 있다.

본 발명의 항체는 당 업계에 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 생산될 수 있다. 목적 항원에 대한 폴리클로날 항체는 당 업계에 널리 공지된 다수의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HMG1 폴리펩티드는 다양한 숙주 동물 예를 들어, 토끼, 마우스 및 래트 등에 투여되어, 이 항원에 특이적인 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청을 생산시킬 수 있다. 다양한 애쥬반트 예를 들어, 프룬트(완전 및 불완전) 애쥬반트, 무기 겔 예를 들어, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질 예를 들어, 리소레시틴, 플루론산 폴리올, 다가 음이온, 펩티드, 오일 유액, 키홀 림펫헤모시아닌, 디니트로페놀 및 잠재적으로 유효한 인간 애쥬반트 예를 들어, BCG(바실레 칼메트-구에린; Bacille Calmette-Guerin) 및 코린박테리움 파르븀(Corynebacterium parvum)이 숙주의 종류에 따라서 면역 반응을 증가시키는데에 사용될 수 있다. 이러한 애쥬반트에 관하여도 당 업계에 널리 공지되어 있다.

모노클로날 항체는 당 업계에 공지된 다양한 기술 예를 들어, 하이브리도마를 사용하는 방법, 재조합체를 사용하는 방법 및 파지 디스플레이 기술 또는 이들의 병행법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당 업계에 공지된 기술 및 예를 들어, 문헌[Harlow외 다수, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling,외 다수, : Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 교시된 기술을 비롯한 하이브리도마 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 "모노클로날 항체"란 용어는, 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에만 국한되는 것은 아니다. "모노클로날 항체"란 용어는, 항체 생산 방법에 의해서 생산되는 것이 아닌, 임의의 진핵 생물, 원핵 생물 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유래하는 항체를 의미하는 것이다.

"모노클로날 항체"는 2개의 단백질 즉, 중쇄 및 경쇄를 포함하거나, 또는 이로써 이루어진 것일 수 있다.

하이브리도마 기술을 이용하여 특정 항체를 생산 및 스크리닝하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 통상적으로 행하여지고 있다. 비-제한적 예에 있어서, 마우스는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이 펩티드를 발현하는 세포에 의해 면역화될 수 있다. 예를 들어, 항원에 특이적인 항체가 마우스 혈청 중에서 검출되는 것과 같이 일단 면역 반응이 확인되면, 마우스 비장을 수집하여 비장 세포를 분리한다. 이후 비장 세포를 널리 공지된 기술에 의해 임의의 적당한 골수종 세포 예를 들어, ATCC로부터 입수 가능한 세포주인 SP20의 세포에 융합한다. 하이브리도마를 선택하여 이를 제한된 희석법에 의해 클로닝한다. 이후 당 업계에 공지된 방법에 의해 하이브리도마 클론이, 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포인지 여부에 대해 검정한다. 일반적으로 고 수준의 항체를 함유하는 복수액은 양성 하이브리도마 클론으로 마우스를 면역화시켜 얻을 수 있다.

그러므로, 본 발명은, 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양한 후[바람직하게, 상기 하이브리도마는 본 발명의 항원으로 면역화한 마우스로부 터 분리된 비장 세포와 골수종 세포를 융합시켜 생산됨], 상기 융합 과정에 의해 생산된 하이브리도마를 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하는, 모노클로날 항체를 생산하는 방법과, 이 방법에 의하여 생산된 항체를 제공한다.

특이적 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 효소 예를 들어, 파페인(Fab 단편 생산) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생산)을 이용하여 면역 글로불린 분자를 단백 분해함으로써 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변부, 경쇄 불변부 및 중쇄의 CH1 도메인을 함유한다.

본 발명의 항체는 또한 당 업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이법을 이용하여 생산될 수 있다. 파지 디스플레이법에 있어서, 기능성 항체 도메인은 이 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 운반하는 파지 입자 표면에 디스플레이된다. 특정 구체예에서, 이러한 파지는 보관용 항체 라이브러리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 인간 또는 쥣과 동물)로부터 발현되는 항원-결합 도메인을 디스플레이하는데에 사용될 수 있다. 목적 항원과 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 예를 들어, 표지화된 항원 또는 고체 표면이나 비드에 결합 또는 포획된 항원과 같은 항원을 이용하여 선택 또는 동정될 수 있다. 이 방법에 사용되는 파지는 통상적으로 사상 파지로서 예를 들어, 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합 융합된 이황화물 안정화 Fv 항체 도메인, Fv 또는 Fab와 함께 파지로부터 발현되는 fd 및 M13 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 항체를 생산하는데에 사용될 수 있는 파지 디스플레이법의 예로서는 문헌[Brinkman외 다수, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames외 다수, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough외 다수, Eur. J. Immunol 24:952-958 (1994); Persic외 다수, Gene 187 9-18 (1997); Burton외 다수, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원 PCT/GB91/01134; PCT 공보 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허 제5,698,426호; 동 제5,223,409호; 동 제5,403,484호; 동 제5,580,717호; 동 제5,427,908호; 동 제5,750,753호; 동 제5,821,047호; 동 제5,571,698호; 동 제5,427,908호; 동 제5,516,637호; 동 제5,780,225호; 동 제5,658,727호; 동 제5,733,743호 및 동 제5,969,108호]에 개시된 방법들을 포함한다.

상기 참고 문헌에 기술된 바와 같이, 파지 선별 이후, 파지로부터 유래하는 항체 암호화 부위는 분리되어 전체 항체 예를 들어, 인간 항체, 또는 기타 임의의 목적 항원 결합 단편을 생산하는데에 사용될 수 있으며, 또한 이 암호화 부위는 임의의 목적 숙주 예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아 내에서 예를 들어, 이하에 상세히 설명된 바와 같이 발현될 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합 생산하는 기술은 또한 당 업계에 공지된 방법[PCT 공보 WO 92/22324; Mullinax외 다수, BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai외 다수, AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better외 다수, Science 240:1041-1043 (1988)]을 이용하여 수행될 수 있다.

단일 사슬 Fv 및 항체를 생산하는데에 사용될 수 있는 기술의 예로서는 문헌[미국 특허 제4,946,778호 및 동 제5,258,498호; Huston외 다수, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu외 다수, PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra외 다수, Science 240:1038-1040 (1988)]에 개시된 기술들이 있다.

인간의 체 내에서 항체를 사용하는 생체 내 검정법 및 시험관 내 검출 검정법을 비롯한 몇몇 경우에 있어서, 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간의 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메라 항체는 항체의 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자로서 예를 들어, 쥣과 동물 모노클로날 항체로부터 유래하는 가변부와 인간의 면역 글로불린 불변부를 보유하는 항체가 있다. 키메라 항체를 생산하는 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi외 다수, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies외 다수, (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허 제5,807,715호; 동 제4,816,567호 및 동 제4,816,397호]을 참조하시오. 인간화된 항체는 인간 이외의 종으로부터 유래하는 하나 이상의 상보성 결정 부위(CDR)와 인간의 면역 글로불린 분자로부터 유래하는 구조틀 부위를 보유하며, 목적 항원에 결합하는, 인간 이외의 종의 항체로부터 유래하는 항체 분자이다. 종종, 인간 구조틀 부위 내에 존재하는 구조틀 잔기는 CDR 공여 항체로부터 유래하는 상응 잔기로 치환되어, 항원 결합성을 변형, 바람직하게는 개선할 것이다. 이와 같은 구조틀 치환은 당 업계에 널리 공지된 방법 예를 들어, 항원 결합에 중요한 구조틀 잔기를 확인하기 위해 CDR 및 구조틀 잔기의 상호 반응을 모델링하고, 특정 위치에 있는 특이한 구조틀 잔기를 확인하기 위해 서열 비교를 수행함으로써 확인된다[Queen외 다수, 미국 특허 제5,585,089호; Riechmann외 다수, Nature 332:323 (1988)]. 항체는 예를 들어, CDR-크래프트화[EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 미국 특허 제5,225,539호; 동 제5,530,101호; 및 동 제5,585,089호], 베니어링(veneering) 또는 표면 재생(resurfacing)[EP 592,106; EP 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka외 다수, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska.외 다수, PNAS 91 :969-973 (1994)], 및 사슬 셔플링(chain shuffling)[미국 특허 제5,565,332호]와 같이 당 업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.

완전히 인간의 것인 항체는 인간 환자의 치료제로서 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역 글로불린 서열로부터 유래한 항체 라이브러리를 이용하는, 전술한 바와 같은 파지 디스플레이법을 비롯하여 당 업계에 공지된 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 또한, 미국 특허 제4,444,887호 및 동 제4,716,111호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741를 참조하시오.

인간의 항체는 또한 기능을 갖는 내인성의 면역 글로불린을 발현할 수는 없지만, 인간의 면역 글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스게닉 마우스를 이용하여 생산될 수도 있다. 예를 들어, 인간의 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자 복합체는 마우스 배아 줄기 세포에 상동성 재조합법에 의하거나 또는 랜덤하게 도입될 수 있다. 대안적으로, 인간의 가변부, 불변부 및 다양성 부위는 인간의 중쇄 및 경쇄 유전자에 더하여 마우스 배아 줄기 세포에 도입될 수 있다. 마우스의 중쇄 및 경쇄 면역 글로불린 유전자는 상동성 재조합법에 의하여 인간의 면역 글로불린 위치를 도입함과 동시에 또는 이와는 별도로 비-기능성이 될 수 있다. 구체적으로, JH 부위가 동형 접합 결실되면 내인성 항체 생산이 억제된다. 변형 배아 줄기 세포는 증식되어 배반포로 미세 주입되며, 그 결과 키메라 마우스가 생산된다. 이후 키메라 마우스는 육종되어 인간의 항체를 발현하는 동형 접합성 자손을 생산한다. 트랜스게닉 마우스는 선택된 항원 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 일부 또는 전부를 이용하여 정상적인 방식으로 면역화된다. 이 항원에 대하여 유도된 모노클로날 항체는 종래의 하이브리도마 기술을 이용하여 면역화된 트랜스게닉 마우스로부터 얻어질 수 있다. 트랜스게닉 마우스에 포유되는 인간 면역 글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분회시 재정렬된 후, 클래스 스위치(class switch) 및 체세포 돌연변이를 일으킨다. 그러므로, 이러한 기술을 이용하면, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하는 기술에 관하여는 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기술되어 있다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는 기술 및 이러한 항체를 생산하는 방법에 대한 보다 상세한 설명은 문헌[PCT 공보 WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; 유럽 특허 제0 598 877호; 미국 특허 제5,413,923호; 동 제5,625,126호; 동 제5,633,425호; 동 제5,569,825호; 동 제5,661,016호; 동 제5,545,806호; 동 제5,814,318호; 동 제5,885,793호; 동 제5,916,771호; 및 동 제5,939,598호]에 기술되어 있다. 뿐만 아니라, 애비제닉스 인코포레이션(Abgenix, Inc.)(캘리포니아 프리몬트 소재) 및 젠팜(Genpharm)(캘리포니아 산 호세 소재)와 같은 회사도 전술한 기술과 유사한 기술을 이용하여 선택된 항원에 대해 유도된 인간 항체를 제공할 수 있다.

선택된 에피토프를 인지하는 완전히 인간의 것인 항체는 "가이드 선택법(guided selection)"이라 칭하여지는 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 이 방법에 있어서, 선택된 인간 이외의 것의 모노클로날 항체 예를 들어, 마우스 항체는 동일한 에피토프를 인지하는, 완전히 인간의 것인 항체의 선택을 가이드 하는데에 사용된다[Jespers외 다수, Bio/technology 12:899-903 (1988)].

뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체는 또한 당 업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 "모의"하는 항-유전자형 항체를 생산하는데에도 사용될 수 있다[예를 들어, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989) 및 Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)]. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 이 폴리펩티드의 다량체화 및/또는 이 폴리펩티드와 리간드의 결합을 억제하는 항체는, 이 폴리펩티드의 다량체화 및/또는 결합 도메인을 "모의"하는 항-유전자형을 생산하는데에 사용되어, 결과적으로는 폴리펩티드 및/또는 이의 리간드와 결합하여 이것들을 중화시킬 수 있다. 이와 같이 항-유전자형 또는 이 항-유전자형의 Fab 단편의 중화는 폴리펩티드 리간드를 중화하는 치료 방법에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항-유전자형 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 결합시키고/결합시키거나 이 폴리펩티드의 리간드/수용체를 결합시키는데에 사용될 수 있으며, 이로써 이의 생물 활성을 차단하게 된다.

만일 항체를 생체 내 방법에서 치료용으로 사용한다면, 이 항체는 변형되어 개체 내에서의 면역원성이 더욱 떨어진 것이 바람직하다. 예를 들어, 개체가 인간이면, 항체는 "인간화된" 항체인 것이 바람직하고; 이 항체의 상보성 결정 부위(들)는 인간 항체에 이식된다[예를 들어, Jones외 다수, Nature 321:522-525, 1986; 및 Tempest외 다수, Biotechnology 9:266-273, 1991].

파지 디스플레이 기술은 또한 항-B 박스 항체를 보유하는지 여부에 대해 스크리닝된 인간 유래의 림프구의 v-유전자를 PCR 증폭한 저장체 또는 원래의 라이브러리로부터 유래한 폴리펩티드에 대해 결합 활성을 갖는 항체 유전자를 선택하는 데에 이용될 수도 있다[McCafferty외 다수, Nature 348:552-554, 1990; 및 Marks,외 다수, Biotechnology 10:779-783, 1992]. 이러한 항체의 친화성은 또한 사슬 셔플링에 의해 개선될 수도 있다[Clackson외 다수, Nature 352: 624-628, 1991].

생산용으로서 사용될 폴리펩티드의 선택은 당 업자에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다. 폴리펩티드는, 생산된 항체가 HMG 단백질 군의 다른 일원과 거의 교차 반응을 하지 않거나 또는 이에 특이적으로 결합하지 않는 것으로 선택될 수 있다. 대안적으로, HMG 단백질 군 중 2 이상의 일원들 사이에서 상동성을 상당한 정도로 공유하는 폴리펩티드는 HMG 단백질군(예를 들어, HMG1 및 HMG2) 중 다수의 일원들과 특이적으로 결합할 수 있는(즉, 교차 반응할 수 있는) 항체를 생산하는데에 사용될 수 있다.

3. 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드

본 발명은 또한 본 발명의 고 친화성 항체 및 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 정의한 바와 같이, 엄중한 혼성화 조건 또는 이보다 덜 엄중한 혼성화 조건 하에서 본 발명의 HMG1 및/또는 HMG2 폴리펩티드(예를 들어, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 또는 이의 단편)에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호화한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 기타의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 결합하는 항체를 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호화한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 28 및/또는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 암호화한다.

"엄중한 혼성화 조건"이란, 50% 포름아미드, 5×SSC(750 mM NaCl, 75 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH7.6), 5×덴하르트 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 mu.g/㎖의 변성 및 전단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 밤새도록 항온 처리(42℃)한 후, 필터를 0.1×SSC (약 65℃) 중에서 세척하는 경우를 의미한다.

폴리뉴클레오티드는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 결정된 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열로써 제조할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오티드 서열이 공지되면, 이 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있는데(예를 들어, Kutmeier외 다수, BioTechniques 17:242 (1994)), 간단히 말해서, 이 조립 과정은 항체를 암호화하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계, 이 올리고뉴클레오티드를 어닐링 및 결찰하는 단계, 그리고 결찰된 올리고뉴클레오티드를 PCR에 의해 증폭시키는 단계를 포함한다.

대안적으로, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적당한 공급원으로부터 유래하는 핵산으로부터 생산될 수 있다. 만일 특정 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론이 얻어질 수는 없지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 면역 글로불린을 암호화하는 핵산은 화학적으로 합성되거나, 또는 적당한 공급원(예를 들어, 항체 cDNA 라이브러리, 또는 핵산으로 생산된 cDNA 라이브러리, 또는 핵산, 바람직하게는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포 예를 들어, 본 발명의 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 분리된 폴리A + RNA)으로부터, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화될 수 있는 합성 프라이머를 이용하는 PCR 증폭법에 의하거나, 또는 예를 들어, 항체를 암호화하는 cDNA 라이브러리로부터 유래된 cDNA 클론을 동정하기 위해 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 클로닝함으로써 얻어질 수 있다. 이후 PCR에 의하여 생산된 중폭 핵산은 당 업계에 널리 공지된 임의의 방법을 이용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내에 클로닝될 수 있다.

일단 항체의 뉴클레오티드 서열 및 해당 아미노산 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오티드 서열은 당 업계에 널리 공지된 뉴클레오티드 서열 조작 방법 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 위치 배향 돌연 변이 유발법, PCR 등을 이용하여 조작되어[예를 들어, Sambrook외 다수, 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. 및 Ausubel외 다수, eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY에 개시된 기술 참조], 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생한, 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 당 업계에 널리 공지된 방법 예를 들어, 기타 중쇄 및 경쇄 가변부의 공지된 아미노산 서열을 비교하여 서열 과변이 부위를 결정하는 방법에 의해서 상보성 결정 부위(CDR)의 서열을 관찰함으로써 이를 동정해낼 수 있다. 통상적인 재조합 DNA 기술을 이용하면, CDR 중 하나 이상은 전술한 바와 같이 구조틀 부위 예를 들어, 인간 이외의 것의 항체를 인간화하는 인간 구조틀 부위에 삽입될 수 있다. 상기 구조틀 부위는 천연 생성되거나 또는 공통적인 구조틀 부위로서, 바람직하게는 인간의 구조틀 부위일 수 있다[예를 들어, Chothia외 다수, J. Mol. Biol. 278: 451-479 (1998), 인간 구조틀 부위 목록 참조]. 바람직하게, 구조틀 부위 및 CDR을 조합하여 생산된 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 암호화한다.

전술한 바와 같이, 구조틀 부위 내에 1회 이상의 아미노산 치환이 일어날 수 있는 것이 바람직하며, 또한 이 아미노산 치환으로 인하여 항체와 항원의 결합성을 개선시킬 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 방법은 사슬 내 이황화 결합에 관여하는 하나 이상의 가변부 시스테인 잔기들의 아미노산을 치환 또는 결실시켜, 하나 이상의 사슬내 이황화 결합이 흠결된 항체 분자를 생산할 수 있다. 당 업계에 공지되어 있는 기타 폴리뉴클레오티드 변형법도 본 발명에 포함된다.

뿐만 아니라, 적당한 항원 특이성을 갖는 마우스 항체 분자로부터 유래한 유전자와 적당한 생물 활성을 갖는 인간 항체 분자로부터 유래한 유전자를 스플라이싱시켜 "키메라 항체"를 생산하도록 개발된 기술이 사용될 수 있다[Morrison외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger외 다수, Nature 312:604-608 (1984); Takeda외 다수, Nature 314:452-454 (1985)]. 전술한 바와 같이, 키메라 항체는 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래한 분자로서, 그 예로서는 쥣과 동물 mAb로부터 유래한 가변부와 인간 면역 글로불린 불변부를 보유하는 항체 예를 들어, 인간화된 항체가 있다.

대안적으로, 단일 사슬 항체를 생산하기 위한 것으로 개시된 기술[미국 특허 제4,946,778호; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); 및 Ward외 다수, Nature 334:544-54 (1989)]이 단일 사슬 항체를 생산하는데에 사용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 아미노산 결합을 통하여 Fv 부위의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단일 사슬 폴리펩티드를 제조함으로써 생산된다. 기능성 Fv 단편을 이.콜라이 내에서 조립하는 기술도 사용될 수 있다[Skerra외 다수, Science 242:1038-1041 (1988)].

4. 항체를 생산하는 방법

본 발명의 항체는 항체를 합성하는 것으로 당 업계에 공지되어 있는 임의의 방법, 구체적으로 화학 합성법 또는 바람직하게는 재조합 발현 기술에 의하여 생산될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 단편, 이의 유도체 또는 유사체(예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일 사슬 항체)의 재조합 발현시에는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터를 구성해야 한다. 일단 본 발명의 항체 분자, 또는 이 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 함유하는 부분)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 이 항체 분자 생산용인 벡터는 당 업계에 널리 공지된 기술을 이용하는 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 그러므로, 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 생산하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 당 업자에게 널리 공지된 방법은 항체 암호화 서열 및 적당한 전사 및 번역 제어 시그널을 함유하는 발현 벡터를 구성하는데에 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는 예를 들어, 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 유전자 재조합법을 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(이들은 모두 프로모터에 연결됨)을 포함하는 복제 가능 벡터를 제공한다. 이러한 벡터는 항체 분자의 불변부를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며[예를 들어, PCT 공보 WO 86/05807; PCT 공보 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호], 이 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄를 발현시키기 위한 벡터 내에 클로닝될 수 있다.

발현 벡터는 종래의 기술에 의해 숙주 세포로 이전되고, 이후 형질 감염된 세포는 종래의 기술에 의해 배양되어 본 발명의 항체를 생산할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 본 발명의 단일 사슬 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는(이들은 모두 이종 프로모터에 작동 가능하도록 연결되어 있음) 숙주 세포를 포함한다. 이중 사슬 항체를 발현시키는 것에 관한 바람직한 구체예에서, 중쇄와 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터는 이하에 기술된 바와 같이, 전체 면역 글로불린 분자를 발현시키기 위해 숙주 세포 내에서 공동 발현될 수 있다.

다수의 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명의 항체 분자를 발현하는데에 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은, 목적 암호화 서열이 생산된 후 정제될 수 있는 비이클로서 대표되지만, 또한 적당한 뉴클레오티드 암호화 서열로 형질 전환 또는 형질 감염되었을 때, 시험관 내에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포도 이에 해당한다. 이러한 숙주-발현 시스템의 예로서는, 항체 암호화 서열을 함유하는, 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 미생물 예를 들어, 박테리아(예를 들어, 이.콜라이, 비.서브틸리스(B. subtilis); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질 전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia)); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 꽃상추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되었거나, 또는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질 전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포 게놈으로부터 유래한 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래한 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조물을 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, NSO, 3T3, PerC6 세포)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히 전체 재조합 항체 분자를 발현시키는 세포, 바람직하게는 박테리아 세포 예를 들어, 에스케리치아 콜라이, 및 더욱 바람직하게는 진핵 세포가 재조합 항체 분자를 발현시키는데에 사용된다. 예를 들어, 포유동물 세포 예를 들어, 중국 햄스터 난소 세포(CHO)는, 벡터 예를 들어, 인간 싸이토메갈로바이러스로부터 유래한 주요 매개성 초기 유전자 프로모터 요소를 포함하는 벡터와 함께, 항체 발현용인 효율적 발현 시스템에 해당한다[Foecking외 다수, Gene 45:101 (1986); Cockett외 다수, Bio/Technology 8:2 (1990)]. 문헌[예를 들어, 미국 특허 제5827739호, 동 제5879936호, 동 제5981216호 및 동 제5658759호 참조].

박테리아 시스템에 있어서는, 발현되는 항체 분자의 의도로 하는 용도에 따라서 다수의 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 분자의 약학 조성물을 제조하기 위하여 이러한 항체 단백질을 다량 생산할 때, 용이하게 정제되는 융합 단백질 산물을 고 수준으로 발현시키는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터로서는 이.콜라이 발현 벡터 pUR278[Ruther외 다수, EMBO J. 2:1791 (1983); 항체 암호화 서열이 개별적으로 벡터의 lacZ 암호화 부위가 존재하는 틀 내에 결찰되어서 융합 단밸질이 생산될 수 있는 벡터]; pIN 벡터[Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)] 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. pGEX 벡터는 또한 외래 폴리펩티드를 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현하는데에 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이며, 매트릭스 글루타치온-아가로즈 비드에 흡착 및 결합시킨 후, 유리 글루타치온의 존재 하에 용리시킴으로써, 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 Xa 프로테아제 절단 위치를 포함하도록 디자인되며, 이에 따라서 클로닝된 표적 유전자 산물은 GST 부분으로부터 방출될 수 있는 것이다.

곤충 시스템에 있어서는, 오토그래파 캘리포니카(Autographa californica) 핵 다면체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus; AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키는 벡터로서 사용된다. 이 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 내에서 생육된다. 항체 암호화 서열은 각각 바이러스의 불필수 부위(예를 들어, 다각체 단백질 유전자)에 클로닝되어, AcNPV 프로모터(예를 들어, 다각체 단백질 프로모터)의 제어 하에 배치될 수 있다.

포유동물 숙주 세포에 있어서는, 다수의 바이러스계 발현 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 목적으로 하는 항체 암호화 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체 예를 들어, 후기 프로모터 및 삼중체(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이후, 이와 같은 키메라 유전자는 시험관 내 또는 생체 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 불필수 부위(예를 들어, E1 또는 E3 부위) 내에 삽입이 일어나면, 감염된 숙주 내에서 생존할 수 있고 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성할 수 있다[Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984)]. 특이적 개시 시그널은 또한 삽입된 항체 암호화 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이러한 시그널은 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 뿐만 아니라, 개시 코돈은 목적으로 하는 암호화 서열의 해독 틀과 동조하여 전체 삽입부의 번역을 보장하는 것이어야 한다. 이와 같은 외인성 번역 제어 시그널 및 개시 코돈은 다양한 근원(천연 및 합성)의 것일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 강화 요소, 전사 종결 인자 등을 통합함으로써 강화될 수 있다[Bittner외 다수, Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)].

뿐만 아니라, 숙주 세포 균주는 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 원하는 특정 방식으로 유전자 산물을 변형 및 가공하는 것으로서 선택될 수 있다. 이러한 단백질 산물의 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 가공(예를 들어, 절단)은 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질과 유전자 산물의 번역 후 가공 및 변형에 특이한 기작과 특성을 가질 수 있다. 적당한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현된 외래 단백질의 올바른 변형 및 가공을 보장하는 것으로서 선택될 수 있다. 이러한 목적으로, 1차 전사물의 적절한 가공, 글리코실화 및 유전자 산물의 인산화에 대한 세포내 기작을 보유하는 진핵 생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포로서는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, NSO, Per.C6, 특히, 유방암 세포주 예를 들어, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, 그리고 정상 유선 세포주 예를 들어, CRL7030 및 Hs578Bst를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

오랜 기간 동안, 고수율로 재조합 단백질을 얻기 위해서는 발현이 안정하게 이루어지는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 숙주 세포는, 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하기보다는, 적당한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 서열, 전사 종결 인자 및 폴리아데닐화 위치 등) 및 선별 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질 전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입한 후, 조작된 세포는 부유 배지 중에서 1∼2일 동안 생육된 후, 선택적 매질에 대해 스위칭될 수 있다. 재조합 플라스미드 내에 존재하는 선별 마커는 선별에 대한 내성을 부여하고, 세포가 플라스미드를 그 세포의 염색체 내에 안정하게 통합하게 하여, 생장 후 그 세포주에서 클로닝 및 증식될 수 있는 위치를 형성하도록 만들 수 있다. 이 방법은 항체 분자를 발현하는 세포주를 조작하는데에 유리하게 사용될 수 있다. 이와 같이 조작된 세포주는 특히 항체 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호 작용을 하는 화합물을 스크리닝 및 평가하는데에 유용할 수 있다.

예를 들어, tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 내에서 사용될 수 있는, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(Wigler외 다수, Cell 11 :223 (1977)), 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Lowy외 다수, Cell 22:817 (1980)) 유전자를 비롯하여, 다수의 선별 시스템이 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 대사 길항 물질 내성도 다음과 같은 유전자에 대한 선별 기초로서 이용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(Wigler외 다수, Proc Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, 1993, TIB TECH 11(5):155-215)); 그리고 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(Santerre외 다수, Gene 30:147 (1984)). 재조합 DNA 기술 분야에 일반적으로 공지된 방법은 통상적으로 원하는 재조합 클론을 선별하는데에 사용될 수 있으며, 이러한 방법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Ausubel외 다수 (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); 및 Chapters 12 and 13, Dracopoli외 다수 (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin외 다수, J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.

항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭법에 의하여 증가할 수 있다[Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)을 참조하시오]. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내에서 마커가 증폭될 수 있는 경우, 숙주 세포 배양액 중에 존재하는 억제 인자의 수준이 증가하면 마커 유전자의 복사체 수도 증가할 것이다. 증폭된 부위는 항체 유전자와 결합하기 때문에, 항체의 생산도 증가하게 될 것이다[Crouse외 다수, Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)].

숙주 세포는 본 발명의 발현 벡터 2개 즉, 중쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 경쇄 유래 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터와 공동 형질 감염될 수 있다. 상기 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 동등하게 발현시킬 수 있도록 동일한 선별 마커를 함유할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 암호화하여 이들을 발현시킬 수 있는 단일 벡터도 사용될 수 있다. 이러한 경우, 경쇄는 중쇄 앞에 배치되어, 독성의 유리 중쇄가 과량으로 생산되는 것을 막아야 한다[Proudfoot, Nature 322:562 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄의 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈성 DNA를 포함할 수 있다.

