KR20070088727A - 안정화된 중합체성 티올 시약 - Google Patents

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Abstract

구조 POLY-[Y-S-W]x, (여기서, POLY 는 수용성 중합체이고 ; Y 는 탄화수소계 스페이서 기이고, x 는 1 내지 25 이고, S-W 는 티올, 보호 티올, 또는 티올-반응성 유도체임) 를 포함하는 수용성 중합체성 시약이 개시된다. 바람직하게는, 수용성 중합체는 PEG 중합체이다. 상기 중합체성 시약과 약학적으로 상응하는 분자와의 콘쥬게이트, 및 그의 형성 및 사용 방법이 또한 개시된다.

Description

안정화된 중합체성 티올 시약 {STABILIZED POLYMERIC THIOL REAGENTS}
본 발명은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 수용성 중합체 유래의 안정화된 중합체성 티올 시약에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 중합체성 티올 시약, 그의 컨쥬게이트, 및 그러한 컨쥬게이트를 사용하는 방법에 관한 것이다.
생물공학에서의 최근의 발전으로 인해, 치료성 단백질 및 기타 생물분자, 예를 들어 항체 및 항체 절편이 이제 대규모로 제조될 수 있으며, 그러한 생물분자는 더욱 광범위하게 이용가능하게 되었다. 불행하게도, 비개질 형태의, 잠재적인 치료성 생물분자의 임상적 유용성은 종종 그의 빠른 단백용해성 분해, 제조, 저장 또는 투여 시 불안정성, 또는 그의 면역원성에 의해 방해받는다.
상기 결함은 종종 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 수용성 중합체의 공유 결합에 의해 극복될 수 있다. 예를 들어, [Abuchowski, A. 등, J. Biol. Chem. 252(11):3579 (1977); Davis, S. 등, Clin. Exp Immunol. 46:649-652 (1981)] 을 참조한다. PEG-컨쥬게이트 또는 PEG화 단백질이라고도 하는 PEG-개질 단백질의 생물학적 특성은 많은 경우 그의 비-PEG화 대응물의 것을 넘어서서 상당히 향상된 것으로 보인다 (Herman 등, Macromol. Chem. Phys. 195:203-209 (1994)). 폴리에틸렌 글리콜-개질 단백질은 단백용해성 분해에 대한 내성이 증가됨으로 인해 체 내에서 더 긴 순환 시간을 가지며, 또한 증가된 열안정성을 가진 것으로 보인다 (Abuchowski, A. 등, J. Biol. Chem. 252:3582-3586 (1977). 생물효능에 있어서의 유사한 증가가 기타 생물분자, 예를 들어 항체 및 항체 절편으로 관찰된다 (Chapman, A., Adv. Drug Del. Rev. 54:531-545 (2002)).
아미노기와의 반응에 적합한 활성화된 말단 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜은 흔히 단백질의 개질에 사용된다. 상기 활성화된 PEG 또는 "중합체성 시약" 은 PEG-알데하이드 (Harris, J.M. and Herati, R.S., Polym Prepr. (Am. Chem. Soc, Div. Polym. Chem.) 32(1): 154-155 (1991)), 혼합 무수물, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 카르보닐이미다졸리드, 및 클로로시아누레이트를 포함한다 (Herman, S. 등, Macromol. Chem. Phys. 195:203-209 (1994)). 그러나, 일부 경우, 단백질 아미노기를 통한 중합체 부착은, 특정 리신 잔기의 유도체화가 단백질을 불활성화시킬 때, 바람직하지 않을 수 있다 (Suzuki, T. 등, Biochimica et Biophysica Acta 788:248- 255 (1984)). 따라서, 시스테인과 같은 또다른 표적 아미노산을 사용하여 PEG 에 의한 단백질의 추가의 개질 방법을 가지는 것이 유리할 것이다. 단백질 티올기의 시스테인 상에의 결합은, 시스테인이 전형적으로 리신보다 단백질에서 덜 풍부하여, 상기 티올-함유 아미노산에의 공액 시 단백질 탈활성화의 경향을 감소시킨다는 점에서 이점을 제공한다. 티올-선택성 활성화된 중합체는 예를 들어 흔히 PCT 공개 번호 WO 2004/063250 에 기술되어 있다.
중합체성 티올 유도체, 및 구체적으로는 PEG 티올은 티올-선택성 활성화 중합체의 한 유형이다. 그러나, 많은 선행 기술 중합체성 티올은 이황화를 형성 하는 산화성 커플링을 하기가 매우 쉬우며, 활성 성분을 감소시키고 제거하기 어려운 불순물을 첨가하는 분해 과정을 하기가 매우 쉬운 점으로 인해 곤란을 겪는다. 후자는 특히 상기 물질로부터 생물컨쥬게이트의 제조 시 문제가 될 수 있다. 따라서, 선행 기술 시약을 초과한 개선된 안정성을 가진 중합체성 티올 시약을 제공하는 것이 유리할 것이다.
발명의 개요
한 측면에서, 본 발명은 하기 구조를 갖는, "중합체성 시약" 이라고도 하는 수용성 활성화된 중합체를 제공한다 :
POLY-[Y-S-W]x
[식 중 :
POLY 는 수용성 중합체이고 ;
Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 4 개 이상의 탄소 원자를 함유하는 2 가 연결기이고 ;
S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
x 는 1 내지 25 이고 ;
S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임]. 한 구현예에서, S-W 는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 와 같은 티올-반응성 유도체이다.
x 가 2 일 때, 시약은 하기에서 추가로 기술되는 것과 같은 이작용성 중합체성 시약이고, 본원에 기술된 바와 같은 선형 또는 "포크" 형태를 가질 수 있다. 중합체성 시약은 또한 특히 x 가 3 이상일 때 본원에 기술된 바와 같은 "다중팔 (multiarmed)" 형태를 가질 수 있다. 선택된 구현예에서, x 는 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4 이고 ; 추가의 구현예에서, x 는 1 또는 2 이거나, 또는 x 는 1 이다. 개시된 중합체성 시약의 POLY 성분은 그 자체가 본원에 기술된 바와 같은 선형, 분지형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
특별한 구현예에서, POLY 가 선형 폴리에틸렌 글리콜이고, Y 가 선형 알킬쇄이고, POLY 가 500 이상의 분자량을 갖는다.
추가의 구현예에서, POLY 의 분자량은 1000 이상, 또는 2000 이상이다. 상한 범위로서, POLY 의 분자량은 300,000 Da 이하이다.
연결기 Y 의 "탄화수소 골격" 은 더욱 특히 POLY 와 S 를 연결하는 가장 짧은 인접 탄소쇄로서 정의된다. Y 의 골격이 불포화되어 있을 때, 바람직하게는 단일불포화되어 있는데, 즉, 단일 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 가진다. 바람직하게는, 골격 및 치환체를 포함하는 스페이서기 Y 는 단일불포화 또는 더욱바람직하게는, 전체 포화되어 있다. 또다른 구현예에서, 골격 및 치환체를 포함하는 스페이서기 Y 는 포화 및 방향족 부분으로 이루어져 있다.
바람직하게는, 골격은 포화되어 있다. 예를 들어, Y 는 형태 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 의 것일 수 있다. 선택된 구현예에서, n 은 3 내지 6 이거나, n 은 4 내지 6 이거나, 또는 n = 4 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 저급 알킬로부터 선택되며, 여기서 저급 알킬은 바람직하게는 메틸 또는 에틸이다.
추가의 선택된 구현예에서, Y 는 C4-C8 알킬렌, C5-C8 시클로알킬렌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그 중 임의는 하나 이상의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, C3-C6 시클로알킬, 할로, 시아노, 저급 알콕시, 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 플루오로, 및 클로로로부터 선택되는, 많아야 1 또는 2 개의 비-방해 치환체가 포함된다. 한 구현예에서, 헤테로원자-함유 치환체는 존재하지 않는데 ; 즉 연결기 Y 는 탄소 및 수소로 이루어져 있다.
한 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 -(CR1R2)- 의 n 번 반복에 대해서는 수소이고 ; 또다른 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황 원자에 인접한 탄소 원자 상의 R1 은 예외로 하며, 상기 R1 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸 또는 에틸 (α-분지) 이다. 한 구현예에서, α-분지기는 메틸이다.
Y 가 -(CR1R2)n- 이고 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 R1 및 R2 가 연결되어 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성하는 Y 의 구현예에서, 시클로알킬기는 바람직하게는 시클로펜틸 또는 시클로헥실기이다. 바람직하게는, S 는 상기 구현예의 Y 의 sp3 혼성화된 비환식 탄소에 연결된다.
상기 언급된 바와 같이, POLY 는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 일 수 있다. 그러한 PEG 의 분자량은 전형적으로 148 (예를 들어, 삼량체 + 연결 산소 원자) 내지 약 200 내지 약 100,000 달톤이다. 선택된 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 달톤이다. 대표적인 분자량은 예를 들어, 500, 1000, 2000, 2500, 3500, 5000, 7500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 및 40000 달톤을 포함한다. 개시된 시약의 PEG 성분은 그 자체가 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 선형, 분지형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
따라서, 본 발명은 하기 구조를 포함하는 수용성 중합체성 시약을 제공한다 :
PEG-[Y-S-W]x
[식 중 :
PEG 는 폴리에틸렌 글리콜 중합체이고 ;
Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
x 는 1 내지 25 이고 ;
S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체이고 ;
PEG 의 분자량은, PEG 가 선형이고, x 가 1 이고, Y 가 선형 알킬쇄일 때, 500 이상임].
상기 언급된 바와 같이, x 가 2 일 때, 시약은 하기에서 추가로 기술되는 것과 같은 이작용성 중합체성 시약이고, 본원에 기술된 바와 같은 선형 또는 "포크" 형태를 가질 수 있다. 중합체성 시약은 또한 특히 x 가 3 이상일 때 본원에 기술된 바와 같은 "다중팔형" 형태를 가질 수 있다. 선택된 구현예에서, x 는 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4 이고 ; 추가의 구현예에서, x 는 1 또는 2 이거나, 또는 x 는 1 이다. 개시된 중합체성 시약의 PEG 성분은 그 자체가 본원에 기술된 바와 같은 선형, 분지형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, PEG 의 분자량은 148 이상, 200 이상, 500 이상, 1000 이상, 또는 2000 이상, 약 100,000 달톤 이하이고, 상기 언급된 다양한 범위를 포함하며, 선형, 분지형, 포크형, 및 다중팔형으로부터 선택되는 형태를 가진다. S-W 는 바람직하게는 티올-반응성 티올 유도체, 및 더욱 바람직하게는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 이다.
연결기 Y 의 "탄화수소 골격" 은 더욱 특히 PEG 와 S 를 연결하는 가장 짧은 인접 탄소쇄로서 정의된다. 바람직하게는 연결기 Y 의 골격이 포화되어 있고, Y 는 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 가진다. 선택된 구현예에서, n 은 3 내지 6 이거나, n 은 4 내지 6 이거나, 또는 n = 4 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다.
추가의 선택된 구현예에서, Y 는 C3-C8 알킬렌, C5-C8 시클로알킬렌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그 중 임의는 하나 이상의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, C3-C6 시클로알킬, 할로, 시아노, 저급 알콕시, 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 플루오로, 및 클로로로부터 선택되는, 많아야 1 또는 2 개의 비-방해 치환체가 포함된다. 한 구현예에서, 헤테로원자-함유 치환체는 존재하지 않는데 ; 즉 연결기 Y 는 탄소 및 수소로 이루어져 있다.
상기 언급된 바와 같이, 한 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 -(CR1R2)- 의 n 번 반복에 대해서는 수소이고 ; 또다른 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황 원자에 인접한 탄소 원자 상의 R1 은 예외로 하며, 상기 R1 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸 또는 에틸 (α-분지) 이다. 한 구현예에서, α-분지기는 메틸이다.
Y 가 -(CR1R2)n- 이고 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 R1 및 R2 가 연결되어 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성하는 Y 의 구현예에서, 시클로알킬기는 바람직하게는 시클로펜틸 또는 시클로헥실기이다. 바람직하게는, S 는 상기 구현예의 Y 의 sp3 혼성화된 비환식 탄소에 연결된다.
형태 PEG-Y-S-W 의 실례의 시약에서, Y 는 -(CR1R2)n- 이고, 여기서 R1 및 R2 의 각각은 수소이고, n 은 4 이고, S-W 는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 이고, PEG 는 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 이다. mPEG 의 분자량은 바람직하게는 5000 내지 30000 Da 의 범위이다. 추가의 실례의 시약에서, PEG 및 SW 는 유사하게 정의되고, n 은 3 또는 4 이고, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황 원자에 인접한 탄소 원자 상의 R1 은 예외로 하고, 상기 R1 은 메틸이다 (즉, Y 는 -CH2CH2CH(CH3)- 또는 -CH2CH2CH2CH(CH3)- 임).
수용성 중합체성 시약은 나타낸 바와 같이, 다중작용성 구조를 가질 수 있다 :
POLY-[Y-S-W]x
[식 중 :
POLY 는 수용성 중합체이고 ;
x 는 2 내지 25 이고 ;
각각의 Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개, 바람직하게는 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 4 개 이상의 탄소 원자를 갖는 2 가 연결기이고 ;
각각의 S 는 인접한 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
각각의 S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
바람직하게는, 2 개 이상의 Y 기는 동일하고 ; 2 개 이상의 W 기도 또한 전형적으로 동일하다. 대안적으로, 특히 이작용성 시약 (x = 2) 에서, 2 개의 SW 는 상이할 수 있으며 ; 예를 들어 하나의 SW 는 티올 또는 보호된 티올인 반면, 나머지 다른 SW 는 티올-반응성 유도체이거나, 또는 하나의 SW 가 티올 또는 티올- 반응성 유도체인 반면, 나머지 다른 SW 는 보호된 티올이다.
상기 언급된 바와 같이, x 가 2 일 때, 중합체성 시약은 본원에 기술된 바와 같은 선형 또는 "포크" 형태를 가질 수 있다. 중합체성 시약은 또한 특히 x 가 3 이상일 때 본원에 기술된 바와 같은 "다중팔형" 형태를 가질 수 있다. 선택된 구현예에서, x 는 2 내지 8, 2 내지 6, 또는 2 내지 4 이고 ; 한 구현예에서, x 는 2 이다. 개시된 시약의 POLY 성분은 그 자체가 본원에 기술된 바와 같은 선형, 분지형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
상기와 같이, Y 의 골격은 바람직하게는, 각각의 Y 가 4 개 이상의 탄소 원자를 갖고 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 갖는 연결기이도록 포화되어 있다. Y, 및 POLY 의 추가의 바람직한 구현예는 일반적으로 단량체성 시약 POLY-Y-S-W 에 대해 상기에서 정의된 바와 같다.
상응하는 PEG-기재 다중작용성 중합체성 시약은 하기 구조를 갖는다 :
PEG-[Y-S-W]x
[식 중 :
PEG 는 폴리에틸렌 글리콜 중합체이고 ;
x 는 2 내지 25 이고 ;
각각의 Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개, 바람직하게는 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
각각의 S 는 인접 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
각각의 S-W 는 독립적으로 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
바람직하게는, 복합 Y 기는 동일하고 ; 복합 W 기 또한 전형적으로 동일하다. Y 의 골격은 바람직하게는, 각각의 Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 갖는 연결기이도록 포화되어 있다.
Y 및 PEG 의 추가의 바람직한 구현예는 일반적으로 PEG-[Y-S-W]x 에 대해 상기에서 정의된 바와 같다. 형태 W-S--Y-PEG-Y-S-W 의 실례의 이작용성 시약에서, 각각의 Y 는 -(CR1R2)n- 이고, 여기서 R1 및 R2 의 각각은 수소이고, n 은 4 이고, S-W 는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 이고, 각각의 PEG 는 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 이다. mPEG 의 분자량은 바람직하게는 5000 내지 30000 Da, 예를 들어, 약 2000 또는 약 3400 Da 의 범위이다. 추가의 실례의 시약에서, PEG 및 SW 는 유사하게 정의되고, n 은 3 또는 4 이고, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황 원자에 인접한 탄소 원자 상의 R1 은 예외로 하고, 상기 R1 은 메틸이다.
관련 측면에서, 본 발명은 하기 구조를 포함하는 중합체 컨쥬게이트를 제공한다 :
POLY-[Y-S-S-A]x
[식 중 :
POLY 는 수용성 중합체이고 ;
x 는 1 내지 25 이고 ;
Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개, 바람직하게는 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
S-S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 디술피드기이고 ;
A 는 약리학적으로 활성인 분자의 공유 연결 잔기 (본원에 정의됨) 임].
선택된 구현예에서, x 는 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4 이고 ; 추가의 구현예에서, x 는 1 또는 2 이거나, 또는 x 는 1 이다. x 가 2 일 때, 컨쥬게이트는 본원에 정의된 바와 같은 선형 또는 "포크" 형태를 가질 수 있다. 컨쥬게이트는 또한 특히 x 가 3 이상일 때, 본원에 정의된 바와 같은 "다중팔" 형태를 가질 수 있다. 컨쥬게이트의 POLY 성분은 그 자체가 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 선형, 분지형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
바람직하게는, 복합 Y 기는 동일하다. Y 의 탄화수소 골격은 바람직하게는 포화되어 있고, Y 는 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 를 갖는다. 더욱 바람직하게는, Y 는 C3-C8 알킬렌, C5-C8 시클로알킬렌, 아릴, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그 중 어느 하나는 하나 이상의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다. 한 구현예에서, Y 는 4 개 이상의 탄소 원자를 갖는다.
추가의 구현예에서, Y 는 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택됨) 을 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌이다. 더욱 바람직하게는, n 은 3 내지 8, 또는 3 내지 6 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다. 선택된 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소이다. 또다른 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 디술피드 연결에 인접한 탄소 상의 R1 은 예외로 하고, 상기 R1 은 메틸 또는 에틸과 같은 저급 알킬이다.
기타 구현예는 Y 가 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8 이고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기, 바람직하게는 시클로펜틸 또는 시클로헥실기와 같은 시클로알킬을 형성함) 인 것들을 포함한다.
수용성 중합체 POLY 의 분자량은 바람직하게는 500 이상, 또는 1000 이상이다. POLY 의 분자량은 전형적으로 200 초과 및 약 300 K 달톤 미만, 바람직하게는 약 200 K 달톤 미만, 및 더욱 바람직하게는 약 100 K 달톤 미만이다. 한 구현예에서, POLY 는 바람직하게는 분자량이 148 내지 약 200 내지 약 100,000 달톤인 폴리에틸렌 글리콜이고, 형태는 선형, 분지형, 포크형 및 다중팔형으로부터 선택된다. 선택된 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 200 내지 약 40,000 달톤이다. 대표적인 분자량은 예를 들어, 500, 1000, 2500, 3500, 5000, 7500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 및 40000 달톤이다.
그의 공액 형태로 있는 A 에 의해 나타내어진 수용성 중합체에 공액된 분자는 그의 비공액된 형태 내에서 반응성 티올기를 가지고, 바람직하게는 단백질, 펩티드, 및 소분자, 전형적으로 소 유기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
컨쥬게이트는 바람직하게는 그 자체가 수용성이다. 컨쥬게이트는 치료 용도를 위해, 수성 담체와 같은 적합한 약학적 부형제 내에서 또는 그것과 함께 제공될 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은, 약학적으로 허용가능한 담체 내에 있는 상기 기술된 바와 같은 컨쥬게이트를 개체에 투여함으로써, 개체에 반응성 티올기를 가진 약리학적으로 활성인 분자를 전달하는 방법을 제공한다. 컨쥬게이트는 전형적으로 본원에 기술된 수용성 중합체성 시약 중 어느 것과 분자를 공액시킴으로써 제조된다.
