KR20070007055A

KR20070007055A - Ｔｇｆ-베타 억제제를 이용한 악성 신경교종의 치료법

Info

Publication number: KR20070007055A
Application number: KR1020067014933A
Authority: KR
Inventors: 미하엘 벨러; 선디프 두가르; 린다 에스 히긴스; 데이비드 와이 리우; 죠지 에프 슈라이너; 사르바지트 차크라바티
Original assignee: 사이오스 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2007-01-12
Also published as: CA2551524A1; US20050245508A1; RU2006122519A; EP1708712A1; BRPI0417213A; AU2004312049A1; WO2005065691A1; JP2007517046A; CN1921864A; MXPA06008157A

Abstract

본 발명은 I형 TGF-β 수용체(TGFβ-R1)에 우선적으로 결합하는 분자를 포함하는, TGF-β, TGF-β 신호전달 경로의 억제제를 투여하여 악성 신경교종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 당해 억제제는 퀴나졸린 유도체를 포함하는 비-펩타이드 소분자이다. 본 발명은 또한 신경교종 세포 또는 조직을 생체내 또는 시험관내에서 TGF-β의 억제제와 접촉시킴을 포함하여, 신경교종 세포에 대한 TGF-β-매개된 효과를 역전시켜 이들 세포가 신호전달 및 다른 면역세포에 대해 덜 굴성이도록 만든다.

TGF-β 억제제, 신경교종, I형 TGF-β 수용체, 퀴나졸린 유도체, 비-펩타이드 소분자

Description

ＴＧＦ-베타 억제제를 이용한 악성 신경교종의 치료법{Treatment of malignant gliomas with TGF-beta inhibitors}

본 발명은 전환 성장 인자-β(transforming growth factor-β; TGF-β) 억제제를 사용하여 TGF-β 신호전달과 관련된 신경교모세포종 및 기타 악성 신경교종을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 1형 TGF-β 수용체(TGFβ-R1)에 특이적으로 결합하는 TGF-β 억제제를 투여하여 이러한 질환들 및 관련 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.

전환 성장 인자-베타(TGF-β)는 세포 성장 및 분화, 배아 발달, 골 발달, 세포외 매트릭스 형성, 조혈작용, 면역반응 및 염증 반응의 다면발현성 조절인자인 단백질 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β 3의 계열을 지칭한다[참조: Roberts and Sporn Handbook of Experimental Pharmacology (1990) 95: 419-58; Massague et al. Ann Rev Cell Biol (1990) 6:597-646]. 상기 상과계열(superfamily)의 다른 구성원에는 액틴, 인히빈, 골 형성 단백질(bone morphogenic protein) 및 뮬레니안(Mullerian) 억제 물질이 포함된다. TGF-β는 세포내 신호전달 경로를 개시하 여, 궁극적으로 세포주기를 조절하거나, 증식반응을 제어하거나, 외부-내부(out-in) 세포 신호전달, 세포 부착, 이동 및 세포내 상호교통을 매개하는 세포외 매트릭스 단백질과 관련되는 유전자의 발현을 유도한다. TGF-β는 발암과정의 초기단계에서는 종양 억제인자로서 작용하지만, 후기 단계에서는 악성 증식을 촉진한다고 공지되어 있다[참조: Cui et al., Cell (1996) 86: 531-542].

TGF-β는 전사 조절인자의 Smad 계열을 통해서 신호를 전달하는, 세포내 세린-트레오닌 키나제 도메인을 갖는 1형 및 2형 단일 트랜스막 수용체(수용체 서브유닛으로도 언급됨)를 포함하는 수용체 시스템을 통해서 생물학적 활성을 발휘한다. II형 수용체의 세포외 도메인에 TGF-β이 결합하면 II형 수용체(TGFβ-R2)에 의해 I형 수용체(TGFβ-R1)의 인산화 및 활성화가 유도된다. 활성화된 TGFβ-R1는 수용체-관련된 공동 전사 인자 Smad2/Smad3를 인산화시킴으로써 이 전사 인자를 활성화시키고, 이때 이 전사 인자는 세포질내 Smad4에 결합한다. Smad 복합체는 핵으로 전위되어 Fast-1과 같은 DNA-결합 보조인자와 결합하고, 특정 유전자들의 인핸서 및 억제인자 영역에 결합하여 전사를 조절한다. 이들 유전자가 발현되면 증식반응을 제어하는 세포주기 조절인자, 또는 외부-내부(out-in) 세포 신호전달, 세포 부착, 이동 및 세포내 상호교통을 매개하는 세포외 매트릭스 단백질의 합성이 유도된다. MAP 키나제-ERK 연쇄증폭반응(cascade)과 같은 기타 신호전달 경로도 또한 TGF-β 신호전달에 의해 활성화된다[참조: Whitman, Genes Dev. 12: 2445-62 (1998); and Miyazono et al., Adv. Immunol. (2000) 75:111-57, 이는 명백하게 본원에서 참조로 인용된다]. TGF-β 신호전달 경로에 관한 추가의 정보는 예를 들 어, 다음 문헌에서 찾아볼 수 있다[참조: Attisano et al., "Signal transduction by the TGF-β super-family" Science 296:1646-7 (2002); Bottinger and Bitzer, "TGF-β signaling in renal disease" Am. Soc. Nephrol. 13:2600-2610 (2002); Topper, J.N., "TGF-β in the cardiovascular system: molecular mechanisms of a context-speciic growth factor" Trends Cardiovasc. Med. 0:132-7 (2000), review: Itoh et al., "Signaling of transforming growth factor-β family" Eur. J. Biochem. 267:6954-67 (2000), review].

신경교모세포종 사람 환자는 외과술, 방사선요법 및 니트로소우레아계 화학요법의 표준 치료법을 받은 경우 중간 생존율이 단지 1년에 불과하다[참조: Glioma Meta-analysis Trialists(GTM) Group. Chemotherapy in adult high- grade glioma: a systematic review and meta-analysis of individual patient data from 12 randomised trials. Lancet, 359: 1011-1018 (2002)]. 사람 신경교종 환자가 생체외에서 세포성 면역반응의 특정한 결핍을 나타내고[참조: Roszman et al., Immunol. Today, 12: 370-384 (1991)] 사람 신경교종 세포가 면역억제성 분자를 발현하는 암 세포의 특성에 대한 전형이 되기 때문에 면역요법은 다년간 이러한 종양에 대한 대안적 접근법으로서 조사되어 왔다. 여기에는 가용성 인자, 즉, TGF-β[참조:Fontana et al., 132: 1837-1844 (1984)]; 프로스타글란딘[참조: Fontana et al., J. Immunol., 129: 2413-2419]; IL-10[참조: Hishii et al., Neurosurgery, 37: 1160-1166 (1995)], 및 CD70[참조: Wischhusen et al., Cancer Res., 62: 2592-2599 (2002)] 또는 HLA-G[참조: Wiendl et al., J. Immunol., 168: 4772-4780 (2002)]와 같은 세포 표면 분자가 포함된다. 악성 신경교종에서의 TGF-β의 바람직하지 않은 효과는 숙주에서의 면역억제의 유도로 제한되지 않고, 이동 및 침윤에서의 TGF-β의 결정적 역할을 포함한다[참조: Wick et al., J. Neurosci., 21: 3360-3368 (2001)].

신경교모세포종의 중증도 및 장기간의 생존을 제공하는 만족스런 치료 선택권의 부족이라는 견지에서, 이러한 악질성 질환의 치료를 위한 신규한 접근법이 상당히 요구된다.

발명의 개요

본 발명은 신경교모세포종을 포함하는 악성 신경교종의 치료를 위한 신규한 치료학적 접근법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 TGF-β 신호전달 경로의 구성원의 억제제를 이용한 악성 신경교종의 치료법에 관한 것이다. 본 발명은 구체적으로 I형 TGF-β 수용체(TGFβ-R1)와 같은 TGF-β 키나제 수용체에 특이적으로 결합하는 억제제를 이용한, 신경교모세포종을 포함하는 악성 신경교종의 치료법을 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 포유동물 피험체에게 TGFβ 키나제 수용체를 억제하는 유효량의 분자를 투여함을 포함하는, 포유동물 피험체의 악성 신경교종의 치료방법에 관한 것이다.

특정한 양태에서, 당해 치료방법에서 사용되는 분자는 하기 화학식 1의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 프로드럭 형태이다.

상기 화학식 1에서,

R³은 비간섭 치환체이고,

각각의 Z는 CR² 또는 N이고, 여기서 환 A내 2개 이하의 Z 위치는 N이고, 환 A내의 2개의 인접 Z 위치는 N이 될 수 없으며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

L은 링커이며,

n은 0 또는 1이고,

Ar'은 1 내지 3개의 비간섭 치환체에 의해 임의로 치환된, 지환족, 사이클릭 헤테로지방족, 방향족 또는 헤테로방향족 잔기이다.

다른 양태에서, 본 발명의 치료법에서 사용되는 분자는 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태이다.

상기 화학식 2에서,

Y₁은 할로, 알콕시(1-6C), 알킬티오(1-6C), 알킬(1-6C), 할로알킬(1-6C), -O-(CH₂)_m-Ph, -S-(CH₂)_m-Ph, 시아노, 페닐 및 CO₂R[여기서, R은 수소 또는 알킬(1-6 C)이고, m은 0 내지 3이다]로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이거나, 5 내지 7원의 방향족 또는 비방향족 사이클릭 환(여기서, 상기 사이클릭 환은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택되는 3개 이하의 헤테로원자를 함유한다)과 융합된 페닐이고,

Y₂, Y₃, Y₄ 및 Y₅는 독립적으로 수소, 알킬(1-6C), 알콕시(1-6C), 할로알킬(1-6C), 할로, NH₂, NH-알킬(1-6C) 또는 NH(CH₂)_n-Ph(여기서, n은 0 내지 3이다)이거나; Y₂, Y₃, Y₄ 및 Y₅의 인접 쌍은 2개 이하의 질소 원자를 임의로 함유하는 융합된 6원 방향족 환[여기서, 상기 환은 알킬(1-6C), 알콕시(1-6C), 할로알킬(1-6C), 할로, NH₂, NH-알킬(1-6C) 또는 NH(CH₂)_n-Ph(여기서, n은 0 내지 3이다)로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된다]을 형성하고, Y₂, Y₃, Y₄ 및 Y₅ 중 나머지는 수소, 알킬(1-6C), 알콕시(1-6C), 할로알킬(1-6C), 할로, NH₂, NH-알킬(1-6C) 또는 NH(CH₂)_n-Ph(여기서, n은 0 내지 3이다)이고,

X₁ 및 X₂ 중 하나는 N이고, 나머지는 NR⁶(여기서, R⁶은 수소 또는 알킬(1-6C)이다.

추가의 양태에서, 본 발명의 치료 방법에서 사용된 분자는 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태이다.

상기 화학식 3에서,

Y₁은 할로, 알콕시(1-6C), 알킬티오(1-6C), 알킬(1-6C), -O-(CH₂)_m-Ph, -S-(CH₂)_m-Ph, 시아노, 페닐 및 CO₂R(여기서, R은 수소 또는 알킬(1-6C)이고, n은 0, 1, 2 또는 3이다)에 의해 임의로 치환된 나프틸, 안트라세닐 또는 페닐이거나, Y₁은 5 내지 7원의 방향족 또는 비방향족 사이클릭 환(여기서, 상기 환은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 2개 이하의 헤테로원자를 임의로 함유한다)과 융합된 페닐 환을 나타내고,

Y₂는 H, NH(CH₂)_n-Ph 또는 NH-알킬(1-6C)(여기서, n은 0, 1, 2 또는 3이다)이며,

Y₃은 CO₂H, CONH₂, CN, NO₂, 알킬티오(1-6C), -SO₂-알킬(C1-6), 알콕시(C1-6), SONH₂, CONHOH, NH₂, CHO, CH₂NH₂ 또는 CO₂R(여기서, R은 수소 또는 알킬(1-6C)이다)이고,

X₁ 및 X₂ 중 하나는 N 또는 CR'이고, 나머지는 NR' 또는 CHR'(여기서, R'은 수소, OH, 알킬(C-16) 또는 사이클로알킬(C3-7)이거나; X¹ 및 X² 중 하나가 N 또는 CR'인 경우 나머지는 S 또는 O일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 치료방법에서 사용되는 분자는 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태이다.

상기 화학식 4에서,

Ar은 5 내지 12개의 환 원을 함유하는 임의로 치환된 방향족 또는 임의로 치환된 헤테로방향족 잔기(여기서, 상기 헤테로방향족 잔기는 하나 이상의 O, S 및/ 또는 N을 함유한다)이고, 단 임의로 치환된 Ar은

(여기서, R⁵는 H, 알킬(1-6C), 알케닐(2-6C), 알키닐(2-6C), 또는 5 내지 11개의 환 원을 함유하는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기이다)이 아니며,

X는 NR¹, O 또는 S이고,

R¹은 H, 알킬(1-8C), 알케닐(2-8C) 또는 알키닐(2-8C)이며,

Z는 N 또는 CR⁴이고,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H 또는 비간섭 치환체이며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.

하나의 양태에서, n이 2를 초과하고 R²들이 인접해 있는 경우, R²들은 함께 결합하여 각각 독립적으로 O, N 또는 S일 수 있는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 7원의 비방향족, 헤테로방향족 또는 방향족 환을 형성할 수 있다.

다른 추가의 양태에서, 본 발명의 치료방법에서 사용되는 분자는 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태이다.

상기 화학식 5에서,

각각의 Z⁵, Z⁶, Z⁷ 및 Z⁸은 N 또는 CH이고, 여기서 Z⁵, Z⁶, Z⁷ 및 Z⁸ 중 1개 또는 2개는 N이며, 2개의 인접한 Z 위치는 N이 될 수 없으며,

m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 3이고,

R¹은 할로, 알킬, 알콕시 또는 알킬 할라이드이고, 여기서 2개의 인접한 R¹ 그룹들은 결합하여 5 내지 6원의 지방족 헤테로사이클릭 환을 형성할 수 있으며,

R²는 비간섭 치환체이고,

R³은 H 또는 CH₃이다.

