JP4138073B2 - ヒト癌退縮抗原タンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医療分野に属し、詳しくは癌または自己免疫疾患を処置する方法、さらに詳しくは細胞傷害性Ｔ細胞によって攻撃を受けて退縮する癌退縮抗原およびそれを利用する免疫療法等に関する。
【０００２】
生体による腫瘍の排除には免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch.Surg.126:200-205,1990）、メラノーマから自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が分離されている(Immunol.Today 8:385、1987、J.Immunol.138:989,1987、Int.J.Cancer 52:52-59 、1992等) 。また、Ｔ細胞移入によるメラノーマ治療の臨床結果も腫瘍排除によるＴ細胞の重要性を示唆している(J.Natl.Cancer.Inst.86:1159,1994) 。
【０００３】
自己の腫瘍細胞を攻撃するＣＴＬは、腫瘍抗原ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原に結合した複合体をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて認識し、自己の腫瘍細胞を攻撃している。この腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍抗原（タンパク質）が細胞内で合成された後、プロテオソームによって細胞質内でペプチドに分解されることによって生成される。一方、ＭＨＣクラスＩ抗原は、上記の腫瘍抗原ペプチドと結合し、シスゴルジを経て成熟側のトランスゴルジへと移動し細胞表面に発現する（臨床免疫27(9):1034-1042 、1995）。
【０００４】
【従来の技術】
ヒト癌細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原上に提示され、宿主Ｔ細胞の標的分子となる腫瘍抗原タンパク質が1991年にT.Boonにより同定された(Science254:1643-1647,1991) 。この抗原は、この抗原を発現する癌細胞がＣＴＬによって攻撃を受け退縮することから癌退縮抗原と呼ばれ、また、メラノーマ細胞から同定されたことよりMelanoma antigen（ＭＡＧＥ）と名付けられている。
その後、ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原タンパク質がメラノーマ細胞などから相次いで同定された。今までに同定された腫瘍抗原タンパク質はその由来、構造（変異の有無）や発現様式により以下の４つのカテゴリーに分類される(T.Boon et al.,J.Exp.Med.183:725-729,1996)：
【０００５】
ｉ）腫瘍特異的共有抗原（Tumor −Specific Shared Antigens）
ここに分類される抗原は正常組織では睾丸と胎盤でのみ発現され、腫瘍組織ではメラノーマ、頭頚部癌、非小細胞性肺癌、膀胱癌など各種の癌に広範に発現が認められる一群のタンパク質である。このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、上記のＭＡＧＥ、その１２種類以上の類似するファミリーを形成するタンパク質群(J.Exp.Med.178:489-495,1993)、ＢＡＧＥ（Immunity 2:167-175、1995）およびＧＡＧＥ(J.Exp.Med.182:689-698,1995)があり、いづれもメラノーマ細胞から同定されている。また最近、メラノーマに限って広範に発現されるＮＡ１７−Ａが報告された。それは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに相当する部分が翻訳され、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に抗原ペプチド（ＶＬＰＯＶＦＩＲＣ）が癌退縮抗原として発現し、ＣＴＬにより認識される。
【０００６】
ii）分化抗原（Differentiation Antigens ）
ここに分類される腫瘍抗原タンパク質は、正常組織ではメラノサイトで発現しており、腫瘍組織ではメラノーマでのみ発現が認められる一群のタンパク質である。これらの組織特異的なタンパク質は腫瘍細胞のメラノーマに強度に発現しているが、他の組織型の癌（腺癌や扁平上皮癌）には認められないことから、メラノーマに特異的な腫瘍抗原タンパク質と考えられる。このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、チロシナーゼ(J.Exp.Med.178:489-495,1993)、ＭＡＲＴ−１(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 3515, 1994）、ｇｐ１００(J.Exp.Med. 179: 1005-1009, 1994) ，ｇｐ７５(J.Exp.Med. 181: 799-352, 1995）があり、これらの遺伝子はいづれもメラノーマ細胞からクローニングされている。なお、他にMelan-A （J.Exp.Med. 180: 35, 1994）が同定されたが、後にＭＡＲＴ−１と同一の分子であることが判明した。
また、ここに分類される抗原は正常のメラノサイトにも発現していることから、メラノサイト破壊性自己免疫疾患での標的分子としての可能性が存在する。特にＭＡＲＴ−１／melan-Ａはvon −小柳−原田氏病における標的分子と考えられる（S.Sugita, et al., Int.Immunol.8:799-803,1996）。ｇｐ１００はそれを発現するメラノーマが免疫療法に高い感受性を示すので、in vivoでの癌退縮抗原として作用している可能性がある。
このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質は、メラノーマ以外の腫瘍では発現していないため、他の腫瘍に応用することはできない。
【０００７】
iii ）個々の腫瘍に特異的な抗原（Antigens Specific for Individual Tumors ）
この領域に分類される腫瘍抗原タンパク質は、正常細胞が癌化する過程でおこる遺伝子変化に伴う癌特有の新しい抗原である。遺伝子変化としては点突然変異（point mutation、変異ＣＤＫ４抗原、変異β−Catenin 抗原、ＭＵＭ−抗原）、alterative open reading frame（変異ｇｐ７５抗原）がこれまでに知られている。したがって、このような抗原は癌に特異的であり特異免疫の成立が容易に成立するものと考えられる。しかしながら、一方で各々の遺伝子変化は個々の腫瘍もしくは個々の腫瘍細胞に限って発現していることが殆どである。したがって発現頻度はきわめて低く、癌治療を目的としたワクチン分子として臨床応用され難いという欠点を有する。
【０００８】
iv）普遍性抗原（Ubiquitous Antigens）
殆どの正常細胞や癌細胞に非変異体として普遍的に発現される（ubiquitous）抗原がＣＴＬの癌認識分子になっているケースとしては、ｐ１５が知られている。ｐ１５分子はＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドを有する。ｐ１５は正常細胞に比して癌細胞により強く発現されている。その観点からは、腺癌等に強発現している癌遺伝子タンパク質であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原も同類として分類される。即ち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕはＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドを有し、癌退縮抗原として宿主キラーＴ細胞により認識される。
ここに分類される抗原を腫瘍抗原タンパク質とした場合、普遍的に発現しているために広範な癌に応用可能と考えられるが、疾病特異性に乏しいため、正常組織に障害を与える可能性があり、またＣＴＬ誘導が困難である可能性（トランスのため）が考えられる。
【０００９】
ＭＨＣ−非拘束性と考えられていたＭＵＣ−１抗原特異的ＣＴＬが同抗原由来ペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶをＨＬＡ−Ａ１１拘束性に認識すると報告され、またＭＡＧＥ−３ペプチドを用いての臨床試験の初期成績が報告された（M.Marchand,et al., Int.J.Cancer 63:883-885,1995 ）。これらは、癌退縮抗原を用いての癌ワクチン開発の可能性を示唆している。
【００１０】
これまでに同定された上記の抗原ペプチドはＨＥＲ−２／ｎｅｕを除き、その殆どがメラノーマから発見されており、発病頻度の高い扁平上皮癌や腺癌では全く報告されていない。しかし、我々は最近、食道扁平上皮癌よりＨＬＡ２６０１拘束性の癌抗原ペプチドが存在し宿主ＣＴＬによって認識されることを報告した（M.Nakao, et al., Cancer Res. 55:4248-4252,1995）。したがって、扁平上皮癌にも同様の抗原ペプチドをコードする腫瘍抗原タンパク質の存在することが示唆される。扁平上皮癌は、ヒトの癌で最も多く認められる癌のひとつであり、特に食道癌や肺癌での扁平上皮癌は現在の化学療法や放射線療法に比較的抵抗性を示すことが知られている。その点からも腫瘍抗原ペプチド等を用いた特異的免疫療法の開発が期待される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、扁平上皮癌等の幅広い腫瘍に応用でき、または応用可能な腫瘍が限られていてもその腫瘍の患者のうち多くの人に応用でき、またはその腫瘍の治療や診断を補完しつつ各種腫瘍に応用できる癌療法の一助となる腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド等を提供することにある。
また、腫瘍において高発現している腫瘍抗原タンパク質は、一方で、正常組織にも発現しその腫瘍抗原タンパク質に由来する免疫反応が過剰に起こることで、自己免疫疾患を引き起こしているとも考えられている。例えば、化学療法剤とＩＬ−２を併用してメラノーマの治療を行った場合、白斑症状の出現が認められるとの報告がある(J.Clin.Oncol.10:1338-1343,1992)。これは、メラノーマに出現する腫瘍抗原タンパク質の断片ペプチドとＭＨＣ複合体に対してＣＴＬまたは抗体が誘導、産生され、正常組織である皮膚組織に作用することで自己免疫疾患様の症状である白斑症状が出現したためと考えられる。
腫瘍抗原タンパク質に由来する特異的免疫が過剰に惹起されることにより自己免疫疾患が発症した場合には、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を妨ぐアンチセンスDNA や腫瘍抗原ペプチドのアンタゴニストなどを用いて、免疫反応を特異的にブロックする治療法が期待される。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
メラノーマ細胞以外の腫瘍細胞、特に扁平上皮癌等の治療や診断に幅広く応用できる腫瘍抗原タンパク質またはその対応する腫瘍抗原ペプチド等を得るために、扁平上皮癌からの腫瘍抗原タンパク質の同定を試みた。
本発明者らは食道癌患者の末梢血リンパ球からリンパ球腫瘍混合培養法により、HLA-A2402 拘束性の腫瘍抗原ペプチドを認識するＣＴＬ(KE-4-CTL)を樹立した。このＣＴＬはHLA-A2402 陽性の食道癌細胞株KE-4を強く障害する。
そこで、サル腎細胞株COS7細胞に、KE-4癌細胞株から作製したcDNAライブラリーの組換えプラスミドとHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドを同時にトランスフェクトし、そのトランスフェクタントにKE-4-CTL細胞を作用させ、KE-4-CTL細胞が活性化されたか否かをIFN-γの産生量で測定しスクリーニングした。その結果、メラノーマ以外の腫瘍細胞KE-4から本発明の腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は、（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子、（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子、（４）配列番号：１の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子、および（５）前記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子であって、該ポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドであるポリヌクレオチド分子；本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる腫瘍抗原タンパク質；本発明の腫瘍抗原タンパク質の部分ペプチドであってＭＨＣクラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体；本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体を含有する医薬；本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体に対する抗体；本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするオリゴヌクレオチド分子、好ましくは腫瘍抗原タンパク質をコードしている塩基配列が配列番号：１の塩基配列である該オリゴヌクレオチド分子；配列番号：１の腫瘍抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド分子またはその化学的修飾体；本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子もしくはその化学的修飾体を含有する医薬；本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を有するプラスミド；および本発明のプラスミドによって形質転換された形質転換体、に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本明細書中で使用している用語の意義を明らかにするとともに、発明の実施形態を説明する。
