KR20190062149A

KR20190062149A - 전이성 암 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20190062149A
Application number: KR1020180100502A
Authority: KR
Inventors: 임형신; 신솔비
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-08-27
Publication date: 2019-06-05
Also published as: KR102209537B1

Abstract

본 발명은 PLK1의 발현 및 작용 억제를 통하여 전이성 암세포의 전이성 및 침습성에 대한 강력한 억제효과를 갖는 전이성 암 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 PLK1의 발현 및 작용 억제 또는 특정 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질이 PLK1의 발현 및 작용 억제를 통해서 암의 치료 또는 예방 특히 암세포의 전이 또는 침습에 대한 강력한 억제효과를 가진다는 점을 새롭게 밝힌 바, 전이성 암의 치료에 널리 이용될 수 있다.

Description

전이성 암 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING METASTIC CANCER}

본 발명은 PLK1의 발현 및 작용 억제를 통하여 전이성 암세포의 전이성 및 침습성에 대한 강력한 억제효과를 갖는 전이성 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Polo-like kinase 1(PLK1)은 최근 발암의 원인 및 전이의 원인이 되는 타겟분자로 연구되고 있으며, 이를 기반으로 PLK1에 대한 억제제 개발을 통한 항암제 개발 연구가 다국적기업을 중심으로 경쟁적으로 진행되고 있다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761(2014) 31-39). PLK1은 구조적으로 인산화효소 활성을 지닌 효소활성 도메인과 기질과 결합하는 폴로박스 도메인을 지니고 있으며, T210 위치 에서의 인산화가 PLK1의 활성화를 유발시킨다. 기질의 폴로박스 도메인 결합에 의해 활성화된 PLK1의 인산화 효소는 기질의 Ser/Thr 잔기에 인산화를 유도하는 효소이다(Barr et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5(2004) 429-440). 기능적으로는 성장 및 분열하는 세포에서 발현이 증가되는데 특히 세포주기 중 세포분열기에서의 발현과 활성이 정점을 이루고 있다. 따라서 빠르게 성장하는 암세포에서 또한 그 발현율이 높은 것으로 알려져 있으며(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761(2014) 31-39), 암세포의 단계별 악성화 과정에서 많은 경우 그 발현이 증가되는 것이 실험적으로 보고되었다. 특히 비소세포 폐암, 두부경부암, 후두암, 유방암, 간암, 자궁내막암, 대장암, 난소암, 췌장암, 전립선암 등에서 악성 단계가 높을수록 그 발현이 증가되어 있음이 보고되었다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761(2014) 31-39). 임상적으로 PLK1의 발현이 낮을수록 암환자들의 치료 예후가 좋은 반면, PLK1의 발현이 높으면 암환자들의 생존율이 떨어진다는 연구결과가 비소세포폐암, 대장암 등 여러 암종에서 보고되어 환자의 치료 예후를 판단하는 지표로써 PLK1을 임상적으로 사용하고 있다.

PLK1 타겟 항암제 개발에 대한 연구는 2000년대 초반의 학계에서 연구성과들이 보고되면서 중반 이후 이를 기반으로 세계적 다국적 제약기업에서 항암제 개발을 위한 연구가 본격화되었다. 현재까지 볼라설팁(volasertib)를 중심으로 10여 종의 PLK1의 타겟 항암제 후보 물질이 연구되고 있으나, 미국 FDA로부터 혁신 치료제로 한정적 승인을 받은 볼라설팁(volasertib) 외에 임상적으로 승인받은 PLK1 타겟 항암제는 알려져 있지 않다

암전이는 암의 진행의 결과로 나타나는 현상이나, 실질적으로 원발소 암을 제거 또는 치료한다고 하더라도, 전이를 막을 수 없다면 암의 재발 등에 의해서 생존률이 매우 낮아진다. 암의 크기가 커질수록 주변 림프절 및 다른 조직으로 전이하는 비율이 높은 것으로 여겨지나, 암의 크기가 작음에도 불구하고 전이가 되는 경우가 있어, 아직까지 암의 전이와 증식의 관계는 여전히 명확하게 규명되어 있지 않다. 암의 치료에 있어, 암 세포의 증식 억제와 전이의 억제가 항상 같이 나타나는 효과가 아니고, 암의 전이를 억제할 수 있다면 많은 암의 치료 효율을 비약적으로 개선할 수 있다는 측면에서, 전이성 암의 치료를 위한 암의 전이 및 침윤을 효과적으로 억제하는 치료 타겟 또는 치료제의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 PLK1의 발현을 억제하는 유전자 치료를 기반으로 하는 항암제 개발에 노력한 결과, PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 PLK1 shRNA가 PLK1에 기반한 전이성 암세포의 전이성, 침습성, 종양 형성에 대한 억제 효과가 있음을 확인하였다. 또한, PLK1의 점 돌연변이를 함유하는 돌연변이체 단백질이 간암, 대장암 및 비소세포폐암의 전이성, 침습성, 종양 형성을 현저히 감소시키는 결과를 확인하고, 특히, PLK1 돌연변이체가 각종 고형암의 전이성, 침습성 및 종양 형성을 차단하고 감소시켜 전이성 암치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이러한 측면에서 본 발명은 서열번호 1의 PLK1(Polo-like kinase 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질 및 PLK1 변이단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA인 올리고 뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 상기 siRNA 또는 shRNA를 발현하는 재조합 벡터를 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) K82M 변이; 또는 b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질을 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 상기 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드; 이를 발현하는 재조합 벡터; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F, V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

