CN107267481A - Cdk5抗原表位肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗原表位肽，其氨基酸序列含有SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列，或含有对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列。该抗原表位肽可以用于产生抗原呈递细胞、主要组织相容性抗原复合物或细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，还能应用于制备治疗如胶质瘤的癌症的药物中。

Description

CDK5抗原表位肽及其应用
技术领域
本发明属于分子免疫学领域，涉及抗原表位肽，具体涉及HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的CDK5表位肽及其应用。
背景技术
胶质瘤是神经***最常见的恶性肿瘤，复发率高，预后差。主要原因是肿瘤的残留病变难以消除。免疫治疗可以进一步清除手术、放化疗后的微小残留病灶，从而可以减少或避免胶质瘤的复发。但是寻找肿瘤相关抗原是肿瘤免疫治疗的关键，研究者不断筛选新的肿瘤相关抗原以最终达到针对每位患者个体化治疗的目的。研究显示，细胞周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)在胶质瘤中高表达，并与PD-L1表达相关。下调或者抑制CDK5蛋白的表达会使胶质瘤细胞显著凋亡。本研究将CDK5蛋白作为胶质瘤免疫治疗的候选靶抗原，并以表位肽来替代蛋白质作为靶点。
因此，本领域技术人员致力于开发一种HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别的CDK5表位肽。
发明内容
有鉴于现有技术中肿瘤特异性抗原的免疫原性不够强等问题，本发明提供了一种CDK5抗原表位肽及其应用。
本发明的第一方面提供了一种CDK5抗原表位肽，其选自以下任一项：
1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，该肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。
进一步地，上述抗原表位肽为SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。
本发明的第二方面提供了一种核苷酸序列，该核苷酸序列编码上述抗原表位肽的氨基酸序列。
本发明的第三方面提供了一种抗原呈递细胞，该抗原呈递细胞脉冲以上述抗原表位肽。
本发明的第四方面提供了一种主要组织相容性抗原复合物，其包括HLA-A0201分子和上述抗原表位肽。
本发明的第五方面提供了一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，该细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：
1)如上所述的抗原表位肽；
2)如上所述的抗原呈递细胞；或
3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。
本发明的第六方面提供了一种癌症疫苗，该癌症疫苗的活性成分包括：
1)如上所述的抗原表位肽；
2)如上所述的抗原呈递细胞；或
3)如上所述的主要组织相容性抗原复合物。
进一步地，上述癌症为胶质瘤。
本发明还提供了上述抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。
优选地，癌症为胶质瘤。
本发明通过在线筛选、T2细胞亲和性和稳定性实验，筛选获得了两条目的抗原表位肽aa106和aa164。他们在健康供者及患者外周血中均存在，这为后续的研究供了必要条件。
通过上述抗原表位肽，在专制抗原提呈细胞(如DC)的辅助下，激活CTL并使之扩增。激活后的CTL作用于CDK5蛋白来阻断免疫耐受及免疫忽视，提高其免疫原性，从而有效地杀伤胶质瘤细胞，但是其对正常造血细胞没有杀伤作用。据推测，在CDK5-CTL细胞下调了肿瘤细胞CDK5表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。
附图说明