원래 소수성인 본 발명의 활성화된 중합체성 시약 내에 있는 탄화수소-계 분절(들) 인 Y 는 선행 기술분야의 시약과 비교해 상기 시약의 이량체화에 관한 경향을 감소시키기에 효과적이고, 여기서 티올은 예를 들어, 2-탄소 연결에 의해 중합체 분절 내의 (또는 연결 부분 내의) 헤테로원자에 연결된다. 황 원자에 인접한 탄소에서의 Y 의 분지화 (α-분지화) 는 추가로 이량체화를 감소시키기에 효과적이다. 탄화수소-계 분절 Y 는 또한 상기 시약을 사용하여 형성된 컨쥬게이트 내에서, 인접 이황화 결합의, 생체 내에서의 효소적 절단과 같은 절단을 감소시킨다.
본원에 개시된 시약은 추가로 "연결기없는" 시약임을 특징으로 하는데 ; 즉 수용성 중합체, 바람직하게는 PEG 는 탄화수소-계 스페이서기 Y 에 직접 연결된다. 활성 공액 작용기, 즉 티올 또는 보호된 티올, 및 중합체 사이의 아미드, 에스테르 또는 카르바메이트와 같은 헤테로원자-함유 연결기의 부재는 생성 컨쥬게이트의 분해에 대한 잠재력을 감소시킨다. 더욱이, 상기 시약 내에서의 아미드와 같은 상기 연결기의 존재는 해로운 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 잠재성은 현재의 "연결기없는" 시약을 사용하여 제거 또는 크게 감소된다.
본원의 실시예 2 에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 중합체성 티올 시약은 친수성 중합체 (PEG) 및 티올기 사이의 2-탄소 연결기만을 가진 상응하는 시약보다 합성 조건 하에서 더욱 안정하였다. 이러한 증가된 안정성은 또한 실시예 9 및 비교예 10 에서 나타나 있다. 본 발명의 중합체성 티올 시약의 공액 거동은 실시예 2 에서도 나타낸 바와 같이, 이량체화하지 않는 것으로 알려진 중합체성 시약 (말레이미드-말단 중합체) 에 대해 관찰된 거동과 유사하였다.
본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적, 그리고 특징은 본 발명의 후속하는 상세한 설명이 수반되는 도면과 함께 읽혀질 때, 더욱 전체적으로 명백해 질 것이다.
도 1 은 실시예 1 - 2 에서 기술된 바와 같은 mPEG5000-4C-OPSS 로서 나타낸 본 발명의 중합체성 시약과 감소된 BSA 사이의 공액 반응, 및 중합체성 시약 mPEG5000-말레이미드와 감소된 BSA 사이의 상응하는 공액 반응의 PAGE 분석을 보여준다 : 레인 1, 표준 ; 레인 2, 환원된 BSA ; 레인 3, mPEG-MAL 과의 공액 ; 레인 4, mPEG-4C-OPSS 와의 공액. 젤을 SimplyBlue Safe Stain 으로 염색한다.
도 2 는 PEG 의 검출을 위해, 바륨 요오드로 추가로 염색된 도 1 의 젤을 보여준다.
발명의 상세한 설명
정의
본원에서 사용된 하기 용어는 지시된 의미를 가진다. 명세서, 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "하나 (a)," "하나 (an)," "그 (the)" 는 내용상 달리 분명하게 지시되지 않는 한, 복수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "PEG" 또는 "폴리에틸렌 글리콜" 은 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥시드) 를 포함한다. 전형적으로, 본 발명에 사용되기 위한 PEG 는 2 가지 하기 구조 중 하나를 포함할 것이다 : -CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2- 또는 -0(CH2CH2O)m- (여기서, m 은 일반적으로 2 내지 약 6000, 더욱 전형적으로 4 또는 5 내지 약 2500 임). 더 넓은 의미에서, "PEG" 는 -CH2CH2O- 인 하위단위의 대부분, 즉 하위단위 중 50% 초과를 함유하는 중합체를 말할 수 있다. 바람직하게는, 단량체성 하위단위 중 75% 초과, 95% 초과, 또는 실질적으로 거의 모두가 -CH2CH2O- 이다. 전체 PEG 의 말단기 및 구조는 다양할 수 있다. PEG 의 한 말단은 일반적으로 1 - 20 개의 탄소로 이루어진 탄소-함유 기이고 바람직하게는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아르알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로, 및 전술한 것 중 임의의 치환 형태인 말단-캡핑기를 함유할 수 있다. 말단-캡핑기는 또한 실란일 수 있다. 말단-캡핑기는 전형적인 합성 반응 조건 하에서 화학적 변형을 쉽게 일으키지 않는 것이다. 메틸, 에틸 또는 벤질과 같은 알킬 (알콕시) 또는 아르알킬 (아르알콕시) 캡핑기가 가장 바람직하다.
말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 중합체가 인지질과 같은 말단-캡핑기를 가질 때, 독특한 특성 (유사하게 말단-캡핑된 중합체로 유기 구조를 형성하는 능력과 같은 특성) 이 중합체에 부여된다. 실례의 인지질은 제한 없이, 포스파티딜콜린이라고 하는 인지질 부류로부터 선택되는 것들을 포함한다. 특정 인지질에는 제한 없이, 디라우릴 포스파티딜콜린, 디올레일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 베헤노일 포스파티딜콜린, 아라키도일 포스파티딜콜린, 및 레시틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이 포함된다.
말단-캡핑기는 또한 유리하게는 검출가능한 표지를 포함할 수 있다. 그 러한 표지에는 제한 없이, 형광물질, 화학발광물질, 효소 표지화에 사용되는 부분, 측색 (예를 들어 염료), 금속 이온, 방사성 부분 등이 포함된다.
PEG 는 또한 바람직하게는 보호된 형태로 하기 기술된 바와 같은 작용기로 종결될 수 있다.
본 발명에 사용되는 특정 PEG 형태에는 다양한 분자량, 구조 또는 기하학형태 (예를 들어, 분지형, 선형, 포크형, 다중팔형) 를 가진 PEG 가 포함된다.
중합체의 기하학구조 또는 전체 구조에 관해서 "분지형" 은 2 개 이상의 중합체 "팔" 을 가진 중합체를 말한다. 분지형 중합체는 2 개의 중합체 팔, 3 개의 중합체 팔, 4 개의 중합체 팔, 6 개의 중합체 팔, 8 개의 중합체 팔 이상을 가질 수 있다. 고도의 분지형 중합체의 한 특별한 유형은 수지상 중합체 또는 수지상체로서, 본 발명의 목적을 위해서, 분지형 중합체의 것과 구별되는 구조를 가진 것으로 생각된다. "분지점" 은, 중합체가 선형 구조에서 하나 이상의 추가의 중합체 팔로 쪼개지거나 또는 분지되는, 하나 이상의 원자를 포함하는 분기점을 말한다.
"수지상체" 는 모든 결합이 중심 초점 또는 일정한 분지 패턴 및 반복 단위(각각이 분지점에 기여함) 를 가진 중심으로부터 방사상으로 나온 구형의, 크기가 단일분산된 중합체이다. 수지상체는 코어 캡슐화와 같은 특정 수지상 상태 특성을 나타내며, 이는 중합체의 다른 유형과는 다른 독특한 점을 만든다.
본 발명의 중합체의 내용에서 "수용성" 또는 "수용성 중합체 분절" 은 실온에서 물 중에서 용해되는 임의의 분절 또는 중합체이다. 전형적으로, 수용성 중합체 또는 분절은 여과 후에 동일한 용액에 의해 전달되는 빛 중 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상을 전달할 것이다. 따라서, 중량을 기준으로, 수용성 중합체 또는 그의 분절은 바람직하게는 물 중에서 약 35% 이상 (중량에 의해) 수용성, 더욱 바람직하게는 물 중에서 약 50% 이상 (중량에 의해) 수용성, 더욱 더 바람직하게는 물 중에서 약 70% 이상 (중량에 의해) 수용성, 및 더욱 더 바람직하게는 물 중에서 약 85% 이상 (중량에 의해) 수용성일 것이다. 그러나, 수용성 중합체 또는 분절이 물 중에서 약 995% (중량에 의해) 수용성, 또는 물 중에서 완전히 수용성인 것이 가장 바람직하다.
달리 명시되지 않는 한, 중합체의 "분자 질량" 또는 "분자량" 은 수평균 분자량을 말한다. 수평균 분자량 (Mn) 은 ∑NiMi/∑Ni (여기서, Ni 는 분자량 Mi 를 가진 중합체 분자의 수 (또는 이러한 분자의 몰 수) 임) 로서 정의된다. 중합체의 수평균 분자량은 삼투압 측정, 말단기 적정, 및 총괄성에 의해 결정될 수 있다. 중량 평균 분자량은 ∑NiMi 2/∑NiMi (여기서, Ni 는 또한 분자량 Mi 의 분자수임) 로서 정의된다. 중량 평균 분자량은 빛 산란, 소각 중성자 산란 (SANS), X-선 산란, 및 침강 속도에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 중합체, 또는 본 발명에 사용되는 중합체는 다분산성일 수 있는데, 즉 중합체의 수평균 분자량 및 중량 평균 분자량이 동일하지 않다. 그러나, 중량 평균 분자량 (Mw) 대 수평균 분자량 (Mn) 의 비율로 표현되는 다분산성 값 (Mw/Mn) 은 일반적으로 낮은데 ; 즉, 약 1.2 미만, 바람직하게는 약 1.15 미만, 더욱 바람직하게는 약 1.10 미만, 더욱 더 바람직하게는 약 1.05 미만, 더욱 더 가장 바람직하게는 약 1.03 미만, 및 가장 바람직하게는 약 1.025 미만이다.
용어 "반응성" 또는 "활성화된" 은 유기 합성의 통상적인 조건 하에서 쉽게 또는 실제 속도로 반응하는 작용기를 말한다. 이는, 반응하기 위해 강한 촉매 또는 비실용적인 반응 조건을 필요로 하거나 또는 반응하지 않는 기 (즉, "비반응성" 또는 "불활성" 기) 와는 대조적이다.
반응 혼합물 중의 분자 상에 존재하는 작용기에 관해 "쉽게 반응성이지 않은" 또는 "불활성" 은, 반응 혼합물 중에서 목적하는 반응을 생성하기에 효과적인 조건 하에 대부분 그대로인 채로 남아 있는 기를 말한다.
"보호기" 는 특정 반응 조건 하에서 분자에 있는 특정의 화학적으로 반응성인 작용기의 반응을 방지 또는 차단하는 부분이다. 상기 용어는 또한 보호된 형태의 작용기를 말할 수 있다. 보호기는 분자 내에서 추가의 반응성 또는 보호기의 존재 및 사용되는 반응 조건뿐만 아니라 보호되는 화학적으로 반응성인 기의 유형에 따라 다양할 것이다. 보호될 수 있는 작용기에는, 예를 들어, 카르복실산기, 아미노기, 히드록실기, 티올기, 카르보닐기 등이 포함된다. 대표적인 보호 형태의 상기 작용기에는, 카르복실산에 대해서는, 에스테르 (예컨대 p-메톡시벤질 에스테르), 아미드 및 히드라지드 ; 아미노기에 대해서는, 카르바메이트 (예컨대 tert-부톡시카르보닐 또는 플루오레닐메톡시카르보닐) 및 아미드 ; 히드록 실기에 대해서는, 에테르 및 에스테르 ; 티올기에 대해서는, 티오에테르 및 티오에스테르 ; 카르보닐기에 대해서는, 아세탈 및 케탈 등이 포함된다. 상기 보호기는 당업자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 [T.W. Greene and G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Wiley, New York, 1999], 및 거기에서 언급된 참조에서 기술되어 있다.
티올의 "티올-반응성 유도체" 는 바람직하게는 온화한 온도 및 중성 또는 생리학적 pH 조건 하에서 또다른 티올과 반응하여 이황화 결합을 형성할 수 있는 티올 유도체를 말한다. 바람직하게는, 상기 반응은 단지 안정한 부산물을 형성한다. 상기 유도체의 전형적인 예는 오르토-피리딜 디술피드 및 TNB-티올 유도체 (여기서, TNB 는 5-티오-2-니트로벤조산임) 이다. 예를 들어, [Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996, pp 150-152] 를 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작용기" 또는 그의 임의의 상동어는 그의 보호 또는 유도체화된 형태를 포함하는 것을 의미한다. 유사하게는, 상기 용어 "티올 시약" 또는 "중합체성 티올" 은 보호된 또는 유도체화된 티올 시약, 또는 중합체성의 보호된 또는 유도체화된 티올 (예컨대 중합체-OPSS) 을 포함한다.
"생리학적으로 절단가능한" 또는 "가수분해가능한" 또는 "분해가능한" 결합은 생리학적 조건 하에서 물과 반응하는 (즉, 가수분해되는) 상대적으로 약한 결합이다. 물 중에서 가수분해되는 결합의 경향은 2 개의 중심 원자를 연결하는 일반적인 유형의 결합뿐만 아니라, 상기 중심 원자에 결합된 치환체에 따라 다를 것이다. 적절한 가수분해적으로 불안정한 또는 약한 연결에는, 카르복실레이트 에스테르, 포스페이트 에스테르, 무수물, 아세탈, 케탈, 아실옥시알킬 에테르, 이민, 오르토에스테르, 펩티드 및 올리고뉴클레오티드, 티오에스테르, 티올에스테르, 및 카르보네이트가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. "효소적으로 분해가능한 연결" 은 하나 이상의 효소에 의한 분해가 되기 쉬운 연결을 의미한다.
"실질적으로" 또는 "원래" 는 일부 주어진 양 중 95%, 99% 이상처럼, 거의 전체 또는 완전히 모두를 의미한다.
"알킬" 은 길이가 전형적으로 약 1 내지 20 개 원자의 범위인 탄화수소쇄를 말한다. 상기 탄화수소쇄는 바람직하게는 그러나 반드시는 아니고, 포화일 수 있고, 분지형 또는, 바람직하게는, 선형 (비분지형) 일 수 있다. 실례의알킬기에는 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 2-메틸부틸, 2-메틸프로필 (이소부틸), 3-메틸펜틸 등이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "알킬" 은 3 개 이상의 탄소원자가 참조된 시클로알킬을 포함한다. "알킬렌" 은 2 가 알킬기, 예를 들어 -(CH2)x- 를 말한다.
"저급 알킬" 은 메틸, 에틸, n-부틸, 이소프로필, 및 t-부틸로서 예시되는 바와 같이, 1 내지 6 개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 말한다.
"시클로알킬" 은 가교, 융합, 또는 스피로 환형 화합물을 포함하여, 바람직하게는 3 내지 약 12 개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 3 내지 약 8 개의 탄소 원자로 이루어진 포화 또는 불포화 환형 탄화수소쇄를 말한다. "시클로알킬렌" 은 2 가 시클로알킬기를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, "알케닐" 은 에테닐, n-프로페닐, 이소프로페닐, n-부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 테트라데세닐 등과 같이, 2 내지 15 개의 탄소 원자를 갖고 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 말한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알키닐" 은 에티닐, n-프로피닐, 이소펜티닐, n-부티닐, 옥티닐, 데시닐 등과 같이, 2 내지 15 개의 원자를 갖고 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 분지형 또는 비분지형 탄화수소기를 말한다.
"알콕시" 는 -OR 기 (여기서, R 은 알킬 또는 치환 알킬, 바람직하게는 C1-C20 알킬 (예를 들어, 메톡시, 에톡시, 프로필옥시 등), 더욱 바람직하게는 저급 알킬 (즉, C1-C6 또는 C1-C4) 을 말함) 을 말한다.
"아릴" 은 단일 고리를 가지거나 (예를 들어, 페닐) 또는 2 개의 축합 또는 융합 고리를 가진 (예를 들어, 나프틸) 치환 또는 비치환 1 가 방향족 라디칼을 말한다. 복합 아릴 고리는 또한 비융합 (예를 들어, 비페닐) 될 수 있다. 상기 용어는 푸릴, 피롤, 피리딜 및 인돌과 같이, 고리 내에서 하나 이상의 질소, 산소, 또는 황 원자를 갖는 방향족 고리기인 헤테로아릴기를 포함한다.
"아르알킬" 은 알킬, 바람직하게는 저급 (C1-C4, 더욱 바람직하게는 C1-C2) 알킬, 추가로 아릴기로 치환되는 치환체를 말하고 ; 예로는 벤질 및 페네틸이 있다. "아르알콕시" 는 형태 -OR (여기서, R 은 아르알킬임) 의 기를 말하고 ; 하나의 예로는 벤질옥시가 있다.
"헤테로사이클" 은 고리 원자가 탄소, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되는 고리, 바람직하게는 5- 내지 7-원 고리를 말한다. 바람직하게는, 상기 고리 원자는 3 내지 6 개의 탄소 원자를 포함한다. 방향족 헤테로사이클 (헤테로아릴) 의 예는 상기에 주어져 있으며 ; 비-방향족 헤테로사이클에는, 예를 들어 피롤리딘, 피페리딘, 피페라진 및 모르폴린이 포함된다.
"치환" 기 또는 부분은 수소 원자가 비-수소 원자 또는 기로 대체된 것, 바람직하게는 비-방해 치환체인 것이다.
"비-방해 치환체" 는 분자 내에 존재할 때, 전형적으로 분자 내에 함유된 다른 작용기와 비-반응성인 기이다.
이러한 것에는, 저급 알킬, 알케닐, 또는 알키닐 ; 저급 알콕시 ; C3-C6 시클로알킬 ; 할로, 예를 들어, 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도 ; 시아노 ; 옥소 (케토) ; 니트로 ; 및 페닐이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
"잔기" 는 하나 이상의 분자와의 반응 후에 남아 있는 분자의 부분을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 중합체 컨쥬게이트 내의 생물학적으로 활성인 분자 잔기는 전형적으로 생물학적으로 활성인 분자 상의 반응성 기와 중합체 시약 상의 반응성 기와의 반응으로부터 생성되는 공유 결합을 제외하고, 생물학적으로 활성인 분자의 부분에 상응한다.
용어 "컨쥬게이트" 는 분자, 예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자의, 반응 성 중합체 분자, 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) 에의 공유 결합의 결과로서 형성되는 본체를 말한다.
본원에 사용될 때, 각각의 용어 "약물," "생물학적으로 활성인 분자," "생물학적으로 활성인 부분," "생물학적 활성제", "약리학적 활성제", 및 "약리학적으로 활성인 분자" 는 생물학적 개체의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 줄 수 있는 임의의 성분을 의미하고, 여기서 상기 개체는 바이러스, 박테리아, 균류, 식물, 동물, 및 인간으로부터 선택될 수 있다. 특히, 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적으로 활성인 분자는 인간 또는 기타 동물에서의 질환의 진단, 치료적 경감, 치료 또는 예방을 위하거나, 또는 그렇지 않다면 인간 또는 동물의 물리적 또는 정신적 안녕을 증진시키기 위한 임의의 성분을 포함한다. 생물학적으로 활성인 분자의 예에는, 펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 세포, 바이러스, 리포좀, 미립자, 및 미셀이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류에는 항생제, 진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항분노제, 호르몬, 성장인자, 스테로이드제 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 식품, 식품 보조제, 영양물, 영양제, 약물, 백신, 항체, 비타민, 및 기타 유익한 제제가 포함된다.