일단, 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해 생산되거나, 화학적으로 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되면, 이 항체는 면역 글로불린 분자 정제 분야에 공지된 임의의 방법 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 특히 단백질 A 다음으로 특이적인 항원에 대한 친화성에 의한 친화성 크로마토그래피, 및 크기별 분류 컬럼 크로마토그래피(sizing column chromatography)), 원심 분리, 차등적 용해도(differential solubility) 또는 단백질 정제에 관한 기타 임의의 표준적인 기술에 의하여 정제될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 본원에 기술되었거나 또는 당 업계에 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합되어, 정제를 촉진할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 마커 서열 예를 들어, 정제를 용이하게 하는 펩티드에 융합될 수 있다. 임의의 구체예에서, 마커 아미노산 서열로서는 헥사-히스티딘 펩티드 예를 들어, 시판되고 있는 다수의 것들 중 pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., 캘리포니아주 91311, 채스워스, 9259 이튼 애버뉴)에 제공되는 태그가 있다. 예를 들어, 문헌[Gentz외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 헥사-히스티딘은 융합 단백질을 편리하게 정제할 수 있도록 만들어 준다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그로서는, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래하는 에피토프에 상응하는 "HA" 태그[Wilson외 다수, Cell 37:767 (1984)]와 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

5. 항체 컨쥬게이트 및 유도체

본 발명의 항체는 (예를 들어, 임의의 형태의 분자를 항체에 공유 결합시킴으로써) 변형된 유도체를 포함한다. 예를 들어(제한적인 것은 아님), 항체의 유도체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페그화, 인산화, 아미드화, 공지의 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백 분해 절단, 세포성 리간드 또는 기타 단백질과의 결합에 의해 변형된 항체를 포함한다. 다수의 화학적 변형 중 임의의 것은 공지의 기술 예를 들어, 특이적 화학 절단법, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신 등의 대사 합성법에 의해 수행될 수 있다. 뿐만 아니라, 이 유도체는 하나 이상의 비 통상적 아미노산을 함유할 수 있다.

생체 내 반감기가 증가한 항체 또는 이의 단편은 상기 항체 또는 항체 단편에 중합체 분자 예를 들어, 고분자량 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 부착시킴으로써 생산될 수 있다. PEG는 상기 항체 또는 항체 단편에, 다 작용성 링커(multifunctional linker)의 도움으로 또는 이것의 도움 없이, PEG와 상기 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단부를 위치 특이적으로 컨쥬게이트화 시키거나, 또는 리신 잔기 상에 존재하는 엡실론-아미노기를 통하여 부착될 수 있다. 생물 활성을 최소한 상실하는 선형 또는 분지형 중합체의 유도체화가 이용될 것이다. 컨쥬게이트화의 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분광 분석법에 의해 면밀하게 관찰될 것이며, 그 결과, 항체에 PEG 분자가 적절히 컨쥬게이트화 되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다. 미반응 PEG는 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해 항체-PEG 컨쥬게이트로부터 분리될 수 있다.

뿐만 아니라, 이 항체 또는 항체 단편이 생체 내에서 더욱 안정적이 되도록 만들거나, 또는 생체 내 반감기를 연장하기 위해서 항체를 알부민에 컨쥬게이트화시킬 수 있다. 이 기술에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 국제 출원 공보 WO 93/15199, WO 93/15200 및 WO 01/77137; 및 유럽 특허 EP 413, 622]. 본 발명은 하나 이상의 부분 예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모의 분자, 합성 약물, 무기 분자 및 유기 분자에 컨쥬게이트화 또는 융합된 항체 또는 이의 단편을 사용하는 것을 포함한다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 단편 특히, 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되었거나 또는 화학적으로 컨쥬게이트화된(공유 및 비공유 컨쥬게이트화 포함) 항체 또는 이의 단편을 사용하여 융합 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 이종 단백질 또는 폴리펩티드(또는 이의 단편 특히, 약 10개 이상, 약 20개 이상, 약 30개 이상, 약 40개 이상, 약 50개 이상, 약 60개 이상, 약 70개 이상, 약 80개 이상, 약 90개 이상 또는 약 100개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드)에 재조합적으로 융합되었거나 또는 화학적으로 컨쥬게이트화된(공유 및 비공유 컨쥬게이트화 포함) 항체 또는 이의 단편을 사용하여 융합 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 융합은 반드시 직접적으로 행할 필요는 없지만, 링커 서열을 통해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 항체는, 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 항체를 융합 또는 컨쥬게이트화시킴으로써, 시험관 내 또는 생체 내에서 특정 세포 유형에 이종 폴리펩티드를 표적화하는데에 사용될 수 있다. 이종 폴리펩티드에 융합 또는 컨쥬게이트화된 항체는 또한 당 업계에 공지된 방법을 이용하는 시험관 내 면역 검정법과 정제 방법에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[국제 출원 공보 WO 93/21232; 유럽 특허 EP 439,095; Naramura외 다수, 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; 미국 특허 제5,474,981호; Gillies외 다수, 1992, PNAS 89:1428-1432; 및 Fell외 다수, 1991, J. Immunol. 146:2446-2452]을 참조하시오.

본 발명은 또한 항체 단편에 융합 또는 컨쥬게이트화된 이종 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 제형을 포함한다. 예를 들어, 이종 폴리펩티드는 Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, V_H 도메인, V_L 도메인, V_H CDR, V_L CDR 또는 이의 단편에 융합 또는 컨쥬게이트화될 수 있다. 항체의 일부에 폴리펩티드를 융합 또는 컨쥬게이트화시키는 방법에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,336,603호, 동 제5,622,929호, 동 제5,359,046호, 동 제5,349,053호, 동 제5,447,851호 및 동 제5,112,946호; 유럽 특허 EP 307,434 및 EP 367,166; 국제 출원 공보 WO 96/04388 및 WO 91/06570; Ashkenazi외 다수, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539; Zheng외 다수, 1995, J. Immunol. 154:5590-5600; 및 Vil외 다수, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337- 11341]을 참조하시오.

예를 들어, HMG1 및/또는 HMG2 또는 이의 단편(상동)에 특이적으로 결합하는 항체의 부가적 융합 단백질은 유전자-셔플링, 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링(총칭하여 "DNA 셔플링"이라 함)과 같은 기술을 통해 생산될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명의 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 친화도가 높고 해리 속도가 낮은 항체 또는 이의 단편)의 활성을 바꾸는데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 문헌[미국 특허 제5,605,793호; 동 제5,811,238호; 동 제5,830,721호; 동 제5,834,252호; 및 동 제5,837,458호, 그리고 Patten외 다수, 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2): 76-82; Hansson,외 다수, 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; 및 Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2): 308-313]을 참조하시오. 항체 또는 이의 단편, 또는 암호화된 항체 또는 이의 단편은 실수 유발 PCR(error-prone PCR), 랜덤 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 재조합 이전의 방법에 의해 랜덤하게 돌연변이를 유발시킴으로써 변형될 수 있다. 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 부분 즉, C/CLP에 특이적으로 결합하는 부분은 하나 이상의 이종 분자의 하나 이상의 성분, 모티프, 구획, 부분, 도메인, 단편 등과 재조합될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 마커 서열 예를 들어, 정제를 용이하게 만드는 펩티드에 융합될 수 있다. 임의의 구체예에서, 상기 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드 예를 들어, 시판되고 있는 다수의 것들 중 pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., 캘리포니아주 91311, 채스워스, 9259 이튼 애버뉴 소재)에 제공되는 태그가 있다. 문헌[Gentz외 다수, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기술되어 있는 바와 같이, 예를 들어, 헥사-히스티딘은 융합 단백질을 편리하게 정제할 수 있도록 해준다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그로서는, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래하는 에피토프에 상응하는 "HA" 태그[Wilson외 다수, Cell 37:767 (1984)]와 "플래그" 태그를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 진단제 또는 치료제에 컨쥬게이트화되는 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 항체는 예를 들어, 소정의 치료법의 효능을 측정하기 위한 임상 실험 절차의 일환으로 종양의 발전 상태 또는 진행 상태를 관찰하기 위하여 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출 가능한 물질과 커플링시킴으로써 용이하게 수행될 수 있다. 검출 가능한 물질의 예로서는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물 발광 물질, 방사성 물질, 양전자 단층 촬영에 사용되는 양전자 방사 금속, 그리고 비 방사성의 상자성 금속 이온을 포함한다. 검출 가능한 물질은 당 업계에 공지된 기술을 이용하여 매개 물질(예를 들어, 당 업계에 공지된 링커)을 통해, 항체(또는 이의 단편)에 간접적으로 또는 직접적으로 컨쥬게이트화 또는 커플링될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라서 진단 제로서 사용되는 항체에 컨쥬게이트화될 수 있는 금속 이온에 관한 미국 특허 제4,741,900호를 참조하시오. 적당한 효소의 예로서는 호오스 래디쉬 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스터라제를 포함하며; 적당한 보결 분자단 복합체의 예로서는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴 복합체를 포함하고; 적당한 형광 물질의 예로서는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 염화댄실 또는 피코에리트린을 포함하며; 발광 물질의 예로서는 루미놀을 포함하고; 생물 발광 물질의 예로서는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린을 포함하며; 적당한 방사성 물질의 예로서는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In 또는 ⁹⁹Tc와, 양전자 단층 촬영에 사용되는 양전자 방사 금속, 그리고 비 방사성의 상자성 금속 이온을 포함하며, 특정 방사성 동위 원소에 방사성 표지화되거나 또는 컨쥬게이트화되는 분자는 본 발명의 항체에 컨쥬게이트화될 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 치료제 부분 예를 들어, 세포 독소 예를 들어, 세포 증식 억제제 또는 세포 파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온 예를 들어, 알파-방사 이온 예를 들어, ²¹³Bi에 컨쥬게이트화될 수 있다. 세포 독소 또는 세포 독성 제제는 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 이것의 예로서는 파클리탁셀, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화에티듐, 에머틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 도노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-디하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신과 이의 유사체 또는 상동체를 포함한다. 치료제로서는 대사 길항 물질(예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카바진), 알킬화제(예를 들어, 메클로레타민, 티오에파, 클로람부실, 멜파란, 카머스틴(BSNU) 및 로머스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 cis-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린(예를 들어, 도노루비신(구 도노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예를 들어, 닥티노마이신(구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)), 및 항-유사 분열 촉진제(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 치료제 부분의 보다 광범위한 예에 관하여는 PCT 공보 WO 03/075957에 개시되어 있다.

본 발명의 컨쥬게이트는 소정의 생물 반응을 개선 시키는데에 사용될 수 있으며, 치료제 또는 약물의 일부는 전통적인 화학 요법 제제에 한정되는 것으로 파악되지 않는다. 예를 들어, 약물의 일부는 원하는 생물 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로서는 예를 들어, 독소 예를 들어, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질 예를 들어, 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 세포 자살 제제 예를 들어, TNF-알파, TNF-베타, AIM I(국제 출원 공보 WO 97/33899), AIM II(국제 출원 공보 WO 97/34911), Fas 리간드(Takahashi외 다수, Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI(국제 출원 공보 WO 99/23105), CD40 리간드, 혈전제 또는 혈관 생성 억제제 예를 들어, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는, 생물 반응 개선제 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1("IL-1"), 인터루킨-2("IL-2"), 인터루킨-6("IL-6"), 과립구 대식 세포 콜로니 자극 인자("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자를 포함할 수 있다.

항체도 또한 표적 항원의 면역 검정 또는 정제에 특히 유용한 고형 지지체에 부착될 수 있다. 이러한 고형 지지체의 예로서는 유리, 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 염화폴리비닐 또는 폴리프로필렌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이러한 치료제 일부를 항체에 컨쥬게이트화시키는 기술에 관하여는 널리 공지되어 있다[예를 들어, Amon외 다수, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld외 다수 (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom외 다수, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson외 다수 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera외 다수 (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin외 다수 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), 및 Thorpe외 다수, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982) 참조].

본 발명의 항체는 다른 폴리펩티드에 컨쥬게이트화될 수 있다. 항체를 폴리펩티드 부분에 융합 또는 컨쥬게이트화시키는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[미국 특허 제5,336,603호; 동 제5,622,929호; 동 제5,359,046호; 동 제5,349,053호; 동 제5,447,851호 및 동 제5,112,946호; EP 307,434; EP 367,166; PCT 공보 WO 96/04388 및 WO 91/06570; Ashkenazi외 다수, 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng외 다수, 1995, J Immunol 154:5590; 및 Vil외 다수, 1992, PNAS USA 89:11337]을 참조하시오. 항체를 부분에 융합시키는 것은 직접적일 필요는 없으며, 링커 서열을 통해서 이루어질 수도 있다. 이러한 링커 분자에 관하여는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 또한 문헌[Denardo외 다수, 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson외 다수, 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman외 다수, 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171]에 공지되어 있다.

대안적으로, 항체는 제2 항체에 컨쥬게이트화되어 문헌[Segal, 미국 특허 제 4,676,980호]에 기술되어 있는 바와 같이 항체 이형 컨쥬게이트를 형성할 수도 있다.

치료제 일부가 컨쥬게이트화되어 있거나, 또는 컨쥬게이트화되어 있지 않은 항체는 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 세포 독성 인자(들) 및/또는 시토킨과 함께 투여되어 치료제로서 사용될 수 있다.

6. 항체 결합 및 활성에 대한 검정법

본 발명의 항체의 특이적(즉, 면역 특이적) 결합성에 관하여는 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 검정 될 수 있다. 이때에 실시될 수 있는 면역 검정법으로서는 웨스턴 블럿과 같은 기술을 이용하는 경쟁적 및 비 경쟁적 검정 시스템, 방사성 면역 검정법, ELISA(효소 결합 면역 흡착 검정법), "샌드위치" 면역 검정법, 면역 침전 검정법, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역 확산 검정법, 응집 검정법, 보체-고정 검정법, 면역 방사성 계측 검정법, 형광 면역 검정법, 단백질 A 면역 검정법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 검정법은 통상적으로 행하여 지는 것으로서 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, Ausubel외 다수, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York 참조]. 대표적인 면역 검정법에 관하여는 이하에 간단히 기술되어 있으나, 이는 한정적인 것은 아니다.

면역 침전법의 절차는 일반적으로, 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA, PMSF, 어프로티닌, 바나듐산나트륨)으로 보강된 용해 완충액 예를 들어, RIPA 완충액[1% NP-40 또는 트리톤 X-100, 1% 데옥시콜산나트륨, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 인산나트륨(pH 7.2), 1% 트라실올]에 세포 군집을 용해시키는 단계, 목적 항체를 이 세포 용해물에 첨가하는 단계, 일정 기간(예를 들어, 1∼4 시간) 동안 4℃에서 항온 처리하는 단계, 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로즈 비드를 세포 용해물에 첨가하는 단계, 약 1 시간 이상 동안 4℃에서 항온 처리하는 단계, 이 비드를 용해 용액 중에서 세척하는 단계 및 이 비드를 SDS/시료 완충액 중에 재현탁시키는 단계를 포함한다. 목적 항체가 특정 항원을 면역 침전시키는 능력은 예를 들어, 웨스턴 블럿 분석법에 의하여 평가될 수 있다. 당 업자는 항체가 항원에 결합하는 것을 증가시키고, 또한 (예를 들어, 세파로즈 비드로 세포 용해물을 사전에 정화시킴으로써) 백그라운드를 감소시키도록 개질될 수 있는 매개 변수에 관하여 알 고 있을 것이다. 면역 침전법의 절차에 관한 상세한 설명은 문헌[Ausubel외 다수, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.16.1]에 기술되어 있다.

웨스턴 블럿 분석법은 일반적으로, 단백질 시료를 제조하는 단계, 폴리아크릴아미드 겔 상에서 이 단백질 시료를 전기 영동 시키는 단계(예를 들어, 항원의 분자량에 따라서 8∼20%인 SDS-PAGE), 상기 폴리아크릴아미드 겔로부터 얻은 단백질 시료를 막 예를 들어, 니트로셀룰로즈, PVDF 또는 나일론으로 이동시키는 단계; 차단 용액(예를 들어, 3% BSA 또는 무 지방 우유를 함유하는 PBS) 중에서 이 막을 차단하는 단계, 세척 완충액(예를 들어, PBS-트윈 20) 중에서 이 막을 세척하는 단계, 이 막을 차단 완충액 중에 희석된 1차 항체(목적 항체)로 차단하는 단계, 이 막을 세척 완충액 중에서 세척하는 단계, 이 막을 불로킹 완충액 중에 희석된 효소 기질(예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사능 분자(예를 들어, ³²P 또는 ¹²⁵I) 에 컨쥬게이트화된 2차 항체(1차 항체를 인지하는 항체 예를 들어, 항-인간 항체)로 차단하는 단계, 이 막을 세척 완충액 중에서 세척하는 단계, 그리고 항원의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 당 업자는 시그널 검출률을 증가시키고 백그라운드 노이즈(background noise)는 감소시킬 수 있는 매개 변수에 관하여 알 것이다. 웨스턴 블럿 절차에 관한 상세한 설명은 문헌[예를 들어, Ausubel외 다수, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 10.8.1]에 기술되어 있다.

ELISA는, 항원을 준비하는 단계, 96웰 미세 역가 평판을 항원으로 코팅하는 단계, 검출 가능한 화합물 예를 들어, 효소 기질(예를 들어, 호오스래디쉬 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 컨쥬게이트화된 목적 항체를 웰에 가하는 단계 및 일정 시간 동안 항온 처리하는 단계, 그리고 항원의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함한다. ELISA에 있어서, 목적 항체는 검출 가능한 화합물에 컨쥬게이트화되어서는 안되며; 그 대신, 검출 가능한 화합물에 컨쥬게이트화된 2차 항체(목적 항체를 인지하는 항체)가 웰에 가하여질 수 있다. 또한, 이 웰을 항원으로 코팅시키는 대신에, 항체를 웰에 코팅시킬 수 있다. 이러한 경우, 검출 가능한 화합물에 컨쥬게이트화된 2차 항체가 가하여지고, 그 후 코팅된 웰에 목적 항원을 가하면 된다. 당 업자는 시그널 검출률을 증가시킬 수 있는 매개 변수와 당 업계에 공지된 ELISA에 관한 기타 변법에 관하여 알 것이다. ELISA에 관한 상세한 설명은 문헌[예를 들어, Ausubel외 다수, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York, 11.2.1]에 기술되어 있다.

항원에 대한 항체의 결합 친화성 및 기타 결합 특성(예를 들어, 항체-항원 상호 작용의 해리 속도(off-rate))는 당 업계에 널리 공지된 다양한 시험관 내 검정법 예를 들어, 평형법(예를 들어, 효소-결합 면역 흡착 검정법(ELISA; 또는 방사성 면역 검정법(RIA)), 또는 동력학(예를 들어, BIACORE® 분석법) 및 기타 방법 예를 들어, 간접 결합 검정법, 경쟁적 결합 검정법, 형광 공명 에너지 전이(FRET), 겔 전기 영동법 및 크로마토그래피(예를 들어, 겔 여과법)에 의해 측정될 수 있다. 이와 같은 방법 및 기타 방법은 관찰될 성분 중 하나 이상에 표지 예를 들어, 발색 표지, 형광 표지, 발광 표지 또는 동위 원소 표지를 부착시키고/부착시키거나 다양한 검출 방법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 결합 친화성 및 동력학에 관한 상세한 설명에 대해서는, 항체-면역원 상호 작용에 중점을 둔 문헌[Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)]에서 살펴볼 수 있다. 경쟁적 결합 검정법의 일례로서는, 미 표지화 항원의 양을 늘려가면서 목적 항체와 표지화된 항원을 항온 처리하는 단계, 및 표지화된 항원에 결합한 항체를 검출하는 단계를 포함하는 방사성 면역 검정법이 있다. 특정 항원에 대한 목적 항체의 친화성과 결합-해리 속도는 스캐차드 플롯 분석법에 의한 데이터로부터 구할 수 있다. 2차 항체와의 경쟁은 또한 방사성 면역 검정법을 이용하여 측정될 수도 있다. 이러한 경우, 항원은 미표지화 2차 항체의 양을 증가시키면서 표지화된 화합물에 컨쥬게이트화된 목적 항체와 함께 항온 처리된다. 기타 구체적인 방법에 관하여는 이하 실시예 2∼4를 참조하시오.

본 발명의 항체의 생물 활성은 당 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 검정될 수 있다.

본 발명의 방법 및 제형은 인간에 사용하기 이전에, 목적으로 하는 치료 활성 또는 예방 활성을 보유하는지 여부에 대하여 시험관 내에서 시험한 후, 생체 내에서 시험하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 구체적 치료 방법에 사용되는 제형을 투여할지 또는 본 발명의 치료법을 병행할지 여부를 결정하는데에 사용될 수 있는 시험관 내 검정법은, 환자의 조직 시료를 배양액 중에서 생육시키고, 본 발명의 제형에 노출시키거나 또는 이 제형과 접촉시킨 후, 이 조직 시료에 대한 제형의 효능을 관찰하는 단계를 포함하는 시험관 내 세포 배양 검정법을 포함한다. 조직 시료는 환자를 생검하여 얻을 수 있다. 이 검정법을 통해서, 개별 환자에 대하여 치료학적으로 가장 효율적인 예방제 또는 치료제를 확인할 수 있다. 다수의 특정 구체예에서, 시험관 내 검정법은 자가 면역 질환, 염증성 질환, HMG1 및/또는 HMG2의 이상 발현 및/또는 이상 활성과 관련된 질환에 관여하는 세포류의 대표적 세포를 사용하여 수행되며, 그 결과 본 발명의 제형이 이러한 세포류에 대해 목적으로 하는 효과를 갖는지 여부를 측정할 수 있다. 예를 들어, 접촉된 세포에 의해 생산되는 HMG1 및/또는 HMG2 및/또는 전 염증 시토킨의 수준이 낮다는 사실은 곧, 본 발명의 조성물이 환자의 병상을 치료하는데에 효과적일 수 있음을 나타낸다. 대안적으로, 환자로부터 얻은 세포를 배양하는 대신에, 본 발명의 제형은 HMG1 및/또는 HMG2에 의해 자극될 수 있는 세포 예를 들어, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC), THP-1 세포 또는 대식 세포(Mφ)를 이용하여 스크리닝될 수 있다. 당 업계에 표준적인 다수의 검정법 예를 들어, ELISA 검정법, 실시간 PCR 및 기타 당 업계에 널리 공지된 방법이 시토킨 생산 여부를 평가하는데에 사용될 수 있다. 구체적인 방법도 또한 본원에 개시되어 있다(예를 들어, 이하 실시예 2 및 실시예 6 참조).

예방제 또는 치료제는 인간에 대해 시험하기 이전에 적당한 동물 모델 시스템 예를 들어, 래트, 마우스, 닭, 소, 원숭이, 토끼, 햄스터 등의 체내에서 검정될수 있다.

당 업계에 공지되어 널리 사용되고 있는 주요 동물 모델에 관하여는 전술된 바와 같이 이미 알려져 있다. 뿐만 아니라, 부패중에 대한 특정 동물 모델(실시예 5 참조), 복막염에 대한 특정 동물 모델(실시예 10 참조) 및 관절염에 대한 특정 동물 모델(실시예 7∼9 참조)에 관하여도 본원에 개시되어 있다.

뿐만 아니라, 당 업자에게 공지된 임의의 검정법은, 본원에 개시된 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 병행 치료법의 예방 및/또는 치료 효능을 평가하는데에도 사용될 수 있다.

7. 본 발명의 항체, 항체 조성물 및 이의 치료적 투여 및/또는 예방적 투여

본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항-HMG1 항체를 포함하며, 또한 본 발명은 본원에 "본 발명의 항체 조성물", "본 발명의 조성물" 또는 더 간단하게 "조성물"이라고 칭하여지는 항체 조성물에 관한 것이다. 임의의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제 중에 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 용어는, 본 발명의 항체와 화합될 수 있으며, 이와 같이 화합된 후 본 발명의 항체를 개체에 투여할 때 사용될 수 있는 화학 조성물을 의미한다. 이와 같은 항체 조성물을 본원에서는 "약학 조성물"이라고도 부른다. 다른 구체예에서는 본 발명의 조성물이라고 부른다.

본 발명은 또한 염증 시토킨 연쇄 반응의 활성화를 특징으로 하는 병상 예를 들어, 급성 및 만성 염증성 병상을 치료하는 방법을 포함하며, 이 방법은 본 발명의 항체 또는 약학 조성물을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다. 만성 염증성 병상은 염증 반응이 오랜 기간 동안(수주, 수 개월 또는 무한정으로) 지속되어, 종종 영구적이 될 수도 있는 조직 손상을 일으키는 것을 특징으로 한다. 만성 염증성 병상으로서는 관절염(예를 들어, 류머티즘성 관절염), 염증성 장 질환(예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론병), 담낭염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 급성 염증성 증상은 일반적으로 증상 예를 들어, 혈관 투과도의 증가, 부종, 전신 발열 증상(종종 조직 괴사 및 사망에까지 이르게 할 수 있음)이 급작스럽게 발생하는 것을 특징으로 한다. 급성 염증성 병상으로서는 부패증(예를 들어, 미생물 감염에 의한 부패증), 과민성 반응, 조직 괴사 및 충수염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 병상은 염증 시토킨 연쇄 반응이 전신 반응 예를 들어, 내독소 쇼크를 일으키는 경우에 발생할 수 있다. 대안적으로, 이러한 병상은 예를 들어, 류머티즘성 관절염에서와 같이, 국소화된 염증 시토킨 연쇄 반응에 의해 매개될 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HMG1의 A 박스(예를 들어, 서열 번호 4, 28 및 29 내부에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HMG1의 B 박스(예를 들어, 서열 번호 4 내부에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HMG2의 A 박스(예를 들어, 서열 번호 22 내부에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 고 친화성 항체를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HMG2의 B 박스(예를 들어, 서열 번호 23 내부에 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다.

전술한 바와 같이, HMG1 신호 전달은 최소한 부분적으로 RAGE에 의하거나 또는 단백질의 TLR군의 일원에 의해 매개된다. A 박스 및 B 박스 둘 다는 수용체 결합 및 신호 전달에 관여하는 것으로 파악된다. 그러므로, 어떠한 특정 이론에 국한되지 않았을 때, A 박스에 특이적으로 결합하는 항체(또는 기타 길항제)와 B 박스에 특이적으로 결합하는 항체(또는 기타 길항제)를 조합하면 RAGE 및/또는 TLR 단백질에 HMG1이 결합하는 것을 효과적으로 차단할 것이라고 생각된다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 본 발명의 고 친화성 항체(또는 기타 HMGB1 항체 또는 길항제)의 조합체 예를 들어, HMG1 A 박스에 특이적으로 결합하는 항체와 HMG1 B 박스에 특이적으로 결합하는 항체의 조합체, 또는 HMG2 A 박스에 특이적으로 결합하는 항체와 HMG2 B 박스에 특이적으로 결합하는 항체의 조합체를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 HMG1의 A 박스 및 B 박스 둘 다로부터 유래된 에피토프(예를 들어, A 박스와 B 박스 사이의 접합부까지 확장되어 존재하는 에피토프)에 특이적으로 결합하는 본 발명의 고 친화성 항체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 고 친화성 항체만을 포함할 수 있거나, 또는 이 항체와 기타 활성 치료 분자 및/또는 애쥬반트 예를 들어, 스테로이드, 기타 소염 분자, 또는 기타 항체 치료제를 모두 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 조성물은 초기 부패증 매개 인자의 길항제를 포함할 수 있다. 초기 부패증 매개 인자의 길항제는 본 발명의 하나의 구체예에 해당하는데, 이 길항제의 예로서는 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6로 이루어진 군으로부터 선택되는 시토킨이 있다. 특정 구체예에서, 초기 부패증 매개 인자의 길항제로서는 TNF 또는 MIF에 대한 항체, 또는 IL-1 수용체 길항제가 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 실질적으로 내독소 및/또는 관련 발열원성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 무 발열원성 제형이다. 내독소로서는 미생물의 내부에 국한되어 존재하고, 미생물이 분해되거나 또는 사멸될 때에만 방출되는 독소를 포함한다. 발열원성 물질로서는 또한 박테리아 및 기타 미생물의 외막으로부터 얻어진 열-유도 물질, 및 열 안정성 물질(당단백질)을 포함한다. 이 두 물질은 모두 인간에게 투여될 경우 발열, 저혈압 및 쇼크의 원인이 될 수 있다. 잠재적인 유해 효과로 인하여, 소량의 내독소일지라도 정맥 투여용 약물 용액에서 제거되어야 한다. 식품의약국("FDA")에서는 정맥 내 약물 투여용으로서 1회 투여시 시간당 5 내독소 유닛(EU)/투여량/체중 1㎏을 상한선으로 정하였다[The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)]. 모노클로날 항체를 투여하는 경우에서와 같이, 치료용 단백질이 체중 1㎏당 수백 또는 수천 ㎎의 양만큼 투여될 때에는, 유해하고 위험한 내독소는 미량일지라도 제거되어야 한다. 임의의 특정 구체예에서, 조성물 중 내독소 및 발열원의 수준은 10 EU/㎎ 미만, 또는 5 EU/㎎ 미만, 또는 1 EU/㎎ 미만, 또는 0.1 EU/㎎ 미만, 또는 0.01 EU/㎎ 미만, 또는 0.001 EU/㎎ 미만이다.

생체 내 투여시 사용될 경우, 본원에 개시된 조성물은 멸균되어야 한다. 이러한 멸균 상태는 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과법에 의하거나 또는 당 업계에 널리 공지된 기타 수단에 의하여 쉽게 얻어질 수 있다. 주사용 멸균 조성물은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (180' ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990]에 기술된 바와 같은 통상적인 약학 실무에 따라서 조제될 수 있다. 항체 예를 들어, 본원에 개시된 항체를 포함하는 조성물은 통상적으로 동결 건조된 형태 또는 용액의 형태로 보관될 것이다. 본 발명의 항체를 포함하는 멸균 조성물은 멸균 통로 입구가 존재하는 용기 예를 들어, 정맥 내 용액용 백 또는 제형을 회수할 수 있는 어뎁터 예를 들어, 피하 주사용 바늘에 의해 뚫릴 수 있는 마개가 장착된 바이알에 담을 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 급성 및 만성 염증성 병상을 포함하여 염증 시토킨 연쇄 반응을 활성화하는 것을 특징으로 하거나, 또는 이로써 매개되는 병상을 억제할 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 급성 염증성 병상(예를 들어, 부패증)의 치료에 유용하다. 다른 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 만성 염증성 병상(예를 들어, 류머티즘성 관절염)의 치료에 유용하다. 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 급성 및 만성 염증성 병상의 치료에 유용하다.