다른 측면에서, 본 발명은 악성 신경교종과 관련된 유전자를 포함하는 세포를 당해 세포내에 존재하는 TGFβ-R1 수용체 키나제에 특이적으로 결합하는 TGF-β의 비-펩타이드 소분자 억제제와 접촉시킴을 포함하여, 악성 신경교종과 관련된 유전자에 대한 TGF-β-매개된 효과를 역전시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 당해 소분자 억제제는 화학식 1 내지 5의 화합물이다.

도 1. TGF-β 억제제(표 2의 화합물 79번)에 의한 재조합 및 신경교종 유래의 TGF-β₁ 및 TGF-β₂ 성장 억제 효과의 방지. 도 1A. CCL64 세포를 72시간 동안 증가되는 농도의 화합물 79번의 존재 또는 부재하에 사람 재조합 TGF-b₁(검은색 기호) 또는 TGF-b₂(흰색 기호)(10ng/ml)에 노출시켰다. 도 1B. CCL64 세포를 72시간 동안 화합물 79번의 존재 또는 부재하에 열-활성화된 신경교종 세포 SN을 함유하는 혈청 비함유 배지(1:1)에서 유지시켰다. 크리스탈 바이올렛 분석법으로 성장을 평가하였다(평균 및 SD, n=3).

도 2. 화합물 79번에 의한 신경교종 세포내 자가분비(autocrine) TGF-β 신호전달의 소실. 도 2A. 세포를 10⁴개 세포/웰로 96웰 플레이트에 씨딩하고 화합물 79번의 존재 또는 부재하에 48시간 동안 혈청 비함유 배지에서 배양하였다. 48시간에서의 [메틸-³H]-티미딘 혼입으로 성장을 평가하였다(*p<0.05, t-검정). 도 2B. 미처리된 신경교종 세포 또는 화합물 79번(1μM)에 24시간 동안 사전노출되었거나 TGF-β₂에 1시간 동안 노출되었거나 이들 둘다에 노출된 세포를 p-Smad2 및 전체 Smad2/3의 수준에 대해 각각 평가하였다. 항체는 각각 p-Smad2 및 전체 Smad2 및 3에 특이적임을 주지한다.

도 3. 화합물 79번에 의한 동종 항-신경교종 면역반응의 조절은 TGF-β 길 항작용을 포함한다. 도 3A. 화합물 79번의 부재(흰색 기호) 또는 존재(검은색 기호)하에, PBL(사각형) 또는 방사선 조사된 LN-308과 함께 예비항온처리한 정제된 T 세포(삼각형)의 LN-308 표적에 대한 용해 활성을 ⁵¹Cr 방출 분석법으로 측정하였다. 도 3B 내지 3D. PBL을 5일 동안 방사선 조사된 LN-308 세포의 부재(좌측) 또는 존재(우측)하에 배양하였다. 배양물은 화합물 79번(1μM)을 함유하거나(검은색 막대) 함유하지 않았다(흰색 막대). 이어서, 이들 이펙터 세포에 방사선 조사되지 않은 신선한 LN-308 세포를 24시간 동안 화합물 79번의 부재하에 접종시켰다. IFN-γ(B), TNF-α(C) 또는 IL-10(D)의 방출을 Elispot 분석법으로 분석하였다. 데이타는 5 x 10⁵개 이펙터 세포당 사이토킨-생산 세포로서 표현한다(n=3, *p<0.05, **p<0.01, t-검정, 화합물 79번의 효과). 도 3E 및 3F. 폴리클로날 NK 세포 배양물을 화합물 79번(1μM)의 부재 또는 존재하에 48시간 동안 TGF-β₁(5ng/ml)(E) 또는 희석된(1:4) 신경교종 세포 SN(F)에 노출시킨 다음, 표적으로서 LN-308을 사용한 ⁵¹Cr 방출 분석법에서 이펙터로서 사용하였다. 단독의 화합물 79번 또는 단독의 항체는 당해 분석법에서 NK 세포 활성에 효과를 미치지 않았다(데이타는 제시하지 않음).

도 4. 화합물 79번은 생체내 동계 SMA-560 실험적 신경교종의 성장을 억제하며 면역 활성화를 촉진한다. 도 4A. DM/Dk 마우스에게 5x10³개 SMA-560 세포를 두개내 주사하였다. 3일 후, 화합물 79번 처리를 개시하고, 생존율을 모니터링하 였다. 도 4B. 동물을 도 4A에서와 같이 처리하였지만, 10일째에 희생시켜 비장세포를 수득하였다. 24시간에서의 IFN-γ 방출을 Elispot로 분석하였다. 데이타는 10⁶개 이펙터 세포당 사이토킨-생산 세포로서 표현한다. 도 4C. 비장세포를 10일 동안 IL-2로 자극시켜 LAK 세포를 생성시켰다. 이의 용해 활성을 표적 세포로서 SMA-560을 사용하여 ⁵¹Cr 방출로 측정하였다(비히클, 흰색 사각형; 화합물 79번, 검은색 사각형)(*p<0.05, t-검정).

A. 정의

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌[참조: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, and Structure 4th ed., John Wiley Sons (New York, NY 1992)]은 당해 분야의 숙련가들에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어들에 대한 전반적 지침을 제공한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "악성 신경교종"은 가장 광의적 의미로 사용되며 뇌내의 신경아교세포 또는 지지세포에서 시작하는 뇌 종양을 지칭한다. 제한됨이 없이, 당해 용어는 구체적으로 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종, 희소돌기아교세포종 및 시신경 교종을 포함한다.

"신경교모세포종", "다형성 신경교모세포종" 및 "IV급 성상세포종은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 가장 광의적 의미에서 가장 흔한 형태의 뇌 종양인 악성 신경교종의 공격적 형태 뿐만 아니라 이러한 종양을 특징으로 하거나 이와 관련된 상태를 말한다. 따라서, 세포 충만성 성상세포 종양(highly cellular astrocytic tumor)과 같은 신경교모세포종은 전형적으로 핵 및 세포 다형태성, 높은 혈관 증식, 임의로 괴사를 동반한 높은 유사분열상, 현미경적 침윤성 병변, 높은 표지 지수 및 기타 이러한 진단적 척도를 특징으로 한다. 전체적 역전(정상 발현 수준으로의 전체적 회복)이 유리하나 당해 정의하에 이것이 필수적이 아님이 강조된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 악성 신경교종, 예를 들어, 신경교모세포종에 대한 "TGF-β-매개된 효과의 역전"의 언급은 어느 것이 적용되든 성상세포 또는 희소돌기아교세포 계통의 중추신경계 세포의 표준 샘플에 상대적인, 신경교종 세포주 또는 생체내 신경교종 종양, 또는 악성 신경교종(예: 신경교모세포종)과 관련된 유전자 또는 단백질의 발현에 대한 TGF-β의 효과의 부분적 또는 완전한 역전을 의미한다. 전체적 역전(예를 들어, 정상 발현 수준으로의 전체적 회복)이 유리하나 이것이 당해 정의하에서 필수적이지는 않음이 강조된다.

"치료"는 질병의 발생을 예방하거나 질병의 병리를 변경시키고자 하는 의도로 수행되는 중재이다. 따라서, "치료"는 치료학적 처치 및 예방적 또는 방지적 수단 둘다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상에는 질병을 이미 앓고 있는 대상 뿐만 아니라 질병이 예방되어야 하는 대상이 포함된다. 종양(예: 신경교종 또는 신경교모세포종) 치료에서, 치료제는 종양 세포의 병리를 직접적으로 감소시킬 수 있거나 종양 세포가 다른 치료제, 예를 들어, 방사선 및/또는 방사선요법에 의한 치료에 더욱 민감해지도록 만들 수 있다. 따라서, 치료에는 제한됨이 없이, (1) 종양 성장의 둔화 및 완전한 성장 정지를 포함하는 종양 성장의 어느 정도까지의 억제; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 인접 주변 기관 및/또는 조직으로의 침윤의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (5) 전이의 억제(즉, 감소, 둔화 또는 완전한 정지); (6) 종양의 퇴행 또는 거부를 초래할 수 있지만 반드시 그렇지만은 않은, 항-종양 면역반응의 증진; (7) 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 경감; 종양 유래의 순환 TGF-β로 인한 전신 면역 억제의 경감; (8) 치료 후 생존 기간의 증가; (9) 치료 후 소정의 시점에서 감소된 사망율이 포함된다.

신경교모세포종과 같은 악성 신경교종을 포함하는 암의 "병리"는 환자의 안위를 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 이러한 현상에는 제한됨이 없이, 비정상적인 조절되지 못한 세포 성장, 전이, 주변 세포의 정상적 기능의 방해, 비정상적 수준에서의 사이토킨(예: TGF-β) 또는 기타 분비성 산물의 방출, 염증 또는 면역반응의 억제 또는 악화, 신생물, 전암, 악성종양, 주위 또는 원위 조직 또는 기관의 침입이 포함된다.

신경교모세포종의 치료와 관련하여 "치료학적 유효량"은, 예를 들어, 본 발명의 억제제가 사용되는 경우, 상기한 "치료"의 정의하에 열거한 효과 중 하나 이상을 유발할 수 있는 양을 지칭한다.

"특이적으로 결합하는", "특이적으로 결합하다", "특이적 결합"란 용어 및 이들의 문법적 동의어는 1형 TGF-β 수용체의 범주에서 TGFβ-R2 및 p38을 포함하는 임의의 다른 폴리펩타이드보다 더욱 높은 친화성으로 1형 TGF-β수용체(TGFβ-R1)에 결합함을 지칭하기 위해 사용된다. 전형적으로, 특이적 결합은 TGFβ-R1내 고유한 에피토프에 대한 결합을 의미한다. 결합은 TGFβ-R1을 통한 TGF-β 신호전달을 효과적으로 억제하는 친화성으로 일어나야 한다. 유사한 정의가 다른 제제에 대한 "특이적 결합"에 적용된다.

"폴리뉴클레오타이드"란 용어는 단수형 또는 복수형으로 사용되는 경우, 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 정의하는 바와 같은 폴리뉴클레오타이드는 제한됨이 없이, 일본쇄 및 이본쇄 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 영역을 포함하는 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 RNA 및 일본쇄 및 이본쇄 영역을 포함하는 RNA, 일본쇄 또는 보다 전형적으로 이본쇄일 수 있거나 일본쇄 및 이본쇄 영역을 포함하는 DNA와 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 RNA 또는 DNA를 포함하거나 RNA와 DNA 둘다를 포함하는 삼본쇄 영역을 지칭한다. 이러한 영역내의 쇄는 동일한 분자 또는 상이한 분자로부터 유래할 수 있다. 상기 영역은 하나 이상의 분자를 모두 포함할 수 있지만, 보다 전형적으로 이들 분자의 일부의 영역만을 포함할 수 있다. 삼중-나선 영역의 분자 중 하나는 흔히 올리고뉴클레오타이드이다. "폴리뉴클레오타이드"란 용어에는 구체적으로 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 및 RNA가 포함된다. 따라서, 안정성을 위해 또는 기타 이유로 변형된 주쇄를 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 당해 용어가 의도되는 바와 같이 "폴리뉴클레오타이드"이다. 또한, 이노신 또는 변형된 염기, 예를 들어, 삼중수소 염기와 같은 비통상적 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA는 본원에서 정의하는 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드"란 용어에 포함된다. 일반적으로, "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 변형되지 않은 폴리뉴클레오타이드의 모든 화학적으로, 효소적으로 및/또는 대사적으로 변형된 형태 뿐만 아니라, 단순 및 복합 세포를 포함하는 세포 및 바이러스 특유의 DNA 및 RNA의 화학적 형태를 모두 포괄한다.

"올리고뉴클레오타이드"란 용어는 제한됨이 없이, 일본쇄 데옥시리보뉴클레오타이드, 일본쇄 또는 이본쇄 리보뉴클레오타이드, RNA:DNA 하이브리드 및 이본쇄 DNA를 포함하는 비교적 짧은 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 일본쇄 DNA 프로브 올리고뉴클레오타이드와 같은 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어, 시판되는 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 화학적 방법으로 흔히 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드는 시험관내 재조합 DNA-매개 기법을 포함하는 다양한 기타 방법 및 세포 및 유기체내 DNA 발현에 의해 제조할 수 있다.

"차등적으로 발현되는 유전자", "차등적 유전자 발현"이란 용어 및 이의 동의어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 발현이 정상적 또는 대조 샘플에서의 발현에 비해 시험 샘플에서 낮거나 높은 수준까지 활성화되는 유전자를 지칭한다. 본 발명의 목적상, "차등적 유전자 발현"은 정상 샘플과 시험 샘플의 소정 유전자의 발현 간에 약 2.5배 이상, 바람직하게는 약 4배 이상, 보다 바람직하게는 약 6배 이상, 가장 바람직하게는 약 10배 이상 차이가 있는 경우에 존재하는 것으로 고려된다.

본원에서 사용되는 "억제제"란 용어는 천연 TGF-β 분자의 생물학적 기능을 억제하는 능력을 갖는 TGFβ-R1 수용체에 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어, 비-펩타이드 소분자를 지칭한다. 따라서, "억제제"란 용어는 TGF-β 및 이의 수용체의 생물학적 역할의 범주에서 정의된다.

본원에서 사용되는 "우선적으로 억제하다"란 용어는 "우선적으로 억제되는" 표적에 대한 억제 효과가 다른 어떤 표적에 대한 효과보다도 현저하게 큰 것을 의미한다. 따라서, p38 키나제와 비교한 TGFβ-R1 키나제의 우선적 억제의 범주에서, 당해 용어는 억제제가 TGF-β-R1 키나제에 의해 매개되는 생물학적 활성, 예를 들어, 종양의 전이 활성, 종양의 증식, 괴사를 p38 키나제에 의해 매개되는 생물학적 활성에 비해 현저하게 크게 억제함을 의미한다. 우선적으로 억제되는 수용체를 선호하여 억제 정도의 차이는 다를 수 있지만, 일반적으로 약 2배 이상, 보다 바람직하게는 약 5배 이상, 보다 더욱 바람직하게는 약 10배 이상이다.