또 다른 일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1의 PLK1(Polo-like kinase 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질 및 PLK1 변이단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 종양의 전이 억제용 조성물을 제공한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 PLK1 돌연변이체 또는 PLK1 억제제는 PLK1의 발현 및 작용 억제를 통해서 암의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다. 특히, PLK1 돌연변이 단백질은 암세포의 증식, 전이 및 침습에 대한 강력한 억제효과를 가지므로, 일차 항암제뿐 아니라 전이성 암의 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 대장암세포 HCT116에서의 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 전이성 억제효과를 확인한 결과이다:
A: 대장암세포 HCT116에서의 대조군(Control), 양성대조군(TGF-beta), PLK1 원형(WT), PLK1 활성형(T210D), ATP 결합부위 변이형(K82M), 폴로박스도메인 변이형(FA 변이: W414F 및 V415A 변이)의 발현에 의한 암세포의 전이성 변화를 시간에 따라 사진 촬영한 도면;
B: A 도면을 상대적 거리에 따라 암세포의 전이성을 백분율로 변환한 그래프;
C: 72 시간 후 암세포의 상대적 거리를 대조군(Control)을 0%라고 할 때, 타 실험군 암세포의 전이성을 상대적으로 변환한 그래프.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 간암세포 Hep3B, 폐암세포 H460 및 A549에서의 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 전이성 억제효과를 확인한 결과이다:
A: 간암세포 Hep3B에서 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 이동성을 상대적 거리에 따라 백분율로 변환한 그래프;
B: 간암세포 Hep3B에서 72시간 후 암세포의 상대적 거리에 대해 대조군(control)을 0%라고 할 때, 상대적 비율로 암세포의 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
C: 폐암세포 H460에서 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 이동성을 상대적 거리에 따라 백분율로 변환한 그래프;
D: 폐암세포 H460에서 72시간 후 암세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, 상대적 비율로 암세포의 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
E: 폐암세포 A549에서 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 이동성을 상대적 거리에 따라 백분율로 변환한 그래프;
F: 폐암세포 A549에서 72시간 후 암세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, 상대적 비율로 암세포의 이동성을 백분율로 변환한 그래프.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 폐암세포 A549에 PLK1 억제제인 BI 6727(volasertib)을 시간에 따른 처리에 의한 암세포의 전이성 억제 효과를 확인한 결과이다:
A: PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의해 유도되는 암세포 이동성이 BI 6727(volasertib) 처리에 의해 시간에 따라 감소되는 양상을 보여주는 세포 현미경 사진 도면,
B: BI 6727(volasertib) 처리에 의해 PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의해 유도되는 암세포 이동성을 시간에 따라 상대적 백분율로 변환한 그래프;
C: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군(Mock+Veh)을 0%라고 할 때, 암세포의 이동성을 상대적 백분율로 변환한 그래프;
D: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
E: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, BI6727 에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
F: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 PLK1 활성형(TD-PLK1)을 0%라고 할 때, PLK1 활성형(TD-PLK1)발현세포에서의 BI6727 처리에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
G: PLK1 활성형(TD-PLK1) 단백질을 발현시킨 A549 폐암세포를 정맥주사 한 마우스에서, BI6727 처리에 의한 전이성 암생성 억제효과를 관찰하기 위한 실험도;
H: PLK1 활성형(TD-PLK1) 단백질을 발현시킨 A549 폐암세포를 정맥주사 한 마우스에서, BI6727 처리에 의한 전이성 및 종양 억제효과를 관찰한 사진 및, 각 실험군의 전이성 암 생성 빈도를 수치로 나타낸 그래프.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PLK1 mRNA 억제물질인 PLK1 shRNA 처리에 의한 암세포의 전이성 억제 효과를 시간에 따라 확인한 결과이다:
A: PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의해 유도되는 암세포 이동성이 PLK1 shRNA 처리에 의해 시간에 따라 감소되는 양상을 보여주는 세포 현미경 사진;
B: PLK1 shRNA 처리에 의해 PLK1 활성형(TD-PLK1)에 의해 유도되는 암세포 이동성을 시간에 따라 상대적 백분율로 변환한 그래프;
C: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, PLK1 shRNA 처리에 의한 암세포의 이동성을 상대적 백분율로 변환한 그래프;
D: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, PLK1 shRNA 처리에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
E: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 대조군을 0%라고 할 때, PLK1 shRNA 처리에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
F: 72시간 후 세포의 상대적 거리에 대해 PLK1 활성형(TD-PLK1)을 0%라고 할 때, PLK1 활성형(TD-PLK1)발현 세포에서의 PLK1 shRNA 처리에 의한 암세포 이동성을 백분율로 변환한 그래프;
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 종양형성 억제 효과를 확인한 결과이다:
A: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 종양형성 양상을 보여주는 세포 현미경 사진;
B: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의해 형성된 종양 덩어리의 수를 측정하여 나타낸 그래프;
C: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의해 형성된 종양 덩어리의 수에 대해, 대조군을 1라고 할 때, 상대적 비율로 나타낸 그래프;
D: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의해 형성된 종양 덩어리의 수에 대해, PLK1 원형 발현 세포군을 1라고 할 때, 상대적 비율로 나타낸 그래프;
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 침습성 억제 효과를 나타낸 도면이다:
A: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 침습성 억제 효과를 관찰하기 위한 실험도;
B: 마트리겔(Matrigel)을 이용한 침습성 실험에서 크리스탈 바이올렛으로 염색 후 그 흡광도를 측정하여, 대조군의 침습성 정도를 1이라고 할 때, 다른 실험군의 침습성 정도를 상대적 수치로 나타낸 그래프;
C: B의 마트리겔(Matrigel)을 이용한 침습성 실험에서 PLK1 원형의 침습성 정도를 1이라고 할 때, 다른 실험군의 침습성 정도를 상대적 비율로 나타낸 그래프.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질을 발현시킨 폐암세포를 정맥주사 했을 때 마우스에서의 전이성 암생성 억제효과를 나타낸 도면이다:
A: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질을 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 전이성 암생성 억제효과를 관찰하기 위한 실험도;
B: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질을 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 전이성 암생성 및 억제효과를 관찰하여, 각 실험군의 전이성 암 생성 빈도를 수치로 나타낸 그래프;
C: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질을 발현시킨 폐암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 얻은 폐조직을 분쇄하여 상피간엽이행 단백질 마커의 변화를 나타낸 그래프;
D: 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질을 발현시킨 암세포를 정맥주사했을 때 마우스에서의 비장의 무게 변화를 나타낸 그래프.
도 8은 본 발명의 PLK1의 mRNA 서열을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 PLK1 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

본 발명은 PLK1(Polo-like kinase 1)의 mRNA 및/또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제 또는 PLK1 변이체 단백질을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 억제제는 PLK1(Polo-like kinase 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; PLK1 단백질의 아미노산에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질; 및 이를 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 일 수 있다.

본원발명에서 "PLK1(Polo-like kinase 1; Human Plk1 mRNA [NM_005030.5]- 서열번호 1, Human Plk1 protein [NP_005021.2]-서열번호 2)"은 구조적으로 기질이 결합하는 폴로박스 도메인(polo-box domain)과 인산화효소 활성부위(catalytic domain)를 지니고 있어 단백질 기능에 중요 부위로 알려져 있다(Yim, Anti-Cancer Drugs 24(2013) 999-1006; Yim and Erikson, Mutation Research Reviews Mutation Research, 761(2014) 31-39; Barr et al., Nat Rev Mol Cell Biol 5(2004) 429-440). 단백질의 구조에 따른 기능과 관련해서, T210위치에서의 인산화 형태의 변이(T210D)는 PLK1을 활성형 상태로 유지시켜 주는 것을 알려져 있고, 인산화 효소 활성부위에서 ATP 결합부위인 82번 위치의 Lysine(K)은 ATP와의 결합에 중요부위로 알려져 있으며 이 부위를 Methinone(M)으로 치환시킨 경우(K82M 변이형) 효소 활성이 억제되는 것으로 알려져 있다. 또한, 기질과 결합한다고 밝혀진 2개의 폴로박스 도메인에서의 첫번째 도메인의 414번 Tryptophan(W)과 두번째 도메인의 538번 Histidine(H) 또는 540번 Lysine(K)의 아미노산 잔기는 기질과의 결합에 중요한 부위로 알려져 있다. 그러나 PLK1 단백질에서 인산화효소 활성부위, ATP 결합부위 또는 기질과 결합하는 폴로박스 도메인은 PLK1 단백질 자체의 활성에 있어서 기능을 나타내는 것으로 알려져 있을 뿐, 상기 부위가 변이된 PLK1 변이 단백질 자체의 용도에 대해서는 밝혀진 바 없다.

본 발명의 발명자는 PLK1 단백질에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 변이단백질이 PLK1의 작용을 억제하여 이에 따른 암세포의 증식, 전이 또는 침습을 개선 또는 치료할 수 있음을 새롭게 밝혔다. 이러한 측면에서, 본 발명은 PLK1(Polo-like kinase 1)의 mRNA 및/또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 억제제 또는 PLK1 변이체 단백질을 포함하는 종양(또는 암세포)의 전이 억제용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 "PLK1 억제제"는 PLK1 mRNA 또는 PLK1 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로는 PLK1에 직접적으로 작용하거나, 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 방식으로 PLK1 유전자의 발현을 전사 수준에서 방해하거나 그 활성을 저해하여 PLK1의 발현 또는 활성을 감소시키는 모든 제제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 " PLK1"은 별도의 언급이 없는 한 PLK1 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석될 수 있다.

상기 PLK1 억제제는 PLK1 mRNA 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 모두 본 발명에 포함된다. 상기 PLK1 억제제는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; 또는 PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편일 수 있다.

이러한 측면에서 본 발명의 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드, 또는 10 내지 30 뉴클레오티드를 표적서열로 하여 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드일 수 있다. 구체적인 예로, 서열번호 1에서 1424-1444 번째 뉴클레오티드(서열번호 3); 286-306 번째 뉴클레오티드(서열번호 4); 785-805 번째 뉴클레오티드(서열번호 5); 554-574 번째 뉴클레오티드(서열번호 6); 593-613 번째 뉴클레오티드(서열번호 7); 1028-1048 번째 뉴클레오티드(서열번호 8); 671-691 번째 뉴클레오티드(서열번호 9); 501-521 번째 뉴클레오티드(서열번호 10); 431-451 번째 뉴클레오티드(서열번호 11); 110-130번째 뉴클레오티드(서열번호 12); 542-562번째 뉴클레오티드(서열번호 13); 725-745 번째 뉴클레티드(서열번호 14); 1497-1517 번째 뉴클레오티드(서열번호 15); 또는 1649-1669 번째 뉴클레오티드(서열번호 16)를 표적서열로 하여 PLK1 mRNA 발현을 억제하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열을 표적으로하는 경우, 더욱 효과적으로 PLK1의 발현 또는 활성을 억제할 수 있다. 본 발명에서 “표적 서열로 한다”는 것은 해당 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 결합하여 PLK1의 발현을 억제하는 것을 의미한다.