본 발명의 조성물은 염증 시토킨 연쇄 반응의 활성화에 의해 매개되거나 또는 이를 특징으로 하는 염증성 병상이 발병한 개체에 투여될 때 보호 효능을 나타낼 것으로 생각된다. 본 발명의 조성물에 의해 부여된 보호 효능은 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 측정 가능하다. 본 발명의 조성물이 얼마나 강한 보호 효능을 나타내는지를 평가하는 데에 사용되는 방법은 치료 및/또는 예방될 병상과 관찰된 측정 결과에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, 설치류 관절염 모델에 있어서, 본 발명의 조성물로 처리한 동물의 발 염증 스코어(paw inflammation score)와 적당한 대조구 조성물로 처리한 동물의 발 염증 스코어를 비교하여 본 발명의 조성물의 보호 효능이 얼마나 되는지를 측정할 수 있다. 부패증의 CLP 모델에 있어서, 본 발명의 조성물로 처리한 동물의 생존률과 적당한 대조구 조성물로 처리한 동물의 생존률을 비교하여, 항체를 처리함으로써 부여되는 보호 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물로 처리한 경우와 임의의 대조구로 처리한 경우가 비교될 것이다. 예를 들어, 대조구 처리는 대조구 항체를 포함할 수 있거나 또는 부형제만을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에 있어서, 대조구는 질병의 치료에 대한 보호 기준(또는 적당한 대용 분자) 예를 들어, 관절염 치료용인 메토트렉세이트 또는 항-TNF(예를 들어, 엔브렐(Enbrel), 휴미라(Humira))일 수 있다. 몇몇 경우, 대조구는 음성 대조구(예를 들어, PBS)일 수 있다. 대조구가 보호 기준(the standard of care)을 나타낼 때, 본 발명의 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 각 비교 군에 대한 보호 처리 기준과 함께, 보호 효능 수준을 고려하면서 투여될 수 있다. 대조구의 선택은 치료 및/또는 예방될 병상과 평가될 여러 가지 측정 결과를 비롯한 인자에 따라서 달라질 것이며, 이러한 대조구는 당 업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 부여되는 보호 효능을 측정하는 방법에 관한 특정 구체예는 본원에 제공되어 있다(이하 실시예 7∼11 참조).

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 본원에 기술된 조성물은 동물 CLP 부패증 모델에서, 대조구 조성물보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상]. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 마우스 CLP 모델 및 새끼 돼지 CLP 모델을 포함하는 군으로부터 선택되는 동물 CLP 부패증 모델에서, 대조구 조성물보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상]. 다른 특정 구체예에서, 동물 CLP 모델은 마우스 CLP 모델이다.

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 본원에 기술된 조성물은 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델에서, 대조구 조성물보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상]. 특정 구체예에서, 상기 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 수동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 능동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델에서, 렌브렐®(메토트렉세이트와 함께 투여되는 경우 또는 함께 투여되지 않는 경우)보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상]. 특정 구체예에서, 상기 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 수동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 능동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델에서, 대조구 조성물보다 골 감소율 및/또는 연골 손상률을 감소시킨다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상]. 특정 구체예에서, 상기 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 수동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다. 다른 특정 구체예에서, 마우스 콜라겐-유도성 관절염 모델은 능동적 콜라겐-유도성 관절염 모델이다.

다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 래트 애쥬반트-유도성 관절염 모델에서, 대조구 조성물보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 래트 애쥬반트-유도성 관절염 모델에서, 렌브렐®(메토트렉세이트와 함께 투여되는 경우 또는 함께 투여되지 않는 경우)보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 래트 애쥬반트-유도성 관절염 모델에서, 대조구 조성물보다 골 상실률 및/또는 연골 손상률을 감소시킨다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 인간에 있어서, 엔브렐(Enbrel)®(메토트렉세이트와 함께 투여되는 경우 또는 함께 투여되지 않는 경우)보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 마우스 복막염 모델에 있어서, 대조구 조성물보다 보호 효능이 더욱 우수하다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 인간 또는 설치류 SCI 모델에 있어서, 대조구 조성물보다 척수 손상(SCI) 중증도를 경감시킨다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 인간 또는 설치류 ALI 모델에 있어서, 대조구 조성물보다 급성 폐 손상(ALI) 중증도를 경감시킨다[10% 이상, 또는 15% 이상, 또는 20% 이상, 또는 30% 이상, 또는 40% 이상, 또는 50% 이상, 또는 60% 이상, 또는 70% 이상, 또는 80% 이상, 또는 90% 이상].

본 발명은 또한 포유동물 세포로부터 전 염증 시토킨이 방출되는 것을 억제하는 방법에 관한 것이기도 하다. 이 방법은 세포로부터 전 염증 시토킨이 방출되는 것을 억제하기에 충분한 양만큼의 본 발명의 항체 또는 항체 조성물로 세포를 처리하는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, 세포는 대식 세포인 것이 바람직하다. 임의의 구체예에서, 전 염증 시토킨은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 세포는 대식 세포이며, 전 염증 시토킨은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 세포는 PBMC이고 전염증 시토킨은 TNF, IL-1α, IL-1β, MIF 및 IL-6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구체예에서, 상기 방법은 염증 시토킨 연쇄 반응의 활성화를 특징으로 하는 병상이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자의 세포를 치료한다. 구체적인 병상에 관하여는 본원에 나열되어 있다.

본 발명은 또한 포유동물로부터 HMG1 및/또는 HMG2가 방출되는 것을 억제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 세포로부터 HMG1 및/또는 HMG2가 방출되는 것을 억제하기에 충분한 양만큼의 본 발명의 항체 또는 항체 조성물로 세포를 처리하는 단계를 포함한다. 이 방법은 염증 시토킨 연쇄 반응의 활성화를 특징으로 하는 병상이 발병하였거나 또는 발병 위험이 있는 환자의 세포를 치료하는 것이 바람직하다. 바람직한 병상에 관하여는 본원에 나열되어 있다.

시토킨, HMG1 및/또는 HMG2의 방출을 억제하는지 여부를 측정하는 방법은 당 업계에 널리 공지된 다수의 방법 예를 들어, 전술한 방법과 본원에 개시된 방법에 의해 수행될 수 있다(이하 실시예 2∼11 참조).

본원에 사용된, "치료학적 유효량", "~에 충분한 양" 등의 용어는, HMG1 및/또는 HMG2에 의해 매개되는 질병 또는 질환을 치료 또는 관리하는데에 충분한, 예를 들어, 치료제 곧, 본 발명의 HMG1 항체 조성물의 양을 의미한다. 치료학적 유효량이란, 질병의 발병을 지연시키거나 또는 최소화하는데에 충분한 치료제의 양 예를 들어, 질병의 중증도를 경감 또는 최소화하는데에 충분한 치료제의 양을 의미한다. 치료학적 유효량은 또한 염증성 질환의 치료 또는 관리에 있어서 치료 효과를 제공하는 치료제의 양을 의미한다. 뿐만 아니라, 본 발명의 약학 조성물에 있어서 치료학적 유효량이란, 질병 예를 들어, 염증성 질병의 치료 또는 관리에 있어서 치료 효과를 제공하는, 치료제만의 양 또는 다른 치료제와 합한 양을 의미한다.

본 발명은 또한 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 완화하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 본 발명의 항체 조성물 및/또는 하나 이상의 치료제를 필요로 하는 개체에 이 항체 조성물 및/또는 하나 이상의 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상들을 예방, 관리, 치료 또는 완화하는데에 유용하거나, 또는 이에 사용되어 왔거나 또는 현재 사용되고 있는 임의의 제제 또는 치료제는 본 발명의 항체 조성물과 함께 사용될 수 있다. 이러한 제제의 예로서는 면역력 증진제, 혈관 생성 억제제, 소염제 및 TNF-알파 길항제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

항체 조성물 즉, 본 발명의 약학 조성물을 사용하여 효과적으로 치료할 수 있는 병상의 비 제한적인 예로서는 본 명세서의 "배경 기술"과 이하에 열거한 병상들을 포함한다. 바람직하게, 상기 병상으로서는 충수염, 소화성 궤양, 위궤양 또는 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 또는 허혈성 대장염, 게실염, 후두개염, 무이완증, 담관염, 담낭염, 간염, 크론병, 장염, 휘플병, 천식, 알레르기, 과민성 쇼크, 면역 복합체 질환, 기관 허혈, 재 관류 손상, 기관 괴사, 고초열, 부패증, 패혈증, 내독소 쇼크, 악액질, 초 이상 고열, 호산성 육아종, 육아종증, 유육종증, 패혈성 유산, 부고환염, 질염, 전립선염, 요도염, 기관지염, 기종, COPD, 비염, 낭포성 섬유증, 간질성 폐렴, 진폐증, 폐포 염, 세기관지염, 인두염, 늑막염, 부비강염, 인플루엔자, 호흡기 세포 융합 바이러스 감염, 헤르페스 바이러스 감염, HIV 감염, B형 간염 바이러스 감염, C형 간염 바이러스 감염, 산재성 균혈증, 댕기열, 칸디다증, 말라리아, 사상충증, 아메바증, 포충낭, 화상, 피부염, 피부근염, 햇볕 화상, 담마진성 사마귀, 팽진, 혈관염, 맥관염, 심내막염, 동맥염, 죽상 동맥경화증, 재발 협착증, 혈전 정맥염, 심막염, 심근염, 심근 허혈증, 결절성 동맥 주위염, 류머티즘열, 알츠하이머병, 소아 지방 변증, 울혈성 심부전, 성인 호흡 장애 증후군, 수막염, 뇌염, 다발성 경화증, 뇌경색, 뇌색전증, 길라메-바 증후군, 신경염, 신경통, 척수 외상, 마비, 포도막염, 관절염, 관절통, 골수염, 근막염, 패젯병, 통풍, 치주 질환, 류머티즘성 관절염, 윤활막염, 중증 근무력증, 갑상선염, 전신 홍반성 루프스병, 구드패스츄어 증후군, 버셋 증후군, 동종 이식 거부 반응, 이식편 대 숙주 병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 버거씨병, 제I형 당뇨병, 강직성 척추염, 레티어 증후군 또는 호지킨병이 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 병상으로서는 충수염, 소화성 궤양, 위궤양 또는 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 또는 허혈성 대장염, 간염, 크론병, 천식, 알레르기, 과민성 쇼크, 기관 허혈, 재 관류 손상, 기관 괴사, 고초열, 부패증, 패혈증, 내독소 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 산재성 균혈증, 화상, 알츠하이머병, 소아 지방 변증, 울혈성 심부전증, 성인 호흡 장애 증후군, 뇌경색, 뇌 색전증, 척수 외상, 마비, 동종 이식 거부 또는 이식편 대 숙주 병이 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명은 충수염, 소화성 궤양, 위궤양 및 십이지장 궤양, 복막염, 췌장염, 궤양성, 가막성, 급성 및 허혈성 대장염, 간염, 크론병, 천식, 알레르기, 과민성 쇼크, 류머티즘성 관절염, 기관 허혈, 재 관류 손상, 기관 괴사, 고초열, 부패증, 패혈증, 내독소 쇼크, 악액질, 패혈성 유산, 산재성 균혈증, 화상, 알츠하이머병, 소아 지방 변증, 울혈성 심부전증, 성인 호흡 장애 증후군, 뇌경색, 뇌 색전증, 척수 외상, 마비, 동종 이식 거부 및 이식편 대 숙주 병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병상을 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 조성물 및 항체를 사용 즉, 투여하는 방법에 관한 것이다. 가장 바람직한 구체예에서, 병상은 내독소 쇼크 또는 동종 이식 거부 반응이다. 병상이 동종 이식 거부 반응인 경우, 본 발명의 조성물은 또한 동종 이식 거부 반응을 억제하는데에 사용되는 면역 억제제 예를 들어, 사이클로스포린을 포함하는 것이 유리할 수 있다.

본 발명의 바람직한 특정 구체예는 부패증 및 관절염(예를 들어, RA, 건선성 관절염, 소아 류머티즘성 관절염)을 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 조성물 및 항체를 사용 즉, 투여하는 방법에 관한 것이다. 뿐만 아니라, 본 발명의 바람직한 특정 구체예는 건선 및 강직성 척수염을 치료 및 예방하는 본 발명의 조성물 및 항체를 사용 즉, 투여하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 바람직한 특정 구체예는 재발 협착증, 혈관병 및 심혈관 질환을 치료 및 예방하는 본 발명의 조성물 및 항체를 사용 즉, 투여하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 조직의 손상을 치료 및 예방하고 조직 회복 및 재생을 촉진하는 본 발명의 항체 및 조성물을 사용 즉, 투여하는 방법에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 관리, 치료 또는 경감시키는데에 유용하다고 공지되어 있거나, 또는 사용되어 왔거나 또는 현재 사용되고 있는 임의의 제제 또는 치료제는 본 발명의 항체 조성물과 함께 사용될 수 있다. 염증성 질환을 알고 있는 개체에 본 발명의 항체 조성물과 함께 투여될 수 있는 면역력 증진제의 구체적인 예로서는 메토트렉세이트, 레플루모니드, 사이클로포스파미드, 사이톡산(Cytoxan), 이뮤란(Immuran), 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제(예를 들어, FK506(타크롤리무스)), 메틸프레드니손(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나, 말로노니트릴로아미드(예를 들어, 레플룬아미드), 항-T 세포 수용체의 항체(예를 들어, 항-CD4 항체(예를 들어, cM-T412 (Boeringer), IDEC-CE9.1.RTM. (IDEC 및 SKB), mAB 4162W94, 오르토클론(Orthoclone) 및 OKTcdr4a (Janssen-Cilag)), 항-CD3 항체(예를 들어, 뉴비온(Nuvion)(Product Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson)), 항-CD20 항체(예를 들어, 리툭산(Rituxan)(IDEC & Genentech, 미국 특허 출원 공보 및 국제 특허 출원 공보 US2004/0202658, WO 00/67796) 및 이의 유도체, HuMax-CD20 (GenMab and Medarex, 미국 특허 공보 2004/0167319)), 항-CD19 항체(예를 들어, 미국특허 출원 공보 및 국제 특허 출원 공보 US20020041847, US20030133930 및 WO 05/012493), 항-CD5 항체(예를 들어, 항-CD5 리신-결합 면역컨쥬게이트), 항-CD7 항체(예를 들어, CHH-380 (Novartis)), 항-CD8 항체, 항-CD40 리간드 모노클로날 항체(예를 들어, IDEC-131 (IDEC)), 항-CD52 항체(예를 들어, CAMPATH 1H (Ilex)), 항-CD2 항체(예를 들어, MEDI-507 (MedImmune, Inc., 국제 출원 공보 WO 02/098370 및 WO 02/069904), 항-CD11a 항체(예를 들어, 자넬림(Xanelim)(Genentech)), 및 항-B7 항체(예를 들어, IDEC-114)(IDEC)); 항-시토킨 수용체의 항체(예를 들어, 항-IFN 수용체의 항체, 항-IL-2 수용체의 항체(예를 들어, 제나팍스(Zenapax; Protein Design Labs)), 항-IL-4 수용체의 항체, 항-IL-6 수용체의 항체, 항-IL-10 수용체의 항체, 및 항-IL-12 수용체의 항체), 항-시토킨 항체(예를 들어, 항-IFN 항체, 항-TNF-알파 항체, 항-IL-베타 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-8 항체(예를 들어, ABX-IL-8 (Abgenix)), 및 항-IL-12 항체)); 항-CD22 항체(예를 들어, 비-리간드 차단 항체 예를 들어, 에프라투즈맵(Epratuzumab)(Immunomedics) 및 리간드 차단 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공보 2004/0001828 및 2003/0202975)); CTLA4-면역 글로불린; LFA-3TIP (Biogen, 국제 출원 공보 WO 93/08656 및 미국 특허 제6,162,432호); 가용성 시토킨 수용체(예를 들어, TNF-알파 수용체의 세포 외 도메인 또는 이의 단편, IL-1 베타 수용체의 세포 외 도메인 또는 이의 단편, 및 IL-6 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편); 시토킨 또는 이의 단편(예를 들어, 인터루킨(IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-알파, TNF-베타, 인터페론(IFN)-알파, IFN-베타, IFN-감마, 및 GM-CSF); 및 항-시토킨 항체(예를 들어, 항-IL-2 항체, 항-IL-4 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-10 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL-15 항체, 항-TNF-알파 항체, 및 항-IFN-감마 항체)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 조성물과 함께 염증성 질환 환자에 투여될 수 있는 혈관 생성 억제제의 비 제한적인 예로서는 비탁신(Vitaxin)®(MedImmune) 또는 기타 항-알파 v 베타3 항체(예를 들어, CNTO95 (Centocor)), 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아포미그렌, 혈관 생성 억제성 안티트롬빈 III, 피브로넥틴의 29 kDa N-말단 및 40 kDa C-말단 단백 분해 단편, uPA 수용체의 길항제, 프로락틴의 16 kDa 단백 분해성 단편, 혈소판 인자-4의 7.8 kDa 단백 분해 단편, 혈소판 인자-4의 혈관 생성 억제성 24 아미노산 단편, 혈관 생성 억제 인자(13.40), 트롬보스폰딘 I의 혈관 생성 억제성 22 아미노산 펩티드 단편, SPARC, RGD 및 NGR 함유 펩티드의 혈관 생성 억제성 20 아미노산 펩티드 단편, 라미닌의 소 혈관 생성 억제성 펩티드, 피브로넥틴, 프로콜라겐 및 EGF, 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF) 길항제, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 길항제, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제, VEGF 수용체(VEGFR) 길항제(예를 들어, 항-VEGFR 항체), 및 아바스틴(Avastin)®을 포함한다.

본 발명의 항체 조성물과 함께 염증성 질환을 앓는 환자에게 투여될 수 있는 TNF-알파 길항제의 비 제한적인 예로서는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체(예를 들어, 인간, 인간화, 키메라, 모노클로날, 폴리클로날 항체, Fv, scFv, Fab 단편, F(ab)₂ 단편 및 이의 항원-결합 단편) 예를 들어, TNF-알파에 면역 특이적으로 결합하는 항체, 핵산 분자(예를 들어, 안티센스 분자 또는 삼중 나선 분자), 유기 분자, 무기 분자, 및 TNF-알파의 기능, 활성 및/또는 발현을 차단, 감소, 억제 또는 중화시키는 소(small) 분자를 포함한다. 다양한 구체예에서, TNF-알파 길항제는 TNF-알파의 기능, 활성 및/또는 발현을 대조구 예를 들어, 인산염 완충 염수(PBS)에 비하여 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상까지 감소시킨다. TNF-알파에 면역 특이적으로 결합하는 항체의 예로서는 인플릭시맵(REMIC ADE.TM.; Centacor), D2E7 (Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., 뉴저지주 마운틴 올리브 소재), HUMICADE.TM이라고도 알려져 있는 CDP571, 및 CDP-870 (두 가지 모두 Celltech/Pharmacia, 영국 슬로우 소재), 및 TN3-19.12 (Williams외 다수, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2762-2766; Thorbecke외 다수, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7375-7379)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 다음과 같은 미국 특허에 개시된 바와 같이 TNF-알파에 면역 특이적으로 결합하는 항체를 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하는 것도 포함한다: 미국 특허 제5,136,021호; 동 제5,147,638호; 동 제5,223,395호; 동 제5,231,024호; 동 제5,334,380호; 동 제5,360,716호; 동 제5,426,181호; 동 제5,436,154호; 동 제5,610,279호; 동 제5,644,034호; 동 제5,656,272호; 동 제5,658,746호; 동 제5,698,195호; 동 제5,736,138호; 동 제5,741,488호; 동 제5,808,029호; 동 제5,919,452호; 동 제5,958,412호; 동 제5,959,087호; 동 제5,968,741호; 동 제5,994,510호; 동 제6,036,978호; 동 제6,114,517호; 및 동 제6,171,787호. 가용성 TNF-알파 수용체의 예로서는 sTNF-R1 (Amgen), 에타너셉트(etanercept)(엔브렐™; Immunex) 및 이의 래트 상동체인 렌브렐™, TNFrI, TNFrII로부터 유래된 TNF-알파의 가용성 억제 인자(Kohno외 다수, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8331-8335), 및 TNF-알파 인(Inh)(Seckinger외 다수, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5188-5192)을 포함한다.

본 발명에 포함되는 기타 TNF-알파 길항제로서는, 인터페론 감마-활성화 대식 세포에 의해 TNF-알파의 생산을 차단하는 것으로 공지되어 있는 IL-10(Oswald외 다수 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi외 다수, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539), 쥣과 동물 생산물인 TBP-1(Serono/Yeda), 백신인 CytoTAb (Protherics), 안티센스 분자 104838 (ISIS), 펩티드 RDP-58 (SangStat), 탈리도미드 (Celgene), CDC-801 (Celgene), DPC-333 (Dupont), VX-745 (Vertex), AGIX-4207 (AtheroGenics), ITF-2357 (Italfarmaco), NPI-13021-31 (Nereus), SCIO-469 (Scios), TACE 표적화제(targeter)(Immunix/AHP), CLX-120500 (Calyx), 티아졸로피림 (Dynavax), 오라노핀 (Ridaura)(SmithKline Beecham Pharmaceuticals), 퀴나크린 (메파크린 디클로로하이드레이트), 테니댑 (Enablex), 멜라닌 (Large Scale Biological), 및 항-p38 MAPK 제제(Uriach)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 조성물과 함께 염증성 질환을 앓고 있는 개체에 투여될 수 있는 소염제의 비 제한적인 예로서는 비스테로이드계 소염 약물(NSAID), 스테로이드계 소염 약물, 베타-작동제, 항콜린제 및 메틸잔틴을 포함한다. 상기 NSAID의 예로서는 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕십 (CELEBREX™), 디클로페낙 (VOLTAREN™), 에토돌락 (LODINE™), 페노프로펜 (NALFON™), 인도메타신 (INDOCIN™), 케토랄락 (TORADOL™), 옥사프로진 (DAYPRO™), 나부멘톤 (RELAFEN™), 설린닥 (CLINORIL™), 톨멘틴 (TOLECTIN™), 로페콕십 (VIOXX™), 나프록센 (ALEVE™, NAPROSYN™), 케토프로펜 (ACTRON™) 및 나부멘톤 (RELAFEN™)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 NSAID는 사이클로옥시게나제 효소(예를 들어, COX-1 및/또는 COX-2)를 억제함으로써 작용한다. 스테로이드계 소염 약물의 예로서는 글루코코르티코이드, 덱사메타손 (DECADRON™), 코르티손, 하이드로코르티손, 프레드니손(DELTASONE™), 프레드니솔론, 트리암시놀론, 아줄피딘 및 에이코사노이드 예를 들어, 프로스타글란딘, 트롬복산 및 루코트리엔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 퇴행성 관절염 환자에는 본 발명의 항체 조성물을 퇴행성 관절염 예방, 치료, 관리 또는 경감에 유용한 기타 제제 또는 치료제 예를 들어, 진통제[비 제한적 예로서는 아세트아미노펜(투여량 = 4000 ㎎/d 이하); 페나세틴; 및 트라마돌(1일 투여량 = 200∼300 ㎎)]; NSAID[비 제한적 예로서는 아스피린, 디플루니살, 디클로페낙, 에토돌락, 페나메이트, 페노프로펜, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메틸살리실레이트, 네부메톤, 나프록신, 옥사프라진, 페닐부타존, 피록시캠, 술린닥 및 톨메틴과 함께 예방학적 유효량 또는 치료학적 유효량으로 투여한다. NSAID의 투여량은 적은 것이 바람직한데, 예를 들어, 이부프로펜(1200 ㎎/d), 나프록센(500 ㎎/d)이 바람직하다. 위장 보호제(gastroprotective agent) 예를 들어, 미소프로스톨, 파모티딘 또는 오메프라졸은 NSAID; 비 아세틸화 살리실산염 예를 들어, 살살레이트; 시클로옥시게나제 (Cox)-2-특이적 억제제(CSIs) 예를 들어, 셀레콕십 및 로페콕십과 함께 사용하면 바람직하고; 관절 내부 또는 관절 주위에 글루코코르티코이드 제제의 저장체(depot)를 주입하거나; 히알루론산을 관절 내부에 주입하거나; 캡사이신 크림을 도포하거나; 퇴행성 관절염 발생 무릎에 다량의 자극을 주어 피브린, 연골 조각 그리고 기타 부스러기가 흘러나오도록 하거나; 또는 관절 교체 수술시 함께 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체 조성물은 또한 퇴행성 관절염 예방, 치료, 관리 및 경감시 기타 비 약리학적 수단과 함께 사용될 수도 있는데, 예를 들어, 본 발명의 항체 조성물 투여시에는 관절에 가하여지는 하중을 줄이거나(예를 들어, 나쁜 자세 교정, 요추 전만 상태의 지지, 관련 관절에 과도한 하중을 가하지 않기, 오래 서있지 않기, 무릎 꿇지 않기 그리고 쪼그려 앉지 않기); 발병한 관절 부위에 열을 가하여 주거나; 유산소 운동을 한다든지 아니면 기타 물리 치료를 병행한다든지 할 수 있다.

특정 구체예에서, 류머티즘성 관절염 환자에는 본 발명의 항체 조성물을 류머티즘성 관절염 예방, 치료, 관리 및 경감에 유용한 기타 제제 또는 치료제 예를 들어, NSAID(예를 들어, 아스피린, 디플루니살, 디클로페낙, 에토돌락, 페나메이트, 페노프로펜, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메틸살리실레이트, 네부메톤, 나프록신, 옥사프라진, 페닐부타존, 피록시캠, 술린닥 및 톨메틴); 진통제(예를 들어, 아세타미노펜, 펜아세틴 및 트라마돌); CSI 예를 들어, 셀레콕십 및 로페콕십; 글루코코르티코이드(바람직하게는 낮은 투여량의 경구 투여용 글루코코르티코이드 예를 들어, <7.5 ㎎/d의 프레드니손, 또는 매월 한꺼번에 다량 투여하는 글루코코르티코이드 또는 관절 내부에 투여하는 글루코코르티코이드); 병상 개선 항 류머티즘 약물(DMARD) 예를 들어, 메토트렉세이트(바람직하게는 일정 간격을 두고 소량 투여 예를 들어, 1주일에 한 번씩 7.5∼30 ㎎ 투여), 금 화합물(예를 들어, 금 염), D-페니실라민, 말라리아 치료제(예를 들어, 클로로퀸) 및 설파살라진; TNF-알파 중화제 예를 들어, 에타너셉트 및 인플릭시맵; 면역 억제제 및 세포 독성 제제(예를 들어, 아자티오프린, 레플루노미드, 사이클로스포린 및 사이클로포스파미드)와 함께 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여하고, 수술(예를 들어, 관절 성형술, 전관절 대치술, 수부 재건술, 개방 또는 관절경적 활액막 절제술, 및 손목의 건초 절제술)시에도 함께 투여한다. 본 발명의 항체 조성물은 또한 류머티즘성 관절염의 예방, 치료, 관리 및 경감에 있어서 다른 수단과 함께 사용될 수도 있는데, 예를 들어, 본 발명의 항체 조성물 투여시에는 휴식을 취하거나, 염증이 일어난 관절이 될 수 있으면 쓸데없이 움직이지 않도록 부목을 대준다든지, 다양한 정형용 지지대 및 보조 장치를 사용하여 운동을 한다든지, 기타 물리 치료를 행한다든지 할 수 있다. 본 발명의 항체 조성물은 또한 류머티즘성 관절염의 예방, 치료, 관리 및 경감시 몇몇 비 전통적인 수단과 함께 사용될 수도 있는데, 예를 들어, 본 발명의 항체 조성물 투여시 식이 조절(예를 들어, 생선 기름에서 발견되는 오메가-3 지방산 예를 들어, 에이코사펜타에논산을 고기에서 발견되는 식이성 오메가-6 필수 지방산으로 대체)을 한다든지, 백신, 호르몬 및 국소 제제를 함께 투여할 수도 있다.

특정 구체예에서, 만성 폐색상 폐 질환(COPD) 환자에는 본 발명의 항체 조성물을, 단독으로, 또는 COPD의 예방, 치료, 관리 및 경감에 유용한 기타 제제 또는 치료제 예를 들어, 기관지 확장제 예를 들어, 단기간- 또는 장기간- 작용성 베타₂- 교감 신경 자극제(단기간-작용성 베타₂ 작동제의 예로서는 알부테롤, 피르부테롤, 터부탈린 및 메타프로테레놀을 포함하며; 장기간-작용성 베타₂ 작동제의 예로서는 경구 투여용 지연-방출형 알부테롤 및 흡입용 살메테롤을 포함), 항콜린제(예를 들어, 브롬화이프라트로퓸), 및 테오필린과 이의 유도체 (테오필린의 치료학적 투여량 범위는 바람직하게 10∼20 mu.g/㎖); 글루코코르티코이드; 외인성 알파₁ AT(예를 들어, 1주일 간격으로 60㎎/㎏씩 정맥 내 투여하여 풀링된 인간 혈청으로부터 유래하는 알파₁ AT); 산소; 폐 이식; 폐 용적 절제술; 기관 내 삽관, 구조 호흡; 23가 다당류를 사용하는 폐렴 구균 백신화 및 연간 생산되는 인플루엔자 백신과 함께 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여하며; 이때 운동 및 금연을 병행한다.

