CN102559604B - 拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能持续稳定分泌拮抗HMGB1Bbox的单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其分泌的抗体。HMGB1是一重要的炎症介质，具有促炎和趋化功能，广泛地的参与许多炎症疾病的致病，Bbox是HMGB1生物活性区域。本发明所制备的单克隆抗体具有以下特征：该单克隆抗体为IgG2a,κ，能特异性的与脊椎动物HMGB1Bbox结合，抑制其生物学活性；此外该单克隆抗体还可以用于westernblot、ELISA检测。总体而言，该单克隆抗体一方面可以用于脊椎动物HMGB1的检测；另外一方面还可以用于治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种拮抗HMGB1 B box这一重要炎症介质的单克隆抗体及其应用范围。
背景技术
高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）为高迁移率族蛋白（HMG）家族成员之一，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 中具有高迁移能力而得名。HMGB1广泛分布于淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等组织中，HMGB1除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外，在大多数组织中存在于胞核。HMGB1在进化过程中其氨基酸序列高度保守，啮齿类动物与人的氨基酸序列同源性高达98%以上，小鼠与大鼠氨基酸序列同源性更是高达100%。人类HMGB1基因位于13q12染色体上，包括5个外显子和4个内含子，编码含215个氨基酸的蛋白，由三个区域组成：两个正电荷区域（A盒和B盒），和一个负电荷羧基末端（酸性末端）。A 盒(aa1～79)和B 盒(aa89～163) ，是DNA 的非特异性结合区。其中B 盒前20个氨基酸是其发挥细胞因子活性的关键位点，可以诱导巨噬细胞分泌更多的致炎细胞因子如TNF-α，或树突状细胞分泌IL-6。HMGB1在胞内具有调节基因转录、稳固胞核结构的功能。胞内HMGB1可通过活化的巨噬细胞、树突状细胞主动分泌或坏死、凋亡的细胞被动释放进入胞外。释放到胞外的HMGB1通过与其配体高度聚糖化作用终产物受体(receptor for advanced
glycation end products, RAGE)和Toll样受体(Toll like receptor, TLR)结合，一方面促进前炎症因子、趋化因子以及MHCII类分子的表达，进而参与CD4+T细胞的发育以及免疫应答的调控；另外一方面HMGB1作为晚期重要的炎症介质，参与败血症、心血管***疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、缺血/再灌注损伤等疾病的致病以及组织损伤与修复，中和HMGB1能够有效地的缓解以上疾病的症状，因此，HMGB1成为炎症疾病潜在的治疗靶位。而拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体能够有效地的中和HMGB1，抑制其发挥生物学效应。
发明内容
HMGB1是一重要的炎症介质广泛参与许多炎症疾病的致病，其生物学活性位点位于B box区域，中和HMGB1能够有效地缓解炎症疾病，因此制备拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体对于研究HMGB1的生物学效应、以及炎症的疾病的治疗具有重要意义。
本发明提供了分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株2D4E3A2，它的保藏号是CGMCC No.5534。
本发明所述的分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株2D4E3A2由原核表达的B box蛋白免疫BALB/c小鼠后分离脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合而制得。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图 1是本发明中所用免疫原HMGB1 B box蛋白的表达与纯化。M：为蛋白marker；空白：为空载体；1：转化菌的全菌液；2：洗涤流出的液体；3：洗涤最后流出的液体；4-6：为纯化后的HMGB1B box蛋白。
图 2是免疫过程示意图。
图 3是2D4E3A2细胞系分泌的单克隆抗体亚型示意图。1，该单克隆抗体亚型；2，亚型鉴定对照图；3，该单克隆抗体轻链类型；4，轻链类型鉴定对照图。
图 4是2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于ELISA检测示意图。
图 5是 LPS诱导小鼠脓毒血症模型分别在4h、12h、24h心脏采血、利用2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体所建立的ELISA检测血浆HMGB1。*p<0.01 。