따라서, 이러한 측면에서, 본 발명의 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1에서 1424-1444 번째 뉴클레오티드 서열; 286-306 번째 뉴클레오티드 서열; 785-805 번째 뉴클레오티드 서열; 554-574 번째 뉴클레오티드 서열; 593-613 번째 뉴클레오티드 서열; 1028-1048 번째 뉴클레오티드 서열; 671-691 번째 뉴클레오티드 서열; 501-521 번째 뉴클레오티드 서열; 431-451 번째 뉴클레오티드 서열; 110-130번째 뉴클레오티드 서열; 542-562번째 뉴클레오티드 서열; 725-745 번째 뉴클레오티드 서열; 1497-1517 번째 뉴클레오티드 서열; 및 1649-1669 번째 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 것 일 수 있다.

또 다른 측면에서 본 발명은 상기 서열번호 1의 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터일 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명의 약학적 조성물은 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터의 형태로 포함할 수 있고, 따라서, 본 발명은 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드를 상기 뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 또는 종양의 전이 억제용 조성물; 또는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, "유전자 치료용 조성물"이란 유전자 질병 치료의 활성 성분으로 포함하는 조성물로 잘못된 유전자를 정상 유전자로 바꾸거나 치료하는 효과가 있는 유전자를 개체에 투입해 증상을 완화 또는 치료하는 효과를 갖는다. 본 발명에서는 PLK1의 발현 또는 활성을 억제하는 유전물질로서 올리고 뉴클레오티드를 포함하거나, PLK1 변이 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로서 포함하는 것 일 수 있다. 상기 유전자 치료용 조성물은 PLK1의 발현을 억제하거나, 특정 변이를 포함하는 PLK1 변이 단백질을 발현시킴으로서 암의 증식, 전이 또는 침윤을 억제할 수 있다는 점에서, 암의 유전자 치료용 조성물 일 수 있다.

본 발명에서, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 도입 시킬 수 있는 것을 의미하며, 도입 및 발현할 수 있는 발현벡터를 포함하며, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 벡터는 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 유전자 발현이 안정적이고, 세포에 효과적으로 유전자를 전달할 수 있는 렌티 바이러스 벡터(Lenti Viral Vector), 아데노 바이러스 벡터(Adono Viral Vector) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(Adeno-associated Viral Vector, AAV) 일 수 있다. 바람직하게는 렌티 바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터 일 수 있다. 렌티바이러스를 벡터로 사용하는 경우 유전자 전달 효율이 높고, 면역 반응 부작용이 거의 없다는 장점이 있다. 상기 벡터는 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 것을 이용할 수 있다. 상기 벡터는 본 발명의 올리고 뉴클레오티드를 발현할 수 있는 것으로, 개체 내에 투여되는 경우, 장시간에 걸쳐 올리고 뉴클레오티드를 제공함으로써, 우수한 항암효과를 가질 수 있다.

상기 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 PLK1 mRNA에 특이적인 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.

본 발명에서 "안티센스 올리고 뉴클레오티드"는 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 PLK1 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DAN 또는 RNA 서열을 의미한다. 일 예로, 서열번호 3 내지 16의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열에 상보적인 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 염기, 또는 8 내지 60 염기, 또는 10 내지 40 염기, 또는 10 내지 30 염기 일 수 있다. 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성는 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고 뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고 뉴클레오티드를 발현시키는 재조합벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 상법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 디자인은 서열번호 1의 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다. 일 예로, 안티센스 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 3 내지 16의 서열로 이루어진 군에서 선택된 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하는 것 일 수 있다.

본 발명에서 "앱타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로, 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 서열에 따라 다양한 3 차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 PLK1 mRNA에 결합하여 PLK1의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 앱타머는 서열번호 1의 PLK1의 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "siRNA" 및 "shRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. shRNA는 단일 가닥의 올리고 뉴클레오티드 내에서 상보적인 서열간의 결합에 의해 헤어핀(hairpin) 구조를 형성한 것이고, 생체 내에서 상기 shRNA는 다이서(dicer)에 의해 절단되면서 8 내지 30 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 이중 가닥의 올리고 뉴클레오티드인 siRNA가 되며, 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제할 수 있다. 따라서 shRNA 및 siRNA 중 어느 수단을 이용할지는 당업자의 선택에 의해 결정될 수 있으며 이들이 표적으로 하는 mRNA 서열이 동일한 경우라면 유사한 발현 감소 효과를 기대할 수 있다. 본 발명의 목적상 PLK1에 특이적으로 작용하여 PLK1 mRNA 분자를 절단하여 RNA 간섭(RNAi, RNA interference) 현상을 유도함으로써, 상기 PLK1을 억제할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, siRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명의 PLK1에 대한 siRNA, shRNA는 센스 뉴클레오티드와 이와 상보적인 서열의 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 뉴클레오티드 사이에 루프서열을 포함하는 것 일 수 있다. 구체적인 예로, 본 발명의 PLK1에 대한 siRNA는 서열번호 3 내지 16의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 서열; 및/또는 상기 올리고 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고 뉴클레오디트의 이중가닥으로 이루어지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 PLK1에 대한 shRNA는 서열번호 3 내지 16의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 표적서열로 하는 것일 수 있고, 또는, 서열번호 3 내지 16의 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 올리고 뉴클레오티드 서열; 및/또는 상기 올리고 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 포함하는 것 일 수 있다.

또한, 본 발명의 shRNA에 사용되는 루프서열은 PLK1의 발현 또는 활성 억제를 위해서 그 표적서열을 명확히 하는 경우, 상기 루프서열은 본 발명의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 서열을 이용할 수 있으므로, 권리범위가 여기에 제한되는 것은 아니다. 일 예로 서열번호 45의 루프서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 PLK1 억제제는 통상적인 방법으로 사용할 수 있다. 일 예로, 표적타겟에 따라 서열번호 17 내지 서열번호 44에서 선택된 프라이머 쌍을 이용하여 shRNA를 만들 수 있다.

본 발명에서 "miRNA(micro RNA)"는 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다. 본 발명의 PLK1의 발현 또는 작용을 억제할 수 있는 miRNA라면 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중쇄(heavy chain) 및 두 개의 경쇄(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중쇄 및 경쇄는 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위(Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 항체는 PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체라면 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어, 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편 등을 모두 포함할 수 있다. 또한, 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 암의 예방 또는 치료는 암 세포 특이적 세포 사멸(apoptosis)에 의하여 달성되는 것일 수 있다. 상기 세포 사멸은 세포가 죽는 일 형태로서 물리적으로 세포가 파괴되는 세포 괴사(necresis)와는 구별되는데, 예정세포사(programmed cell death)로도 일컬어지며 DNA가 손상되거나 불필요하게 된 세포가 스스로 사멸하는 과정을 말한다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, PLK1 shRNA에 의한 암세포 증식 또는 전이 억제효과는 PLK1의 발현 또는 작용을 억제함으로써 암세포의 증식, 전이 또는 침습을 억제하는 것을 확인하였는 바, 본 발명의 PLK1 억제제가 항암제로 사용되는 경우 암세포의 사멸뿐 아니라, 전이성 암에서 전이 및 침습을 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 PLK1 변이단백질에 관한 것이다.

상기 PLK1 변이단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 것 일 수 있다. 또는, 상기 PLK1 변이단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) K82M 변이; 및/또는 b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 것 일 수 있다. 상기 PLK1 변이단백질은 본 발명의 약학적 조성물에서 우수한 항암활성, 특히 암세포의 전이성 및 침습성을 억제하는데 우수한 활성을 가지는 것을 일 실시예에서 확인 하였다. 이러한 측면에서 본 발명은 PLK1 변이단백질을 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 PLK1 변이단백질을 포함하는 전이성 암 치료 또는 예방용 조성물일 수 있다.

바람직하게 항암용 조성물의 유효성분으로서 상기 변이단백질은 a) K82M 변이를 포함하는 변이단백질; 및/또는 b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 변이단백질 일 수 있다. 상기 변이단백질은 PLK1의 활성 또는 작용을 억제함으로써 PLK1 기반 암의 증식, 전이 또는 침습을 억제 또는 치료할 수 있다는 점에서, 전이성 암의 치료에 우수한 효과를 갖는다.