특정 구체예에서, 폐섬유증 환자에는 본 발명의 항체 조성물을, 단독으로, 또는 폐 섬유증 치료법에 유용한 하나 이상의 기타 제제 (유효량) 예를 들어, 산소; 코르티코스테로이드[예를 들어, 1∼1.5 ㎎/㎏/d(100 ㎎/d 이하)을 시작으로 하여 6주 동안 매일 프레드니손을 투여하다가 3∼6개월에 걸쳐 다시 투여량을 최소 투여량인 0.25 ㎎/㎏/d로 감소]; 세포 독성 약물[예를 들어, 사이클로포스파미드(하루에 한 번씩 100∼120 ㎎ 경구 투여), 및 아자티오프린(하루에 한 번씩 3∼200 ㎎/㎏ 경구 투여)]; 기관지 확장제(예를 들어, 단기간- 및 장기간- 작용성 베타₂-교감 신경 자극제, 항콜린제 및 테오필린 및 이의 유도체); 및 항히스타민제(예를 들어, 디펜히드라민 및 독실아민)와 함께, 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여한다.

특정 구체예에서, SCI 환자에는 본 발명의 항체 조성물을, 단독으로, 또는 SCI 치료법에 유용한 하나 이상의 기타 제제(유효량) 예를 들어, 글루코코르티코이드 스테로이드[예를 들어, 메틸프레드니솔론(15분에 걸쳐 30 ㎎/㎏의 환약을 투여하고, 환약 투여후 45분 경과시를 시작으로 하여 23 시간 동안 5.4 ㎎/㎏/h 흡입)], 신경 보호제(예를 들어, 미노사이클린)와 함께, 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여하거나, 또는 재생 치료법(예를 들어, 줄기 세포 치료법, 하이드로겔), 약한 전기장을 형성시킬 때[예를 들어, 주입 가능한 의료 장치인 척추 외 진동장 자극기(extraspinal oscillating field stimulator) 사용] 투여할 수 있다.

특정 구체예에서, 천식 환자에는 본 발명의 항체 조성물을, 단독으로, 또는 천식 치료법에 유용한 하나 이상의 기타 제제(유효량) 예를 들어, 교감 신경 자극제(예를 들어, 카테콜아민 예를 들어, 에피네프린, 이소프로테레놀 및 이소에타린; 레소르시놀 예를 들어, 메타프로테레놀, 터부탈린 및 페노테롤; 및 살리제닌 예를 들어, 살부타몰(교감 신경 자극제의 바람직한 투여 경로는 흡입임); 메틸잔틴 예를 들어, 테오필린 및 이의 다양한 염; 항콜린성 작용 약물 예를 들어, 황산아트로핀, 메틸질산아트로핀 및 브롬화이프라트로퓸; 글루코코르티코이드(예를 들어, 전신 및 경구 투여용 스테로이드 및 흡입 투여용 글루코코르티코이드); 비만 세포 안정화제(예를 들어, 크로몰린 소듐 및 네도크로밀 소듐); 루코트리엔 개질제(예를 들어, 질루톤(Zileuton), 자퍼루카스트 및 몬테루카스트); 면역 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트 및 금 염); 및 점액 용해제(예를 들어, 아세틸시스테인)와 함께, 예방학적 또는 치료학적 유효량으로 투여한다.

본 발명은 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물, 바람직하게는 본 발명의 항체를 개체에 유효량만큼 투여하는 단계를 포함하는 치료, 억제 및 예방 방법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 화합물은 실질적으로 순수하다(예를 들어, 효능을 제한하거나 또는 원치 않는 부작용을 초래하는 물질이 실질적으로 존재하지 않음). 개체는 동물 예를 들어, 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등이 바람직하고, 포유동물이 더욱 바람직하며, 인간이 가장 바람직하다.

화합물이 핵산 또는 면역 글로불린을 포함할 때 사용될 수 있는 제형 및 투여 방법에 관하여는 전술되어 있으며, 부가적으로 적당한 제형 및 투여 경로는 이하 본원에 기술된 것들로부터 선택할 수 있다.

본 발명의 화합물을 투여하는데에 사용될 수 있는 것으로 공지된 다양한 전달 시스템의 예로서는, 리포좀, 미세 입자, 미세 캡슐에의 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 내포 작용(Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) 참조), 레트로바이러스 또는 기타 벡터의 일부인 핵산 구조물 등이 있다. 도입 방법으로서는 예를 들어, 피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 경구 투여 경로를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로 예를 들어, 주입법 또는 환약 투여, 상피 또는 점막 라이닝(mucocutaneous lining)(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 소장 점막 등)을 통한 흡착에 의해서 투여될 수 있으며, 또한 기타 생물 활성 제제와 함께 투여될 수도 있다. 투여 방식은 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 중추 신경계에 임의의 적당한 경로 예를 들어, 뇌실 내 및 초 내 주사에 의해 투여하는 것도 바람직할 수 있으며; 뇌실 내 주사는 뇌실 내 카테터 예를 들어, 저장 용기 예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장 용기에 부착된 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 내 투여는 또한 예를 들어, 흡입기나 분무기, 그리고 에어로졸화 제제를 포함하는 제형을 사용하여 수행될 수도 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 약학 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 부위에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이러한 투여는 예를 들어(제한적인 것은 아님), 수술시에 국소 주입하든지, 예를 들어, 수술 후 상처 부위 드레싱 할 때 국소 도포하든지, 카테터에 의한 주사, 좌제, 임플란트(다공성, 비공극성 임플란트), 겔 상의 물질 예를 들어, 막 예를 들어, 실라스틱 막 또는 섬유에 의해 주입될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 단백질 예를 들어, 본 발명의 항체 투여시에는 단백질이 흡착되지 않는 재료를 사용하도록 주의하여야 한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 소포, 구체적으로는 리포좀의 형태로 전달될 수 있다[Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat외 다수, Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조].

또 다른 구체예에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템의 형태로 전달될 수 있다. 하나의 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다[Langer, 상동; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald외 다수, 1980, Surgery 88:507; Saudek외 다수, 1989, N. Engl. J. Med. 321 :574]. 다른 구체예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press, Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 및 Levy외 다수, 1985, Science 228:190; During외 다수, 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard외 다수,1989, J. Neurosurg. 71 :105)]. 또 다른 구체예에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적 즉, 뇌에 근접한 부분에 장착될 수 있으므로, 전신 투여용 분획만 있으면 된다[예를 들어, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, 상동, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. 기타 제어 방출 시스템에 관하여는 문헌[Langer (1990, Science 249:1527-1533)]에 기술되어 있다.

본 발명의 화합물이 단백질 암호화 핵산인 특정 구체예에서, 핵산은 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 사용하거나(미국 특허 제4,980,286호 참조), 또는 직접 주입법에 의하거나, 또는 미립자 충격법을 이용하거나(예를 들어, 유전자 총; Biolistic, Dupont), 또는 지질이나 세포 표면 수용체 또는 형질 감염 제제로 코팅하거나, 또는 핵 내에 도입되는 것으로 알려진 호메오박스(homeobox)-유사 펩티드에 결합시켜 투여함으로써(예를 들어, Joliot외 다수, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성해서 투여하여 세포 내 성분으로 만들어져 체 내에 투여되어 그 핵산이 암호화하는 단백질의 발현을 촉진할 수 있다. 대안적으로, 핵산은 상동성 재조합에 의해, 세포 내에 도입된 후 숙주 세포 DNA에 통합되어 발현될 수 있다.

본 발명은 또한 약학 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 화합물과, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, "약학적으로 허용 가능한"이라 용어는, 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인을 얻었거나, 또는 미국 약전 또는 기타 일반적으로 인정되고 있는 약전에 동물, 보다 구체적으로는 인간에 사용되는 것으로서 열거된 경우를 의미한다. "담체"란 용어는, 희석제, 애쥬반트, 부형제, 또는 치료제가 투여되는 비이클을 의미한다. 이러한 약학적 담체는 멸균 용액 예를 들어, 물 및 오일 예를 들어, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 오일 예를 들어, 땅콩 오일, 대두 오일, 광유, 참기름 등일 수 있다. 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때에 바람직한 담체는 물이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로즈 그리고 글리세롤 용액은 또한 액상 담체, 특히 주사 용액으로서 사용될 수도 있다. 적당한 약학적 부형제로서는 전분, 글루코즈, 락토즈, 수크로즈, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 모노스테아르산글리세롤, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올 등을 포함한다. 원한다면, 조성물은 또한 소량의 습윤제나 유화제 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유액, 정제, 환약, 캡슐, 분말, 지연-방출형 제형 등의 형태를 띨 수 있다. 본 조성물은 통상의 결합제와 담체 예를 들어, 트리글리세리드를 포함하는 좌제로서 제형화될 수도 있다. 경구 투여용 제형은 표준적인 담체 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산 마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적당한 약학 담체의 예에 관하여는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", E. W. Martin]에 개시되어 있다. 이러한 조성물은 치료학적 유효량의 화합물을, 바람직하게는 정제된 형태로, 적당량의 담체와 함께 포함하여, 환자에 투여 가능한 적당한 형태로 제형화될 수 있다. 제형은 투여 방식에 맞추어야 한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라서 인간에 정맥 내 투여하기에 적합한 약학 조성물로서 제형화된다. 통상적으로, 정맥 내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액 중의 용액이다. 필요한 경우, 본 조성물은 용해제와 국소 마취제 예를 들어, 리그노카인을 포함하여 주사 부위의 통증을 완화시킬 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 개별 투여되거나 또는 단위 투여형 예를 들어, 밀폐 밀봉형 용기 예를 들어, 활성 성분의 양이 표시된 앰플 또는 사세트에 담긴 동결 건조 분말 또는 무수 농축물로서 혼합 투여되는 방식으로 공급된다. 이 조성물이 주입에 의해 투여될 경우, 그 조성물은 약학적 등급의 멸균수 또는 염수가 담겨져 있는 주입용 병으로 분배될 수 있다. 이 조성물이 주사에 의해 투여될 경우, 주사용 멸균수 또는 염수 앰플은 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

본 발명의 화합물은 중성 또는 염의 형태로서 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염으로서는 음이온으로 형성된 염 예를 들어, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타타르산 등으로부터 유래되는 음이온으로 형성된 염과, 양이온으로 형성된 염 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수소화철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등 양이온으로 형성된 염을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 또는 질환을 치료, 억제 및 예방하는데에 유효할 본 발명의 화합물의 양은 표준적인 임상 기술에 의해 측정될 수 있다. 뿐만 아니라, 시험관 내 검정법은 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 보조하는데에 사용될 수도 있다. 제형에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로와, 질병 또는 질환의 심각성에 따라서 달라질 것이며, 또한 전문가의 판단과 각 환자의 상태에 따라서 결정되어야 할 것이다. 유효 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 얻어진 투여량-반응 곡선으로부터 추정할 수 있다.

동물에 있어서, 환자에 투여될 투여량은 통상적으로 환자의 체중 1㎏당 0.1∼100 ㎎이다. 바람직하게, 환자에 투여될 투여량은 환자의 체중 1㎏당 0.1∼20 ㎎, 더욱 바람직하게는 환자의 체중 1㎏당 1∼10 ㎎이다. 일반적으로, 인간의 항체는 이의 외래 폴리펩티드에 대한 면역 반응으로 인하여, 다른 종의 항체보다 인간 체 내 반감기가 더욱 길다. 그러므로, 인간 항체의 투여량과 투여 횟수를 더 줄일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 항체의 투여량 및 투여 횟수는 변형 예를 들어, 지질화에 의해 항체의 흡수율과 조직 투과성(예를 들어, 뇌 투과성)을 강화함으로써 줄일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 약학 조성물 성분 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 이러한 용기(들)와 함께, 약물 또는 생물학적 생산물의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 알려진 고시[이 고시는 제조, 사용 또는 판매에 관한 정부 기관에 의해 인간 투여용으로서의 승인을 받았음을 나타냄]도 포함될 수도 있다.

본 조성물 중에 함유된 폴리펩티드와 함께 포함되어 있는 부형제는 치료용으로서 본 조성물의 예상 투여 경로를 바탕으로 하여 선택된다. 이 조성물의 투여 경로는 치료될 병상에 따라서 달라진다. 예를 들어, 정맥 내 주사는 전신성 질환 예를 들어, 내독소 쇼크의 치료에 바람직할 수 있고, 경구 투여는 위장관 질환 예를 들어 위궤양의 치료에 바람직할 수 있다. 조성물의 투여 경로와 투여될 조성물의 양은 표준적인 투여량-반응 연구와 함께 적당한 실험을 통하여 당 업자에 의해 결정될 수 있다. 이와 같은 결정에 있어서 고려되어야 할 관련 사항으로서는 치료될 병상(들), 투여될 조성물의 선택, 각 환자의 연령, 체중 및 반응, 그리고 환자 증상의 중증도를 포함한다. 그러므로, 이러한 사항에 따라서 항체 조성물은 환자에게 경구, 비 경구, 비강 내, 질 내, 직장, 설 내, 설하, 협측, 협측 내 그리고 경피 투여될 수 있다.

그러므로, 경구, 설 내, 설 하, 협측 및 협측 내 투여용으로 디자인된 조성물은 당 업계에 널리 공지된 수단 예를 들어, 비활성 희석제 또는 식용 담체를 사용하여 적당한 실험을 통해 제조될 수 있다. 본 조성물은 젤라틴 캡슐 내에 봉입될 수 있거나 또는 정제로 압착될 수 있다. 경구용 치료제를 투여하기 위해서, 본 발명의 약학 조성물은 부형제와 함께 통합될 수 있으며, 또한 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉 검 등의 형태로 사용될 수 있다.

정제, 환약, 캡슐 및 트로키 등은 또한 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제 및 풍미제를 함유할 수도 있다. 결합제의 몇몇 예로서는 미세 결정질 셀룰로즈, 검 트래거칸트 또는 젤라틴을 포함한다. 부형제의 예로서는 전분 또는 락토즈를 포함한다. 붕해제의 몇몇 예로서는 알긴산 및 옥수수 전분 등을 포함한다. 윤활제의 예로서는 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산 칼륨을 포함한다. 유동화제의 예로서는 콜로이드성 이산화규소가 있다. 감미제의 몇몇 예로서는 수크로즈 및 사카린 등을 포함한다. 풍미제의 예로서는 페퍼민트, 살리실산메틸 및 오랜지맛 등이 있다. 이와 같이 다양한 조성물을 제조하는데에 사용되는 물질은 약학적으로 순수해야 하고, 그 사용량은 무독성이어야 한다.

본 발명의 조성물은 비 경구 투여 경로 예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 초 내 또는 피하 주사에 의해 용이하게 투여될 수 있다. 비 경구 투여는 본 발명의 항체 조성물을 용액 또는 현탁액 중에 통합함으로써 수행될 수 있다. 이러한 용액 또는 현탁액은 또한 멸균 희석제 예를 들어, 주사용 물, 염수 용액, 불휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매를 포함할 수도 있다. 비 경구 투여용 제형은 또한 항균제 예를 들어, 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤, 항산화제 예를 들어, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨 및 킬레이트화제 예를 들어, EDTA를 포함할 수도 있다. 완충액 예를 들어, 아세트산염, 구연산염 또는 인산염과, 강장 조절제 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로즈도 첨가될 수 있다. 비 경구 투여용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 시린지 또는 복수 투여용 바이알에 봉입될 수 있다.

직장 내 투여는 직장 또는 대장에 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 이는 좌제 또는 관장제를 사용하여 수행될 수 있다. 좌제 제형은 당 업계에 공지된 방법에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 좌제 제형은 글리세린을 약 120℃로 가열하고, 이 항체 조성물을 글리세린 중에 용해시켜, 정제수를 첨가할 수 있게 된 이후에 상기 가열된 글리세린과 혼합한 후, 상기 뜨거운 혼합물을 좌제 틀에 부어 제조될 수 있다.

경피 투여는 조성물이 피부를 통하여 경피적으로 흡수되는 것을 포함한다. 경피 투여용 제형으로서는 패치, 연고, 크림, 겔 및 고약 등을 포함한다.

본원에 기술된 항체 조성물은 또한 초기 부패증 매개 인자의 길항제를 포함할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 초기 부패증 매개 인자란, 염증 시토킨 연쇄 반응의 유도 이후(예를 들어, LPS에 노출된 이후) 얼마 안 있어(30∼60분 이내) 세포로부터 방출되는, 전 염증 시토킨이다. 이러한 시토킨의 비 제한적인 예로서는 TNF, IL-1α, IL-1β, IL-6, PAF 및 MIF가 있다. 초기 부패증 매개 인자로서는 이러한 시토킨(예를 들어, 제1형 종양 괴사 인자 수용체) 및 이 시토킨의 생산에 필요한 효소(예를 들어, 인터루킨-1β 전환 효소)에 대한 수용체도 포함한다. 현재 알려져 있거나 또는 이후에 발견될 임의의 초기 부패증 매개 인자의 길항제는 염증 시토킨 연쇄 반응을 더욱 억제함으로써 이러한 구체예에 유용할 수 있다.

초기 부패증 매개 인자의 길항제에 관한 비 제한적인 예로서는, 초기 부패증 매개 인자의 mRNA에 결합하여 이 mRNA가 발현되는 것을 막아주는 안티센스 화합물(예를 들어, Ojwang외 다수, 1997, Biochemistry 36:6033-6045; Pampfer외 다수, 1995, Biol. Reprod. 52:1316-1326; 미국 특허 제6,228,642호; Yahata외 다수, 1996, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6:55-61 ; 및 Taylor외 다수, 1998, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8:199-205), 초기 부패증 매개 인자의 mRNA를 특이적으로 절단하는 리보자임(예를 들어, Leavitt외 다수, 2000, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10: 409-414; Kisich외 다수, 1999; 및 Hendrix외 다수, 1996, Biochem. J. 314: 655-661), 그리고 초기 부패증 매개 인자에 결합하여, 이 매개 인자의 작용을 억제하는 항체(예를 들어, Kam and Targan, 2000, Expert Opin. Pharmacother. 1: 615-622; Nagahira외 다수, 1999, J. Immunol. Methods 222, 83-92; Lavine외 다수, 1998, J. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 52-58; 및 Holmes외 다수, 2000, Hybridoma 19: 363-367)이 있다. 현재 알려져 있거나 또는 이후에 발견될 초기 부패증 매개 인자의 임의의 길항제는 본 발명의 범위 내에서 구체화된다. 당 업자는 임의의 특정 염증 시토킨 연쇄 반응을 억제하는데에 사용될 초기 부패증 매개 인자의 본 조성물 중의 양을, 통상의 투여량-반응 연구에 따라서 결정할 수 있다.

8. 진단 및 이미지화

목적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지화된 항체, 그리고 이의 유도체와 유사체는 본 발명의 폴리펩티드의 이상 발현 및/또는 활성과 관련된 질병 및/또는 질환을 검출, 진단 또는 관찰하기 위한 진단용으로서 사용될 수 있다. 본 발명은 (a) 목적 폴리펩티드에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 개체의 체액 또는 세포 내에서 목적 폴리펩티드가 발현되는지 여부를 검정하는 단계 및 (b) 표준적인 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교하여, 검정된 폴리펩티드 유전자 발현 수준이 표준적인 발현 수준에 비하여 증가 또는 감소하였는지 여부를 통해 이상 발현되었는지를 판단하는 단계를 포함하는, 목적 폴리펩티드의 이상 발현 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 (a) 목적 폴리펩티드에 특이적인 하나 이상의 항체를 사용하여 개체의 세포 또는 체액 중에서 목적 폴리펩티드가 발현되는지 여부를 검정하는 단계 및 (b) 표준적인 유전자 발현 수준과 유전자 발현 수준을 비교함으로써, 검정된 폴리펩티드 유전자 발현 수준이 표준적인 발현 수준에 비하여 증가 또는 감소하였는지 여부를 통해 특정 질환이 발생하였는지 여부를 판단하는 단계를 포함하는, 질환을 진단하는 진단 검정법을 제공한다.

본 발명의 항체는 당 업자에게 공지된 통상의 면역 조직 화학적 방법을 이용하여 생물 시료 중의 단백질 수준을 검정하는데에 사용될 수 있다[예를 들어, Jalkanen,외 다수, 1985, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen,외 다수, 1987, J. Cell. Biol. 105:3087-3096]. 단백질 유전자 발현을 검출하는데에 유용한 기타 항체계 방법으로서는, 면역 검정법 예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 감정법(ELISA) 및 방사성 면역 검정법(RIA)을 포함한다.

본 발명의 항체를 표지화하는데에 당 업계에 공지된 기술이 적용될 수 있다. 이러한 기술의 예로서는 이중 작용성 컨쥬게이트화제를 사용하는 기술을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다[예를 들어, 미국 특허 제5,756,065호; 동 제5,714,631호; 동 제5,696,239호; 동 제5,652,361호; 동 제5,505,931호; 동 제5,489,425호; 동 제5,435,990호; 동 제5,428,139호; 동 제5,342,604호; 동 제5,274,119호; 동 제4,994,560호; 및 동 제5,808,003호].

본 발명의 하나의 구체예는, 동물 바람직하게는 포유 동물 및 가장 바람직하게는 인간의 체 내에서 목적 폴리펩티드의 이상 발현과 관련된 질병 또는 질환을 검출 및 진단하는 것이다. 하나의 구체예에서, 진단 방법은 (a) 목적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 표지화된 분자를 유효량만큼 개체에 투여(예를 들어, 비 경구, 피하 또는 복강 내 투여)하는 단계 ; (b) 폴리펩티드가 발현되는 개체 내 임의 위치에 표지화된 분자가 바람직하게 집약될 수 있도록(그리고 미 결합 표지화 분자가 소멸되어 백그라운드 수준이 낮아질 수 있도록), 투여한 이후에 일정 기간 대기하는 단계; (c) 백그라운드 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 개체 내 표지화된 분자를 검출하여, 표지화된 분자가 백그라운드 수준 이상으로 검출되는 것을 통해, 이 개체에 목적 폴리펩티드를 이상 발현하는 것과 관계된 특정 질병 또는 질환이 발병하였음을 판단하는 단계를 포함한다. 백그라운드 수준은 다양한 방법 예를 들어, 표지화된 분자의 검출량을 특정 시스템에 대하여 미리 측정한 표준치와 비교하는 방법에 의해 측정될 수 있다.

뿐만 아니라, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 항체는 부패증, 류머티즘성 관절염, 복막염, 크론병, 재 관류 손상, 패혈증, 내독소 쇼크, 낭포성 섬유증, 심내막염, 건선, 건선성 관절염, 관절염, 과민성 쇼크, 기관 허혈, 재 관류 손상 및 동종 이식편 거부 반응이 발생한 개체의 치료, 진단 또는 예측에 사용될 수 있다.

당 업자는 개체의 크기와 사용된 이미지화 시스템이 진단용 이미지를 형성하는데에 필요한 이미지화 부분의 양을 결정할 것이라는 사실을 이해할 것이다. 인간인 개체에 있어서 방사성 동위 원소 부분의 경우, 주사된 방사능 양은 일반적으로 ⁹⁹Tc 약 5∼20 밀리큐리일 것이다. 표지화된 항체 또는 항체 단편은 이후 특이적 단백질을 함유하는 세포의 위치에 축적되는 것이 바람직할 것이다. 생체 내 종양 이미지화에 관하여는 문헌[S.W. Burchiel외 다수, "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Chapter 13, Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S. W. Burchiel and B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 기술되어 있다.

사용된 표지의 종류와 투여 방식을 비롯한 몇몇 변수에 따라서, 표지화된 분자가 개체 내 특정 위치에 바람직하게 집약될 수 있으며, 미 결합 표지화 분자가 백그라운드 수준까지 소멸될 수 있도록, 투여된 이후의 대기 시간 간격은, 6∼48 시간, 또는 6∼24 시간, 또는 6∼12 시간으로 잡는다. 다른 구체예에서, 투여 후의 시간 간격은 5∼20일 또는 5∼10일이다.

하나의 구체예에서, 질병 또는 질환의 관찰은, 질병 또는 질환을 예를 들어, 처음 진단한 지 1개월 경과 후, 처음 진단한 지 6개월 경과 후, 처음 진단한 지 1년 경과 후에 반복적으로 진단함으로써 수행된다.

표지화된 분자의 존부는 생체 내 스캐닝에 관하여 당 업계에 공지된 방법을 이용하여 환자의 체 내에서 확인될 수 있다. 이러한 방법은 사용된 표지의 유형에 따라서 달라진다. 당 업자는 특정 표지를 검출하는 적당한 방법을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 진단 방법에 사용될 수 있는 장치 및 방법으로서는 컴퓨터 단층 촬영(CT), 전신 스캐닝 예를 들어, 양전자 단층 촬영(PET), 자기 공명 이미지화(MRI) 및 초음파 검사법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 분자는 방사성 동위 원소로 표지화되며, 이는 방사선 반응성 수술 기구를 이용하였을 때 환자 내에서 검출된다[Thurston외 다수, 미국 특허 제5,441,050호]. 다른 구체예에서, 분자는 형광 화합물로 표지화되며, 형광성 반응성 스캐닝 기구를 이용하여 환자 체내에서 검출된다. 다른 구체예에서, 분자는 양전자 방사 금속으로 표지화되며, 또한 양전자 단층 촬영을 사용하여 환자 체내에서 검출된다. 또 다른 구체예에서, 분자는 상자성 표지로 표지화되고, 또한 자기 공명 이미지화(MRI)를 이용하여 환자 내에서 검출된다.

도 1은 인간 HMG1 및 HMG2의 정렬을 나타내는 것이다. A 박스는 실선으로 밑줄 친 부분이고; B 박스는 점선으로 밑줄 친 부분이다.

도 2는 본 발명의 인간 항-HMG1 항체의 중쇄 가변부(V_H) 및 경쇄 가변부(V_L)의 뉴클레오티드 서열 및 이에 상응하는 아미노산 서열을 나타내는 것이다. 밑줄 친 부분에 대한 설명: CDR(캐벗 정의; Kabat definition). A) S2 V_L(서열 번호 5∼6); B) S2 V_H(서열 번호 7∼8); C) S6 V_L(서열 번호 9∼10); D) S6 V_H(서열 번호 11∼12); E) S16 V_L(서열 번호 13∼14); F) S16 V_H(서열 번호 15∼16); G) G4 V_L(서열 번호 17∼18); H) G4 V_H(서열 번호 19∼20); I) E11 V_L(서열 번호 24∼25); 및 J) E11 V_H(서열 번호 26∼27). 서열 번호는 아미노산 및 뉴클레오티드 서열에 관한 것으로서, 상세한 정보는 표 3을 참조하시오.

도 3은 인간 항-HMB1 항체의 물리적 특성을 나타내는 것이다. 도 3a는 인간 항-HMB1 항체 패널의 등전 초법(IEF) 분석 결과를 나타내는 것으로서, 이를 통하여 상이한 인간 항-HMG1 항체에 대한 pI 값이 광범위함(예를 들어, 약 7.77∼9.24)을 알 수 있다. 도 3b는 인간 항-HMG1 항체 패널의 시차 주사 열 계량법(DSC)의 분석 결과를 나타내는 것으로서, 이를 통하여 상이한 인간 항-HMG1 항체에 대한 Tm 값이 광범위함(예를 들어, 약 66∼약 90℃)을 알 수 있다. 도 3c는 IEF 및 DSC 분석 결과를 그래프로 나타낸 것으로서, 이를 통하여 pI 값과 Tm 값 사이에는 직접적인 상 관 관계가 없음을 알 수 있다.

도 4는 인간 항-HMG1 항체의 결합 동력학 및 결합 특이성을 나타내는 것이다. 도 4a는 인간 항-HMG1 항체 중 몇몇에 대한 HMG1 포획 ELISA(HMG1 capture ELISA)로부터 얻어진 결합 곡선을 나타내는 것으로서, 이를 통하여 상기 항체는 이.콜라이(E.coli) 생산 재조합 HMG1에 대한 친화도가 상이함을 알 수 있다. 도 4b는 재조합 HMG1(좌측) 및 원래의 핵 내 HMG1(우측)의 포획 결과와 비교되고 있는, 몇몇 인간 항-HMG1 항체에 대한 HMG1 포획 ELISA로부터 얻어진 결합 곡선을 나타내는 것으로서, 이를 통하여 S16과 G4는 HMG1의 두 가지 형태 모두와 결합하는 반면에, S2, S6 및 S10은 원래의 핵 내 HMG1 보다는 재조합 HMG1에 더욱 잘 결합함을 알 수 있다. 도 4c는 원래의 핵 내 괴사성 및 활성화 HMG1의 포획 결과와 비교되고 있는, 몇몇 인간 항-HMG1 항체에 대한 HMG1 포획 ELISA로부터 얻어진 결합 곡선을 나타내는 것으로서, 이를 통하여 S6은 다양한 형태의 HMG1과 상이한 친화도로 결합하는 반면에(G4는 이보다 더 낮은 정도로 다양한 형태의 HMG1과 결합함), S16은 그렇지 않음을 알 수 있다. 도 4d는 2개의 상이한 포획 방식 즉, 고정화 항체(■) 및 고정화 HMG1(▲)과 비교되고 있는, 몇몇 인간 항-HMG1 항체에 대하여 수행된 포획 ELISA 검정법에서 얻어진 결합 곡선을 나타내는 것으로서, 이를 통하여 E11은 가용성 HMG1에 대한 친화도가 보다 높았지만(S17의 경우는 상기 E11보다는 낮음), G2, G4, G9 및 G12는 고정화 또는 가용성 HMG1에 대한 결합 정도의 차이가 별로 크지 않았음을 알 수 있다. 도 4e는 HMG1 및 HMG2에 대한 몇몇 인간 항-HMG1 항체의 상대적 결합 친화도를 나타내는 ELISA 데이터로서, 이를 통하여 시험된 항체의 대부 분(G2, G4, G9, G12, S3, G20, G34, G35, S2, S6, S1O, S14 및 S17)은 HMG1에 대해 특이적인 반면에, S12 및 S16은 HMG1과 HMG2 둘 다와 어느 정도 결합하였고, E11은 본 검정법에서 HMG2에 대한 결합 친화성이 더욱 높다는 사실을 알 수 있었다. 본 검정법으로부터 얻어진 데이터와 여기에 제시하지 않은 기타 사항들은 표 1에 요약하여 나타내었다.