"약학적으로 허용가능한 부형제" 또는 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 본 발명의 조성물 내에 포함될 수 있고, 환자에게 유의한 반대의 독성학적 효과를 야기하지 않는 부형제를 말한다.
"약리학적 유효량," "생리학적 유효량," 및 "치료적 유효량" 은 혈류 또는 표적 조직 내에서 목적하는 수준의 활성제 및/또는 컨쥬게이트를 제공하는데 필요한, 약학적 제제에 존재하는 중합체-활성제 컨쥬게이트의 양을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 정확한 양은 수많은 요소, 예를 들어 특정 활성제, 약학적 제제의 성분 및 물리적 특성, 원하는 환자수, 환자 고려 등에 따라 다를 것이고, 본원에서 제공된 정보 및 참조 문헌에서 이용가능한 정보를 바탕으로 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
용어 "환자" 는 생물학적 활성제 또는 그의 컨쥬게이트의 투여에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 상태로부터 고통받거나 또는 그러한 상태에 놓이기 쉬운 살아있는 개체를 말하고, 인간 및 동물 둘 다를 포함한다.
중합체성 티올 시약
본 발명의 수용성, 중합체성 시약은 하기 구조를 포함한다 :
POLY-[Y-S-W]x
[식 중 :
POLY 는 수용성 중합체이고 ;
x 는 1 또는 25 이고 ;
Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원 자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 4 개 이상의 탄소 원자를 포함하는 2 가 연결기이고 ;
S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
S-W 는 티올 (즉, W 는 H 임), 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
한 구현예에서, S-W 는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 와 같은 티올-반응성 유도체이다. 보호된 티올은, 예를 들어 S-벤질 또는 S-트리틸 에테르와 같은 티오에테르, 및 티오에스테르를 포함한다.
황 원자 S 는 언급된 바와 같이, 아릴 고리 또는 이중 결합보다는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소 원자에 결합된다. 한 구현예에서, 황 원자가 결합하는 탄소 원자는 저급 알킬 치환체, 메틸 또는 에틸 (α-분지) 을 가진다.
스페이서기 Y 의 "골격" 은 더욱 특히 POLY 및 S 를 연결하는 가장 짧은 인접 탄소쇄로서 정의된다. 한 구현예에서, Y 의 골격은 포화된다. 예를 들어, Y 는 형태 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8, 바람직하게는 3 내지 6 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 의 것일 수 있다. Y 가 시클로알 킬기를 함유할 때, 그것은 바람직하게는 5- 또는 6-원 시클로알킬이다.
선택된 구현예에서, Y 는 C3-C8 알킬렌, C3-C8 알킬렌과 C5-C8 시클로알킬렌 또는 아릴과의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 그 중 임의는 하나 이상의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, C3-C6 시클로알킬, 할로, 시아노, 저급 알콕시, 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 플루오로 및 클로로부터 선택되는 많아야 1 또는 2 개의 비-방해 치환체가 포함된다. 한 구현예에서, 헤테로원자-함유 치환체는 존재하지 않는데 ; 즉 Y 는 탄소 및 수소로 이루어진다.
Y 의 골격이 불포화될 때, 그것은 바람직하게는 단일불포화되는데, 즉, 단일 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합을 가진다. 바람직하게는, 골격 및 치환체를 포함하는 스페이서기 Y 가 단일불포화, 또는 더욱 바람직하게는, 완전 포화된다. 이러한 구현예에서, Y 는 완전 포화 탄화수소일 수 있다.
또다른 구현예에서, 골격 및 치환체를 포함하는 스페이서기 Y 는 포화 및 방향족 부분, 바람직하게는 포화 및 방향족 탄화수소 부분으로 이루어진다.
중합체성 시약에서, Y 가 -(CR1R2)n- 일 때, 중합체 분절 POLY 의 분자량은 바람직하게는 500 Da 이상이고, R1 및 R2 의 각각이 수소일 때, -(CR1R2)- 의 n 번 반복에 대해, 특히 POLY 가 선형 PEG 이고 상기 화학식에서 x = 1 일 때이다. POLY 는 더욱이 500 Da 초과, 750 Da 초과, 또는 1000 Da 초과의 분자량을 갖는다. 약 300,000 Da 이하, 더욱 전형적으로 약 100,000 Da 이하의 다양한 더 큰 분자량 범위가 상기 기술된 바와 같이 사용될 수 있다.
x 가 2 일 때, 시약은 하기에서 추가로 기술되는 바와 같은 이작용성 중합체성 시약이고, 본원에서 기술된 바와 같은 선형 또는 "포크형" 형태를 가질 수 있다. 중합체성 시약은 또한 특히 x 가 3 이상일 때, 본원에서 기술된 바와 같은 "다중팔형" 형태를 가질 수 있다. 선택된 구현예에서, x 는 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4 이고 ; 추가의 구현예에서, x 는 1 또는 2, 또는 x 는 1 이다. 개시된 시약의 POLY 성분은 그 자체가 본원에서 추가로 기술되는 바와 같은 선형, 분지형, 다중팔, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태를 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, 수용성 중합체 분절은 폴리에틸렌 글리콜이고, 시약은 하기 화학식을 가진다 :
PEG-[Y-S-W]x
[식 중 :
PEG 는 폴리(에틸렌 글리콜) 이고 ;
Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
x 는 1 내지 25 이고 ;
S-W 는 티올 (즉 W 는 H 임), 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
본 발명자들은, 수용성 중합체 분절 및 티올기 사이의 소수성 스페이서기를 포함함으로써, 상기 분자가 이량체화되어 디술피드를 형성하는 경향이 감소됨을 발견하였다. 따라서, 수율은 하기에 기술되는 바와 같이, 상기 시약의 제제 내에서 그리고 그것의 다른 분자와의 공액에서 증가된다.
본원에서 기술된 스페이서기는 길이 면에서 탄소가 3 개 이상인 탄화수소-계 기이고, 바람직하게는 4 개 이상의 탄소 원자를 함유하고, 분지 탄소 (예를 들어, 이소부틸렌, 또는 1-메틸프로필렌, 연결) 를 포함할 수 있다. "탄화수소계" 로서 기술되더라도, 스페이서기는 본원에 정의된 바와 같이 제한된 수의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 스페이서기는 탄소 및 수소로 이루어진다.
중합체성 시약의 바람직한 구현예에서, Y 는 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택됨) 을 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌이다. 바람직하게는 0 또는 2 개, 더욱 바람직하게는 0 또는 1 개의 상기 비-방해 치환체가 포함된다.
바람직하게는, n 은 4 내지 8, 더욱 바람직하게는 4 내지 6 이다. 한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 -(CR1R2)- 의 n 반복에 대해 수소이고 ; 또다른 바람직한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황 원자에 인접하는 탄소 (α-탄소) 상의 R1 은 예외로 하고, 상기 R1 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸 또는 에틸 (α-분지) 이다. 한 구현예에서, α-분지기는 메틸이다.
Y 가 화학식 -(CR1R2)n- 이고, n 이 4 내지 8 이고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 이 연결되어 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성하는 Y 의 구현예에서, 시클로알킬기는 바람직하게는 시클로펜틸 또는 시클로헥실기이다. 상기 구현예에서, 황 원자는 바람직하게는 Y 의 비-환식 탄소에 결합되어 있다.
포화 골격을 갖는 실례의 스페이서기 Y 에는 하기가 포함된다 (여기서, 커브선은 POLY 또는 S 에의 결합을 나타내고, 첫번째 구조에서 예를 들어 n-부틸렌을 나타냄) :
Figure 112007045123905-PCT00001
.
상기 언급된 바와 같이, 스페이서기의 "골격" 은 POLY 를 황 원자에 연결하는 가장 짧은 인접 탄소쇄이다. 따라서, 상기 2 번째 줄의 구조의 각각은 5-탄소 골격을 가진다. 더욱이, 상기 정의에 의해, 보여진 마지막 구조는 포화 골격을 가지고, 그렇더라도 스페이서기는 전체적으로 불포화되어 있다.
하기 나타낸 한 실례의 중합체성 시약에서, POLY 는 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 이고, Y 는 -(CH2)4- 이고, -S-W 는 하기 나타낸 바와 같이 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 또는 SH 이다. mPEG 의 분자량은 바람직하게는 5000 내지 30000 Da 의 범위 ; 예를 들어 약 5000, 약 10000, 약 20000, 또는 약 30000 Da 이다.
Figure 112007045123905-PCT00002
추가의 구현예에서, 중합체성 시약은 W-S-Y-POLY-Y-S-W (여기서, POLY, Y 및 S-W 는 상기 정의된 바임) 로서 나타낸 이작용성 구조이다. 전형적으로, 반드시는 아니라도, 중합체성 시약은 대칭적이다. 하기 나타낸, 상기 구조의 실례의 중합체성 시약은 POLY 가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이고, 각각의 Y 가 -(CH2)4- 이고, 각각의 -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 또는 SH 인 것이다. PEG 의 분자량은 바람직하게는 약 1000 내지 5000 Da 의 범위, 예를 들어, 2000 또는 3400 Da 이다.
Figure 112007045123905-PCT00003
추가의 실례의 중합체성 시약은 화학식 PEG-[Y-S-W]x (여기서, x 는 1 또는 2 이고, Y 는 -(CH2CH2CH2CH(CH3))- 이고, S-W 는 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 임) 의 시약을 포함한다. x 가 1 일 때, PEG 는 바람직하게는 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 이다. 상기 시약은 하기에 나타나 있다 ("Me" 는 여기 및 다른 곳에서도 메틸을 나타냄) :
Figure 112007045123905-PCT00004
.
추가의 실례의 중합체성 시약은 화학식 PEG-[Y-S-W]x (여기서, x 는 1 또는 2 이고, Y 는 -(CH2CH2CH(CH3))- 이고, S-W 는 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 임) 의 것을 포함한다. x 가 1 일 때, PEG 는 바람직하게는 mPEG 이다. 상기 시약은 하기에 나타나 있다 :
Figure 112007045123905-PCT00005
.
또다른 실례의 부류의 중합체성 시약은 화학식 PEG-[Y-S-W]x (여기서, x 는 1 이고, Y 는 -(CH2)4- 이고, -S-W 는 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 임) 의 것이고, PEG 는 하기 구조로 종결된다 :
Figure 112007045123905-PCT00006
.
상기 시약은 일반적으로 하기로 나타내어진다 :
Figure 112007045123905-PCT00007
.
바람직하게는, Y-SW 에 결합된 PEG 의 분자량은 약 500 Da 이하, 또는 약 200 Da 이하이고, 예를 들어 m = 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 4 이다. 한 구현예에서, m = 4 이다. 나타내어진 말단 분지형 구조에서 각각의 mPEG 의 분자량은 바람직하게는 약 5 KDa 내지 약 20 KDa 이고 ; 예를 들어 n = 약 110 내지 약 450 이다. 각각의 mPEG 의 분자량은 예를 들어, 5, 10, 15 또는 20 KDa 이다.
본원에 기술된 시약은 "연결기가 없는" 티올임을 특징으로 하는데 ; 즉, 수용성 중합체는 탄화수소-계 스페이서기 Y 에 직접 연결된다. 예를 들어, PEG 내 -CH2CH2O- 와 같은, 폴리(알킬렌)글리콜의 반복되는 알킬렌 글리콜 단위의 산소 원자는 Y 에 직접 연결된다. 활성 공액 작용기, 즉 티올 또는 보호된 티올 및 중합체 사이의, 특히 에스테르, 카르바메이트, 또는 아미드와 같은 연결기 내에서의 추가의 헤테로원자의 부재는 공액 중합체의 분해에 대한 잠재성을 감소시킨다. 더욱이, 상기 시약 내에서의 아미드와 같은 상기 헤테로원자-함유 연결기의 존재는 해로운 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기 잠재성은 현재의 "연결기 없는" 시약에 의해 제거 또는 크게 감소된다.
중합체성 시약에서, 중합체 분절 POLY 의 분자량은 바람직하게는 특히 POLY 가 PEG 인 구현예에서 500 Da 이상이다. 중합체 분절 POLY 의 다양한 바람직한 구현예는 하기에 상세히 기술된다. 바람직하게는, 중합체 분절 "POLY" 는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 과 같은 폴리알킬렌 글리콜이다. 폴리에틸렌 글리콜은 상기 조건 내에서, 약 88 내지 약 100,000 달톤의 다양한 분자량을 가질 수 있다. 선택된 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜의 중량 평균 분자 질량은 148 (예를 들어 삼량체 + 연결 산소 원자) 내지 약 200 내지 약 40,000 달톤이다. 대표적인 분자량에는 예를 들어, 500, 1000, 2000, 3000, 3500, 5000, 7500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 및 40000 달톤이 포함된다. 일반적으로, 이작용성 또는 다작용성 시약은 단일작용성 시약보다 더 낮은 분자량의 POLY 또는 PEG 분절을 사용할 것이다.
중합체는 본원에서 추가로 기술되는 선형, 분지형, 포크형, 다중팔형, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 가질 수 있다.
중합체 분절, POLY
본 발명의 중합체성 시약의 제조에 사용되는 대표적인 수용성 중합체에는 폴리(알킬렌 글리콜) 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG"), 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(올레핀계 알콜), 폴리(비닐피 롤리돈), 폴리(히드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(히드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-히드록실산), 폴리(비닐 알콜), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸리딘, 및 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 이 포함된다. POLY 는 상기 중 임의의 단독중합체, 대체의 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 대체의 삼중합체, 랜덤 삼중합체, 또는 블록 삼중합체일 수 있다. 수용성 중합체 분절은 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) ("PEG") 또는 그의 유도체이다.
바람직하게는, 중합체는 친수성 중합체 ; 즉, 프로필렌 옥시드 또는 기타 유사한 친수성 중합체 분절 중 약 25 개 미만의 하위단위를 함유하는 중합체이다. 중합체는 대체의 구현예에서 프로필렌 옥시드 또는 유사 친수성 하위단위가 없다. 한 경우에서, 중합체는 바람직하게는 풀로닌 (pluronic)-유형 중합체가 아니다. 더욱 또다른 특별한 구현예에서, 중합체는 바람직하게는 고체상 지지체에 결합되지 않는다.
중합체 분절은 수많은 상이한 기하구조 중 임의를 가질 수 있고, 예를 들어 POLY 는 선형, 분지형, 또는 다중팔형일 수 있다. 가장 전형적으로, POLY 는 예를 들어 2 개의 중합체 팔을 가진 선형 또는 분지형이다. 본원의 토의 중 많은 부분이 예시의 POLY 로서 PEG 에 집중되어 있더라도, 본원에 있는 논의 및 구조는 쉽게 확장되어, 상기 기술된 수용성 중합체 분절 중 임의를 포함할 수 있다.
단지 1 또는 2 개의 티올 작용기를 갖는 수용성 중합체가 전형적으로 본원에서 사용 및 예시되더라고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 상기 작용기를 갖는 중합체가 사용될 수 있다. 수용성 중합체 분절과 연관된 티 올 부분의 수의 상한의 비-제한적 예에는 약 1 내지 약 500, 1 내지 약 100, 약 1 내지 약 80, 약 1 내지 약 40, 약 1 내지 약 20, 및 약 1 내지 약 10 이 포함된다.
수용성 중합체, PEG 의 바람직한 유형은 하기에서 더욱 완전히 기술되는, 단량체 하위단위를 분리하는 하나 이상의 분리가능한 연결기를 함유하는 PEG, 말단-캡핑형 PEG, 포크형 PEG, 분지형 PEG 및 펜던트 PEG를 포함하여, 그의 선형, 분지형 또는 다중팔형 형태 중 어느 하나에서 폴리(에틸렌 글리콜) 을 포함한다. PEG 중합체 분절 내의 반복 에틸렌 글리콜의 수는 전형적으로 약 3 내지 약 4,000, 또는 약 12 내지 약 3,000, 또는 더욱 바람직하게는 약 20 내지 약 1,000 의 범위이다.
바람직한 말단-캡핑형 PEG 는 알콕시, 치환 알콕시, 알케닐옥시, 치환 알케닐옥시, 알키닐옥시, 치환 알키닐옥시, 아릴옥시, 치환 아릴옥시와 같은 말단-캡핑 부분으로서 갖는 것들이다. 바람직한 말단-캡핑기는 메톡시, 에톡시, 및 벤질옥시와 같은 C1-C20 알콕시이다. 말단-캡핑기는 또한 유리하게는 인지질을 포함할 수 있다. 실례의 인지질에는 포스파티딜콜린, 예컨대 디라우로일포스파티딜콜린, 디올레일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 베헤노일 포스파티딜콜린, 아라키도일 포스파티딜콜린, 및 레시틴이 포함된다.
티올화되지 않는 중합체의 말단은 대체로서 바람직하게는 보호된 형태 내에서 캡핑기, 반응성 부분을 포함할 수 있다. 상기 반응성 부분의 예에는, 히드 록시, 아미노, 에스테르, 카르보네이트, 알데하이드, 아세탈, 알데하이드 하이드레이트, 케톤, 케탈, 케톤 하이드레이트, 알케닐, 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 아크릴아미드, 술폰, 카르복실산, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 하이드라지드, 우레아, 말레이미드, 비닐술폰, 디티오피리딘, 비닐피리딘, 요오도아세트아미드, 알콕시, 벤질옥시, 실란, 지질, 인지질, 비오틴, 및 형광물질이 포함되며, 이용가능한 그의 활성화 및 보호 형태가 포함된다. N-히드록시숙신이미딜 에스테르, 1-히드록시벤조트리아졸릴 카르보네이트, 아민, 비닐술폰, 말레이미드, N-숙신이미딜 카르보네이트, 하이드라지드, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 부타노에이트, 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 에스테르, 글리시딜 에테르, 옥시카르보닐이미다졸, p-니트로페닐 카르보네이트, 알데하이드, 오르토피리딜-디술피드, 및 아크릴로일과 같은 작용기가 바람직하다.
이러한 작용기 및 기타 작용기는 예를 들어, 전체가 참조로써 본원에 삽입된 하기 참조에 기술되어 있다 : N-숙신이미딜 카르보네이트 (미국 특허 제 5,281,698 호 및 제 5,468,478 호), 아민 (Buckmann 등, Makromol. Chem. 182:1379 (1981); Zalipsky 등, Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), 하이드라지드 (Andresz 등, Makromol. Chem. 179:301 (1978)), 숙신이미딜 프로피오네이트 및 숙신이미딜 부타노에이트 (Olson 등, in Poly(ethylene glycol): Chemistry & Biological Applications, pp. 170-181, Harris & Zalipsky, Eds., ACS, Washington, DC (1997); 미국 특허 제 5,672,662 호), 숙신이미딜 숙시네이트 (Abuchowski 등, Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) 및 Joppich 등, Makromol. Chem. 180:1381 (1979)), 숙신이미딜 에스테르 (미국 특허 제 4,670,417 호), 벤조트리아졸 카르보네이트 (미국 특허 제 5,650,234 호), 글리시딜 에테르 (Pitha 등, Eur. J. Biochem. 94:11 (1979); Elling 등, Biotech. Appl Biochem. 13:354 (1991)), 옥시카르보닐이미다졸 (Beauchamp 등, Anal. Biochem. 131:25 (1983); Tondelli 등, J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-니트로페닐 카르보네이트 (Veronese 등, Appl Biochem. Biotech. 11:141 (1985); Sartore 등, Appl. Biochem. Biotech. 27:45 (1991)), 알데하이드 (Harris 등, J. Polym. Sci. Chem. Ed. 22:341 (1984); U.S. Patent No. 5,824,784; U.S. Patent 5,252,714), 말레이미드 (Goodson 등, Bio/Technology 8:343 (1990); Romani 등, in Chemistry of Peptides and Proteins 2:29 (1984); Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), 오르토피리딜-디술피드 (Woghiren 등, Bioconj. Chem. 4:314 (1993)), 아크릴로일 (Sawhney 등, Macromolecules 26:581 (1993)), 및 비닐술폰 (U.S. Patent No. 5,900,461).