치료 목적상 "포유동물"이란 용어는 사람, 고등 영장류, 가정용 및 농장 동물 및 동물원, 오락용 동물 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유동물로 분류된다. 바람직하게는 포유동물은 사람이다.

"두개내"는 두개골 내 또는 척수의 등쪽 말단 또는 그 부근을 의미하며 수질, 뇌간, 교뇌, 소뇌 및 대뇌를 포함한다.

외과술 또는 방사선 또는 기타 제제와 같은 하나 이상의 추가 치료학적 처치와 "조합된" 투여는 임의의 순서의 동시적(동시 발생적) 및 연속적 투여를 포함한다. 바람직한 순서 중 하나는 외과술 다음에 방사선에 이어서 화학요법이다. 화학요법은 조합 화학요법; 예를 들어 정맥내 로브스틴 또는 백금, 경구 카르무스틴, 니트로소우레아를 이용한 단일 제제 세포독성 화학요법; 비스클로로에틸니트로소우레아(BCNU); 테모졸로미드 또는 프로카르바진, CCNU, 빈크리스틴(PCV); 방사선 민감화 약물을 포함한다. 방사선 요법은 재방사선조사 및/또는 수술후 방사선 조사, 감마 나이프 또는 선형 가속기를 이용한 방사선수술, 저선량 영구적-씨드 근접 방사선치료, 고선량 정위적 근접 방사선치료를 포함한다.

본 발명의 특정한 측면에서, 본 발명의 TGF-β-R1 키나제 억제제는 예를 들어, 안티센스 전략[참조: Fakharai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2909-2914 (1996)], 푸린 계열의 TGF-β-프로세싱 프로테아제의 억제제 및 트란실라스트와 같은 기타 약물을 포함하는 IGF-β의 다른 억제제와 배합될 수 있다[참조: Platten et al., J. Cancer, 93: 53-61 (2001)]. 본 발명은 추가로 본 발명의 TGFβ-R1 억제제와, 티로신 키나제, 파르네실트랜스퍼라제 및 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함하는 다른 효소의 억제제를 이용한 조합 치료법을 포함한다. 이러한 억제제의 예로는 메탈로프로테이나제 억제제인 마리마스타트(marimastat)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "비간섭 치환체"는 본원에 제공된 화학식에 기술된 화합물이 TGF-β 활성을 억제하는 능력을 질적으로 온전한 상태로 남겨두는 치환체이다. 따라서, 이러한 치환체는 억제 정도를 변경할 수 있다. 그러나, 당해 화합물이 TGF-β 활성을 억제하는 능력을 유지하는 한 치환체는 "비간섭"으로서 분류될 것이다. 바람직하게는, "비간섭 치환체"는 그 존재가 화합물의 TGF-β억제 활성을 실질적으로 파괴하지 않는 치환체이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "하이드로카빌 잔기"는 탄소와 수소만을 함유하는 잔기이다. 당해 잔기는 지방족 또는 방향족, 직쇄, 사이클릭, 측쇄, 포화 또는 불포화될 수 있다. 하이드로카빌 잔기는, 명시되는 경우, 치환체 잔기의 탄소 및 수소 구성원 이외에 헤테로원자를 함유할 수 있다. 따라서, 이러한 헤테로원자를 함유한다고 구체적으로 언급되는 경우, 하이드로카빌 잔기는 카보닐 그룹, 아미노 그룹, 하이드록실 그룹 등을 또한 함유할 수 있거나 하이드로카빌 잔기의 "주쇄"내에 헤테로원자를 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "알킬", "알케닐" 및 "알키닐"은 직쇄 및 측쇄 및 사이클릭 1가 치환체를 포함한다. 예에는 메틸, 에틸, 이소부틸, 사이클로헥실, 사이클로펜틸에틸, 2-프로페닐, 3-부티닐 등이 포함된다. 전형적으로, 알킬, 알케닐 및 알키닐 치환체는 1-10C (알킬) 또는 2-10C(알케닐 또는 알키닐)을 함유한다. 바람직하게는, 이들 치환체는 1-6C(알킬) 또는 2-6C(알케닐 또는 알키닐)을 함유한다. 헤테로알킬, 헤테로알케닐 및 헤테로알키닐은 유사하게 정의되지만, 주쇄 잔기내에 1 내지 2개의 O, S 또는 N 헤테로원자 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "아실"은 카보닐 그룹을 통해서 추가의 잔기에 커플링되는 알킬, 알케닐, 알키닐 및 관련 헤테로-형태의 정의를 포함한다.

"방향족" 잔기 또는 "아릴" 잔기는 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭 자기, 예를 들어, 페닐 또는 나프틸을 지칭하고, "헤테로방향족"은 O, S 및 N으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 모노사이클릭 또는 융합된 바이사이클릭 환 시스템을 지칭한다. 헤테로원자의 포함은 5원 환 뿐만 아니라 6원 환의 포함을 가능하게 한다. 따라서, 전형적 방향족 시스템은 피리딜, 피리미딜, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴 등을 포함한다. 환 시스템 전체에 걸친 전자 분포 측면에서 방향족 특징을 갖는 모든 모노사이클릭 또는 융합된 환 바이사이클릭 시스템이 당해 정의에 포함된다. 전형적으로, 환 시스템은 5 내지 12개의 환 구성원 원자를 함유한다.

유사하게, "아릴알킬" 및 "헤테로아릴"은 치환된 또는 비치환된, 포화 또는 불포화된, 전형적으로 1-6C 또는 1-8C의 탄소 쇄 또는 이의 헤테로 형태를 포함하는 탄소 쇄를 통해 다른 잔기에 커플링되는 방향족 및 헤테로방향족 시스템을 지칭한다. 이들 탄소 쇄는 카보닐 그룹을 또한 포함함으로써 아실 또는 헤테로아실 잔기와 같은 치환체를 제공할 수 있다.

B. 본 발명의 실시 양태

본 발명의 억제제는 신경교모세포종 및 기타 악성 신경교종의 발생, 성장 또는 확산과 관련된 TGF-β 경로의 하나 이상의 구성원의 생물학적 활성을 억제함을 특징으로 한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 억제제는 TGF-β 수용체에 의해 매개되는 생물학적 반응을 억제한다. 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 억제제는 2형 TGF-β수용체-매개된 세포 증식에 영향을 미치지 않으면서 1형 TGF-β수용체에 의해 매개되는 생물학적 반응, 특히 매트릭스 생산을 선택적으로 억제한다.

또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 화합물은 p38 키나제에 비해 TGF-βR1 키나제를 우선적으로 억제한다.

본 발명의 화합물

본 발명은 적어도 부분적으로 신경교모세포종을 포함하는 신경교종이 TGF-β 신호전달 경로의 하나 이상의 구성원의 생물학적 기능을 억제함으로써 치료될 수 있다는 놀라운 발견에 근거한다. 본 발명의 억제제에는 제한됨이 없이, 소형 유기 분자, 펩타이드, 폴리펩타이드(항체 및 항체 단편을 포함), 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 유인 분자(decoy molecule) 등이 포함된다. 구체적 양태에서, 본 발명의 억제제는 일반적으로 크기가 약 1,000달톤 미만인 소형 유기 분자(비-펩타이드 소분자)이다. 바람직한 비펩타이드 소분자는 분자량이 약 750달톤 미만, 보다 바람직하게는 약 500달톤 미만, 보다 더욱 바람직하게는 약 300달톤 미만이다.

바람직한 양태에서, 당해 화합물은 하기 화학식 1의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염이다.

화학식 1

상기 화학식 1에서,

R³은 비간섭 치환체이고,

각각의 Z는 CR² 또는 N이고, 여기서 환 A내 2개 이하의 Z 위치는 N이고, 환 A내 2개의 인접 Z 위치는 N이 될 수 없으며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

L은 링커이며,

n은 0 또는 1이고,

Ar'은 1 내지 3개의 비간섭 치환체로 임의로 치환된, 지환족, 사이클릭 헤테로지방족, 방향족 또는 헤테로방향족의 잔기이다.

보다 바람직한 양태에서, 본원의 소형 유기 분자는 퀴나졸린의 2번 및 4번 위치에 상응하는 위치에 필수적 치환체를 함유하는 퀴나졸린의 유도체 및 관련 화합물이다. 본 발명의 범주내의 대안이 또한 하기에 예시되지만, 일반적으로 퀴나졸린 핵이 바람직하다. Z³의 바람직한 양태는 N 및 CH이고, Z⁵ 내지 Z⁸의 바람직한 양태는 CR²이다. 그러나, 각각의 Z⁵ 내지 Z⁸는 상기 주지된 조건부하에 N일 수도 있다. 따라서, 염기성 퀴나졸린 유형 환 시스템에서, 바람직한 양태는 퀴나졸린 자체, 및 모든 Z⁵ 내지 Z⁸ 뿐만 아니라 Z³이 N 또는 CH인 양태를 포함한다. Z³이 N이고 Z⁵ 또는 Z⁸ 중 하나 또는 Z⁵와 Z⁸ 둘다가 N이고 Z⁶ 및 Z⁷이 CH 또는 CR²인 양태가 또한 바람직하다. R²가 H가 아닌 경우, CR²가 위치 6 및/또는 7에서 발생하는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 범주내의 퀴나졸린 유도체는 추가로 치환될 수 있는 비간섭 치환체(R³)로서 2번 위치에 부착된 방향족 환을 갖는, 퀴나졸린 핵을 포함하는 화합물을 포함한다.

퀴나졸린의 4번 위치에 상응하는 위치의 치환체와 관련하여, LAr'은 존재하거나 부재하며 환 B로부터 치환체 Ar'을 2 내지 8Å, 바람직하게는 2 내지 6Å, 보다 바람직하게는 2 내지 4Å의 거리로 이격시키는 링커이다. 거리는 1 원자가의 L이 결합되어 있는 환 B의 환 탄소로부터 다른 원자가의 링커가 결합되어 있는 Ar' 사이클릭 잔기의 원자까지 측정된다. Ar' 잔기는 또한 환 B에 직접 커플링될 수 있다(즉, n이 0인 경우). 전형적이나 비제한적으로, L의 양태는 화학식 S(CR² ₂)_m, -NR¹SO₂(CR² ₂)_l, NR¹(CR² ₂)_m, NR¹CO(CR² ₂)_l, O(CR² ₂)_m, OCO(CR² ₂)_l 및

[여기서, Z는 N 또는 CH이고, m은 0 내지 4이고 l은 0 내지 3, 바람직하게는 각각 1 내지 3 및 1 내지 2이다]이다. L은 바람직하게는 환 B에 직접 커플링된 -NR¹-을 제공한다. R¹의 바람직한 양태는 H일 뿐만 아니라, R¹은 아실, 알킬, 아릴아실 또는 아릴알킬일 수 있으며, 여기서 아릴 잔기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실, 아릴, 알킬아릴, 아로일, N-아릴, NH-알킬아릴, NH-아로일, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -NRSOR, -NRSO₂R, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, -RCO, -COOR, -SO₃R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂[여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다]와 같은 1 내지 3개의 그룹에 의해 치환될 수 있고, 바람직하게는 치환체는 알킬(1-6C), OR, SR 또는 NR₂(여기서, R은 H 또는 저급 알킬(1-4C)이다)이다. 보다 바람직하게는, R¹은 H 또는 알킬(1-6C)이다. 치환체에 함유된 임의의 아릴 그룹은 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, OR, NR₂, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, -RCO, -COOR, SO₂R, NRSOR, NRSO₂R, -S0₃R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 또는 NO₂에 의해 추가로 치환될 수 있으며, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다.

Ar'은 아릴, 6원 내지 5원의 융합된 헤테로아릴을 포함하는, 헤테로아릴, 지환족 또는 헤테로지환족이다. 바람직하게는, Ar'은 페닐, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 인돌릴, 2- 또는 4-피리미딜, 벤즈이미다졸릴, 인돌릴이며, 바람직하게는 이들 각각은 임의로 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, N-아릴, NH-아로일, 할로, OR, NR₂, SR, -OCOR, -NROCR, RCO, -COOR, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂[여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다]로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 그룹에 의해 임의로 치환된다.

Ar'은 보다 바람직하게는 인돌릴, 6-피리미딜, 3- 또는 4-피리딜 또는 임의로 치환된 페닐이다.

Ar'이 임의로 치환된 페닐인 양태에 있어, 치환체는 제한됨이 없이, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 아로일, N-아릴, NH-알킬아릴, NH-아로일, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, RCO, -COOR, -SO₃R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂[여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다]을 포함한다. 바람직한 치환체는 할로, OR, SR 및 NR₂(여기서, R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다)를 포함한다. 이들 치환체는 페닐 환의 모든 5개 위치, 바람직하게는 1 내지 2개 위치, 바람직하게는 1개 위치를 점유할 수 있다. Ar'의 양태는 치환되거나 비치환된 페닐, 2-, 3- 또는 4-피리딜, 2-, 4- 또는 6-피리미딜, 인돌릴, 이소퀴놀릴, 퀴놀릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조푸라닐, 피리딜, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이미다졸릴 및 모르폴리닐을 포함한다. Ar'의 양태로서 3- 또는 4-피리딜, 특히 비치환된 형태의 4-피리딜이 특히 바람직하다.

임의의 아릴 잔기, 특히 페닐 잔기는 함께 5 내지 7원 카보사이클릭 또는 헤테로지환족 환을 형성하는 2개의 치환체를 또한 포함할 수 있다.

따라서, 퀴나졸린의 4번 위치에 상응하는 환 B의 위치에 있는 치환체의 바람직한 양태는 2-(4-피리딜)에틸아미노; 4-피리딜아미노; 3-피리딜아미노; 2-피리딜아미노; 4-인돌릴아미노; 5-인돌릴아미노; 3-메톡시아닐리닐; 2-(2,5-디플루오로페닐)에틸아미노- 등을 포함한다.