도 5는 HMG1 B 박스 에피토프 맵핑 연구 결과를 나타내는 것이다. 몇몇 인간 항-HMG1 항체에 대한 HMG1 B 박스 펩티드 ELISA로부터 얻어진 결합 곡선을 나타냈다. 이 곡선들을 통하여, S12, S16 및 G4는 HMG1의 91∼169번 펩티드와 결합함을 알 수 있다(도 5a). S12는 또한 HMG1의 150∼183번 펩티드와도 결합한다(도 5b). 시험된 나머지 항체들(S2, S6, S10, G2 및 G9)은 본 검정법에서 시험된 HMG1 B 박스 펩티드 중 어느 하나와 결합하지 않는다.

도 6은 다수의 인간 항-HMG1 항체가 인간 PBMC로부터 HMG1 자극되어 시토킨이 방출되는 것을 억제한다는 사실을 나타내는 것이다. 도 6a는 각각 몇몇 인간 항-HMG1 항체(G9, S14, G20, S2, S6 및 S17)에 대한 재조합 HMG1 자극 IL-1B, IL-6 및 TNF-α 방출 억제 활성의 투여량 반응 곡선을 나타내는 것이다. 그 결과를, 방출된 시토킨 양(pg/㎖)(위 그래프)과 억제%(아래 그래프)로서 나타내었다. 도 6b는 몇몇 부가 인간 항-HMG1 항체들(G4, S6, S16 및 S6+S16)과 RAGE-Fc 융합 단백질에 대한 재조합 HMG1 자극 IL-6 방출 억제 투여량 반응 곡선을 나타내는 것이다. 도 6c는 각각 E11, S13, S16, S17, G4, G9, S6, RAGE-Fc 및 A 박스 융합 단백질에 대한 천연 활성화 HMG1 자극성 IL-6 시토킨 방출 억제 투여량 반응 곡선을 나타내는 것이다. 이 데이터와 여기에 제시하지 않은 다른 데이터로부터 계산된 IC₅₀ 값은 표 1에 요약하여 나타내었다.

도 7은 일부 인간 항-HMG1 항체가 마우스 대식 세포(mMφ) 내에서 HMG1 자극성 시토킨 유전자 발현을 억제함을 나타내는 것이다. IL-1β(좌측) 및 TNF-α(우측)의 상대적 유전자 발현율은 완충액, 재조합 HMG1(E-HMGB1) 단독 처리된, 그리고 E-HMGB1과 인간 동 기준 표본 대조구(HuIgG), 인간 항-HMG1 항체(E11, G2, G4, S6 및 올리고클로날 항체) 뿐만 아니라, 마우스 및 인간 RACE-Fc 융합 단백질 처리된 마우스 대식 세포에 대해 나타내었다. E11, G2, G4 및 올리고클로날 항체 및 RAGE-Fc 융합 단백질은 IL-1β 발현을 강하게 억제하였다. G2 및 마우스 RAGE-Fc 융합 단백질은 TNF-α 발현을 강하게 억제하였다. 이러한 데이터와 여기에 제시하지 않은 데이터에 관하여는 표 1에 요약하였다.

도 8은 인간 항-HMG1 항체의 하위 세트가 재조합 HMG1이 RAGE에 결합하는 것을 차단함을 나타내는 것이다. ELISA계 결합 검정법은 HMG1이 RAGE-Ig 융합체에 결합하는지 여부를 측정하는데에 사용되었다. 다수의 인간 항-HMG1 항체에 대한 억제%를 나타내었다. G2, G4, S1O, S16, S2 및 S6는 HMG1이 RAGE에 결합하는 것을 차단하는 능력이 상당하였던 반면에, E11, G12, G16, G20, G34, G9, 올리고클로날 항체, S12, S14 및 S17은 그렇지 않았다. 이 데이터 및 여기에 제시하지 않은 다른 데이터에 관하여는 표 1에 요약하였다.

도 9는 TLR4 활성화는 부분적으로 E11에 의해 차단됨을 나타내는 것이다. HMG1 유도성 TLR4 활성화는 세포계 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 측정되었다. 배지만을 단독 처리한 세포, 재조합 HMG1 (rHMGB)만을 단독 처리한 세포 및 rHMGB와 S2, E11, S6, G4, S14 또는 폴리클로날 항체를 함께 처리한 세포에 대한 총 루시퍼라제 활성을 나타내었다. E11은 HMG1 유도성 TLR4 활성화를 차단하는 능력이 상당하였다. 이 데이터와 여기에 제시하지 않은 다른 데이터에 관하여는 표 1에 요약하였다.

도 10은 재조합 HMG1 및 Thp-1 세포 결합의 억제를 나타내는 것이다. E11, G2 및 RAGE-Fc 융합 단백질에 의해 재조합 HMG1 및 Thp-1 세포의 결합이 억제됨을 나타내는 각각의 투여량 반응 곡선을 나타내었다. 상기 데이터로부터 계산된 IC50 값과 여기에 제시하지 않은 다른 데이터에 관하여는 표 1에 요약하였다.

도 11은 부패증에 관한 마우스 CLP 모델에 있어서 인간 항-HMG1 항체가 보호 효능을 가짐을 나타내는 것이다. 인간 항-HMG1 항체 또는 인간 동 기준 표본 대조구 항체(R3-47)를 사용하여 처리한 결과와 비교되는, 부패증에 관한 마우스 CLP 모델로부터 얻어진 각각의 생존 곡선을 나타내었다. G4(도 11a 및 11b), S16(도 11a 및 도 11d), S6(도 11c), E11 및 올리고클로날(도 11d) 항-HMG1 항체는 생존율을 60%까지 개선할 수 있다.

도 12는 염증 질환의 몇몇 모델에 있어서 HMG1 수준이 상승 조절된다는 사실을 나타내는 것이다. 10일째 되는 날에 미처리 수동적 CIA 마우스로부터 수집한 앞발에 존재하는 HMG1의 수준은 정상인 마우스에 존재하는 HMG1 수준에 비하여 10배 이상까지 증가함을 알 수 있었다(도 12a). HMGB1, RAGE, TLR2, TLR4 및 TLR9의 상 대적 유전자 발현 수준은 뒷발의 경우 증가하였던 반면에(우측), HMGB1, RAGE 및 TLR2는 미처리 능동적 CIA 마우스의 앞발 관절에서만 증가하였음을(좌측) 알 수 있었다(도 12b). IL-1b, IL-6 및 TNF-α의 상대적 유전자 발현 수준은 미처리 능동적 CIA 마우스의 앞발(그래프) 및 뒷발(그래프) 관절에서 모두 증가하였음을 알 수 있었다(도 12c). ALA 래트 발목 관절에서의 HMGB1 수준의 상승(우측 상부)은, 발 염증 스코어(paw inflammation score; 좌측 상부) 상승 및 상대적 체중 감소(좌측 하부)와 상관성이 있다(도 12d). HMGB1 수준이 에스.아우레우스(S. aureus) 공격 후 2 시간 경과시부터 계속해서 상승하고, TNF-α 수준은 공격 후 2시간 경과시 피크에 이르렀다가 다시 약 7시간 경과시 기준선에 근접하게 하강하고, 또 약 12시간 경과시 두번째로 피크에 이르렀으며, 또한 IL-6 수준은 약 2시간 경과시 피크에 도달한 후, 그 이후로는 천천히 증가한 것으로 보아, 에스.아우레우스의 공격을 받은 동물의 혈청 중에 존재하는 HMGB1, IL-1B 및 TNF-α의 수준은 상승함을 알 수 있다(도 12e). ALI 마우스로부터 얻은 BAL액 중 HMGB1 수준은 LPS 투여 후 50 시간 경과 이내에 16 ng/㎖ 이상으로 상승하였으며, 이때 약 26시간 경과시에 가장 급격히 상승하기 시작하였는데(좌측), 이는 BAL액에 존재하는 세포의 총수가 최대로 증가하는 것과 상관이 있다(우측)(도 12f). PBS, 인간 동 기준 표본 대조구(HuIgG), 항-HMG1 항체 G4, HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질, 메틸트렉세이트(MTX), MTX + HuIgG, MTX + 렌브렐(Renbrel), 그리고 MTX + G4로 처리한 후 AIA 래트의 발목 관절에 존재하는 HMGB1(좌측 상부) 및 IL-6 (좌측 하부)의 수준을 나타냈다. 또한, HuIgG, G4, 또는 MTX + HuIgG로 처리한 이후 AIA 래트의 발목 관절에 존재하는 TNF-α(우 측 상부)의 수준도 나타내었다. G4만을 단독 처리하였을 때와 MTX + HuIgG 또는 MTX + 렌브렐(Renbrel)을 처리하였을 경우에도 HMG1, IL-6 및 TNF-α의 수준이 감소하였으나, MTX + G4를 함께 처리하였을 경우에 그 수준이 가장 급격하게 감소하였음을 알 수 있었다. 이 데이터는 다양한 처리에 따른 발 염증 스코어 감소와 상관이 있는 것이다(도 16b).

도 13은 인간 항-HMG1 항체는 관절염에 관한 수동적 CIA 마우스 모델에서 보호 효능을 보유함을 나타내는 것이다. 도 13a는 MTX 및 렌브렐(좌측 상부), 인간 항-HMG1 항체 S6(우측 상부) 및 G16 (좌측 하부), 그리고 HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질(우측 하부)로 처리한 수동적 CIA 마우스의 경시적 발 염증 스코어를 나타내는 것이다. MTX/렌브렐과 S6 항체를 함께 처리하였을 경우, 이 모델에서 가장 탁월한 효과를 나타내는 S6에 의한 임상 스코어가 떨어졌다. 앞발 및 뒷발(도 13b) 또는 앞발만(도 13c)에 대한 해부학적 관찰을 통하여 얻어진 골(좌측 상부), 연골(우측 상부) 및 염증(좌측 하부) 스코어의 그래프를 나타내었다. 도 13d는 MTX와 렌브렐(좌측 상부), 인간 항-HMG1 항체 S6(우측 상부) 및 G16(좌측 하부), 그리고 HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질(우측 하부)로 처리한 마우스의 경시적 체중 지수를 나타내는 것이다. 임상 스코어를 통하여, MTX/렌브렐과 S6을 처리하였을 경우 모두 보호 효능을 보였으며, 이때 S6를 처리하였을 경우, 그 효능이 더욱 탁월하였음을 알 수 있다.

도 14는 인간 항-HMG1 항체는 관절염의 수동적 CIA 마우스 모델에서 보호 효능을 나타냄을 보여주는 것이다. 실험 2(도 14a): PBS, 렌브렐 또는 G4(우측)로 처 리한 수동적 CIA 마우스와, PBS, G4 또는 동 기준 표본 대조구 항체(좌측)로 처리한 수동적 CIA 마우스의 경시적 발 염증 스코어. 실험 3(도 14b): PBS, G4 또는 동 기준 표본 대조구 항체로 처리한 수동적 CIA 마우스의 경시적 발 염증 스코어. 정상 마우스의 임상 스코어도 추적하여 상기 두 가지 처리의 경우에 대하여 그래프로 나타내었다. 상기 두 실험을 통하여, G4 인간 항-HMG1 항체는 본 모델에서 염증을 억제할 수 있다는 사실이 입증되었다. 실험 2에서, G4는 렌브렐보다 그 효능이 더욱 우수하였음을 알 수 있었다.

도 15는 인간 항-HMG1 항체는 관절염에 관한 능동적 CIA 마우스 모델에서 보호 효능을 나타냄을 보여주는 것이다. 도 15a는 PBS, 동 기준 표본 대조구 항체 또는 G4로 처리한 능동적 CIA 마우스(좌측 그래프)와, PBS 또는 렌브렐로 처리한 능동적 CIA 마우스(우측 그래프)의 경시적 발 염증 스코어를 나타내는 것이다. 도 15b는 동 기준 표본 대조군과 G4 항체 처리 군의 경시적인 상대적 체중을 그래프로 나타내는 것이다. 또한, 도 15a∼15b에는 PBS 처리 마우스와 정상 마우스의 스코어도 그래프로 나타내었다. G4 인간 항-HMG1 항체는 본 모델에 있어서 렌브렐의 경우보다 염증 완화 및 체중 감소 억제에 있어서 우수한 효능을 나타냈다.

도 16은 인간 항-HMG1 항체가 관절염에 관한 AIA 래트 모델에 있어서 보호 효능을 나타냄을 보여주는 것이다. 발 염증 스코어를 PBS, 동 기준 표본 대조구 항체 또는 G4로 처리한 AIA 래트(좌측)와, PBS 또는 렌브렐로 처리한 CIA 마우스(우측)에 대하여 경시적인 그래프로 나타내었는데(도 16a 및 16b), 이 그래프들을 통하여, 본 모델에서 G4 항-HMG1 항체는 PBS 대조구의 경우에 비하여 발 염증 스코어 를 약 35% 까지 감소시킬 수 있었던 반면에, 렌브렐 만을 단독으로 처리한 경우에는 PBS 대조구의 경우에 비하여 발 염증 스코어를 25% 까지 감소시킬 수 있었음을 알 수 있었다(도 16a). 메토트렉세이트와 제2의 시약(동 기준 표본 대조구, G4 또는 렌브렐)을 함께 처리한 AIA 래트에 대한 발 염증 스코어를 경시적 그래프로 나타내었으며(도 16b), 이를 통하여 MTX 및 G4를 함께 처리하면 G4만을 단독 처리하는 경우와 MTX/렌브렐을 함께 처리하는 경우보다 더 효과적임을 알 수 있었다. MTX 및 G4를 함께 처리하면 발 염증 스코어는 정상 수준에 가깝게 감소하였다(도 16b). 또한, HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질로 처리하였을 경우의 발 염증 스코어는 G4만을 단독 처리하였을 경우의 발 염증 스코어도 나타내었다.

도 17은 복막염 마우스 모델에 있어서 인간 항-HMG1 항체가 보호 효능을 나타냄을 보여주는 것이다. 열 불활성화 에스.아우레우스로 공격하여 복막염을 유발시킨 마우스의 생존 %를 96 시간에 걸쳐서 나타낸 결과, G4는 PBS 또는 동 기준 표본 대조구(R347)로 처리한 마우스에 비하여 생존율을 거의 30%까지 개선시켰음을 알 수 있었다(도 17a). 항체는 에스.아우레우스 공격(0분(▲))하기 30 분 전(☆)에 투여하였다.

도 18은 인간 항-HMG1 항체가 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델에서 보호 효능을 나타냄을 보여주는 것이다. G4 또는 E11로 처리한 ALI 마우스로부터 얻은 BAL액에서 회수한 전체 세포는 동 기준 표본 대조구 항체(R347)로 처리한 마우스에 비하여 거의 40% 정도로 감소하였다. HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질로 처리한 경우에만 전체 세포 회수율이 23%까지 감소하였다.

도 19는 다발성 경화증(MS) 표본인 인간 뇌 조직에 있어서의 HMG1 염색 패턴을 나타내는 것이다. 도 19a: 1㎍/㎖ 동 기준 표본 대조구를 이용하여 활성화된 소교세포와 함께 MS 플라크를 백그라운드 염색한 결과. 도 19b: 1㎍/㎖ G16을 이용하여 활성화된 소교세포로 MS 플라크 간질과 소교세포의 세포질을 HMGB1으로 특이 염색한 결과. 도 19c: 1㎍/㎖ G16을 이용하여, 탈수초화된 MS 플라크, 소수의 활성화된 소교세포 및 다수의 림프구를 염색하였을 때 염색 정도가 감소한 결과.

표의 간단한 설명

표 1은 항체 특성 및 기탁 정보를 나타내는 것이다.

표 2는 보존적 아미노산 치환 군을 나타내는 것이다.

표 3은 서열 목록에 대한 설명이다.

표 4는 수동적 CIA 마우스 모델 처리 절차에 대한 설명이다.

표 5는 AIA 래트 모델 처리 절차에 대한 설명이다.

표 6은 복막염 모델 처리 절차에 대한 설명이다.

이하, 본 발명을 다음과 같은 실시예를 참고로 하여 설명하고자 한다. 이하 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공된 것이며, 본 발명은, 이와 같은 실시예에 제한되어 해석되어서는 안 될 것이며, 또한 본원에 제공된 교시에 따라 명백한 임의의 변형예 그리고 모든 변형예를 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1

인간 항- HMG1 항체의 개발 및 물리적 특성 규명

인간 HMG1(서열 번호 1 및 2, 도 1 참조)에 대하여 수 회 패닝(panning)하여 원래의 인간 Fab 파지 디스플레이 라이브러리로부터 인간 항-HMG1 항체의 큰 패널(pannel)을 분리하였다. 이후 클론을 서열 결정하여 중복되어 존재하는 클론을 제거하고, 전장 IgG를 생산하기 위해 발현 벡터에 Fab 단편을 서브클로닝하였다. 몇몇 항체 클론(G2, G4, G9, G12, G16, G20, G34, G35, S2, S6, S10, S12, S14, S16, S17 및 E11)의 경쇄 및 중쇄 가변부의 뉴클레오티드 및 상응하는 아미노산 서열을 서열 목록(특정 서열 번호에 대한 표 3 참조)에 제시하였다. 도 2는 몇몇 항체 클론(S2, S6, S16 및 G4)의 중쇄 및 경쇄 가변부를 나타내는 것으로서, 이는 미국 모식균 배양 수집소(기탁 번호: 각각 PTA-6142, PTA-6143, PTA-6259 및 PTA-6258)에 기탁되어 있는 것이다. 도 2는 또한 항-HMG1 항체인 E11의 중쇄 및 경쇄 가변부를 나타내는 것이다. 도 2에 도시된 각 항체에 대한 CDR에는 밑줄을 쳐서 나타내었으며, 또한 서열 목록에도 제시하였다(특정 서열 번호에 대한 표 3 참조). 결과로 생성된 전장 항체를 정제하고, 이의 물리적 특성을 이하에 기술된 바와 같이 측정하였다. 표 1에 요약된 바와 같이, 분석 결과, 개발된 인간 항-HMG1 항체는 광범위한 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.

재료 및 방법

인간 항- HMG1 항체의 분리: 인간 Fab 파지 디스플레이 라이브러리(Dyax, 메사츄세츠주 캠브리지 소재)를 다음과 같이 3 라운드로 이루어진 패닝 과정에 의해 스크리닝하였다: 제1일. I) 면역 튜브(immunotube)를 0.1 M 탄산염 완충액(pH 9.6) 중 20 ㎍/㎖의 전장 HMGB-1으로 코팅한다. 이를 4℃에서 밤새도록 방치한다. 제2 일. I) 라이브러리 크기의 100배인 파지를 사용함. 1/5 부피의 PEG6000(20%)을 가하였다. 이를 1 시간 동안 얼음 상에 놓아둔다. 이를 10분 동안 14000 rpm으로 회전시킨다. 이를 PBS (pH 7.4) 중에 재현탁하여 파지 라이브러리를 침전시켰다. II) 항원-코팅된 면역 튜브와 파지를 모두 2% 우유/PBS로 차단시킨다. 이후 면역 튜브를 PBS로 2회 헹구고, 파지를 면역 튜브로 옮긴 다음, 30분 동안 회전시켜 혼합하고, 그 다음 추가로 1시간 30분 동안 고정된 상태로 항온 처리한다. III) 상기 면역 튜브를 PBST (PBS + 0.1% Tween 20)로 10∼20회 세척한 후, 다시 PBS로 10∼20회 세척하고, 파지는 100 mM 트리에틸아민 1㎖와 함께 용리시킨다. 용리된 파지는 1 M Tris-HCl (pH 7.5) 0.5 ㎖로 중화시킨다. IV) 용리된 중화 파지 1 부피와 대수기 TG1 5 부피, 그리고 2YT 4부피를 혼합한다. 이를 37℃에서 30분 동안 항온 처리한다(수조). 감염된 세포를 원심 분리로 수집하고, 이를 2YT 중에 재현탁한 다음, 다시 카베니실린과 2% 글루코즈를 함유하는 2YT 아가 상에 도말한다.

인간 항- HMG1 올리고클로날 및 모노클로날 항체의 발현 : 플라스미드를 패닝 과정 중 제3 라운드 수행 이후에 몇몇 박테리아 풀로부터 추출하였다. 이후 Fab 유전자 단편을 이 플라스미드로부터 잘라내고, 이를 CMV 프로모터의 제어하에 있는 IgG 발현 벡터 내에 삽입하였다. Fab 단편을 보유하는 IgG 발현 벡터 플라스미드를 293H 세포에 일시적으로 형질 감염시키고, 올리고클로날 항체를 단백질 A 컬럼을 통과시켜 생육 배지로부터 분리하였다. 올리고클로날 항체의 각 풀을 HMG1에 대한 반응성에 관하여 시험하였다. 양성으로 판명된 풀을 추가로 스크리닝하여 각각의 양성 클론을 동정하였다.

등전 초점 겔 전기 영동법 : 멀티 템프 3(multi temp 3) 냉장 조 재 환류 단위와 EPS 3501 XL 동력 공급원이 장착된 파마시아 바이오테크 멀리포어 2(Pharmacia Biotech Multiphor 2) 전기 영동 시스템을 사용하여 등전점을 측정하였다. 미리 형성해 놓은 암폴린 겔(Amersham Biosciences, pI = 2.5∼10)에 5㎍의 단백질을 로딩하였다. 광범위한 pI 마커 표준(Amersham, pI = 3∼10, 8 ㎕)을 사용하여 Mab에 대한 상대적 pI를 측정하였다. 전기 영동을 1500 V, 50 mA에서 105분 동안 수행하였다. 이 겔을 정제수로 1× 희석시킨 시그마 고정화 용액(5×)을 이용하여 고정시켰다. 심플리 블루(Simply Blue)(Invitrogen)를 이용하여 실온에서 밤새도록 염색을 실시하였다. 25% 에탄올, 8% 아세트산 및 67% 정제수로 이루어진 용액으로 탈색하였다. 등전점은 표준 측정 곡선을 비교 기준으로 삼아 바이오-래드 밀도 측정계(Bio-Rad Densitometer)를 이용하여 측정하였다.

시차 주사 열량 측정법: 주사 속도 1.0℃/분, 온도 범위 25∼120℃로 하여, VP-DSC(MicroCal, LLC)로써 용융점 온도(Tm)를 측정하였다. 5분 동안 서모스테이팅(thermostating) 예비 주사시 필터링 시간은 8초로 하였다. 피어스 투석 컵(Pierce dialysis cup)(3.5 kDa)을 이용하여 25 mM 히스티딘-HCl(pH6)에 투석하여 시료를 마련하였다. 평균 Mab 농도는 A₂₈₀에 의해 측정한 결과 50 ㎍/㎖였다. 오리진(Origin) 소프트웨어 사양의 시스템을 이용하여 제조자의 방법에 따라서 용융 온도를 측정하였다. 간단히 말해서, 시료 및 참고용 세포 둘 다의 완충액을 전개하여 다수의 기준선을 얻었으며, 그 결과 열적 평형 상태를 확립하였다. 기준선을 시 료 온도 기록으로부터 공제한 후, 그 데이터를 보정 함수에 의해 정규화 및 교정하였다.

결과

35개 이상의 개별 Fab 클론들을 단일의 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리하였으며, 이들 중 18개는 전장 IgG1으로 전환되어 일시적 형질 감염법을 통해 정제되었다. 이러한 클론들의 추후 분석 결과를 통하여, 이 클론들은 다양한 특성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다. 예를 들어, 클론은 해리 상수(K_d)가 최고 약 330 nM에서 최저 약 22 nM이었다(표 1에 요약). 안정성에 대한 지표가 되는, Tm 값은 최저 약 70℃에서 최고 약 90℃였다(도 3b 및 3c). 항체의 용해도에 대한 지표가 될 수 있는 pI 값은 또한 항체 pI 값 7.8∼9.0으로서 광범위하였다(도 3a 및 3c). 다양한 특성을 갖는 항체를 다수의 시험관 내 및 생체 내 연구법을 통하여 스크리닝하여(이하 참조), 가장 바람직한 특성의 조합을 결정하였다. 뿐만 아니라, 다수의 기타 클론들은 추가의 스크리닝용으로서 유용하다.

실시예 2

인간 항- HMG1 항체의 동력학적 분석

몇몇 인간 항-HMG1 항체의 특이성 및 결합 동력학적 특성(binding kinetics)을 다양한 기술을 이용하여 관찰하였다. 또한, 몇몇 펩티드를 에피토프 맵핑 연구에 사용하였다. 표 1에 요약되어 있는 바와 같이, 이러한 분석 결과를 통하여 인간 항-HMG1 항체는 결합 동력학적 특성과 결합 특이성이 상이함을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 데이터를 통하여, 항-HMG1 항체는 HMG1 B-박스 및 A-박스를 비롯한 다양한 에피토프에 결합한다는 것을 알 수 있다.

재료 및 방법

재조합 HMG1 의 생산/분리: 재조합 HMG1을 이.콜라이(E.Coli)로부터 칼모듈린 결합 단백질(CBP) 융합 단백질(CBP는 HMGB1의 N-말단과 융합됨)로서 정제하였다. CBP-HMG1 발현 이.콜라이를 2∼3 시간 동안 유도시킨 다음, 25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 8.0) 중에서 미세 유동화하여 단백질을 방출시켰다. 용해된 세포를 125,000 ×g로 1 시간 동안 원심 분리하고, 여과된 상청액을 CaCl₂의 존재 하에 칼모듈린 컬럼에 로딩하였다. 이 컬럼을 2∼2.5 컬럼 부피의 용해 완충액으로 세척한 후, 5 컬럼 부피의 50 mM Tris, 400 mM NaCl, 2 mM CaCl₂(pH 8.0)에 선형 구배를 걸어준 다음, 100 mM Tris, 400 mM NaCl, 5 mM EGTA(pH 8.0)와 함께 단백질을 용리시켰다. 트리톤 X114 추출법을 이용하여 내독소를 제거하였다. TX-114를 사용하여 최종 농도 2%가 되도록 하였으며, 이를 4℃에서 30분 → 37℃에서 30분 동안 항온 처리한 다음, 원심 분리시켜 상을 분리하였다. 단백질을 2회 추출하였다.

천연의 HMG1 의 3가지 형태의 제조 방법: 핵 내 HMG1 을 ATCC 절차에 따라서 10% FBS가 보강된 DMEM 중에서 생육시킨 293H 세포(ATCC 기탁 번호 CRL-1573, 인간 신장 상피 세포)로부터 얻었다. 세포의 80%가 합류 상태가 되었을 때, 여기에 트립신/EDTA를 실온에서 1분 미만 동안 첨가하여 세포를 수집하였다. 플라스크를 PBS로 가볍게 1회 플러싱(flushing)한 후, 1100 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 이후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이를 2㎖ 들이 에펜도르프 튜브로 옮겨 최종 농도가 PBS 중 약 2∼5 × 10⁷ ㎖가 되도록 만들었으며, 이후 이를 액체 질소 중에서 2분 동안 동결시킨 다음, 실온의 수조 중에서 5∼10분 동안 해동시켰다. 동결-해동 과정을 2회 이상 반복하였다. 용해된 세포를 13,000 rpm에서 원심 분리하고, 상청액을 분리하여 새 멸균 튜브에 넣은 다음, 이를 -70∼-80℃에 보관하였다. 사용된 상청액의 양은 동결-해동 이전에 상청액 중 세포 농도를 기준으로 정한다.

방출된 HMG1 을 괴사성 293H 세포의 조건 배양액으로부터 준비한다. 293H 세포를 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 중에서 10일 동안 (배지를 바꾸지 않고) 생육시켰다. 플라스크로부터 배지를 수집하여 이를 3000 rpm에서 10 분 동안 원심 분리시킨 후, 상청액을 0.2 ㎛의 필터에 통과시킨 다음, 이를 투석 백으로 옮겨서 농축 용액(PIERCE)에 대해 투석시켰다. 필요에 따라서, 배지의 부피가 약 10배 감소할 때까지 상기 농축 용액을 바꾸어 주었다. 이후, 농축된 배지를 PBS(pH 7.2)에 대해 투석하였다. 이 농축 시료 중에 존재하는 HMGB1의 농도는 표준으로서 정제 HMGB1을 이용하는 샌드위치 ELISA(이하 참조)로 측정하였다.

