KR20060129504A - 시노비올린 유전자의 프로모터에 대한 디코이 핵산 - Google Patents

시노비올린 유전자의 프로모터에 대한 디코이 핵산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시노비올린 유전자의 프로모터에 대한 디코이 핵산이다. 또한, 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 인자와 결합하여 프로모터 활성을 저해할 수 있는 디코이 핵산, 그리고 이하의 (a) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 디코이 핵산, 또는 (b) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열에 있어서 1 개 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 프로모터 활성을 저해하는 기능을 갖는 디코이 핵산이다.

Description

시노비올린 유전자의 프로모터에 대한 디코이 핵산{DECOY NUCLEIC ACID TO SYNOVIOLIN GENE PROMOTER}
본 발명은, 시노비올린 유전자의 프로모터에 대한 디코이 핵산에 관한 것이다.
관절 류머티즘 (이하, RA 라고 한다) 은, 관절의 활막 조직에 이상한 증식이 보이는 전신성의 만성 염증성 질환이다. 본 발명자는, 이 활막 조직의 이상 증식에 필수 유전자로서 시노비올린 (Synoviolin) 유전자를 동정하고 있다 (WO 02/052007).
시노비올린 유전자가 코드하는 시노비올린은 관절 류머티즘 환자의 활막 세포 라이브러리로부터, 항활막 세포 항체를 이용한 면역 스크리닝에 의해 클로닝된 막단백질이다. 시노비올린을 마우스에서 과잉 발현시킨 경우, 관절에서는 활막의 증생, 뼈, 연골 파괴가 인정되고, 관절염과 혹사한 증상이 확인되었기 때문에, 연골ㆍ뼈 조직의 발생, 분화, 재생 및 대사로의 시노비올린의 관여가 시사되고 있다. 또, 최근에는 시노비올린이 선유증, 암 또는 뇌신경 질환의 발증에도 관여하는 것이 발견되어 있다 (Genes Dev. 2003 Vol.17: p.2436-49).
시노비올린의 발현량은 상기 질환에 있어서 중요하다고 생각되므로, 시노비 올린 프로모터의 전사 영역을 검색하기 위해, 마우스 시노비올린 유전자의 상류 프로모터 영역을 절단하여 여러 가지 길이를 가지는 단편에 대해 프로모터 활성을 조사한 결과, 그 코어 영역이 특정되어 전사 인자와 상호 작용하는 것이 확인되어 있다 (Oncogene. 2000 Vo1. 19: p.6533-48).
발명의 개시
본 발명은, 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 조절 영역을 코드하는 부위에 대한 디코이 핵산을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 실시하였다. 그리고, 시노비올린 유전자의 상기 부위에 대한 디코이 핵산을 제작하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 인자와 결합하여 프로모터 활성을 저해할 수 있는 디코이 핵산.
본 발명의 디코이 핵산은 예를 들어 이하의 (a) 또는 (b) 의 디코이 핵산을 예시할 수 있다.
(a) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 디코이 핵산
(b) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열에 있어서 1 개 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능을 가지는 디코이 핵산
또한, 본 발명의 디코이 핵산은 예를 들어 이하의 (a) 또는 (b) 의 디코이 핵산을 예시할 수 있다.
(a) 서열 번호 11 및 12 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 디코이 핵산
(b) 서열 번호 11 및 12 로 표시되는 염기 서열에 있어서 1 개 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한, 시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능을 가지는 디코이 핵산
시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능으로서는, 예를 들어 프로모터의 전사 인자와 결합하는 기능을 들 수 있다.
본 발명의 디코이 핵산은 프로모터의 전사 인자의 결합 부위인 EBS (Etsbinding site), SBS (Sp1 binding site) 및 ABS (AML binding site) 로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 부위의 염기 서열에 기초하여 설계할 수 있다.
또, 본 발명의 디코이 핵산은 활막 세포, 또는 암 세포에 아포토시스를 유도할 수 있다.
(2) 상기 디코이 핵산을 함유하는, 시노비올린 유전자의 발현에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
본 발명의 의약 조성물은, 또한 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 함유하는 것이어도 된다. 본 발명의 의약 조성물의 적용의 대상이 되는 질환으로서는, 예를 들어, 관절 류머티즘, 선유증, 암 및 뇌신경 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개를 들 수 있다.
(3) 상기 디코이 핵산을 이용하여 시노비올린의 전사 인자의 전사 활성을 저해하는 방법.
(4) 상기 디코이 핵산을 이용하여 시노비올린의 프로모터 활성을 저해하는 방법.
(5) 상기 디코이 핵산을 이용하여 시노비올린의 프로모터 활성을 저해함으로써, 시노비올린의 발현을 억제하는 방법.
(6) 상기 디코이 핵산을 이용하여 활막 세포 또는 암 세포에 아포토시스를 유도하는 방법.
도 1a 는 절단형 시노비올린 프로모터의 활성을 나타내는 도면이다.
도 1b 는 절단형 시노비올린 프로모터의 활성을 나타내는 도면이다.
도 1c 는 시노비올린 프로모터의 Ets 결합 부위 및 코어 영역을 나타내는 도면이다.
도 1d 는 프로모터에 변이를 도입했을 때의 전사 활성을 나타내는 도면이다.
도 2a 는 겔 시프트 에세이를 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2b 는 겔 시프트 에세이를 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2c 는 겔 시프트 에세이를 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2d 는 겔 시프트 에세이를 실시한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3a 는 시노비올린 프로모터의 전사 활성을 나타내는 도면이다.
도 3b 는 시노비올린 프로모터의 전사 활성을 나타내는 도면이다.
도 3c 는 RNAi 를 이용하여 녹아웃한 NIH3T3 세포에 있어서의 시노비올린 프 로모터의 전사 활성을 나타내는 도면이다.
도 4a 는 2.2k 와 1k 의 시노비올린 프로모터에 LacZ 를 결합한 플라스미드의 구축도이다.
도 4b 는 마우스 배에 있어서의 시노비올린 프로모터의 발현을 나타내는 사진이다.
도 4c 는 마우스 배에 있어서의 시노비올린 프로모터의 발현을 나타내는 사진이다.
도 5 는 디코이 핵산의 서열을 나타내는 도면이다.
도 6 은 활막 세포 중의 시노비올린의 발현 억제 확인 시험의 타임 스케쥴을 나타내는 도면이다.
도 7a 는 RA 활막 세포에 있어서의 시노비올린 프로모터의 발현을 나타내는 사진이다.
도 7b 는 활막 세포 중의 시노비올린의 발현 억제를 측정한 WST-8 에세이의 결과를 나타내는 도면이다.
도 7c 는 활막 세포 중의 시노비올린의 발현을 웨스턴 블로팅으로 확인한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8a 는 루시페라아제 에세이를 실시한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8b 는 디코이 ODN 을 이용하여 시노비올린을 녹다운한 NIH3T3 세포에 있어서의 아포토시스를 나타내는 사진 및 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도면이다.
도 8c 는 RNAi 를 이용하여 시노비올린을 녹다운한 NIH3T3 세포에 있어서의 아포토시스를 나타내는 사진 및 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 도면이다.
도 9a 는 EBS-1 디코이 ODN 에 의한 시노비올린의 발현 억제를 나타내는 사진이다.
도 9b 는 시노비올린을 과잉 발현한 NIH3T3 세포에 있어서의 EBS-1 디코이 ODN 처리에 의한 아포토시스를 나타낸다.
도 10 은 EBS-1 디코이를 이용한 RA 활막 세포에 있어서의 시노비올린 RNA 에 대한 억제 효과를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 조절 영역을 코드하는 부위에 대한 디코이 핵산을 제공하는 것을 특징으로 하는 것이다.
1. 개요
본 발명자는, 시노비올린을 중심으로 한 관절 류머티즘 병태 해석하였다. 최근, 시노비올린 녹아웃 마우스를 이용한 해석에 있어서, ER 스트레스에 의한 아포토시스 유도의 역치에 ERAD 의 기능을 담당하는 시노비올린의 양이 관여하는 것을 발견하였다.
그래서, 아포토시스 유도의 감수성을 결정하는 시노비올린의 양을 조절하는 전사 기구를 해명하기 위해 프로모터 해석을 실시하고, 마우스 세포주 및 마우스 배(胚) 를 이용하여 시노비올린의 구성적 발현을 담당하는 Ets 결합 부위 (EBS; Ets binding site) 를 동정하고, 그 엘리먼트가 인비보에 있어서 시노비올린의 발현에 필수적인 것을 증명하였다. Ets 는 효모에서부터 인간까지 보존되고 있는 전사 인자이다. Ets 도메인은 30 종류 이상의 패밀리를 형성하고, 그 대부분이 분화ㆍ증식ㆍ아포토시스를 담당하는 분자의 전사 활성을 담당하고 있다 (D.K.Watoson and A.Seth,; Oncogene.review issue. Dec 18; 19(55); 2000). 또, NIH3T3 세포에 있어서, 그 EBS 를 통하여 Ets 패밀리의 하나 GABP α/β 복합체가 그 전사 제어에 관여하고 있는 것을 나타내었다.
시노비올린의 발현은 헤테로 녹아웃 (LacZ knock in mouse) 의 발현 해석, 노던, 웨스턴에 의한 해석에 의하면 유비쿼터스이며, 많은 세포에 있어서 시노비올린의 발현이 필요하다는 것을 생각할 수 있다. 이것은, 시노비올린 녹아웃 마우스가 전신성의 아포토시스 항진에 의해 태생 치사인 점에서도 추측할 수 있다. 단, 그 발현에는 강약이 있어, 특히 분비 능력이 높은 세포 (췌장, 정소, 신경세포) 에 있어서 그 발현이 강하다. 이것은 일부의 세포에서는, 시노비올린의 발현이 매우 높게 요구되는 것으로 생각할 수 있다.