R³은 일반적으로 O, S 및 N으로부터 선택된 0 내지 5개의 헤테로원자를 함유하는 하이드로카빌 잔기 (1-20C)이다. 바람직하게는 R³은 각각 비치환되거나 1 내지 3개의 치환체로 치환된 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다. 치환체는 독립적으로 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, RCO, -COOR, -SO₃R, NRSOR, NRSO₂R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂[여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다]를 포함하는 그룹으로부터 선택되며, 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 잔기와 관련하여, 상기 그룹은 알킬(1-6C) 또는 알케닐 또는 알키닐을 추가로 포함한다. R³의 바람직한 양태(퀴나졸린의 2번 위치에 상응하는 위치의 치환체)는 1 내지 2개의 치환체, 바람직하게는 할로, 알킬(1-6C), OR, NR₂ 및 SR(여기서, R은 상기 정의한 바와 같다)에 의해 임의로 치환된 페닐 잔기를 포함한다. 따라서, 퀴나졸린의 2번 위치의 바람직한 치환체는 페닐, 2-할로페닐, 예를 들어, 2-브로모페닐, 2-클로로페닐, 2-플루오로페닐; 2-알킬-페닐, 예를 들어, 2-메틸페닐, 2-에틸페닐; 4-할로페닐, 예를 들어, 4-브로모페닐, 4-클로로페닐, 4-플루오로페닐; 5-할로페닐, 예를 들어, 5-브로모페닐, 5-클로로페닐, 5-플루오로페닐; 2,4- 또는 2,5-할로페닐(여기서, 상이한 위치의 할로 치환체는 동일하거나 상이할 수 있다), 예를 들어, 2-플루오로-4-클로로페닐; 2-브로모-4-클로로페닐; 2-플루오로-5-클로로페닐; 2-클로로-5-플루오로페닐 등을 포함한다. R³의 다른 바람직한 양태는 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실 잔기를 포함한다.

상기 주지된 바와 같이, R²는 상기 정의된 비간섭 치환체이다.

각각의 R²는 또한 독립적으로 O, S 및 N으로부터 선택된 0 내지 5개의 헤테로원자를 함유하는 하이드로카빌 잔기(1-20C)이다. 바람직하게는, R²는 독립적으로 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 이의 헤테로-형태이거나, 각각이 비치환되거나 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 아로일, N-아릴, NH-알킬아릴, NH-아로일, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, NRSOR, NRSO₂R, -OCONR₂, RCO, -COOR, -SO₃R, NRSOR, NRS0₂R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다)로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 3개의 치환체에 의해 치환된 아릴, 아릴알킬, 헤테로알킬, 헤테로아릴 또는 헤테로아릴알킬이다. 상기 치환체상의 아릴 또는 아로일 그룹은 예를 들어, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, RCO, -COOR, -SO₃R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다)에 의해 추가로 치환될 수 있다. 보다 바람직하게는, R²상의 치환체는 R⁴, 할로, OR⁴, NR⁴ ₂, SR⁴, -OOCR⁴, -NROCR⁴, -COOR⁴, R⁴CO, -CONR⁴ ₂, -SO₂NR⁴ ₂, CN, CF₃ 및 NO₂[여기서, 각각의 R⁴는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 알킬(1-6C) 또는 임의로 치환된 아릴알킬(7-12C)이고, 2개의 R⁴, 또는 알킬 또는 아릴알킬상의 2개의 치환체는 함께 5 내지 7원의 융합된 지방족 환을 형성할 수 있다]로부터 선택된다.

R²는 또한 자체로 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, NRSOR, NRSO₂R, -OCONR₂, -RCO, -COOR, -SO₃R, NRSOR, NRSO₂R, -CONR₂, SO₂NR₂, CN, CF₃ 및 NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

R²로 대표되는 보다 바람직한 치환체는 상기 제시한 Ar' 또는 R³에 함유된 페닐 잔기와 관련하여 제시한 치환체들이다. 2개의 인접한 CR²는 함께 5 내지 7원의 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 융합된 지방족 환을 형성할 수 있다. 바람직한 R² 치환체는 화학식 R⁴, -OR⁴, SR⁴ 또는 R⁴NH-, 특히 R⁴NH-(여기서, R⁴는 상기 정의한 바와 같다)의 치환체이다. R⁴가 치환된 아릴알킬인 경우가 특히 바람직하다. 화학식 1의 화합물의 구체적 대표예는 하기 표 1 내지 3에 제시한다. 표 1에 열거된 모든 화합물들은 A 환이 비치환된(Z⁵ 내지 Z⁸은 CH이다) 퀴나졸린 환 시스템(Z³은 N이다)을 갖는다. B 환의 치환체는 하기 표에 열거되어 있다.

화합물 번호	L	Ar'	R³
1	NH	4-피리딜	2-클로로페닐
2	NH	4-피리딜	2,6-디클로로페닐
3	NH	4-피리딜	2-메틸페닐
4	NH	4-피리딜	2-브로모페닐
5	NH	4-피리딜	2-플루오로페닐
6	NH	4-피리딜	2,6-디플루오로페닐
7	NH	4-피리딜	페닐
8	NH	4-피리딜	4-플루오로페닐
9	NH	4-피리딜	4-플루오로페닐
10	NH	4-피리딜	3-플루오로페닐
11^*	N^*	4-피리딜	페닐
12^†	N^†	4-피리딜	페닐
13	NHCH₂	4-피리딜	페닐
14	NHCH₂	4-피리딜	4-클로로페닐
15	NH	3-피리딜	페닐
16	NHCH₂	2-피리딜	페닐
17	NHCH₂	3-피리딜	페닐
18	NHCH₂	2-피리딜	페닐
19	NHCH₂CH₂	2-피리딜	페닐
20	NH	6-피리미딜	페닐
21	NH	2-피리미딜	페닐
22	NH	페닐	3-클로로페닐
23	NHCH₂	페닐	페닐
24	NH	3-하이드록시페닐	페닐
25	NH	2-하이드록시페닐	페닐
26	NH	4-하이드록시페닐	페닐
27	NH	4-인돌릴	페닐
28	NH	5-인돌릴	페닐
29	NH	4-메톡시페닐	페닐

화합물 번호	L	Ar'	R³
30	NH	3-메톡시페닐	페닐
31	NH	2-메톡시페닐	페닐
32	NH	4-(2-하이드록시에틸)페닐	페닐
33	NH	3-시아노페닐	페닐
34	NHCH₂	2,5-디플루오로페닐	페닐
35	NH	4-(2-부틸)페닐	페닐
36	NHCH₂	4-디메틸아미노페닐	페닐
37	NH	4-피리딜	사이클로펜틸
38	NH	2-피리딜	페닐
39	NHCH₂	3-피리딜	페닐
40	NH	4-피리미딜	페닐
41^‡	N^‡	4-피리딜	페닐
42	NH	p-아미노메틸페닐	페닐
43	NHCH₂	4-아미노페닐	페닐
44	NH	4-피리딜	3-클로로페닐
45	NH	페닐	4-피리딜
46	NH		페닐
47	NH	4-피리딜	t-부틸
48	NH	2-벤질아민-3-피리딜	페닐
49	NH	2-벤질아미노-4-피리딜	페닐
50	NH	3-벤질옥시페닐	페닐
51	NH	4-피리딜	3-아미노페닐
52	NH	4-피리딜	4-피리딜
53	NH	4-피리딜	2-나프틸
54		4-피리딜	페닐
55		페닐	페닐
56		2-피리딜	페닐
57	NHCH₂CH₂		페닐
58	존재하지 않음		페닐
59	존재하지 않음		페닐
60	NH	4-피리딜	사이클로프로필

화합물 번호	L	Ar'	R³
61	NH	4-피리딜	2-트리플루오로메틸페닐
62	NH	4-아미노페닐	페닐
63	NH	4-피리딜	사이클로헥실
64	NH	3-메톡시페닐	2-플루오로페닐
65	NH	4-메톡시페닐	2-플루오로페닐
66	NH	4-피리미디닐	2-플루오로페닐
67	NH	3-아미노-4-피리딜	페닐
68	NH	4-피리딜	2-벤질아미노페닐
69	NH	2-벤질아미노페닐	페닐
70	NH	2-벤질아미노페닐	4-시아노페닐
71	NH	3'-시아노-2-벤질아미노페닐	페닐
^*R¹=2-프로필 ^†R¹=4-메톡시페닐 ^‡R¹=4-메톡시벤질

표 2의 화합물들은 제시한 바와 같은 퀴나졸린 핵의 변형을 함유한다. 표 2의 모든 화합물들은 Z³이 N이고 Z⁶ 및 Z⁷이 CH를 나타내는 화학식 1의 양태이다. 모든 경우에, 링커 L이 존재하고 NH이다.

화합물 번호	Z⁵	Z⁸	Ar'	R³
72	CH	N	4-피리딜	2-플루오로페닐
73	CH	N	4-피리딜	2-사이클로페닐
74	CH	N	4-피리딜	5-클로로-2-플루오로페닐
75	CH	N	4-(3-메틸)-피리딜	5-클로로-2-플루오로페닐
76	CH	N	4-피리딜	페닐
77	N	N	4-피리딜	페닐
78	N	CH	4-피리딜	페닐
79	N	N	4-피리딜	5-클로로-2-플루오로페닐
80	N	N	4-(3-메틸)-피리딜	5-클로로-2-플루오로페닐

환 A가 Z⁶ 또는 Z⁷에 CR²(여기서, R²는 H가 아니다)를 함유하는 추가의 화합물을 제조하였다. 모두 퀴나졸린 유도체인 이들 화합물(여기서, L은 NH이고 Ar'은 4-피리딜이다)은 하기 표 3에 제시한다.

화합물 번호	R³	상기한 바와 같은 CR²
81	2-클로로페닐	6,7-디메톡시
82	2-플루오로페닐	6-니트로
83	2-플루오로페닐	6-아미노
84	2-플루오로페닐	7-아미노
85	2-플루오로페닐	6-(3-메톡시벤질아미노)
86	2-플루오로페닐	6-(4-메톡시벤질아미노)
87	2-플루오로페닐	6-(2-이소부틸아미노)
88	2-플루오로페닐	6-(4-메틸머캅토벤질아미노)
89	2-플루오로페닐	6-(4-메톡시벤조일 아미노)
90	4-플루오로페닐	7-아미노
91	4-플루오로페닐	7-(3-메톡시벤질아미노)

본 발명의 화학식 1의 화합물의 추가의 대표적 구조는 하기 표 4에 제시한다.

상기한 기술내용으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 방법에서 유용한 많은 화학식 1의 화합물이 퀴나졸린 유도체이지만, 본 발명은 퀴나졸린 유도체와 관련하여 상기 논의한 바와 같은 치환체를 보유하는 비-퀴나졸린, 예를 들어, 피리딘, 피리미딘 핵을 갖는 화학식 1의 화합물의 용도를 포함한다. 화학식 1의 화합물은 2003년 3월 9일자로 공개된 PCT 공보 제WO 00/12497호(이의 전문은 본원에서 참조로 명백히 인용된다)에 기술되어 있다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 또 다른 화합물 그룹은 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태로 표현된다.

화학식 2

상기 화학식 2에서,

Y₁은 할로, 알콕시(1-6 C), 알킬티오(1-6 C), 알킬(1-6 C), 할로알킬(1-6C), -O-(CH₂)_m-Ph, -S-(CH₂)_m-Ph, 시아노, 페닐 및 CO₂R[여기서, R은 수소 또는 알킬(1-6 C)이고, m은 0 내지 3이다]로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환된 페닐 또는 나프틸이거나, 5 내지 7원의 방향족 또는 비방향족 사이클릭 환(여기서, 상기 사이클릭 환은 N, O 및 S로부터 독립적으로 선택되는 3개 이하의 헤테로원자를 함유한다)과 융합된 페닐이고,

화학식 2에서 사용된 바와 같이, 점선으로 표시된 이중 결합은 당해 화합물의 가능한 토토머 환 형태를 나타낸다. 화학식 2의 화합물 및 이의 제조법에 관한 추가의 정보는 2002년 5월 23일자로 공개된 WO 02/40468(이의 전문은 명백히 본원에서 참조로 인용된다)에 기술되어 있다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 또 다른 화합물 그룹은 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태로 표현된다.

화학식 3

상기 화학식 3에서,

화학식 3의 화합물 및 이의 제조방법에 관한 추가의 상세사항은 2000년 10월 19일자로 공개된 WO 00/61576(이의 전문은 명백히 본원에서 참조로 인용된다)에 기술되어 있다.

추가의 양태에서, 본 발명의 TGF-β 억제제는 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태로 표현된다.

화학식 4

상기 화학식 4에서,

Ar은 5 내지 12개의 환 원을 함유하는 임의로 치환된 방향족 또는 임의로 치환된 헤테로방향족 잔기(여기서, 상기 헤테로방향족 잔기는 하나 이상의 O, S 및/또는 N을 함유한다)이고, 단 임의로 치환된 Ar은

X는 NR¹, O 또는 S이고,

R¹은 H, 알킬(1-8C), 알케닐(2-8C) 또는 알키닐(2-8C)이며,

Z는 N 또는 CR⁴이고,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H 또는 비간섭 치환체이며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.

하나의 양태에서, n이 2를 초과하고 R²들이 인접해 있는 경우, R²들은 함께 결합하여 1 내지 3개의 헤테로원자(여기서, 각각의 헤테로원자는 독립적으로 O, N 또는 S일 수 있다)를 함유하는 5 내지 7원 비방향족, 헤테로방향족 또는 방향족 환을 형성할 수 있다.