활성화된 HMG1은 ATCC 절차에 따라서 10% FBS, 0.05 mM 2-머캡토에탄올을 함유하는 RPMI1640(목록 번호 03-0078DJ) 중에서 생육한 THP-1(ATCC 기탁 번호 TIB-202, 인간 단핵구) 세포로부터 준비하였다. 세포를 밤새도록(14∼16 시간) LPS로 처리하여 최종 농도 0.5 ㎍/㎖가 되도록 만들었으며, 이때의 세포는 약 4×10⁵ 세포 /㎖였다. 세포를 1,100 rpm에서 3분 동안 원심 분리하여 수집하고, 수집한 세포를 PBS로 3회 세척하여, LPS를 함유하는 배지를 완전히 제거한 다음, 이를 2 ㎖ 들이 에펜도르프 튜브에 최종 농도 약 2∼5 × 10⁷ 세포/㎖(PBS 중)가 되도록 담은 후, 이를 액체 질소에서 2분 동안 동결시키고, 다시 실온의 수조에서 5∼10 분 동안 해동시켰다. 동결-해동 과정을 2회 이상 반복하였다. 용해된 세포를 13,000 rpm에서 원심 분리하고, 상청액은 새 멸균 튜브에 넣어 -70∼-80℃에 보관하였다. 사용된 상청액의 양은 동결-해동 이전의 상청액의 세포 농도를 기준으로 정한다.

BIAcore 분석법을 통한 HMG1 결합 친화성: 모든 실험은 BIAcore 3000 기기(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 수행되었다. 간단히 말하면, 표준 아민 커플링 화학 절차를 이용하여, 각각의 mAb을 CM5 센서 칩에 고정시켰다. 이와는 개별적으로 참고(대조구) 유동성 세포도 준비하였다. 기기 완충액 중에 2배 연속 희석시킨 HMG1 희석액을, 각각의 mAb와 참고 유동성 세포 표면에 비하여 느린 유속으로 연속 주사하였다. HMG1을 결합 및 해리시킨 후, 간단히 1M NaCl-50mM NaOH 펄스를 가하여 mAb 표면을 재생시켰다. 각 실험의 마지막에는, BIA 평가 소프트웨어(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 통해 입수 가능한 정상 상태 모델을 이용하여 결합 곡선을 평가하였다. 이 연구를 통해 측정된 K_d 값을 표 1에 나열하였다.

직접 ELISA (고정화된 HMG1 ): 96-웰 면역 평판(EIA/RIA 평판, 고 결합성, Costar)의 각 웰을 4℃의 PBS 중에서 HMGB-1(5㎍/㎖)으로 밤새도록 코팅하였다. 이 후, 이 평판을 PBS 중에 용해시킨 4% 분유로 차단하였다(37℃, 1 시간 동안). 차단 용액을 제거하고, 이를 다양한 농도의 인간 항-HMG1 항체로 바꿔 주었다(도 4a). 이후 평판을 세척하고(ELX-405 평판 세척기, BIO-TEK), 2차 항체(항-인간 IgG-HRP, PIERCE)를 최종 농도 1:125,000이 되도록 가하였다(37℃, 1 시간). HRP 활성은 슈어블루(Sureblue) HRP 기질(KLP)로 검출하였다. 평판을 동력학적 미세 평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 ㎚에서 판독하였다. 데이터를 표 1에 요약하였으며, 각각의 결합 곡선은 도 4a 및 도 4d에 나타내었다.

샌드위치 ELISA (가용성 HMG1 ): 면역 평판(EIA/RIA 평판, 고 결합성, Costar)을 PBS(pH7.2) 중 10㎍/㎖의 항-인간 IgG Fc로 코팅하고, 이를 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 코팅 시약을 제거하고, 평판을 PBS로 간단히 헹구었다. 이후 평판을 37℃에서 1 시간 동안 4% 우유로 차단한 후, PBS로 헹구었다. 항-HMG1 항체를 4% 우유 중에 희석시켰다. 연속 희석에 있어서, 항체의 출발 농도는 20㎍/㎖로 설정하였다. 이후, 희석된 항-HMG1 항체를 평판에 가하고, 이후 37℃에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 평판을 PBST(PBS/0.1% Tween 20)로 10회 세척하고, 이를 37℃에서 1 시간 동안, 4% 우유 중 항원(HMGB1 2㎍/㎖; 또는 원래의 HMGB1 0.7 ㎍/㎖)과 함께 항온 처리하였다. 이후, 평판을 10회 세척하고, 이를 4% 우유 중 1㎍/㎖의 마우스 항-HMGB1과 함께 37℃에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 평판을 10회 세척한 다음, 항-마우스 IgG-HRP(1:1000)와 함께 항온 처리하였다(37℃, 1 시간). 그 다음, 평판을 세척하고 전개시켰다. HRP 활성은 슈어블루 HRP 기질(KPL)로 검출하였다. 평판을 동력학적 미세 평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 ㎚에서 판독하였다. 데이터를 표 1에 요약하였으며, 각각의 결합 곡선은 도 4b∼4d에 나타내었다

BIAcore 분석법을 통한 항체 HMG1 결합 경쟁: 모든 실험은 BIAcore 3000 기기(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 상에서 수행되었다. BIAcore 핸드북(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에 기술되어 있는 바와 같이, 표준 아민 커플링 화학 절차를 이용하여, HMGB-1 단백질을 CM5 센서에 고정시켰다. 간단히 말해서, CM5 표면을 NHS/EDC로 활성화시켰다. 활성화시킨 후, HMGB-1을 표면에 대해서 100 nM 또는 200 nM의 농도(10 mM NaOAc 중, pH4)로 주사하여, 표면 밀도가 1100∼1200 RU가 되도록 하였다. 이후, 센서 칩 표면상 미반응 위치를 1 M의 에탄올아민으로 "캡핑"시켰다. 참고용으로, 이와 동일한 방법(HMGB-1을 고정하는데에 사용되되, 리간드는 사용하지 않음)을 이용하여 블랭크 유동성 세포도 제조하였다.

mAb G2, G4, G9, S6 및 시나지스(Synagis)를 1 uM 및 2uM씩 준비하였다. 모든 mAb 용액은 HBS-EP 완충액(BIAcore, Inc., 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 중에서 제조하였다. 각 순환은 처음에 mAb을 100 ㎕(1 μM) 주사하는 것을 시작으로 하여, 그 다음에는 2개의 2X 농축 mAb의 1:1 혼합물을 100 ㎕ 주사하여, 각 성분의 혼합물 중 최종 농도가 첫 번째 주사액과 동일하게 되도록 만들었다. 각 주사 순환 이후에, HMGB-1 표면은 1분 동안 10 mM HCl로 펄스를 가하여 재생시켰다.

일단 전반적으로 설정을 해 주었으면, 각각의 주사 순환(cycle) 수행 이후 각 mAb에 대한 최대 RU 반응성을 기록하였다. 이후, 이 반응성을 사용하여 각 mAb에 대한 평균 반응 수준을 계산하였다. 이와 같이 평균 결합 반응을 이용하여 제1 mAb으로 포화된 HMGB-1 표면에 결합하는 각 mAb 비율을 계산하였다. 전체적으로 보았을 때, 이러한 결합/차단 패턴은 mAb이 HMGB-1 상의 관련 있거나 또는 관련 없는 위치들에 결합하는지 여부를 측정하는데에 사용되었다. 이에 관한 데이터는 표 1에 요약하였다.

HMG1 과의 결합 대 HMG2 와의 결합: 초고도 결합 ELISA 평판(Ultra high-binding ELISA plates)(ThermoLab systems, #3855)을 1OmM의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.2) 중에 희석시킨 소 흉선 HMGB1 또는 HMBG2 5㎍/㎖로 코팅한 다음, 이를 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 이 평판을 Ca 및 Mg을 함유하지 않는 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕의 항-HMGB1 항체(10 mM PBS 중 희석)(pH 7.2) + 1 % 소 혈청 알부민(BSA) (최종 농도 = 10 ㎍/㎖)을 각 웰에 첨가한 다음, 평판을 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 웰을 100 ㎕의 PBS(pH 7.2)로 3회 세척하였다. HRP 표지화된 염소-항-인간 IgG 카파 사슬(KPL, #14-10-10)과 염소-항-인간 IgG 람다 사슬(KPL, #14-10-11)을 1OmM PBS + 1% BSA (1:1000) 중에 희석시키고, 이를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가한 다음에, 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 웰을 100 ㎕의 PBS(pH 7.2)로 3회 세척하였다. OPD 기질(Pierce chemical company, #34006)을 제조자의 지침에 따라서 준비하고, 이 준비된 기질 100 ㎕를 각 웰에 첨가한 다음, 상기 평판을 실온의 암실에서 20∼30분 동안 항온 처리하였다. 여기에 2M H₂SO₄ 100 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, 이 평판을 490 ㎚의 파장에서 평판 판독기로 판독하였다. 다수의 항체에 대한 OD 값은 도 4e에 나타내고 표 1에 요약하였다.

HMG1 B 박스 펩티드 맵핑 : 96-웰 면역 평판의 각 웰(EIA/RIA 평판, 고 결합성, Costar)을 PBS 중 91∼169번 아미노산으로 이루어진 HMG1 B 박스 펩티드(도 5a) 또는 150∼183번 아미노산으로 이루어진 HMG1 B 박스 펩티드(도 5b) 10 ㎍/㎖로 코팅하였다(4℃, 밤새도록). 이후, 상기 평판을 37℃에서 1 시간 동안 PBS 중에 용해된 4% 분유로 차단시켰다. 상기 차단 용액을 제거하고, 이를 다양한 농도의 인간 항-HMG1 항체와 교환하였다(도 5a∼5b). 이후 상기 평판을 세척하고(ELX-405 평판 세척기, BIO-TEK), 2차 항체(항-인간 IgG-HRP, PIERCE)를 최종 농도가 1:125,000이 될 때까지 첨가하였다(37℃, 1 시간). HRP 활성은 슈어블루(Sureblue) HRP 기질(KPL)로 검출하였다. 평판을 동력학적 미세 평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450 ㎚에서 판독하였다

결과

ELISA 연구 결과, 관찰한 대부분의 항체들은 고정화된 rHMG1에 결합한다는 사실을 알 수 있었다(도 4a). 본 검정법에서 고정화 및 가용성인 rHMG1 E11, G34 및 G20에 결합된 대부분의 항체는 가용성 rHMG1에 더 잘 결합하였던 반면에, S10, S12, S16 및 G16은 고정화된 rHMG1에는 더 약하게 결합하였음을 알 수 있었다(도 4d, 이에 관한 데이터는 제시하지 않음). 시험된 다수의 항체는 rHMG1 또는 하나 이상의 천연 HMG1 중 어느 하나와 더욱 선호적으로 결합하였다[표 1에 요약, 도 4b∼4c 참조]. 예를 들어, S16은 재조합 HMG1 및 천연 HMG1 둘 다와 결합하는 반면에, G4는 천연의 핵 내 HMG1과 더 잘 결합하였으며, S2, S6 및 S10은 모두 rHMG1에 더 잘 결합하였음을 알 수 있었다(도 4b). 흥미로운 사실은, S6은 임의의 천연 형태 HMG1과는 잘 결합하지 못하였던 반면에, 방출형 HMG1과는 소수 결합하였다(도 4c, 좌측 상부). S16과 G4는 HMG1의 다양한 천연 형에 대한 결합 특성에 다소 차이를 보였다(도 4c, 우측 상부 및 좌측 하부). 뿐만 아니라, 항체는 밀접하게 관련된 HMG2 단백질과의 교차 반응성에 대해서도 시험되었다. E11, S12 및 S16은 모두 HMG2에 약간씩 결합하였다. 흥미로운 점은, 본원에 사용된 조건 하에서 항원이 고정화될 때, E11은 HMG1보다 HMG2에 더 잘 결합한다는 점이다.

거의 모든 항체를 BIAcore 분석하여, 재조합 HMG1(rHMG1, 표 1 참조)에 대한 각 항체의 K_d를 측정하였다. 몇몇 항체(G4, G9, S2 및 S6)를 BIAcore 경쟁 분석법으로 분석한 결과, 항-HMGB1 항체는 중첩되어 있을 가능성이 있으며, 관련성이 깊은 동일한 위치(들) 중 어느 하나에 결합하는 것으로 파악되었다(표 1 참조).

항-HMG1 항체(S2, S6, S10, G2, G4, G9, S12 및 S16) 중 몇몇에 대하여 펩티드 맵핑 연구를 수행한 결과, HMG1 B 박스와의 결합 특성을 관찰할 수 있었다. 도 9a∼9b에 나타낸 바와 같이, G4, S12 및 S16은 91∼169번 아미노산으로 이루어진 HMG1 펩티드와 결합하였던 반면에(도 5a), S12만은 150∼183번 아미노산으로 이루어진 HMG1 펩티드에도 결합하였다(Figure 5b). 뿐만 아니라, E11은 HMG1 A 박스를 인지하는 것으로 파악되었다(데이터는 제시하지 않음).

요약하면, 분리된 인간의 항-HMG1 항체는 다양한 결합 특성을 나타냈는데, 이들 중 일부(예를 들어, S16)는 모든 형태의 HMG1과의 결합하였으며, 나머지(예를 들어, S10 및 S2)는 재조합 및 천연 형 사이를 구별하여 결합하는 결합 특성을 보유하는 것을 알 수 있다. 상기 항체는 또한 A-박스 및 B-박스를 포함하는 다수의 상이한 에피토프와 결합하기도 한다. 몇몇 인간 항-HMG1 항체는 다수의 시험관 내 첨가 및 생체 내 실험용으로서 선택되었다(이하 참조).

실시예 3

항- HMGB1 항체는 인간 PBMC 로부터 시토킨이 방출되는 것을 억제함

인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)로부터 시토킨이 HMG1에 의해 방출되는 것을 억제하는 인간 항-HMG1 항체 패널의 능력을 측정하였다. 다음과 같은 시토킨 즉, IL-12, IL-1β, TNF-α 및 IL-6에 대한 효과를 관찰하였다. 다수의 항-HMG1 항체는 HMG1에 의해 유도되는 상기 시토킨 중 하나 이상이 방출되는 것을 억제할 수 있다. 뿐만 아니라, HMG1은 NO의 방출을 촉진할 수 있으며, HMG1에 대한 항체는 이와 같은 방출을 억제할 수 있는 것으로 파악된다. 몇몇 인간 항-HMG1 항체가 마우스 대식 세포 내에서 HMG1 유도성 시토킨 유전자 발현을 감소시키는 능력도 측정하였다.

재료 및 방법

시토킨 방출의 억제: 인간의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 밀도 구배 원심 분리를 통해 건강한 지원자의 말초 혈액으로부터 분리하였다. 새로 채혈하여 헤파린 처리한 전혈을 2부피의 PBS와 혼합하였다. 희석된 혈액을 히스토파크(Histopaque)-1077(Sigma-Aldrich)의 표면상에 가만히 적층시켜, 이를 실온에서 30분 동안 원심 분리(400×g)하였다. 혈장과 밀도 구배 용액 사이의 계면으로부터 PBMC를 수집하였다. 이를 PBS로 3회 세척한 다음, 정제된 PBMC를 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 50 μM β-머캅토에탄올을 함유하는 RPMI-1640 배지(GIBCO BRL) 중에 재현탁시켰다. 1×10⁵개의 세포를 96-웰 세포 배양 평판의 각 웰에 첨가하였다.

PBMC를 2 시간 동안 37℃에서 5% CO₂, 재조합 HMG1(4 ㎍/㎖), 또는 2.4×10⁵개의 LPS 자극 THP-1 세포로부터 유래된 천연의 활성화 HMG1과 함께 항온 처리하였으며, 상이한 농도의 인간 항-HMGB1 모노클로날 항체, RAGE-Fc 융합 단백질 또는 HMG1 A 박스-Fc 융합 단백질은 각 웰에 가하였다. 배양 배지에 8 U/㎖(1 ㎍/㎖)의 폴리믹신 B 황산염(Sigma-Aldrich)을 보충하여 잠재적인 내독소의 작용을 억제하였다. HMG1으로 자극하지 않은 동일한 공여체로부터 유래된 PBMC를 대조구로서 사용하였다. 14 시간 결과 후 무 세포 배양 배지를 수집하고 이를 -20℃에 보관하였다.

비드라이트(Beadlyte) 인간 다중-시토킨 유동성 키트[Upstate by LuminexlOO(Luminex Corp.)]를 이용하여 염증 시토킨에 대해 배양 배지를 분석하였다. 전 염증 시토킨인 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-12(p40)을 재조합 HMG1으로 자극된 세포에 대해 평가하였다. 뿐만 아니라, 상기 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-8은 천연의 활성화 HMG1으로 자극된 세포에 대해 평가하였다.

시토킨 방출 데이터는 3회 측정치의 평균 ± 표준 편차로 제시하였다. 항-HMGB1 모노클로날 항체에 대한 IC₅₀은, HMGB1에 의해 자극된 PBMC로부터 방출된 시 토킨의 최대 억제율을 절반으로 만드는데에 필요한 항체의 농도로서 정의된다. 이는 PRISM 프로그램에 의해 계산하였다.

NO 방출의 억제: NO 검정법에 사용된 대식 세포로서는 RAW 세포(마우스 대식 세포주)와, 골수-유래 대식 세포(mBMMf; C57BL/6 마우스로부터 유래)를 포함한다. 3일 동안 M-CSF("신선한 mBMMf")의 존재 하에 배양액 중에서 3일 동안 성숙시킨 다음, mBMMf를 사용하였다. 세포는 96-웰 평판에 10⁵ 세포/웰로서 도말하였으며, 이를 100 ㎕의 무 혈청 배지 중에 넣어 밤새도록 HMG1으로 자극하였다. HMGB-1(5㎍/㎖)과 LPS(1㎍/㎖)를, 다양한 농도에서 대식 세포에 의한 NO 생산을 자극하기 위한 양성 대조구로 사용하였으며, 이 자극으로써 투여량 의존성 반응을 관찰할 수 있었다. 항체는 HMG1에 대하여 4:1의 몰비로 시험하였다. 다음 날, 평판을 1500 rpm에서 5분 동안 회전시키고, 상청액을 수집하였다. 또 다른 96-웰 평판에 다음과 같은 성분들을 혼합하여 가하였다: 자극된 상청액 및 표준(배지 중 희석) 50 ㎕, NADH 25 ㎕, 질산염 리덕타제 25 ㎕, 그리스(Griess) 시약 I 50 ㎕. 이후, 이 평판을 37℃에서 30 분 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 그리스 시약 II 50 ㎕를 각 웰에 가하고, 평판을 실온에서 10분 동안 항온 처리하였다. 각 웰의 흡광도를 540 ㎚에서 판독하였으며, 이때의 질산염 수치를 표준 곡선에 대해 계산하였다.

HMG1 으로 자극된 마우스 대식 세포( mM φ)의 택맨 ( Taqman ) 분석법:

정상의 C57BL/6 마우스의 대퇴골을 가볍게 씻어서 마우스의 골수를 수집하였다. 이후, 분리된 골수 세포를 10%의 소 태아 혈청(FBS) 및 50 ng/㎖의 M-CSF로 보 강된 둘베코 개질 이글 배지(DMEM) 중에서 24 시간 동안 배양하고, 부착되지 않은 세포들을 수집한 후, 이를 10%의 FBS와 50 ng/㎖의 M-CSF로 보강한, T-75 플라스크 내의 완전 DMEM 배지 중에서 6일 동안 생육하였다(1×10⁷ 세포/15㎖/플라스크). 6일 경과시, 이상 세포를 수집하여 이를 다시 96-웰 평판(1×10⁵ 세포/200 ㎕/웰) 중 10% FBS를 함유하는 α-MEM 중에 5ng/㎖ MCSF로 밤새도록 재접종하였다.

배양 배지를 α-MEM으로 교체하고, 이를 2 시간 동안 항온 처리한 다음, 세포에 영양분을 공급하지 않음으로써 이 세포를 자극하였다. HMGB1(이.콜라이로부터 생성된 재조합 CBP-HMGB1 융합 단백질, 10 ㎍/㎖), 마우스-RAGE-Fc 또는 인간-RAGE-Fc 융합 단백질을 α-MEM 중에서 다양한 차단 시약(100 ㎍/㎖)과 예비 혼합하였으며(실온, 20분), 이후 100 ㎕의 혼합물을 세포에 첨가하고, 이를 다시 2 시간 동안 37℃에서 항온 처리하였다. 그 다음, 상청액을 제거하고, 앰비온 MagMAX™-96 토탈 RNA 분리 키트[Ambion's MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit]로써 RNA를 추출하였다. cDNA 합성을 위하여 회수된 RNA 모두를 Superscript™ III 및 올리고(dT) 프라이머(Invitrogen)와 함께 역 전사효소(RT) 반응에 사용하였다. 결과로 생성된 cDNA 1 ㎕ 또는 2 ㎕를 ABI 프리즘 7700 또는 7000을 이용하는 실시간 정량 PCR 분석법(TaqMan)에 사용하였다.

결과

몇몇 항체에 대한 각각의 HMG1-유도성 시토킨 방출 역가 곡선을 도 6a∼6b에나타냈다. 관찰된 각 항체에 대해서 IC₅₀ 값을 계산하였다(표 1 참조). 소수의 항체 는 또한 이것이 천연 활성화 HMG1(LPS 자극 THP-1 세포로부터 유래, 상기 참조)을 차단하는 능력에 대해 시험되었다. RAGE-Fc 융합 단백질과 함께 E11, S16 및 S17은 천연 활성화 HMG1에 의해 유도되는 IL-6 방출을 차단할 수 있었던 반면에, S6, S13, G4 및 G9는 차단 효능이 떨어졌다(도 6c). 이러한 연구 및 다수의 기타 연구의 결과(데이터는 제시하지 않음)를 표1에 요약하였다. 몇몇 항체는 항체 농도가 낮을 때에도 시토킨 방출을 억제할 수 있음을 알 수 있었다. 그러므로, 지금까지 관찰된 항체들 중, S6은 IL-1β, TNF-α, IL-6 및 NO 방출의 가장 우수한 억제 인자인 반면에, G4는 IL-12의 가장 우수한 억제 인자이다. 모든 항체가 시토킨 모두의 방출을 억제하는 능력을 갖는지 여부에 대해 관찰한 것은 아니었음에 주의하여야 할 것이다. 또한 분리된 마우스 대식 세포(mMφ) 내에서 소수의 항체가 rHMG1-유도성 시토킨 유전자 발현을 억제하는 능력을 갖는지에 대해 관찰한 것도 아니었다. E11, G2 및 G4는 HMG1-유도성 IL-1b 유전자 발현을 유의적으로 억제할 수 있었다(도 7 좌측 및 표 1). G2는 또한 HMG1-유도성 TNF-α 유전자 발현을 상당히 억제할 수 있었다(도 7 우측 및 표 1). 몇몇 항체들은 그 항체가 세포 표면 수용체 및 HMG1의 결합에 미치는 영향력을 측정하기 위한 추가 분석용으로서 선택되었다.

실시예 4

항- HMG1 항체는 HMG1 과 세포 표면 수용체의 결합을 차단한다.

RAGE 및 TLR4는 둘 다 HMG1의 추정 수용체인 것으로 확인되었다. 인간 항-HMG1 항체가 상기 추정 수용체 중 하나 이상과 HMG1의 상호 작용을 차단할 수 있음을 입증하기 위해, ELISA 검정법에서 인간 항-HMG1 항체 중 몇몇이 RAGE-Fc 융합체 및 HMG1의 결합을 차단하는 능력(도 8) 및/또는 인간 항-HMG1 항체 중 몇몇이 세포 리포터 시스템 내에서 TLR4의 HMG1-유도성 활성화를 차단하는 능력(도 9)에 대해 검정하였다. 뿐만 아니라, 인간 항-HMG1 항체가 THP-1 세포의 세포 표면 및 HMG1의 결합을 특이적으로 차단하는 능력에 관하여도 입증하였다(도 10).

재료 및 방법

THP -1 세포와 HMG1 결합: 퍼킨엘머社(PerkinElmer)의 Eu-표지화 키트를 이용하여 재조합 래트 HMGB-1을 표지화하였다. HMGB-1 대 Eu의 몰비는 1:5이다. ATCC 절차에 따라서 THP-1을 배양하였다. 세포를 수집하고, 1×DELFIA L*R 결합 완충액(PerkinElmer), 50%의 DELFIA 안정화제(PerkinElmer) 및 0.05%의 아지드화나트륨을 함유하는 검정 완충액 중에 농도 1×10⁶ 세포/㎖가 되도록 현탁하였다. 세포(1×10⁵) 100㎕를 96-웰 세포 배양 평판 중 웰에 넣었다. 이 평판을 4℃에서 1 시간 동안 천천히 진탕 항온 처리하였다. 여러 농도의(333, 166.5, 83.25, 41.6, 20.8, 10.4 및 5.2 nM) 인간 항-HMGB1 항체 E11 또는 G2 또는 가용성 인간 RAGE-Fc와 혼합된, 유로피움-표지화 HMGB-1을 2 nM 함유하는 검정 완충액 100 ㎕를 각각의 웰에 일일이 가하였다. 4℃에서 가볍게 저어주면서 항온 처리한 지 1시간 경과 후, 세포를 1×L*R 세척 완충액(PerkinElmer)으로 4회 세척하였다(1200 rpm에서 5분 동안 원심 분리). 강화 용액 200 ㎕를 각 웰에 가하여 해리시켜, 615 ㎚에서의 Eu 형광도를 증강하였다. 형광도는 월랙 빅터 형광계(Wallac Victor Fluorometer)로 측정하였다. 검정법은 3회 반복 수행하였으며, 인간 항체 R3-47은 음성 동 기준 표본 대조구로 사용하였다.

ELISA 에 의한 RAGE - Ig과 HMG1 의 결합: RAGE-Fc 융합 단백질(PBS 중 5㎍/㎖)을 ELISA 평판의 각 웰에 첨가하고(50 ㎕/웰), 이를 4℃에서 밤새도록 항온 처리하였다. 이후, 상기 평판을 37℃에서 1 시간 동안 5% 우유 200 ㎕로 차단시키고, 이를 PBS/Tween으로 3회 세척하였다. 희석된 HMGB1 용액은 웰당 50㎕씩 들어있었다. 투여량 곡선에 있어서, HMGB1의 초기 농도는 PBS 중 4 ㎍/㎖였다. 항체 차단을 위해, HMGB1을 다른 평판 중에서 인간 항-HMG1 항체 또는 완충액으로 미리 항온 처리한 후, 이를 RAGE-코팅 평판으로 옮겼다. 이후, 평판을 실온에서 2 시간 동안 항온 처리한 다음, 이를 3회 세척하였다. 고정화된 RAGE-Fc에 결합한 임의의 HMG1을 검출하기 위하여, 바이오틴화된 마우스 항-HMG1 mAb(10D4, 4H11, 3E10 및 5C12)(각각, 1 ㎍/㎖, 항체 전부: 4 ㎍/㎖)의 혼합물을 각 웰에 넣고, 이 평판을 실온에서 1 시간 동안 항온 처리하였다. 이후, 상기 평판을 세척하고, 스트렙타비딘-HRP를 각 웰에 첨가하여 이를 15분 동안 항온 처리하였다. 이후, 상기 평판을 3회 세척한 다음, 블럿화하여 건조시켰다. TMB 현상액 100 ㎕를 첨가하고, 평판을 650 ㎚에서 판독하였다. HMG1 단독으로 인한 억제율을 계산한 결과 0%였다. 도 9에 나타낸 데이터와 표 1에 요약한 데이터는 2회의 개별 실험을 통한 결과의 평균이었다.

TLR4 활성화 검정법: 293 세포(Invitrogen)를 안정하게 발현시키는 HuTLR4 및 CD14를 10% FCS와 함께 96-웰 평판에 접종하였다(100 ㎕의 DMEM 중 2×10⁴/웰, 밤새도록). 이후, 세포를 NF-κB/Luc (Stratagene) 루시퍼라제 리포터 구조물로 형 질 감염시켰다(키트에 의해 확인, 24시간 동안). HMGB1 및 항-HMGB1의 혼합물을 세포에 밤새도록 가하였다(100 ㎕/웰). 이후, 루시퍼라제 활성을 측정하여 TLR4 활성화가 일어났는지 여부에 관해 평가하였다(Promega).

결과

본 연구를 통하여, 시험된 항체들 중 몇몇은(예를 들어, G2, G4, S10, S16, S2 및 S6) RAGE와 HMG1의 결합을 35% 이상 억제하였으며, 시험된 항체 중 2개 즉, G2 및 G4는 시험 조건 하에서 이의 결합을 거의 75% 억제하였음을 확인하였다(도 8, 표 2). 몇몇 항체는 RAGE 결합을 억제하지 않았다(예를 들어, G9, G12, G16, S14 등, 표 1 참조). E11 및 G20은 HMG1에 의한 TLR4의 활성화를 억제하였다(도 9 및 표 1). 뿐만 아니라, E11 및 G2 인간 항-HMG1 항체는 HMG1 및 THP-1 세포의 결합을 차단하였다(도 10 및 표 1). 전술한 바와 같은 두 가지 검정법에서 검정된 항체들 중, 어느 것도 RAGE 결합과 TLR4 활성화를 차단하는 능력을 갖지 않았다. 그러나, E11은 TLR4 활성화 및 THP-1 세포와 HMG1의 결합을 차단할 수 있었다. 몇몇 항체를 선택하여, 이 항체들이 생체 내에서 염증 반응에 미치는 효과를 입증하기 위한 추가 분석을 수행하였다(이하 참조).

실시예 5

맹장 결찰 및 천공( Cecal Ligation and Puncture )( CLP ) 모델에서 항- HMG1 항체는 부패증을 억제한다.