图1是本发明一个实施例的T2细胞亲和实验结果图。其中，阴性对照FLU-matrix为流感基质蛋白，阳性对照为HIV pol，aa106和aa164为两条预测的肽段。
图2是本发明一个实施例的T2细胞结合稳定性实验结果图。
图3是本发明的一个实施例的CDK5-CTL中CD8+的细胞的CD45RA表达情况结果图。
图4是本发明的一个实施例的CDK5-CTL中CD8+的细胞的CD45RO表达情况结果图。
图5是本发明一个实施例的CDK5-CTL增殖实验结果图。
图6是本发明一个实施例的CDK5-CTL细胞杀伤实验结果图。
图7是本发明一个实施例的CDK5-CTL细胞功能实验结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明作进一步地说明，应理解这些实施例仅作为例证的目的，不用于限制本发明的保护范围。
以下具体实施方式中使用的试剂，如无特殊说明，均可直接购买获得。
流式细胞仪购自BECKMAN COULTER，型号为Navios。
T2细胞购自ADCC。
FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2购自ebioscience。
FITC标记的CD8+单克隆抗体购自ebioscience。
多肽的合成可以通过现有技术中的任何方法进行，如固相肽合成法等。
氨基酸的替换：通过氨基酸替换可以获得类似或等同活性的突变体肽，该替换可以用具有与替换前的氨基酸的电荷、可溶性、亲水性/疏水性、极性类似的氨基酸进行。
T2细胞亲和性和稳定性分析的原理：T2细胞缺乏内源性抗原肽提呈中必须的抗原加工相关转运蛋白，其本身表面只有少量空载的HLA-A0201分子表达且极不稳定。但当其表面MHC I类分子与HLA-A0201结合力强的肽段结合后，HLA-A0201的表达情况会增强并稳定。并且，HLA-A0201分子和肽段的结合力越强，T2细胞表面的HLA-A0201分子降解就越少，表现为HLA-A0201分子的表达量越高。因此，可以直接用T2细胞表面HLA-A0201分子表达的强弱来反应所预测表位肽与HLA-A0201的结合能力。
同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
实施例1：HLA-A0201限制性CDK5蛋白CTL表位肽预测及合成
(1)CDK5蛋白氨基酸序列的确定：
通过在Genbank数据库中查找CDK5蛋白序列，获得Genbank登录号为：CAG33322.1的一种CDK5蛋白序列，其由292个氨基酸残基组成，具体如SEQ ID No.1所示。
(2)CDK5蛋白表位肽的在线预测：
利用表位肽预测数据库
a：https://www-bimas.cit.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken_parker_comboform及
b：http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)
提供的服务对HLA-A0201限制性CDK5蛋白表位肽进行初步预测，选择其中得分最高的数条表位肽，之后用超基序及量化基序方案对初步预测出的CTL表位肽进行修饰，以进一步提高积分。修饰后得分最高的两条表位肽如表1所示：
表1CDK5蛋白表位肽与人HLA-A0201亲和力预测积分
(得分Ia和得分IIb分别代表使用上方a网站和b网站各自预测的分数。
(3)多肽的合成、纯化与鉴定：
通过生物合成手段，合成、纯化及鉴定了表1中的两个肽段aa106和AA164(上海波泰生物科技公司)。
(4)对照肽：
选取文献报道中的HLA A0201阳性肽和阴性肽作为对照。这两条肽分别为：
阳性肽HIV pol：ILKEPVHGV(SEQ ID No.4)；
阴性肽：流感病毒基质蛋白肽段(FLU-matrix肽段)：GILGFVFTL(SEQ ID No.5)。
实施例2：T2细胞表位肽结合亲和及稳定性实验
借助T2细胞的特性进行HLA-A0201与肽段的亲和能力及稳定性测定。
(1)T2细胞亲和实验