전사 제어 기구에는, (i) 기본 전사 복합체를 포함하는 구성적 유전자 발현과, (ii) 어느 자극에 대한 유도적 유전자 발현이 있다. 시노비올린의 프로모터에는 TATA 박스, 이니시에이터 서열이 존재하지 않는다. 이러한 프로모터 구성의 경우, SP1 이나 Ets 패밀리 등의 전사 인자가 그 전사 유도에 있어서 중요하다 (Rudge, Exp Cell Res. Mar 10; 274(1): 45-55. 2002).
구체적인 전사 인자로서는, GABPα, GABPβ, GABPα 와 GABPβ 의 복합체, Ets1, Tel, Fli-1 등을 들 수 있다.
GABPα 는 Ets 도메인을 가지는 Ets 패밀리의 하나이며, 454 아미노산을 가지는 단백질이다. GABPα 는 세포에 있어서 유비쿼터스에 발현하고, Ets 도메인을 통하여 GABPβ 와 헤테로 2량체를 형성한다. 또한, GABPα 는 2 개의 Ets 결합 부위를 사용하여 헤테로 4량체를 형성하는 것이 알려져 있다. 또, 타켓 유전자의 전사 제어에 있어서 몇 개의 특징을 가진다. 우선, GABPα 는 Ets 도메인에 의한 DNA 결합능은 가지지만, 전사 활성화능은 가지지 않는다. 이에 대해, GABPβ 는 DNA 결합능은 가지지 않지만, GABPα 와 2량체를 형성함으로써 전사 활성을 유도하고, 헤테로 4량체를 형성함으로써 더욱 높은 전사 활성화능을 발휘한다 (Yu M.J Biol Chem Nov 14; 272(46): 29060-7.1997). 또, GABPα 는 TATA 박스를 가지지 않는 유전자나, 복수의 전사 개시점을 가지는 유전자의 발현에 있어서 이니시에이터로서 작용할 수 있다 (Yu M.J Biol Chem Nov 14; 272(46): 29060-7. 1997; Kamura T.J Biol Chem Apr 25; 272(17): 11361-8. 1997). 또한, GABPα 는 그 발현이 유비쿼터스임에도 불구하고, 다른 부위에 결합하는 파트너의 전사 인자와 상승적으로 기능함으로써, 세포 특이적인 분화ㆍ증식에 관여하는 유전자의 발현을 담당한다 (Schaeffer L, EMBO J. Jun 1;17(11): 3078-90.1998).
GABPβ 는 Ets 패밀리는 아니지만, 382 아미노산을 가지는 GABPα 의 코팩터이며, Ankyrin 리피트 서열을 통하여 GABPα 와 헤테로 2량체를 형성하고, 전사 활성 도메인을 가진다.
Ets1 은 1983 년에 닭에 적아구증을 일으키는 레트로 바이러스 E26 의 암 원유전자로서 발견된 v-Ets 의 인간 호몰로그이며, 441 아미노산을 가지는 단백질이다.
Tel 은 452 아미노산을 가지는 단백질이며, Ets 패밀리 중에서도 전사 억제에 작용하는 것이 보고되어 있다. 임상적으로는, t (12;21) 의 염색체 전좌에 의해 AML1 과 유합 유전자를 형성하여 백혈병을 일으키는 것이 알려져 있다.
Fli-1 은 452 아미노산으로 이루어지고, t (11;22) 염색체 전좌에 의해 EWS 와 유합 유전자를 형성하여 유잉육종(ewing sarcoma)을 일으키는 것이 알려져 있다.
Ets 패밀리는 효모에서부터 인간까지 보존된 Ets 로 불리는 도메인을 가지는 전사 인자이다. 이 도메인은 30 종류 이상의 패밀리를 형성하고, 그 대부분이 분화ㆍ증식ㆍ아포토시스를 담당하는 분자의 전사 활성을 담당하고 있다 (D. K. Watoson and A.Seth,; Oncogene.review issue. Dec 18;19(55); 2000).
프로모터 영역을 얻기 위해서는, 시노비올린 유전자 또는 마우스나 인간 게놈 서열 등으로부터, 제한 효소를 이용하여 잘라내는 방법이 있다. 그러나, 일반적으로 적당한 제한 효소 부위가 적절한 위치에 존재한다고는 한정되지 않기 때문에, 미리 제한 효소 인식 부위를 형성한 프라이머를 이용함으로써, PCR 로 원하는 프로모터 영역을 증폭함으로써 얻을 수 있다. 또, 이미 판명된 프로모터 영역의 염기 서열 정보를 기초로 하여, 원하는 프로모터 영역을 화학 합성하는 것도 가능하다. 이렇게 하여, 전사 인자 결합 부위로서 EBS 외에 ABS 및 SBS 의 존 재가 시사된다. 실제로 전사 인자가 그 부위에 결합되는지 여부는, 각각의 부위를 변이시켜 그 전사 활성이 저하되는 것 또는 겔 시프트 에세이 (electrophoretic mobility shift assay: EMSA) 로 해석하여, 전사 인자가 원래의 프로브에는 결합하지만, 1 염기 변이 도입 후에는 결합하지 않는 것을 확인함으로써 판단한다.
여기서, 서열 번호 1 에 마우스 시노비올린 유전자의 전체 길이 프로모터 서열을, 서열 번호 2 에 인간 시노비올린 유전자의 전체 길이 프로모터 서열을 예시한다.
또, 서열 번호 8 에 프로모터 코어 영역인 EBS-1 을 코드하는 염기 서열을, 서열 번호 9 에 ABS-1 을 코드하는 염기 서열을, 서열 번호 10 에 SBS-1 을 코드하는 염기 서열을 나타낸다.
2. 디코이 핵산
본 발명은 상기 전사 인자에 결합하여, 프로모터 활성을 억제할 수 있는 디코이 핵산 (디코이올리고뉴클레오티드) 이다. 본 발명의 디코이 핵산은 전사 인자의 결합 부위를 포함하는 짧은 유인 핵산을 의미하고, 이 핵산을 세포 내에 도입하여 전사 인자가 이 핵산에 결합함으로써, 전사 인자의 본래의 게놈 결합 부위로의 결합이 경합적으로 저해되고, 그 결과, 그 전사 인자의 발현이 억제되는 기능을 가진다. 대표적으로는, 디코이 핵산은 핵산 또는 그 유사체이며, 표적 결합 서열에 결합할 수 있는 핵산 서열을 적어도 하나 포함한다.
본 발명의 바람직한 디코이 핵산의 예는, 예를 들어 프로모터의 EBS-1 에 결 합하는 전사 인자와 결합할 수 있는 핵산, 프로모터의 ABS 에 결합하는 전사 인자와 결합할 수 있는 핵산, 프로모터의 SBS-1 에 결합하는 전사 인자와 결합할 수 있는 핵산, 이들의 상보체를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 이들의 변이체 또는 이들을 분자 내에 함유하는 핵산 등을 들 수 있다. 디코이 핵산은 상기 EBS-1, ABS 또는 SBS-1 의 서열을 기초로, 1 개 사슬, 또는 그 상보 사슬을 함유하는 2 개 사슬로서 설계할 수 있다. 길이는 특별히 한정되지 않고, 15∼60 염기이며, 20∼30 염기가 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 예를 들어 EBS-1 에 결합하는 전사 인자와 결합할 수 있는 핵산 (서열 번호 11) 및/또는 그 상보 사슬 (서열 번호 12) 을 디코이 핵산으로서 바람직하게 사용할 수 있다.
핵산은 DNA 이어도 되고, RNA 이어도 되며, 또는 그 핵산 내에 수식된 핵산 및/또는 의(擬) 핵산을 함유하고 있어도 된다. 또 이들의 핵산, 그 변이체, 또는 이들을 분자 내에 함유하는 핵산은, 1 개 사슬 또는 2 개 사슬이어도 되고, 또 고리상이어도 되고 선상이어도 된다. 변이체란, 상기 디코이 핵산 서열의 1 개 또는 수개 (예를 들어, 1 개∼10 개, 1 개∼5 개 또는 1 개∼2 개 등) 의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한, 시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능, 즉, 전사 인자와 결합하는 기능을 가지는 핵산을 말한다. 상기 염기 서열을 1 개 또는 그 이상 함유하는 핵산이어도 된다.
본 발명에서 이용되는 디코이 핵산은 당업계에서 공지된 화학 합성법 또는 생화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 유전자 재조합 기술 로서 일반적으로 이용되는 DNA 합성 장치를 이용한 핵산 합성법을 사용할 수 있다. 또, 주형이 되는 염기 서열을 단리 또는 합성한 후에, PCR법 또는 클로닝벡터를 이용한 유전자 증폭법을 사용할 수도 있다. 또한, 이들 방법에 의해 얻어진 핵산을, 제한 효소 등을 이용하여 절단하고, DNA 리가아제를 이용하여 결합함으로써 원하는 핵산을 제조해도 된다. 또한, 세포 내에서 보다 안정적인 디코이 핵산을 얻기 위해, 염기 등에 알킬화, 아실화 등의 화학 수식을 부가할 수 있다. 디코이 핵산의 변이체의 제작 방법은 당업계에서 공지의 방법을 이용하고, 예를 들어, 부위 특이적 돌연변이 유발법 등에 의해 합성할 수도 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법은 당분야에 있어서 주지된 것이며, 시판되는 키트, 예를 들어 GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System (인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 (다카라바이오사 제조) 을 사용할 수 있다.
디코이 핵산을 사용한 경우의 프로모터의 전사 활성의 해석은, 일반적으로 실시되는 루시페라아제 에세이, 겔 시프트 에세이, CAT 에세이, 아포토시스의 특이적 마커인 아넥신 V 를 이용한 염색 방법, 웨스턴 블로팅법, FACS 해석법, RT-PCR 등을 채용할 수 있다. 이들의 에세이를 실시하기 위한 키트도 시판되고 있다 (예를 들어, promega dual luciferase assay kit).
예를 들어, 루시페라아제 에세이의 경우에는, 목적 유전자의 전사 개시점의 상류에 리포터로서 호타르루시페라아제 유전자를 연결한다. 또, 에세이의 대상 이 되는 세포간의 도입 효율을 보정하기 위해, 사이토메갈로바이러스 (CMV) β갈락토시다아제 (β-gal) 유전자를 리포터로서 프로모터의 하류에 이은 벡터를 세포에 동시에 도입해도 된다. 세포로의 도입은, 예를 들어 인산 칼슘법 등을 채용할 수 있다. 벡터를 도입한 세포는 소정 시간 배양한 후에 회수하고, 동결-융해 등에 의해 세포를 파괴한 후, 일정량의 세포 추출액을 이용하여 루시페라아제 및 β-gal 활성을 측정한다.