本発明のポリヌクレオチド分子は、新規な腫瘍抗原タンパク質をコードするものであり、（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子、（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子、（４）配列番号：１の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子、および（５）前記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、からなる群より選択され、該ポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドである。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチド分子はDNA またはRNA の形態をとることができ、DNA にはcDNA、ゲノムDNA および合成DNA が包含される。また、DNA およびRNA は一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖の両者が包含され得る。
【００１６】
ある塩基配列のうち一部が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１−３巻 Sambrook, J. ら著、Cold Spring Harber Labolatory Press 出版 New York 1989年などに記載の方法によって製造することができ、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などにより製造できる。本発明のポリヌクレオチド分子はこれらの変異型ポリヌクレオチド分子も包含する。かかる変異型ポリヌクレオチド分子としては、例えば、配列番号：１の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子が挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチド分子には「本発明のポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子」も包含される。ポリヌクレオチド分子としてDNA 分子を代表例にとると、「DNA 分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA 分子」は、例えば前述のMolecular Cloning に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０. １×ＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。
【００１７】
本発明の腫瘍抗原タンパク質は、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされるタンパク質である。
【００１８】
「本発明のポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドがＭＨＣクラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチド」とは、腫瘍抗原タンパク質の連続した少なくとも７個、好ましくは７〜１０個、特に好ましくは９個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドであって、細胞表面のＭＨＣクラスＩ抗原と結合して細胞表面に提示された場合、その結合体に対して特異的に結合するＴ細胞が結合するとそのＴ細胞にシグナルを伝えることのできる、即ちＴ細胞に認識されるＭＨＣクラスＩ抗原との結合体を形成できるそのようなペプチドを意味する。なお、ここでいう「結合」とは非共有結合である。
【００１９】
ペプチドがＭＨＣクラスＩ抗原に結合してＴ細胞に認識されることを確かめる方法としては、例えば、ペプチドを適当な細胞に内因性に発現させるか、または外部から加える（パルスする）ことによりＭＨＣクラスＩ抗原に結合させることで細胞表面にペプチドを提示させ、つづいて、そのペプチド提示細胞に対して腫瘍抗原タンパク質特異的なＴ細胞を作用させ、そのペプチド提示細胞が傷害を受けた際に産生されるサイトカイン（インターフェロンαやＴＮＦα、およびＣＴＬが産生するサイトカイン）を測定する方法などがある。また、ペプチド提示細胞の傷害を測定する方法として、51Ｃｒで標識したペプチド提示細胞を用いる方法も使用できる。ここで、認識するＴ細胞としては、ＣＴＬを用いるのが好ましい。
【００２０】
本発明に係る腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドは例えば、以下のようにして同定することができる。
まず、これらの同定に際し、ＭＨＣ−クラスＩアレルの一致した腫瘍細胞およびこの細胞を攻撃するＣＴＬのセットを用意する。
次いで、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ抗原に結合している腫瘍抗原ペプチドを酸性化して抽出し、高速液体クロマトグラフィーで分離された種々のペプチドを、抗原提示ＭＨＣを発現しているが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えば、同一患者のＢ細胞など）にパルスし、ＣＴＬの反応を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定し、さらにマススペクトロメタリーなどを用いて配列を決定する方法である。この方法によって、メラノーマ細胞からｇｐ１００と同一分子のPme117由来の腫瘍抗原ペプチドが同定されている(Science 264: 716-719, 1994)。
【００２１】
あるいは、上記のような腫瘍抗原ペプチドを直接同定する方法とは異なり、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を決定してさらにその対応する腫瘍抗原ペプチドを同定する方法もある。これは、分子生物学的手法を用いて腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするものである。腫瘍細胞からcDNAを調製し、そのcDNAを腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えばCOS 細胞など）に抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子とともにトランスフェクトして一過的にそれらを発現させ、それに対するＣＴＬの反応性によりスクリーニングを繰り返し行い、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を単離する。この方法により、上記のＭＡＧＥ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５の遺伝子がクローニングされている。
【００２２】
この腫瘍抗原遺伝子の情報から実際にＭＨＣクラスＩ抗原に結合して提示されている腫瘍抗原ペプチドを推定、同定するためには次のような方法を用いる。まず、ＰＣＲ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素などにより様々なサイズの腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを作製し、抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子とともに腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えばCOS 細胞など）にトランスフェクトして一過性に発現させ、ＣＴＬの反応性により腫瘍抗原ペプチドを含む領域を限定する。その後、ペプチドを合成し、抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原は発現しているが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞にパルスし、同様にＣＴＬの反応を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定できる(J.Exp.Med. 176: 1453, 1992 、J.Exp.Med. 179: 24,759、1994) 。
【００２３】
また、HLA-A1，-A0201，-A0205，-A11，A31 ，-A6801，-B7 ，-B8 ，-B2705，-37 ，-Cw0401 ，-Cw0602 などのＭＨＣクラスＩ抗原の型については、結合して提示されるペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明しており (seminars in IMMUNOLOGY 5: 81-94, 1993)、それを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べ、そのペプチドを結合して上記と同様な方法で確認する方法も用いられる(Eur.J.Immunol,24: 759,1994, J.Exp.Med.180: 347,1994) 。
【００２４】
本発明においては、配列番号：１のアミノ酸配列において、HLA-A24 抗原に結合して提示される９マーのモチーフを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べたところ、それぞれ配列番号：２〜１１に示されるＰ１〜Ｐ１０のペプチドが腫瘍抗原ペプチドの候補として挙げられる（表１）。ＣＴＬの反応性という観点から、Ｐ２（配列番号：３）、Ｐ３（配列番号：４）、Ｐ８（配列番号：９）、Ｐ９（配列番号：１０）およびＰ１０（配列番号：１１）のペプチドが好ましく、Ｐ９のペプチドがより好ましい。
【００２５】
【表１】
【００２６】
この様にして決定されたペプチドは、通常のペプチド化学において知られている方法で製造することができる。例えば、"Peptide Synthesis", Interscience,New York. 1996、"The Proteins", Vol.2, Academic Press Inc., New York. 1976、「ペプチド合成」丸善（株) 、1975、「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株) 、1985、等に記載されている方法等が挙げられる。すなわち、Ｃ末端部位の構成により液相法、固相法のいずれかを選択して合成することができ、なかでも液相法がより好ましい。すなわち、アミノ酸の官能基を適当な保護基で適宜保護および脱保護を行い、アミノ酸を、１残基または数残基づつ結合させることでペプチドを製造することができる。なお、アミノ酸の官能基の保護基については、例えば前述のペプチド化学について記載する書籍等に記載されている。
【００２７】
本明細書中、「本発明の腫瘍抗原ペプチドの誘導体」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列のうち１つまたは複数個が置換、欠失、挿入または付加されたペプチドを意味する。好ましい誘導体としては、腫瘍抗原ペプチドのうちでＣＴＬとの結合に関与するエピトープ領域はそのままであってＭＨＣクラスＩ抗原との結合に関与するアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加された誘導体が挙げられ、さらに好ましくはその誘導体であって一つのアミノ酸残基のみを置換したものが挙げられる（Immunol. 84: 298-303,1995 ）。かかる誘導体は、ＣＴＬとの結合性はそのまま維持しつつ、ＭＨＣクラスＩ抗原により強く結合可能であるため、さらに有用な腫瘍抗原ペプチドとして適用ができる。
【００２８】
このような誘導体は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１−３巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Labolatory Press 出版 New York 1989年に記載の方法で調製することができ、部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などの方法によって調製することができる。
【００２９】
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の本発明のオリゴヌクレオチド分子によりコードされるものである。
【００３０】
また、「本発明の誘導体」には、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたは該ペプチドの一部のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入または付加した誘導体のアミノ基もしくはカルボキシル基を修飾した誘導体も包含される。
【００３１】
アミノ基の修飾基としては、例えばアシル基が挙げられ、具体的には炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基等が挙げられる。
【００３２】