바람직한 양태에서, Ar은 5 내지 9개의 환 구성원을 함유하는 임의로 치환된 방향족 또는 임의로 치환된 헤테로방향족 잔기(여기서, 상기 헤테로방향족 잔기는 하나 이상의 N을 함유한다)를 나타내거나,

R¹은 H, 알킬(1-8C), 알케닐(2-8C) 또는 알키닐(2-8C)이거나,

Z는 N 또는 CR⁴[여기서, R⁴는 H, 알킬(1-10C), 알케닐(2-10C) 또는 알키닐(2-10C), 아실(1-10C), 아릴, 알킬아릴, 아로일, O-아릴, 0-알킬아릴, O-아로일, NR-아릴, NR-알킬아릴, NR-아로일 또는 상기한 것 중 어느 하킬의 헤테로-형태, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -NRSOR, -NRSO₂R, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, -COOR, -S0₃R, -CONR₂, -SO₂NR₂, -CN, -CF₃ 또는 -NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 알킬(1-4C)이다) 또는 상기 알킬의 할로 또는 헤테로원자 함유 형태이며, 이들 각각은 임의로 치환될 수 있다. 바람직하게는, R⁴는 H, 알킬(1-10C), OR, SR 또는 NR²(여기서, R²는 H 또는 알킬(1-10C)이다) 또는 O-아릴이다]이거나,

R³은 R⁴와 동일한 방식으로 정의되며 바람직한 형태는 유사하지만, R³은 독립적으로 구체화되거나,

각각의 R²는 독립적으로 알킬(1-8C), 알케닐(2-8C), 알키닐(2-8C), 아실(1-8C), 아릴, 알킬아릴, 아로일, O-아릴, 0-알킬아릴, O-아로일, NR-아릴, NR-알킬아릴, NR-아로일 또는 상기한 것 중 어느 하나의 헤테로-형태, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -NRSOR, -NRSO₂R, -NRSO₂R₂, -SO₂R, -OCOR, -OSO₃R, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, -COOR, -S0₃R, -CONR₂, SO₂NR₂, -CN, -CF₃ 또는 -NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬(1-4C)이다)이다. 바람직하게는, R²는 할로, 알킬(1-6C), OR, SR 또는 NR₂(여기서, R는 H 또는 저급 알킬(1-4C)이다)이고, 보다 바람직하게는 할로이거나, n은 0 내지 3이다.

Ar로 표현되는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기상의 임의의 치환체는 알킬(1-10C), 알케닐(2-10C), 알키닐(2-10C), 아실(1-10C), 아릴, 알킬아릴, 아로일, O-아릴, O-아릴알킬, O-아로일, NR-아릴, NR-알킬아릴, NR-아로일 또는 상기한 것 중 어느 하나의 헤테로-형태, 할로, OR, NR₂, SR, -SOR, -NRSOR, -NRSO₂R, -SO₂R, -OCOR, -NRCOR, -NRCONR₂, -NRCOOR, -OCONR₂, -COOR, -S0₃R, -CONR₂, -SO₂NR₂, -CN, -CF₃ 및/또는 -NO₂(여기서, 각각의 R은 독립적으로 H 또는 저급 알킬(1-4C)이다)을 포함한다. 바람직한 치환체는 알킬, OR, NR₂, 0-알킬아릴 및 NH-알킬아릴을 포함한다.

일반적으로, 치환체내에 함유된 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 아릴 그룹은 자체로 추가의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있다. 이들 치환체의 성질은 1차 치환체 자체와 관련하여 언급한 것과 유사하다.

화학식 4의 대표적 화합물은 하기 표 5에 열거한다.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 추가의 TGF-β 억제제는 하기 화학식 5의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염으로 표현된다.

화학식 5

상기 화학식 5에서,

m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 3이고,

R¹은 할로, 알킬, 알콕시 또는 알킬 할라이드이고, 여기서 2개의 인접한 R¹ 그룹은 결합하여 5 내지 6원의 지방족 헤테로사이클릭 환을 형성할 수 있으며,

R²는 비간섭 치환체이고,

R³은 H 또는 CH₃이다.

화학식 5의 화합물은 퀴나졸린의 2번 및 4번 위치에 상응하는 위치에 필수적 치환체를 함유하는 퀴나졸린의 유도체 및 관련 화합물이다. 바람직하게는, 화학식 5의 화합물은 프테리딘 또는 피리도피리미딘 핵을 포함한다. 프테리딘 및 8-피리도 피리미딘 핵이 바람직하다. 따라서, 하나의 양태에서 Z⁵ 및 Z⁸은 N이고, Z⁶ 및 Z⁷은 CH이다. 그러나, 모든 경우에 각각의 Z⁵ 내지 Z⁸ 중 적어도 하나는 N이여야 한다. R¹의 바람직한 양태는 할로, 바람직하게는 F, Cl 또는 Br, 가장 바람직하게는 Cl 또는 F, NR₂, OH 또는 CF₃이다.

퀴나졸린의 2번 위치에 상응하는 위치는 필수적 페닐 치환체를 함유한다.

퀴나졸린의 4번 위치에 상응하는 위치는 0 내지 4개의 비간섭 치환체, 즉 (R²)_n(여기서, n은 0 내지 4이다)을 임의로 함유할 수 있는 필수적 -NR₃-4'-피리딜 치환체를 함유한다. 바람직하게는, 피리딜 그룹은 비치환되는데, 즉 n은 0이다. 치환되는 경우, 피리딜 잔기는 바람직하게는 메틸 또는 에틸과 같은 알킬 그룹 또는 할로 그룹, 바람직하게는 브로모 또는 요오도로 치환되며, 이들 각각은 바람직하게는 퀴나졸린 유도체 핵에 대한 피리딜의 결합에 대해 오르토 위치에서 치환된다. 다른 양태에서, n은 1이고, R³은 바람직하게는 1' 또는 2' 위치의 메틸이다.

R¹ 치환체(들)은 바람직하게는 할로, 저급 알킬, 저급 알콕시 및 저급 알킬 할라이드 그룹과 같은 대형 그룹을 최소한도로 포함한다. 바람직하게는, 이러한 그룹은 하나 이상의 할로, 예를 들어, Cl, F, Br 및 I(2개 이상의 할로 그룹이 존재하는 경우 동일하거나 상이할 수 있다); 1 내지 3개의 할라이드를 함유하는 알킬 할라이드, 바람직하게는 메틸 할라이드 및 보다 바람직하게는 트리플루오로 메틸; OH; 저급 알킬, 바람직하게는 C1-6, 보다 바람직하게는 C1-3 알킬, 보다 더욱 바람직하게는 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소프로필, 가장 바람직하게는 메틸인 R; OR(여기서, R은 상기 정의한 바와 같고, OR은 바람직하게는 메톡시, 에톡시, 이소프로폭시, 메틸 페닐옥시이다)를 포함한다. 2개의 인접 R 그룹들은 결합하여, 2-페닐에 융합된 지방족 또는 헤테로지방족 환을 형성한다. 바람직하게는, 융합된 환이 존재하는 경우 이는 5 또는 6개의 원, 바람직하게는 5개의 원을 가지며 N, S 또는 O, 바람직하게는 O와 같은 1개 이상의 헤테로원자를 함유한다. 바람직하게는, 융합된 환은 페닐 환의 4 및 5 위치에서 페닐에 융합된 1,3 디옥솔란이다.

2-페닐 그룹에 결합된 R¹ 그룹 또는 그룹들은 페닐 환의 어떠한 가능한 위치에라도 결합될 수 있다. 바람직하게는 R¹ 그룹은 퀴나졸린 유도체 핵상의 페닐의 부착 위치에 대해 메타 위치에 결합된다. 또한, 바람직한 양태에서, 페닐이 2개의 그룹으로 치환되는 경우, 이들 그룹은 퀴나졸린 유도체에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 및 메타 위치, 보다 바람직하게는 비-인접 오르토 및 메타 위치에서 결합된다. 다른 양태는 이러한 그룹들을 오르토 또는 파라 위치에 포함한다. 2개의 그룹이 존재하는 경우 메타 위치 또는 인접한 오르토 및 메타 위치 둘다에서 치환된 페닐이 의도된다. 또는, 2개의 그룹은 바람직하게는 퀴나졸린 유도체에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 및 파라 위치에 부착된 융합된 환을 형성할 수 있다. 또한, 페닐이 비치환됨이 의도된다.

핵으로서 피리도피리미딘을 함유하는 화합물에 있어, 이의 6- 또는 7-이성체가 존재하는 경우, 즉 질소가 피리도피리미딘의 6 또는 7 위치에 있는 경우, 페닐은 바람직하게는 비치환되거나 바람직하게는 1개의 할로 치환체, 바람직하게는 염소를 함유하며 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에 부착된다.

화학식 5의 화합물에서, 바람직하게는 페닐은, 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 또는 파라 위치에서 바람직하게는 할로, 보다 바람직하게는 1 또는 2개의 할로, 보다 더욱 바람직하게는 염소로 치환되거나, 두 메타 위치 모두에서 디클로로로 치환되거나; 보다 바람직하게는, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 및 메타 위치에서 플루오로, 바람직하게는 디플루오로로 치환되거나; 보다 바람직하게는, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에서 보다 바람직하게는 브로모로 치환되거나; 보다 바람직하게는, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에서 바람직하게는 요오도로 치환된다.

8-피리도피리미딘을 함유하는 화합물의 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은, 2개 이상의 상이한 할로 치환체로 치환되고, 바람직하게는 이치환되고, 바람직하게는 플루오로 및 클로로를 함유하고, 보다 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비-인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되고, 보다 바람직하게는 여기서 플루오로는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 위치에 존재하고 클로로는 메타 위치에 존재하거나; 페닐 그룹은, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비인접 오르토 및 메타 위치에서 바람직하게는 플루오로 및 브로모로 이치환되고, 보다 바람직하게는 여기서 플루오로는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 위치에 존재하고 브로모는 메타 위치에 존재한다.

8-피리도피리미딘을 함유하는 화합물의 또 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 바람직하게는 1 또는 2개의 위치에서 치환되고, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 또는 메타 위치에서 바람직하게는 알콕시 또는 아릴아릴옥시, 바람직하게는 메톡시, 에톡시 이소프로폭시 또는 벤족시로 치환된다.

8-피리도피리미딘을 함유하는 화합물의 또 다른 양태에서, 페닐은 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에서 바람직하게는 알킬, 바람직하게는 메틸로 치환된다.

8-피리도피리미딘을 함유하는 화합물의 또 다른 바람직한 양태에서, 2개 이상의 치환체는 결합하여 융합된 환을 형성할 수 있다. 바람직하게는 융합된 환은 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 및 파라 위치에서 페닐 환에 융합된 디옥솔란 환, 바람직하게는 1,3-디옥솔란 환이다.

8-피리도피리미딘을 함유하는 화합물의 또 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 2개 이상의 상이한 치환체로 치환되고, 바람직하게는 이치환되고, 바람직하게는 클로로 및 메톡시로 치환되고, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되고, 보다 바람직하게는 메톡시는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 위치에 존재하고 클로로는 메타 위치에 존재하거나; 페닐 그룹은 바람직하게는, 바람직하게는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 인접 오르토 및 메타 위치에서 플루오로 및 메톡시로 이치환되고, 보다 바람직하게는 여기서 플루오로는 피리도피리미딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 위치에 존재하고 메톡시는 메타 위치에 존재한다.

또한, 프테리딘 핵을 함유하는 화학식 5의 화합물에서, 페닐 그룹은 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토, 메타 또는 파라 위치에 하나 이상의 할로 치환체를 함유한다. 보다 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 또는 메타 위치에 하나의 클로로 그룹을 함유하거나; 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토, 메타 또는 파라 위치에 하나의 플루오로 그룹을 함유하거나; 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에 하나의 브로모 또는 요오도를 함유한다. 또 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비-인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되는 2개의 할로 그룹, 바람직하게는 디플루오로를 함유하거나, 바람직하게는, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되는 디클로로를 함유하고, 바람직하게는, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 인접 또는 비인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되는 플루오로 및 클로로를 함유하고, 바람직하게는 여기서 플루오로는 오르토 위치에 존재하고 클로로는 메타 위치에 존재하고, 보다 더욱 바람직하게는 클로로는 비-인접 메타 위치에 존재하거나; 페닐 그룹은 바람직하게는, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비-인접 오르토 및 메타 위치에서 치환되는 플루오로 및 브로모를 함유하고, 바람직하게는 여기서 플루오로는 오르토 위치에 있고 브로모는 비-인접 메타 위치에 존재한다.

프테리딘을 함유하는 화합물의 또 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 바람직하게는 하나 이상의 위치, 바람직하게는 하나의 위치에서 보다 바람직하게는 알콕시, 보다 더욱 바람직하게는 메톡시로 치환되고, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 또는 메타 위치에서 치환된다. 프테리딘을 함유하는 화합물의 다른 양태에서, 페닐은 바람직하게는 할로알킬, 바람직하게는 트리플루오로메틸로 치환되고, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 메타 위치에서 치환된다.

프테리딘을 함유하는 화학식 5의 화합물의 또 다른 바람직한 양태에서, 페닐 그룹은 2개 이상의 상이한 치환체, 바람직하게는 2개의 치환로 치환되고, 바람직하게는 할로와 할로알킬, 보다 바람직하게는 플루오로와 트리플루오로메틸로 이치환되고, 바람직하게는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 비인접 오르토 및 메타 위치에서 이치환되고, 보다 바람직하게는 여기서 플루오로는 프테리딘 잔기에 대한 페닐의 부착에 대해 오르토 위치에 존재하고 트리플루오로메틸은 메타 위치에 존재한다.

상기 정의에 따라서, R²는 비간섭 치환체이다. 바람직하게는, R²는 독립적으로 H, 할로, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 또는 이의 헤테로-형태이다. 보다 바람직하게는 R²는 저급 알킬(1-3C), 또는 Br, I, Cl 또는 F와 같은 할로이다. 보다 더욱 바람직하게는, R²는 메틸, 에틸, 브로모, 요오도 또는 CONHR이다. 가장 바람직하게는 R²는 H이다.

다음 단서조항이 화학식 5의 화합물에 적용된다.

Z⁵ 내지 Z⁷이 CH이고 Z⁸이 N인 경우, R¹은 2-플루오로 또는 2-클로로가 아니거나 페닐은 비치환되지 않는다;

Z⁵ 및 Z⁸이 N이고 Z⁶ 및 Z⁷이 CH인 경우, 페닐은 비치환되지 않는다;

Z⁵가 N이고 Z⁶ 내지 Z⁸이 CH인 경우, 페닐은 비치환되지 않는다.