이들의 해석에 의해, 디코이 핵산을 사용한 경우에는 시노비올린의 전사 활성이 저해되고, 활막 세포, 암 세포 등의 아포토시스가 유도되는 것이 나타난다.
3. 디코이 핵산을 함유하는 의약 조성물
본 발명은, 상기 디코이 핵산을 1 또는 그 이상 함유하는, 시노비올린 유전자의 발현에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 디코이 핵산은 표적 결합 서열로의 결합 활성을 가지는 한, 본 발명의 의약 조성물로서 이용된다.
본 발명의 의약 조성물의 적용 질환으로서는, 관절 류머티즘, 선유증, 암 및 뇌신경 질환 등의 세포 증식성 질환 및/또는 뇌신경 질환을 들 수 있다. 본 발명의 의약 조성물을 질환에 적용함에 있어서, 상기 질환은 단독인 경우이어도 되고, 복수의 질환이 병발한 경우이어도 된다.
본 발명의 의약 조성물을 암의 치료제로서 사용하는 경우에는, 암의 종류는 특별히 한정되지 않고, 뇌종양, 설암, 인두암, 폐암, 유방암, 식도암, 위암, 패장암, 담관암, 담낭암, 십이지장암, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 신장 암, 방광암, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 피부암, 각종 백혈병 (예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프액성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프액성 백혈병, 성인형 T 세포 백혈병, 악성 임프종) 등을 대상으로 하여 적용된다.
상기 암은 원발소이어도 되고, 전이된 것이어도 되며, 다른 질환과 병발된 것이어도 된다.
뇌신경계 질환으로서는, 예를 들어 알츠하이머, 파킨슨병, 폴리글루타민병을 들 수 있다.
본 발명의 의학적 조성물은 디코이가 환부의 세포 내 또는 목적으로 하는 조직의 세포 내에 삽입되는 형태로 이용된다.
본 발명의 디코이 핵산을 함유하는 의약 조성물의 투여 형태는, 경로, 비경구 투여 중 어느 것이어도 가능하다. 경구 투여의 경우에는 적당한 제형, 예를 들어 정제, 환제, 당의제, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁물에 의해 투여가 가능하다. 비경구 투여의 경우에는, 경폐제형 (예를 들어, 네뷸라이저 등을 이용한 것), 경비투여제형, 경피투여제형 (예를 들어, 연고, 크림제), 주사제형 등을 들 수 있다. 주사제형의 경우에는, 예를 들어 링겔 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 직접적 또는 간접적으로 환부에 투여할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 유전자 치료제로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 의약 조성물을 주사에 의해 직접 투여하는 방법 이외에, 핵산이 삽입된 벡터를 투여하는 방법을 들 수 있다. 상기 벡터로서는, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 백신 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터, 렌치 바이러스 벡터 등을 들 수 있고, 이들의 바이러스 벡터를 이용함으로서 효율적으로 투여할 수 있다.
또, 본 발명의 의약 조성물을 리포솜 등의 인지질 소포체에 도입하고, 그 소포체를 투여하는 것도 가능하다. 본 발명의 의약 조성물을 유지시킨 소포체를 리포펙션법에 의해 소정의 세포에 도입한다. 그리고, 얻어지는 세포를 예를 들어 정맥 내, 동맥 내 등으로부터 전신 투여한다. 뇌 등에 국소 투여할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물을 목적하는 조직 또는 기관에 도입하기 위해, 시판되는 유전자 도입 키트 (예를 들어, 아데노익스프레스:클론텍사) 을 이용할 수도 있다. 리포솜 구조를 형성하기 위한 지질로서는, 인지질, 콜레스테롤류나 질소 지질 등이 이용되지만, 일반적으로, 인지질이 바람직하고, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딘산, 카르디올리핀, 스핑고미엘린, 난황 레시틴, 대두 레시틴, 리조 레시틴 등의 천연 인지질, 혹은 이들을 정법(定法) 에 따라 수소 첨가한 것을 들 수 있다. 또, 디세틸포스페이트, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디팔미트일포스파티딜에탄올아민, 디팔미트일포스파티딜세린, 에레오스테아로일포스파티딜콜린, 엘레오스테아로일포스파티딜에탄올아민 등의 합성 인지질을 이용할 수 있다.
리포솜의 제조 방법은, 디코이가 유지되는 것이면 특별히 한정되는 것이 아니라, 관용의 방법, 예를 들어, 역상 증발법 (Szoka, F 들, Biochim. Biophys. Acta, Vol. 601 559 (1980)), 에테르 주입법 (Deamer, D.W.: Ann. N. Y. Acad. Sci., Vol. 308 250 (1978)), 계면 활성제법 (Brunner, J 들: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 455 322 (1976)) 등을 이용하여 제조할 수 있다.
이들의 인지질을 함유하는 지질 종류는 단독으로 이용할 수 있지만, 2 종 이상을 병용하는 것도 가능하다. 이 때, 에탄올 아민이나 콜린 등의 양성기를 가지는 원자단을 분자 내에 가지는 것을 이용함으로써, 전기적으로 음성의 디코이 핵산의 결합률을 증가시킬 수도 있다. 이들 리포솜 형성시의 주요 인지질 외에 일반적으로 리포솜 형성용 첨가제로서 알려진 콜레스테롤류, 스테아릴아민,α-토코페롤 등의 첨가제를 이용할 수도 있다. 이렇게 하여 얻어지는 리포솜에는, 환부의 세포 또는 목적으로 하는 조직의 세포 내로의 주입을 촉진시키기 위해, 막 융합 촉진 물질, 예를 들어 센다이 바이러스, 불활화 센다이 바이러스, 센다 바이러스로부터 정제된 막 융합 촉진 단백질, 폴리에틸렌글리콜 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 통상적인 방법에 따라서 제제화할 수 있고, 의약적으로 허용되는 캐리어를 함유하는 것이어도 된다. 이러한 캐리어는 첨가물이어도 되고, 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 아르긴산나트륨, 수용성덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아 고무, 카제인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청알부민, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
상기 첨가물은 본 발명의 치료제의 제형에 따라 상기 중에서 단독 또는 적절하게 조합하여 선택된다. 예를 들어, 주사용 제재로서 사용하는 경우, 정제된 디코이 핵산을 용제 (예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등) 에 용해하고, 이것에 TWeen80, Tween20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 또는, 사용 전에 용해하는 제형으로 하기 위해 동결 건조시킨 것이어도 된다. 동결 건조용 부형제로서는, 예를 들어 이하의 것을 들 수 있다. 즉, 만니톨, 포도당, 락토오스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨 등의 당류, 옥수수, 밀, 벼, 감자 또는 다른 식물 유래 전분 등의 전분, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨 등의 셀룰로오스, 아라비아 고무, 트래가칸트 고무 등의 고무, 젤라틴, 콜라겐 등이다.
필요에 따라, 가교된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 아르긴산 또는 그 염 (예를 들어, 아르긴산나트륨) 등의 붕괴제 또는 가용화제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여량은 연령, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 회수, 제형에 따라 상이하다. 투여 방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적절하게 선택한다. 유효 투여량은 질환의 징후 또는 상태를 경감하는 디코이 핵산의 양이다. 이러한 핵산의 치료 효과 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물에 있어서의 표준적인 약학적 순서, 예를 들어 ED5O (집단의 50% 에 있어서 치료적으로 유효한 용량), 또는 LD50 (집단의 50% 에 대해서 치사적인 용량) 에 의해 결정될 수 있다.
치료 효과와 독성 효과 사이의 용량비는 치료 계수이며, ED50/LD50 으로서 나타내질 수 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 예를 들어 1 회에 대해 체중 1kg 당 0.1㎍∼100㎎ 이고, 1∼10㎍ 이 바람직하다. 단, 상기 치료제는 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다. 아데노바이러스를 투여하는 경우의 투여량은, 1 일 1 회당 106∼1013개 정도이며, 1 주∼8 주 간격으로 투여된다. 단, 본 발명의 의약 조성물은 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕
본 실시예는 시노비올린 프로모터의 제작을 위한 플라스미드 구축에 관한 실시예이다.
마우스 (C57B1/6계) 의 게놈으로부터, 시노비올린 유전자를 함유하는 5' 에서 3' 까지 약 7.5k 의 게놈을 SyB/pBluescript 에 서브클로닝하였다. 그 후, 시노비올린 유전자의 프로모터 영역을 XhoI 와 NcoI 로 처리하고, 약 2.2k 의 단편을 뽑아내고, PGV-B2 (TOYO INK GROUP사) 내에 삽입하였다 (SyG-2.2k). 이 약 2.2k 의 단편을 전체 길이 프로모터로 하였다 (서열 번호 1). 또한, 전체 길이 프로모터의 5' 측에서 일부의 영역을 삭제하여, 프로모터 영역을 짧게 한 컨스터럭트를 제작하였다. 제작한 프로모터를 정리하면 표 1 과 같다.