기술된 POLY 유형은 분지형 또는 다중팔형 중합체 분절뿐만 아니라 선형 중합체 분절을 포함한다. 예에는 2 개의 팔, 3 개의 팔, 4 개의 팔, 5 개의 팔, 6 개의 팔, 7 개의 팔, 8 개의 팔 이상을 가진 PEG 분자가 포함된다. 본 발명의 티올 중합체를 제조하는데 사용되는 분지형 중합체는 2 또는 300 개 등의 반응성 말단을 어디서나 가질 수 있다. 2 - 8 개의 중합체 팔을 가진 분지형 또는 다중팔형 PEG 가 바람직하다. 본 발명의 중합체성 티올을 제조하는데 사용되는 분지형 또는 다중팔형 중합체는 더욱 일반적으로 화학식 R(POLY)n (여기서, R 은 PEG 와 같은 2 개 이상의 POLY 팔을 확장시키는 중심 또는 코어 분자임) 으로 나타낸 것들을 포함한다. 다양한 n 은 POLY 팔의 수를 나타내고, 여기서 중합체 팔의 각각은 독립적으로 말단-캡핑될 수 있거나 또는 그의 말단에서 히드록실 또는 기타 반응성기를 가질 수 있으며, 여기서 하나 이상의 중합체 팔은 상기 반응성 기를 가진다. 일반적으로 상기 화학식 R(PEG)n 으로 나타낸 것과 같은 분지형 PEG 는 2 개 이상의 중합체 팔, 약 300 개 이하의 중합체 팔 (즉, n 은 2 내지 약 300 의 범위임) 을 가진다. 바람직하게는, 상기 분지형 PEG 는 2 내지 약 25 개의 중합체 팔, 더욱 바람직하게는 2 내지 약 20 개의 중합체 팔, 및 더욱 더 바람직하게는 2 내지 약 15 개의 중합체 팔 또는 그 이하를 가질 수 있다. 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 개의 팔을 가진 다중팔형 중합체가 가장 바람직하다.
상기 기술된 바와 같은 분지형 PEG 내의 바람직한 코어 분자는 폴리올이다. 상기 폴리올은 에틸렌 글리콜, 알칸 디올, 알킬 글리콜, 알킬렌 알킬 디올, 알킬 시클로알칸 디올, 1,5-데칼린디올, 4,8-비스(히드록시메틸)트리시클로데칸, 시클로알킬렌 디올, 디히드록시알칸, 트리히드록시알칸, 테트라히드록시알칸 등을 포함하여, 1 내지 10 개의 탄소 원자 및 1 내지 10 개의 히드록실기를 갖는 지방족 폴리올을 포함한다. 또한, 전자의 부류 중 일부 또는 모두의 에테르는 디펜타에리트리톨, 트리펜타에리트리톨, 헥사글리세롤 등을 포함하여, 코어 분자로서 작용할 수 있다. 직쇄 또는 밀폐형-고리 당 및 당 알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 자일리톨, 퀘브라치톨, 트레이톨, 아라비톨, 에리트리톨, 아도니톨, 두시톨, 파코오스, 리보오스, 아라비노스, 자일로스, 라익소스, 람노스, 갈락토스, 글루코스, 프룩토스, 소르보스, 만노스, 피라노스, 알도스, 탈로스, 타기토스, 피라노시드, 수크로스, 락토오스, 말토오스 등을 포함하여, 시클로지방족 폴리올이 또한 사용될 수 있다. 추가의 지방족 폴리올은 글리세르알데하이드, 글루코스, 리보오스, 만노스, 갈락토스의 유도체, 및 관련 입체이성질체를 포함한다. 사용될 수 있는 기타 코어 폴리올은 크라운 에테르, 시클로덱스트린, 덱스트린 및 기타 탄수화물 예컨대 전분 및 아밀로스가 포함된다. 바람직한 폴리올에는 글리세롤, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 및 트리메틸올프로판이 포함된다.
본 발명의 중합체성 티올에 상응하는 다중팔형 구조는 R-(POLY-Y-S-W)x, (여기서, POLY, Y, 및 S-W 는 상기 정의된 바와 같고, R 은 다중팔형 구조의 코어 분자를 나타내고, x 는 바람직하게는 3 내지 8 임) 에 의해 제조될 수 있다. 중합체 팔의 각각은 독립적으로 말단-캡핑될 수 있거나 또는 그의 말단에서 티올기를 가질 수 있고, 여기서 하나 이상의 중합체 팔은 티올 (또는 보호된 티올) 기를 가진다. 상기 구조를 제조하는데 적합한 다중팔형 PEG 는 Nektar Therapeutics (Huntsville, Alabama) 에서 구입가능하다.
대안적으로, 중합체 분절은 예를 들어, 유형 PEG-(Y-S-W)2 의 전체적인 포크형 구조를 가질 수 있다. 이러한 유형의 중합체 분절은 Y 의 선택에 따라, 2 가지 활성제와의 반응에 유용하고, 여기서 2 가지 활성제는 정확하거나 또는 예정된 거리만큼 떨어진 곳에 위치한다.
본 발명의 컨쥬게이트의 제조에 사용되는 선형 또는 분지형 구조를 갖는 대표적인 PEG 는 Nektar Therapeutics (Huntsville, Alabama) 에서 구입될 수 있다. 실례의 구조는 참조로써 본원에 표현적으로 삽입된 내용인 "진보된 PEG화용 폴리에틸렌 글리콜 및 유도체" 라는 제목의 Nektar 의 2004 카탈로그에 기재되어 있다.
본원에 제공된 대표적인 구조 중 하나에서, 하나 이상의 분해가능한 연결기는 POLY 분절에 함유되어, 처음에 투여되는 컨쥬게이트에서보다 더 작은 POLY 사슬을 가진 컨쥬게이트의 생체 내에서의 발생을 가능하게 할 수 있다. 적절한 생리학적으로 절단가능한 연결에는, 에스테르, 카르보네이트 에스테르, 카르바메이트, 술페이트, 포스페이트, 아실옥시알킬 에테르, 아세탈, 및 케탈이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 상기 연결은 바람직하게는 저장 및 처음의 투여 시 안정할 것이다.
POLY 의 분자량은 전형적으로 하나 이상의 하기 범위에 속한다 : 약 100 내지 약 100,000 달톤 ; 약 500 내지 약 80,000 달톤 ; 약 1,000 내지 약 50,000 달톤 ; 약 2,000 내지 약 25,000 달톤 ; 및 약 5,000 내지 약 20,000 달톤. 실례의 분자량에는 약 1,000, 약 5,000, 약 10,000, 약 15,000, 약 20,000, 약 25,000, 약 30,000, 및 약 40,000 달톤이 포함된다. 저분자량 POLY 는 약 250, 500, 750, 1000, 2000, 또는 5000 달톤의 분자량을 가진다. 실례의 티올화 중합체는5,000, 20,000, 및 40,000 달톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 가진 PEG 를 포함한다.
본 발명의 특별한 구현예에서, 본원에 제공된 바와 같은 중합체성 티올 시약은 하기 분자량 중 하나를 가진 PEG 분절을 가진다 : 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 10,000, 15,000, 20,000, 30,000 및 40,000 달톤.
하위단위의 수에 관해서, 본 발명에 사용되는 PEG 는 전형적으로 하기 범위 중 하나 이상에 속하는 많은 수의 (-OCH2CH2-) 하위단위를 포함할 것이다 : 12 내지 약 4000 개의 하위단위, 약 15 내지 약 2000 개의 하위단위, 약 20 내지 약 1000 개의 하위단위, 약 25 내지 약 750 개의 하위단위, 및 약 30 내지 약 500 개의 하위단위.
시약의 제조
"연결기 없는" 폴리알킬렌옥시-티올 시약의 한 제조 방법은 도식 1 에 나타나 있다. 나타낸 반응에서, 하나의 말단에서 캡핑기를 가진 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 모노메톡시 PEG 는 NaH 와 같은 강염기로 알콕시화되고, 이러한 시약은 디(할로알킬술피드) 와 조합되어, 중합체성 디에테르 디술피드를 형성한다. 다음, 상기 중간체는 디티오트레이톨 (DTT) 과 같은 환원제로 절단되어, 폴리알킬렌옥시-티올 시약을 형성할 수 있다.
도식 1
Figure 112007045123905-PCT00008
도식 2 에 나타낸 또다른 합성 경로에서, 디(히드록시알킬술피드) 는 에틸렌 옥시드의 중합을 위한 코어 물질로서 사용되고, PEG 디에테르 디술피드를 형성한다. 말단은 예를 들어 메틸기로 캡핑된다. 다음, 디술피드는 디티오트레이톨 (DTT) 과 같은 환원제로 절단되어, 폴리알킬렌옥시-티올 시약을 수득할 수 있다.
도식 2
Figure 112007045123905-PCT00009
추가의 전략은 도식 3 에 나타나 있다. 이 경로에서, 시약 POLY-Y-OH (여기서, Y 는 상기 정의된 바와 같음) 가 제공된다. 상기 시약은 예를 들어, 알콕시드염을 형성하는 m-PEG-OH 와 같은 POLY-OH 와 NaH 와 같은 강염기와의 반응, 및 이어서 4-브로모-1-부탄올과 같은 할로알카놀과의 반응에 의해 제조될 수 있다. 말단 히드록시기는 토실레이트 또는 메실레이트와 같은 이탈기로 전환되고, 다음, 이러한 화합물은 이탈기를 대체하는 티오우레아와 반응한다. 다음, 말단 티오우로늄염은 염기를 사용해 절단되어, 말단 티올이 수득된다. 이탈기가 할라이드인 상기 도식에서의 변형은 하기 실시예 1 에서 사용된다.
도식 3
Figure 112007045123905-PCT00010
상기 시약 중 어느 하나에서, 티올은, 트리틸, 모노티오, 디티오 및 아미노티오 아세탈을 포함하여, 알킬 및 벤질 티오에테르와 같은 티오에테르, 티오에스테르, 티오카르보네이트, 티오카르바메이트, 및 술페닐 유도체와 같은 티올 보호기를 사용하여 보호될 수 있다. 저장 동안의 보호기의 사용은 추가로 시약의 이량체화 경향을 감소시킨다. 티올은 또한 도식 3 에서 나타낸 바와 같이 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 로 전환될 수 있고, 이는 표준 저장 조건 하에서 안정하다. 적절한 반응 조건 하에, OPSS 기는 실시예 2 에서 나타낸 바와 같이, 수용성 중합체에 공액되는 부분 내에서 티올기와 순조롭게 반응한다.
바람직하게는, 본 발명의 중합체성 시약은 아르곤 또는 질소와 같은 불활성 대기 하에 저장된다. 또한, 본 발명의 중합체의 수분에의 노출을 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 저장 조건은 약 -15℃ 미만의 온도에서 건조한 아르곤 또는 또다른 건조한 불활성 기체 하에 있다. 저온 조건 하에서의 저장이 바람직한데, 이는 불필요한 부작용의 속도가 저온에서 느려지기 때문이다. 예를 들어, 중합체 분절이 PEG 일 때, PEG 는 산소와 천천히 반응하여 퍼옥시드를 형성할 수 있고, 궁극적으로는 사슬 절단을 초래하고 PEG 시약의 다분산성을 증가시킬 수 있다. 상기의 면에서, 본 발명의 중합체를 암실에서 저장하는 것이 추가로 바람직하다.
중합체 컨쥬게이트
본 발명은 또한 본원에서 기술된 중합체성 티올 시약 중 어느 하나의 반응에 의해 형성된 컨쥬게이트를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 중합체성 시약은 반응에 이용가능한 하나 이상의 티올기를 갖는 활성제와 공액되기에 유용하다.
본 발명의 컨쥬게이트는 전형적으로 구조 POLY-[Y-S-S-A]x (여기서, POLY 는 상기 정의된 바임) 를 가질 것이고, 바람직한 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 이고 ; x 는 1 내지 25 이고, "A" 는 공액 후의 활성제의 잔기를 나타낸다. 선택된 구현예에서, x 는 1 내지 8, 1 내지 6, 또는 1 내지 4 이고 ; 추가의 구현예에서, x 는 1 또는 x 는 2 이다. Y 는 4 개 이상의 탄소 원자를 가지고, 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 탄소 원자가 3 내지 10 개, 바람직하게는 3 내지 8 개이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지고, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 2 가 연결기이다.
선택된 구현예에서, Y 는 구조 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10, 바람직하게는 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택됨) 을 갖는다. 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있다. 티올 (또는 보호된 티올) 의 황 원자는 아릴 고리 또는 이중 결합보다는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소 원자에 결합된다.
Y 의 선택된 구현예에서, Y 는 C3-C8 알킬렌, 또는 C3-C8 알킬렌과 C5-C8 시클로알킬렌이나 아릴과의 조합이고, 그 중 임의는 상기 기술된 바와 같이 하나 이상의 비-방해 치환체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 0 또는 2 개, 더욱 바람직하게는 0 또는 1 개의 상기 비-방행 치환체가 포함된다.
추가의 구현예에서, Y 는 형태 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 4 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택됨) 을 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, n 은 4 내지 6 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로, 수소 및 메틸로부터 선택된다. 한 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 -(CR1R2)- 의 n 번 반복에 대해서, 수소이다. 또다른 구현예에서, R1 및 R2 의 각각은 수소인데, 상기 황원자 (α-탄소) 에 인접 한 탄소 원자 상의 R1 은 제외로, 상기 R1 은 저급 알킬, 바람직하게는 메틸 또는 에틸이다.
Y 가 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 4 내지 8 이고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 인 Y 의 구현예에서, 시클로알킬기는 바람직하게는 시클로펜틸 또는 시클로헥실기이다.
또다른 측면에서, 본 발명의 컨쥬게이트는 구조 POLYA-L-SS-Y-POLYB-Y'-SS-A 를 가질 수 있다. 각각의 POLY 는 상기 정의된 바와 같은 수용성 중합체 분절이고, 여기서 POLYB 는 저분자량, 예를 들어 10 KDa 이하, 바람직하게는 5 KDa 이하, 및 더욱 바람직하게는 2 KDa 이하이고, POLYA 및 POLYB 의 조합된 분자량은 3 KDa 이상이다. POLYA 의 분자량은 일반적으로 그러나 반드시는 아니고, 중간 내지 고분자량으로, 예를 들어 약 2 KDa 이상, 바람직하게는 5 KDa 이상, 및 더욱 바람직하게는 10 KDa 이상이다.
Y 및 Y' 의 각각은 Y 에 대해 정의된 바와 같은 스페이서기이고, 동일 또는 상이할 수 있다. 일반적으로, Y 및 Y' 는 동일한 스페이서기이다. L 은 POLYA 및 인접한 디술피드 연결 사이의 연결기이다. 전형적으로, 상기 연결기는 직접 결합 또는 길이 면에서 약 10 개 이하의 원자로 된 사슬이고, 바람직하게는 알킬 (C-C), 알케닐, 에테르, 에스테르, 아미드, 카르바메이트, 및 티오에스테르 연결기로부터 선택되는 기를 함유한다. L 은 반드시는 아니고, 본원에서 기술된 바와 같은 Y 의 구현예일 수 있다.
이러한 컨쥬게이트는 일반적으로, 형태 W-S-S-Y-POLYB-Y'-S-S-W (여기서, S-W 는 티올 또는, 바람직하게는, OPSS 와 같은 티올-반응성 유도체임) 의 저분자량 시약이 먼저 생물학적으로 활성인 분자 A-SH, 예를 들어 자유 시스테인 잔기를 갖는 (또는 가지도록 개질된) 단백질과 반응하여, 중간체 A-S-S-Y-POLYB-Y'-S-S-W 를 형성하는, 반응 순서 (하기 실시예 8 - 11 에서 예시됨) 의 생성물이다. 다음, 상기 중간체는 (전형적으로) 형태 POLYA-L-S-S-W 의 고분자량 시약과 반응하여, 최종 컨쥬게이트가 수득된다.
특히 방해받은 티올기가 있는 생물학적 분자에 대해서 상기 도식의 이점은, 저분자량 시약이 고분자량의 시약보다 상기 방해받은 티올기와 더욱 효율적으로 반응할 수 있다는 점이다. 따라서, 고분자량 중합체는, 그것이 방해받은 티올과 직접 반응한다면 그 경우보다 상기 도식을 통해 더 높은 수율로 A 에 결합될 수 있다.
그러나, 처음의 시약 W-S-S-Y-POLYB-Y'-S-S-W 가 본원에서 기술된 바와 같은 친수성 스페이서기(들) Y 가 없다면, 상기 도식은 결합 단계에서의 저 수율로 인해 실패할 수 있다. 이러한 차이점은 하기 비교예 9 및 10 에 기술되어 있다.
일반적으로, 본원에 제공된 컨쥬게이트는 바람직하게는 수용성 또는 분산성 이고, 그렇더라도 중합체성 티올 시약은 또한 활성인 티올기를 가진 고체 지지체 또는 표면에 공액될 수 있다.
본 발명의 활성화 중합체에 커플링되는, 시스테인 잔기에서와 같은 티올기는 자연 발생적일 수 있거나 (즉, 그의 자연적인 형태의 단백질 또는 기타 분자에서 발생), 또는 표준 유전 공학 기술을 사용해 자연-발생 아미노산의 단백질의 고유의 서열에 삽입됨으로써 도입될 수 있다.
활성제가 반응성 티올기(들) 를 거의 함유하지 않거나 또는 단지 하나의 반응성 티올기(들) 를 함유하는 경우, 생성 조성물은 유리하게는 단지 하나의 중합체 컨쥬게이트 종을 함유할 수 있다. 이는, 공액될 수 있는 상대적으로 적은 (아민과 같은 기타 활성기와 비교해서) 수의 술피드릴기를 전형적으로 가진 단백질에의 공액 시 유용하다. 따라서, 티올기를 통한 공유 결합은 표적 단백질의 더욱 선택적인 개질을 초래할 수 있다. 따라서, 중합체성 티올의 사용은 모 단백질에 결합되는 중합체 유도체의 수 및 중합체 결합의 위치 둘 다에서, 생성 중합체 컨쥬게이트를 초과하는 더 큰 조절을 가능하게 할 수 있다.