본 발명의 PLK1 변이단백질은 이를 코딩하는 유전자(폴리뉴클레오티드) 또는 이를 코딩하는 유전자(폴리뉴클레오티드)가 삽입된 재조합 벡터 형태로 약학적 조성물의 유효성분으로서 포함될 수 있다따라서, 본 발명은 서열번호 2에서 a) K82M 변이; b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 이러한 측면에서 본 발명은 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드를 발현하는 재조합 벡터; 서열번호 2에서 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "암"은 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant tumor)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 암의 진행에 1차 암과 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나는 전이성(침습성) 암으로 구분할 수 있다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암(cancer)'이라 한다.

본 발명의 조성물은 암의 증식을 억제할 뿐 아니라, 다른 조직으로 전이되는 전이성 암으로 발달된 경우에도 암세포의 전이성을 억제하는 효과를 가진다는 점에서, 본 발명은 전이성 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 일 수 있다. 또한, 본 발명의 유효성분은 PLK1의 발현 또는 작용을 억제함으로써 암의 증식, 전이 또는 침습을 억제한다는 점에서 PLK1 과발현이 나타나는 암, 또는 PLK1 과발현이 나타나는 고형암 또는 PLK1 과발현이 나타나는 전이성 고형암 치료용 조성물 일 수 있다.

상기 암은 고형암 일 수 있고, 구체적인 암의 종류로는 뇌종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중프종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 위암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 대장암, 림프종, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암을 포함하나, 상기 예들에 의해 본 발명의 암의 종류가 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "개체"는 암 질환을 보유하거나 또는 발병한, 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물 또는 항암보조제용 조성물을 개체에 투여함으로써, 간암을 비롯한 암을 완화 또는 치료할 수 있다. 상기 완화는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

구체적으로 상기 개체는 PLK1 과발현 특성이 나타나는 암 질환을 보유하고 있는 개체 일 수 있다.

본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 PLK1을 억제하는 물질 또는 PLK1 변이단백질을 포함하는 조성물의 투여로 암의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다.

또한, "예방"은 본 발명에 따른 PLK1을 억제제 또는 PLK1 변이단백질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 암의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 치료를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

또한, 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 암세포사멸 촉진 효과를 나타내는 항암용 조성물은 성인의 체중 1㎏ 당 0.01 내지 100 ㎎, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 암세포 사멸 촉진 항암제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 촉진 항암제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, '약제학적으로 허용가능한 담체'는 투여용 약제학적 활성 화합물을 제형화할 경우에 유용하고 사용 조건하에 사실상 비독성 및 비민감성인 공지된 약제학적 부형제를 의미한다. 이러한 부형제의 정확한 비율은 유효성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정된다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 발명의 약학 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] Plk1의 활성형 및 점 돌연변이형 발현을 위한 렌티바이러스 시스템 구축

본 발명자들은 Plk1의 활성형 및 비활성형 유전자 발현을 위한 렌티 바이러스 시스템(lentivirus system)을 구축하였다. 구체적으로 pLVX-TRE3G-eRFP 벡터를 Mlu1과 Apa1으로 절단한 후, PLK1 원형(WT) 또는 PLK1 돌연변이체(K82M-PLK1, T210D-PLK1(활성형 돌연변이체), 또는 FA-PLK1(W414F/V415A))의 플라스미드 각각을 5'-ACGGGGCCCATGAGTGCTGCAGTGA-3'(forward primer)와 5'-ACGACGCGTTTAGGAGGCCTTGAGA-3'(reverse primer)를 이용하여 PCR로 증폭시킨 후 이를 Mlu1과 Apa1(NEB, MA, USA)으로 절단하고, 벡터 pLVX-TRE3G-eRFP에 서브클로닝 하였다. 구축된 렌티 바이러스 플라스미드(Lentiviral plasmid)를 HEK293 세포(ATCC, USA)에서 발현시키고자, CaCl₂방법을 이용하여 HEK293 세포에 형질주입 하였다. 형질 주입 후 바이러스 배양액은 12시간 간격으로 72시간까지 모아, 0.2 mm 필터로 배양액을 필터하고 17000 rpm, 4℃, 90분 동안 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 TNE 버퍼로 모아진 바이러스를 4℃에 보관하여, 다음 날부터 암세포 처리에 사용하였다.

[ 실시예 2] 렌티바이러스를 이용한 Plk1의 활성형 및 비활성형 유전자 발현 세포 선별

간암세포 Hep3B(ATCC, USA), 폐암세포 A549(ATCC, USA) 및 H460(ATCC, USA)그리고 대장암 세포 HCT-116(ATCC, USA)를 Plk1 활성형 또는 비활성형 돌연변이체가 발현되는 렌티 바이러스로 감염시키고자 다음과 같이 암세포를 배양하였다.

폐암세포인 A549는 웰 하나당 1X10⁵세포(1X10⁵ cells/well)를 넣고 MEM 배지(Corning Cellgro, VA, USA)를 이용하여 배양하였고, 폐암세포인 H460과 대장암 세포인 HCT-116는 RPMI 1640 배양배지에서 웰 하나당 1X10⁵세포(1X10⁵ cells/well)로 깔고 배양했으며, 간암세포인 Hep3B는 RPMI 1640 배양배지(Corning Cellgro, VA, USA)에서 웰 하나당 5X10⁴세포(5X10⁴ cells/well)로 분주하였다. 각 세포를 깔고 배양한 후 다음 날 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES(Sigma-Aldrich, USA), 1 mg/ml 폴리브렌(Sigma-Aldrich, MO, USA))에 각 PLK1 활성형 또는 점 돌연변이체가 발현되는 렌티바이러스를 20 ml/well로 첨가하여 암세포를 감염시켰다. 24시간이 지난 후 퓨로마이신(puromycine; Sigma-Aldrich, MO, USA)을 48시간동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 감염된 세포를 선별하였다.

[ 실시예 3] 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 전이성 활성 측정

본 발명자들은 세포의 이동성을 관찰하기 위해 PLK1의 활성형 또는 점 돌연변이형 유전자가 발현되는 암세포를 이용하여 암세포의 이동성 실험(migration assay) 진행하였다.

구체적으로, 실시예2에서 제조된 PLK1의 활성형 또는 점 돌연변이형 유전자를 발현하는 간암세포 Hep3B, 폐암세포 A549 및 H460 그리고 대장암 세포 HCT-116 각각을 6 well 플레이트에 분주한 후 24시간 후에, 플레이트에 200 ㎕ 팁을 이용하여 일정한 간격으로 스크래치를 내었다. 이동성 실험에서 양성 대조군으로 5 ng/ml의 TGF-β(Sigma-Aldrich, MO, USA)를 사용하였고, 대조군(control)으로는 특정 유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군을 사용하였다. 스크래치를 낸 후 24시간 간격으로 세포의 간격과 이동성을 현미경으로 관찰하고 현미경에서의 세포 촬영을 통하여 간격이 복구되는 정도를 세포 사이의 거리로 측정하였다.

측정된 수치를 대조군의 거리를 100%라고 할 때 상대적 이동 거리를 산출한 후, %로 그래프를 표시하였다(도 1B 참조).

Relative distance(%) = 실험군에서의 측정수치 x 100 / 대조군의 측정수치

도 1 및 도2에 나타낸 바와 같이, 시간에 따라 T210D 변이를 포함하는 활성형 PLK1 변이단백질이 발현되는 실험군(TD-PLK1)에서는 암세포의 이동성이 증가되는 것을 관찰하였다. 이와 상반되게 촉매 도메인(catalytic domain)의 82번 위치의 라이신(Lysine; K)을 메티오닌(Methinone; M)으로 치환시킨 K82M 변이형 PLK1 단백질을 발현하는 세포의 경우 이동성이 감소되었다. 또한 폴로-박스 도메인(polo-box domain) 변이형(FA; W414F 및 V415A) PLK1 단백질을 발현하는 경우에도 암세포의 이동성이 감소됨을 관찰하였다. 72시간 후 이동성을 대조군과 비교한 결과, 양성대조군인 5 ng/ml의 TGF-beta 처리에 의한 대장암세포 이동성보다 활성형의 Plk1-TD의 이동성이 더 많이 증가됨을 관찰하였다. 또한, ATP-결합 도메인(catalytic domain; ATP-binding domain) 변이형(K82M 변이체)과 폴로-박스 도메인(polo-box domain) 변이형(FA 변이체; W414F 및 V415A)의 경우에는 대조군(control) 대비 암세포의 이동성이 급격히 감소됨을 확인하였는바, 본 발명의 PLK1 변이단백질이 암세포의 이동성이 억제하는 효과를 가짐을 알 수 있다.