화학식 5의 대표적 화합물은 하기 표 6에 열거한다.

본원의 TGF-β 억제제는 피험체에게 투여되는 경우에 당해 화합물을 방출하도록 고안된 "프로드럭"의 형태로 제공될 수도 있다. 프로드럭 형태 고안은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 당해 화합물에 함유된 치환체에 따라 좌우된다. 예를 들어, 설프히드릴을 함유하는 치환체는 화합물을 내인성 효소 또는 예를 들어, 특정 피험체의 특정 수용체 또는 위치로 표적화된 효소에 의해 제거될 때까지 생물학적으로 불활성 상태가 되게 하는 담체에 커플링될 수 있다.

상기한 화합물의 임의의 치환체가 키랄 중심을 함유하는 경우, 상기한 화합물은 이의 모든 입체이성체 형태를 분리된 입체이성체로서 및 이러한 입체이성체 형태의 혼합물로서 포함한다.

화학식 1 내지 5의 화합물은 염산, 황산, 브롬화수소산 또는 인산과 같은 무기 산의 염 또는 아세트산, 타르타르산, 석신산, 벤조산, 살리실산 등과 같은 유기산의 염을 포함하는 약제학적으로 허용되는 이의 산 부가 염의 형태로 제공될 수 있다. 카복실 잔기가 화학식 1 내지 5의 화합물에 존재하는 경우, 당해 화합물은 약제학적으로 허용되는 양이온과의 염으로서 제공될 수 있다.

화학식 1 내지 5의 화합물은 또한 피험체에게 투여되는 경우에 당해 화합물을 방출하도록 고안된 "프로드럭"의 형태로 제공될 수도 있다. 프로드럭 형태 고안은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 화학식 1 내지 5의 화합물에 함유된 치환체에 따라 좌우된다. 예를 들어, 설프히드릴을 함유하는 치환체는 화합물을 내인성 효소 또는 예를 들어, 특정 피험체의 특정 수용체 또는 위치로 표적화된 효소에 의해 제거될 때까지 생물학적으로 불활성 상태가 되게 하는 담체에 커플링될 수 있다.

화학식 1 내지 5의 화학식의 화합물의 임의의 치환체가 키랄 중심을 함유하는 경우, 이들 화합물은 이들의 모든 입체이성체 형태를 분리된 입체이성체로서 및 이러한 입체이성체 형태의 혼합물로서 포함한다.

본 발명의 화합물의 합성

본 발명의 화합물을 합성하는 방법은 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 화학식 1의 화합물은 2003년 3월 9일자로 공개된 WO 00/12497에 기술된 바와 같이 합성될 수 있다. 화학식 2의 화합물의 합성 방법은 2002년 5월 23일자로 공개된 WO 02/40468에 기재되어 있다. 화학식 3의 화합물은 예를 들어, 2000년 10월 19일자로 공개된 WO 00/61576에 기재되어 있다. 화학식 4의 화합물의 합성법은 예를 들어, PCT 출원 제PCT/US03/28590호에 기재되어 있다. 화학식 5의 화합물은 예를 들어, 미국 출원 제60/507,910호에 기재되어 있는 바와 같이 합성할 수 있다. 또한, 본 발명의 범주내의 대표적 화합물들은 미국 출원 제60/458,982호에 추가로 기술되어 있다. 본 단락에서 인용한 모든 문헌의 전문은 명백히 본원에서 참조로 인용된다.

화합물의 활성

본 발명의 방법에서 유용한 화합물은 TGF-β를 억제하는 이의 능력으로 동정할 수 있다. 유용한 화합물을 동정하는 분석법은 예를 들어, 다음과 같이 실시할 수 있다: 화합물 희석액 및 시약을 매일 새로이 제조한다. 분석시의 최종 DMSO 농도를 1% 이하로 유지시키면서 화합물을 DMSO 모액으로부터 목적하는 분석 농도의 2배로 희석시킨다. TGFβ-R1은 완충액+DTT 중에 목적하는 분석 농도의 4배로 희석시켜야 한다. ATP는 4×반응 완충액으로 희석시킬 수 있고, 감마-³³P-ATP는 60μCi/mL에서 첨가될 수 있다.

분석법은 효소 10㎕를 화합물 용액 20㎕에 첨가하여 실시할 수 있다. 가능한 프로토콜에서, 반응은 ATP 혼합물 10㎕를 첨가하여 개시한다. 최종 분석 조건은 20mM MOPS(pH 7) 중의 10μM ATP, 170nM TGFβ-R1 및 1M DTT를 포함한다. 반응물을 실온에서 20분 동안 항온처리한다. 반응 혼합물 23㎕를 웰당 0.25M H₃PO₄ 15㎕로 예비 습윤화시킨 포스포셀룰로즈 96-웰 필터 플레이트로 옮겨서 반응을 중단시킨다. 5분 후, 웰을 75mM H₃PO₄로 4회 세척하고, 95% 에탄올로 1회 세척한다. 플레이트를 건조시키고, 신틸레이션 칵테일을 각 웰에 첨가하고, 웰을 Packard TopCount 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기에서 계수한다.

대안으로서, 화합물은 기질 카제인의 인산화를 억제하는 이의 기능을 측정하여 평가할 수 있다. 분석법은 다음과 같이 실시할 수 있다: 화합물 희석액 및 시약을 매일 새로이 제조한다. 분석시의 최종 DMSO 농도를 1% 이하로 유지시키면서 화합물을 DMSO 모액으로부터 목적하는 분석 농도의 2배로 희석시킨다. TGFβ-R1 키나제는 완충액+DTT 중에 목적하는 분석 농도의 4배로 희석시켜야 한다. ATP 및 카제인은 4×반응 완충액으로 희석시킬 수 있고, 감마-33P-ATP는 50μCi/mL로 첨가할 수 있다.

가능한 프로토콜에 따라서, 분석법은 효소 10㎕를 화합물 용액 20㎕에 첨가하여 실시할 수 있다. 반응은 카제인 10㎕/ATP 혼합물을 첨가하여 개시한다. 최종 분석 조건은 20mM Tris 완충액(pH 7.5) 중의 2.5μM ATP, 100μM 카제인, 6.4nM TGF R1 카제인 및 1M DTT를 포함한다. 반응물을 실온에서 45분 동안 항온처리한다. 반응 혼합물 23㎕를 웰당 0.25M H₃PO₄ 15㎕로 예비 습윤화시킨 포스포셀룰로즈 96-웰 필터 플레이트로 옮겨서 반응을 중단시킨다. 5분 후, 웰을 75mM H₃PO₄로 4회 세척하고, 95% 에탄올로 1회 세척한다. 플레이트를 건조시키고, 신틸레이션 칵테일을 각 웰에 첨가하고, 웰을 Packard TopCount 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기에서 계수한다. 효소를 억제하는 화합물의 능력은 당해 화합물의 존재하에 수득된 계수를 양성 대조군(화합물의 부재하) 및 음성 대조군(효소의 부재하)과 비교하여 측정한다.

치료 방법

본 발명에 따라서 치료될 수 있는 악성 신경교종에는 제한됨이 없이, 성인 및 아동의 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종 및 혼합 신경교종이 포함된다.

가장 흔한 신경교종인 성상세포종은 성상세포라 불리는 뇌 세포에서 시작하고, 대뇌에서 가장 흔하게 발견되나 뇌의 대부분(때로는 척수)에서 발생할 수 있다. 성상세포종은 성인 및 아동 모두에서 발생할 수 있지만, 성인에서 보다 흔하다. 뇌의 기저에서의 성상세포종은 아동 또는 청년층에서 보다 흔하다. 신경교모세포종은 IV형 성상세포종으로도 지칭되는, 특히 공격적인 형태의 성상세포종이다.

뇌실막세포종은 뇌척수액이 생성되고 저장되는 뇌내의 통로를 따라 정렬된 세포인 뇌실막에서 시작하는 뇌 종양이다. 뇌실막세포종은 드문 유형의 신경교종이며 뇌 또는 척추의 어떠한 부분에서도 발견될 수 있지만, 대뇌에서 가장 흔히 발견된다. 뇌실막세포종은 뇌척수액을 통해서 뇌에서 척수로 확산될 수 있다. 아동을 포함하는 모든 연령의 사람에서 뇌실막세포종이 발생할 수 있다.

희소돌기아교세포종은 신경 자극을 전달하는 세포에 원조 및 영양분을 제공하는 희소돌기아교세포라 불리는 뇌 세포에서 시작한다. 이러한 유형의 종양은 통상적으로 대뇌에서 발견되며 성인 및 아동 모두에서 발생할 수 있다.

혼합 교종은 성상세포, 뇌실막세포 및/또는 희소돌기아교세포를 포함하는 1가지 이상의 뇌 세포 유형의 뇌 종양이다. 혼합 신경교종의 가장 흔한 부위는 대뇌이지만, 다른 신경교종과 같이 뇌의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 이러한 유형의 종양은 성인 및 아동 모두에서 발생할 수 있다.

희소돌기아교세포종은 세포 희소돌기아교세포라 불리는 신경아교로부터 발생하는 비교적 드문 뇌 종양이다. 악성 형태의 희소돌기아교세포종 및 혼합 악성 성상세포종-희소돌기아교세포종이 있으며, 이들 둘다는 다형성 신경교모세포종과 상당히 유사한 방식으로 치료된다.

시신경 교종은 안구와 뇌 시각 중심 사이를 이동하는 신경에서 또는 그 부근에서 발견된다. 이는 신경섬유종증을 갖는 사람에서 특히 흔하다.

본 발명에서 유용한 화합물 및 이의 관련 화합물의 투여 방식, 제형 및 투여량은 치료될 신경교종의 유형 및 중증도(등급), 치료될 특정 피험체 및 의료인의 판단에 따라 좌우될 것이며, 제형은 투여 방식에 따라 좌우될 것이다.

신경교모세포종의 현행 치료법은 외과술 다음의 방사선 및/또는 화학요법을 포함한다.

본 발명의 화합물은 정제, 캡슐제, 시럽제 등을 제공하도록 적합한 약제학적 부형제와 합성함으로써 경구 투여로 편리하게 투여된다. 경구 투여에 적합한 제형은 또한 완충제, 풍미제 등과 같은 소량의 성분을 포함할 수 있다. 전형적으로, 제형 중의 활성 성분의 양은 전체 제형의 약 5% 내지 95%이지만, 담체에 따라서 광범위한 변화가 가능하다. 적합한 담체에는 슈크로즈, 펙틴, 마그네슘 스테아레이트, 락토즈, 땅콩유, 올리브유, 물 등이 포함된다.

당해 화합물은 정맥내, 근육내, 피하, 관절내, 복강내 또는 두개내 주사를 포함하는 주사로 투여될 수도 있다. 이러한 사용에 전형적인 제형은 행크액 또는 링거액과 같은 등장성 비히클 중의 액체 제형이다.

일반적으로, 어떠한 적합한 제형이라도 사용할 수 있다. 당해 분야에 공지된 제형의 개요는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다. 상기 편람의 인용은 당해 분야에서 통상적이다.

본 발명의 화합물의 투여량은 환자마다 달라질 수 있는 수많은 요인에 따라 좌우될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 1일 경구 투여량은 0.001 내지 100mg/총 체중(kg), 바람직하게는 0.01 내지 50mg/kg, 보다 바람직하게는 약 0.01mg/kg 내지 10mg/kg을 사용할 것으로 사료된다. 그러나, 투여량 섭생은 치료될 특정 종양, 환자의 연령, 성별 및 전반적 상태, 및 의료인의 판단에 따라 달라질 것이다.

본 발명에서 유용한 화합물은 개별적 활성 성분으로서 또는 수개의 상이한 화합물들의 혼합물로서 투여될 수 있다. 또한, TGF-β 억제제는 단독의 치료제로서 또는 다른 치료제와의 배합물로서 사용될 수 있다. 이들 화합물과 유용하게 배합될 수 있는 약물에는 천연 또는 합성 코르티코스테로이드, 특히 프레드니손 및 이의 유도체, 악성 신경교종의 발생 또는 진행과 관련된 면역계의 세포 또는 유전자를 표적화하는 모노클로날 항체, 및 세포 분열, 단백질 합성 또는 mRNA 전사 또는 해독의 소분자 억제제, 또는 면역세포 분화 또는 활성화의 억제제가 포함된다.

특히, 본 발명의 화합물은 방사선요법, 다른 화학치료제의 투여, 면역요법 또는 스테로이드 요법, 골수 이식 및 기타 치료 선택사항을 포함할 수 있는 치료 섭생의 일부분으로서 내과의에 의해 결정되는 임의의 조합 및 순서로 투여될 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이, 본 발명의 화합물이 사람에서 사용될 수 있지만, 본 발명의 화합물은 사람이 아닌 포유동물 피험체를 치료하는데 있어 수의학적 용도로도 이용할 수 있다.

본 발명의 추가 상세 설명은 하기 비제한적 실시예로부터 명백할 것이다.

TGF-β 억제제에 의한, 시험관내 및 생체내 신경교종 성장의 억제

생체내에서 동계 VM/Dk 마우스에서의 쥐 SMA-560 및 사람 LN-308 신경교종 세포의 성장 및 면역원성, 및 두개내 SMA-560 신경교종의 성장 및 이에 대한 면역반응에 미치는 TGFβ-R1 키나제 억제제, 특히 표 II에서 화합물 79번으로서 지정된 억제제의 효과를 연구하였다.