공액용 후보 분자
본 발명의 컨쥬게이트의 제조에서 사용되기 위한 생물학적 활성제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 폴리사카라이드, 스테로이드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 지방, 전해질, 소분자 (바람직하게는 불용성 소분자) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 구조 부류 중 하나에 속할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 중합체에 커플링되는 활성제는 천연 술피드릴기를 가지 거나 또는 커플링에 적합한 하나 이상의 반응성 술피드릴기를 함유하도록 개질된다.
본 발명의 중합체성 티올에 커플링되기에 바람직한 펩티드 또는 단백질은 EPO, IFN-α, IFN-β, EFN-γ, 콘센서스 (consensus) IFN, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 IX, JL-2, Remicade™ (인플릭시마브), Rituxan™ (리툭시마브), Enbrel™ (에타네르셉트), Synagis™ (팔리비주마브), Reopro™ (아브식시마브), Herceptin™ (트라스투지마브), tPA, Cerizyme™ (이미글루세라제), 헤파티티스-B 백신, rDNAse, 알파-1 단백질분해효소 억제제, G-CSF, GM-CSF, hGH, 인슐린, FSH, 및 PTH 를 포함한다. 선택된 구현예에서, 단백질은 G-CSF 또는 GM-CSF 이다.
상기 실례의 생물학적 활성제는 사용가능한 유사체, 아고니스트, 안타고니스트, 억제제, 이성질체, 및 그의 약학적으로 허용가능한 염 형태를 포함하는 것으로 의미된다. 펩티드 및 단백질에 관해서, 본 발명은 합성, 재조합, 천연, 글리코실화, 및 비-글리코실화 형태, 뿐만 아니라, 그의 생물학적으로 활성인 절편을 포함하고자 한다. 상기 생물학적으로 활성인 단백질은 추가로 치환 (예를 들어, 시스테인), 삭제 등이 된 하나 이상의 아미노산을 가진 변이체를 포함하는 것으로 의미되고, 그러는 한, 생성 변이체 단백질은 모 (고유) 단백질의 특정 활성도 이상을 가진다.
적합한 제제는 예를 들어, 최면제 및 진정제, 정신 자극제, 정신안정제, 호흡성 약물, 경련방지제, 근육 이완제, 항파킨슨제 (도파민 안타고니스트), 진통제, 비스테로이드성 항염증제, 항분노 약물 (불안완화제), 식욕 억제제, 항두통제, 근 육 수축제, 항감염제 (항생제, 항바이러스제, 항진균제, 백신) 항관절염제, 말라리아치료제, 구토방지제, 항간질약, 기관지확장제, 사이토카인, 성장 인자, 항암제, 항혈전제, 항고혈압제, 심혈관 약물, 항부정맥 약물, 항산화제, 항-천식제, 피임약, 교감신경흥분제, 이뇨제, 지질 조절제, 항안드로겐제, 구충제, 항응고제, 신생물제, 항신생물제, 혈당강하제, 영양제 및 보충제를 포함하여 호르몬제, 성장 보충제, 장염치료제, 백신, 항체, 진단제, 및 조영제로부터 선택될 수 있다.
활성제의 기타 구체적인 예에는, 아스파라기나제, 암독소비르 (DAPD), 안티드, 베카플레르민, 칼시토닌, 시아노비린, 데니루킨 디프티톡스, 에리트로포이에틴 (EPO), EPO 아고니스트 (예를 들어, 길이가 약 10 - 40 개의 아미노산이고 WO 96/40749 에 기술된 바와 같은 특정 코어 서열을 포함하는 펩티드), 도르나제 알파, 조혈 자극 단백질 (NESP), 응고 인자 예컨대 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 인자 XII, 인자 XIII, von Willebrand 인자 ; 세레다제, 세레자임, 알파-글루코시다제, 콜라겐, 사이클로스포린, 알파 데펜신, 베타 데펜신, 엑센딘-4, 과립구 콜로니 자극 인자 (GCSF), 트롬보포이에틴 (TPO), 알파-1 단백질분해효소 억제제, 엘카토닌, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GMCSF), 피브리노겐, 필그라스팀, 성장 호르몬 인간 성장 호르몬 (hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH), GRO-베타, GRO-베타 항체, 뼈 형성 단백질 예컨대 뼈 형성 단백질-2, 뼈 형성 단백질-6, OP-1 ; 산성 섬유아세포 성장 인자, 염기성 섬유아세포 성장 인자, CD-40 리간드, 헤파린, 인간 혈청 알부민, 저분자량 헤파린 (LMWH), 인터페론 예컨대 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가, 인터페론 타우, 콘센서스 인터페론 ; 인터루킨 및 인터루킨 수용체 예컨대 인터루킨-1 수용체, 인터루킨-2, 인터루킨-2 융합 단백질, 인터루킨-1 수용체 안타고니스트, 인터루킨-3, 인터루킨-4, 인터루킨-4 수용체, 인터루킨-6, 인터루킨-8, 인터루킨-12, 인터루킨-13 수용체, 인터루킨-17 수용체 ; 락토페린 및 락토페린 절편, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬 (LHRH), 인슐린, 프로-인슐린, 인슐린 유사체 (예를 들어, 미국 특허 제 5,922,675 호에 기술된 바와 같은 단일-아실화 인슐린), 아밀린, C-펩티드, 소마토스타틴, 옥트레오티드를 포함하는 소마토스타틴 유사체, 바소프레신, 난포 자극 호르몬 (FSH), 독감 백신, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 인슐린트로핀, 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 플라스미노겐 활성화제 예컨대 알테플라제, 유로키나아제, 레테플라제, 스트렙토키나아제, 팔미테플라제, 라노테플라제, 및 테네테플라제 ; 신경 성장 인자 (NGF), 오스테오프로테게린, 혈소판-유래 성장 인자, 조직 성장 인자, 변형 성장 인자-1, 혈관 내피세포 성장 인자, 백혈병 억제 인자, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 신경교세포 성장 인자 (GGF), T 세포 수용체, CD 분자/항원, 종양 괴사 인자 (TNF), 단핵구 화학주성 단백질-1, 내피세포 성장 인자, 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤-유사 펩티드, 소마토트로핀, 티모신 알파 1, 티모신 알파 1 IIb/IIIa 억제제, 티모신 베타 10, 티모신 베타 9, 티모신 베타 4, 알파-1 항트립신, 포스포디에스터라제 (PDE) 항트립신 화합물, VLA-4 (매우 늦은 항원-4), VLA-4 억제제, 비스포스포네이트, 호흡성 시냅스성 바이러스 항체, 낭성 섬유증 막 전도 조절자 (CFTR) 유전자, 데옥시라이보뉴클레아제 (Dnase), 살박테리아성/침투성 증가 단백질 (BPI), 및 항-CMV 항체가 포함되나, 이에 제한되지 않는 다. 실례의 단일클론 항체에는 에타네르셉트 (IgG1 의 Fc 부분에 결합되는 인간 75 kD TNF 수용체의 세포외 리간드-결합 부분으로 이루어진 이량체성 융합 단백질), 아브식시마브, 아펠리오모마브, 바실릭시마브, 다클리주마브, 인플릭시마브, 이브리투모마브 티우엑세탄, 미투모마브, 무로모나브-CD3, 요오드 131 토시투모마브 컨쥬게이트, 올리주마브, 리툭시마브, 및 트라스투주마브 (헤르셉틴) 가 포함된다.
중합체에 공유 결합하기에 적합한 추가의 제제에는, 아미포스틴, 아미오다론, 아미노카프로산, 아미노히푸레이트 나트륨, 아미노글루테티미드, 아미노레불린산, 아미노살리실산, 암사크린, 아나그렐리드, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 안트라사이클린, 벡사로텐, 비칼루타미드, 블레오마이신, 부세렐린, 부술판, 카베르골린, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로르암부신, 실라스타틴 나트륨, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 시클로포스파미드, 시프로테론, 시타라빈, 캄포테신, 13-시스 레티노산, 모든 트랜스 레티노산 ; 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노마이신, 데페록사민, 덱사메타손, 디클로페낙, 디에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포시드, 엑세메스탄, 펙소페나딘, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 겜시타빈, 에피네프린, L-도파, 히드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브, 이리노테칸, 이트라코나졸, 고셀렐린, 레트로졸, 루코보린, 레바미솔, 리시노프릴, 로보티록신 나트륨, 로무스틴, 메클로레타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 메캅토퓨린, 메타라미놀 비타르트레이트, 메토트렉세이 트, 메토클로프라미드, 멕시레틴, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 날록손, 니코틴, 닐루타미드, 옥트레오티드, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 필카마이신, 포르피머, 프레드니손, 프로카바진, 프로클로페라진, 온단스테론, 랄티트렉세드, 시로리무스, 스트렙토조신, 타크로리무스, 타목시펜, 테모졸라마이드, 테니포시드, 테스토테론, 테트라히드로카나비놀, 탈리도미드, 티오구아닌, 티오테파, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 돌라세트론, 그라니세트론 ; 포르모테롤, 플루티카손, 루프롤리드, 미다졸람, 알프라졸람, 암포테리신 B, 포도필로톡신, 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존, 수마트립탄 ; 마크롤리드 예컨대 에리트로마이신, 올레안도마이신, 트롤레안도마이신, 록시트로마이신, 클라리트로마이신, 다베르신, 아지트로마이신, 플루리트로마이신, 디리트로마이신, 조사마이신, 스피로마이신, 미데카마이신, 루코마이신, 미오카마이신, 로키타마이신, 안다지트로마이신, 및 스위놀리드 A ; 플루오로퀴놀린 예컨대 시프로플록사신, 오플록사신, 레보프록사신, 트로바플록사신, 알라트로플록사신, 목시플록시신, 노르플록사신, 에녹사신, 그레파플록사신, 가티플록사신, 로메플록사신, 스파플록사신, 테마플록사신, 퍼플록사신, 아미플록사신, 플레록사신, 토수플록사신, 프루리플록사신, 이를록사신, 파주플록사신, 클리나플록사신, 및 시트플록사신 ; 아미노글리코시드 예컨대 겐타마이신, 네틸마이신, 파라메신, 토브라마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 및 스트렙토마이신, 반코마이신, 테이코플라닌, 람폴라닌, 미데플라닌, 콜리스틴, 답토마이신, 그람이시딘, 콜리스티메테이트 ; 폴리믹신 예컨대 폴리믹신 B, 카프레오마이신, 바시트라신, 페넴 ; 페니 실린 G, 페니실린 V 와 같은 페니실라제-민감성 제제를 포함하여 페니실린 ; 메티실린, 옥사실린, 클록사실린, 디클록사실린, 플록사실린, 나프실린과 같은 페니실라제-내성 제제 ; 암피실린, 아목실린, 및 헤타실린, 시실린, 및 갈람피실린과 같은 그람 음성 미생물 활성제 ; 카르베니실린, 티카실린, 아즐로실린, 메즐로실린, 및 피페라실린과 같은 항슈도모나스 페니실린 ; 세프포독심, 세프프로질, 세프트부텐, 세프티족심, 세프트리악손, 세팔로틴, 세파피린, 세팔렉신, 세프라드린, 세폭시틴, 세파만돌, 세파졸린, 세팔로리딘, 세파클로, 세파드록실, 세팔로글리신, 세푸록심, 세포라니드, 세포탁심, 세파트리진, 세파세트릴, 세페핌, 세픽심, 세포니시드, 세포페라존, 세포테탄, 세프메타졸, 세프타지드, 로라카르베프, 및 아즈트레오남과 같은 목살락탐 ; 및 카르바페넴 예컨대 이미페넴, 메로페넴, 펜타미딘 이세티오우에이트, 알부테롤 술페이트, 리도카인, 메타프로트레놀 술페이트, 베클로메타손 디프레피오네이트, 트리암시놀론 아세타미드, 부데소니드 아세토니드, 플루티카손, 이프라트로퓸 브로미드, 플루니솔리드, 크로몰린 나트륨, 및 에르고타민 타르트레이트 ; 탁산 예컨대 파클리탁셀 ; SN-38, 및 티로포스틴이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
공액 방법
적합한 공액 조건은 중합체성 티올 시약 및 활성제 사이의 공액에 영향을 주기에 충분한시간, 온도, pH, 시약 농도, 용매 등의 조건이다. 당기술분야에 공지된 바와 같이, 특정 조건은 다른 것들 중에서도, 활성제, 원하는 공액 유형, 반응 혼합물에 존재하는 기타 물질의 존재 등에 의존한다. 임의의 특별한 경우에 공액에 영향을 주기에 충분한 조건은 본원 개시물, 참조 문헌을 읽을 때, 및/또는 일반적인 실험을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
실례의 공액 조건은 약 6 내지 약 10 의 pH, 예를 들어 약 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10 의 pH 에서의 공액 반응을 수행하는 것을 포함한다. 상기 반응이 약 5 분 내지 약 72 시간, 바람직하게는 약 30 분 내지 약 48 시간, 및 더욱 바람직하게는 약 4 시간 내지 약 24 시간 이하 동안 수행되도록 놔둔다. 공액 반응의 온도는 전형적으로, 반드시는 아니더라도, 약 0℃ 내지 약 40℃ 의 범위에 있고 ; 공액은 종종 실온 이하에서 수행된다. 공액 반응은 종종 완충용액 예컨대 포스페이트 또는 아세테이트 완충용액 또는 유사한 계 내에서 수행된다.
시약 농도에 관해서, 과량의 중합체성 시약은 전형적으로 활성제와 조합된다. 그러나, 일부 경우, 활성제의 양에 대해 중합체성 시약 상의 반응성 기의 수의 화학양론적 양을 가지는 것이 바람직하다. 실례의 중합체성 시약 대 활성제의 비율에는, 약 1 : 1 (중합체성 시약 : 활성제), 1.5 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 6 : 1, 8 : 1, 또는 10 : 1 의 몰비가 포함된다. 공액 반응은 실질적으로 더 이상의 공액이 일어나지 않을 때까지 수행되도록 놔두고, 이는 일반적으로 시간에 걸친 반응의 진행을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
반응의 진행은 다양한 시점에서 반응 혼합물로부터 분획을 제거하고, 반응 혼합물을 SDS-PAGE 또는 MALDI-TOF 질량 분석계 또는 임의의 기타 적합한 분석 방법에 의해 분석함으로써 모니터링될 수 있다. 형성된 컨쥬게이트의 양 또는 남 아 있는 비공액 중합체의 양에 대해 일단 안정기에 도달하면, 반응은 완료된 것으로 가정한다. 전형적으로, 공액 반응은 수 분 내지 수 시간 (예를 들어, 5 분 내지 24 시간 이상) 이 걸린다. 결과의 생성 혼합물은 바람직하게는, 그러나, 반드시는 아니고, 정제되어서, 과량의 시약, 비공액 반응물 (예를 들어, 활성제), 불필요한 다중-공액 종, 및 자유 또는 미반응 중합체가 분리된다. 다음, 생성 컨쥬게이트는 추가로 분석 방법 예컨대 MALDI, 모세관 전기영동, 젤 전기영동, 및/또는 크로마토그래피를 사용해 특징화될 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명의 중합체성 티올은 전형적으로 약 6 - 9 (예를 들어, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 또는 9) 의 pH, 더욱 바람직하게는 약 7 - 9 의 pH, 더욱 더 바람직하게는 약 7 - 8 의 pH 에서 술피드릴-함유 활성제에 공액된다. 일반적으로, 약간 몰 초과된 양의 중합체성 시약이 예를 들어, 1.5 내지 15-배 몰 과량, 바람직하게는 2-배 내지 10 배 몰 과량이 사용된다. 반응 시간은 일반적으로 실온에서 약 15 분 내지 수 시간, 예를 들어, 8 시간 이상의 범위이다. 입체 방해 술피드릴기에 대해서는, 필요한 반응 시간이 유의하게 더 길 수 있다.
컨쥬게이트의 정제
임의로, 본 발명의 중합체성 티올을 생물학적 활성제와 반응시킴으로써 생성된 컨쥬게이트는 정제되어, 상이한 종, 예를 들어, PEG-종을 수득/단리하거나, 또는 불필요한 반응 부산물을 제거한다.
필요하다면, 상이한 분자량을 갖는 PEG 컨쥬게이트는 겔 여과 크로마토그래피를 사용해 단리될 수 있다. 상기 접근이 상이한 분자량을 갖는 PEG 컨쥬게이 트를 분리하는데 사용될 수 있는 한편, 상기 접근은 일반적으로 단백질 내의 상이한 PEG화 부위를 갖는 위치상 이성질체를 분리하는데는 비효율적이다. 예를 들어, 겔 여과 크로마토그래피는 PEG 단량체, 이량체, 삼량체 등의 각각 다른 혼합물로부터 분리하는데 사용될 수 있는데, 그렇더라도 각각의 회수된 PEG-량체 조성물은 단백질 내에서 상이한 반응성 기에 결합된 PEG 를 함유할 수 있다.
상기 유형의 분리를 하는데 적합한 겔 여과 칼럼에는 Amersham Biosciences 사의 Superdex™ 및 Sephadex™ 칼럼이 포함된다. 특정 칼럼의 선택은 목적하는 분획 범위에 따라 다를 것이다. 용출은 일반적으로 비-아민 기재 완충용액, 예컨대 포스페이트, 아세테이트 등을 사용해 수행된다. 수합된 분획은 많은 상이한 방법, 예를 들어, (i) 단백질 함량에 대한 280 nm 에서의 OD, (ii) BSA 단백질 분석, (iii) PEG 함량에 대한 요오드 시험 (Sims, G.E.C. 등, Anal. Biochem, 107, 60-63, 1980), 또는 대안적으로, (iv) SDS PAGE 겔을 진행시키고, 이어서 바륨 요오다이드로의 염색에 의해 분석될 수 있다.
위치 이성질체의 분리는 RP-HPLC C18 칼럼 (Amersham Biosciences or Vydac) 을 사용한 역상 크로마토그래피, 또는 이온 교환 칼럼, 예를 들어, Amersham Biosciences 사의 Sepharose™ 이온 교환 칼럼을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 어느 접근이든지 간에 동일한 분자량을 갖는 PEG-생 분자 이성질체 (위치 이성질체) 를 분리하는데 사용될 수 있다.
생성 PEG-컨쥬게이트에 대한 원하는 용도, 후속하는 공액, 및 임의로 추가의 분리 단계에 따라, 컨쥬게이트 혼합물은 농축, 멸균 여과, 및 약 -20℃ 내지 약 -80℃ 의 저온에서 저장될 수 있다. 대안적으로, 컨쥬게이트는 잔여 완충용액 이 있거나 또는 없는 상태로 동결건조되고, 동결건조된 분말로서 저장될 수 있다. 일부 경우, 나트륨 아세테이트와 같은 공액에 사용되는 완충용액을, 동결건조 동안에 쉽게 제거될 수 있는 암모늄 카르보네이트 또는 암모늄 아세테이트와 같은 휘발성 완충용액으로 교환하여, 동결건조된 단백질 컨쥬게이트 분말 제제에 잔여 완충용액이 없게 하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 완충용액 교환 단계는 제제 완충용액을 사용하여 이용될 수 있어서, 동결건조된 컨쥬게이트가 제제 완충용액으로 재구성되기에 적합한, 궁극적으로는 포유류에 투여되기에 적합한 형태로 존재한다.
약학적 조성물
본 발명은 또한 약학적 부형제와 조합되어 본원에서 제공되는 컨쥬게이트를 포함하는 약학적 제제를 포함한다. 일반적으로, 컨쥬게이트 그 자체는 고체 형태 (예를 들어, 침전물 또는 동결건조물) 또는 용액 내에 있을 것이며, 고체 또는액체 형태로 있을 수 있는 적합한 약학적 부형제와 조합될 수 있다.