[실시예 4] BI 6727(volasertib)에 의한 전이성 억제 효과 평가

BI 6727에 의한 전이성 억제효과를 확인하기 위해 PLK1 활성형 단백질을 발현하는 렌티 바이러스 시스템을 이용하여, 이동성 시험을 수행하였다. 활성형 PLK1 단백질을 발현하는 렌티바이러스로 감염시킨 세포군(TD-PLK1)과 무처리군(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군) 으로 나누어 실험을 수행하였고, 무처리군(Mock)과 TD-PLK1 실험군은 다시 BI6727로 처리한 실험군(BI6727)과 BI6727 대신 0.01% DMSO를 처리한 대조군(vehicle)로 나누어 실험을 수행하였다.

A549 폐암세포를 1X10⁵ cells/well의 수로 플레이트에 넣고, MEM 배지를 이용하여 배양한 다음 날 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES, 1ug/ml Polybrene)에 TD-PLK1을 발현하는 렌티바이러스 20 ㎕/well를 섞어서 A549 폐암세포를 감염시켰다. 24시간이 지난 후 퓨로마이신을 48시간 동안 처리하여 죽지 않고 살아있는 감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포를 6 웰 플레이트(well plate)에 각 웰당 1X10⁵ cells의 수로 분주하였으며, 24시간 후 피펫 팁(pipette tip)을 사용하여 일정한 간격으로 스크래치를 낸 후 배지를 갈아주었다. 각 처리군에 10 nM의 BI 6727의 약물을 처리 후, 24시간, 48시간, 72시간 간격으로 세포의 이동성을 관찰하고 현미경으로 촬영한 후 세포간의 거리를 측정 및 분석하였다.

측정된 수치에서 무처리 대조군(Mock+Veh)의 거리를 100%라고 할 때 상대적 이동 거리를 산출한 후, %로 그래프를 표시하였다(도 3의 B).

상대적 이동 거리(%) = 실험군에서의 측정수치 x 100 / 대조군의 측정수치

또한, 동물모델에서도 동일하게 암세포의 전이를 억제하는 효과가 나타나는지 확인하고자, BALB/c nude 마우스를 이용한 전이암 동물모델을 이용해서 전이성 억제 효과 실험을 수행하였다. 활성형의 TD-PLK1을 발현시키는 A549 폐암세포를 2X10⁶세포수로, 4주령의 Nude Balb/c 마우스에 꼬리정맥에 주사한 후 혈관계를 따라 이동한 암세포에 의해 폐에서 종양이 유발되는지 관찰하였다. 이러한 종양의 이동성과 발암성이 BI 6727 처리에 의해 감소되는지 관찰하고자 세포 주사 후 2 주 후에 BI 6727 약물을 20 mg/kg으로 처리하거나 0.01% DMSO (대조군; vehicle)를 3주 동안 정맥주사 하였고, 총 10주 사육 후 개복하여 암세포의 전이 여부를 확인하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, BI6727은 처리시간에 따라 폐암세포 자체의 전이성을 감소시켰는데, 특히 72시간에는 무처리대조군(Mock+Veh)의 이동성이 0%라고 설정할 때, 약 400% 이상 암세포의 이동성을 감소시켰다(Mock+BI6727)(도 3의 C 참고). 72시간에서 PLK1 활성형(TD-PLK1)은 대조군 대비 약 100%의 이동성이 증가되는데, 이러한 폐암세포의 전이성을 BI 6727 처리에 의해 대조군 대비 약 -350%까지 감소시켜, 결과적으로 PLK1 활성형 세포에서는 -450% 감소 효과를 보여주었다(도 3의 C 참조).

또한, 누드마우스의 꼬리 정맥 투여법을 이용한 전이 모델에서 PLK1 활성형(TD-PLK1)의 발현은 종양형성 및 혈관을 통한 전이가 일어남을 관찰할 수 있었으며, 이러한 효과는 BI 6727로 처리한 실험군(BI 6727)에서 PLK1의 억제에 의하여 암세포의 전이를 전해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 BI6727은 암세포 자체의 전이성뿐만 아니라 PLK1 활성형 발현에 의한 전이성에 대한 강력한 억제효과가 있음을 알 수 있었다.

[실시예 5] PLK1 shRNA의 전이성 억제 효과 평가

PLK1의 mRNA 발현 억제 효과를 확인하기 위해서, shRNA 및 이를 포함하는 렌티바이러스를 제작하였다.

PLK1의 mRNA 발현을 억제하기 위하여 기 보고된(Yim and Erikson, Mol Cell Biol 29(2009) 2609-2621) 사람의 PLK1 mRNA(Human Plk1 mRNA [NM_005030.5])서열 중 1424-1444 위치의 뉴클레오티드 서열을 타겟으로하는 shRNA를 만들고자 센스 부위(sense region)로는 5'-AGATCACCCTCCTTAAATATT-3'를, 안티센스 부위(antisense region)로는 5'-AATATTTAAGGAGGGTGATCT-3'부위를 이용하여 이를 기반으로 pLKO-puro.1 벡터를 이용한 pLKO-puro.1-PLK1 플라스미드를 제작하였다. 포워드 프라이머로 5'-CCGGAGATCACCCTCCTTAAATATTCTCGAGAATATTTAAGGAGGGTGATCTTTTTTG -3'를 사용하였고, 리버스 프라이머로 5'- AATTCAAAAAAGATCACCCTCCTTAAATATTCTCGAGAATATTTAAGGAGGGTGATCT-3'를 사용하였다. 루프서열은 5'-CTCGAG-3'이고, 프라이머에 포함된 형태로 shRNA를 제작하였다. 이를 pHR'-CMV-VSVG, pHR'-CMV-deltaR8.2와 함께 HEK293 세포 형질감염을 통해 발현시킨 후, 세포의 배양배지를 모아 렌티 바이러스를 생산하였다. 원심분리기를 이용하여 상기 렌티 바이러스를 농축시켰다. 생산된 바이러스를 폐암세포인 A549 세포에 감염시킨 후 폐암세포의 전이성에 PLK1 shRNA가 미치는 영향에 대한 실험을 진행하였다.

shRNA의 처리여부에 따라 shCtrl 대조군과 shPLK1 실험군(PLK1에 대한 shRNA 발현)으로 나누고, 상기 대조군 및 실험군 각각은 아무 처리도 하지 않은 세포(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군)와 활성형 PLK1을 발현하는 세포(TD-PLK1)로 나누어 암세포의 이동성을 확인하였다.

대조군(Mock) 또는 활성형 PLK1(TD-PLK1) 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549를 1X10⁵ cells/well의 수로 분주하여 MEM 배지로 배양하였다. PLK1 mRNA의 발현 억제를 위하여 제작한 pLKO-puro1.-PLK1을 이용하여 발현시킨 바이러스성 (viral) PLK1 shRNA를 20 ml 취하여 감염 버퍼(Infection Buffer; 10mM HEPES, 1㎍/ml Polybrene)와 섞어 대조군(shPLK1 실험군의 Mock) 또는 TD-PLK1 발현 세포(shPLK1의 TD-PLK1)에 처리하였다. 24시간 후 피펫 팁(pipette tip)을 사용하여 일정한 간격으로 스크래치를 낸 후 배지를 갈아주었다. 이 후 24시간, 48시간, 72시간 간격으로 암세포의 이동성을 관찰하고 현미경으로 촬영한 후 힐링(Healing)되는 거리를 측정 및 분석하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 활성형 PLK1(TD-PLK1)이 발현된 세포의 경우 72시간에 전이성이 대조군 대비 약 100% 전이성이 증가되었다. 반면, 아무처리하지 않은 폐암세포에 PLK1 shRNA를 발현시킨 경우(Mock+shPLK1 처리구) 72시간에 약 -200% 이하로 세포의 상대적 전이성이 감소됨을 관찰하였다(도 4의 E). 또한 같은 시간에 활성형 PLK1(TD-PLK1)이 발현된 세포에 PLK1 shRNA를 발현시킨 경우(TD-PLK1+shPLK1 처리구), TD-PLK1+shCtrl 처리구에 비하여 상대적으로 전이성이 약 -200% 이하로 낮아짐을 발견하였다(도 4의 F). 따라서, PLK1 shRNA는 PLK1 활성형에 기인한 전이성뿐만 아니라 암세포 자체의 전이성도 함께 민감하게 억제하는 전이성 억제 효과를 나타내어 항암 효과가 더 뛰어난 것을 발견하였다.