カルボキシル基の修飾基としては、例えばエステル基およびアミド基が挙げられ、エステル基の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル基、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル基、炭素数５から７のシクロアルキルエステル基等が挙げられ、アミド基の具体例としては、アミド基、炭素数１から６のアルキル基１つまたは２つで置換されたアミド基、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基１つまたは２つで置換されたアミド基、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド基等が挙げられる。
【００３３】
本発明はさらに、本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体を含有する医薬を提供する。本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドは、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev.7:277-289、1994）に記載のものなどが応用可能である。また、剤型としては、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッド（脂質）を結合させた製剤など外因性の抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ抗原へ効率良く抗原提示させうる投与法が用いられる。また、腫瘍抗原ペプチドをパルスした樹状細胞やマイクロファージなどの抗原提示細胞や腫瘍抗原タンパク質をコードするDNA を導入した細胞を投与する方法も考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg 〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００３４】
本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体に対する「抗体」は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane.H.D.ら編、Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989年などに記載の方法により、腫瘍抗原タンパク質またはその断片ペプチドを用いて適切な方法で適切な動物を免疫することにより、腫瘍抗原タンパク質を認識する抗体、あるいはその活性を中和する抗体を容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、cDNAライブラリーのスクリーニング、免疫学的診断法、医薬等が挙げられる。免疫学的診断法は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。
【００３５】
本発明はさらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするオリゴヌクレオチド分子に関する。本発明のオリゴヌクレオチド分子はDNA またはRNA の形態をとることができ、DNA にはcDNA、ゲノムDNA および合成DNA が包含される。また、DNA およびRNA は一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖の両者が包含され得る。
【００３６】
ある塩基配列のうち一部が置換、欠失、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド分子は、前記ポリヌクレオチド分子と同様の部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などにより製造できる。本発明のオリゴヌクレオチド分子は、これらの変異型オリゴヌクレオチド分子も包含する。かかる変異型オリゴヌクレオチド分子としては、例えば、配列番号：１の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド分子が挙げられる。また、本発明のオリゴヌクレオチド分子には「本発明のオリゴヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子」も包含される。オリゴヌクレオチド分子としてDNA 分子を代表例にとると、「DNA 分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA 分子」は、例えば前記ポリヌクレオチド分子と同様の条件によって得ることができ、ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前記ポリヌクレオチド分子において記載された条件が挙げられる。
【００３７】
また、本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをコードするDNA を発現させることによって、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドを大量に製造することが可能となる。
【００３８】
DNA を発現してタンパク質を生産するには、例えば、前述のMolecular Cloning 等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。発現させたいDNA の上流に翻訳開始コドンを、下流には翻訳終始コドンを付加し、転写を制御するプロモーター配列（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター）等の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１など）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。
【００３９】
次に、発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体細胞を得る。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。形質転換体は、適当な培地で培養することによって目的とするタンパク質を生産する。以上のようにして得られたタンパク質は一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００４０】
これらの本発明のプラスミドによって形質転換された形質転換体も本発明の範囲に包含される。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子もしくはその化学的修飾体を含有する医薬に関する。
本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含有する「医薬」は、例えば、本発明のDNA を腫瘍患者等に投与することで腫瘍を治療または予防することができる。本発明のDNA を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス、1994年4 月号、20-45 頁、月刊薬事、36(1)23-48(1994)、実験医学増刊、12(15)、(1994)、およびこれらの引用文献等) のいずれの方法も適用することができる。
【００４２】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のRNA ウイルスまたはDNA ウイルスに本発明のDNA を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００４３】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNA ワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNA ワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４４】
これらの本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を有するプラスミドも本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス、1994年4 月号、20-45 頁、月刊薬事、36(1)23-48(1994)、実験医学増刊、12(15)、(1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００４６】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のDNA を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のDNA を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４７】
製剤中の本発明のDNA 含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常本発明のDNA として、0.0001mg〜100mg 、好ましくは0.001mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４８】
本発明はさらに、配列番号：１のアミノ酸配列を有する腫瘍抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド分子またはその化学的修飾体に関する。好ましくは、配列番号：１の塩基配列（構造遺伝子部分）からなるポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列をもつ９塩基以上からなるDNA もしくはRNA である。このようなDNA もしくはRNA とは、二本鎖DNA のアンチセンス鎖のDNA またはそのアンチセンス鎖のDNA に対応するRNA であって９塩基以上からなるもの（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドという）をいう。
【００４９】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を基にしてDNA として製造するか、またこのDNA をアンチセンスの向きに遺伝子発現プラスミドに組み込むことで容易に対応するRNA を製造することができる。
【００５０】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子であるcDNAのコーディング部分、５' ノンコーディング部分のいずれの部分の相補的な配列であってもよいが、好ましくは転写開始部位、翻訳開始部位、５' 非翻訳領域、エクソンとイントロンとの境界領域もしくは5'CAP 領域に相補的配列であることが望ましい。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド分子の化学的修飾体」とは、DNA またはRNA の細胞内への移行性または細胞内での安定性を高めることができる化学的修飾体を表し、例えば、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデート等の誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY −LISS刊 1992 P.1-50）が挙げられる。この化学的修飾体は、同文献等に従って製造することができる。
【００５２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を用いて、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することができる。この方法によって腫瘍抗原タンパク質の生産量を減らすことで、自己免疫疾患を治療または予防することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬も本発明に包含される。
【００５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをそのまま投与する場合は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、例えば５〜２００塩基のものが挙げられる。
【００５４】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミドに組み込む場合は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、例えば１００塩基以上が挙げられ、好ましくは３００塩基以上が挙げられ、さらに好ましくは５００塩基以上が挙げられる。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミドに組み込む場合、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入する方法としては例えば、実験医学12巻 1994年に述べられている方法が挙げられ、リポソームや組換えウイルスなどを利用した方法が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現プラスミドは通常の発現ベクターを用いてプロモーターの後ろに逆向きに、すなわち本発明の遺伝子が３' から５' の向きに転写されるように、本発明の遺伝子をつなぐだけで簡単に作製できる。
【００５６】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するプラスミドも本発明に包含される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投与する場合、安定化剤、緩衝液、溶媒などと混合して製剤された後、投与時には抗生物質、抗炎症剤、麻酔薬などと同時に用いることもできる。こうして作製された製剤は様々な方法で投与可能である。投与は連日または数日から数週間おきになされるのが好ましい。また、この様な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレット製剤を作製し患部近くに埋め込むことも可能である。あるいはオスモチックポンプなどを用いて患者に連続的に徐々に投与することも可能である。通常投与量は作用部位における濃度が0.1nM-10μM になるように調製する。