제작한 프로모터 일람표 (마우스)
명칭 영역* 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 영역
-2201/+843 (전체 길이) TS (전사 개시점) 를 기점 (+1) 으로서 상류 (5'측) 에 2201 염기, 하류 (3'측) 에 843 염기의 영역 1∼3043
-1233/+843 TS 를 기점으로서 상류에 1233 염기, 하류에 843 염기의 영역 969∼3043
-1060/+843 TS 를 기점으로서 상류에 1060 염기, 하류에 843 염기의 영역 1142∼3043
-503/+843 TS 를 기점으로서 상류에 503 염기, 하류에 843 염기의 영역 1699∼3043
-322/+843 TS 를 기점으로서 상류에 322 염기, 하류에 843 염기의 영역 1880∼3043
-200/+843 TS 를 기점으로서 상류에 200 염기, 하류에 843 염기의 영역 2002∼3043
-108/+843 TS 를 기점으로서 상류에 108 염기, 하류에 843 염기의 영역 2094∼3043
-84/+843 TS 를 기점으로서 상류에 84 염기, 하류에 843 염기의 영역 2118∼3043
-73/+843 TS 를 기점으로서 상류에 73 염기, 하류에 843 염기의 영역 2129∼3043
-65/+843 TS 를 기점으로서 상류에 65 염기, 하류에 843 염기의 영역 2137∼3043
-39/+843 TS 를 기점으로서 상류에 39 염기, 하류에 843 염기의 영역 2163∼3043
-10/+843 TS 를 기점으로서 상류에 10 염기, 하류에 843 염기의 영역 2191∼3043
영역은 상류 (5'측) 를 향할 때에는 TS (서열 번호 1 의 제 2201 번의 t) 의 1 개 5' 측의 염기를 -1 로서 세고, 하류 (3'측) 를 향할 때에는 TS 를 +1 로서 센다.
또한, 인간의 시노비올린 유전자의 절단형 프로모터도, 마우스의 경우와 동일하게 제조할 수 있다 (서열 번호 2). 이 경우의 절단 부위의 위치를 표 2 에 나타낸다.
제작한 프로모터 일람표 (인간)
명칭 영역* 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 영역
-2201/+892 (전체 길이) TS (전사 개시점) 를 기점 (+1) 으로서 상류 (5'측) 에 2201 염기, 하류 (3'측) 에 892 염기의 영역 1∼3092
-1233/+892 TS 를 기점으로서 상류에 1233 염기, 하류에 892 염기의 영역 969∼3092
-1060/+892 TS 를 기점으로서 상류에 1060 염기, 하류에 892 염기의 영역 1142∼3092
-503/+892 TS 를 기점으로서 상류에 503 염기, 하류에 892 염기의 영역 1699∼3092
-322/+892 TS 를 기점으로서 상류에 322 염기, 하류에 892 염기의 영역 1880∼3092
-200/+892 TS 를 기점으로서 상류에 200 염기, 하류에 892 염기의 영역 2002∼3092
-108/+892 TS 를 기점으로서 상류에 108 염기, 하류에 892 염기의 영역 2094∼3092
-84/+892 TS 를 기점으로서 상류에 84 염기, 하류에 892 염기의 영역 2118∼3092
-73/+892 TS 를 기점으로서 상류에 73 염기, 하류에 892 염기의 영역 2129∼3092
-65/+892 TS 를 기점으로서 상류에 65 염기, 하류에 892 염기의 영역 2137∼3092
-39/+892 TS 를 기점으로서 상류에 39 염기, 하류에 892 염기의 영역 2163∼3092
-10/+892 TS 를 기점으로서 상류에 10 염기, 하류에 892 염기의 영역 2191∼3092
*영역은 상류 (5' 측) 를 향할 때에는 TS (서열 번호 1 의 제 2201 번의 t) 의 1 개 5' 측의 염기를 -1 로서 세고, 하류 (3'측) 를 향할 때에는 TS 를 +1 로서 센다.
다음으로, 상기 마우스 유래 프로모터의 변이체를 제작하기 위해, 오버랩 신장에 의한 부위 특이적 변이 유발법 (Molecular cloning, CSHL Press, 3rd edition, 2001년, chapter 13) 을 이용하여, SyG-2.2 kG-76T/BV2 를 제작하였다. 사용한 프라이머를 이하에 나타낸다.
1. EBS-1m(G-76T) : GCGCCGCCGTAAGTGAGGT (서열 번호 3)
2. ABSm(G-68T) : AAGTGAGTTGTCTTACCCCC (서열 번호 4)
3. SBS-1m (G-92A, C-91A) : ACTCCGCCAAGCCCCGCGCC (서열 번호 5)
PCR 은 반응액 50㎕ 중, 1 pmol SyB/pBluescript, 100pmo1프라이머, 0.2 mM dNTPs, 5U 폴리머라아제, 10mM Tris-HCl (pH8.3) 및 50mM KCl 을 함유하는 반응 조성액을 이용하여, 이하의 PCR 조건으로 실시하였다.
PCR 조건
제 1 단계: 94℃, 1 분→(94℃, 30 초→55℃, 30 초→72℃, 1 분 )×25 회
제 2 단계: 1 사이클째: 94℃, 1 분→55℃, 30 초→29 분에 걸쳐 30℃ 까지 차게 한다→30℃, 1 분→9 분에 걸쳐 72℃ 로→72℃, 1 분→(94℃, 30 초→55℃, 30 초→72℃, 1 분)×25 회
EBS-1m(G-76T) 은 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 제2125번째 (TS 에서 상류를 향하여 76 번째 (-76)) 의 G 를 T 로 변이시키기 위한 프라이머이며, ABSm(G-68T) 은, 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 제2133번째 (TS 에서 상류를 향하여 68번째 (-68)) 의 G 를 T 로 변이시키기 위한 프라이머이이고, SBS-1m(G-92A, C-91A) 은 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 제2112번째 (TS 에서 -91번째) 의 C 를 A 에, 또한, 서열 번호 1 에 나타내는 염기 서열의 제 2111 번째 (TS 에서 -92번째) 의 G 를 A 로 변이시키기 위한 프라이머이다.
〔실시예 2〕
본 실시예는 시노비올린 프로모터의 기능 해석에 관한 실시예이다.
시노비올린 양의 조절 기구를 해명하기 위해, 프로모터 해석하였다. 또한, 시노비올린은 트랜스제닉 마우스 (LacZ knock in) 의 해석, 그리고 노던 및 웨스턴의 결과로부터 유비쿼터스에 발현하고 있는 것을 알 수 있다.
우선, 시노비올린 프로모터의 클로닝 후, 번역 개시점으로부터 2.2k 를 포함하는 영역을 루시페라아제 벡터에 결합시켰다. 여러 가지 세포 (하기) 를 사용하여, 상류측에서 깎은 컨스트럭션으로 그 전사 활성을 조사하였다. 또한, 세포는, 10% 불활화 소 태아 혈청 첨가 DMEM 배지 (Life Techno1ogies, Inc.) 를 이용해 배양하였다.
사용한 세포
ATDC5: 마우스 teratocarcinoma 세포 AT805 유래의 아주(亞株). 연골 및 색소 세포 특이적. 알칼리포스파다아제 양성.
HEK293: 인간 태아 신장 유래 세포
NIH3T3: 마우스 태자 유래 섬유아 세포
트랜스펙션과 리포터 에세이는 이하와 같이 실시하였다
세포를 2×104/웰로 24 웰 플레이트에 준비하였다. 그 24 시간 후, FUGENE6 키트을 사용하여, 키트 (Biochem. Roche사) 의 메뉴얼에 따라 발현하였다.
또, 트랜스펙션 효율의 보정을 위해, CMV-β-gal 을 각 50ng 사용하여, 추가로 전체 벡터만을 넣어 전량을 200ng 으로 갖추었다.
트랜스펙션 후 30 시간으로 단백질을 회수하였다. 우선, 배지를 버린 후, PBS 로 세정하고, Passive lysis bufferTM (Promega사) 를 100㎕ 이용하여 세포 용해물을 회수하였다. 다음으로, 그 세포 용해물의 20㎕ 을 96 웰 플레이트로 옮긴 후, 루미노메타로 루시페라아제 활성을 측정하였다. 또한, β-gal 활성을 플레이트 리더로 측정한 후, β-gal 치로 Luc 치를 나누어 보정하였다. 또한, β-gal 염색은 이하와 같이 실시하였다. 즉, β-갈락토시다아제는 X-gal 을 사용하여 염색하였다 (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드 Sigma사). 배를 4% 파라포름알데히드로 20 분간 고정시켜, X-gal 용액에 침지시킨 후, 37℃ 에서 12 시간∼24 시간 염색하였다. 염색 후, PBS 로 세정하고, 다시 4% 파라포름알데히드로 고정하였다.
그 결과, -84 에서 -73bp 의 12 염기에 있어서 그 전사 활성이 10% 에서 30% 로 저하되었다 (도 1a, b).
그 영역을 포함하는 -114 에서 -1 에 있어서는, 마우스와 인간에서 94% 의 상동성을 가지고, 또한 12 염기에 있어서는, 100% 의 상동성이었다. 컴퓨터를 이용한 바이오인포메틱스 해석 소프트 (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCHJ.html) 로 해석을 실시한 결과, 그 12 염기에 EBS (Ets 결합 부위) 가 존재하는 것이 판명되었다 (도 1c).
다음으로, 본 발명자는 그 영역을 포함하는 전후의 영역에 있어서의 전사 인자 결합 서열에 변이를 도입하고, 몇 개의 세포계를 이용하여, 그 부위의 전사에 미치는 영향에 대해서 검토하였다.
도 1d 에 보여지는 바와 같이, EBS 의 점 변이에 의해, 거의 모든 세포계에서 그 활성이 약 9% 에서 40% 정도로 저하되었다. 이로부터, 이 EBS 는 시노비올린의 구성적 발현을 담당하는 필수의 엘리먼트라고 생각되었다 (이후 EBS-1 로 한다).
〔실시예 3〕
본 실시예는 EBS-1 (-89 에서 -65) 에 결합하는 전사 인자를 동정한 것이다.
Ets 패밀리는 30 종류 이상의 패밀리를 형성하고, 전부 DNA 결합 도메인인 Ets 도메인을 가진다. 또, 그 중심 배열은 GGAA 이며, 그 서열로의 결합에는 그 서열에 계속되는 서열이 중요하다고 생각되고 있다.
우선, 그 12 염기 서열을 포함하는 프로브를 사용하여, 실제로 그 서열에 전사 인자가 결합하는지 여부를 검토하였다. 이 전사 인자의 결합 시험은 겔 시프트 에세이 (EMSA) 에 의해 실시하였다.
EMSA 는 이하와 같이 실시하였다.