재료 및 방법

세포주 및 시약

화합물 79번은 싸이오스 인코포레이티드(Scios Inc.)에 의해 개발된 TGFβ-R1 키나제 억제제이다. 피토헤마글루티닌(PHA)는 바이오크롬(Biochrom, Berlin, Germany)로부터 구입하였다. [메틸-³³H]-티미딘은 애머샴(Amersham, Braunschwig, Germany)으로부터 구입하였다. ⁵¹Cr은 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear, Boston, MA)로부터 구입하였다. 사람 재조합 TGF-β₁ 및 TGF-β₂는 페프로테크(Peprotech, London, MA)로부터 입수하였다. 마우스 IL-2는 페프로테크(London, MA)로부터 입수하였다. 중화 pan-항-TGF-β 항체는 R & D(Wiesbaden, Germany)로부터 구입하였다. 사람 악성 신경교종 세포주 LN-308은 N. de Tribolet(Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, Lausanne, Switzerland)에 의해 제공되었다. 쥐 신경교종 세포주 SMA-560은 D.D. Bigner(Duke University Medical Center, Durham, NC)에 의해 제공되었다. CCL64 밍크 폐 상피 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection, Rockville, MD)로부터 입수하였다.

세포 배양물

신경교종 세포 및 CCL64 세포를 2mM L-글루타민(Gibco Life Technologies, Paisley, UK), 10% FCS(Biochrom KG, Berlin, Germany) 및 페니실린(100 IU/ml)/스트렙토마이신(100㎍/ml)(Gibco)가 보충된 DMEM에서 유지시켰다. 신경교종 세포의 성장 및 생존성을 크리스탈 바이올렛, LDH 방출(Roche, Mannheim, Germany) 및 트 립판 블루 염료 배제 분석법으로 조사하였다. 클론형성능을 평가하기 위해, 500개 SMA-560 세포를 6웰 플레이트(9.4cm²)에 씨딩하였다. 가시적 세포 형성 후, 20개 세포 초과의 콜로니가 계수되었다.

사람 PBMC를 밀도 구배 원심분리(Biocoll, Biochrom KG)에 의해 건강한 공여자로부터 분리하였다. 단핵구를 부착 및 편차 원심분리에 의해 제거하여 말초혈 림프구(PBL)을 수득하였다. 정제된 T 세포를 수득하기 위해, LymphoKwikT^TM 시약(One Lambda Inc., Canoga Park, CA)을 사용하여 PBMC에서 B 세포 및 단핵구를 고갈시켰다. 이 집단의 순도는 항-사람 CD3-PE 항체를 사용한 유세포분석법에 의해 97%를 초과하는 것으로 확인되었다(Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). PBL을 방사선조사된 RPMI8866 영양세포에서 10일 동안 배양하여 사람 폴리클로날 NK 세포 집단을 수득하였다[참조: Valiante et al., Cel., Immunol., 145:187-198 (1992)]. 쥐 NK 세포를 DX5 모노클로날 항체-커플링된 마그네틱 비이드와 함께 상응하는 컬럼 시스템을 사용하여 양성 선별법에 의해 VM/Dk 마우스로의 비장세포로부터 제조하고[참조: Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany], 사용 전에 10일 이상 마우스 IL-20(5000U/ml)과 함께 배양하였다. 사람 폴리클로날 NK 세포 배양물, 사람 PBL, 사람 T 세포 및 마우스 NK 세포를 15% FCS, 2mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 50μM β-머캅토에탄올 및 페니실린(100IU/ml)/스트렙토마이신(100㎍/ml)이 보충된 RPMI 1640에서 성장시켰다.

TGF-β 생물학적 분석법

생물활성 TGF-β의 수준을 CCL64 생물학적 분석법을 사용하여 측정하였다. 간략하게 언급하면, 104개 CCL64 세포를 24시간 동안 96웰 플레이트에 부착시키고, 전체 배지를 혈청 비함유 배지로 대체시키고, 세포를 72시간 동안 혈청 비함유 배지에 희석된 재조합 TGF-β1/2 또는 신경교종 세포 배양 상청액에 노출시켰다. 성장을 72시간째에 크리스탈 바이올렛 염색으로 평가하였다. 신경교종 세포 상청액을 혈청 비함유 배지에서 48시간 동안 유지시키고 열-처리한(5분, 85℃) 컨플루언트(confluent) 배양물로부터 수거하여, 잠재적 TGF-β를 활성화시켰다[참조: Leitlein et al., J. Immunol., 166: 7238-7243 (2001)].

면역블롯 분석

인산화된 Smad2(p-Smad2) 단백질 수준을 12% 아크릴아미드 겔상의 레인당 단백질 20㎍을 사용하여 면역블롯으로 분석하였다. PVDF 막(제조원: Amersham, Braunschweig, Germany)으로 옮긴 후, 블롯을 5% 탈지유 및 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 차단시키고 4℃에서 p-Smad2 항체(2㎍/ml)와 함께 밤새 항온처리하였다. 단백질 비이드의 가시화를 서양고추냉이 퍼옥시다제-커플링된 2차 항체(Sigma) 및 증강된 화학발광(Becton-Dickinson)을 사용하여 달성하였다. 전체 Smad2/3 수준을 특이적 Smad2/3 항체(Becton-Dickinson)를 사용하여 평가하였다.

용해 분석

HLA-A2-미스매치된 PBL 또는 T 세포(107/25cm² 플라스크)를 106개의 방사선조사된(30 Gy) 신경교종 세포와 5일 동안 공배양하였다. 신경교종 세포 표적을 ⁵¹Cr(50μCi, 90분)을 사용하여 표지하고, 상기 공배양물로부터 수거된 이펙터 PBL과 100:1 내지 3:1의 이펙터: 표적(E:T) 비에서 항온처리하였다(104/웰). 최대 ⁵¹Cr 방출을 NP40(1%)를 부가하여 측정하였다. 4시간 후, 상청액을 Luma-PlateTM-96(제조원: Packard, Germany)으로 옮기고 측정하였다. ⁵¹Cr 방출율(%)을 다음과 같이 계산하였다: 100×([실험적 방출- 자발적 방출]/[최대 방출-자발적 방출]).

사이토킨 방출

면역 이펙터 세포에 의한 IL-10, TNF-α 및 IFN-γ 방출을 상응하는 항-사람 포획 항체(Becton Dickinson)로 피복된 멀티스크린 HA 96웰 플레이트(Millipore, Germany)에서 Elispot 분석법으로 평가하였다. 간략하게 언급하면, 5×104개 신경교종 세포를 105, 2.5×105 또는 5×105개 HLA-A2-미스매치된, 예비자극된(5일) PBL과 24시간 동안 공배양하였다. 이중-정제수를 사용하여 세포를 제거하고, 포획된 사이토킨을 바이오티닐화된 항체 및 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제(Becton Dickinson)를 사용하여 가시화하였다. 스팟을 Elispot 판독기 시스템(AID, Straβberg, Germany)에서 계수하였다. 유사하게, 갓 분리된 비장세포를 항-마우스 포획 IFN-γ 항체 및 상응하는 바이오티닐화된 2차 항체(Becton Dickinson)를 사용하여 생체외 실험에서 IFN-γ방출에 대해 평가하였다.

유세포분석법

부착성 신경교종 세포를 세포 해리 용액(Sigma)을 사용하여 비효소적으로 탈착시켰다. 세포 주기 분석을 고정된 투과화된 신경교종 세포(70% 에탄올)를 사용하여 수행하였다. RNA를 RNase A(제조원: Life Technologies, Inc.)을 사용하여 분해시켰다. DNA를 요오드화프로피움(50㎍/ml)으로 염색하였다.

동물 실험

VM/Dk 마우스를 TSE Research Center(Berkshire, UK)로부터 구입하였다. 모든 실험에서 6 내지 12주령의 마우스를 사용하였다. 실험은 독일 동물 보호법에 따라 실시하였다. 7 내지 8마리 마우스의 그룹을 모든 두개내 과정 전에 마취시키고 장치(Stoelting, Wood Dale, IL)내에 넣어두었다. 정수리에서 측면으로 2mm에 있는 두개골을 천공시켜 천두공(burr hole)을 만들었다. 해밀턴 주사기(Hamilton, Darmstadt, Germany)의 바늘을 3mm 깊이까지 삽입시켰다. 2㎕ 용적의 PBS에 재현탁시킨 5×103개 SMA-560 세포[참조: Serano et al., Acta Neuropathol., 51: 53-64 (1980)]를 우측 선조에 주사하였다. 3일 후에 마우스에게 탈이온수에 1 mg/ml로 용해된 화합물 79번을 음용시켰다. 마우스를 매일 관찰하고, 생존 실험에서는 신경학적 증상이 발생하면 희생시키거나 다른 실험에서는 지시된 바와 같이 희생시켰다.

생체외 면역 이펙터 분석법

신경교종 보유 마우스를 종양 세포를 주사하지 10일 후에 희생시켰다. 비장세포를 분리하고 상기한 바와 같이 24시간 IFN-γ Elispot 분석법에서 사용하였다. 또한, 상기 세포들을 10일 동안 IL-2(5000 U/ml)로 자극시켜 LAK 세포를 생성시키고, 이를 SMA-560 신경교종 세포에 대한 51Cr 방출 분석법에서 표적으로서 사용하였다.

통계학적 분석

실험은 통상적으로 3회 이상 실시하였으며 유사한 결과가 수득되었다. 유의성은 스튜던트 t-검정으로 검정하였다. P 값은 양측 검정(two-tailed t-test)으로 부터 도출하였다.

결과

화합물 79번은 시험관내에서 TGF-β1 및 TGF-β2 억제제이다.

CCL64 밍크 폐 상피 세포는 0.5ng/ml의 EC50 농도에서 사람 TGF-β1 및 TGF-β2의 성장 억제성 효과에 대해 민감성이다. 재조합 TGF-β의 억제 효과 및 TGF-β-함유 신경교종 세포 상청액의 억제 효과는 특이적 TGF-β 항체에 의해 소실된다[참조: Leitlein et al., J. Immunol. 166:7238-7243 (2001)](데이타는 제시하지 않음). 본원에서는 화합물 79번의 길항작용 특성을 입증하기 위해 CCL64 생물학적 분석법을 사용하였다. 화합물 79번은 TGF-β1 및 TGF-β2(10ng/ml)에 의해 매개된 성장 억제를 농도-의존적 방식으로 구제하였으며, 이때 EC50 농도는 0.03μM의 범위였다(도 1A). 유사하게, 희석된 혈청 비함유 SMA-560 또는 LN-308 신경교종 세포 상청액에 의해 매개된 성장 억제는 동일한 농도의 화합물 79번에 의해 무효화되었다(도 1B).

화합물 79번은 신경교종 세포의 TGF-β-의존적 신호전달을 소멸시킨다.

이어서, 쥐 및 사람 신경교종 세포에 대한 화합물 79번의 생물학적 효과를 시험관내에서 조사하였다. CCL64 생물학적 분석법에서 TGF-β의 성장 억제 효과를 차단시키는데 요구되는 농도는 어떠한 세포주의 증식에도 효과가 없었다. 그러나, 1μM 이하의 보다 고 농도는 두 세포주 모두의 성장을 적절하게 억제하였다(도 2A). LDH 방출 또는 트립판 블루 배체 분석법 어떠한 것도 72시간 동안 1μM 이하의 농도에서 신경교종 세포에 대한 화합물 79번의 세포독성 효과를 나타내지 않았기 때문에, 성장 억제는 손상된 증식과 관련되었지만, 실제 세포 사멸과는 관련되지 않았다. 0.01, 0.1 또는 1μM의 화합물 79번에 노출시킨 후 48시간째에 실시한 유세포분석 세포 주기 분석은 어떠한 세포주에서도 특정 유형의 세포 주기 정지가 없음을 나타냈다(데이타는 제시하지 않음). 게다가, 화합물 79번은 혈청 박탈(serum deprivation)에 반응하여 신경교종 세포의 생존성을 조절하지 않았다(데이타는 제시하지 않음). 그러나, 화합물 79번이 전체 세포 Smad2/3 수준을 변경시키지 않으면서 Smad2 인산화를 방해한다는 것이 입증됨으로써 내인성 또는 외인성 TGF-β에 의해 전달된 신호의 억제가 확인되었다(도 2B). 주목할만하게도, 미처리된 신경교종 세포의 pSmad 인산화는 거의 검출할 수 없었지만, 이러한 신호도 화합물 79번에 의해 소멸되었다.

화합물 79번은 시험관내에서 신경교종 세포에 대한 동종 면역반응을 증진시킨다.

화합물 79번이 배양된 사람 신경교종 세포에 대한 동종 면역세포 반응을 회 복시키는지를 조사하기 위해 다음 일련의 실험을 고안하였다. HLA-A2-미스매치된 PBL 또는 정제된 T 세포를 화합물 79번의 존재 또는 부재하에 방사선조사된 신경교종 세포와 공배양한 경우, 후속적 ⁵¹Cr 4시간 방출 분석법에서의 이들의 용해 활성은 화합물 79번에 사전 노출시킴으로써 유의적으로 증진되었다(도 3A). 중화 TGF-β 항체(10㎍/ml, 2일마다 부가됨)를 사용한 경우에도 유사한 효과가 관찰되었다(데이타는 제시하지 않음). HLA-미스매치된 PBL에 의한 IFN-γ 방출은 신경교종의 존재하에 초회자극(priming)이 일어난 경우에 강력하게 억제되었다. 화합물 79번은 IFN-γ 방출을 LN308 세포의 부재하에 예비배양된 BPL과 유사한 수준까지 회복시켰다(도 3B). 유사한 결과는 TNF-α(도 3C)에서 관찰되었다. 대조적으로, IL-10 방출은 LN-308 세포와 공배양한 후에 자극되었고, 화합물 79번은 비자극된 배양물 및 신경교종 세포-초회자극된 배양물 둘다로부터 생성된 면역 이펙터 세포에 의한 IL-10 방출을 감소시켰다(도 3D).

폴리클로날 NK 세포의 LN-308 표적에 대한 용해 활성은 외인성 TGF-β에 의해 강력하게 억제되었으며, TGF-β-매개된 억제는 화합물 79번에 의해 감소되었다(도 3E). 유사하게, 세포 상청액은 NK 세포 활성을 억제하였으며, 이러한 억제도 화합물 79번(도 3F) 또는 중화 TGF-β 항체(데이타는 제시하지 않음)에 의해 차단되었다.

화합물 79번은 SMA-560 두개내 실험적 신경교종 보유 동계 마우스의 생존을 연장시킨다.