【００５７】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を含有する医薬も本発明に包含される。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００５９】
参考例１
食道癌細胞株に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株の樹立
６７歳男性の食道癌患者末梢血リンパ球をリンパ球腫瘍混合培養法により、インターロイキン２存在下で約６０日間、５％炭酸ガス（９５％空気）培養器にて培養した。その間、培養２８日目以降、頻回に培養して増殖するＴ細胞の各種癌細胞に対する細胞障害能を51Ｃｒ遊離法とＩＦＮ−γ測定法にて解析した。その結果、培養３９日目〜４９日目のＴ細胞がＣＤ８陽性のキラーＴ細胞を主体とし、かつＭＨＣクラスＩ抗原のうちのHLA-A2402 拘束性のＣＴＬ活性を示すことが判明した。HLA-A2402 陽性の癌細胞中、扁平上皮癌であるKE-4細胞株（M.Nakao ら, Cancer Research 55,4248-4252, 1995）が最も高い感受性を上記ＣＴＬに対して示した。そこで、上記ＣＴＬ（KE-4-CTLと命名）を大量に液体窒素添加細胞凍結保存用タンクに保存し、ＣＴＬの認識する癌退縮抗原遺伝子のクローニングに備えた。
【００６０】
参考例２
HLA-A2402 cDNA の組換えプラスミドの調製
中尾ら著、Cancer Res.55:4248-252(1995)の教示に従い、KE-4細胞由来のHLA-A2402 cDNAを発現ベクターpCR3（INVITROGEN社製）に組込み、組換えプラスミドを作製した。
【００６１】
参考例３
KE-4 細胞 cDNA ライブラリー作製
mRNA精製システム（ファルマシアバイオテク社製）を用い添付のプロトコールに従い、KE-4細胞から全RNA 画分の分離およびオリゴ(dT)カラムによるポリ(A) + mRNAの調製を行った。mRNAよりスーパースクリプトプラスミドシステム(GIBCO BRL 社製) を用い添付のプロトコールに従い、両端にNot １アダプターとSal １アダプターを連結したcDNAを作製した後、このcDNAを発現ベクターpSV-SPORT1（GIBCO BRL社製）の制限酵素Not １およびSal １の切断部位に連結して組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドをジーンパルサー(Bio-Rad社製) を用いて25μF, 200Ω, 2.5kV の条件で、電気パルスにより大腸菌のエレクトロマックスDH10B/p3TMセル（GIBCO BRL社製）に導入し、アンピシリン（50μｇ／ml）を含むLB培地（１％バクトトリプトンTM、0.5%NaCl、pH7.3 ）上にて組換えプラスミドが導入されている形質転換体を選択した。
【００６２】
参考例４
インターフェロン−γの定量
インターフェロン−γ（IFN-γ）の定量は、エンザイムイムノアッセイ（ELISA ）により行った。９６ウェルマイクロプレートに一次抗体として抗ヒトIFN-γマウスモノクロール抗体を吸着させ、ウシ血清アルブミンで非特異的結合をブロックした後、検体中のIFN-γを抗体に結合させた。次に二次抗体として抗ヒトIFN-γウサギポリクロール抗体を結合させ、さらにペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ免疫グロブリンロバ抗体を結合した後、発色剤としてＴＭＢＺ（テトラメチルベンジディン）を反応させ、2N H2SO4 を等量加えて反応を停止させた後、吸光度(450 nm)を測定した。これを標準品のIFN-γより得られた値と比較することにより定量した。
【００６３】
実施例１
腫瘍抗原タンパク質遺伝子のスクリーニング
まず、参考例３にて調製した形質転換体のプールから組換えプラスミドDNA を回収する。
アンピシリン（50μｇ／ml）を含むLB培地の入った96ウェルＵ底マイクロプレートにウェルあたり100-200 個の形質転換体を加え培養後、その一部をウェル当たり0.3ml のTYGPN 培地（F.M. Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.）の入った別の96ウェルＵ底マイクロプレートに移して３７℃で４８時間培養し、残りのLB培地のマイクロプレートは凍結保存した。TYGPN 培地で培養した形質転換体の組換えプラスミドDNA は、マイクロプレートでアルカリ溶解法（F.M. Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.）により調製した。イソプロパノール沈殿で回収した組換えプラスミドDNA は、50μｌの20 ng ／ml RN アーゼを含む10mM Tris ，1mM EDTA，pH7.4 溶液に懸濁した。
【００６４】
次に、上記にて調製した組換えプラスミドDNA と参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをCOS7細胞（Gluzan,Y. Cell,23: 175-182, 1981）にリポフェクチン法により同時にトランスフェクトする。
COS7細胞を96ウェル平底マイクロプレートのウェル当たり1 ×104 個を加え、100 μｌの10％FCS を含むRPMI培養液で1 日培養した。形質転換体約100 個分のKE-4cDNAの組換えプラスミド25μｌに参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミド100 ngを加え、さらに約100 倍に希釈したリポフェクチン試薬（リポフェクタミン、GIBCO-BRL 社製）25μｌを加えた。得られた混合液 50 μｌ（リポソームと組換えプラスミドの融合懸濁液）を、培養したCOS7細胞に加えてダブルトランスフェクトした。トランスフェクタントは2 点ずつ用意した。トランスフェクタントは48〜72時間、37℃で培養した後、培養液を除去し、ウェル当たり1 ×104 個のKE-4ＣＴＬを加えて100 μｌの10％ヒト血清と50Ｕ／mlのIL-2を含む培養液で37℃で16〜24時間培養した。培養液を回収し、IFN-γをELISA で測定した。
【００６５】
次いで、ELISA によって高いIFN −γ産生が認められた８群について、該当する凍結保存しておいたKE-4cDNAの組換えプラスミドによる形質転換体約100 〜200 クローン／ウェルのプールを用いてさらに以下のようにスクリーニングを行う。
形質転換体のプ―ルを約６時間LB（アンピシリン50μg ／mlを含む）培地にて培養し、さらに培養物をアンピシリン（50μg ／ml）を含むLB寒天培地のプレートにまいて１日培養し、得られた単一コロニー各群200 コロニー、合計8 ×200 コロニーをそれぞれ９６穴マイクロプレートの各ウェルに移し、ウェル当たりの形質転換体が１種類となる条件で上記と同様の方法で培養し、KE-4 cDNA の組換えプラスミドDNA を調製した。さらに上記と同様な方法によりKE-4 cDNA の組換えプラスミドとHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドとをCOS7細胞にダブルトランスフェクトし、引き続いてKE-4- ＣＴＬとの混合培養を行い、KE-4- ＣＴＬが反応して産生した培養液中のIFN-γを定量し、陽性プラスミドを選択した。この操作により、KE-4- ＣＴＬと反応するKE-4細胞cDNA組換えプラスミドクローンが選択され、SART-2と命名した。SART-2について、さらにもう一度、同様な操作を繰り返してKE-4- ＣＴＬによるIFN-γの産生を確認した。
【００６６】
実施例２
腫瘍抗原遺伝子の塩基配列決定
目的の腫瘍抗原遺伝子のcDNAが組み込まれた組換えプラスミドを持つ形質転換体SART-2をそれぞれ、500ml のアンピシリン（50μg ／ml）を含むLB培地で37℃で14〜16時間培養し、遠心分離にて菌体を回収した。菌体からPLASMID MAXI キット（QIAGEN社製）に従い、組換えプラスミドを回収した。cDNAは、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター配列とT7 RNA ポリメラーゼプロモーター配列に挟まれた部位に組み込まれている。そこで文献（DNA 4: 165,1985 ）に記載のSP6 プロモータープライマーおよびT7プロモータープライマーを合成した。次に、SP6 プロモータープライマーまたはT7プロモータープライマーをFluore-dATP Labeling Mix（ファルマシアバイオテク社製）およびAutoRead Sequencing Kit （ファルマシアバイオテク社製）と組み合わせてジデオキシシークエンシング反応を行い、蛍光DNA シーケンサー（ファルマシアバイオテク社製）を使用し、両端からcDNAの塩基配列を決定した。SART-2cDNAの塩基配列は全長が3998塩基対と決定され、配列番号：１の通りであった。また、SART-2cDNAの塩基配列から推定される最長のオープンリーディングフレームを有するアミノ酸配列を配列番号：１および図１に示す。
【００６７】
Gene Worksデーターベースを使用し、配列番号：１に記載の塩基配列の検索を行った。その結果、SART-2遺伝子は、第６染色体長腕（６ｑ２２）上に存在していた。
【００６８】
実施例３
SART-2 クローンの活性断片の特定
実施例２で得られたSART-2cDNAから、様々なサイズのＣ末端欠失変異体腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の断片を作製した。この断片を含む組換えプラスミドDNA と参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをCOS7細胞に実施例１に記載の手法によりダブルトランスフェクトし、IFN-γ産生量をELISA によって測定した。得られた結果は、トリプリケートの平均値を示し、関連性のない遺伝子をHLA-A2402 遺伝子とダブルトランスフェクトしたネガティブコントロールへの反応性に対して、いずれも有意差（ｐ＜0.05）が認められた（図３）。
【００６９】
図３より、Ｃ末端欠失変異体腫瘍抗原タンパク質は、全長のSART-2腫瘍抗原タンパク質に比べてIFN-γ産生量が低下しており、低下の程度からSART-2の腫瘍抗原ペプチドは、Ｎ末端側とＣ末端側に存在していることが示唆された。
【００７０】
また、HLA-A24 のＭＨＣクラスＩ抗原の型については、結合して提示されるペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明しており(seminars in IMMUNOLOGY 5:81-94,1993)、それを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べたところ、表１に示される10個のペプチドＰ１〜Ｐ１０（配列番号：２〜１１）が腫瘍抗原ペプチドの候補として挙げられた。
【００７１】
前記ペプチドを常法により合成し、最終濃度10μg/mlとなるように10％FCS 添加RPMI640 培養液に加え、HLA-A2402 cDNAをトランスフェクトしたCOS7細胞にパルスし、前記と同様にIFN-γ産生量を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定した（図４）。
【００７２】
図４より、Ｐ２（配列番号：３）、Ｐ３（配列番号：４）、Ｐ８（配列番号：９）、Ｐ９（配列番号：１０）およびＰ１０（配列番号：１１）が活性があり、このうちＰ９が最も活性が高いことが示された。
【００７３】
実施例４
腫瘍抗原タンパク質の HLA-A2402 拘束性の同定
異なる量（0 〜400ng/ウエル) のSART-2遺伝子を含むプラスミドベクターを、一定量（100ng/ウエル) のHLA-A2402 cDNAまたはHLA-A2601 cDNAとダブルトランスフェクトしたCOS7細胞それぞれに対して、KE-4- ＣＴＬが用量依存的に反応するかどうかをIFN-γ産生量を調べることにより検討した（図５）。
【００７４】
図５より、SART-2腫瘍抗原タンパク質は、HLA-A2402 拘束性であることが示された。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドを用いた抗腫瘍免疫を活性化するための医薬、本発明の腫瘍抗原タンパク質に対する抗体等を用いた自己免疫疾患を治療するための医薬、および腫瘍抗原タンパク質をコードするDNA 等を含有する医薬を提供することができ、また腫瘍または自己免疫疾患の診断方法を提供することができる。
【００７６】
【配列表】
【００７７】
【００７８】
【００７９】
【００８０】
【００８１】
【００８２】
【００８３】
【００８４】
【００８５】
【００８６】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、SART-2cDNAおよびそれから推定される最長のオープンリーディングフレームを有するアミノ酸配列（１文字標記）を示す。
【図２】図２は、SART-2遺伝子の構造を示す模式図である。ＯＲＦは、オープンリーディングフレームを示す。
【図３】図３は、SART-2遺伝子欠失変異体を用いてIFN-γ産生量をELISA によって測定したグラフである。図中、NCはネガティブコントロールを示す。
【図４】図４は、表１に示す推定HLA-A24 結合ペプチドを用いてIFN-γ産生量をELISA によって測定したグラフである。
【図５】図５は、SART-2遺伝子がコードする腫瘍抗原タンパク質がHLA-A2402 拘束性であることを示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は医療分野に属し、詳しくは癌または自己免疫疾患を処置する方法、さらに詳しくは細胞傷害性Ｔ細胞によって攻撃を受けて退縮する癌退縮抗原およびそれを利用する免疫療法等に関する。
【０００２】