EBS-1 WT (-89 에서 -65): CCCCGCGCCGCCGGAAGTGT (서열 번호 6)
EBS-1 MT (-89 에서 -65): CCCCGCGCCGCCGTAAGTGT (서열 번호 7)
EMSA 용 프로브는 25 염기 서열의 센스 사슬과 안티센스 사슬을 90℃ 에서 10 분 어닐링시킴으로써 제작하였다.
다음으로, T4 뉴클레아제키나아제, 버퍼 및 γ32P 를 혼합하고, 혼합액을 실온에서 30 분 반응시켰다. 반응액을 MicroSpin G-25 칼럼 (Amersham Pharmacia Biotech사) 에 통하여, 채취된 칼럼의 프랙션을 원심으로 분리하여, 표지한 프로브를 얻었다. 방사 활성은 1㎕ 당 30000cpm 이상의 것을 사용하였다.
10㎍ 의 단백질, 반응 버퍼 및 프로브를 혼합하여 실온에서 30 분 반응시켰다. 수퍼 시프트의 경우에는, 프로브와 반응시키기 전에 1 시간 4℃ 에서 반응시켰다. 그 반응액을 비변성 겔로 100v, 50mA 로 3 시간 정도 영동시켰다. 겔을 건조시킨 후, Fuji BAS2000 을 이용하여 오토라디오그래피로 해석하였다.
그 결과, NIH3T3 의 핵추출액을 사용한 겔 시프트에 의해, 4 개의 밴드 (도 2a 의 a, b, c, d 위치의 밴드) 가 형성되는 것이 판명되었다. 또한, cold competition (표지되어 있지 않은 프로브를 이용한 경합 시험) 에 의해, 그 모든 밴드가 소실되고, 1 염기 변이를 도입한 프로브에 있어서는 그 저해가 보이지 않았다 (도 2a).
다음으로, 어느 Ets 패밀리가 결합하는지를 검토하기 위해, Ets1/Pea3, Ets 프로브의 cold competition 을 실시한 결과 Etsl/Pea3 의 프로브로 경합 저해되고, 그 변이에 의해 그 저해가 소실되었다 (도 2b, 5 와 6 번 레인).
이것은, Ets1/Pea3 프로브 (Santa Cruz사) 에 결합하는 인자인 Ets1, Pea3, GABPα 등의 전사 인자일 가능성을 생각할 수 있다. 또한, 다양한 항체를 사용하여 수퍼 시프트 시험을 실시한 결과, GABPα 와 Tel 이 수퍼 시프트하고, Fli-1 은 저해 효과를 나타내었다 (도 2b 의 5, 6 번의 레인, 도 2c 의 6, 7, 8 과 10, 11, 12 번의 레인). 또, GABPα, Fli-1, Ets1 의 인비트로 번역 산물로 겔 시프트 시험을 실시한 결과, 그 전부에서 수퍼 시프트가 보였다. 이들로부터, 이 서열에는 복수의 Ets 패밀리가 결합하는 것이 나타났다.
다음으로, 수퍼 시프트된 GABPα 에 의한 GABPβ 와의 복합체 형성에 대해 검토하였다. 각각 인비트로 번역 산물을 이용하여 겔 시프트 시험을 실시한 결과, GABPα 단백질에 GABPβ 단백질을 첨가한 레인 (7) 에 있어서, 새로운 밴드 (a, b (복합체)) 의 형성이 확인되었다 (도 2d). 또한, GABPα 항체를 첨가하면, 그 복합체 a, b 가 소실되어 수퍼 시프트되었다 (도 2d, 레인 (8, 9)). 또한, GABPβ 항체를 첨가한 결과, 복합체 a 의 형성이 저해되었다 (도 2d, 레인 (10, 11)).
이들로부터, GABPα/β 는 시노비올린 프로모터의 EBS-1 로 복합체를 형성하는 것을 알 수 있었다 (도 2d).
〔실시예 4〕
본 실시예는 NIH3T3 에 있어서의 Ets 패밀리에 의한 전사 제어 및 GABPα 와 Fli-1, Ets1 의 시노비올린 전사 활성에 대한 효과를 확인한 것이다.
각각 EBS-1 에 결합하는 전사 인자의 세포 내에서의 시노비올린의 전사 활성화능을 평가하기 위해, 전사 활성화 에세이를 실시하였다.
(1) ODN 의 올리고 제작과 세포 추출액의 제작
20 뉴클레오티드 길이의 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (ODN) 는 화학 합성에 의해 얻었다. decoy (디코이) ODN 은 센스 및 안티센스올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의해 제작하였다. 대수 증식기의 세포를 트립신 처리하고, 96-웰 플레이트 (1×103 세포/웰) 로 옮겼다. 24 시간 후, 1 웰당 20pmol 의 디코이 ODN 을 웰에 넣어 LipofectAMINE (Invitrogen사, San Diego, CA) 을 이용하여 키트의 설명서에 따라 3 일간 트랜스펙션을 실시하였다. 디코이 ODN 을 가지는 세포의 증식을 결정하기 위해, Alamar Blue (Biosource International사) 를 사용하여, 키트의 설명서에 따라 세포 증식 에세이를 실시하였다.
(2) RNAi 의 올리고 제작과 세포 추출액의 제작
21 뉴클레오티드 길이의 RNA 는 화학 합성에 의해 얻었다. siRNA 는 Elbashir 들의 프로토콜 (Elbashir, S.M.,Nature 411:494-498. 2001) 에 따라 제작하였다. 대수 증식기의 세포를 트립신 처리하고, 96-웰 플레이트 (1×103 세포/웰) 로 옮겼다. 24 시간 후, 1 웰당 20pmol 의 siRNA 를 웰에 넣어 LipofectAMINE (Invitrogen사, San Diego, CA) 를 이용하여 키트의 설명서에 따라 3 일간 트랜스펙션을 실시하였다. siRNA 세포의 증식을 결정하기 위해, Alamar Blue (Biosource International사) 를 이용하여, 키트의 설명서에 따라 세포 증식 에세이를 실시하였다 (도 7b).
(3) 결과
NIH3T3 에 있어서, Fli-1 은 시노비올린 전사 활성을 억제하고, GABPα 는 그 전사 활성을 증가시키는 결과가 얻어졌다 (도 3a, b). 또, GABPα, GABPβ의 RNAi 로 녹아웃한 NIH3T3 세포에서는, 시노비올린의 전사도 저하가 확인되었다 (도 3c). 이들로부터 NIH3T3 에 있어서, GABPα/β 복합체가 시노비올린의 발현을 담당하고 있는 것으로 생각할 수 있다.
또한, 그 GABPα/β 복합체가 EBS-1 을 통하여 시노비올린의 전사 활성을 담당하고 있는 것을 증명하기 위해, EBS-1 (G-76T) 변이체 및 EBS-1 야생형이 가지는 프로모터 (-200 에서 +843) 를 사용하여 전사 활성 에세이를 실시하였다.
그 결과, 변이체가 전혀 활성화되지 않음에도 불구하고, 야생형에서는 약 3배의 전사 활성화가 보였다.
(4) 웨스턴 블로팅
마지막으로, NIH3T3 을 200nM 의 디코이로 처리한 후, 시노비올린의 발현을 웨스턴 블로팅으로 평가하였다.
웨스턴 블로팅 해석은 이하와 같이 실시하였다. 즉, 세포 배양물을 회수하고, 1% NP-40, 25mM Tris-HCl, pH6.8, 0.25% SDS, 0.O5% 2-메르캅토에탄올 및 0.1% 글리세롤을 함유하는 용액 중에서 용해시켰다. 투명한 세포 용해물의 알리쿼트를 SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 분리하였다. 분리한 단백질을 니트로셀룰로오스막으로 옮기고, 항시노비올린모노크로날 항체를 이용하여 이뮤노블롯을 실시하였다. 결합한 항체를, 퍼옥시다아제 결합 염소항 마우스 면역 글로블린 및 ECL 검출 시스템 (Amersham Pharmacia Biotech사) 에 의해 검출하였다.
그 결과, EBS-1 야생형으로 처리한 시노비올린의 발현은 약 반절로 저하되었다.
이들 데이터로부터 GABPα/β 에 의해 EBS-1 을 통하여, 시노비올린의 전사가 제어되는 것으로 나타났다.
〔실시예 5〕
본 실시예는, 마우스 배에 있어서의 시노비올린의 발현에 필수 부위의 동정에 관한 것이다.
다음으로, 마우스의 배에서 인비보에 있어서의 EBS-1 의 효과를 확인하기 위해, 시노비올린 프로모터에 LacZ 를 결합한 플라스미드를 과잉 발현시킨 트랜스제닉마우스를 제작하였다. Tg 는 전체 길이 2.2k 와 1k 의 프로모터와 각각 1 염기 변이를 넣은 프로모터를 과잉 발현시킨 4 종류를 제작하였다 (도 4a).
트랜스제닉 (Tg) 마우스용의 컨스트럭션과 Tg 마우스의 제작은 이하와 같이 실시하였다.
SyG-2.2k/BV2 로부터 NotI 와 NcoI 로 약 2.2k 의 단편을 뽑아낸 후, SyTB/pBluescript 에 삽입하여 SyL-2.2kwt/Bluescript 를 제작하였다. 또한, SyL-2.2kmG-76T/pbs, SyL-200wt/pBluescrlpt 및 SyL-200mG-76T/pBluescript 를, 각각 SyG 로부터 꺼낸 단편을 이용하여 제작하였다. 각 구축물에 대해, 각각 QIAGEN Plasmid Kit (QIAGEN사) 를 사용하여 정제 후, ScaI 로 선상화한 DNA 를 BDF 마우스 (C57BL/6N 과 DBA/2N 의 교배에 의한 자마우스) 의 수정란의 핵 내에 직접 마이크로인젝션하고, 가친모의 난관에 이식하였다. 각각, 8 내지 9 모태로부터 탄생한 마우스의 꼬리로부터 게놈을 추출하고, 서든 블롯법으로 Tg 마우스인 것의 확인을 실시하였다.
이들 Tg 마우스로부터 시노비올린의 발현을 검토하기 위해, 배에 의한 Xㆍgal 염색을 실시하였다. 그 LacZ 를 녹인한 녹아웃 마우스의 배에 있어서의 LacZ 의 발현과 금회 제작한 4 개의 Tg 마우스의 발현을 비교 검토하였다.