[ 실시예 6] 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 종양형성 억제 효과 평가

암세포의 침습성과 종양형성 효과를 관찰을 위해 PLK1 원형(WT-PLK1), PLK1 활성형(TD-PLK1), K82M 변이형(KM-PLK1), W414F 및 V415A 변이를 포함하는 FA 변이형 단백질(FA-PLK1)을 발현시키는 폐암세포 A549에서 소프트 한천(Soft agar)을 이용한 콜로니 형성 실험(colony formation assay, soft agar assay)를 진행하였다.

구체적으로, 하단에는 0.6%의 한천(agar)층을 만들기 위해 4% stock agar 300 ml, FBS 200㎕, Free MEM 1500ml을 섞어 총 2ml의 한천(agar) 배지를 지름 60 mm 플레이트에 넣고 1시간 굳혔다. 상단에는 0.35%의 한천(agar) 층을 만들기 위해 4% stock agar 175 ml와 10% FBS 200 ㎕에 2X10⁵ cells의 A549 세포를 포함하는 MEM 배지 1625ml를 섞어 1시간 동안 굳혔다. 이를 5일 간격으로 배지를 바꾸어 주었으며 6주 후 현미경 상으로 종양 덩어리인 콜로니가 형성된 것을 관찰하였다. 0.05% 크리스탈 바이올렛-메탄올(crystal violet-methanol) 용액을 이용하여 15분 동안 염색한 후, 이를 20% 메탄올-PBS(methanol-PBS) 용액을 이용하여 세척한 후 현미경 상으로 전체 콜로니의 수를 측정하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 5 ng/ml TGF-β 처리군의 경우 대조군 대비 8배 콜로니 형성이 증가되는 것을 관찰할 수 있었으며, TD-PLK1 발현군 세포는 PLK1 원형(WT)에 대비하여 3배, FA 변이형에 대비하여 5배의 콜로니(Colony)의 수가 증가한 것을 관찰 할 수 있었다. 따라서 Plk1 활성형(TD-PLK1)은 암세포의 침습성(invasion)과 종양(colony) 형성을 촉진하는 중요한 인자임을 알 수 있었고 반면 FA 변이형(FA-PLK1)은 이러한 작용을 억제하는 돌연변이형 PLK1 단백질임을 알 수 있었다.

[ 실시예 7] 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 침습성 억제 효과 평가

PLK1 원형, 활성형, K82M 변이형, FA 변이형 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549에서 이들 점 돌연변이체가 암세포의 침습성과 이동성에 미치는 효과를 관찰하기 위해 마트리겔(Matrigel)을 이용한 침습성 실험(Matrigel assay, invasion assay)을 실시하였다.

구체적으로, 4℃에서 16~20시간동안 마트리겔(Matrigel)을 완전히 녹인 후 마트리겔(Matrigel)을 1 mg/ml이 되도록 차가운 혈청 프리 MEM(4℃)으로 희석하였다. 이를 8.0 mm 24 웰(well) 인서트(insert)에 1 ml 의 마트리겔(Matrigel) 혼합물(1 mg/ml)을 넣고 37℃ 배양기에서 12-20시간 동안 굳혀주었다. 굳은 마트리겔 인서트(Matrigel insert)에 각각의 PLK1 원형(WT), 활성형 PLK1(TD), K82M 변이형(KM), W414F 및 V415A 변이형(FA) 단백질을 발현시키는 폐암세포 A549들을 2X10⁵ cells/well의 세포수로 혈청프리 MEM(36℃)에 희석하여 인서트에 분주하였다. 여기에 36℃의 따뜻한 MEM(10% FBS 포함)을 0.5 ml/well씩 분주하였다. 양성 대조군의 경우 5 ng/ml TGF-β가 포함된 36℃ MEM(10% FBS)를 0.5 ml 분주하여 사용하였다. 이 후 3일에 한 번씩 배지를 교환해주고 침습되는 정도를 관찰하였으며, 암세포의 침습이 충분히 일어난 것으로 관찰된 5일 차에 배지를 제거하고 1XPBS로 세척한 후, 인서트 안쪽의 세포들을 면봉으로 긁어 내었고, 1XPBS로 세척하여 인서트 내부에 세포와 마트리겔(Matrigel)의 잔여물이 남지 않도록 제거하였다. 인서트 바깥 면이 있는 24 웰(well)에 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 500 ㎕를 분주하고 5분간 실온에서 인큐베이션한 후 5분에 1XPBS로 3회 세척하여, 0.5% crystal-violet 용액으로 5분간 염색하였다. 5분 후 1XPBS로 5회 세척하였고, 염색된 정도를 590nm에서 파장을 측정하였다. 대조군의 흡광도를 1이라고 할 때 각 실험군에서의 상대적 흡광도를 산출하여 그래프를 표시하였다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 양성대조군인 TGF-beta 처리군과 유사하게 활성형인 TD-PLK1을 발현시킨 실험군에서 흡광도 수치가 대조군 대비 8배 증가하였으며 상대적으로 KM-PLK1 변이형, FA-PLK1 변이형의 경우 TD-PLK1 실험군 혹은 대조군 대비 상대적 흡광도가 더 낮아져 KM-PLK1 변이형과 FA-PLK1 변이형은 폐암세포의 이동성과 침습성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.

[ 실시예 8] 동물모델에서 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 전이성 억제 효과 평가

BALB/c nude 마우스를 이용한 전이암 동물모델에서 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질에 의한 암세포의 전이성 억제 효과를 평가하고자 하였다.

구체적으로, 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질이 안정적으로 발현되는 A549 폐암세포(2X10⁶ 세포수)를 PBS에 넣어 마우스의 꼬리 정맥에 주사하여, 10주 동안 사육하고, 개복하여 장기에 암세포가 전이되었는지 관찰하였다(FA 처리군). 비교를 위해 대조군(Mock; 목적유전자가 발현되지 않는 렌티바이러스 처리군), 돌연변이 포함하지 않는 PLK1 단백질 발현되는 A549 폐암세포주 투여군(WT), 활성형 PLK1 단백질 발현되는 A549 폐암세포주 투여군(TD)에 대해서도, 상기와 동일한 조건으로 암세포 전이 여부를 관찰하였다. 각 실험군 마다 5마리의 마우스에 대하여 실험을 실시하고, 폐에서의 전이성 암인 결절의 생성 빈도수를 측정하여 그래프로 표시하였다(도 7).