图 6是 利用2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体采用Western blot法检测巨噬细胞HMGB1表达水平。
图 7 2D4E3A2细胞分泌的抗体能够有效地的缓解心肌炎心肌的损伤，C 代表对照组 E 代表实验组 E-B 代表2D4E3A2抗体干预组。
本发明的细胞株2D4E3A2于2011年11月30日提交到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株，保藏编号为CGMCC No.5534。保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
免疫原的制备 HMGB1 B box的蛋白采用基于工程技术由原核表达产生，HMGB1 B box基因序列和对应的蛋白序列分别如下：
HMGB1 B box基因序列如SEQ ID NO：1所示。
与基因相对应的HMGB1 B box蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。
动物免疫 用10μg纯化的B box蛋白（制备过程为：将从pQE-80L（购自于第三军医大学）上切下B box基因的片段与表达载体pET-28(史小菊博士馈赠)连接，转化E. coli DH5α感受态细胞。挑取单个转化菌落接种于含卡那霉素的LB培养基中，用碱裂解法小量提取质粒DNA。用Kpn I、Hind III（大连宝生生物工程有限公司）双酶切及PCR鉴定。取阳性转化菌接种于含卡那霉素的LB培养基中，于37℃振摇培养过夜。然后，取此菌液100 μl接种于6 ml LB培养基中（杭州天和微生物试剂有限公司），于37℃振荡培养至0.5<OD600<0.6 (约2～3 h)。加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）（苏州科晴生物有限公司）至终浓度为1 mmol/L，于37℃振荡培养6h后，收集菌液离心进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析(PAGE的分离胶为150g/L)，SDS-PAGE结果见图1，在Mr约10000处有1条特别浓的蛋白带，其大小与预期的结果相当。而用IPTG诱导pET-28空载体转化菌则未见此条带。证实pET-28-HMGB1 B box融合蛋白在转化菌中表达成功，见图1中4-6位置的条带（M：为蛋白marker；空白：为空载体；1：转化菌的全菌液；2：洗涤流出的液体；3：洗涤最后流出的液体；4-6：为纯化后的HMGB1B box蛋白）；以His标记的蛋白纯化柱进行纯化，纯化后与福氏完全佐剂混合并完全乳化后，经皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。隔2-3周同法进行第2次免疫，一周后，经尾静脉加强免疫（详细步骤见图2）。
细胞融合及杂交瘤细胞的筛选 细胞的融合按常规的方法进行，阳性细胞株的筛选采用间接ELISA进行。（详细步骤如下：）
1.饲养细胞的制备：
小鼠腹腔巨噬细胞的制备：取6～10周龄BALB/c小鼠（扬州实验动物中心购买），短颈处死，浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟；用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜；用无菌注射器注入2ml左右NS，反复冲洗，吸出冲洗液；放入10ml离心管，500-800r/min离心5～6分钟，弃尽上清；用50ml含20％小牛血清的HAT培养液制成悬液；加入24孔板，500μl／孔（4块板，50ml）；放入37℃ CO2孵箱培养。
2.免疫脾细胞
脾细胞悬液的制备：取已经免疫的小鼠，摘眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照，同时断颈处死小鼠，浸泡于75%的乙醇5分钟，在无菌平皿中，取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中尼龙筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
骨髓瘤细胞的制备：在无菌条件下取出肿瘤，剥掉外面血色部分，留取白色部分，用不完全的培养液洗一次，置平皿中尼龙筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。
3. 细胞融合
（1）将上述已计数的骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶9的比例混合于50ml塑料离心管内（一般脾细胞数较少，可以全部用完并置50ml离心管，只要将9倍于所有脾细胞量的瘤细胞加入脾细胞管即可）用不完全培养液补充至45ml，1000rpm，8分钟。
（2）弃上清，（直接迅速倒尽上清，使管底朝上即可）。
（3）弹击离心管底，使细胞沉淀充分混匀分散。
（4）在预先调至37℃的水中进行融合: 即在1000ml烧杯中加入500-600ml 40℃的热水，并在融合前先置37℃水浴箱中预温（用温度计置烧杯的水中测定温度）。融合时：
① 将装有1：9脾细胞和瘤细胞混合液的50ml离心管放入装有500ml 37℃水的烧杯中，于水面上边摇边加入1ml 50%PEG，1 分钟加完（加入PEG时逐滴加入，由慢到快，1分钟加完）。
② 仍在水浴中继续摇，等候1分钟（即继续摇1分钟）.