시노비올린의 11.5 에서 14.5 d.p.c (days post coitus: 태령) 의 배를 사용하여 LacZ 염색을 실시하였다. 2.2k 와 1k 의 프로모터를 도입한 트랜스제닉마우스는, 헤테로 녹아웃 마우스와 거의 동일한 부위에서 염색이 보였다. 놀라운 것은, 1 염기 변이를 도입한 2.2k 와 1k 의 프로모터를 도입한 트랜스제닉마우스는, 어느 쪽도 발현 부위가 그 계에 의해 랜덤해지는 것이 확인되었다 (도 4b).
전사 활성화에 필요한 영역이 없어지면, 상기 결과와 동일한 결과가 얻어지는 것이 보고되어 있다 (pax5, col11a2 등). 이들로부터, EBS-1 은 시노비올린의 전사에 필수 부위인 것이 판명되었다.
또한, 그 발현과 GABPα 의 발현을 13.5 d.p.c 의 배를 이용하여 비교한 결과, 거의 동일한 부위에서 발현하고 있는 것으로 판명되었다 (도 4c). 이상의 결과로부터, 배 발생에 있어서도, 인비트로의 결과와 마찬가지로, GABPα 가 EBS-1 을 통하여 시노비올린의 발현을 제어하는 것으로 나타났다.
〔실시예 6〕
본 실시예는, RA 활막 세포에 있어서의 시노비올린의 발현 억제를 확인한 것이다.
관절 류머티즘의 활막 세포에 있어서의 EBS-1 을 통한 GABPα 의 효과에 대해 검토한 결과, 활막 세포의 핵 추출액을 이용한 겔 시프트에 있어서도, NIH3T3 의 각 추출액 시와 동일하게, GABPα 로 수퍼 시프트가 얻어졌다. 또한, 그 EBS-1 의 류머티즘 활막 세포에 있어서의 의의, 즉 GABPα 에 의한 EBS-1 을 통한 전사 제어가 시노비올린의 발현 억제로 연결되고, 최종적으로 활막 세포의 증식 억제가 되는지를 확인하기 위해, EBS-1 디코이에 의한 시노비올린의 발현 억제에 대해 검토하였다.
우선, 상기의 EBS-1 에 결합하는 GABPα 와 결합하는 디코이 핵산 (서열 번호 11, 12) 및 네거티브 컨트롤의 디코이 핵산 (서열 번호 13, 14) 도 설계하였다 (도 5). 20 뉴클레오티드 길이의 ODN 은 화학 합성에 의해 얻었다. 디코이 ODN 은 센스 및 안티센스올리고뉴클레오티드의 어닐링에 의해 제작하였다.
이하와 같이, 디코이 핵산을 세포에 도입하였다. 즉, 대수 증식기의 인간 류머티즘 활막 세포를 트립신 처리하고, 10%FCS 를 함유하는 DMEM 로 96 웰 플레이트에 1.0×103 세포/웰로 배양하였다. 18∼24 시간 후, FCS 가 없고, 항생 물질이 없는 DMEM 으로 한 번 세정하고, FCS 가 없고, 항생 물질이 없는 DMEM 90㎕ 을 첨가하였다. OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 45㎕, 상기의 디코이 ODN (20μM)5㎕ 를 혼합한 것을, OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 50㎕, Lipofectamine 2000 1㎕ 를 혼합한 것에 첨가하고, 약하게 피펫팅한 후 10 분간 방치하였다. 이것을 세포에 10㎕ 씩 골고루 첨가하였다. 24 시간 배양 후, FCS 를 10㎕ 첨가하고, 가볍게 섞어 방치하고, 3 일간 트랜스펙션을 실시하였다 (도 6). 이 세포를 이용하여 키트의 설명서에 따라 세포 증식 에세이에 제공하였다.
HRP 활성의 검출에는 ECL Plus 키트 (Amersham사) 을 이용하였다.
그 결과, 약 반절로 그 발현의 저하가 확인되었다 (도 7a).
상기의 세포를 24 시간 배양 후, WST-8 에세이에 제공함과 동시에, 이 24 시간 후 세포 파쇄액으로 세포를 용해하고, 웨스턴 블로팅을 실시하였다. WST-8 에세이는 Cell Counting Kit-8 (Dojindo사) 을 이용하여 상기 24 시간 배양 후의 세포에 Cell Counting Kit-8 (Dojindo사, WST-8) 을 첨가하고, 4 시간 후의 흡광도 (450㎚) 를 측정하여 실시하였다. 웨스턴 블로팅은 세포 파쇄액 15mM tris (pH7.5), 200mM NaCl, 0.5% NP40, 0.1% SDS, 1mM PMSF, 2㎍/㎖ 류펩틴 (leupeptin), 2㎍/㎖ 아프로티닌 (aprotinin), 2㎍/㎖ 펩스타딘 (pepstatin) 으로 조제 후, SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 일렉트로블로팅법에 의해 니트로셀룰로오스 (NC) 막에 전사하였다. 이 NC 막에 대해, 5% 스킴 밀크를 첨가한 0.03% TWeen 20 첨가 TBS 로 실온, 1 시간 블로킹한 후, 항시노비올린 항체 또는 항β아시틴 항체를 0.5% 스킴 밀크를 첨가한 0.03% TWeen20 첨가 TBS 로 실온, 1 시간 면역 반응시켰다. 반응 후의 NC 막을 0.03% TWeen 20/TBS 로 세정하고, HRP 표지 항토끼 IgG 항체를 2 차 항체로 하여, 실온, 1 시간 면역 반응시키고, 0.03% Tween 20/TBS 로 세정하고, HRP 활성을 검출함으로써 목적 항원을 검출하였다.
WST-8 에세이의 결과를 도 7b 에, 웨스턴 블로팅의 결과를 도 7c 에 나타낸다. 도 7b 에 나타내는 바와 같이, 스크램블 디코이 핵산 도입 세포 (네거티브 컨트롤) 에 비해, EBS-1 디코이 핵산 도입 세포에서는 우위로 세포 증식 활성이 억제되고 있고, 도 7c 에 보여지는 바와 같이, 웨스턴 블로팅에 있어서도 시노비올린 단백질 생성량의 감소가 보였다.
이상의 결과로부터, RA 활막 세포에 있어서 상기 디코이 핵산을 이용하면 프로모터 활성이 억제되는 것이 나타났다.
〔실시예 7〕
본 실시예는, 시노비올린 발현에 있어서의 EBS-1 의 기능적인 효과를 확인한 것이다.
(1) 루시페라아제 에세이
시노비올린 발현에 있어서의 EBS-1 의 기능적인 효과의 검토하였다. 우선, EBS-1(-77/-72) 을 표적으로 하는 디코이 ODN (이하,『EBS-1 디코이』라고 한다) 을 합성하고, 이 EBS-1 디코이를 NIH3T3 세포에 도입함으로써, 시노비올린의 조절에 있어서의 EBS-1 디코이의 효과를 루시페라아제 에세이에 의해 확인하였다. FITC 를 이용한 면역 화학 분석에 의해, NIH3T3 세포에 도입된 EBS-1 디코이의 효과는 80% 이상인 것을 확인하고 나서 에세이를 실시하였다.
NIH3T3 세포에 대한 일과성 트랜스펙션을 실시하기 위해, 시료 플라스미드 (100ng) 및 내재 컨트롤 DNA (CMV-β-갈락토시다아제 발현 벡터 50ng) 를 FUGENE6TM (Roche사) 을 이용하여, 메뉴얼 (Roche사) 에 따라 트랜스펙션하고, 24 웰 플레이트에 첨가하였다. 30 시간 배양 후, 배양액을 흡인하여 PBS 로 세정하고, 세포에 Passive lysis bufferTM (Promega사) 를 100㎕ 첨가하였다. 그 세포 용해물의 잔사를 펠렛으로서 침전시키고, 상청을 회수하고, 바로 루시페라아제 활성 및 β-gal 활성을 측정하였다. 세포 추출물 중의 루시페라아제 활성을 측정하기 위해, 세포 용해액 20㎕ 를 에세이 버퍼 (0.25mM ATP, 10mM MgCl2, 100mM 인산 칼륨, pH7.8) 100㎕ 에 첨가하였다. 발광은 MicoLumat Plus (Perkin Elmer-Cetus사) 로 측정하였다. β-gal 에세이는 이하와 같이 실시하였다. 즉, 세포 추출물 7㎕ 에 에세이버퍼 (60mM Na2HPO4, 40mM NaH2PO4, 1mM MgCl2, 50mM β-메르캅토에탄올, 0.665㎎/㎖ ο-니트로페닐-β-D-갈락토시드) 를 100㎕ 첨가한 후, 37℃ 에서 30 분간 인큐베이션하였다. 1.0M Na2CO3 을 160㎕ 첨가하여 반응을 정지시키고, 420㎚ 로 흡광도를 측정하였다. 루시페라아제 측정치는 모두 플라스미드 CMV-β-갈락토시다아제로 발현한 β-갈락토시다아제에 대한 트랜스펙션 효율로 표준화 (보정) 하고, 얻어진 값을 상대 루시페라아제 활성으로 하였다. 또한, 이들의 값을 SyG-200/+843 에 대해서 상대화하여, 평균을 구하였다.
그 결과, EBS-1 디코이를 도입한 세포의 추출물을 이용한 루시페라아제 에세이에서는, 트랜스펙션 시약만을 사용한 경우와 비교하여, EBS-1 디코이에서는, 28.4% 까지 저하되고, 그에 따라, 전사가 억제된 (도 8a) 것으로 나타났다.