收集T2细胞，用4℃的无菌PBS离心洗涤三次，加入无血清1640培养基，2×105/孔细胞接种于24孔细胞培养板中，设立实验组及对照组，每组重复三个副孔，将未加肽刺激的T2细胞作为空白对照，每孔加入相应的实验肽段(aa106和aa164)及对照肽段(阳性对照：HIV pol肽段；阴性对照：流感病毒基质蛋白肽段FLU-matrix)(终浓度50uM)，同时加入β2微球蛋白(终浓度2.5ug/ml)。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中孵育18h，再次收集细胞，4℃PBS洗涤三次，加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(2ul/孔)，4℃避光孵育15分钟，4℃PBS洗涤3次，用流式细胞仪检测平均荧光强度。
用荧光系数(FI)作为衡量亲和力指标，荧光系数>1的表位肽被认为与HLA-A0201分子具有高亲和力，荧光系数由以下公式计算得到：
荧光系数(FI)＝(样本平均荧光强度-空白对照平均荧光强度)/空白对照平均荧光强度。
亲和性实验结果如图1所示，aa106和aa164的用荧光系数(FI)均大于1，这表明aa106和aa164与HLA-A0201分子具有高亲和力。
(2)T2细胞表位肽结合稳定性实验
收集T2细胞，1×105/孔接种于96孔细胞培养板中，加入无血清1640培养基、β2微球蛋白以及相应的实验肽段(aa106和aa164)，实验组设置三个副孔。将细胞置于5％CO2培养箱中孵育18h，再次收集细胞，洗涤后加入无血清1640培养基、胞外布雷菲德菌素共同孵育1h，收集细胞，洗涤后再次加入含有胞外布雷菲德菌素(0.5ug/ml)的无血清1640培养基，放入培养箱中孵育，于不同的时间点(0、2、4、8、12、24h)收集细胞。加入FITC标记的HLA-A0201单克隆抗体BB7.2(10ul/孔)，用流式细胞仪检测平均荧光强度，计算出每个时间点的FI，用此衡量表位肽诱导的HLA-A0201的表达情况。
结合稳定性实验结果如图2所示，在孵育24h时，肽段aa106和aa164仍然能和HLA-A0201分子保持较好的亲和性，这说明肽段aa106和aa164的结合稳定性好。
实施例3：肽段aa106相应五聚体阳性细胞毒性T细胞检测
肽段aa106相应五聚体是根据T细胞活化的双识别原理，用生物工程技术将MHCⅠ类分子重链α与β2微球蛋白在体外组装，并结合抗原表位肽形成一个能够与相应TCR特异性结合的单体，再将5个单体组装在一起形成五聚体。
选取两名健康供者及六名胶质瘤确诊未缓解患者，检测其外周血中CDK5表位肽五聚体阳性的CD8+细胞数目。收集健康供者及胶质瘤确诊未缓解患者外周血5ml，用淋巴细胞分离液分离方法提取外周血单个核细胞，将细胞计数后取1×106个细胞，溶于100ul PBS中，加入2ul肽段aa106对应的PE标记的五聚体及同型对照，常温避光孵育40分钟后，冰面放置1分钟，加入FITC标记的CD8+单克隆抗体，4℃避光15分钟，取出后以4℃PBS洗3次，用500ul PBS重悬后用流式细胞仪进行检测。
流式结果判读如表2所示，表明肽段aa106是CDK5蛋白在患者体内或者胞内裂解后的天然产物，为生理状态下产生的表位肽片段，并且健康供者体内CDK5-CTL水平明显低于胶质瘤患者。
表2aa106的五聚体阳性的CD8+细胞数目检测结果
健康1 健康2 患者1 患者2 患者3 患者4 患者5 患者6
aa106 0.15％ 0.23％ 0.99％ 1.25％ 2.11％ 0.81％ 1.78％ 1.45％
实施例4：体外验证CDK5蛋白特异性细胞毒性T细胞对胶质瘤细胞细胞溶解作用并研究其特性
一、诱导生成细胞毒性T细胞：
通过具有稳定的HLA-A0201+的健康供者的外周血，分离外周血单个核细胞(PBMC)，诱导培养DC细胞及细胞毒性T细胞(CTL)。
1.1)获取HLA-A0201+健康供者外周血单个核细胞
(1).抽取HLA-A0201+健康供者外周血约20ml，肝素钠抗凝。
(2).将外周血加入50ml无菌离心管中，并加入等体积无菌PBS。
(3).分2个50ml离心管，将约40ml稀释的外周血缓慢加入40ml淋巴细胞分离液上，使两者分两层(分两管操作)。
(4).离心400g 18min(相当于1500rpm/min)，离心机选择慢加速及慢减速程序。
(5).吸出在液相交界处的雾状细胞层(即单个核细胞层)，装入另一10ml离心管中。
(6).将单个核细胞用无菌PBS重悬，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。
(7).离心结束后弃上清，用保存于冰面的红细胞裂解液4ml重悬并混合吹打，4℃冰箱放置10分钟，再以300g 10分钟离心，弃上清。
(8).将单个核细胞用无菌PBS洗两遍，300g 10min(每次用10ml左右的冲洗液量)。