인간 항-HMG1 항체가 부패증 발병시 치사율을 낮출 수 있음을 입증하기 위하여, 마우스의 부패증 모델을 확립하고, 몇몇 항체 치료 절차에 있어서의 생존율을 관찰하였다. 마우스의 맹장을 결찰 및 천공(CLP)시켰는데 즉, 이는 다균성 복막염과 부패증을 일으키게 되는 모델로서, 수술에 의해 생성된 맹장 게실에 구멍을 내어 부패증을 발생시킨, 특성 규명이 잘 된 모델이다. 몇몇 인간 항-HMG1 항체로 처리한 마우스의 생존율을 동 기준 표본 대조구 항체로 처리한 마우스의 생존율과 비교하였다. 몇몇 인간 항-HMG1 항체는 CLP 모델 예를 들어, G4, S6 및 S16에서 상당한 보호 효능을 나타냈다(도 11a∼11d 및 표 1).

재료 및 방법

부패증에서의 항- HMGB1 : 살아있는 복강 내 감염 및 부패증 모델을 확립하기 위하여, Balb/C 마우스(그룹당 9∼11 마리)를 사용하여 전술한 바와 같이, CLP 절차를 수행하였다(Fink and Heard, 1990, J Surg Res 49:186-196; Wichmann외 다수, 1996, J Surg Res 65, 109-114). 케타민(75 mg/kg, Fort Dodge Laboratories, 아이오와주 포트 다지 소재)과 자일라진(20 mg/kg, Boehringer Ingelheim)을 근육 내 주사하여 마취시킨 후, 정중선 15 ㎜를 절개히여 맹장을 꺼내었다. 맹장의 끝에서부터 5 ㎜를 결찰 시킨 이후, 22-게이지 바늘로 맹장의 기부에 1회 구멍을 내고, 소량의 대변(길이 1㎜)을 꺼내었다. 그 다음, 맹장을 이것이 원래 있던 복강 내 위치에 집어넣고 상처 부위를 2겹으로 꿰매어 봉합하였다. 모든 동물에 염수 용액(0.9% s.c, 20 ㎖/체중 1㎏)을 주입하여 소생시킨 다음, 수술 후 30분 경과시 항생제(마우스 1마리당 200 ㎕ 멸균 염수 중 0.5 ㎎ 이미페넴, s.c. 주사) (Primaxin, Merck)를 1회 투여하였다.

항-HMG1 항체 또는 동 기준 표본 대조구 항체(50 ㎍/마우스, 부피 = 200 ㎕) 를 수술 후 24 시간 및 48 시간 경과시에 투여하였다. 임의의 후속 실험에서는, 항-HMG1 항체 또는 동 기준 표본 대조구 항체(8 ㎎/㎏)를 수술 후 24 시간 경과시에 복강 내 투여하였다(도 11c∼11d). 이와 같은 실험은 맹검 실험으로서, 어느 기술자가 우리를 랜덤화하고, 또 다른 기술자는 암호화된 항체를 투여하는 식으로 행해졌다. 총 14일 동안 마우스 생존율을 매일 2회씩 관찰하였다. 24 시간 및 48 시간 경과시 항체를 마우스 1`마리당 50㎍씩 투여하는 몇몇 대표적인 실험에 있어서의 생존률 곡선을 도 11a 및 11b에 나타내었다. 몇몇 대표적인 실험을 조합 수행하여[수술 후 24 시간 경과시 항체를 8㎎/㎏ 투여] 얻어진 생존률 곡선은 도 11c에 나타내었다. 몇몇 부가적인 항체 및 올리고클로날 항체 풀에 관하여는 수술 후 24 시간 경과시 8㎎/㎏만큼 투여하여 검정하였다.

결과

본 연구를 통하여 중증 부패증 마우스를 인간 항-HMG1 항체로 수동 면역화시키면 보호 효능이 나타난다는 사실을 입증하였다. 특히, 인간 항-HMG1 항체인 S6, S16, E11 및 G4는 CLP 모델에서 보호 효능을 나타내었다(도 11a∼11d). 몇몇 연구에서는 9일째 되는 날의 생존율이 14일째 되는 날의 생존율보다 더 높았음을 알 수 있었다(도 11b). 장기 생존율에 있어서 이와 같이 차이가 나타나는 이유는 마우스 시스템 내 인간 항체의 반감기가 감소하였기 때문일 것이다. 그러나, 인간 항-HMG1 항체 처리한 대부분의 동물들은 사망이 지연되었을 뿐만 아니라, 치명적인 부패증에 대하여 완전한 보호 효능을 나타내었다. 본 모델에서 항-HMG1 항체 S6가 가장 심도있게 연구되었으며, 다수의 실험에서는 보호 효능이 30% 이상 나타났다(각각의 누적 데이터는 도 11c에 나타냄).

실시예 6

HMG1 은 몇몇 염증성 병상이 나타나는 동물 모델에서 상향 조절된다.

혈청 HMG1 수준은 인간에 있어서 부패증/부패성 쇼크 발생시 증가함을 알 수 있었다. 본 발명자는 염증성 질병에 관한 다수의 상이한 동물 모델 예를 들어, 몇몇 관절염 모델, 급성 폐 손상 및 복막염 모델에 있어서의 HMG1 단백질 및/또는 유전자 발현 수준을 관찰하였다. 이제까지 관찰한 모든 모델을 통하여, HMG1 수준은 질병이 진행됨에 따라서 상승함을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 몇몇 시토킨 및/또는 추정 HMG1 수용체 분자의 수준도 상승함을 알 수 있었다.

재료 및 방법

염증성 질병의 유도: 각 질병 모델에서 질병 유도시 사용된 방법에 관한 자세한 설명은 이하를 참조하시오. HMG1 및 다양한 시토킨의 수준을 발병한 미처리 동물 내에서 관찰하여, 이를 정상 동물과 비교하였다.

수동 CIA 마우스 내 HMG1 수준: 10일째 되는 날에 정상 또는 수동 CIA 마우스의 앞발을 수집하고, 이를 검정 수행시까지 액체 질소로 동결시켜 -80℃에 보관하였다. 관절 시료 및 용해 완충액을 충격 방지형 2 ㎖ 들이 튜브[특정화된 용해 매트릭스 A 입자(Q biogen)로 예비 충전]에 가하였다. 관절을 FastPrep® 균질화기로 균질화한 다음, 원심 분리하였다. 상청액을 수집하고, HMG1 수준을 ELISA[중간 규모 기법(MesoScale technology; Meso Scale Discovery) 사용]로 측정하였다. 도 12a에 나타낸 데이터는 각 그룹당 5개의 발로부터 얻어진 데이터의 평균이다.

능동 CIA 마우스의 택맨 분석법: 35일 경과시 정상 또는 능동 CIA 마우스의 앞발 및 뒷발을 수집하여, 이를 검정 수행시까지 액체 질소로 동결시켜 -80℃에 보관하였다. 관절 시료 및 용해 완충액을 충격 방지형 2 ㎖ 들이 튜브[특정화된 용해 매트릭스 A 입자(Q biogen)로 예비 충전]에 가하였다. 관절을 FastPrep® 균질화기로 균질화한 다음, 제조자의 지침에 따라서 Qiagen RNA 미니 키트 또는 RNA STAT-60을 사용하여 이 균질화물로부터 RNA를 얻었다. 회수된 RNA 모두를 Superscript™ III 및 올리고(dT) 프라이머(Invitrogen)를 사용하는 역 전사 반응에 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 1㎕ 또는 2㎕ 사용하여 ABI 프리즘 7700 또는 7000을 이용하는 실시간 질량 PCR 분석법(TaqMan)을 수행하였다. HMGB1 및 몇몇 추정 수용체 분자 즉, RAGE, TLR2, TLR4 및 TLR9의 상대적 유전자 발현율(뒷발 및 앞발)을 각각 관찰하였다(도 12b). 몇몇 시토킨 즉, IL-1b, IL-6 및 TNF-α의 상대적 유전자 발현율(뒷발 및 앞발)도 각각 관찰하였다(도 12c). 정상인 마우스에 있어서 각 분자의 유전자 발현율을 1로 정하고, 각 분자에 관한 상대적 유전자 발현율을 그래프로 나타내었다. 각 분자 아래에 적혀 있는 숫자는 결과 수치를 나타내는 것이다.

AIA 래트 내 HMG1 수준: 0일, 5일, 10일, 15일 및 20일 경과시 AIA 래트의 뒷발을 수집하여 이를 검정 수행시까지 액체 질소로 동결시켜 -80℃에 보관하였다. 상기 수동 CIA 마우스에 사용된 바와 동일한 방법을 이용하여 AIA 관절을 처리 및 검정하였다. 관절 균질물에 존재하는 HMG1 수준을 경시적 그래프로 나타내었다(도 12d, 우측 상부). 질병 진행 정도에 대한 중요한 2가지 지표인 관절 염증과 체중 감소에 관하여도 그래프로 나타내었다(각각 좌측 상부 및 좌측 하부 그래프).

에스 아우레우스 (S. Aureus ) 감염 후 마우스 혈청 중 HMG1 및 시토킨 수준: 에스.아우레우스로 감염시킨 마우스로부터 얻은 혈청을 감염 후 2시간, 8시간 및 12시간 경과시에 수집하였다. HMG1, IL-1b 및 TNF-α 수준을 ELISA[메조 스케일 기법(Meso Scale technique; Meso Scale Discovery) 사용]를 통하여 측정하였다. HMG1, IL-1b 및 TNF-α의 수준을 경시적 그래프로 나타내었다(도 12e). HMG1 및 시토킨에 사용된 단위는 서로 상이하였음에 주목하시오. 갈락토사민만을 투여한 마우스 또는 아무것도 투여하지 않은 마우스에서는 HMG1 또는 시토킨이 증가하였으되, 그 양상은 상이하였다(데이터는 제시하지 않음).

ALI 마우스의 BAL 액 중 HMG1 수준: PBS(대조구) 또는 LPS(폐 손상)가 투여된 마우스의 BAL액을, 상기 물질 투여 후 일정 시간 경과시에 수집하여, HMG1 수준을 측정하였다[메조스케일 ELISA(MesoScale ELISA)]. HMG1 수준을 경시적 그래프로 나타내었다(도 12f, 좌측 그래프). 질병의 진행 정도에 대한 지표인 현존하는 총 세포 계수도 경시적 그래프로 나타내었다(도 12f, 우측 그래프)

AIA 래트 처리후 HMG1 수준: 처리 후 AIA 래트의 뒷발(이하 실험 9 참조)을 전술한 바와 같이 처리하고, HMG1, IL-6 및 TNF-α 수준을 메조스케일 ELISA로 측정하였다.

메조스케일 ELISA : 요약하면, 평판을 HMGB1 또는 시토킨(예를 들어, IL-1b, TNF-α, IL-6 등)에 대한 포획 항체로 예비 코팅하고, 이를 1 시간 동안 MSD 블로커 완충액(blocker buffer)(MSD, Cat#R93AA-1)으로 차단하였다. 표준(적당한 시료 완충액 예를 들어, 정상 마우스의 BAL액, 혈청 또는 관절 균질화물 중에 희석) 및 시료를 부피 20 ㎕인 평판에 가하였다. 1차 및 검출용 항체의 혼합물 20 ㎕을 각 웰에 가하고, 이를 실온에서 4 시간 동안 진탕 하면서 항온 처리하였다. 이후 평판을 세척하고, 가하여진 완충액(MSD, Cat#R92TD-2)을 섹터 이미저(Sector Imager) 6000으로 판독하였다. HMG1 검출에 있어서, 1차 항체는 친화성 토끼 항-HMGB1 폴리클로날 항체였으며(Becton Dickinson Biosciences, Cat # 556528), 검출용 항체는 염소 항-토끼 MSD 검출용 항체(MSD, Cat # R32AB-1)였다.

결과

3 마리의 관절염 모델을 관찰하였다. 각 모델에 있어서, 관절 내 HMG1 수준은 질병이 진행됨에 따라서 함께 상승함을 알 수 있었다. 수동 CIA 마우스 모델에서, HMG1 수준은 관절 염증이 퍼지는 시기인 10일(도 12a)이 경과 할 때까지 약 10배 증가하였다(이하, 도 13a 참조). 능동 CIA 마우스에서 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려진, HMG1, 몇몇 시토킨 그리고 몇몇 수용체의 수준도 질병이 진행됨에 따라서 함께 상승하는 것을 알 수 있었다(도 12b∼12c 및 15a). RAGE 수용체는 앞발과 뒷발에서 약 2배 증가하였으며, TLR2 및 TRL4 수용체는 앞발에서 각각 2배 및 3배 증가하였고, 뒷발에서는 각각 19배 및 17배 증가하였다. TLR9 수준은 뒷발에서만 증가하였다(7배). 시토킨 IL-1b, IL-6 및 TNF-α의 발현 수준은, 앞발의 경우 각각 39배, 145배 및 7배 정도 증가하는 성향을 보였고, 뒷발의 경우에는 각각 247배, 361배 및 76배 증가하는 성향을 보였다. AIA 래트 모델에서, 15일째 되는 날[관절 염증이 가장 심해지는 시기], 관절 균질물 중 HMG1 수준은 검출이 안 되는 수준으로부터 200 ng/㎖ 이상까지 증가하였다(도 12d의 좌측 및 우측 그래프 비교 ). 약 20일째 되는 날 염증이 감소할 때, HMG1 수준도 감소하였음을 알 수 있었다.

기타 2개의 질병 모델도 관찰하였다. 도 12e는 에스.아우레우스 감염된 복막염 모델에서 감염 후 약 2시간 경과시로부터 시작하여 시간이 경과 함에 따라서 HMG1 수준도 증가함을 나타내는 것이다. TNF-α 및 IL-6의 수준은 감염 직후 증가하였으며, 이때 TNF-α의 수준은 2 시간 경과시 피크였다가, 다시 하강하고, 감염 후 9시간 경과시에 또다시 증가하였다. IL-6 수준은 약 2 시간 경과시에 피크에 달하였고, 이후에는 약간만 증가하였을 뿐, 일반적으로 일정하게 유지되었다. 급성 폐 손상 마우스 모델에 있어서, BAL액 중 HMG1 수준은 LPS 투여 후 48 시간 경과시까지, 검출이 불가능한 수준으로부터 1500 ng/㎖ 이상까지 증가하였다(도 12f, 좌측 그래프). 이와 같은 HMG1 수준의 증가 현상은 LPS 감염 마우스로부터 얻은 BAL액 내에 존재하는 세포 내 침윤액(총 세포 수) 증가와 상관 있다(도 12f, 좌측 및 우측 그래프 비교). HMG 수준은 PBS 완충액 투여 마우스로부터 얻어진 BAL 액 내에서는 검출이 불가능한 수준이었다(도 12f, 좌측 그래프). 본 연구를 통하여, 3개의 관절염 모델, 급성 폐 손상 모델 그리고 복막염 모델을 비롯한 다수의 염증 모델에 있어서, HMG1 수준은 질병이 진행함에 따라서 증가함을 알 수 있다. 항-HMG1 항체는 HMG1 수준이 증가하는 기타 염증성 질병에 유용하다는 사실을 입증하기 위해, 몇몇 인간 항-HMG1 항체를 선택하여 상기 모델을 이용한 추가 연구를 수행하였다.

본 발명자들은 또한 PBS, 인간 동 기준 표본 대조구(HuIgG), G4, A-박스-Fc 융합체 및 메토트렉세이트(MTX)와 함께 HuIgG 또는 렌브렐 또는 G4를 처리한 후, AIA 래트의 관절에서의 HMG1, IL-6 및 TNF-α 수준을 관찰하였다. 도 12g는 각 처 리 후 HMG1(좌측 상부) 및 IL-6(좌측 하부)의 수준을 나타내는 것이다. HuIgG 또는 A-박스-Fc를 처리하였을 경우에는 HMG1 또는 IL-6의 수준이 거의 감소하지 않았다. G4를 단독 투여하였을 경우와, MTX를 HuIgG 또는 렌브렐과 함께 투여하였을 경우에는 HMG1 및 IL-6의 수준이 유사하게 감소하였으나, MTX 및 G4를 함께 투여할 경우에는 정상 수준까지 떨어졌다. MTX와 HuIgG를 함께 투여할 경우 이 시토킨 수준을 더욱 감소시켰으나, G4도 TNF-α 수준을 상당한 정도로 감소시켰다(도 12g, 우측 상부).

실시예 7

항- HMG1 항체는 수동 콜라겐-유도성 관절염( CIA ) 마우스 모델에서 질병의 진행에 따른 중증도( severity )를 감소시킨다.

HMG1에 대한 인간 항체가 유용한 치료제임을 입증하기 위해서, 본 발명자들은 인간 항-HMG1 항체의 패널이 수동 마우스 모델에 있어서 콜라겐-유도성 관절염을 치료할 수 있는지 여부를 검정하였다. 이와 같은 일련의 실험에 있어서, 본 발명자들은 관절염의 임상적 징후가 발생하기 이전에 처치를 개시하는 예방 모델(prevention model)을 이용하였다. 본 연구에서, 본 발명자들은 항-HMG1 항체의 효능과 공지의 치료법[렌브렐(설치류 모델 시스템에서 엔브렐™ 대신 사용되는 분자) 단독 투여 또는 렌브렐™과 메틸트렉세이트(MTX) 공동 투여]에 따른 효능을 직접 비교하였다.

여기서, 본 발명자들은, HMG1에 대한 항체가 수동 CIA 마우스 RA 모델에서 예방 효능을 나타낸다는 사실을 최초로 입증하였다. 실재로, 항-HMG1 항체 G4는 렌 브렐만을 단독 투여하였을 경우보다 더욱 효과적이었으며, 항-HMG1 항체 S6은 MTX/렌브렐 치료시보다 발 염증을 더욱 감소시키고 골 상실률 및 연골 손상 정도도 더욱 낮추는 등, 보다 효과적이었다.

재료 및 방법

수동적 콜라겐 유도성 관절염( CIA )의 유도: 관절염 모델을 확립하기 위해서, 6∼8주령의 수컷 DBA/1J 마우스(Jackson Labs, 메인주 바 하버 소재)를 사용하였다. 일반적으로, 그룹당 5∼8 마리의 마우스를 사용하였다. 실험 첫날, 마우스 1마리당 2 ㎎의 항-콜라겐 mAb 칵테일(Chemicon # ECM1100, 10 ㎎/㎖)을 마우스 꼬리 부분 정맥에 정맥 내 주사하여 마우스를 면역화시켰다. 이후, 3일째 되는 날, 마우스 1마리당 50㎍의 LPS를 복강 내 주사하였다. 각 실험에는 다음과 같은 동물군을 사용하였다: 실험 1 = A∼E 그룹, 실험 2 = G∼J 그룹 및 L∼N 그룹. 마우스의 추가 그룹(F, K 및 O 그룹)은 정상적인 대조구로서 아무런 처리도 하지 않았다. 이후, 후속 처리는 이하 표 4에 나타낸 바와 같이 수행하였다.

질병의 관찰: 실험 전을 시발점으로 하여, 모든 동물의 발에 발생한 질병의 상태를 매일 관찰하여 평가하였으며, 이때 발에 각각의 발에 분석용 임상 스코어(clinical score)를 메겼다. 매일같이, 각 동물의 4개의 발에 임상학적 질병 단계에 따른 스코어를 메겼다. 이와 같이 스코어를 메김에 있어서는 2명의 관찰자가 동원되었으며, 이들 중 한 명 이상은 맹검 방식으로 수행하였다. 뿐만 아니라, 각 마우스의 체중을 달아 체중 변화를 측정함과 동시에, 발에 스코어를 메겼다(도 6a 및 6d).

발목/손목/가운데 발/앞발에 대한 등급 단위(grading scale)는 다음과 같다:

0 = 정상; 1 = 약간 부음; 2 = 심하게 부음; 3 = 매우 심하게 부어올랐으되, 묵직한 정도는 아님.

각 발의 측면에 있는 4개의 발가락에 대한 등급 단위는 "겹쳐짐(1) 또는 겹쳐지지 않음(0)"으로 메겼다. 예를 들어, 가장 많이 겹쳐진 좌측 뒷발에는 다음과 같이 스코어가 메겨졌다: 발목 = 3, 가운데 발 = 3, 발가락 = 4(임상 스코어 = 총 10 단위). 본 발명자들은 각각의 발에 대해 반복하여 스코어를 메긴 다음, 이 스코어를 합하였다. 14일째 되는 날에, 또는 임상 스코어가 총 40에 이른 후에 마우스를 마취시켜, 관절을 해부하여 관찰하였다.

해부학: 문헌[Badger외 다수, 2001, Arthritis & Rheumatism 44:128-37]에 기술된 바와 같이 각 동물의 뒷다리 전 경골 관절을 관찰하여 해부학적 변화에 대해 스코어를 메겼다. 요약하면, 32일째 되는 날에 동물을 안락사시키고, 뒷다리를 포르말린에 고정시켜 Cal-Rite(Richard-Allen Scientific, 미시건주, 칼라마주 소재) 내에서 석회질을 제거하였다. 이후 전 경골 골간으로부터 멀리 떨어져 있는 다리에서 발을 떼어냈다. 통상적인 처리를 한 다음, 시료를 매립하고, 두정 검편은 전 경골 관절과 관절의 중간 평면으로부터 잘라냈다. 이 검편을 사프라닌 O로 염색하고, 패스트 그린(Fast Green)으로 대비 염색하였다(데이터는 제시하지 않음).

골 및 관절 연골/관절 주위 연 조직의 해부학적 특징에 대해 각각 스코어를 메겼다(맹검 관찰자에 의함; 도 13b 및 13c). 골에는 다음과 같이 등급을 메겼다: 0 = 정상, 1 = 골막 직골에 골막 하 섬유증 발생, 2 = 골수 염증, 골내 및 골주 재흡수, 3 = 염증이 퍼짐, 4 = 골수가 육아 조직에 의해 치환되고, 골주가 잔재하며, 피질의 윤곽이 점차 사라짐. 연골/활막에는 다음과 같이 등급을 메겼다: 0 = 정상, 1 = 활막 및 주위 조직에 림프구에 의한 약간의 염증이 발생함, 2 = 활막 섬유증 및 부종이 발생하고, 관절 공간에 부분적으로 림프구가 흘러나와 차게 되며, 연골의 판누스성 미란 증세가 약간 발생함, 3 = 관절 공간에 림프구가 흘러나와 퍼지게 되며, 주위 연골 및 연골 밑에 미란 증세가 나타나고, 국소적 괴사로 인한 자반 액상화를 동반하는 연 조직의 섬유증이 퍼짐.

결과

몇몇 실험을 수행한 결과, HMG1 항체를 처리하면 수동 CIA 마우스 모델에 있어서 질병의 중증도가 감소하거나 또는 질병의 상태가 심해지는 것을 막을 수 있었다는 것이 입증되었다. 실험에서, 마우스에 LPS를 주입한 후 3일째 되는 날에 마우스 중 1마리에는 항-HMG1 항체 S6 또는 G16(0.2 ㎎/마우스)을 처리하였다. 이후, 13일의 기간에 걸쳐서 마우스에 총 6회 투여하였다. 이와 동시에, 대조구 마우스에는 인간 mAb(0.2 ㎎/마우스)를 투여하였다. 마지막 그룹에는 MTX(0.2 ㎎/마우스, 12일에 걸쳐서 4회 투여)와 렌브렐(0.2 ㎎/마우스, 10일에 걸쳐서 2회 투여)을 함께 투여하였다. 관절염의 진행 정도는 처음에 처리한 이래로 매일 관찰하였다. 도 13a의 그래프는 본 연구 기간 동안 처리 군 각각에 대하여 발 염증 스코어를 메긴 결과를 나타내는 것이다. 도 13b는 CIA 예방 모델에 대한 골, 연골 및 염증에 대해 해부학적 스코어를 메긴 결과를 나타낸다. 본 모델에서 앞발은 질병의 상태에 대한 보다 강력한 예측 지표이고, 뒷발은 질병이 다양한 양상으로 발병할 수 있다는 사실에 주목해야 할 것이다. 도 13c는 앞발만의 골, 연골 및 염증에 대한 해부학적 스코어를 나타내는 것이다. 인간 IgG를 투여하면 관절염 진행에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 항-HMG1 S6 항체가 투여된 동물은 대조구 동물에 비하여 골, 연골 및 전체 염증 스코어가 상당히 감소하였다. 놀라운 점은, 항-HMG1 S6 항체로 처리한 동물은 MTX/렌브렐을 병용하여 처리한 동물보다 치료 효과가 더 뛰어났다는 점이다.

질병 진행에 따른 다른 임상학적 특징은 체중 감소이다. 대조구 동물에 대한 상대적 체중 스코어는 연구 내내 전반적으로 낮아졌다. 항-HMG1 S6 항체로 처리한 마우스에 메겨진 임상학적 스코어에 따르면 상당한 보호 효능이 나타났으나, 이 동물 그룹의 체중도 또한 전반적으로 감소하였다. 그러나, 항-HMG1 S6 항체로 처리한 동물의 체중은 대조구의 경우만큼 감소하지는 않았다. MTX/렌브렐 처리된 동물의 경우도 연구 초반에는 체중이 전반적으로 감소하였지만, 연구 마지막에는 미처리 동물 체중으로 다시 회복되었다(도 13d). 이러한 결과를 통하여, 항-HMG1 항체는 질병이 발병하기 이전에 투여되면, 관절 손상 및 기타 증상에 대해 우수한 보호 효능이 나타남을 입증할 수 있다. 특히, 이러한 결과는 항-HMG1 S6 항체 처리가 CIA 마우스에 있어서 질병의 중증도를 상당 수준 감소시키는 효과가 있음을 알려주는 것이다. 본 실험은 관절염 모델에 있어서 S6의 예방 효능의 대표적인 입증 수단은 될 수 없다는 사실에 주목하여야 할 것이다. 항-HMG1 S6 항체를 반복하여 투여하면, 부패증에 관한 마우스 CLP 모델에서의 예방 효과는 뛰어났으나(상기 실시예 5 참조), 관절염 모델에서의 예방 효과는 상당히 가변적이었다. 이러한 가변성을 통하여 항체 제조, 동물 모델, 항체의 약동학적 특성 및 기타 유사한 매개 변수에 차이가 있음을 파악할 수 있다.

제2 실험 및 제3 실험에서, 마우스에 LPS를 주사한 후 3일 경과시를 시발점으로 하여, 마우스를 항-HMG1 항체 G4(10 ㎎/㎏)로 처리하였다. 제2 실험에서는 13일에 걸쳐서 마우스에 총 6회 투여하였으며, 제3 실험에서는 동일한 기간 동안 총 4회 투여하였다. 이와 동시에, 대조구 마우스에는 인간 mAb(10 ㎎/㎏) 또는 PBS를 투여하였다. 제2 실험에서, 마지막 그룹에는 렌브렐을 투여하였다(G4와 동일하게 투여함). 최초 처리 후에는 관절염의 진행 상황을 매일 관찰하였다. 도 14a∼14b에 도시한 그래프는 연구 기간 동안의 발 염증 스코어를 나타낸 것이다. 제2 실험(도 14a)을 통하여, 항-HMG1 항체 G4가 렌브렐만을 단독 처리하였을 경우보다 발 염증 감소 효과가 더 우수함을 알 수 있다(우측 패널). 제3 실험으로부터 얻은 데이터(도 14b)를 통하여는, 항-HMG1 항체 G4의 투여 횟수를 줄이면, 발 염증에 차도가 보이지 않았음을 알 수 있었다. G4 항체를 반복적으로 투여할 경우, 본 모델 및 기타 몇몇 관절염 모델에 있어서 보호 효능이 보다 뛰어났다(이하, 실시예 8 및 9 참조).

실시예 8

항- HMG1 항체는 능동 콜라겐-유도성 관절염( CIA ) 마우스 모델에 있어서 질병의 진행에 따른 중증도를 감소시킨다.

HMG1에 대한 인간 항체가 유용한 치료제임을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 모델에 있어서 항-HMG1 항체 패널이 능동 콜라겐-유도성 관절염을 치료할 수 있는지 여부에 대해 시험하였다. 이와 같은 일련의 실험에 있어서, 본 발명자들은 관절염의 임상적 징후가 발생하기 이전에 처치를 개시하는 예방 모델을 이용하였다. 본 연구에서, 본 발명자들은 항-HMG1 항체의 효능과 렌브렐의 효능을 비교하였다.

본 연구에 있어서, 본 발명자들은 최초로, HMG1에 대한 항체가 CIA 마우스 RA 모델에 있어서 발 염증을 완화하는 효능을 가지며, 체중을 감소시킨다는 사실을 입증하였다. 실재, 항-HMG1 항체 G4는 렌브렐만을 단독 투여하였을 경우보다 발 염증을 완화하는데에 있어서 보다 효율적이었음을 알 수 있었다.

재료 및 방법

능동 콜라겐 유도성 관절염( CIA )의 유도: 6∼8주령 된 수컷 DBA/1J 마우스(Jackson Labs, 메인주 바 하버 소재)를 사용하였다. 실험 개시전에 이소플루란으로 마취시킨 동물에 200 ㎍의 제II형 소 콜라겐(CII)[0.1 N 아세트산 50 ㎕ 중에 용해하고, 동 부피의 완전 프룬트 애쥬반트(Chondrex, 워싱턴주 레드몬드 소재)로 유화시킴]을 피 내 주사(꼬리 기부)하였다. 3주 경과시 즉, 21일째 되는 날에, 이 마우스에 0.1 N 아세트산 25 ㎕ 중에 용해하고, 동 부피의 불완전 프룬트 애쥬반트(Difco, 미시건주 디트로이트 소재)로 유화한 CII 100 ㎍을 유사한 방식으로 2차 피 내 주사하였다.