(2) 아넥신 V 에 의한 염색
NIH3T3 세포를 트립신 처리하고, 냉 PBS 로 2 회 세정하고, 1×아넥신 결합 버퍼 (Vybrant apoptosis assay kit, Invitrogen사) 에 현탁하고, 1×106 세포/㎖ 의 농도가 되도록 조제하였다. 1 시험당 세포 현탁액 100㎕ 를 사용하였다. 5㎍ 의 FITC 표지 아넥신 V 및 1㎕ 의 PI 검량선용 용액을 첨가하고, 실온에서 15 분간 인큐베이트한 후, 400㎕ 의 1×아넥신 결합 버퍼를 첨가하고, 천천히 교반한 후, FACSCalibur (Becton Dickinson사) 에 의해 해석하였다.
또, 시노비올린은 ER 스트레스에 의해 유도되는 아포토시스에 저항성을 가지는 점에서, 시노비올린의 양과 아포토시스의 관계를 분명히 하기 위해 이하의 실험을 실시하였다.
NIH3T3 세포를 조제하고, 24 시간 후에 GFP 또는 시노비올린의 siRNA (25nM) 를, LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen사) 을 이용하여 NIH3T3 세포에 트랜스펙션하고, 84 시간 인큐베이트 하였다. 또, 상기와 동일하게 하여 EBS-1 디코이 ODN 을 제작하고, 이것을 NIH3T3 세포에 트랜스펙션 하였다.
그 결과, EBS-1 디코이 핵산을 이용하여 시노비올린의 전사 저해에 의한 영향을 본 결과, NIH3T3 세포에 있어서 아포토시스가 유도되었다 (도 8b). 도 8b 에 있어서, 상 패널은 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내고, 하 패널은 NIH3T3 세포의 현미경 사진이다 (100 배). 동일하게, NIH3T3 세포에 있어서 시노비올린의 RNAi 에 의해 시노비올린의 발현량을 저하시킨 결과, 아포토시스가 유도되었다 (도 8c). 도 8c 에 있어서, 상 패널은 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내고, 하 패널은 NIH3T3 세포의 현미경 사진이다 (100 배).
(3) FACS 해석
또한, 시노비올린을 과잉 발현하는 NIH3T3 세포를 제작하고, EBS-1 디코이 핵산에 의한 영향을 검토하였다.
시노비올린을 과잉 발현하는 안정 세포주의 수립에 대해서는, LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen사) 에 의한 NIH3T3 세포에 대한 트랜스펙션으로부터 24 시간 후, 세포를 신선한 증식 배지에서 10 배 희석하여 계대하였다. 다음날, 선택 배지 (G418 를 0.5㎍/㎖ 함유) 를 첨가하고, HA-Synoviolin-HAHA/pcDN_A3 발현 벡터를 안정 발현하는 클론을 얻었다. 또한, 대조로서 또는 HA-p cDNA3 공(空) 벡터를 사용하였다. 각 세포주에 있어서 플라스미드로부터의 발현을 확인하기 위해, HA 태그에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다.
EBS-1 디코이 ODN 에 의한 아포토시스 유도에 대해서는, 다음과 같이 실험을 실시하였다.
FUGENE6TM (Roche사) 시약에 의한 EBS-1 디코이의 트랜스펙션을 실시하여 84 시간 후에, 세포를 회수하여 마이크로 튜브에 넣고, 아넥신 V-FITC 로 라벨하였다. FACS 분석에 의해, 생 세포와 아포토시스를 일으킨 세포의 분포 상태를 측정하였다. 또한, 시노비올린 항체를 이용한 웨스턴 블로팅도 실시하였다. 또한, 대조로서 β-액틴 항체를 사용하여, 안정 발현의 확인용으로서 HA-항체를 사용하였다.
결과를 도 9a 및 도 9b 에 나타낸다. 시노비올린 과잉 발현 세포에서는, EBS-1 디코이에 의한 아포토시스에 대한 저항성이 획득되었다 (도 9a, 도 9b). 또한, 아넥신 V 를 이용한 FACS 에 의한 아포토시스의 정량화를 실시한 결과, 통상의 NIH3T3 세포에 있어서는 51.1% 가 아포토시스를 일으켰으나, 시노비올린 과잉 발현 세포에서는, 그 비율이 29.8% 이었다 (도 9b). 도 9b 의 스크램블과 EBS-1 디코이의 패널 중, 좌측의 사진은 100 배의 배율에 의한 NIH3T3 세포의 현미경 사진이다.
이상으로부터, EBS-1 을 통하여 전사 조절을 억제하면, 시노비올린의 발현이 억제되고, NIH3T3 세포의 아포토시스가 유도되는 것으로 나타났다.
〔실시예 8〕
본 실시예는 EBS-1 디코이가 시노비올린 RNA 의 발현을 억제하는 것을, 실시간 PCR 에 의해 확인한 것이다.
대수 증식기의 인간 류머티즘 활막 세포 (RASCs) 를 트립신 처리하고, 10% FCS 를 함유하는 DMEM 로 6 웰 플레이트에 1.5×104 세포/웰로 배양하였다. 18∼24 시간 후, FCS 가 있고, 항생 물질이 없는 DMEM 으로 한 번 세정하고, FCS 가 없고, 항생 물질이 없는 DMEM 1000㎕ 를 첨가하였다. OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 47.5㎕, 상기의 EBS-1 디코이 ODN (final 100μM) 2.5㎕, 또는 시노비올린 siRNA (final 20μM) 2.5㎕ 를 혼합한 것을 OPTI-MEM I Reduced-Serum Medium 49㎕, Lipofectamine 2000 1㎕ 의 혼합물을 첨가하고, 약하게 피펫팅한 후 10 분간 방치하였다. 이것을 세포에 100㎕ 씩 골고루 첨가하였다. 24 시간 배양 후, 가볍게 섞어 방치하고, 이하의 방법에 의해 트랜스펙션을 실시하였다.
트랜스펙션 시약 첨가 84 시간 후, 세포로부터 Isogene (닛폰진사) 를 이용한 페놀 추출법으로 전체 RNA 를 추출하고, RT (real time)-PCR 을 실시하였다.
시약은 TaqMan Universal PCR Master Mix (Roche사) 및 Applied Biosystems 사로부터 구입한 이하의 프로브를 이용하였다.
시노비올린: HS00381211_m1 HRD1
hsGAPDH: Human GAPDH
즉, 프로브 0.5㎕, RNA 1㎕, TaqMan Univers al PCR Master Mix 5㎕, 정제수 3.5㎕ 를 PCR 튜브에 분주 후 혼합하고, 어플라이드바이오 RT-PCR7500 을 이용하여 RT-PCR 을 실시하였다.
사이클은 cDNA 신장 반응으로서 50℃ 2 분, 95℃ 10 분을 1 회, 계속해서 PCR 증폭 반응으로서 95℃ 15 초, 60℃ 1 분을 50 회 실시하고, 마지막으로 72℃ 5 분 최종 신장 반응을 실시한 후, 4℃ 에서 보존하였다.
RNA량 발현의 해석은 실시간 PCR 장치 부속의 해석 소프트를 이용하여 실시하였다. 시노비올린 유전자 발현량은 hsGAPDH 의 발현량으로 나눔으로써 값을 보정하였다.
그 결과, EBS-1 디코이를 이용한 경우, 시노비올린 RNA 의 발현이 억제되었던 것이 분명해졌다 (도 10).
본 발명에 의해, 시노비올린 유전자의 프로모터에 관한 디코이 핵산이 제공된다. 본 발명의 디코이 핵산은 시노비올린의 전사 인자 결합 부위에 있어서, 이 전사 인자와 경합적으로 결합할 수 있고, 그 결과, 시노비올린 프로모터의 활성을 억제할 수가 있다. 이것은, 본 발명의 디코이 핵산이 류머티즘 등의 각종 질환의 치료에 유용한 것을 의미한다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 3: 합성 DNA
서열 번호 4: 합성 DNA
서열 번호 5: 합성 DNA
서열 번호 6: 합성 DNA
서열 번호 7: 합성 DNA
서열 번호 11: 합성 DNA
서열 번호 12: 합성 DNA
서열 번호 13: 합성 DNA
서열 번호 14: 합성 DNA
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ggcactgaca ctgctaccct ttaatacagt tcctcctgtt gtgatcccca 720 accataatta cttcgttgct acttcataac tgtaattttg ctagttatga attgtaagta 780 aacgtctgat atgcaggata tctcatttgt gacccctgtg taacggtttg attcccaaag 840 ggcttacgac tcacaggttg agagccagcc actgccttaa agtcgtctag aatcagtttt 900 ctttcttttt tgacagacaa gatgtttaat tccgttgtac tgaaggaaag ccattttatg 960 tatttttctt aagtgctcta tcagtaatga caattctgaa agcccctgtg ttatatttta 1020 acaacacagt cacctccggt tctgtattca ctgtccgtgt tgtgactccc acagtataaa 1080 ttcctccagt tgatcttcat gaattcttat atttgatccc cccccccctt aggcctctga 1140 attccgagtg agtccgagtt aaaaatggga ggagcaccct ctagctgata aacctgggta 1200 atgaggtgtc cgctttcagt ttccattctg tacgcgacta tactgcttgt gtgagcccta 1260 acagacagaa tcagctcaga acaaagggtc tggctatctc ccagggatga acacgcacgc 1320 cgactgagct tttggggtgt tgaaaagtca acgccttcgc acagaactct ccaccccaac 1380 ctagaaataa ctggcgttct gttttatgtc agtccggaca cgcaagcact gctccttttg 1440 cgggccccgt aagcatcccc ccaggcggga tagggatccc cggcctatgg actgcgcttt 1500 ctcagctggc atccagctgc cttggcaccc agtccggggc cactctgcct acagacccta 1560 gcaaccactc acctgctttt ctttccctat aggccagaaa tttttccttt cttttctcat 1620 tggtccgcgt aactttatcg caaccaatcg gcggtacacg ggaacaaact cactcctaca 1680 caacctgcgt tggggggagg taacctggga agacctatat ctgttttctg caccgctatt 1740 tttttccgag aagcacttaa cttcttaccg tgtcgtagct atccctggaa tgaggcgctt 1800 acacatttta tttctttcat gcctgacata aagtctggcc cttgctcgct cctgcccccc 1860 gtccaaatgg ctcggcccgc ggaacgccca tcttccaggc acattgagag ccggagtctt 1920 ggagggagtt tagggtggtg attctacaac ggcgactagc aagtggcggg cttcagccct 1980 ttcccgctgc tctcctggtc gcgaccacac gtcacagctc tcgctcgttc cggttgctcg 2040 cgcagggggt ggggagtgtt gttaaccgga gcggctgccg cagtcgcggt gattgagcgt 2100 actccgccgc gccccgcgcc gccggaagtg aggtgtctta cccccgaagt tccggttcgc 2160 agggggtggg gagtgttgtt aaccggagcg gctgccgcag tcgcggtgat tgagcgtgct 2220 cgcggcgctg ggctcctggt gagtgggcct ggtcctgatt ggggttgggg ggtcggcgtc 2280 taggaccttg tcctttgggg tcactgcgat cagcccgccc cgctgcgttc ggccgccagt 2340 tttcggcctg tcagatggct ggagacctta ggcggcggcg cggccaccgt tccagaggcc 2400 gggccccgcc tgcgaggttc gcaactccta gcgttcacag gtgcgcgact gtgaggcgac 2460 ctgactggtt ctcagccccg ccgccgcacc ctggcggtcg gccgtttctc cggttctcag 2520 agtggacact gctgggggcg gggggggggg cagggttcca gactgacgta ccccgatggg 2580 cgcgcgtctg cgctgaccac cctggcacag ctgtcactgg ttgtgtcgcc ttctcaagct 2640 gtgccctctg caccttgcct cctccacccc tggcgggccc agcgaacctg cctctaaagc 2700 ctatcatccc agctccttca gagggtcagc ggtggcagcc cccctcctcc taactttgcc 2760 tcagtgactc cctagaggag gcgccttggc agacagcgtg gaagagccct agatttgaaa 2820 cgagattgat ccaagttcta ggccttgcat cagtgtgagc ctctaacccc tttgagtcct 2880 agtttctcgt ttgtgaaaca gggagtatat gctgttttga atctaatggc