③ 继续摇并边加边加入1ml无血清RPMI1640培养基，1分钟加完。继续遥，等1分钟后，加5ml无血清RPMI1640培养基（ 边加边摇，3分钟加完）。
④ 补充无血清RPMI1640培养基至50ml刻度，800r/min离心8分钟。
⑤弃上清（同上将试管底朝上弃尽液体），轻轻打匀沉淀细胞，加入HAT培养基96－100ml（即往离心管中加入50mlHAT培养基后，将离心管中的细胞悬液移至剩余45－50ml HAT培养基的100ml瓶中混匀，分种于24孔培养板，每孔1ml）
⑥ 37℃、5％CO2孵箱培养。
4.阳性细胞克隆的筛选 间接ELISA法筛选细胞培养上清中分泌有抗HMGB1的抗体的细胞孔。
5.杂交瘤的克隆化 将阳性细胞孔进行克隆筛选出能够稳定分泌抗HMGB1 B box单克隆抗体的细胞株，命名为2D4E3A2。
细胞分泌的单克隆抗体效价、反应特异性及亚型的鉴定 采用间接ELISA法测定mAb的效价、Western blot法进行特异性鉴定、sigma aldrich的单克隆抗体亚型鉴定试纸条（The IsoQuickä strips,
ISOQ25)进行单克隆抗体亚型的鉴定，其操作步骤依据说明书进行，结果见图3。由图3可以看出2D4E3A2细胞所分泌的单克隆抗体为IgG2a，κ型，（1，待检单克隆抗体的亚型；2，亚型鉴定对照图；3，该单克隆抗体轻链类型；4，轻链类型鉴定对照图）。将杂交瘤细胞株稳定传代后冻存于液氮罐中，复苏后仍能有效地分泌mAb。
细胞分泌的单克隆抗体的应用 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体通过ELISA（双抗体夹心）、Western blot用于脊椎动物HMGB1的检测（无种属的限制）；此外，2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体可用于心肌炎的治疗。
应用实例如下：
1. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于小鼠血浆HMGB1的检测
小鼠腹腔注射LPS（10mg/kg），分别在4h、12h、24h麻醉后心脏采血，分离血浆，加入到预先包被该抗体的96孔板中，4℃培养过夜，洗涤后加入兔抗HMGB1的多克隆抗体（购自于Abcam公司），洗涤后加入山羊抗兔的HRP-IgG抗体，洗涤后加入TMB，测其OD值（该单克隆抗体的使用方法见图4）。如图5，小鼠腹腔注射LPS24h后，血清中HMGB1水平达到200±67.3ng/ml，与对照组相比明显增加。
2. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体利用Western blot法检测巨噬细胞HMGB1的表达
分离小鼠腹腔巨噬细胞种植于24孔板中，LPS刺激1小时，洗涤后换培养液，继续培养细胞，24小时后收集细胞，裂解、煮沸，进行SDS-PAGE电泳，转膜后进行免疫印迹实验，WB法检测巨噬细胞HMGB1的表达。有图6可以看出，制备的单克隆抗体（1D2F3E4、2D4E3A2）与购自于Abcam的抗体一样具有特异的反应。
3. 2D4E3A2细胞分泌的单克隆抗体用于心肌炎的治疗
100μg小鼠心肌球蛋白（MyHC-α614-629，Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH）与福氏完全佐剂（CFA）1:1混合，分别在第0和7天，免疫小鼠，对照组用CFA和PBS进行免疫；在第二次免疫后一周分成两组。一组用100 μg/mouse 的HMGB1 B box单克隆抗体皮下注射、另外一组用PBS，2周后处死小鼠，收集血清、***固定心脏组织；苏木精-伊红（H-E）染色。心肌损伤以及炎症细胞的浸润程度，由两位病理医生采用双盲法根据Dallas诊断标准分级进行。诊断标准如下：
“0”、没有炎症浸润；
“1”、心肌组织少量炎症细胞浸润；
“2”、局灶性炎症细胞浸润，炎症细胞浸润数量大于100；
“3”、大于10%的心肌断面出现心肌细胞坏死和炎症细胞的浸润；
“4”、大于30%心肌断面出现心肌细胞坏死和炎症细胞的浸润。
如图7注射单克隆抗体组，心肌损伤程度明显减轻。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 拮抗HMGB1 B box的单克隆抗体及其应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcaaggatc ccaatgcacc caagaggcct ccttcggcct tcttcctctt
ctgctctgag 60
tatcgcccaa aaatcaaagg agaacatcct ggcctgtcca ttggtgatgt
tgcgaagaaa 120
ctgggagaga tgtggaataa cactgctgca gatgacaagc agccttatga
aaagaaggct 180
gcgaagctga aggaaaaata cgaaaaggat attgctgcat
atcga
225
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<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu
1
5
10
15
Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu
20
25
30
Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr
35
40
45
Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys
50
55
60
Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala Ala Tyr Arg
65
70
75
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1.分泌抗HMGB1 B box 单克隆抗体细胞株2D4E3A2，它的保藏号是CGMCC No.5534。
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