실례의 부형제에는 제한 없이, 탄수화물, 무기염, 항균제, 항산화제, 계면활성제, 완충용액, 산, 염기, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이 포함된다.
당과 같은 탄수화물, 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당, 및/또는 당 중합체와 같은 유도체화된 당은 부형제로서 존재할 수 있다. 특정 탄수화물 부형제에는 예를 들어 : 모노사카라이드, 예컨대 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만 노스, 소르보스 등 ; 디사카라이드, 예컨대 락토오스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등 ; 폴리사카라이드, 예컨대 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란 등 ; 알디톨, 예컨대 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨, 소르비톨 (글루시톨), 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨 등이 포함된다.
부형제는 또한 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 제 1 인산나트륨, 제 2 인산나트륨, 및 그의 조합과 같은 무기염 또는 완충용액을 포함할 수 있다.
제제는 또한 미생물 성장을 방지 또는 저지하기 위한 항균제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 항균제의 비제한적 예에는, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 벤질 알콜, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알콜, 페닐머큐릭 니트레이트, 티메솔, 및 그의 조합이 포함된다.
항산화제 또한 제제에 존재할 수 있다. 항산화제는 산화 방지, 그로 인한 컨쥬게이트 또는 기타 제제의 성분의 저하를 방지하는데 사용된다. 본 발명에 사용되기에 적합한 항산화제에는 예를 들어, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 하이포스포러스산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 나트륨 비술피트, 나트륨 포름알데하이드 술폭실레이트, 나트륨 메타비술피트, 및 그의 조합이 포함된다.
계면활성제는 부형제로서 존재할 수 있다. 실례의 계면활성제에는 : 폴리소르베이트, 예컨대 "Tween 20" 및 "Tween 80," 및 플루론 (pluronics) 예를 들어 F68 및 F88 (둘 다 BASF, Mount Olive, New Jersey 사에서 구입가능함) ; 소르 비탄 에스테르 ; 지질, 예컨대 인지질 예컨대 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 (그렇더라도 바람직하게는 리포좀 형태로 있지 않음), 지방산 및 지방 에스테르 ; 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤 ; 및 킬레이트제, 예컨대 EDTA, 아연 및 기타 상기 적합한 양이온이 포함된다.
산 또는 염기는 제제 내에서 부형제로서 존재할 수 있다. 산의 비제한적 예에는, 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 퍼클로르산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 산이 포함된다. 적합한 염기의 예에는, 제한 없이, 나트륨 히드록시드, 나트륨 아세테이트, 암모늄 히드록시드, 칼륨 히드록시드, 암모늄 아세테이트, 칼륨 아세테이트, 나트륨 포스페이트, 칼륨 포스페이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포르메이트, 나트륨 술페이트, 칼륨 술페이트, 칼륨 푸메레이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기가 포함된다.
약학적 제제는 모든 유형의 제제를 포함하고, 특히 주사용에 적합한 것들, 예를 들어 재구성될 수 있는 분말뿐만 아니라 현탁액 및 용액을 포함한다. 조성물 내의 컨쥬게이트 (즉, 본원에서 기술된 중합체 및 활성제 사이에 형성된 컨쥬게이트) 의 양은 많은 요소에 따라 다를 것이나, 최적으로는 조성물이 단위 투여량 용기 (예를 들어, 바이알) 에 저장될 때 치료적 유효 투여량일 것이다. 또한, 약학적 제제는 주사기에 저장될 수 있다. 치료적 유효 투여량은 임상적으로 목적하는 결론을 얻게 되는 양을 결정하기 위해 컨쥬게이트의 양을 증가시키면서 투여를 반복함으로써, 실험적으로 결정될 수 있다.
조성물 내 개별 부형제의 양은 부형제의 활성 및 조성물의 특별한 필요에 따라 다를 것이다. 전형적으로, 개별 부형제의 최적량은 일반적인 실험을 통해 결정되는데, 즉, 부형제의 양을 다양하게 함유하는 (저량에서 고량의 범위) 조성물을 제조하고, 안정성 및 기타 척도를 시험한 다음, 최적의 성능이 유의한 부작용이 없는 상태로 수득되는 범위를 측정함으로써 결정된다.
그러나, 일반적으로, 부형제는 조성물 내에서 약 1 중량% 내지 약 99 중량%, 바람직하게는 약 5 - 98 중량%, 더욱 바람직하게는 약 15 - 95 중량% 의 부형제 양으로 존재할 것이고, 농도가 30 중량% 미만인 것이 가장 바람직하다.
기타 부형제와 함께 상기 전술한 약학적 부형제는 ["Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipents, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000] 에 기술되어 있다.
본 발명의 약학적 제제는 전형적으로, 반드시는 아니더라도, 주사를 통해 투여되고, 따라서 일반적으로 투여 바로 전에 액체 용액 또는 현탁액이다. 약학적 제제는 또한 시럽, 크림, 연고, 정제, 분말 등과 같은 기타 형태를 취할 수 있다. 기타 투여 경로에는 또한, 폐, 직장, 경피, 경점막, 경구, 수막강내, 피하, 동맥내 등이 포함된다.
이미 기술된 바와 같이, 컨쥬게이트는 정맥 내 주사에 의해 비경구로 주사될 수 있거나, 또는 덜 바람직하게는 근육 내 주사 또는 피하 주사에 의해 주사될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 제제 유형에는, 다른 것들 중에서도, 즉시-주사용 용액, 사용 전 용매와 조합되는 건조 분말, 주사용 현탁액, 사용 전 비히클과 조합되는 건조 불용성 조성물, 및 에멀젼 및 투여 전 희석을 위한 액체 농축물이 포함된다.
투여 방법
본 발명은 또한 본원에 제공된 컨쥬게이트를, 컨쥬게이트로의 치료에 반응성인 상태로부터 고통받는 환자에 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 일반적으로 치료적 유효량의 컨쥬게이트 (바람직하게는 약학적 제제의 일부로서 제공되는) 를 주사를 통해 투여하는 것을 포함한다. 상기 투여 방법은 특정 컨쥬게이트의 투여에 의해 경감 또는 예방될 수 있는 임의의 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 당업자는 특정 컨쥬게이트가 효과적으로 치료할 수 있는 상태를 고려한다. 투여되는 실제 투여량은 대상의 연령, 체중, 및 일반적인 상태, 뿐만 아니라 치료되는 상태의 심각성, 건강 케어 프로페셔널의 판단, 및 투여되는 컨쥬게이트에 따라 다양할 것이다. 치료적 유효량은 당업자에게 공지되어 있고/거나 또는 참조 텍스트 및 문헌에 기술되어 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 약 0.001 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.01 mg/일 내지 75 mg/일의 투여량, 및 더욱 바람직하게는 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 투여량 범위일 것이다.
임의의 주어진 컨쥬게이트 (또, 바람직하게는 약학적 제제의 일부로서 제공되는) 의 단위 투여량은 임상의의 판단, 환자의 요구 등에 따라 다양한 투여 스케 쥴로 투여될 수 있다. 특정 투여 스케쥴은 당업자에게 공지될 것이고, 또는 일반적인 방법을 사용해 실험적으로 결정될 수 있다. 실례의 투여 스케쥴에는 제한 없이, 1 일 5 회 투여, 1 일 4 회 투여, 1 일 3 회 투여, 1 일 2 회 투여, 1 일 1 회 투여, 1 주 3 회 투여, 1 주 2 회 투여, 1 주 1 회 투여, 1 달 2 회 투여, 1 달 1 회 투여, 및 그의 임의의 조합의 투여가 포함된다. 일단 임상적인 목표가 달성되면, 조성물의 투여는 중지된다.
필요한 경우, 생체 내에서의 컨쥬게이트의 수용성 중합체 부분의 절단은, 중합체 골격에 있는 생리학적으로 절단가능하고/거나 또는 효소적으로 분해가능한 연결기, 예컨대 우레탄, 아미드, 카르보네이트 또는 에스테르-함유 연결기의 사용을 통해 영향을 받을 수 있다. 이러한 방식에서, 컨쥬게이트의 제거 (수용성 중합체 부분의 절단을 통한 것임) 는 목적하는 투명도 특성을 제공할 작용기 유형 및 중합체 분자 크기를 선택함으로써 조정될 수 있다. 당업자는 중합체의 적절한 분자 크기뿐만 아니라, 절단가능한 연결기를 결정할 수 있다. 예를 들어, 당업자는 우선 상이한 중합체 중량을 가진 다양한 중합체 유도체 및 절단가능한 연결기를 제조한 다음, 중합체 유도체를 환자에게 투여하고 주기적인 혈액 및/또는 소변 샘플링을 취함으로써 투명도 프로파일 (예를 들어, 주기적인 혈액 및 소변 샘플링) 을 수득하는 일반적인 실험을 사용해, 적절한 분자 크기 및 절단가능한 작용기를 결정할 수 있다. 일단 일련의 투명도 프로파일은 각각의 테스트된 컨쥬게이트에 대해 수득되면, 적합한 컨쥬게이트가 규명될 수 있다.
하기 실시예는 예시적인 것이나, 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 한 측면에서, 실시예는 본 발명의 중합체성 티올 시약의, 합성 및 공액 동안의 증가된 안정성을 예시한다.
1H NMR 데이타를 Bruker 에 의해 제조된 400 MHz 분석계를 사용해 수득하였다.
언급된 PEG 시약은 Nektar Therapeutics, Huntsville, AL 에서 구입가능하다.
실시예 1
mPEG -( CH 2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG -4C- OPSS ) 의 제조
I. mPEG 5000 -부틸 브로마이드
톨루엔 (200 ml) 중 mPEG5000 (20.Og, 0.004 mol) (NOF Corporation) 의 용액을, 50 ml 톨루엔을 증류 제거함으로써 공비 건조시켰다. 나트륨 하이드리드 (0.8 g, 광유 중 60% 분산액, 0.020 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 60℃ 에서 아르곤 분위기 하에 1 시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄 (9.0 g, 0.0417 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 75℃ 에서 아르곤 하에 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 잔기를 850 ml 냉 에틸 에테르와 조합하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 17.4 g. NMR (d6-DMSO): 1.60 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 1.84 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2- CH2-Br, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 골격).
II. mPEG 5000 - 부탄티올
무수 에틸 알콜 (20 ml) 중의 mPEG 5000 -부틸 브로마이드 (2.0 g, 0.0004 mol) 의 용액에, 티오우레아 (0.31 g, 0.0041 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 1% 수성 NaOH (21 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 2.5 시간 동안 가열하였다. 용액을 35℃ 로 냉각시킨 후, 10% 인산으로 pH 를 3 으로 맞추었다. NaCl (6 g) 을 첨가하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 생성물을 냉 에틸 에테르로 침전시켰다. 수율 1.8 g. NMR (CDCl3): 1.35 ppm (t, -CH2-SH, 1H), 1.69 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-SH, 4H), 2.55 ppm (m, -CH2-SH, 2H), 2.69 ppm (t, -CH2-S-S-CH2-, 4H, 1.2 몰% ) 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 골격). 요오드측정 분석은, 생성물이 94% 티올기를 함유함을 보여주었다. 상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 매우 소량 (NMR 에 의해 1.2 몰%) 으로 함유함으로 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요하지 않았다.
반대로, 유사한 방식으로 수행된 mPEG5000-메실레이트 및 티오우레아로부터의 mPEG5000-에탄티올 (즉, PEG 및 티올기 사이에서 단지 2-탄소 스페이서만을 함유하는 상응하는 시약) 의 유사 제제는 디티올기를 함유하는 디술피드-연결 이량체를 약 15 몰% 함유하는 생성물을 제조하였다 (예를 들어 WO 2004/063250 를 참조). 이량체의 이러한 수준은 이량체를 원하는 PEG-티올로 전환하기 위해서는 추가의 정제 또는 추가의 화학적 처리를 필요로 한다.
III. mPEG 5000 -4C- OPSS
무수 메틸 알콜 (40 ml) 중 mPEG5000-부탄티올 (2.0 g, 0.0004 mol) 의 용액에, 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.18 g, 0.00082 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (5 ml) 중에 용해시키고, 생성물을 냉 에틸 에테르 50 ml 로 침전시켰다. 수율 1.7 g. NMR (CDCl3): 1.68 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 1.76 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 2.82 ppm (t, -CH2-S-, 2H), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.52 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 양성자, 4H).
실시예 2
PEG 2000 -디-(( CH 2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ) ( PEG -디-(4C- OPSS ), 2 KDa ) 의 제조
Figure 112007045123905-PCT00011
PEG 2000 -디-부틸 브로마이드
톨루엔 (150 ml) 중 PEG2000 (20.Og, 0.020 당량) (NOF Corporation) 의 용액을 50 ml 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 나트륨 하이드리드 (6.0 g, 광유 중 60% 분산액, 0.150 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 60℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄 (34.55 g, 1.600 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 75℃ 에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 850 ml 냉 에틸 에테르와 조합하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 17.0 g. NMR (d6-DMSO): 1.60 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 1.84 ppm (m, -0-CH2- CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 3.51 ppm (s, PEG 골격); 치환 96.3%.
PEG 2000 -디( 부탄티올 )
무수 에틸 알콜 (100 ml) 중 PEG2000-디(부틸 브로마이드) (10.0 g, 0.0100 equiv.) 의 용액에, 티오우레아 (7.68 g, 99%, 0.100 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 3.3 % 수성 NaOH (180 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 2.5 시간 동안 가열하였다. 용액을 35℃ 로 냉각시킨 후, 60 ml 탈이온수를 첨가하고, 10% 인산으로 pH 를 3 으로 맞추었다. 용액을 50 ml 에틸 아세테이트로 세척하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물을 이소프로필 알콜로부터 재결정화하고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 7.8 g. NMR (CDCl3): 1.35 ppm (t, -CH2-SH, IH), 1.69 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-SH, 4H), 2.55 ppm (m, -CH2-SH, 2H), 2.69 ppm (t, -CH2-S-S-CH2-. 4H, 1.9 몰% ), 3.64 ppm (s, PEG 골격).
상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 상대적으로 소량 (NMR 에 의해 1.9 몰%) 으로 함유함을 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요하지 않았다.
반대로, 유사한 방식으로 수행된, PEG2000-디-메실레이트 및 티오우레아로부터의 PEG2000-디-에탄티올 (즉, PEG 및 티올기 사이에 단지 2-탄소 스페이서만을 함유하는 상응하는 시약) 의 유사 제제는, 디티올기를 함유하는 디술피드-연결 이량체를 약 41% 함유하는 생성물을 제조하였다.
PEG 2000 -디-(4C- OPSS )
무수 메틸 알콜 (40 ml) 중의 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.89 g, 0.0040 mol) 의 용액에, PEG2000-디-부탄티올 (2.0 g, 0.0020 당량) 을 첨가하고, 혼합물을 아르 곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (5 ml) 중에 용해시키고, 생성물을 50 ml 냉 에틸 에테르로 침전시켰다. 침전을 반복하여, 백색 고체 생성물 1.0 g 을 수득하였다. NMR (CDCl3): 1.68 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 1.76 ppm (m, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 2.82 ppm (t, -CH2-S-, 2H), 3.64 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 Hs, 4H).
실시예 3
mPEG 10 ,000 -(CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG -4C- OPSS , 10 KDa ) 의 제조
mPEG 10 ,000 -부틸 브로마이드
톨루엔 (200 ml) 중 mPEG10 ,000 (20.Og, 0.002 mol) (NOF Corporation) 의 용액을, 50 ml 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 나트륨 하이드리드 (0.8 g, 광유 중 60% 분산액, 0.0200 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 60℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄 (4.8 g, 0.0222 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 75℃ 에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 850 ml 냉 에틸 에테르와 조합하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 18.5 g. NMR (d6-DMSO): 1.60 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 1.84 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 골격); 치환 97.5%.
mPEG 10 ,000 - 부탄티올
무수 에틸 알콜 (100 ml) 중 mPEG10 ,000-부틸 브로마이드 (10.0 g, 0.0010 mol) 의 용액에, 티오우레아 (0.77 g, 99%, 0.0100 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 1.0 % 수성 NaOH (90 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 3 시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후, NaCl (10 g) 을 첨가하고, pH 를 10% 인산으로 3 으로 맞추었다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물을 소량의 디클로로메탄 중에 용해시키고, 에틸 에테르로 침전시키고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 9.0 g. NMR (CDCl3): 1.35 ppm (t, -CH2-SH, IH), 1.69 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-SH, 4H), 2.55 ppm (m, -CH2-SH, 2H), 2.69 ppm (t, -CH2-S-S-CH2-, 4H, 4.8 몰%), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격). 상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 상대적으로 소량 (NMR 에 의해 4.8 몰%) 으로 함유함을 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요하지 않았다.
mPEG 10 ,000 -4C- OPSS
무수 메틸 알콜 (40 ml) 중의 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.89 g, 0.0040 mol) 의 용액에, PEG10 ,000-디-부탄티올 (2.0 g, 0.00020 당량) 을 첨가하고, 혼합물을 아 르곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조성물을 디클로로메탄 (5 ml) 중에 용해시키고, 50 ml 냉 에틸 에테르로 침전시켜, 건조 후에 백색 고체 분말 1.8 g 을 수득하였다. NMR (CDCl3): 1.68 ppm (m, -0-CH2-CH2CH2-CH22-S-, 2H), 1.76 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 2.82 ppm (t, -CH2-S-, 2H), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 양성자, 4H).
실시예 4 및 5 는 더 높은 분자량의 상응하는 시약의 제조를 예시한다.
실시예 4
mPEG 20 ,000 -( CH7 )4- 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG -4C- OPSS . 20 KDa ) 의 제조
mPEG 20 ,000 -부틸 브로마이드
톨루엔 (200 ml) 중 mPEG20 ,000 (20.Og, 0.0010 mol) (NOF Corporation) 의 용액을, 50 ml 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 나트륨 하이드리드 (0.4 g, 광유 중 60% 분산액, 0.0100 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 60℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄 (2.4 g, 0.0111 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 75℃ 에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 850 ml 냉 에틸 에테르와 조합하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 18.2 g. NMR (d6-DMSO): 1.60 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 1.84 ppm (m, -0-CH2- CH22-CH2-CH2-Br, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 골격); 치환 98.0 %.
mPEG 20 ,000 - 부탄티올
무수 에틸 알콜 (100 ml) 중 mPEG20 ,000-부틸 브로마이드 (10.0 g, 0.5 mmol) 의 용액에, 티오우레아 (0.39 g, 99%, 0.0051 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 1.0 % 수성 NaOH (90 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 3 시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후, NaCl (10 g) 을 첨가하고, pH 를 10% 인산으로 3 으로 맞추었다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물을 소량의 디클로로메탄 중에 용해시키고, 에틸 에테르로 침전시키고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 8.2 g. NMR (CDCl3): 1.35 ppm (t, -CH2-SH, IH), 1.69 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-SH, 4H), 2.55 ppm (m, -CH2-SH, 2H), 2.69 ppm (t, -CH2-S-S-CH2-, 4H, 3.4 몰% ), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격). 상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 상대적으로 소량 (NMR 에 의해 3.4 몰%) 으로 함유함을 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요하지 않았다.
mPEG 20 ,000 -4C- OPSS
무수 메틸 알콜 (40 ml) 중의 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.05 g, 0.00023 mol) 의 용액에, PEG20 ,000-디-부탄티올 (2.0 g, 0.00010 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (5 ml) 중에 용해시키고, 생성물을 50 ml 냉 에틸 에테르로 침전시켜, 백색 고체 생성물 1.9 g 을 수득하였다. NMR (CDCl3): 1.68 ppm (m, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 1.76 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 2.82 ppm (t, -CH2-S-, 2H), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 양성자, 4H).