生体による腫瘍の排除には免疫系、特にＴ細胞が重要な役割を果たしていることが知られている。実際、ヒトの腫瘍局所には腫瘍細胞に対して傷害活性を示すリンパ球の浸潤が認められ（Arch.Surg.126:200-205,1990）、メラノーマから自己の腫瘍細胞を認識する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が分離されている(Immunol.Today 8:385、1987、J.Immunol.138:989,1987、Int.J.Cancer 52:52-59 、1992等) 。また、Ｔ細胞移入によるメラノーマ治療の臨床結果も腫瘍排除によるＴ細胞の重要性を示唆している(J.Natl.Cancer.Inst.86:1159,1994) 。
【０００３】
自己の腫瘍細胞を攻撃するＣＴＬは、腫瘍抗原ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原に結合した複合体をＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて認識し、自己の腫瘍細胞を攻撃している。この腫瘍抗原ペプチドは、腫瘍抗原（タンパク質）が細胞内で合成された後、プロテオソームによって細胞質内でペプチドに分解されることによって生成される。一方、ＭＨＣクラスＩ抗原は、上記の腫瘍抗原ペプチドと結合し、シスゴルジを経て成熟側のトランスゴルジへと移動し細胞表面に発現する（臨床免疫27(9):1034-1042 、1995）。
【０００４】
【従来の技術】
ヒト癌細胞上のＭＨＣクラスＩ抗原上に提示され、宿主Ｔ細胞の標的分子となる腫瘍抗原タンパク質が1991年にT.Boonにより同定された(Science254:1643-1647,1991) 。この抗原は、この抗原を発現する癌細胞がＣＴＬによって攻撃を受け退縮することから癌退縮抗原と呼ばれ、また、メラノーマ細胞から同定されたことよりMelanoma antigen（ＭＡＧＥ）と名付けられている。
その後、ＣＴＬにより認識される腫瘍抗原タンパク質がメラノーマ細胞などから相次いで同定された。今までに同定された腫瘍抗原タンパク質はその由来、構造（変異の有無）や発現様式により以下の４つのカテゴリーに分類される(T.Boon et al.,J.Exp.Med.183:725-729,1996)：
【０００５】
ｉ）腫瘍特異的共有抗原（Tumor −Specific Shared Antigens）
ここに分類される抗原は正常組織では睾丸と胎盤でのみ発現され、腫瘍組織ではメラノーマ、頭頚部癌、非小細胞性肺癌、膀胱癌など各種の癌に広範に発現が認められる一群のタンパク質である。このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、上記のＭＡＧＥ、その１２種類以上の類似するファミリーを形成するタンパク質群(J.Exp.Med.178:489-495,1993)、ＢＡＧＥ（Immunity 2:167-175、1995）およびＧＡＧＥ(J.Exp.Med.182:689-698,1995)があり、いづれもメラノーマ細胞から同定されている。また最近、メラノーマに限って広範に発現されるＮＡ１７−Ａが報告された。それは、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ遺伝子のイントロンに相当する部分が翻訳され、ＨＬＡ−Ａ２拘束性に抗原ペプチド（ＶＬＰＯＶＦＩＲＣ）が癌退縮抗原として発現し、ＣＴＬにより認識される。
【０００６】
ii）分化抗原（Differentiation Antigens ）
ここに分類される腫瘍抗原タンパク質は、正常組織ではメラノサイトで発現しており、腫瘍組織ではメラノーマでのみ発現が認められる一群のタンパク質である。これらの組織特異的なタンパク質は腫瘍細胞のメラノーマに強度に発現しているが、他の組織型の癌（腺癌や扁平上皮癌）には認められないことから、メラノーマに特異的な腫瘍抗原タンパク質と考えられる。このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質としては、チロシナーゼ(J.Exp.Med.178:489-495,1993)、ＭＡＲＴ−１(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91: 3515, 1994）、ｇｐ１００(J.Exp.Med. 179: 1005-1009, 1994) ，ｇｐ７５(J.Exp.Med. 181: 799-352, 1995）があり、これらの遺伝子はいづれもメラノーマ細胞からクローニングされている。なお、他にMelan-A （J.Exp.Med. 180: 35, 1994）が同定されたが、後にＭＡＲＴ−１と同一の分子であることが判明した。
また、ここに分類される抗原は正常のメラノサイトにも発現していることから、メラノサイト破壊性自己免疫疾患での標的分子としての可能性が存在する。特にＭＡＲＴ−１／melan-Ａはvon −小柳−原田氏病における標的分子と考えられる（S.Sugita, et al., Int.Immunol.8:799-803,1996）。ｇｐ１００はそれを発現するメラノーマが免疫療法に高い感受性を示すので、in vivoでの癌退縮抗原として作用している可能性がある。
このカテゴリーの腫瘍抗原タンパク質は、メラノーマ以外の腫瘍では発現していないため、他の腫瘍に応用することはできない。
【０００７】
iii ）個々の腫瘍に特異的な抗原（Antigens Specific for Individual Tumors ）
この領域に分類される腫瘍抗原タンパク質は、正常細胞が癌化する過程でおこる遺伝子変化に伴う癌特有の新しい抗原である。遺伝子変化としては点突然変異（point mutation、変異ＣＤＫ４抗原、変異β−Catenin 抗原、ＭＵＭ−抗原）、alterative open reading frame（変異ｇｐ７５抗原）がこれまでに知られている。したがって、このような抗原は癌に特異的であり特異免疫の成立が容易に成立するものと考えられる。しかしながら、一方で各々の遺伝子変化は個々の腫瘍もしくは個々の腫瘍細胞に限って発現していることが殆どである。したがって発現頻度はきわめて低く、癌治療を目的としたワクチン分子として臨床応用され難いという欠点を有する。
【０００８】
iv）普遍性抗原（Ubiquitous Antigens）
殆どの正常細胞や癌細胞に非変異体として普遍的に発現される（ubiquitous）抗原がＣＴＬの癌認識分子になっているケースとしては、ｐ１５が知られている。ｐ１５分子はＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドを有する。ｐ１５は正常細胞に比して癌細胞により強く発現されている。その観点からは、腺癌等に強発現している癌遺伝子タンパク質であるＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原も同類として分類される。即ち、ＨＥＲ−２／ｎｅｕはＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチドを有し、癌退縮抗原として宿主キラーＴ細胞により認識される。
ここに分類される抗原を腫瘍抗原タンパク質とした場合、普遍的に発現しているために広範な癌に応用可能と考えられるが、疾病特異性に乏しいため、正常組織に障害を与える可能性があり、またＣＴＬ誘導が困難である可能性（トランスのため）が考えられる。
【０００９】
ＭＨＣ−非拘束性と考えられていたＭＵＣ−１抗原特異的ＣＴＬが同抗原由来ペプチドＳＴＡＰＰＡＨＧＶをＨＬＡ−Ａ１１拘束性に認識すると報告され、またＭＡＧＥ−３ペプチドを用いての臨床試験の初期成績が報告された（M.Marchand,et al., Int.J.Cancer 63:883-885,1995 ）。これらは、癌退縮抗原を用いての癌ワクチン開発の可能性を示唆している。
【００１０】
これまでに同定された上記の抗原ペプチドはＨＥＲ−２／ｎｅｕを除き、その殆どがメラノーマから発見されており、発病頻度の高い扁平上皮癌や腺癌では全く報告されていない。しかし、我々は最近、食道扁平上皮癌よりＨＬＡ２６０１拘束性の癌抗原ペプチドが存在し宿主ＣＴＬによって認識されることを報告した（M.Nakao, et al., Cancer Res. 55:4248-4252,1995）。したがって、扁平上皮癌にも同様の抗原ペプチドをコードする腫瘍抗原タンパク質の存在することが示唆される。扁平上皮癌は、ヒトの癌で最も多く認められる癌のひとつであり、特に食道癌や肺癌での扁平上皮癌は現在の化学療法や放射線療法に比較的抵抗性を示すことが知られている。その点からも腫瘍抗原ペプチド等を用いた特異的免疫療法の開発が期待される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、扁平上皮癌等の幅広い腫瘍に応用でき、または応用可能な腫瘍が限られていてもその腫瘍の患者のうち多くの人に応用でき、またはその腫瘍の治療や診断を補完しつつ各種腫瘍に応用できる癌療法の一助となる腫瘍抗原タンパク質、腫瘍抗原ペプチド等を提供することにある。
また、腫瘍において高発現している腫瘍抗原タンパク質は、一方で、正常組織にも発現しその腫瘍抗原タンパク質に由来する免疫反応が過剰に起こることで、自己免疫疾患を引き起こしているとも考えられている。例えば、化学療法剤とＩＬ−２を併用してメラノーマの治療を行った場合、白斑症状の出現が認められるとの報告がある(J.Clin.Oncol.10:1338-1343,1992)。これは、メラノーマに出現する腫瘍抗原タンパク質の断片ペプチドとＭＨＣ複合体に対してＣＴＬまたは抗体が誘導、産生され、正常組織である皮膚組織に作用することで自己免疫疾患様の症状である白斑症状が出現したためと考えられる。
腫瘍抗原タンパク質に由来する特異的免疫が過剰に惹起されることにより自己免疫疾患が発症した場合には、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を妨ぐアンチセンスDNA や腫瘍抗原ペプチドのアンタゴニストなどを用いて、免疫反応を特異的にブロックする治療法が期待される。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
メラノーマ細胞以外の腫瘍細胞、特に扁平上皮癌等の治療や診断に幅広く応用できる腫瘍抗原タンパク質またはその対応する腫瘍抗原ペプチド等を得るために、扁平上皮癌からの腫瘍抗原タンパク質の同定を試みた。
本発明者らは食道癌患者の末梢血リンパ球からリンパ球腫瘍混合培養法により、HLA-A2402 拘束性の腫瘍抗原ペプチドを認識するＣＴＬ(KE-4-CTL)を樹立した。このＣＴＬはHLA-A2402 陽性の食道癌細胞株KE-4を強く障害する。
そこで、サル腎細胞株COS7細胞に、KE-4癌細胞株から作製したcDNAライブラリーの組換えプラスミドとHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドを同時にトランスフェクトし、そのトランスフェクタントにKE-4-CTL細胞を作用させ、KE-4-CTL細胞が活性化されたか否かをIFN-γの産生量で測定しスクリーニングした。その結果、メラノーマ以外の腫瘍細胞KE-4から本発明の腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は、（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子、（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子、（４）配列番号：１の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子、および（５）前記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子からなる群より選択されるポリヌクレオチド分子であって、該ポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドであるポリヌクレオチド分子；本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされる腫瘍抗原タンパク質；本発明の腫瘍抗原タンパク質の部分ペプチドであってＭＨＣクラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体；本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体を含有する医薬；本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体に対する抗体；本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするオリゴヌクレオチド分子、好ましくは腫瘍抗原タンパク質をコードしている塩基配列が配列番号：１の塩基配列である該オリゴヌクレオチド分子；配列番号：１の腫瘍抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド分子またはその化学的修飾体；本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子もしくはその化学的修飾体を含有する医薬；本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を有するプラスミド；および本発明のプラスミドによって形質転換された形質転換体、に関する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本明細書中で使用している用語の意義を明らかにするとともに、発明の実施形態を説明する。