tgtcaaggtg 2940 aaatgagtgt ttgcccttac actctgccag ggactgtgct aggtttacat agtgtggata 3000 tcacaaatgt cattttcctt gtgcaggtct ctgggccagg gcgatg 3046 <210> 2 <211> 3092 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttggctcata acctcacttc ctttaagtct ttgctcaaat gtcaccttct caaggaagct 60 tacccgatta tcctcgctga tactgcaacc agcttcaagt accccaccac atcctgatcc 120 cctttattct gttctacttt tttcctatag cactgatcat cttccagcgt attagatttt 180 tcacttatgt ctgtggtttg ctgtcacatc tactaggata agctccacaa aggtagagat 240 ctttattttg ttcactgaca tcctaagtcc ctagaacagg agacacttga tccatatttg 300 tagactaact gaataaatga cttaattacc agtttggatg tgggggcaga tagtgagcat 360 gatgcccgtt tccggagctg gggtgcagac agtgtctagg gacactgaac tgttttaaaa 420 gcaggataga tcccggctgg agaccacaca aggaaatcat cagcacctgg gtcaggggct 480 ggactggagc agaggaaatc atgcaggaaa agtaaagaga aggacatcag gtaaagagaa 540 gaggacacat gcatagccag agagaaaaga ggagcagagg catgtggatc acagaagctt 600 agggaggaga ctttcaagaa ggggagagag gttgagtcaa gcaagggctg aaagccaacc 660 attggatgca gtcactagaa agttacagat aggcaaggtg ttgtggctca cgcctgtaat 720 cccaacacct tgtggggctg aggtgggagg atcgcttgag cccgggaggt cgaggctgca 780 atgagccctg atggcgccaa tgcactccag cctgggcgac agagcaagac cctgtcgcaa 840 aaattaataa ataaataaat aaaaagaaaa gggggaaaaa aagttatacg tggccttacg 900 gggaagccaa ctctgactgg ttataagctg aaactgtcaa gtcaacaggt ggcagggaag 960 atggctgaga ccaacagcac agagatttag aggcagacag acctggcgcc aatcctagga 1020 caggttttgg taagcctttg aatttcaatt gccccacgtt tcgggggagg gggtagcacc 1080 ccctagctca taaaccttag tgattgatga ttaaatgaga tgacggagga aaacgcaagg 1140 cacaaagtgg atgcattagc tccattttgt taatcagcag gcttagttgg ctgcgaccca 1200 gacacgaact aaaatacagt gcagcccagg accagtgggg gtcttgctta tggctcagag 1260 ctgaacaaca catgggcagc aaaatcagac actgagatgc gggcaggcct gcgacgctga 1320 agtcaattcc tttgaacaaa cagaacactt ccgtcccaag attagcagga attaatctcc 1380 cagtctcggg tacacctggt tgtccctccc tgtcctggcg cggcaaacgt tcccggaggc 1440 cagccaggga tcactcgccc aaggactgag ctttccctac tctcagccaa ctggagcggg 1500 accagggcct aggcaacgca gctgtccgcc cctaacaacc actcacctgc tttccccttt 1560 ctataggcca gcaaaggtac attctttttc ttattgggcc gcgtaactta tcgcaaccaa 1620 tcagtggcag ccacgggacc caactcactc ccacacaact tgtgggggtg atcatggaga 1680 agacaaattt ttgttttccg catccagttc tctcagagag caccgtattt gtcaaactgt 1740 tgtgactctc cctaaatgtt taagaaaaca tttcattccc ctcaggcttg tatagtctgt 1800 ccctggccta ctccccgctc caggtggtac agcccgcaag cggctcccct tcccagctgc 1860 tcgcggggcc gagtccccca gtccgaggag gccactcagc gcaggagcca taccatctgt 1920 gactaataaa taataggggg acctccgact cccccctgtt gccttattac cttccgacca 1980 cctctcggac ctcttgccca gcccttcccc gtagacatca ccccagatac ggtggtgaca 2040 ccattgctat gggcccacgt agggcgcagt gcgagccagg gcaggacgca cttggtacga 2100 cccacgccgc gccccgcgcc gccggaagtg aggtgtctga cccccgaagt tccggttcgc 2160 agggggtggg gagtgttgtt aaccggaggg gcagccgcag tcgcgcggat tgagcgggct 2220 cgcggcgctg ggttcctggt gagtggggcg aagtctggcc cgagttgtgg ttggggtcgg 2280 gacccgaacc ttccccttga ggtctccgga gtcggcacgc ccctcagccc cgccgcacgc 2340 tttcggcctg tcagctggcc ggagacctca gacgccggtg cggccgcttt gctcaagcct 2400 gggccctgcc tgcgacgccc gcaactcctg gtgctcacag gtgcgcggcc gcgagggcga 2460 cccggctcct cccgtcccgc tgctgctctc tcccgtcccg ctgtttttgt ggtgctctga 2520 gttgacacta ctccgggggt cgggggaccc caggattcca ggctgacgtt ccccgcccgc 2580 tcccgcaggg cgggcgtccg aactgcccac cctaacacag ctgtcaccgg cgctgtcgcc 2640 tgcccagcct gctatcctct gtgccttggc tgctctcagc cctggctgcg cattcccgcc 2700 cctggagcag atttctgctg ttgcctccca ccccatcttc tccaccggag ggtcagcggt 2760 gcagctcccc ctcctccaac attgcagctt ttcctcatca cctccctaga ggaggcggct 2820 tggcaggcag cgtggaaaga gccctagatt tgaagcaaga ctgacccagg ttccaggcct 2880 tgcgtcagtg tgatcactta accccttcga gtctaatttg taaaatgggg tagcgtaagc 2940 tattctttgt ctgatgattt cgagggcgaa atgtgatttc ccccccactt tctcctatga 3000 attgaggctg tgccaggcac cgggctattt tgcacagcac gagcatcaca taagttattt 3060 tcttgcccca tgcaggtctc cgggccaggg ca 3092 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 3 gcgccgccgt aagtgaggt 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 4 aagtgagttg tcttaccccc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 5 actccgccaa gccccgcgcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 6 ccccgcgccg ccggaagtgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 7 ccccgcgccg ccgtaagtgt 20 <210> 8 <211> 11 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gccggaagtg a 11 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tgaggt 6 <210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gccgcgcccc 10 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 11 gcgccgccgg aagtgaggtg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 12 cacctcactt ccggcggcgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 13 ttgccgtacc ctacttagcc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 14 ggctaagtag ggtacggcaa 20

Claims (13)

  1. 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 인자와 결합하여 프로모터 활성을 저해할 수 있는 디코이 핵산.
  2. 이하의 (a) 또는 (b) 의 디코이 핵산.
    (a) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 디코이 핵산
    (b) 서열 번호 11 또는 12 로 표시되는 염기 서열에 있어서 1 개 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능을 가지는 디코이 핵산.
  3. 이하의 (a) 또는 (b) 의 디코이 핵산.
    (a) 서열 번호 11 및 12 로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 디코이 핵산
    (b) 서열 번호 11 및 12 로 표시되는 염기 서열에 있어서 1 개 또는 수개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, 또한 시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능을 가지는 디코이 핵산.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    시노비올린 유전자의 프로모터 활성을 저해하는 기능이, 시노비올린 유전자의 프로모터의 전사 인자와 결합하는 기능인 핵산.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    EBS, SBS 및 ABS 로 이루어지는 군에서 선택되는 수개의 전사 인자 결합 부위의 염기 서열에 기초하여 설계된 핵산.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    활막 세포 또는 암 세포에 아포토시스를 유도할 수 있는 핵산.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 함유하는, 시노비올린 유전자의 발현에 기인하는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 의약 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    추가로, 약학적으로 허용 가능한 캐리어를 함유하는 의약 조성물.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    질환이 관절 류머티즘, 선유증, 암 및 뇌신경 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1 개인 의약 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 이용하여, 시노비올린의 전사 인자의 전사 활성을 저해하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 이용하여, 시노비올린의 프로모터 활성을 저해하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 이용하여, 시노비올린의 프로모터 활성을 저해함으로써 시노비올린의 발현을 억제하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 이용하여, 활막 세포 또는 암 세포에 아포토시스를 유도하는 방법.
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