(9).用8ml含有10％FBS的1640培养基重悬单个核细胞。
1.2)诱导生成DC细胞
(1).将提取的单个核细胞按照每孔1×106个加入24孔板中，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2h，使单核细胞贴壁。
(2).吸尽24孔板中的细胞悬液，并用含有10％FBS的1640培养基0.5ml轻轻冲刷每孔，重复三次，按需要决定是否收集吸出的细胞悬液(其中含有单个核细胞)。
(3).每孔加入1ml含有10％FBS的1640培养基，并加入GM-CSF 10ng/ml及IL-410ng/ml。
(4).每3日半量换液一次，换液时同样加入GM-CSF 10ng/ml及IL-4 10ng/ml，第5日半量换液，加入GM-CSF 10ng/ml、IL-4 10ng/ml及TNF-α 10ng/ml，48h后DC细胞成熟。
(5).加入aa106肽段，浓度为50ng/ml，37℃，5％二氧化碳培养箱中静置2-4h。
(6).30Gy伽马射线照射成熟的DC细胞。
(7).吸除所有上清，准备加入淋巴细胞或者诱导的CTL细胞。
1.3).PBMC来源CTLs的产生
(1).第一次淋巴细胞与DC细胞共培养时，将1.2步骤中的细胞悬液收集并以1000转10分钟离心，后用含有IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-15 5ng/ml的10％FBS的1640培养基重悬，将淋巴细胞计数后与成熟DC细胞按照10：1比例混合。
(2).每2-3日半量换液一次，同时加入IL-2 50IU/ml、IL-7 2.5ng/ml及IL-155ng/ml。
(3).第7日新的DC成熟后，将淋巴细胞吹打后吸出，移入新生成DC孔中并与之共培养。
(4).每次与新的DC细胞共培养前，需取样检测特异性，一般与DC共培养4次。
1.4)CTL细胞CD8及五聚体双阳性率的检测
(1)取5×105个培养的CTL细胞(每次与DC共培养后第7天)，加入无菌PBS5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以100ul无菌PBS重悬.
(2)在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)，室温避光反应15分钟。置细胞于冰上，孵育1分钟。加入抗-CD8-FITC。在冰上继续避光反应20分钟。
(3)PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于适量PBS洗涤液中。
(4)细胞流式仪分析。
利用流式细胞仪技术的检测，得到CD8+阳性及五聚体阳性细胞比例超过10％以上的CDK5-CTL，用以完成后续实验。CTL细胞的产生结果表3所示。
表3四轮冲击后CDK5-CTL细胞的比例
第一轮 第二轮 第三轮 第四轮
比例 2.2％ 5.5％ 8.9％ 13.5％
二、细胞表型测定：
抗原特异性CTLs细胞表型应与初始(naive)T细胞有所区别，借助CD45RO及CD45RA检测诱导生产的CTL细胞与同一来源健康供者外周血表型区别，一般认为，特异性CTL细胞中CD8+的细胞高表达CD45RO，低表达CD45RA；相应的未经过与DC细胞共培养的健康供者外周血PBMC中，CD8+的细胞高表达CD45RA，低表达CD45RO。
1.取3×106个培养的CTL细胞(第四次与DC共培养后5天)，加入无菌PBS 5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以100ul无菌PBS重悬。同时取未经过与DC共培养的外周血PBMC作为对照组。
2.在细胞悬液中加入5μl带有荧光标记的MHC/肽多聚体(Epimer)，室温避光反应15分钟。置细胞于冰上，孵育1分钟。加入抗-CD8-FITC及抗-CD45RA-APC或抗CD45RO-APC。在冰上继续避光反应20分钟。
3.PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于适量PBS洗涤液中。
4.细胞流式仪分析。
流式分析结果如图3和图4所示，表明特异性CTL细胞中CD8+的细胞高表达CD45RO，低表达CD45RA。
三、CTL细胞增殖实验：
取经过与DC细胞共培养四周的CTL细胞进行实验，即使用上方一中诱导产生的CTL进行实验。