실시예 5
mPEG 30 ,000 -(CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG -4C- OPSS , 30 KDa ) 의 제조
mPEG 30 ,000 -부틸 브로마이드
톨루엔 (150 ml) 중 mPEG30 ,000 (20.Og, 0.00067 mol) (NOF Corporation) 의 용액을, 50 ml 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 나트륨 하이드리드 (0.3 g, 광유 중 60% 분산액, 0.00750 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하에 60℃ 에서 1 시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄 (2.17 g, 0.0100 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 75℃ 에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 850 ml 냉 에틸 에테르와 조합하였다. 침전된 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 15.3 g. NMR (d6-DMSO): 1.60 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 1.84 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-Br, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, PEG 골격); 치환 96.0%.
mPEG 30 ,000 - 부탄티올
무수 에틸 알콜 (100 ml) 중 mPEG30 ,000-부틸 브로마이드 (10.0 g, 0.00033 mol) 의 용액에, 티오우레아 (0.26 g, 99%, 0.00338 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 1.0 % 수성 NaOH (90 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 3 시간 동안 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 후, NaCl (10 g) 을 첨가하고, pH 를 10% 인산으로 3 으로 맞추었다. 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물을 소량의 디클로로메탄 중에 용해시키고, 에틸 에테르로 침전시키고, 진공 하에 건조시켰다. 수율 9.4 g. NMR (CDCl3): 1.35 ppm (t, -CH2-SH, 1H), 1.69 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-SH, 4H), 2.55 ppm (m, -CH2-SH, 2H), 2.69 ppm (t, -CH2-S-S-CH2-, 4H, 3.8 몰% ), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격). 상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 상대적으로 소량 (NMR 에 의해 3.8 몰%) 으로 함유함을 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요 하지 않았다.
mPEG 30 ,000 -4C- OPSS
무수 메틸 알콜 (60 ml) 중의 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.05 g, 0.00023 mol) 의 용액에, PEG30 ,000-디-부탄티올 (3.0 g, 0.00010 mol) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (8 ml) 중에 용해시키고, 생성물을 60 ml 에틸 에테르로 침전시켜, 백색 고체 분말 2.9 g 을 수득하였다. NMR (CDCl3): 1.68 ppm (m, -O-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 1.76 ppm (m, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-S-, 2H), 2.82 ppm (t, -CH2-S-, 2H), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 양성자, 4H).
실시예 6
BSA 와 mPEG 5000 -4C-0 PSS 및 mPEG5000 - MAL ( MAL = 말레이미드 ) (비교) 과의 공액
BSA 의 환원 ( 디술피드 연결의 절단)
BSA 3.1 mg 샘플을 3.1 mL 1x PBS pH 7.5 를 함유하는 5 mL ReactiVial™ 에 첨가하였다. 용액을 중간 속도의 교반 플레이트 상에 놓았다. 디티오트레이톨 (DTT) 4.62 mg 을 교반하면서 용액에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 반응하도록 놔두어서, 샘플을 완전히 환원시켰다.
반응 혼합물을 DTT 의 제거용 10,000 MW PES 막이 있는 350 mL Amicon StirCell 에 넣었다. 침전되지 않도록 교반하면서, 부피가 350 mL 이 되게 완충용액 (1x PBS pH 7.5) 을 첨가하였다. 부피가 < 10 mL 로 감소될 때까지 압력을 장치에 가하였다 (60 psi). 부피가 350 mL 이 되게 PBS 를 다시 첨가하고, 과정을 2 회 반복하였다. 1 mL 분획을 표준 (겔, HPLC 등) 을 위해 동결시키고, 남은 부피를 공액 단계에 사용하였다.
공액
단계 A 로부터 환원된 BSA (4 mL) 를, 중간 세팅으로 세팅된 교반 플레이트 상에서 5 mL ReactiVial 중의 실시예 1 에 기술된 2.35 mg (10x 과량) mPEG5K-4C-OPSS 와 조합하였다. 단계 A 로부터의 환원 BSA (4 mL) 및 2.35 mg (10x 과량) mPEG5K-MAL 을 사용하여 유사한 반응 혼합물을 제조하였다 (Nektar Therapeutics, Huntsville, AL 로부터 구입가능한 mPEG-MAL 에서, 말레이미드는 mPEG 의 말단 -OCH2CH2- 에 질소 고리를 통해 결합됨). 바이알을 실온에서 60 시간 동안 놔두었다.
분석
반응 혼합물을 하기 조건을 사용하여 10% Bis-Tris NuPAGE Gels (Invitrogen) 상에서 진행시켰다.
4x LDS 샘플 완충용액 (Invitrogen) 1O ㎕/샘플
반응 샘플 30 ㎕/샘플
1x MES 진행 완충용액 (Invitrogen) 60O mL
MultiMark 단백질 표준 (Invitrogen) 7 ㎕
SimplyBlue Safe Stain (Invitrogen) 5O mL
로딩 샘플 (a + b) 30 ㎕
전압 200 V
전류 400 mA
시간 36 분.
도 1 은 SimplyBlue Safe Stain 으로 염색된 완성된 겔을 보여준다.
도 2 는 PEG 의 검출을 위해, 바륨 요오드로 추가로 염색된 동일한 겔을 보여준다.
도 2 의 겔에 나타내어진 종의 분자량 및 상대 세기는 또한 하기 표에 나타나 있다 :
레인 2 : 감소된 BSA 레인 3 : PEG5K-MAL 공액 반응 레인 4 : PEG5K-OPSS 공액 반응
MW 상대 세기 MW 상대 세기 MW 상대 세기
100718.7 0.0727 126546.9 0.0591 134703.1 0.0433
50521.2 0.9273 85120 0.0852 85120 0.0664
75000 0.1449 75460 0.0826
58440 0.3984 58440 0.4224
50077.5 0.1822 50077.5 0.2032
7883.1a 0.1301 22090.9a 0.0806
6454.5a 0.1015
a BaI (PEG 검출용) 에 의해 시각화됨
PEG5K-MAL-BSA 공액 반응으로 39.8% 모노PEG머 (58440 MW 밴드) 가 수득되었고, mPEG5K-4C-OPSS-BSA 공액 반응으로 42.2% 모노PEG머가 수득되었다. 따라서, 본 발명의 중합체성 티올 시약의 공액 거동은 참조 중합체성 시약 (말레이미드-말 단 중합체) 에 대해 관찰된 것보다 더 양호했으며, 이는 mPEG-에탄티올 기재의 상응하는 시약에 대해서는 전형적인 PEG-OPSS 의 유의한 이량체화가 발생하지 않았음을 지시한다.
실시예 7
mPEG 10 ,000 -(CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG 10 ,000 -4C- OPSS ) 로의 과립구- 콜로니 자극 인자 (G- CSF ) 의 PEG 화
Figure 112007045123905-PCT00012
mPEG10 ,000-(CH2)4-오르토피리딜 디술피드 (mPEG10 ,000-4C-OPSS)
실시예 3 에서 제조된 mPEG10 ,000-(CH2)4-오르토피리딜 디술피드 (mPEG10 ,000-4C-OPSS) 의 50-배 초과 (스톡 G-CSF 용액의 측정 분획 내 G-CSF 의 양에 대해) 를 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 용해시켜, 10% 시약 용액을 형성하였다. 10% 시약 용액을 스톡 G-CSF 용액 (나트륨 포스페이트 완충용액 중 0.4 mg/ml, pH 7.0) 의 분획에 빨리 첨가하고, 잘 혼합하였다. G-CSF 의 위치 17 에서 mPEG-OPSS 시약을 자유 (즉, 비내부단백질-디술피드 결합 참여) 시스테인 잔기에 커플링하도록 놔두기 위해, 반응 용액을 RotoMix (Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) 상에 놓아서, 37 에서 공액되도록 하였다. 30 분 후, 또다른 50-배 초과의 mPEG10 ,000-4C-OPSS 를 반응 용액에 첨가하고, 이어서 우선 37℃ 에서 30 분 동안 혼합한 다음, 실온에서 2 시간 동안 혼합하여, mPEG10 ,000-G-CSF 컨쥬게이트 용액을 형성하였다.
mPEG10 ,000-G-CSF 컨쥬게이트 용액을 SDS-PAGE 및 RP-HPLC 에 의해 특징화하였다. PEG화 반응은 수율 36% 의 mPEG10 ,000-G-CSF 컨쥬게이트 (G-CSF 의 시스테인 잔기의 모노PEG화 컨쥬게이트) 로 결정되었다. 양이온-교환 크로마토그래피를 사용해 컨쥬게이트를 정제하였다.
다른 분자량을 갖는 mPEG-4C-OPSS 시약을 사용하여 기타 컨쥬게이트로 제조하는데 동일한 접근을 사용할 수 있다.
하기 실시예 8 - 10 은 상대적으로 저분자량의 중합체성 시약 (도식에서 PEGB) 을 우선 공액되는 부분 (A) 에 결합시키고, 이어서 고분자량 중합체성 시약 (도식에서 PEGA) 을, 저분자량 시약의 공액 부분에의 결합으로부터 형성된 컨쥬게이트의 중합체성 부분에 결합시키는 접근 (하기에서 도식적으로 예시됨) 을 사용한다. 이러한 접근을 사용하여, 방해 위치를 효율적으로 개질시키는 것이 가능하다. 하기 실시예에서, 방해 위치는 G-CSF 의 부분적으로 묻혀진 자유 티올-함유 시스테인 잔기이다.
Figure 112007045123905-PCT00013
실시예 8a
PEG 2000 -디-((CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ) 및 mPEG 2000 - 부탄디올로의 G- CSF 의 PEG 화
Figure 112007045123905-PCT00014
PEG2000-디-((CH2)4-오르토피리딜 디술피드) (PEG2000-디-(4C-OPSS))
Figure 112007045123905-PCT00015
mPEG2000-부탄디올 (mPEG20K-4C-SH)
본 실시예에서, 이작용성 PEG-디-(4C-OPSS) 시약을 디술피드 연결을 통해 입체 방해 자유 티올로 삽입하고, 이어서 mPEG20K-부탄티올을 추가의 디술피드 연결을 통해 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 시약의 자유 잔기에 커플링하였다.
아르곤 하에 -20℃ 에서 저장된 실시예 2 에서 제조된 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 를 주위 온도로 되게 데웠다. 시약의 50-배 초과량 (스톡 G-CSF 용액의 측정 분획 내의 G-CSF 의 양에 대해) 을 DMSO 중에 용해시켜, 10% 용액을 형성하였다. 10% 시약 용액을 스톡 G-CSF 용액 (나트륨 포스페이트 완충용액 중 0.4 mg/ml, pH 7.0) 의 분획에 빨리 첨가하고, 잘 혼합하였다. 반응 용액을 RotoMix (Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) 상에 놓고, 37℃ 에서 1 시간 동안, 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 혼합되도록 놔두었다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 나트륨 포스페이트 완충용액, pH 7.0 에 대해 투석하여, 과량의 자유 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 를 제거하였다.
다음, 실시예 4B 에서 제조된 바와 같은 mPEG20 ,000-부탄티올 50-배 초과량 (G-CSF 와 비교) 을 중간체 컨쥬게이트의 투석된 용액에 첨가하고, 이어서 실온에서 1 시간 동안 혼합한 다음, 4℃ 에서 밤새 혼합하여, mPEG20 ,000-PEG2 ,000-GCSF 컨쥬게이트를 형성하였다. 생성물을 SDS-PAGE 및 RP-HPLC 에 의해 특징화하였다.
상기 접근은 PEG-디-(4C-OPSS) 및 다른 분자량을 갖는 mPEG-4C-SH 를 사용하여, 다른 컨쥬게이트를 제조하는데 사용될 수 있으며, 또 여기서 PEG-디-(4C-OPSS) 시약은 바람직하게는 상대적으로 저분자량의 것이다.
실시예 8b
PEG 2000 -디-((CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ) 및 mPEG - 30,000 - 부탄티올로의 G- CSF 의 PEG 화
상응하는 양의 PEG2000-디-((CH2)4-오르토피리딜 디술피드) 및 mPEG30 ,000-부탄티올을 사용하여 실시예 8a 의 과정을 반복하여, 상응하는 mPEG30 ,000-PEG2 ,000-GCSF 컨쥬게이트를 수득하였다.
기타 컨쥬게이트는 PEG-디-(4C-OPSS) 및 다른 분자량을 갖는 mPEG-4C-SH 를 사용하여 유사하게 제조될 수 있다.
하기 실시예 9 - 10 은 실시예 9 의 저분자량 PEG 종이 본 발명의 4-탄소 친수성 연결기를 함유하는 점에서 서로 상이하고, 한편 실시예 10 의 것은 2-탄소 연결기만을 함유한다. 본 발명의 연결기는 유의하게 더 큰 수율의 컨쥬게이트를 제공하는 것으로 볼 수 있다.
실시예 9
G- CSF 의 PEG 2000 -디-((CH2 ) 4 - 오르토피리딜 디술피드 ) 및 분지형 PEG2 40 ,000 - 티올로의 PEG 화
Figure 112007045123905-PCT00016
PEG2000-디-((CH2)4-오르토피리딜 디술피드)
Figure 112007045123905-PCT00017
PEG240 ,000-티올
또, 상기 실시예는 상대적으로 소분자량 (본 실시예에서, PEG2000-디-(4C-OPSS)) 을 갖는 중합체성 시약의 G-CSF 부분에의 처음의 결합, 및 이어서 또다른 디술피드 연결을 통한 상대적으로 고분자량 중합체성 시약 (본 실시예에서, 분지형 PEG240,000-티올) 의 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 시약의 잔기에의 결합을 포함하는 접근을 사용한다.
아르곤 하에 -20℃ 에서 저장된 실시예 2 에서 제조된 바와 같은 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 를 주변 온도로까지 데웠다. 50-배 초과 (스톡 G-CSF 용액의 측정된 분획 중의 G-CSF 의 양) 의 데워진 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 를 DMSO 중에 용해시켜, 10% 시약 용액을 형성하였다. 10% 시약 용액을 스톡 G-CSF 용액 (나트륨 포스페이트 완충용액 중의 0.4 mg/ml, pH 7.0) 의 분획에 빨리 첨가하고, 잘 혼합하였다. 용액을 RotoMix (Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) 상에 놓고, 37℃ 에서 1 시간 동안, 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 혼합되도록 놔두었다. 반 응이 완료된 후, 반응 용액을 나트륨 포스페이트 완충용액, pH 7.0 에 대해 투석하여, 과량의 PEG2 ,000-디-(4C-OPSS) 를 제거하였다.
다음, 75-배 초과량 (G-CSF 에 대해) 의 PEG240 ,000-티올 (Nektar Therapeutics) 을 투석된 컨쥬게이트 용액에 첨가하고, 이어서 실온에서 3 시간 동안, 그런 다음 4℃ 에서 밤새 혼합하여, PEG240 ,000-PEG2 ,000-G-CSF 컨쥬게이트를 형성하였다. 컨쥬게이트를 SDS-PAGE 및 RP-HPLC 에 의해 특징화하였다. 수득된 컨쥬게이트의 최종 수율은 35% 였다.
실시예 10 (비교)
G- CSF 의 , PEG 2000 -디-((CH2 ) 2 - 오르토피리딜 디술피드 ) 및 PEG2 40 ,000 - 티올로의 PEG화 반응
Figure 112007045123905-PCT00018
PEG2000-디-((CH2)2-오르토피리딜 디술피드)
Figure 112007045123905-PCT00019
PEG240 ,000-티올
4-탄소 연결기보다는 2-탄소를 갖는 저분자량 PEG 티올 시약을 사용하여, 실시예 10 의 반응 과정을 원래 중복하였다.
따라서, 아르곤 하에 -20℃ 에서 저장된 Nektar Therapeutics 사의 PEG2 ,000-디-(2C-OPSS) 를 주변 온도로까지 데웠다. 50-배 초과량 (스톡 G-CSF 용액의 측정 분획 중 G-CSF 양에 대해) 의 시약을 DMSO 중에 용해시켜, 10% 용액을 형성하였다. 상기 용액을 스톡 G-CSF 용액 (나트륨 포스페이트 완충용액, pH 7.0 중 0.4 mg/ml) 의 분획에 빨리 첨가하고, 잘 혼합하였다. 반응 용액을 RotoMix (Type 48200, Thermolyne, Dubuque IA) 상에 놓고, 37℃ 에서 1 시간 동안, 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 혼합되도록 놔두었다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 나트륨 포스페이트 완충용액, pH 7.0 에 대해 투석하여, 과량의 PEG2 ,000-디-(2C-OPSS) 를 제거하였다.
70-배 초과량 (G-CSF 에 대해) 의 분지형 PEG240 ,000-티올 (Nektar Therapeutics) 을 투석된 컨쥬게이트 용액에 첨가하고, 이어서 실온에서 3 시간 동안 그리고 4℃ 에서 밤새 교반하였다. 그러나, SDS-PAGE 및 RP-HPLC 분석은 검출가능한 양의 목적하는 PEG240 ,000-PEG2 ,000-G-CSF 컨쥬게이트를 보여주지 않았다.
증거는, 에틸렌 (C2)-연결 PEG-OPSS 시약이, 표적 단백질과 반응하기 전에 시약을 효과적으로 파괴하기 위한 환원 절단을 수행함을 제시한다. 부틸렌 (C4)-연결 시약은 상기 절단에 대해 더욱 안정하고, 그로 인해 컨쥬게이트를 훨씬 더 높은 수율로 수득하게 된다.
실시예 11
mPEG 5000 - CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH ( CH 3 )- 오르토피리딜 디술피드 ( mPEG -(α- 메틸 )4C- OPSS , 5 KDa ) 의 제조
Figure 112007045123905-PCT00020
1- 메틸 -4- 브로모 -1- 부탄올
Figure 112007045123905-PCT00021
2-메틸테트라히드로푸란 (10.14 g, 0.0834 mol) 을 클로로포름 (72 ml) 중에 용해시키고, 테트라에틸암모늄 브로마이드 (18.4 g, 0.0876 mol) 를 첨가하였다. 다음, 보론 트리플루오리드-디에틸 에테레이트 (11.12 ml, 0.0876 mol) 를 15 분에 걸쳐 적가하고, 상기 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 0 - 5℃ 로 냉각시키고, 포화 수성 NaHCO3 (80 ml) 로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 물 (80 ml) 및 포화 수성 NaCl (80 ml) 로 세척하고, 무수 Na2SO4 로 건조시켰다. 용매를 증류에 의해 제거하여, 담황색 점성 액체 9.5 g 을 수득하였다.
NMR (d6-DMSO): 1.04 ppm (d, -CH3-, 3H), 1.43 ppm (b, -CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 1.84 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 3.53 ppm (t, -CH2Br, 2H), 3.60 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-OH, 1H), 4.41 ppm (bs, -OH, IH).