음용수(1mg/ml)를 통해 투여된 화합물 79번의 치료학적 효과를 동계 마우스 신경교종 패러다임[참조: Friese et al. 2003]으로 평가하였다. 신경학적 증상의 발생은 화합물 79번-처리된 마우스(데이타는 제시하지 않음)에서 지연되었으며, 평균 생존은 비히클-처리된 동물에서 18.6±2.1일(중앙값 18)인 것과 비교하여 25.1±5일(중앙값 23)으로 연장되었다(도 4)(p=0.004, t-검정). 30일째에서의 생존율은 화합물 79번 처리된 동물에서 29%였지만, 대조 동물에서는 0%였다.

화합물 79번은 생체내에서 SMA-560 신경교종 세포에 대한 면역반응을 조절한다.

화합물 79번으로 처리 개시 후 7일째에 수거된 비장세포에 의한 IFN-γ 방출의 Elispot 분석법 결과, 화합물 79번 처리된 5마리의 동물 중 3마리에서 배경값을 초과하는 증가가 나타났지만, 5마리의 대조 동물 중 1마리에서만 이러한 증가가 나타났다(도 4B). 또한, 화합물 79번 처리된 동물의 비장세포로부터 생성된 LAK 세포는 표적으로서 SMA-560에 대한 증진된 용해 활성을 나타냈다(도 4C).

논의

TGF-β의 생물학적 활성을 길항하는 것은 악성 신경교종을 포함하는 각종 유형의 암을 퇴치하기 위한 주요 전략 가운데 하나가 되었다. 항 TGF-β전략에 대한 현재의 이론적 근거는 이동 및 침입[참조: Wick et al., Neurosci. 21: 3360-3368 (2001)] 및 전이[참조: Yang et al., J. Clin. Invest., 109: 1607-1615 (2002)] 및 종양 관련 면역억제[참조: Weller and Fontana, Brain Res. Rev., 21:128-151 (1995); Gorelik and Flavelli, Nat. Rev. Immunol., 2:46-53 (2002)]에서의 이의 추정상 역할을 포함한다. 현재까지 실험적 신경교종에서 평가된 모든 TGF-β기반 치료 접근법은 이를 임상에 적용하는데 있어 한계가 있는 것으로 보인다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 목적하는 작용 부위로의 전달의 측면에서 몇가지 문제점을 갖고 있다. 이는 예를 들어, 데코린(decorin) 유전자의 전달에 기초한 유전자 요법 전략도 마찬가지이다[참조: Stander et al., Gene Ther., 5: 1187-1194 (1998)]. TGF-β 프로세싱 수준에서 TGF-β 생물활성을 억제하는 것을 목적하는 하는 푸린(furin)-유사 프로테아제의 억제[참조: Leitlein et al., J. Immunol. 166: 7238-7243 (2001)]는 현재로서는 허용되는 특이성으로 달성될 수 없는데, 그 이유는 모든 종류의 분자가 이러한 효소에 의한 프로세싱을 요구하기 때문이다[참조: Thomas, G., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3: 753-766 (2002)]. 보다 큰 특이성은 표적 세포 집단에 도달할 수 있기 전에 생물활성 TGF-β를 제거하는 작용을 하는 가용성 TGF-β수용체 단편의 사용으로부터 수득될 수 있다[참조: Yang et al., supra; Muraoka et al., J. Clin. Invest. 109: 1551-1559 (2002)]. 이러한 효과는 이론상 분자내 신호전달 수준에서 TGF-β의 작용으로부터 세포를 보호하도록 고안된 특이적 소분자에 의해 모사될 것이다.

본원에서는 이러한 후보 인자 중 하나인 화합물 79번의 활성을 시험관내 및 생체내에서 쥐 및 사람 신경교종 세포에 대해 특징분석하였다. 현저한 TGF-β 합성의 전형이 되기 때문에 사람 LN-308 세포를 선택하였다[참조: Fontana et al. supra; Leitlein et al., supra]. 동계 VM/Dk 마우스에 이식된 SMA-560 세포는 설치류 신경교종의 면역요법을 위한 최상의 모델을 대표한다[참조: Serano et Acta Neuropathol., 51: 53-64 (1980)]. 당해 실험은 화합물 79번이 CCL64 밍크 폐 상피 분석법에서 TGF-β₁ 및 TGF-β₂의 잠재적 길항제이고(도 1A) 이들 세포의 성장에 대한 신경교종 세포 SN의 억제 효과를 소멸시킴(도 1B)을 확인시켰다. 화합물 79번은 신경교종 세포에 대해 세포독성이 아니며 고 농도에서 증식을 오직 적절하게억제한다(도 2A). 이와 관련하여, SMA-560 세포에 대한 TGF-β의 음성 성장 조절 효과는 확인되지 않았다[참조: Ashley et al., Cancer Res., 15:302-309 (1998)]. Smad2 인산화는 화합물 79번에 대해 민감한 방식으로 TGF-β에 의해 빠르게 유도되었으며(도 2B), 이는 TGF-β 신호전달이 신경교종 세포에서 본질적으로 소멸되지 않지만 신경교종 세포 증식의 조절에 관여하지 않을 수 있음을 가리킨다. 또한, 화합물 79번으로 처리된 신경교종에서 TGF-β에 의한 자가분비 및 측분비 신호전달의 길항작용으로, 화합물 79번-유사 제제도 또한 신경교종 세포의 이동 및 침입의 잠재적 억제제가 될 수 있음이 예측된다[참조: Wick et al., J. Neurosci., 21: (2001)].

그 다음, 감소된 생물활성의 결과로서 신경교종 세포의 면역원성을 증진시키는 화합물 79번의 바람직한 면역 조절 효과에 중점을 두고 연구를 실시하였다. 사람 PBL 및 정제된 T 세포는 화합물 79번의 존재하에 신경교종 세포로 사전 자극된 경우에 LN-308 신경교종 세포 표적에 대한 증진된 용해 활성을 나타냈다. 이는 화합물 79번-처리된 세포에서 IFN-γ 및 TNF-α와 같은 염증촉진성 사이토킨의 증진 된 방출 및 면역억제성 사이토킨 IL-10의 감소된 방출과 병행되었다(도 3B 내지 3D). 유사하게, 화합물 79번은 TGF-β₁ 또는 LN-308 SN과 공배양된 폴리클로날 NK 세포 배양물의 용해 활성을 회복시켰다(도 3E 내지 3F).

화합물 79번은 SMA-560 신경교종 보유 마우스의 중간 생존율을 유의적으로 연장시켰다(도 4A). 용량-제한적 독성이 달성되지 않았지만, 화합물 79번의 비교적 낮은 용해도로 인해서 음용수로는 보다 높은 용량을 투여할 수 없었으며, 이는 화합물 79번의 치료 효과 또는 방출된 제제가 신경교종 모델에서 더욱 개선될 수 있음을 시사한다. 어떠한 특정한 이론 또는 기작으로 제한됨이 없이, 화합물 79번의 치료 효과는 신경교종 세포 이동 및 침입의 억제[참조: Wick et al. supra] 또는 항-신경교종 면역반응의 촉진[참조: Weller and Fontana, supra]에 의해 매개될 수 있다. 후자를 지지하여, 화합물 79번-처리된 신경교종 보유 마우스의 생체외 분석은 배양물에서 10일 후에 증진된 IFN-γ 방출 뿐만 아니라 LAK 활성의 증가가 상실되지 않았음을 나타냈다(도 4B, 4C).

당해 데이타는 신경교종의 치료에서의 화합물 79번 또는 관련 분자의 역할을 강력하게 제시한다. 이러한 TGF-βR1 길항제로의 전신 치료는 TGF-β의 생체이용성을 제한하는 국소적 접근법, 예를 들어, TGF-β안티센스 올리고뉴클레오타이드와 병용될 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌은 명백히 본원에서 참조로 인용된다. 본 발명을 이의 구체적 양태를 참조로 하여 설명하였지만, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 진정한 취지 및 범주에서 벗어남이 없이 다양한 변화가 이루어 질 수 있고 등가물로 대체될 수 있음을 이해할 수 있다. 또한, 내용, 방법 등의 특정 상황, 물질, 조성을 적합화시키기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 본원에 첨부된 청구의 범위내에 속한다.

Claims

포유동물 피험체에게 TGFβ-R1 키나제 수용체에 특이적으로 결합하는 분자의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 포유동물 피험체의 악성 신경교종을 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 신경교종이 성상세포종, 뇌실막세포종, 희소돌기아교세포종, 혼합 교종 및 시신경 교종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제2항에 있어서, 신경교종이 성상세포종인 방법.
제3항에 있어서, 성상세포종이 신경교 근육모세포종인 방법.
제1항에 있어서, 포유동물이 사람인 방법.
제5항에 있어서, 사람이 성인인 방법.
제6항에 있어서, 사람이 아동인 방법.
제1항에 있어서, 분자가 비-펩타이드 소분자인 방법.
제1항에 있어서, 분자가 p38 키나제에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부가적으로 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 분자가 p38 키나제에 의해 매개되는 생물학적 활성에 비해서 TGFβ-R1 키나제에 의해 매개되는 생물학적 활성을 우선적으로 억제하는 방법.
제1항에 있어서, 분자가 하기 화학식 1의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태인 방법.

화학식 1

상기 화학식 1에서,

R³은 비간섭 치환체이고,

각각의 Z는 CR² 또는 N이고, 여기서 환 A내 2개 이하의 Z 위치는 N이고, 환 A내 2개의 인접 Z 위치는 N이 될 수 없으며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

L은 링커이며,

n은 0 또는 1이고,

Ar'은 1 내지 3개의 비간섭 치환체로 임의로 치환된, 지환족, 사이클릭 헤테로지방족, 방향족 또는 헤테로방향족의 잔기이다.
제11항에 있어서, 화합물이 퀴나졸린 유도체인 방법.
제11항에 있어서, Z³이 N이고, Z⁵ 내지 Z⁸이 CR²인 방법.
제11항에 있어서, Z³이 N이고, Z⁵ 내지 Z⁸ 중 하나 이상이 질소인 방법.
제11항에 있어서, R³이 임의로 치환된 페닐 잔기인 방법.
제11항에 있어서, R³이 2-, 4-, 5-, 2,4- 및 2,5-치환된 페닐 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택된 방법.
제11항에 있어서, R³이 하나 이상의 알킬(1-6C), 알콕시(1-6C) 또는 할로에 의해 치환되는 방법.
제11항에 있어서, 화학식 1의 화합물이 [4-(3-메틸)-피리딜]-6-클로로-2-플루오로페닐-피리딘 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태인 방법.
제1항에 있어서, 분자가 하기 화학식 4의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태인 방법.

화학식 4

상기 화학식 4에서,

Ar은 5 내지 12개의 환 원을 함유하는 임의로 치환된 방향족 또는 임의로 치환된 헤테로방향족 잔기(여기서, 상기 헤테로방향족 잔기는 하나 이상의 O, S 및/또는 N을 함유한다)이고, 단 임의로 치환된 Ar은
(여기서, R⁵는 H, 알킬(1-6C), 알케닐(2-6C), 알키닐(2-6C), 또는 5 내지 11개의 환 원을 함유하는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기이다)이 아니며,

X는 NR¹, O 또는 S이고,

R¹은 H, 알킬(1-8C), 알케닐(2-8C) 또는 알키닐(2-8C)이며,

Z는 N 또는 CR⁴이고,

각각의 R³ 및 R⁴는 독립적으로 H 또는 비간섭 치환체이며,

각각의 R²는 독립적으로 비간섭 치환체이고,

n은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다.
제19항에 있어서, n이 2를 초과하고 R²들이 인접해 있는 경우, R²들이 함께 결합하여, 각각 독립적으로 O, N 또는 S일 수 있는 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 7원의 비방향족, 헤테로방향족 또는 방향족 환을 형성할 수 있는 방법.
제1항에 있어서, 분자가 하기 화학식 5의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 형태인 방법.

화학식 5

상기 화학식 5에서,

각각의 Z⁵, Z⁶, Z⁷ 및 Z⁸은 N 또는 CH이고, 여기서 Z⁵, Z⁶, Z⁷ 및 Z⁸ 중 1개 또는 2개는 N이며, 2개의 인접한 Z 위치는 N이 될 수 없으며,

m 및 n은 각각 독립적으로 0 내지 3이고,

R¹은 할로, 알킬, 알콕시 또는 알킬 할라이드이고, 여기서, 2개의 인접한 R¹ 그룹은 결합하여 5 내지 6원의 헤테로사이클릭 환을 형성할 수 있으며,

R²는 비간섭 치환체이고,

R³은 H 또는 CH₃이다.
악성 신경교종과 관련된 유전자를 포함하는 세포를 당해 세포내에 존재하는 TGFβ-R1 수용체 키나제에 특이적으로 결합하는 TGF-β의 비-펩타이드 소분자 억제제와 접촉시킴을 포함하는, 악성 신경교종과 관련된 유전자에 대한 TGF-β-매개된 효과를 역전시키는 방법.
제22항에 있어서, 세포가 신경교모세포종가 관련되는 방법.
제22항에 있어서, 유전자가 세포에서 과발현되는 방법.
제22항에 있어서, 유전자가 세포에서 저발현되는 방법.
제22항에 있어서, 억제제가 2개 이상의 유전자의 발현에 대한 TGF-β 매개된 효과를 역전시키는 방법.
제22항에 있어서, 억제제가 신경교모세포종과 관련된 다수의 유전자의 발현에 대한 TGF-β 매개된 효과를 역전시키는 방법.
제22항에 있어서, 유전자 또는 유전자들이 TGF-β₁, TGF-β₂, TGF-β₃, TGF-βRI, TGF-βRII, Smad2, Smad3, Smad4, IL-10, CD95, IL-6, IL-1, IGF-1, VEGF, MMP, COX-2, TIPM, PAI-1, TNFα, IL-11, EG 및 FGF로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제22항에 있어서, 억제제가 Smad 단백질, p38 및 TAK1에 의해 매개되는 생물학적 활성을 부가적으로 억제하는 방법.