在流式细胞学检测方法中，用CFSE标记CTL细胞，并将其与照射过的HLA-A0201+的胶质瘤细胞株共培养，以检测CDK5-CTL是否会表现出特定的细胞增殖。一般认为只有在与HLA-A0201+的胶质瘤细胞株共培养时，CDK5-CTL细胞才表现出明显的增殖，在没有任何抗原刺激的情况下，CDK5-CTL细胞不增殖，在MHC不匹配的情况下，CDK5-CTL细胞也不增殖。通过这个实验，将论证CDK5-CTL细胞对胶质瘤细胞的作用是否受限于抗原特异性及MHC I类分子限制性。
取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验。
CCK-8试剂盒法，取经过与DC细胞共培养四周的CTLs细胞进行实验：
(1).获取DC细胞，方法如本实施例的诱导生成细胞毒性T细胞部分的1.2)，DC细胞在24孔板中诱导成熟。
(2).DC细胞成熟后分为实验组及对照组：实验组的DC细胞加入筛选出的肽段aa·06冲击(50ng/ml)，对照组的DC不加入肽段。
(3).放入37℃5％二氧化碳培养箱培养2-4小时后，将实验组及对照组DC细胞从培养箱取出，弃上清，以少量培养基重悬DC细胞并计数。
(4).取出共培养四周的CTLs细胞，吹打重悬后计数。
(5).将实验组及对照组的DC细胞分别与CTLs细胞按照梯度混合共培养，设置三个梯度：DC细胞与CTLs细胞的比例分别为：4:1、20:1及100：1。
(6).混合的几组细胞重新计数，取96孔板，每孔接种1×105个细胞，培养基为含有10％FBS的1640培养基，不加任何细胞因子，放入37℃5％二氧化碳培养箱培养12小时。每组设4个复孔，每孔均加入10ul CCK-8试剂。
(7).12小时后取出96孔板，震荡10分钟，采用双波长酶标仪读取450nm波长吸光度(OD)值，均应减除空白对照组OD值。
(8).根据第12小时时间点测得OD值绘制改点各组细胞增殖情况。
结果如图5所示，负载肽段的DC细胞才可以刺激CTL细胞增殖，形成特异性的CDK5-CTL细胞。加入肽段aa106冲击后，T细胞出现了明显的增殖。
四、CTL细胞杀伤实验：
用流式细胞学靶细胞PI及CD138+双标染色方法检测CDK5-CTLs细胞对HLA-A0201±的原代胶质瘤细胞及胶质瘤细胞株的特异性溶解作用。
取经过与DC细胞共培养四周的CTL细胞进行实验，即使用上方一中诱导产生的CTL进行实验。
(1).取10×106个培养的CTL细胞，加入无菌PBS5ml，以1000转10分钟离心，弃上清，以10ml无菌PBS重悬，使其达到每1ml有1×106个细胞。
(2).加入CFSE使其终浓度为3μM，放入37℃二氧化碳培养箱孵育15分钟，每5分钟摇匀细胞。
(3).取出细胞后加入等量胎牛血清放入4℃冰箱终止10分钟。
(4).用无菌PBS洗涤三次，每次为1000转10分钟。
(5).用含有10％FBS的1640重悬，使细胞浓度达到1×106/ml。
(6).将细胞分组移入24孔培养板中，每孔CTL细胞为1×106个。各实验组为CTL细胞分别按10：1、5:1、1:1比例加入HLA-A0201+胶质瘤细胞株或原代细胞、HLA-A0201-胶质瘤细胞株或原代细胞、4个患者细胞，每组设3个复孔。
(7).效靶细胞混合培养4小时后，取出并收集各组细胞，用PBS重悬后1000转离心10分钟，弃上清；
(8).以100ulPBS重悬，避光加入PI，4℃避光15分钟后上流式细胞仪进行检测。
实验结果如图6所示，其中a2+代表HLA-A0201+细胞株，a2-是指非HLA A2细胞株，p1代表HLA-A0201+患者1，p2代表HLA-A0201+患者2，p3代表非HLA-A0201患者3，p4代表非HLA-A0201患者4。结果表明，获得的CDK5-CTL细胞对HLA-A0201+性细胞有良好的细胞杀伤作用，而对非HLA-A0201性细胞基本没有细胞杀伤作用。并且，当效应细胞与靶细胞的体积比为10:1时，细胞杀伤作用能达到50％以上。
所以，来自于健康供者的CDK5蛋白特异性细胞毒性T细胞能有效地杀伤胶质瘤细胞，并且对正常造血细胞没有杀伤作用。特别地，在CDK5-CTL细胞下调了肿瘤细胞CDK5表达后，将会极大的恢复正常的活化T淋巴细胞的清除肿瘤作用。
六、CDK5-CTL细胞功能测定：
为了衡量CDK5-CTL细胞杀伤胶质瘤细胞株的效能，借助测量CD107a在CDK5-CTL细胞表面的表达，评估其细胞杀伤胶质瘤细胞时的脱颗粒作用。其中，脱粒作用即CD107a在CTL细胞释放细胞毒颗粒时会短暂的在CTLs细胞膜表面表达。