질병의 관찰: 14일 경과시를 시발점으로 하여, 모든 동물의 발에 발생한 질병의 상태를 매일 관찰하여 평가하였으며, 이때, 각각의 발에는 분석용 임상 스코어(clinical score)를 메겼다. 매일같이, 각 동물의 4개의 발에 임상학적 질병 단계에 따른 스코어를 메겼다. 이와 같이 스코어를 메김에 있어서는 2명의 관찰자가 동원되었으며, 이들 중 한 명 이상은 맹검 방식으로 실험을 진행하였다. 뿐만 아니라, 각 마우스의 체중을 달아 체중 변화를 측정함과 동시에, 발에 스코어를 메겼다.

발목/손목/가운데 발/앞발에 대한 등급 단위는 다음과 같다:

각 발의 측면에 있는 4개의 발가락에 대한 등급 단위는 "겹쳐짐(1) 또는 겹쳐지지 않음(0)"으로 메겼다. 예를 들어, 가장 많이 겹쳐진 좌측 뒷발에는 다음과 같이 스코어가 메겨졌다: 발목 = 3, 가운데 발 = 3, 발가락 = 4(임상 스코어 = 총 10 단위). 본 발명자들은 각각의 발에 대해 반복하여 스코어를 메긴 다음, 이 스코어를 합하였다. 36일째 되는 날에, 또는 전체 임상 스코어가 40에 이른 후에 마우스를 마취시켜, 관절을 해부하여 관찰하였다.

결과

본 발명자들은 능동 CIA 모델에서, 인간 항-HMG1 항체로 처리하면 CIA의 질병 중증도가 감소하거나 또는 이 질병의 발생이 예방될 수 있었음을 알아냈다. 21일째 되는 날을 시발점으로 하여 3일마다, 렌브렐(10 ㎎/㎏), 동 기준 표본 대조구 항체 또는 항-HMG1 항체 G4로 마우스를 처리하였다. 관절염의 진행 여부는 매일 관찰하였다. 도 15a의 그래프는 연구 기간에 걸친 처리 군 각각에 대한, 발 염증 스코어를 나타내는 것이다. 인간 IgG를 투여하였을 경우에는 관절염 진행에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 그러나, 항-HMG1 G4 항체로 처리한 동물은 대조구 동물에 비하여 염증 스코어가 매우 낮아졌다. 놀랍게도, 항-HMG1 G4 항체로 처리된 동물은 렌브렐 치료가 행하여진 동물의 경우보다 효능이 우수하였다(도 15의 좌측 및 우측 패널 비교).

본 모델에 있어서 질병이 진행됨에 따른 다른 임상학적 특징은 체중 감소이다. 대조구 동물에 대한 상대적 체중 스코어는 연구 내내 전반적으로 낮아졌다. 항-HMG1 G4 항체로 처리한 마우스에 메겨진 임상학적 스코어에 따르면 상당한 보호 효능이 나타났음을 알 수 있었으나, 이 동물 그룹의 경우에는 체중도 전반적으로 감소하였다. 그러나, 항-HMG1 G4 항체로 처리한 동물의 체중은 대조구 동물의 체중만큼 감소하지는 않았다. 이러한 결과를 통하여, 항-HMG1 항체를 질병이 발병하기 이전에 투여하면, 관절 손상 및 기타 증상에 대해 우수한 보호 효능이 나타남을 입증할 수 있다. 특히, 이러한 결과는 항-HMG1 G4 항체 처리가 CIA 마우스 모델에 있어서 질병의 중증도를 상당 수준 감소시키는 효과가 있음을 알려주는 것이다.

실시예 9

항- HMG1 항체는 애쥬반트 -유도성 관절염( AIA ) 래트 모델에 있어서 질병의 진행에 따른 중증도를 감소시킨다.

본 발명자들은 또한 애쥬반트-유도성 관절염(AIA) 래트 모델에서의 인간 항-HMG1 항체 G4의 효능에 관하여도 평가하였다. 이와 같은 일련의 실험에서, 본 발명자들은 관절염의 임상 증상이 발생하기 이전에 치료를 개시하는 예방 모델을 이용하였다. 본 연구에 있어서, 발명자들은 항-HMG1 항체의 효능과 렌브렐에 의한 효능을 비교하였다.

본 연구에 있어서, 본 발명자들은 최초로, HMG1에 대한 항체(G4)가 AIA 래트 RA 모델에 있어서 발 염증을 완화하는 효능을 가진다는 사실을 입증하였다. 실재, 항-HMG1 항체 G4는 렌브렐만을 단독 투여하였을 경우보다 발 염증을 완화하는데에 있어서 보다 효율적이었음을 알 수 있었다. 항-HMG1 G4 동물의 경우에는 임상 스코어가 약 34% 감소하였으며, 렌브렐 처리한 동물의 경우에는 임상 스코어가 약 11% 감소하였다. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 메토트렉세이트와 G4를 함께 투여하면, 메토트렉세이트와 렌브렐을 함께 투여하는 경우보다 발 염증 스코어를 보다 효과적으로 감소시켰음을 입증하였다.

재료 및 방법

애쥬반트 유도성 관절염( AIA )의 유도: 6∼8주령 된 암컷 DA 래트(Harlen)를 사용하였다. 실험 개시 전에 이소플루란으로 마취시킨 동물에 100 ㎕의 불완전 프룬트 애쥬반트(Difco, 미시건주 디트로이트 소재)와 혼합한 0.75 ㎎의 마이코박테리움 부티리큠(Mycobacterium butyricum; Difco #0640-33-7)을 피 내 주사(꼬리 기부)하였다. 이후의 처리는 이하 표 5에 제시한 바와 같이 행하였다.

인간의 항-HMG1 항체 G4, A-박스-Fc 융합체 및 huIgG 동 기준 표본 대조구를 0∼15일 동안 3일에 한번 씩 10 ㎎/㎏ 투여하였다. 메토트렉세이트는 0∼15일 동안 6일 마다 한번 씩 2.5 ㎎/㎏ 투여하였거나, 또는 처리 군 6에 대해서는 0∼15일 동안 3일 마다 한번 씩 4 ㎎/㎏ 투여하였다.

질병의 관찰: 6일 경과시를 시발점으로 하여, 모든 동물의 발에 발생한 질병의 상태를 매일 관찰하여 평가하였으며, 이때 각각의 발에는 분석용 임상 스코어를 메겼다. 매일같이, 각 동물의 4개의 발에 임상학적 질병 단계에 따른 스코어를 메겼다. 이와 같이 스코어를 메김에 있어서는 2명의 관찰자가 동원되었으며, 이들 중 한 명 이상은 맹검 방식으로 수행하였다. 뿐만 아니라, 각 마우스의 체중을 달아 체중 변화를 측정함과 동시에 발에 스코어를 메겼다.

발목/손목/가운데 발/앞발에 대한 등급 단위는 다음과 같다:

0 = 정상; 1 = 거의 인지되지 않을 정도로 부음; 2 = 약간 붓되, 심하지는 않음; 3 = 심하게 부음; 4 = 매우 심하게 부어올랐으되, 묵직한 정도는 아님.

각 발의 측면에 존재하는 4개의 발가락에 대한 등급 단위는 "겹쳐짐(1) 또는 겹쳐지지 않음(0)"으로 메겼다. 예를 들어, 가장 많이 겹쳐진 좌측 뒷발에는 다음과 같이 스코어가 메겨졌다: 발목 = 4, 가운데 발 = 4, MTP = 4, PIP = 4, DIP = 4(총 20 단위). 본 발명자들은 각각의 발에 대해 반복하여 스코어를 메긴 다음, 이 스코어를 합하였다. 21일째 되는 날에, 또는 전체 임상 스코어가 80에 이른 후에 마우스를 마취시켜, 관절을 해부하여 관찰하였다.

결과

인간 항-HMG1 항체 G4가 래트에서 AIA의 중증도를 감소시킬 수 있거나 또는 증상이 심해지는 것을 예방할 수 있었음을 알 수 있었다. AIA 래트에 PBS, 항-HMG1 항체 G4, 동 기준 표본 대조구 항체(HuIgG)를 3일에 한 번씩 10 ㎎/㎏ 투여하였거나, 또는 실험 개시 후 21일째 되는 날을 시발점으로 하여 이틀에 한번씩 렌브렐을 2.5 ㎎/㎏ 투여하였다. 뿐만 아니라, AIA 래트를, 기타 몇몇 치료제 예를 들어, 렌브렐, G4 또는 HuIgG와 함께 메토트렉세이트로 처리하였다. AIA 래트에는 또한 HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질로도 처리하였다. 관절염 진행 정도는 매일 검사하였다. 도 16a의 그래프는 연구 내내 각각의 항체 또는 렌브렐만을 단독 처리한 군과, PBS 및 정상 대조구 군에 대한 발 염증 스코어를 나타내는 것이다. 인간 IgG를 투여하였을 경우에는 관절염 진행에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나, 항-HMG1 G4 항체로 처리한 동물의 경우에는 대조구 동물의 경우에 비하여 염증 스코어가 상당히 낮아졌다. 놀랍게도, 항-HMG1 G4 항체로 처리한 동물은 렌브렐 치료만을 행한 동물의 경우보다 치료 효과가 월등히 우수하였다(도 16a, 좌측 및 우측 패널 비교). 항-HMG1 G4 항체 처리된 동물의 경우에는 임상 스코어가 약 30% 낮아졌고, 렌브렐 처리된 동물의 경우에는 임상 스코어가 약 25% 낮아졌다.

도 16b의 그래프는 항체만을 단독 처리한 처리 군과 HMG1 A-박스-Fc 융합 단백질을 처리한 처리 군을 비교하기 위한, 병행 요법 처리 군의 경시적 발 염증 스코어를 나타내는 것이다. A-박스-Fc 융합 단백질만을 단독 처리하였을 경우에는 염증 스코어가 낮아졌으나, 그 정도는 G4만을 단독 처리하였을 경우보다는 약했다. 렌브렐을 함께 투여하였을 경우의 염증 스코어는 G4만을 단독 처리하였을 경우보다 효율성이 떨어졌다. MTX와 HuIgG 대조구 항체를 함께 투여하였을 경우, MTX/렌브렐을 함께 투여하였을 경우와 유사한 정도로 염증이 완화되었던 것으로 보아, MTX는 이러한 감소 현상에 가장 크게 기여하는 물질인 것으로 예측된다. 그러나, MTX와 G4를 함께 투여할 경우 염증 스코어가 거의 정상에 가까운 수준으로 떨어진 것으로 보아, MTX/렌브렐을 함께 투여하는 경우보다 더욱 효과적임을 알 수 있다. 다양한 처리 군에서 관찰되는 발 염증 스코어의 감소는 AIA 래트 관절에서 관찰되는 HMG1, IL-6 및 TNF-α의 수준의 감소와 상관성이 있었다(도 12g 참조).

실시예 10

항- HMG1 항체는 에스 . 아우레우스 복막염 마우스 모델에서 동물의 생존율을 향상시킨다.

본 발명자들은 HMG1의 혈청 내 수준이 상승한, 중증 복막염을 앓고 있는 마우스 모델 내 몇몇 인간 항-HMG1 항체에 관하여도 시험하였다(상기 참조). 지금부터는 인간 항-HMG1 항체로 처리할 경우 대조구에 비하여 생존율을 거의 30%까지 증가시킬 수 있음을 입증하고자 한다.

재료 및 방법

복막염 의 유도: 4∼6주령된 암컷 BALB/c 마우스를 사용하였다. 우선, 갈락토사민과 미리 혼합한 열 불활성화 에스.아우레우스를 마우스에 복강 내 투여한 결과, LD₁₀₀이 1×10⁷∼1×10⁹ 세포임을 알 수 있었다(데이터는 제시하지 않음). 실험 개시전 HMG1의 수준을 측정하기 위해, 약 10⁹개의 열 불활성화 에스.아우레우스(균주 8325-4) 세포를 20 ㎎의 갈락토사민과 미리 혼합하여(부피 200 ㎕의 PBS 중) 복강 내 투여하거나, 또는 이 갈락토사민만을(부피 200 ㎕의 PBS 중) 복강 내 투여하였다. 세 번째 동물 군에는 아무것도 투여하지 않았다. 투여 후 2시간, 8시간 및 12시간 경과시 동물에 CO₂를 흡입시켜 마취시키고, 심장에 구멍을 내어 채혈하였다. 제0일째 되는 날 항체 처리 연구를 위해, 표 6에 나타낸 바와 같이, 약 10⁹개의 열 불활성화 에스.아우레우스(균주 8325-4) 세포를 20 ㎎의 갈락토사민과 미리 혼합하고, 이를 200 ㎕만큼 취하여 복강 내 투여한 다음, 후속 투여 30분 전에 100 ㎕를 또 투여하였다.

복막염 모델에 대한 처리 군
군 번호	시험 물질	투여량 1×LD₁₀₀	갈락토사민 투여량 (㎎)	처리	처리 시간	총 동물 수
A	에스.아우레우스	1×10⁹	20	안함		30
B	없음	없음	20	안함		15
C	없음	없음	없음	안함		7
1	에스.아우레우스	1×10⁹	20	PBS	30분 전	10
2	에스.아우레우스	1×10⁹	20	R347 200㎍	30분 전	10
3	에스.아우레우스	1×10⁹	20	G4-12-3 200㎍	30분 전	10

질병의 관찰: 실험 첫날로부터 14일에 걸쳐, 동물이 병적 상태를 나타내는지 여부(운동성의 심각한 감소, 털의 엉킴 현상 및/또는 최고 체중의 20% 이상 감소하였는지 여부) 및 사망하였는지 여부를 매일같이 관찰하였다. 동물의 체중은 일주일에 2번씩 측정하였다. 병적 상태가 심각한 동물은 안락사시켰다. 15일째 되는 날에는 생존하고 있던 동물 모두를 아락사시켰다(병적 증상이 심각해 지는 즉시 안락사시킴).

결과

인간 항-HMG1 항체에 관하여는 심각한 그람-양성 박테리아 유발성 패혈증 모델 즉, 열 불활성화 에스.아우레우스를 치사량 투여한 마우스를 통하여 시험하였다. 이 모델에서, PBS만으로 처리한 마우스나 항체 동 기준 표본 대조구(R347)를 처리한 마우스 중 어느것도 생존하지 못하였다. 이와는 반대로, HMG1 G4에 대한 인간 항체를 처리한 마우스 중 27%는 생존하였으며(도 17), E11을 처리한 마우스는 그 중 8%가 생존하였다(데이터는 제시하지 않음). 처리 후 24시간 이내에, 그리고 연구 내내 계속해서 사망률에 차이가 났다. 이러한 데이터는 CLP 연구 결과를 뒷받침하는 것이며(상기 참조), 또한 인간 항-HMG1 항체가 다양한 병원성 유기체에 의해 유발되는 부패증 치료에 유용함을 나타내는 것이다.

실시예 11

항- HMG1 항체는 급성 폐 손상과 관련된 세포 침윤을 감소시킨다.

2개의 인간 항-HMG1 항체를 리포다당류(LPS) 유발성 급성 폐 손상(ALI) 마우스 모델 내에서 시험하였다. 지금부터는 인간 항-HMG1 항체를 처리하면 대조구에 비하여 총 세포 침윤이 약 40%까지 감소한다는 사실을 최초로 입증하고자 한다(도 18).

재료 및 방법

LPS - 유발성 ALI 의 유도: 실험 첫날, LPS(이.콜라이 균주 0111:B4...미주리주 세인트 루이스 소재, Sigma)를, 이소플루란(일리노이주 디어필드 소재, Baxter Pharmaceuticals)으로 마취한 성체 BALB/c 마우스에 비강 내 투여하였다[마우스 한 마리당 5∼10 ㎍, 50∼100 ㎕]. HMG1 수준을 측정하기 위하여, LPS 투여 후 동물을 CO₂로 기절시켜 마취하고, 기관지 폐포 누출액(BAL)과 기타 시료를 단백질 분석 및 조직 병리학적 분석용으로서 수집하였다. LPS 투여 후 24 시간 경과시 치료 절차에 있어서, 항-HMGB1 항체, HMG1 A-박스 Fc 융합체 또는 대조구를 10 ㎎/㎏씩 100 ㎕ 만큼 복강 내(i.p.) 투여하였다. 3일 경과시(LPS 투여 후 48시간 경과시), 동물을 CO₂로 기절시켜 마취하고 시료(BAL, 혈액 및 폐)를 분석을 위해 수집하였다.

BAL 시료 수집: 카테터 튜브가 장착된 시린지를 이용하여 폐에 약 0.8 ㎖의 인산염 완충 염수(PBS, pH7.2, GIBCO, 미주리주 록빌 소재)를 3회 플러싱(flushing)하였다. BAL 시료를 수집하여 이를 1,200 rpm에서 10분 동안 원심 분리하고(4℃), 상청액을 수집하여 이를 -80℃에 보관하였으며(단백질(예를 들어, HMGB1) 정량용), 펠렛에 있던 세포는 재현탁하여 세포 슬라이드(cytoslide)에 옮긴 후, 고정화시키고, GIEMSA 염색한 다음, BAL 세포질을 현미경으로 관찰하였다.

결과

LPS를 비강 내 투여한 급성 폐 손상 모델에서 인간 항-HMG1 항체를 시험하였다. 이 모델에서, HMG의 전 염증 작용에 대한 경쟁적 억제 인자인 것으로 알려진 HMG1 A-박스만이 대조구에 비하여 침윤을 약 23%까지 감소시켰다. G4와 E11이 BAL액 중에서의 세포 침윤을 대조구에 비하여 37∼40% 감소시켰던 것으로 보아, 항-HMG1 항체는 급성 폐 손상 치료에 유용함을 알 수 있었다.

실시예 12

다발성 경화증( MS ) 플라크에 있어서 HMGB1 염색 패턴

G16 인간 항-HMGB1 항체를 이용하여 인간의 뇌 조직으로부터 유래하는 MS 플라크의 HMGB 염색 패턴을 관찰하였다. 탈 수초화되었으며, 다수의 활성화 소교 세포를 보유하는 플라크, 그리고 주로 탈 수초화되어 있고, 소수의 활성화 소교 세포 및 다수의 림프구를 보유하는 플라크를 관찰하였다. 도 19a는 탈 수초화되었으며, 다수의 활성화 소교 세포를 보유하는 플라크를 동 기준 표본 대조구 항체를 이용하여 낮은 수준으로 백그라운드 염색한 결과를 나타내는 것이다. HMGB1은 MS 환자로부터 유래한 인간 뇌 조직 내 소교 세포의 세포질 내에서 인간 mAb G16을 사용하였을 때 검출되었다. 탈 수초화되었으며, 다수의 활성화 소교 세포를 보유하는 플라크의 소교 세포 세포질과 탈 수초화된 플라크 간질은 진하게 염색되었다(도 19b). 이와는 반대로, 주로 탈 수초화되어 있고, 소수의 활성화 소교 세포 및 다수의 림프구를 보유하는 플라크는 인간 mAb G16으로 프로빙하였을 때 거의 염색이 되지 않았거나 또는 전혀 염색되지 않았다(도 19c). 이러한 결과를 통하여, HMGB1은 세포 외 염증 조정 인자로서 중요한 역할을 한다는 사실을 확인할 수 있었으며, 또한 HMGB1은 MS의 염증 과정에 관여할 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로, 본 발명을 내용의 명확성과 이해를 돕기 위하여 어느 정도 상세히 설명하였으나, 당 업자는 이와 같이 교시된 바로부터 본 발명을 다양하게 변형 실시할 수 있으며, 또한 그러한 변형 실시는 본 발명의 진정한 범위를 벗어나서는 행하여질 수 없다는 사실을 명백히 알고 있을 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기술과 장치는 다양한 방식으로 함께 사용될 수 있다. 각각의 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있는 것과 같이, 본원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌들은 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 것이다. 뿐만 아니라, 미국 가 명세서 출원 제60/620,726호(2004년 10월 22일 출원); 동 제60/651,512호(2005년 2월 10일 출원); 동 제60/658,572호(2005년 3월 7일 출원); 동 제60/662,944호(2005년 3월 18일 출원) 및 동 제60/713,712호(2005년 9월 6일 출원)는 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.

SEQUENCE LISTING <110> MedImmune, Inc. Wu, Herren Allan, Christian Gao, Changshou An, Ling-Ling Kiener, Peter Mao, Su-Yau Coyle, Anthony <120> High Affinity Antibodies Against HMGB1 and Method of Use Thereof <130> HB601PCT <150> 60/620,726 <151> 2004-10-22 <150> 60/651,512 <151> 2005-02-10 <150> 60/658,572 <151> 2005-03-07 <150> 60/662,944 <151> 2005-03-18 <150> 60/713,712 <151> 2005-09-06 <160> 103 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser 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ccagtctcca gactccctgg ctgtgtctct gggcgagagg 60 gccaccatca actgcaagtc cagccagagt gttttataca gctccaacaa taagaactac 120 ttagcttggt accagcagaa accaggacag cctcctaagc tgctcattta ctgggcatct 180 acccgggaat ccggggtccc tgaccgattc agtggcagcg ggtctgggac agatttcact 240 ctcaccatca gcagcctgca ggctgaagat gtggcagttt attactgtca gcaatattat 300 agtactcctc ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaa 345 <210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Met Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gln Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 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ctttacactg 240 aaaatcagca gagtggaggc tgaggatgtt ggggtttatt actgcatgca atctctacaa 300 agtcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 56 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Lys Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Val Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ile Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Gln Gln Trp Leu Gly Arg Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacaaga tggtttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttct atcgttcctt ctggtggcat tactatttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagtgcag 300 cagtggctgg gacggcccta ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctca 360 agc 363 <210> 58 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Thr Gln Ser Val Arg 20 25 30 Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg 65 70 75 80 Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn 85 90 95 Ser Pro Ile Ile Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 59 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca ggcaccctgt ctttgtctcc aggcgaaaga 60 gccaccctct cctgcagggc cactcagagt gttagaaaga acttcttagc ctggtatcag 120 cagaaacctg gccaggctcc caggctcctc atctacgatg catccagcag ggccactggc 180 atcccagaca ggttcagtgg cagtgggtct gggacagact tcactctcac catcagcaga 240 ctggagcctg aagattttgc agtgtattac tgtcagcagt atggtaactc acctatcatc 300 ttcggccaag ggacacgact ggagattaaa 330 <210> 60 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Val Pro Ser Gly Gly Ile Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asn Tyr Gly Pro Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgata tgtggtgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttcttgg atcgttcctt ctggtggcat tactgcttat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gagaggtaac 300 tacggcccat cgccgtttga ctactggggc cagggcaccc tggtcaccgt ctcaagc 357 <210> 62 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Arg 1 5 10 15 Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn 20 25 30 Asn Ala Val Thr Trp Tyr Gln Tyr Phe Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Arg Gly 85 90 95 Leu Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 63 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gcacagagcg ctttgactca gccaccctcg gtgtctgcag cccccaggca gagggtcacc 60 atctcctgtt ctggaagcac ttccaacatc ggaaataatg ctgtaacctg gtaccagtat 120 ttcccaggaa aggctcccaa actcctcatc tatagtgata atcagcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcgtatg acagaggcct gagtgtggtt 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 64 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30 Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Pro Ser Gly Gly Leu Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ile Phe Gly Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 gaagttgaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct aagtacatta tgcattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atcgttcctt ctggtggcct tactgagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccacat attactgtgc gaaagagatt 300 tttggacaat ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcaag c 351 <210> 66 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Arg Ala Asn Glu Arg Ile Asn 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Ser Gly Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ser Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Arg 100 105 <210> 67 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 67 gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60 gtcaccatca tttgccgggc aaatgagcgc ataaacacct atttaaactg gtatcagcag 120 aagccaggaa aagcccctaa gttgttgatt tctggtacat ccagtttgga aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctgga acagaattca ctctcagtat cagcagtctg 240 caacctgaag attttgcatc ttactactgt caacagagtt acagttcccc gtacactttt 300 ggccagggga ccaacctgga gatcaga 327 <210> 68 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr 20 25 30 Glu Thr Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Gln Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Val Gly Ala Thr Lys Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tggtacgaga cgggttgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctggt atctctcctt ctggtggcta tactcagtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatcgggg 300 gtgggagcta ctaagatttt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcaagc 360 <210> 70 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ala Gln Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Thr 85 90 95 Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 71 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 71 gcacaagaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 60 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attggcacct atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga cagcccctaa ggtcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 240 caacctgaag atttttcaac ttactactgt caacagagtt acaatacccc tcgcactttt 300 ggccagggga ccaaactgga gatcaaa 327 <210> 72 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Trp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Arg Tyr Thr Ser Gly Trp His Glu Tyr Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 gaagttcaat tgttagagtc tggtggcggt cttgttcagc ctggtggttc tttacgtctt 60 tcttgcgctg cttccggatt cactttctct tattacgata tgcattgggt tcgccaagct 120 cctggtaaag gtttggagtg ggtttctcgt atctctcctt ctggtggcta tacttggtat 180 gctgactccg ttaaaggtcg cttcactatc tctagagaca actctaagaa tactctctac 240 ttgcagatga acagcttaag ggctgaggac acagccgtgt attactgtac gagaggaagg 300 tataccagcg gctggcatga gtacttcgac ccctggggcc agggcaccct ggtcaccgtc 360 tcaagc 366 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 76 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 77 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Gly Tyr Met Met Val 1 5 <210> 78 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Gln Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 79 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Glu Glu Gly Gly Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 80 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Trp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 84 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Arg Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Leu Glu Val Gly Ala Thr Ser Gly Gly Thr Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Arg Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 88 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Phe Thr 1 5 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Trp Tyr Ser Met Leu 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Tyr Ile Ser Pro Ser Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Trp Asp Tyr Asn Ser Gly Trp Tyr Tyr Asp His 1 5 10 <210> 92 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Thr Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Glu Ala Ser Lys Arg Ala Thr 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Gln His Arg His Asn Trp Pro Pro Gln Trp Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Trp Tyr Asp Met Thr 1 5 <210> 96 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Tyr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Glu Phe Tyr Asp Tyr Leu Asp Val 1 5 <210> 98 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn Phe Leu Ala 1 5 10 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Gly Ala Ser Arg Arg Ala Ser 1 5 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asn Thr 1 5 <210> 101 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Arg Tyr Gln Met Asn 1 5 <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly His Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Asp Gly Arg Gln Gly Lys Ile Ser Thr Val Asp His 1 5 10

Claims

인간 HMGB1 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편과 특이적으로 결합하는 분리된 항체로서, 상기 항체는 상기 인간 HMGB1 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편과 해리 상수(K_d) 39 nM 이하로 결합하는 분리된 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 HMGB1 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편과 해리 상수(K_d) 22∼39 nM로 결합하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 HMGB1의 B 박스를 포함하는 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 인간 HMGB1의 B 박스로 이루어진 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것인 항체.
제3항에 있어서, 상기 인간 HMGB1의 B 박스는 서열 번호 3, 서열 번호 28 및 서열 번호 29로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 4의 인간 HMGB1의 A 박스로 필수적 으로 이루어진 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 번호 4의 인간 HMGB1의 A 박스로 이루어진 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화 항체; 키메라 항체; 단일 사슬 Fv(scFv); Fab 단편; F(ab') 단편; 인트라바디(intrabody); 및 합성 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체는 인간 항체이거나 이의 항원성 결합 단편인 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체의 pI는 6.5∼9.5인 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체의 Tm은 65∼95℃인 것인 항체.
제9항에 있어서, 상기 항체는 고 이동성 단백질 군(HMG)으로 처리한 척추 동물 세포로부터 전 염증성(proinflammatory) 시토킨이 방출되는 것을 억제하는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 마우스 CLP 부패증(sepsis) 모델에 투여되었을 때 30% 이상의 보호 효능을 나타내는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 하나 이상의 설치류 관절염 모델에 투여되었을 때 30% 이상의 보호 효능을 나타내는 것인 항체.
제14항에 있어서, 상기 설치류 관절염 모델은 마우스 수동적 콜라겐-유도성 관절염 모델, 마우스 능동적 콜라겐-유도성 관절염 모델 및 래트 애쥬반트-유도성 관절염 모델로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체.
제1항에 있어서, 상기 항체는 마우스 복막염 모델에 투여되었을 때 30% 이상의 보호 효능을 나타내는 것인 항체.
제1항의 항체를 생산하는 방법.
제1항의 항체를 포함하는 항체 조성물.
제1항의 항체 하나 이상을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 시토킨 연쇄 반응의 활성화를 특징으로 하는 병상의 치료 방법.
제9항의 항체 하나 이상을 치료학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 류머티즘성 관절염의 치료 방법.
a) 항체와 HMGB가 적당히 결합하는 조건 하에서 생물 시료와 제1항의 항체를 접촉시키는 단계; 및

b) 상기 생물 시료 중 결합된 HMGB를 검출하는 단계

를 포함하는,

염증성 시토킨 연쇄 반응의 활성화를 특징으로 하는 병상의 치료 효능을 진단, 예측 또는 관찰하는 방법.
S2, S6, S16 및 G4로 이루어진 기탁 항체 군으로부터 선택되는 항체.
제22항에 있어서, 상기 기탁 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체로서, 상기 기탁 항체는 HMG1 폴리펩티드에 대한 친화성이 같거나 또는 더욱 큰 것인 항체.