本発明のポリヌクレオチド分子は、新規な腫瘍抗原タンパク質をコードするものであり、（１）配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子、（２）配列番号：１のアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、（３）配列番号：１の塩基配列からなるポリヌクレオチド分子、（４）配列番号：１の塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子、および（５）前記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子、からなる群より選択され、該ポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチドである。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチド分子はDNA またはRNA の形態をとることができ、DNA にはcDNA、ゲノムDNA および合成DNA が包含される。また、DNA およびRNA は一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖の両者が包含され得る。
【００１６】
ある塩基配列のうち一部が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１−３巻 Sambrook, J. ら著、Cold Spring Harber Labolatory Press 出版 New York 1989年などに記載の方法によって製造することができ、例えば部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などにより製造できる。本発明のポリヌクレオチド分子はこれらの変異型ポリヌクレオチド分子も包含する。かかる変異型ポリヌクレオチド分子としては、例えば、配列番号：１の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたポリヌクレオチド分子が挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチド分子には「本発明のポリヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子」も包含される。ポリヌクレオチド分子としてDNA 分子を代表例にとると、「DNA 分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA 分子」は、例えば前述のMolecular Cloning に記載の方法によって得ることができる。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０. １×ＳＳＣ、０. ５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイズのシグナルが観察されることを表す。
【００１７】
本発明の腫瘍抗原タンパク質は、前記ポリヌクレオチド分子によりコードされるタンパク質である。
【００１８】
「本発明のポリヌクレオチド分子がコードするタンパク質の一部からなるペプチドがＭＨＣクラスＩ抗原と結合してＴ細胞により認識される腫瘍抗原ペプチド」とは、腫瘍抗原タンパク質の連続した少なくとも７個、好ましくは７〜１０個、特に好ましくは９個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドであって、細胞表面のＭＨＣクラスＩ抗原と結合して細胞表面に提示された場合、その結合体に対して特異的に結合するＴ細胞が結合するとそのＴ細胞にシグナルを伝えることのできる、即ちＴ細胞に認識されるＭＨＣクラスＩ抗原との結合体を形成できるそのようなペプチドを意味する。なお、ここでいう「結合」とは非共有結合である。
【００１９】
ペプチドがＭＨＣクラスＩ抗原に結合してＴ細胞に認識されることを確かめる方法としては、例えば、ペプチドを適当な細胞に内因性に発現させるか、または外部から加える（パルスする）ことによりＭＨＣクラスＩ抗原に結合させることで細胞表面にペプチドを提示させ、つづいて、そのペプチド提示細胞に対して腫瘍抗原タンパク質特異的なＴ細胞を作用させ、そのペプチド提示細胞が傷害を受けた際に産生されるサイトカイン（インターフェロンαやＴＮＦα、およびＣＴＬが産生するサイトカイン）を測定する方法などがある。また、ペプチド提示細胞の傷害を測定する方法として、51Ｃｒで標識したペプチド提示細胞を用いる方法も使用できる。ここで、認識するＴ細胞としては、ＣＴＬを用いるのが好ましい。
【００２０】
本発明に係る腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドは例えば、以下のようにして同定することができる。
まず、これらの同定に際し、ＭＨＣ−クラスＩアレルの一致した腫瘍細胞およびこの細胞を攻撃するＣＴＬのセットを用意する。
次いで、腫瘍細胞のＭＨＣクラスＩ抗原に結合している腫瘍抗原ペプチドを酸性化して抽出し、高速液体クロマトグラフィーで分離された種々のペプチドを、抗原提示ＭＨＣを発現しているが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えば、同一患者のＢ細胞など）にパルスし、ＣＴＬの反応を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定し、さらにマススペクトロメタリーなどを用いて配列を決定する方法である。この方法によって、メラノーマ細胞からｇｐ１００と同一分子のPme117由来の腫瘍抗原ペプチドが同定されている(Science 264: 716-719, 1994)。
【００２１】
あるいは、上記のような腫瘍抗原ペプチドを直接同定する方法とは異なり、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を決定してさらにその対応する腫瘍抗原ペプチドを同定する方法もある。これは、分子生物学的手法を用いて腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子をクローニングするものである。腫瘍細胞からcDNAを調製し、そのcDNAを腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えばCOS 細胞など）に抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子とともにトランスフェクトして一過的にそれらを発現させ、それに対するＣＴＬの反応性によりスクリーニングを繰り返し行い、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子を単離する。この方法により、上記のＭＡＧＥ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｇｐ７５の遺伝子がクローニングされている。
【００２２】
この腫瘍抗原遺伝子の情報から実際にＭＨＣクラスＩ抗原に結合して提示されている腫瘍抗原ペプチドを推定、同定するためには次のような方法を用いる。まず、ＰＣＲ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素などにより様々なサイズの腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを作製し、抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原遺伝子とともに腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞（例えばCOS 細胞など）にトランスフェクトして一過性に発現させ、ＣＴＬの反応性により腫瘍抗原ペプチドを含む領域を限定する。その後、ペプチドを合成し、抗原提示ＭＨＣクラスＩ抗原は発現しているが腫瘍抗原タンパク質を発現していない細胞にパルスし、同様にＣＴＬの反応を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定できる(J.Exp.Med. 176: 1453, 1992 、J.Exp.Med. 179: 24,759、1994) 。
【００２３】
また、HLA-A1，-A0201，-A0205，-A11，A31 ，-A6801，-B7 ，-B8 ，-B2705，-37 ，-Cw0401 ，-Cw0602 などのＭＨＣクラスＩ抗原の型については、結合して提示されるペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明しており (seminars in IMMUNOLOGY 5: 81-94, 1993)、それを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べ、そのペプチドを結合して上記と同様な方法で確認する方法も用いられる(Eur.J.Immunol,24: 759,1994, J.Exp.Med.180: 347,1994) 。
【００２４】
本発明においては、配列番号：１のアミノ酸配列において、HLA-A24 抗原に結合して提示される９マーのモチーフを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べたところ、それぞれ配列番号：２〜１１に示されるＰ１〜Ｐ１０のペプチドが腫瘍抗原ペプチドの候補として挙げられる（表１）。ＣＴＬの反応性という観点から、Ｐ２（配列番号：３）、Ｐ３（配列番号：４）、Ｐ８（配列番号：９）、Ｐ９（配列番号：１０）およびＰ１０（配列番号：１１）のペプチドが好ましく、Ｐ９のペプチドがより好ましい。
【００２５】
【表１】
この様にして決定されたペプチドは、通常のペプチド化学において知られている方法で製造することができる。例えば、"Peptide Synthesis", Interscience,New York. 1996、"The Proteins", Vol.2, Academic Press Inc., New York. 1976、「ペプチド合成」丸善（株) 、1975、「ペプチド合成の基礎と実験」丸善（株) 、1985、等に記載されている方法等が挙げられる。すなわち、Ｃ末端部位の構成により液相法、固相法のいずれかを選択して合成することができ、なかでも液相法がより好ましい。すなわち、アミノ酸の官能基を適当な保護基で適宜保護および脱保護を行い、アミノ酸を、１残基または数残基づつ結合させることでペプチドを製造することができる。なお、アミノ酸の官能基の保護基については、例えば前述のペプチド化学について記載する書籍等に記載されている。
【００２７】
本明細書中、「本発明の腫瘍抗原ペプチドの誘導体」とは、本発明の腫瘍抗原ペプチドのアミノ酸配列のうち１つまたは複数個が置換、欠失、挿入または付加されたペプチドを意味する。好ましい誘導体としては、腫瘍抗原ペプチドのうちでＣＴＬとの結合に関与するエピトープ領域はそのままであってＭＨＣクラスＩ抗原との結合に関与するアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加された誘導体が挙げられ、さらに好ましくはその誘導体であって一つのアミノ酸残基のみを置換したものが挙げられる（Immunol. 84: 298-303,1995 ）。かかる誘導体は、ＣＴＬとの結合性はそのまま維持しつつ、ＭＨＣクラスＩ抗原により強く結合可能であるため、さらに有用な腫瘍抗原ペプチドとして適用ができる。
【００２８】
このような誘導体は、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual第２版第１−３巻 Sambrook,J.ら著、Cold Spring Harber Labolatory Press 出版 New York 1989年に記載の方法で調製することができ、部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などの方法によって調製することができる。
【００２９】
従って、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体は、後述の本発明のオリゴヌクレオチド分子によりコードされるものである。
【００３０】
また、「本発明の誘導体」には、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたは該ペプチドの一部のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入または付加した誘導体のアミノ基もしくはカルボキシル基を修飾した誘導体も包含される。
【００３１】
アミノ基の修飾基としては、例えばアシル基が挙げられ、具体的には炭素数１から６のアルカノイル基、フェニル基で置換された炭素数１から６のアルカノイル基、炭素数５から７のシクロアルキル基で置換されたカルボニル基、炭素数１から６のアルキルスルホニル基、フェニルスルホニル基等が挙げられる。
【００３２】
カルボキシル基の修飾基としては、例えばエステル基およびアミド基が挙げられ、エステル基の具体例としては、炭素数１から６のアルキルエステル基、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキルエステル基、炭素数５から７のシクロアルキルエステル基等が挙げられ、アミド基の具体例としては、アミド基、炭素数１から６のアルキル基１つまたは２つで置換されたアミド基、フェニル基で置換された炭素数０から６のアルキル基１つまたは２つで置換されたアミド基、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド基等が挙げられる。
【００３３】
本発明はさらに、本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体を含有する医薬を提供する。本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドは、細胞性免疫が効果的に成立するようにアジュバントとともに投与したり、粒子状の剤型にして投与することができる。アジュバントとしては、文献（Clin. Microbiol.Rev.7:277-289、1994）に記載のものなどが応用可能である。また、剤型としては、リポソーム製剤、直径数μm のビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッド（脂質）を結合させた製剤など外因性の抗原ペプチドをＭＨＣクラスＩ抗原へ効率良く抗原提示させうる投与法が用いられる。また、腫瘍抗原ペプチドをパルスした樹状細胞やマイクロファージなどの抗原提示細胞や腫瘍抗原タンパク質をコードするDNA を導入した細胞を投与する方法も考えられる。製剤中の本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドの投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常0.0001mg〜1000mg、好ましくは0.001mg 〜1000mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００３４】