1- 브로모 -4- 메틸 -4- 벤질옥시부탄
Figure 112007045123905-PCT00022
0℃ 로 냉각된 무수 시클로헥산 (100 ml) 및 무수 디클로로메탄 (50 ml) 의 혼합물 중의 1-메틸-4-브로모-1-부탄올 (9.0 g, 0.05384 mol) 및 벤질 2,2,2-트리클로로아세티미데이트 (16.3 g) 의 용액에, 트리플루오로메탄술폰산 (1.0 ml) 을 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 여과하고, NaHCO3 (250 ml) 및 탈이온수 (250 ml) 의 포화 용액으로 세척하고, 무수 Na2SO4 로 건조시켰다. 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물 (9.2 g) 을 진공 증류시켜, 무색 점성 액체 7.2 g 을 수득하였다.
NMR (d6-DMSO): 1.14 ppm (d, -CH3-, 3H), 1.57 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-0H, 2H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 3.53 ppm (bm, -CH2Br, 2H 및 -CH2-CH(CH3)-OH, 1H), 4.46 ppm (m, -CH2-벤질, 2H), 7.32 ppm (m, C6H5-, 벤질, 5H).
mPEG 500 0 -4- 메틸 -4- 벤질옥시부탄
Figure 112007045123905-PCT00023
무수 톨루엔 (200 ml) 중의 mPEG5000 (20.0 g, 0.004 mole) (NOF Corporation) 의 공비 건조된 용액에, tert-부탄올 (16.0 ml, 0.0160 mole) 및 1-브로모-4-메틸-4-벤질옥시부탄 (3.10 g, 0.012 mole) 중의 칼륨 tert-부톡시드 1.0 M 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 질소 하에 70℃ 에서 20 시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물을 여과하고, 진공 하에 농축시켜 건조시켰다. 조 생성물을 디클로로메탄 30 ml 중에 용해시키고, 0 - 5℃ 에서 이소프로판올 500 ml 로 침전시켰다. 최종 생성물을 진공 여과를 통해 수합하고, 진공 하에 밤새 건조시켰다. 수율: 17.4 g.
NMR (d6-DMSO): 1.14 ppm (d, -CH3, 3H), 1.57 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.46 ppm (m, -CH2-벤질, 2H), 7.32 ppm (m, C6H5-, 벤질, 5H).
mPEG 5000 -4- 메틸 -4- 부탄올
Figure 112007045123905-PCT00024
mPEG5000-4-메틸-4-벤질옥시부탄 (15.0 g, 0.00300 mole), 에틸 알콜 (150 ml), 및 팔라듐 (활성 탄소 상 10%, 1.5 g) 의 혼합물을 45 psi 의 수소 하에 밤새 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 조 생성물을 디클로로메탄 (25 ml) 중에 용해시키고, 0 - 5℃ 에서 400 ml 이소프로필 알콜로 침전시켰다. 생성물을 여과제거하고, 감압 하에 건조시켰다. 수율 : 13.1 g.
NMR (d6-DMSO): 1.14 ppm (d, -CH3, 3H), 1.57 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-OH, 2H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3) OH, 2H), 3.24 ppm (s, - OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.45 ppm (bs, -OH, 1H).
mPEG 5000 -4- 메틸 -4- 메탄술포닐부탄
톨루엔 (100 ml) 중 mPEG5000-4-메틸-4-부탄올 (1O.Og, 0.0020 mole) 의 용액을 감압 하에 톨루엔을 증류제거함으로써 공비 건조시켰다. 건조된 mPEG5000-4-메틸-4-부탄올을 무수 톨루엔 (100 ml) 및 무수 디클로로메탄 (20 ml) 의 혼합물 중에 용해시켰다. 트리에틸아민 (0.9 ml, 0.0030 mole) 및 메탄술포닐 클로라이드 (0.45 ml, 0.0026 mole) 를 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (15 ml) 중에 용해시키고, 250 ml 이소프로필 알콜을 첨가하였다. 침전된 생성물을 여과하고, 진공 하에 건조시켜, 백색 고체 분말 8.9 g 을 수득하였다.
NMR (d6-DMSO): 1.40 ppm (d, -CH3, 3H), 1.57 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-메실레이트, 2H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-메실레이트, 2H), 3.17 ppm (s, -CH3, 메실레이트, 3H), 3.24 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.51 ppm (s, 중합체 골격), 4.00 ppm (m, -CH-메실레이트, IH).
mPEG 5000 -4- 메틸 -4- 부탄티올
Figure 112007045123905-PCT00025
무수 에틸 알콜 (80 ml) 중의 mPEG5000-4-메틸-4-메탄술포닐부탄 (8.0 g, 0.0016 mol) 의 용액에, 티오우레아 (1.24 g, 0.0163 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 78℃ 에서 밤새 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 1% 수성 NaOH (84 ml) 중에 용해시켰다. 상기 용액을 아르곤 하에 85℃ 에서 2.5 시간 동안 가열하였다. 용액을 35℃ 로 냉각시킨 후, 10% 인산으로 pH 를 3 으로 맞추었다. NaCl (24 g) 을 첨가하고, 생성물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 추출물을 무수 나트륨 술페이트로 건조시키고, 생성물을 냉 에틸 에테르로 침전시켰다. 수율 7.3 g.
NMR (CDCl3): 1.24 ppm (d, -CH3, 3H), 1.38 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-SH, 2H), 1.54 ppm (d, -CH-SH, 1H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-SH, 2H), 2.83 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-SH, 1H), 2.05 ppm (m, -CH2-CH(CH3)-S-S-CH(CH3)-CH2-, 4H, 0.7 몰%), 3.38 ppm (s, -OCH3-, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격).
상기 NMR 데이타는, 생성물이 티올기의 산화에 의해 형성된 디술피드-연결 이량체를 매우 소량 (NMR 에 의해 0.7 몰%) 으로 함유함을 가리켰다. 추가의 티올 정제는 필요하지 않았다.
mPEG5000 - CH 2 - CH 2 - CH 2 - CH ( CH 3 )- OPSS
Figure 112007045123905-PCT00026
무수 메틸 알콜 (40 ml) 중 mPEG5000-4-메틸-4-부탄티올 (2.0 g, 0.0004 mol) 의 용액에, 2,2'-디피리딜 디술피드 (0.18 g, 0.00082 mol) 를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 하에 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. 상기 용매를 감압 하에 증류에 의해 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄 (5 ml) 중에 용해시키고, 생성물을 냉 에틸 에테르 50 ml 로 침전시켰다. 수율 1.7 g.
NMR (CDCl3): 1.34 ppm (d, -CH3, 3H), 1.68 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-SH, 2H), 1.88 ppm (m, -CH2-CH2-CH(CH3)-SH, 2H), 3.38 ppm (s, -OCH3, 3H), 3.64 ppm (s, PEG 골격), 7.12, 7.68, 7.75, & 8.47 ppm (4 m, 피리딜 양성자, 4H).

Claims (92)

  1. 하기 구조를 포함하는 수용성 중합체성 시약 :
    POLY-[Y-S-W]x
    [식 중 :
    POLY 는 수용성 중합체이고 ;
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 4 개 이상의 탄소 원자를 함유하는 2 가 연결기이고 ;
    S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
    S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체이고 ;
    x 는 1 내지 25 이고 ;
    POLY 의 분자량은, POLY 가 선형 폴리에틸렌 글리콜이고, x = 1 이고, Y 가 선형 알킬쇄일 때, 500 이상임].
  2. 제 1 항에 있어서, Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 가지는 시약.
  3. 제 1 항에 있어서, x 가 1 또는 2 인 시약.
  4. 제 1 항에 있어서, POLY 가 폴리에틸렌 글리콜인 시약.
  5. 제 1 항에 있어서, S-W 가 티올-반응성 티올 유도체인 시약.
  6. 제 5 항에 있어서, S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 148 내지 약 100,000 달톤이고, 선형, 분지형, 포크형, 및 다중팔형 (multiarm) 으로부터 선택되는 형태를 가지는 시약.
  8. 제 1 항에 있어서, Y 가 C4-C8 알킬렌, C5-C8 시클로알킬렌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약.
  9. 제 2 항에 있어서, n 이 3 내지 6 이고, R1 및 R2 의 각각이 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되는 시약.
  10. 제 2 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소 (상기 황 원자에 인접한 탄소 상의 R1 은 제외, 상기 R1 은 저급 알킬) 인 시약.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 저급 알킬이 메틸 또는 에틸인 시약.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 저급 알킬이 메틸인 시약.
  13. 제 2 항에 있어서, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어, 시클로알킬 또는 아릴기를 형성하는 시약.
  14. 제 13 항에 있어서, Y 가 시클로펜틸 또는 시클로헥실기를 포함하는 시약.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 비-방해 치환체가 C3-C6 시클로알킬, 할로, 시아노, 저급 알콕시, 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약.
  16. 하기 구조를 포함하는 수용성 중합체성 시약 :
    PEG-[Y-S-W]x
    [식 중 :
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 8 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
    S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
    S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체이고 ;
    x 는 1 내지 25 이고 ;
    PEG 의 분자량은, PEG 가 선형이고, x 가 1 이고, Y 가 선형 알킬쇄일 때, 500 이상임].
  17. 제 16 항에 있어서, Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 가지는 시약.
  18. 제 16 항에 있어서, x 가 1 또는 2 인 시약.
  19. 제 16 항에 있어서, S-W 가 티올-반응성 티올 유도체인 시약.
  20. 제 19 항에 있어서, S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 148 내지 약 100,000 달톤이고, 선형, 분지형, 포크형, 및 다중팔형으로부터 선택되는 형태를 가지는 시약.
  22. 제 16 항에 있어서, Y 가 C3-C8 알킬렌, C5-C8 시클로알킬렌, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 시약.
  23. 제 17 항에 있어서, n 이 3 내지 6 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되는 시약.
  24. 제 17 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소 (상기 황 원자에 인접한 탄소 상의 R1 은 제외, 상기 R1 은 저급 알킬) 인 시약.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 저급 알킬이 메틸 또는 에틸인 시약.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 저급 알킬이 메틸인 시약.
  27. 제 26 항에 있어서, x 가 1 또는 2 이고, n 이 4 이고, S-W 가 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  28. 제 27 항에 있어서, x 가 1 이고, PEG 가 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 인 시약.
  29. 제 27 항에 있어서, x 가 2 인 시약.
  30. 제 28 항에 있어서, S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  31. 제 29 항에 있어서, S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  32. 제 23 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소인 시약.
  33. 제 32 항에 있어서, x 가 1 또는 2 이고, n 이 4 이고, S-W 가 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  34. 제 33 항에 있어서, x 가 1 이고, PEG 가 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 인 시약.
  35. 제 33 항에 있어서, x 가 2 인 시약.
  36. 제 34 항에 있어서, -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  37. 제 35 항에 있어서, -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  38. 제 16 항에 있어서, x 가 1 또는 2 이고, Y 가 -(CH2CH2CH(CH3))- 이고, S-W 가 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  39. 제 38 항에 있어서, x 가 1 이고, PEG 가 메톡시-말단 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG) 인 시약.
  40. 제 38 항에 있어서, x 가 2 인 시약.
  41. 제 39 항에 있어서, -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  42. 제 40 항에 있어서, -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  43. 제 16 항에 있어서, x 가 1 이고, Y 가 -(CH2)4- 이고, -S-W 가 SH 또는 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 이고, PEG 가 하기 구조로 종결되는 시약 :
    Figure 112007045123905-PCT00027
    .
  44. 제 43 항에 있어서, -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  45. 제 43 항에 있어서, PEG 의 분자량이 약 500 Da 이하인 시약.
  46. 제 45 항에 있어서, PEG 의 분자량이 약 200 Da 이하인 시약.
  47. 제 43 항에 있어서, 나타내어진 말단 구조의 각각의 mPEG 의 분자량이 약 5 KDa 내지 약 20 KDa 인 시약.
  48. 하기 구조를 포함하는 수용성 중합체 시약 :
    POLY-[Y-S-W]x
    [식 중 :
    POLY 는 수용성 중합체이고 ;
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진, 4 개 이상의 탄소 원자를 함유하는 2 가 연결기이고 ;
    S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
    x 는 2 내지 25 이고 ;
    S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
  49. 제 48 항에 있어서, 각각의 Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 저급 알킬로부터 선택됨) 을 가지는 선형 또는 분지 알킬렌인 시약.
  50. 제 49 항에 있어서, n 이 3 내지 8 인 시약.
  51. 제 49 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소인 시약.
  52. 제 49 항에 있어서, 하나 이상의 Y 에 대해서, R1 및 R2 의 각각이 수소 (상기 황 원자에 인접한 R1 은 제외, 상기 R1 은 저급 알킬) 인 시약.
  53. 제 52 항에 있어서, x 가 2 인 시약.
  54. 하기 구조를 포함하는 수용성 중합체 시약 :
    PEG-[Y-S-W]x
    [식 중 :
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
    S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 황 원자이고 ;
    x 는 2 내지 25 이고 ;
    S-W 는 티올, 보호된 티올, 또는 티올-반응성 티올 유도체임].
  55. 제 54 항에 있어서, x 가 2 인 시약.
  56. 제 54 항에 있어서, 각각의 Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 저급 알킬 및 저급 알케닐로부터 선택됨) 인 시약.
  57. 제 56 항에 있어서, n 이 3 내지 8 인 시약.
  58. 제 57 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되는 시약.
  59. 제 58 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소인 시약.
  60. 제 56 항에 있어서, 하나 이상의 Y 에 대해서, R1 및 R2 의 각각이 수소 (상기 황 원자에 인접한 R1 은 제외, 상기 R1 은 저급 알킬) 인 시약.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 저급 알킬이 메틸 또는 에틸인 시약.
  62. 제 59 항에 있어서, n 이 각각의 Y 에 대해 4 인 시약.
  63. 제 59 항에 있어서, 각각의 -S-W 가 오르토-피리딜 디술피드 (OPSS) 인 시약.
  64. 제 63 항에 있어서, PEG 의 분자량의 범위가 1000 내지 5000 Da 인 시약.
  65. 하기 구조를 포함하는 중합체 컨쥬게이트 :
    POLY-[Y-S-S-A]x
    [식 중 :
    POLY 는 수용성 중합체이고 ;
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원 자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 을 갖는 연결기이고 ;
    S-S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합된 디술피드기이고 ;
    A 는 약리학적으로 활성인 분자의 공유 연결 잔기이고 ;
    x 는 1 내지 25 임].
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 컨쥬게이트가 수용성인 컨쥬게이트.
  67. 제 65 항에 있어서, Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택됨) 인 컨쥬게이트.
  68. 제 67 항에 있어서, n 이 3 내지 8 인 컨쥬게이트.
  69. 제 66 항에 있어서, x 가 1 또는 2 인 컨쥬게이트.
  70. 제 66 항에 있어서, Y 가 4 개 이상의 탄소 원자를 갖는 컨쥬게이트.
  71. 제 65 항에 있어서, POLY 가 폴리에틸렌 글리콜인 컨쥬게이트.
  72. 제 71 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌 글리콜의 분자량이 148 내지 약 100,000 달톤이고, 형태가 선형, 분지형, 포크형, 및 다중팔형으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  73. 제 66 항에 있어서, Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 저급 알케닐로부터 선택됨) 을 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌인 컨쥬게이트.
  74. 제 73 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 독립적으로 수소 및 메틸로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  75. 제 74 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소인 컨쥬게이트.
  76. 제 73 항에 있어서, R1 및 R2 의 각각이 수소 (상기 황 원자에 인접한 R1 은 제외, 상기 R1 은 저급 알킬) 인 컨쥬게이트.
  77. 제 66 항에 있어서, Y 가 -(CR1R2)n- 이고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 는 연결되어서, 시클로알킬 또는 아릴기를 형성하는 컨쥬게이트.
  78. 제 65 항에 있어서, 상기 분자가 비공액 형태 중의 반응성 티올기를 갖고, 단백질, 펩티드, 및 소분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 컨쥬게이트.
  79. 제 65 항에 있어서, 구조 : A-S-S-Y-POLY-Y-S-S-A 를 포함하는 컨쥬게이트.
  80. 제 79 항에 있어서, Y 기들이 동일한 컨쥬게이트.
  81. 제 65 항에 있어서, 약학적 부형제와 조합된 컨쥬게이트.
  82. 제 81 항에 있어서, 상기 부형제가 수성 담체인 컨쥬게이트.
  83. 하기 구조를 포함하는 중합체 컨쥬게이트 :
    POLYA-L-S-S-Y-POLYB-Y-S-S-A
    [식 중 :
    POLYA 및 POLYB 의 각각은 수용성 중합체 분절이고, 여기서 POLYB 의 분자량 은 10 KDa 이하이고, POLYA 및 POLYB 의 분자량의 합은 3 KDa 이상이고 ;
    각각의 Y 는 독립적으로 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 상으로 3 내지 10 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지고, 여기서 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어, 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
    L 은 연결기이고 ;
    각각의 S-S 는 인접 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합된 디술피드기이고 ;
    A 는 약리학적으로 활성인 분자의 공유 결합 잔기임].
  84. 제 83 항에 있어서, 각각의 Y 가 독립적으로 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 10 이고, R1 및 R2 의 각각이 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 및 비-방해 치환체로부터 선택되고, 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 기 R1 및 R2 가 연결되어, 시클로알킬 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 인 컨쥬게이트.
  85. 제 84 항에 있어서, n 이 3 내지 8 인 컨쥬게이트.
  86. 제 83 항에 있어서, POLYA 의 분자량이 5 KDa 이상인 컨쥬게이트.
  87. 제 84 항에 있어서, 2 개의 Y 기가 동일한 컨쥬게이트.
  88. 제 84 항에 있어서, 각각의 Y 가 화학식 -(CR1R2)n- (여기서, n 은 3 내지 8 이고, R1 및 R2 의 각각은 독립적으로 수소 및 저급 알킬로부터 선택됨) 을 갖는 선형 또는 분지형 알킬렌인 컨쥬게이트.
  89. 약학적으로 허용가능한 담체 내의 하기 구조를 포함하는 컨쥬게이트를 개체에 투여하는 것을 포함하는, 약리학적으로 활성인 분자를 개체에 전달하는 방법 :
    POLY-[Y-S-S-A]x
    [식 중 :
    POLY 는 수용성 중합체이고 ;
    Y 는 포화 또는 불포화 탄화수소 골격 (길이 면에서 3 내지 10 개의 탄소 원자이고, 수소, 저급 알킬, 저급 알케닐, 및 본원에서 정의된 바와 같은 비-방해 치환체로부터 독립적으로 선택되는 치환체를 가지며, 여기서, 골격의 상이한 탄소 원자 상의 2 개의 상기 알킬 및/또는 알케닐 치환체는 연결되어서 시클로알킬, 시클로알케닐, 또는 아릴기를 형성할 수 있음) 으로 이루어진 2 가 연결기이고 ;
    S-S 는 Y 의 sp3 혼성화된 탄소에 결합되는 디술피드기이고 ;
    x 는 1 내지 25 이고 ;
    A 는 상기 약리학적으로 활성인 분자의 공유 연결 잔기이고 ; 여기서 상기 분자는 비공액 형태의 반응성 티올기를 가짐].
  90. 제 89 항에 있어서, x 가 1 또는 2 인 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, POLY 가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 인 방법.
  92. 제 90 항에 있어서, 상기 담체가 수성 담체인 방법.
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