도 7에 나타낸 바와 같이, 대부분의 종양은 폐에 생성되었고, 따라서 본 실험도 폐를 중심으로 분석하였다. 대조군(Mock)과 점 돌연변이를 포함하는 PLK1 단백질이 발현되는 A549 세포를 투여한 FA 실험군에서는 5 마리의 마우스 모두에서 전이가 나타나지 않았다. WT 실험군에서는 5마리 중 두 마리에서 종양이 형성되었으며, 활성형 PLK1이 발현되는 A549 세포 투여된 실험군(TD)에서는 5마리 모두 5~9개의 종양이 형성되었다. 뿐만 아니라 활성형 PLK1이 발현되는 A549가 주입된 마우스에서는 종양면역에 관여하는 비장의 크기가 증가되었다(도 7의 D). 또한, 폐의 일부를 용해하여 상피간엽이행 마커의 단백질 수준을 관찰한 결과, TD 실험군에서 중간엽 마커인 N-cadherin의 단백질 수준이 증가하였으며, E-cadherin의 수준은 감소하였다. 반면 FA 실험군은 WT 실험군의 전이성 빈도보다 더 낮은 대조군 수준으로 전이성 암의 생성이 차단됨을 폐와 비장 모두에서 관찰할 수 있었다. 따라서 세포주 실험과 일관되게 활성형 PLK1가 발현되는 TD 실험군은 전이성이 가장 강하게 나타나는데, PLK1 T210의 인산화가 상피간엽이행과 전이성을 증진시킴을 시사한다. 반면, 본 발명의 폴로박스도메인 점돌연변이체인 FA 실험군은 원형의 PLK1 실험군보다 낮은 전이성으로, PLK1 점돌연변이체는 암세포의 전이성을 억제하는 효과가 뛰어남을 알 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University ERICA Campus <120> COMPOSITION FOR TREATING METASTIC CANCER <130> P20180610KR/P18U22C1009 <150> 10-2017-0159265 <151> 2017-11-27 <160> 45 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1812 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagtgctg cagtgactgc agggaagctg gcacgggcac cggccgaccc tgggaaagcc 60 ggggtccccg gagttgcagc tcccggagct ccggcggcgg ctccaccggc gaaagagatc 120 ccggaggtcc tagtggaccc acgcagccgg cggcgctatg tgcggggccg ctttttgggc 180 aagggcggct ttgccaagtg cttcgagatc tcggacgcgg acaccaagga ggtgttcgcg 240 ggcaagattg tgcctaagtc tctgctgctc aagccgcacc agagggagaa gatgtccatg 300 gaaatatcca ttcaccgcag cctcgcccac cagcacgtcg taggattcca cggctttttc 360 gaggacaacg acttcgtgtt cgtggtgttg gagctctgcc gccggaggtc tctcctggag 420 ctgcacaaga ggaggaaagc cctgactgag cctgaggccc gatactacct acggcaaatt 480 gtgcttggct gccagtacct gcaccgaaac cgagttattc atcgagacct caagctgggc 540 aaccttttcc tgaatgaaga tctggaggtg aaaatagggg attttggact ggcaaccaaa 600 gtcgaatatg acggggagag gaagaagacc ctgtgtggga ctcctaatta catagctccc 660 gaggtgctga gcaagaaagg gcacagtttc gaggtggatg tgtggtccat tgggtgtatc 720 atgtatacct tgttagtggg caaaccacct tttgagactt cttgcctaaa agagacctac 780 ctccggatca agaagaatga atacagtatt cccaagcaca tcaaccccgt ggccgcctcc 840 ctcatccaga agatgcttca gacagatccc actgcccgcc caaccattaa cgagctgctt 900 aatgacgagt tctttacttc tggctatatc cctgcccgtc tccccatcac ctgcctgacc 960 attccaccaa ggttttcgat tgctcccagc agcctggacc ccagcaaccg gaagcccctc 1020 acagtcctca ataaaggctt ggagaacccc ctgcctgagc gtccccggga aaaagaagaa 1080 ccagtggttc gagagacagg tgaggtggtc gactgccacc tcagtgacat gctgcagcag 1140 ctgcacagtg tcaatgcctc caagccctcg gagcgtgggc tggtcaggca agaggaggct 1200 gaggatcctg cctgcatccc catcttctgg gtcagcaagt gggtggacta ttcggacaag 1260 tacggccttg ggtatcagct ctgtgataac agcgtggggg tgctcttcaa tgactcaaca 1320 cgcctcatcc tctacaatga tggtgacagc ctgcagtaca tagagcgtga cggcactgag 1380 tcctacctca ccgtgagttc ccatcccaac tccttgatga agaagatcac cctccttaaa 1440 tatttccgca attacatgag cgagcacttg ctgaaggcag gtgccaacat cacgccgcgc 1500 gaaggtgatg agctcgcccg gctgccctac ctacggacct ggttccgcac ccgcagcgcc 1560 atcatcctgc acctcagcaa cggcagcgtg cagatcaact tcttccagga tcacaccaag 1620 ctcatcttgt gcccactgat ggcagccgtg acctacatcg acgagaagcg ggacttccgc 1680 acataccgcc tgagtctcct ggaggagtac ggctgctgca aggagctggc cagccggctc 1740 cgctacgccc gcactatggt ggacaagctg ctgagctcac gctcggccag caaccgtctc 1800 aaggcctcct aa 1812 <210> 2 <211> 603 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Ala Val Thr Ala Gly Lys Leu Ala Arg Ala Pro Ala Asp 1 5 10 15 Pro Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly Val Ala Ala Pro Gly Ala Pro Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Pro Ala Lys Glu Ile Pro Glu Val Leu Val Asp Pro Arg 35 40 45 Ser Arg Arg Arg Tyr Val Arg Gly Arg Phe Leu Gly Lys Gly Gly Phe 50 55 60 Ala Lys Cys Phe Glu Ile Ser Asp Ala Asp Thr Lys Glu Val Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Ile Val Pro Lys Ser Leu Leu Leu Lys Pro His Gln Arg Glu 85 90 95 Lys Met Ser Met Glu Ile Ser Ile His Arg Ser Leu Ala His Gln His 100 105 110 Val Val Gly Phe His Gly Phe Phe Glu Asp Asn Asp Phe Val Phe Val 115 120 125 Val Leu Glu Leu Cys Arg Arg Arg Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Arg 130 135 140 Arg Lys Ala Leu Thr Glu Pro Glu Ala Arg Tyr Tyr Leu Arg Gln Ile 145 150 155 160 Val Leu Gly Cys Gln Tyr Leu His Arg Asn Arg Val Ile His Arg Asp 165 170 175 Leu Lys Leu Gly Asn Leu Phe Leu Asn Glu Asp Leu Glu Val Lys Ile 180 185 190 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Lys Val Glu Tyr Asp Gly Glu Arg Lys 195 200 205 Lys Thr Leu Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu Ser 210 215 220 Lys Lys Gly His Ser Phe Glu Val Asp Val Trp Ser Ile Gly Cys Ile 225 230 235 240 Met Tyr Thr Leu Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Thr Ser Cys Leu 245 250 255 Lys Glu Thr Tyr Leu Arg Ile Lys Lys Asn Glu Tyr Ser Ile Pro Lys 260 265 270 His Ile Asn Pro Val Ala Ala Ser Leu Ile Gln Lys Met Leu Gln Thr 275 280 285 Asp Pro Thr Ala Arg Pro Thr Ile Asn Glu Leu Leu Asn Asp Glu Phe 290 295 300 Phe Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Ala Arg Leu Pro Ile Thr Cys Leu Thr 305 310 315 320 Ile Pro Pro Arg Phe Ser Ile Ala Pro Ser Ser Leu Asp Pro Ser Asn 325 330 335 Arg Lys Pro Leu Thr Val Leu Asn Lys Gly Leu Glu Asn Pro Leu Pro 340 345 350 Glu Arg Pro Arg Glu Lys Glu Glu Pro Val Val Arg Glu Thr Gly Glu 355 360 365 Val Val Asp Cys His Leu Ser Asp Met Leu Gln Gln Leu His Ser Val 370 375 380 Asn Ala Ser Lys Pro Ser Glu Arg Gly Leu Val Arg Gln Glu Glu Ala 385 390 395 400 Glu Asp Pro Ala Cys Ile Pro Ile Phe Trp Val Ser Lys Trp Val Asp 405 410 415 Tyr Ser Asp Lys Tyr Gly Leu Gly Tyr Gln Leu Cys Asp Asn Ser Val 420 425 430 Gly Val Leu Phe Asn Asp Ser Thr Arg Leu Ile Leu Tyr Asn Asp Gly 435 440 445 Asp Ser Leu Gln Tyr Ile Glu Arg Asp Gly Thr Glu Ser Tyr Leu Thr 450 455 460 Val Ser Ser His Pro Asn Ser Leu Met Lys Lys Ile Thr Leu Leu Lys 465 470 475 480 Tyr Phe Arg Asn Tyr Met Ser Glu His Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asn 485 490 495 Ile Thr Pro Arg Glu Gly Asp Glu Leu Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Arg 500 505 510 Thr Trp Phe Arg Thr Arg Ser Ala Ile Ile Leu His Leu Ser Asn Gly 515 520 525 Ser Val Gln Ile Asn Phe Phe Gln Asp His Thr Lys Leu Ile Leu Cys 530 535 540 Pro Leu Met Ala Ala Val Thr Tyr Ile Asp Glu Lys Arg Asp Phe Arg 545 550 555 560 Thr Tyr Arg Leu Ser Leu Leu Glu Glu Tyr Gly Cys Cys Lys Glu Leu 565 570 575 Ala Ser Arg Leu Arg Tyr Ala Arg Thr Met Val Asp Lys Leu Leu Ser 580 585 590 Ser Arg Ser Ala Ser Asn Arg Leu Lys Ala Ser 595 600 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 3 agatcaccct ccttaaatat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 4 gagaagatgt ccatggaaat a 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 5 ggatcaagaa gaatgaatac a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 6 atgaagatct ggaggtgaaa a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 7 caaccaaagt cgaatatgac g 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 8 tcaataaagg cttggagaac c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 9 gcaagaaagg gcacagtttc g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 10 gcaccgaaac cgagttattc a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 11 ggaggaaagc cctgactgag c 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 12 cgaaagagat cccggaggtc c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 13 gccagtacct gcaccgaaac c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 14 ataccttgtt agtgggcaaa c 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 15 gcgcgaaggt gatgagctcg c 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target sequence for PLK1 mRNA <400> 16 tgacctacat cgacgagaag c 21 <210> 17 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #1 <400> 17 ccggagatca ccctccttaa atattctcga gaatatttaa ggagggtgat cttttttg 58 <210> 18 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #1 <400> 18 aattcaaaaa agatcaccct ccttaaatat tctcgagaat atttaaggag ggtgatct 58 <210> 19 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #2 <400> 19 ccgggagaag atgtccatgg aaatactcga gtatttccat ggacatcttc tctttttg 58 <210> 20 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #2 <400> 20 aattcaaaaa gagaagatgt ccatggaaat actcgagtat ttccatggac atcttctc 58 <210> 21 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #3 <400> 21 ccggggatca agaagaatga atacactcga gtgtattcat tcttcttgat cctttttg 58 <210> 22 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #3 <400> 22 aattcaaaaa ggatcaagaa gaatgaatac actcgagtgt attcattctt cttgatcc 58 <210> 23 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #4 <400> 23 ccggatgaag atctggaggt gaaaactcga gttttcacct ccagatcttc attttttg 58 <210> 24 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #4 <400> 24 aattcaaaaa atgaagatct ggaggtgaaa actcgagttt tcacctccag atcttcat 58 <210> 25 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #5 <400> 25 ccggcaacca aagtcgaata tgacgctcga gcgtcatatt cgactttggt tgtttttg 58 <210> 26 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #5 <400> 26 aattcaaaaa caaccaaagt cgaatatgac gctcgagcgt catattcgac tttggttg 58 <210> 27 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #6 <400> 27 ccggtcaata aaggcttgga gaaccctcga gggttctcca agcctttatt gatttttg 58 <210> 28 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #6 <400> 28 aattcaaaaa tcaataaagg cttggagaac cctcgagggt tctccaagcc tttattga 58 <210> 29 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #7 <400> 29 ccgggcaaga aagggcacag tttcgctcga gcgaaactgt gccctttctt gctttttg 58 <210> 30 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #7 <400> 30 aattcaaaaa gcaagaaagg gcacagtttc gctcgagcga aactgtgccc tttcttgc 58 <210> 31 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #8 <400> 31 ccgggcaccg aaaccgagtt attcactcga gtgaataact cggtttcggt gctttttg 58 <210> 32 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #8 <400> 32 aattcaaaaa gcaccgaaac cgagttattc actcgagtga ataactcggt ttcggtgc 58 <210> 33 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #9 <400> 33 ccggggagga aagccctgac tgagcctcga ggctcagtca gggctttcct cctttttg 58 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #9 <400> 34 aattcaaaaa ggaggaaagc cctgactgag cctcgaggct cagtcagggc tttcctcc 58 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #10 <400> 35 ccggcgaaag agatcccgga ggtccctcga gggacctccg ggatctcttt cgtttttg 58 <210> 36 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #10 <400> 36 aattcaaaaa cgaaagagat cccggaggtc cctcgaggga cctccgggat ctctttcg 58 <210> 37 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #11 <400> 37 ccgggccagt acctgcaccg aaaccctcga gggtttcggt gcaggtactg gctttttg 58 <210> 38 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #11 <400> 38 aattcaaaaa gccagtacct gcaccgaaac cctcgagggt ttcggtgcag gtactggc 58 <210> 39 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #12 <400> 39 ccggatacct tgttagtggg caaacctcga ggtttgccca ctaacaaggt attttttg 58 <210> 40 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #12 <400> 40 aattcaaaaa ataccttgtt agtgggcaaa cctcgaggtt tgcccactaa caaggtat 58 <210> 41 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #13 <400> 41 ccgggcgcga aggtgatgag ctcgcctcga ggcgagctca tcaccttcgc gctttttg 58 <210> 42 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #13 <400> 42 aattcaaaaa gcgcgaaggt gatgagctcg cctcgaggcg agctcatcac cttcgcgc 58 <210> 43 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward primer #14 <400> 43 ccggtgacct acatcgacga gaagcctcga ggcttctcgt cgatgtaggt catttttg 58 <210> 44 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer #14 <400> 44 aattcaaaaa tgacctacat cgacgagaag cctcgaggct tctcgtcgat gtaggtca 58 <210> 45 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> loop sequence <400> 45 ctcgag 6