(1).取1×106个培养的CTLs细胞，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为333ul。
(2).两组分别取2×106个培养的胶质瘤细胞株(HLA-A0201-及HLA-A0201+各一组)，以1000转10分钟离心，弃上清，用含有10％FBS的1640重悬，使体积为667ul。
(3).将CTL细胞333ul与靶细胞(HLA-A0201-及HLA-A0201+各一组)667ul混合，共1ml。
(4).将效靶细胞混合液放入V型底96孔培养板中，每孔100ul，共10孔。
(5).将放有细胞的96孔板放入37℃ 5％二氧化碳培养箱中，培养4小时(对96孔板进行离心1000转5分钟)。
(6).培养4h后取出培养板，吹匀并吸出每孔细胞悬液，将10孔细胞混合。
(7).向效靶细胞混合液中加入5ml无菌PBS，混匀后以1000转10分钟离心，弃上清。以100ul无菌PBS重悬效靶细胞混合液，加入2ul抗-CD8-FITC及10ul抗-CD107a-PC5在冰上避光反应20分钟。
(8).用无菌PBS洗涤液洗细胞3次，400xg 5分钟，细胞沉淀重悬于500ulPBS中。用流式细胞仪进行检测。
检测结果如图7所示，图中，a2+是指HLA-A0201+细胞株；a2-是指非HLA-A0201细胞株。CDK5-CTL细胞与HLA-A0201+胶质瘤细胞株共培养后，CD8+细胞中CD107a的表达明显上升，表明CTL杀伤HLA-A0201+胶质瘤细胞株时的脱颗粒作用明显。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属新华医院
<120> CDK5抗原表位肽及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 292
<212> PRT
<213> Homo sapiens（智人）
<400> 1
Met Gln Lys Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
1 5 10 15
Thr Val Phe Lys Ala Lys Asn Arg Glu Thr His Glu Ile Val Ala Leu
20 25 30
Lys Arg Val Arg Leu Asp Asp Asp Asp Glu Gly Val Pro Ser Ser Ala
35 40 45
Leu Arg Glu Ile Cys Leu Leu Lys Glu Leu Lys His Lys Asn Ile Val
50 55 60
Arg Leu His Asp Val Leu His Ser Asp Lys Lys Leu Thr Leu Val Phe
65 70 75 80
Glu Phe Cys Asp Gln Asp Leu Lys Lys Tyr Phe Asp Ser Cys Asn Gly
85 90 95
Asp Leu Asp Pro Glu Ile Val Lys Ser Phe Leu Phe Gln Leu Leu Lys
100 105 110
Gly Leu Gly Phe Cys His Ser Arg Asn Val Leu His Arg Asp Leu Lys
115 120 125
Pro Gln Asn Pro Leu Ile Asn Arg Asn Gly Glu Leu Lys Leu Ala Asp
130 135 140
Phe Gly Leu Ala Arg Ala Phe Gly Ile Pro Val Arg Cys Tyr Ser Ala
145 150 155 160
Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Asp Val Leu Phe Gly Ala
165 170 175
Lys Leu Tyr Ser Thr Ser Ile Asp Met Trp Ser Ala Gly Cys Ile Phe
180 185 190
Ala Glu Leu Ala Asn Ala Gly Arg Pro Leu Phe Pro Gly Asn Asp Val
195 200 205