本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドもしくはその誘導体に対する「抗体」は、例えば、Antibodies; A Laboratory Manual, Lane.H.D.ら編、Cold Spring Harber Laboratory Press 出版 New York 1989年などに記載の方法により、腫瘍抗原タンパク質またはその断片ペプチドを用いて適切な方法で適切な動物を免疫することにより、腫瘍抗原タンパク質を認識する抗体、あるいはその活性を中和する抗体を容易に作製できる。抗体の用途としては、アフィニティークロマトグラフィー、cDNAライブラリーのスクリーニング、免疫学的診断法、医薬等が挙げられる。免疫学的診断法は、イムノブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光あるいは発光測定法等より適宜選択できる。
【００３５】
本発明はさらに、本発明の腫瘍抗原ペプチドまたはその誘導体をコードするオリゴヌクレオチド分子に関する。本発明のオリゴヌクレオチド分子はDNA またはRNA の形態をとることができ、DNA にはcDNA、ゲノムDNA および合成DNA が包含される。また、DNA およびRNA は一本鎖または二本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖の両者が包含され得る。
【００３６】
ある塩基配列のうち一部が置換、欠失、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド分子は、前記ポリヌクレオチド分子と同様の部位特異的変異誘発やＰＣＲ法などにより製造できる。本発明のオリゴヌクレオチド分子は、これらの変異型オリゴヌクレオチド分子も包含する。かかる変異型オリゴヌクレオチド分子としては、例えば、配列番号：１の塩基配列において１もしくは複数個の塩基が置換、欠失、挿入または付加されたオリゴヌクレオチド分子が挙げられる。また、本発明のオリゴヌクレオチド分子には「本発明のオリゴヌクレオチド分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド分子」も包含される。オリゴヌクレオチド分子としてDNA 分子を代表例にとると、「DNA 分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA 分子」は、例えば前記ポリヌクレオチド分子と同様の条件によって得ることができ、ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、前記ポリヌクレオチド分子において記載された条件が挙げられる。
【００３７】
また、本発明の腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドをコードするDNA を発現させることによって、腫瘍抗原タンパク質または腫瘍抗原ペプチドを大量に製造することが可能となる。
【００３８】
DNA を発現してタンパク質を生産するには、例えば、前述のMolecular Cloning 等の多くの成書や文献に基づいて実施することができる。発現させたいDNA の上流に翻訳開始コドンを、下流には翻訳終始コドンを付加し、転写を制御するプロモーター配列（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｔ７、ＳＶ４０初期プロモーター）等の制御遺伝子を付加し、適当なベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＶ・ＳＰＯＲＴ１など）に組み込むことにより、宿主細胞内で複製し、機能する発現プラスミドを作製する。
【００３９】
次に、発現プラスミドを適当な宿主細胞に導入して形質転換体細胞を得る。宿主細胞としては、大腸菌などの原核生物、酵母のような単細胞真核生物、昆虫、動物などの多細胞真核生物の細胞などが挙げられる。また、宿主細胞への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、電気パルス法などがある。形質転換体は、適当な培地で培養することによって目的とするタンパク質を生産する。以上のようにして得られたタンパク質は一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００４０】
これらの本発明のプラスミドによって形質転換された形質転換体も本発明の範囲に包含される。
【００４１】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子もしくはその化学的修飾体を含有する医薬に関する。
本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含有する「医薬」は、例えば、本発明のDNA を腫瘍患者等に投与することで腫瘍を治療または予防することができる。本発明のDNA を投与し細胞内に導入する方法としては、ウイルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス、1994年4 月号、20-45 頁、月刊薬事、36(1)23-48(1994)、実験医学増刊、12(15)、(1994)、およびこれらの引用文献等) のいずれの方法も適用することができる。
【００４２】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のRNA ウイルスまたはDNA ウイルスに本発明のDNA を組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【００４３】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNA ワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にDNA ワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【００４４】
これらの本発明のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を有するプラスミドも本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
本発明の腫瘍抗原ペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するin vivo方法、およびヒトからある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo方法がある（日経サイエンス、1994年4 月号、20-45 頁、月刊薬事、36(1)23-48(1994)、実験医学増刊、12(15)、(1994)、およびこれらの引用文献等）。in vivo方法がより好ましい。
【００４６】
in vivo方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。in vivo方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には有効成分である本発明のDNA を含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、本発明のDNA を含有するリポソームまたは膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）−リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【００４７】
製剤中の本発明のDNA 含量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常本発明のDNA として、0.0001mg〜100mg 、好ましくは0.001mg 〜10mgであり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。
【００４８】
本発明はさらに、配列番号：１のアミノ酸配列を有する腫瘍抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列からなるオリゴヌクレオチド分子またはその化学的修飾体に関する。好ましくは、配列番号：１の塩基配列（構造遺伝子部分）からなるポリヌクレオチド分子のコーディング配列またはその５' ノンコーディング配列中の塩基配列と相補的な配列をもつ９塩基以上からなるDNA もしくはRNA である。このようなDNA もしくはRNA とは、二本鎖DNA のアンチセンス鎖のDNA またはそのアンチセンス鎖のDNA に対応するRNA であって９塩基以上からなるもの（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドという）をいう。
【００４９】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば本発明の腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を基にしてDNA として製造するか、またこのDNA をアンチセンスの向きに遺伝子発現プラスミドに組み込むことで容易に対応するRNA を製造することができる。
【００５０】
このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子であるcDNAのコーディング部分、５' ノンコーディング部分のいずれの部分の相補的な配列であってもよいが、好ましくは転写開始部位、翻訳開始部位、５' 非翻訳領域、エクソンとイントロンとの境界領域もしくは5'CAP 領域に相補的配列であることが望ましい。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド分子の化学的修飾体」とは、DNA またはRNA の細胞内への移行性または細胞内での安定性を高めることができる化学的修飾体を表し、例えば、ホスホチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホトリエステル、アルキルホスホナート、アルキルホスホアミデート等の誘導体（"Antisense RNA and DNA" WILEY −LISS刊 1992 P.1-50）が挙げられる。この化学的修飾体は、同文献等に従って製造することができる。
【００５２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を用いて、腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御することができる。この方法によって腫瘍抗原タンパク質の生産量を減らすことで、自己免疫疾患を治療または予防することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する医薬も本発明に包含される。
【００５３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをそのまま投与する場合は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、例えば５〜２００塩基のものが挙げられる。
【００５４】
また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミドに組み込む場合は、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの好ましい長さとしては、例えば１００塩基以上が挙げられ、好ましくは３００塩基以上が挙げられ、さらに好ましくは５００塩基以上が挙げられる。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを発現プラスミドに組み込む場合、このアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入する方法としては例えば、実験医学12巻 1994年に述べられている方法が挙げられ、リポソームや組換えウイルスなどを利用した方法が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現プラスミドは通常の発現ベクターを用いてプロモーターの後ろに逆向きに、すなわち本発明の遺伝子が３' から５' の向きに転写されるように、本発明の遺伝子をつなぐだけで簡単に作製できる。
【００５６】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを有するプラスミドも本発明に包含される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体をそのまま投与する場合、安定化剤、緩衝液、溶媒などと混合して製剤された後、投与時には抗生物質、抗炎症剤、麻酔薬などと同時に用いることもできる。こうして作製された製剤は様々な方法で投与可能である。投与は連日または数日から数週間おきになされるのが好ましい。また、この様な頻回の投与を避けるために徐放性のミニペレット製剤を作製し患部近くに埋め込むことも可能である。あるいはオスモチックポンプなどを用いて患者に連続的に徐々に投与することも可能である。通常投与量は作用部位における濃度が0.1nM-10μM になるように調製する。
【００５７】
このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその化学的修飾体を含有する医薬も本発明に包含される。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【００５９】
参考例１
食道癌細胞株に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）株の樹立
６７歳男性の食道癌患者末梢血リンパ球をリンパ球腫瘍混合培養法により、インターロイキン２存在下で約６０日間、５％炭酸ガス（９５％空気）培養器にて培養した。その間、培養２８日目以降、頻回に培養して増殖するＴ細胞の各種癌細胞に対する細胞障害能を51Ｃｒ遊離法とＩＦＮ−γ測定法にて解析した。その結果、培養３９日目〜４９日目のＴ細胞がＣＤ８陽性のキラーＴ細胞を主体とし、かつＭＨＣクラスＩ抗原のうちのHLA-A2402 拘束性のＣＴＬ活性を示すことが判明した。HLA-A2402 陽性の癌細胞中、扁平上皮癌であるKE-4細胞株（M.Nakao ら, Cancer Research 55,4248-4252, 1995）が最も高い感受性を上記ＣＴＬに対して示した。そこで、上記ＣＴＬ（KE-4-CTLと命名）を大量に液体窒素添加細胞凍結保存用タンクに保存し、ＣＴＬの認識する癌退縮抗原遺伝子のクローニングに備えた。
【００６０】
参考例２
HLA-A2402 cDNA の組換えプラスミドの調製
中尾ら著、Cancer Res.55:4248-252(1995)の教示に従い、KE-4細胞由来のHLA-A2402 cDNAを発現ベクターpCR3（INVITROGEN社製）に組込み、組換えプラスミドを作製した。
【００６１】
参考例３
KE-4 細胞 cDNA ライブラリー作製
mRNA精製システム（ファルマシアバイオテク社製）を用い添付のプロトコールに従い、KE-4細胞から全RNA 画分の分離およびオリゴ(dT)カラムによるポリ(A) + mRNAの調製を行った。mRNAよりスーパースクリプトプラスミドシステム(GIBCO BRL 社製) を用い添付のプロトコールに従い、両端にNot １アダプターとSal １アダプターを連結したcDNAを作製した後、このcDNAを発現ベクターpSV-SPORT1（GIBCO BRL社製）の制限酵素Not １およびSal １の切断部位に連結して組換えプラスミドを得た。この組換えプラスミドをジーンパルサー(Bio-Rad社製) を用いて25μF, 200Ω, 2.5kV の条件で、電気パルスにより大腸菌のエレクトロマックスDH10B/p3TMセル（GIBCO BRL社製）に導入し、アンピシリン（50μｇ／ml）を含むLB培地（１％バクトトリプトンTM、0.5%NaCl、pH7.3 ）上にて組換えプラスミドが導入されている形質転換体を選択した。
【００６２】
参考例４
インターフェロン−γの定量
インターフェロン−γ（IFN-γ）の定量は、エンザイムイムノアッセイ（ELISA ）により行った。９６ウェルマイクロプレートに一次抗体として抗ヒトIFN-γマウスモノクロール抗体を吸着させ、ウシ血清アルブミンで非特異的結合をブロックした後、検体中のIFN-γを抗体に結合させた。次に二次抗体として抗ヒトIFN-γウサギポリクロール抗体を結合させ、さらにペルオキシダーゼ標識した抗ウサギ免疫グロブリンロバ抗体を結合した後、発色剤としてＴＭＢＺ（テトラメチルベンジディン）を反応させ、2N H2SO4 を等量加えて反応を停止させた後、吸光度(450 nm)を測定した。これを標準品のIFN-γより得られた値と比較することにより定量した。
【００６３】
実施例１
腫瘍抗原タンパク質遺伝子のスクリーニング
まず、参考例３にて調製した形質転換体のプールから組換えプラスミドDNA を回収する。
アンピシリン（50μｇ／ml）を含むLB培地の入った96ウェルＵ底マイクロプレートにウェルあたり100-200 個の形質転換体を加え培養後、その一部をウェル当たり0.3ml のTYGPN 培地（F.M. Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.）の入った別の96ウェルＵ底マイクロプレートに移して３７℃で４８時間培養し、残りのLB培地のマイクロプレートは凍結保存した。TYGPN 培地で培養した形質転換体の組換えプラスミドDNA は、マイクロプレートでアルカリ溶解法（F.M. Ausubelら編、CURRENT PROTCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc.）により調製した。イソプロパノール沈殿で回収した組換えプラスミドDNA は、50μｌの20 ng ／ml RN アーゼを含む10mM Tris ，1mM EDTA，pH7.4 溶液に懸濁した。
【００６４】
次に、上記にて調製した組換えプラスミドDNA と参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをCOS7細胞（Gluzan,Y. Cell,23: 175-182, 1981）にリポフェクチン法により同時にトランスフェクトする。
COS7細胞を96ウェル平底マイクロプレートのウェル当たり1 ×104 個を加え、100 μｌの10％FCS を含むRPMI培養液で1 日培養した。形質転換体約100 個分のKE-4cDNAの組換えプラスミド25μｌに参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミド100 ngを加え、さらに約100 倍に希釈したリポフェクチン試薬（リポフェクタミン、GIBCO-BRL 社製）25μｌを加えた。得られた混合液 50 μｌ（リポソームと組換えプラスミドの融合懸濁液）を、培養したCOS7細胞に加えてダブルトランスフェクトした。トランスフェクタントは2 点ずつ用意した。トランスフェクタントは48〜72時間、37℃で培養した後、培養液を除去し、ウェル当たり1 ×104 個のKE-4ＣＴＬを加えて100 μｌの10％ヒト血清と50Ｕ／mlのIL-2を含む培養液で37℃で16〜24時間培養した。培養液を回収し、IFN-γをELISA で測定した。
【００６５】
次いで、ELISA によって高いIFN −γ産生が認められた８群について、該当する凍結保存しておいたKE-4cDNAの組換えプラスミドによる形質転換体約100 〜200 クローン／ウェルのプールを用いてさらに以下のようにスクリーニングを行う。
形質転換体のプ―ルを約６時間LB（アンピシリン50μg ／mlを含む）培地にて培養し、さらに培養物をアンピシリン（50μg ／ml）を含むLB寒天培地のプレートにまいて１日培養し、得られた単一コロニー各群200 コロニー、合計8 ×200 コロニーをそれぞれ９６穴マイクロプレートの各ウェルに移し、ウェル当たりの形質転換体が１種類となる条件で上記と同様の方法で培養し、KE-4 cDNA の組換えプラスミドDNA を調製した。さらに上記と同様な方法によりKE-4 cDNA の組換えプラスミドとHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドとをCOS7細胞にダブルトランスフェクトし、引き続いてKE-4- ＣＴＬとの混合培養を行い、KE-4- ＣＴＬが反応して産生した培養液中のIFN-γを定量し、陽性プラスミドを選択した。この操作により、KE-4- ＣＴＬと反応するKE-4細胞cDNA組換えプラスミドクローンが選択され、SART-2と命名した。SART-2について、さらにもう一度、同様な操作を繰り返してKE-4- ＣＴＬによるIFN-γの産生を確認した。
【００６６】
実施例２
腫瘍抗原遺伝子の塩基配列決定
目的の腫瘍抗原遺伝子のcDNAが組み込まれた組換えプラスミドを持つ形質転換体SART-2をそれぞれ、500ml のアンピシリン（50μg ／ml）を含むLB培地で37℃で14〜16時間培養し、遠心分離にて菌体を回収した。菌体からPLASMID MAXI キット（QIAGEN社製）に従い、組換えプラスミドを回収した。cDNAは、SP6 RNAポリメラーゼプロモーター配列とT7 RNA ポリメラーゼプロモーター配列に挟まれた部位に組み込まれている。そこで文献（DNA 4: 165,1985 ）に記載のSP6 プロモータープライマーおよびT7プロモータープライマーを合成した。次に、SP6 プロモータープライマーまたはT7プロモータープライマーをFluore-dATP Labeling Mix（ファルマシアバイオテク社製）およびAutoRead Sequencing Kit （ファルマシアバイオテク社製）と組み合わせてジデオキシシークエンシング反応を行い、蛍光DNA シーケンサー（ファルマシアバイオテク社製）を使用し、両端からcDNAの塩基配列を決定した。SART-2cDNAの塩基配列は全長が3998塩基対と決定され、配列番号：１の通りであった。また、SART-2cDNAの塩基配列から推定される最長のオープンリーディングフレームを有するアミノ酸配列を配列番号：１および図１に示す。
【００６７】
Gene Worksデーターベースを使用し、配列番号：１に記載の塩基配列の検索を行った。その結果、SART-2遺伝子は、第６染色体長腕（６ｑ２２）上に存在していた。
【００６８】
実施例３
SART-2 クローンの活性断片の特定
実施例２で得られたSART-2cDNAから、様々なサイズのＣ末端欠失変異体腫瘍抗原タンパク質をコードする遺伝子の断片を作製した。この断片を含む組換えプラスミドDNA と参考例２にて調製したHLA-A2402 cDNAの組換えプラスミドをCOS7細胞に実施例１に記載の手法によりダブルトランスフェクトし、IFN-γ産生量をELISA によって測定した。得られた結果は、トリプリケートの平均値を示し、関連性のない遺伝子をHLA-A2402 遺伝子とダブルトランスフェクトしたネガティブコントロールへの反応性に対して、いずれも有意差（ｐ＜0.05）が認められた（図３）。
【００６９】
図３より、Ｃ末端欠失変異体腫瘍抗原タンパク質は、全長のSART-2腫瘍抗原タンパク質に比べてIFN-γ産生量が低下しており、低下の程度からSART-2の腫瘍抗原ペプチドは、Ｎ末端側とＣ末端側に存在していることが示唆された。
【００７０】
また、HLA-A24 のＭＨＣクラスＩ抗原の型については、結合して提示されるペプチドの配列の規則性（モチーフ）が判明しており(seminars in IMMUNOLOGY 5:81-94,1993)、それを参考にして腫瘍抗原ペプチドの候補を調べたところ、表１に示される10個のペプチドＰ１〜Ｐ１０（配列番号：２〜１１）が腫瘍抗原ペプチドの候補として挙げられた。
【００７１】
前記ペプチドを常法により合成し、最終濃度10μg/mlとなるように10％FCS 添加RPMI640 培養液に加え、HLA-A2402 cDNAをトランスフェクトしたCOS7細胞にパルスし、前記と同様にIFN-γ産生量を調べることにより腫瘍抗原ペプチドを同定した（図４）。
【００７２】
図４より、Ｐ２（配列番号：３）、Ｐ３（配列番号：４）、Ｐ８（配列番号：９）、Ｐ９（配列番号：１０）およびＰ１０（配列番号：１１）が活性があり、このうちＰ９が最も活性が高いことが示された。
【００７３】
実施例４
腫瘍抗原タンパク質の HLA-A2402 拘束性の同定
異なる量（0 〜400ng/ウエル) のSART-2遺伝子を含むプラスミドベクターを、一定量（100ng/ウエル) のHLA-A2402 cDNAまたはHLA-A2601 cDNAとダブルトランスフェクトしたCOS7細胞それぞれに対して、KE-4- ＣＴＬが用量依存的に反応するかどうかをIFN-γ産生量を調べることにより検討した（図５）。
【００７４】
図５より、SART-2腫瘍抗原タンパク質は、HLA-A2402 拘束性であることが示された。
【００７５】
【発明の効果】
本発明の腫瘍抗原タンパク質および腫瘍抗原ペプチドを用いた抗腫瘍免疫を活性化するための医薬、本発明の腫瘍抗原タンパク質に対する抗体等を用いた自己免疫疾患を治療するための医薬、および腫瘍抗原タンパク質をコードするDNA 等を含有する医薬を提供することができ、また腫瘍または自己免疫疾患の診断方法を提供することができる。
【００７６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、SART-2cDNAおよびそれから推定される最長のオープンリーディングフレームを有するアミノ酸配列（１文字標記）を示す。
【図２】図２は、SART-2遺伝子の構造を示す模式図である。ＯＲＦは、オープンリーディングフレームを示す。
【図３】図３は、SART-2遺伝子欠失変異体を用いてIFN-γ産生量をELISA によって測定したグラフである。図中、NCはネガティブコントロールを示す。
【図４】図４は、表１に示す推定HLA-A24 結合ペプチドを用いてIFN-γ産生量をELISA によって測定したグラフである。
【図５】図５は、SART-2遺伝子がコードする腫瘍抗原タンパク質がHLA-A2402 拘束性であることを示すグラフである。
Claims (8)
- 腫瘍抗原タンパク質である配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド分子。
- 配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる腫瘍抗原タンパク質。
- 配列番号：１の１〜２８１７、１〜２２５６、１〜２０００、１〜１８６７、１〜１５２５、１〜１２３９、１〜１１００、１〜８２５、１〜５４０、１〜４００および１〜２００からなる群から選択されるポリヌクレオチド分子によりコードされる腫瘍抗原タンパク質。
- 配列番号：１の１〜２８１７、１〜２２５６、１〜２０００、１〜１８６７、１〜１５２５、１〜１２３９、１〜１１００、１〜８２５、１〜５４０、１〜４００および１〜２００からなる群から選択されるポリヌクレオチド分子。
- 配列番号：２〜７、９〜１１いずれかの腫瘍抗原ペプチド。
- 請求項５に記載のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド分子。
- 請求項２または３記載の腫瘍抗原タンパク質に対する抗体。
- 請求項５に記載の腫瘍抗原ペプチドに対する抗体。
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