Claims

서열번호 1의 PLK1(Polo-like kinase 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질 및 상기 PLK1 변이단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1의 PLK1 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1에서 1424-1444 번째 뉴클레오티드 서열; 286-306 번째 뉴클레오티드 서열; 785-805 번째 뉴클레오티드 서열; 554-574 번째 뉴클레오티드 서열; 593-613 번째 뉴클레오티드 서열; 1028-1048 번째 뉴클레오티드 서열; 671-691 번째 뉴클레오티드 서열; 501-521 번째 뉴클레오티드 서열; 431-451 번째 뉴클레오티드 서열; 110-130번째 뉴클레오티드 서열; 542-562번째 뉴클레오티드 서열; 725-745 번째 뉴클레오티드 서열; 1497-1517 번째 뉴클레오티드 서열; 및 1649-1669 번째 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 PLK1 변이단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에서
a) K82M 변이를 포함하는 변이단백질; 및
b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 변이단백질
로 이루어진 군에서 선택된 것인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 전이성 암의 예방 또는 치료용인 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 PLK1 과발현이 나타나는 암의 치료용인, 약학적 조성물.
서열번호 1의 표시되는 염기서열에서 연속되는 5 내지 50 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA인 올리고 뉴클레오티드.
서열번호 1에서 1424-1444 번째 뉴클레오티드 서열; 286-306 번째 뉴클레오티드 서열; 785-805 번째 뉴클레오티드 서열; 554-574 번째 뉴클레오티드 서열; 593-613 번째 뉴클레오티드 서열; 1028-1048 번째 뉴클레오티드 서열; 671-691 번째 뉴클레오티드 서열; 501-521 번째 뉴클레오티드 서열; 431-451 번째 뉴클레오티드 서열; 110-130번째 뉴클레오티드 서열; 542-562번째 뉴클레오티드 서열; 725-745 번째 뉴클레티드 서열; 1497-1517 번째 뉴클레오티드 서열; 및 1649-1669 번째 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 siRNA 또는 shRNA인 올리고 뉴클레오티드.
제7항 또는 제8항의 siRNA 또는 shRNA를 발현하는 재조합 벡터.
서열번호 2의 아미노산 서열에서 a) K82M 변이; 또는 b) W414F 및 V415A 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질.
제10항의 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
서열번호 1의 PLK1 mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; 이를 발현하는 재조합 벡터; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료용 조성물.
제12항에 있어서,
PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1의 PLK1 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머, siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 암의 유전자 치료용 조성물.
제12항 또는 제13항에 있어서,
상기 PLK1의 mRNA 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드는 서열번호 1에서 1424-1444 번째 뉴클레오티드 서열; 286-306 번째 뉴클레오티드 서열; 785-805 번째 뉴클레오티드 서열; 554-574 번째 뉴클레오티드 서열; 593-613 번째 뉴클레오티드 서열; 1028-1048 번째 뉴클레오티드 서열; 671-691 번째 뉴클레오티드 서열; 501-521 번째 뉴클레오티드 서열; 431-451 번째 뉴클레오티드 서열; 110-130번째 뉴클레오티드 서열; 542-562번째 뉴클레오티드 서열; 725-745 번째 뉴클레오티드 서열; 1497-1517 번째 뉴클레오티드 서열; 및 1649-1669 번째 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열을 포함하는 것인 암의 유전자 치료용 조성물.
서열번호 1의 PLK1(Polo-like kinase 1) mRNA의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드; PLK1 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편; 서열번호 2의 아미노산 서열에서 K82M, W414F 및 V415A 변이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 변이를 포함하는 PLK1 변이단백질 및 PLK1 변이단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 종양의 전이 억제용 조성물.