Asp Asp Gln Leu Lys Arg Ile Phe Arg Leu Leu Gly Thr Pro Thr Glu
210 215 220
Glu Gln Trp Pro Ser Met Thr Lys Leu Pro Asp Tyr Lys Pro Tyr Pro
225 230 235 240
Met Tyr Pro Ala Thr Thr Ser Leu Val Asn Val Val Pro Lys Leu Asn
245 250 255
Ala Thr Gly Arg Asp Leu Leu Gln Asn Leu Leu Lys Cys Asn Pro Val
260 265 270
Gln Arg Ile Ser Ala Glu Glu Ala Leu Gln His Pro Tyr Phe Ser Asp
275 280 285
Phe Cys Pro Pro
290
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa106
<400> 2
Phe Leu Phe Gln Leu Leu Lys Gly Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> aa164
<400> 3
Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Asp Val
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV pol
<400> 4
Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FLU-matrix肽段
<400> 5
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5

Claims (10)

1.一种CDK5抗原表位肽，其特征在于，其选自以下任一项：
1)含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
2)含有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的氨基酸序列组成的肽；
3)通过对SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列添加、缺失或替换一个或多个氨基酸形成的氨基酸序列组成的肽，所述肽能与HLA-A0201分子形成复合物而被HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞识别或诱导HLA-A0201限制性细胞毒性T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽为SEQ ID No.2或SEQID No.3所示的氨基酸序列组成的肽。
3.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码如权利要求1中所述的抗原表位肽的氨基酸序列。
4.一种抗原呈递细胞，其特征在于，所述抗原呈递细胞脉冲以权利要求1或2所述的抗原表位肽。
5.一种主要组织相容性抗原复合物，其特征在于，包括HLA-A0201分子和如权利要求1或2所述的抗原表位肽。
6.一种细胞毒性T淋巴细胞诱导剂，其特征在于，所述细胞毒性T淋巴细胞诱导剂的活性成分包括：
1)如权利要求1或2所述的抗原表位肽；
2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或
3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。
7.一种癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗的活性成分包括：
1)如权利要求1或2所述的抗原表位肽；
2)如权利要求4所述的抗原呈递细胞；或
3)如权利要求5所述的主要组织相容性抗原复合物。
8.如权利要求5所述的癌症疫苗，其特征在于，所述癌症为胶质瘤。
9.如权利要求1或2所述的抗原表位肽在制备治疗癌症的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为胶质瘤。
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