KR20060006055A - 막횡단 단백질 유전자내 돌연변이를 갖는 재조합인플루엔자 바이러스 - Google Patents

막횡단 단백질 유전자내 돌연변이를 갖는 재조합인플루엔자 바이러스 Download PDF

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Abstract

돌연변이 막 단백질 유전자를 갖는 바이러스를 제조하는 방법, 및 그 방법에 의해 수득되는 바이러스가 제공된다.

Description

막횡단 단백질 유전자내 돌연변이를 갖는 재조합 인플루엔자 바이러스{RECOMBINANT INFLUENZA VIRUSES HOLDING A MUTATION IN A TRANSMEMBRANE PROTEIN GENE}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2003년 4월 23일 출원된 미국출원 제60/464,776호 및 2003년 4월 24일 출원된 미국출원 제60/465,328호의 출원일의 이익을 주장하고, 그의 개시내용은 여기에 참조에 의해 도입된다.
정부 권리의 진술
본 발명은 미합중국 정부로부터의 허가(내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰로부터의 허가 AI-47446)로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 일정 권리를 가질 수 있다.
세포막은 다양한 단백질이 파묻혀 있는 지질 분자의 이중 층으로 구성되어 있다. 세포막의 지질 이중층은, 그의 소수성 내부로 인해, 대부분의 극성 분자의 통과에 대한 장벽으로 역할하고 따라서 세포 생존성에 중요하다. 세포 또는 세포내 구획 내부 또는 외부로 작은 수용성 분자의 수송을 용이하게 하기 위해, 그러한 막은 담체와 채널 단백질을 갖는다. 이온 채널은 근육 세포의 전기적 흥분성 및 신경계에서 전기적 신호전달을 포함하는, 많은 세포 기능에 필수적이다(Alberts 등, 1994에 의해 검토됨). 그들은 모든 동물 및 식물 세포, 및 미생물에 존재할 뿐 아니라, 바이러스에서도 확인된 바 있으며(Ewart 등, 1996; Piller 등, 1996; Pinto 등, 1992; Schubert 등, 1996; Sugrue 등, 1990; Sunstrom 등, 1996), 거기에서 그들은 바이러스 생활 주기에서 중요한 역할을 하는 것으로 교시되어 있다.
A형 인플루엔자 바이러스는 핵단백질(nucleoprotein(NP))로 캡시드화된(encapsidated) 8개의 RNA 분절을 갖는 외피를 갖는 (-)-쇄 바이러스이다(Lamb 및 Krug, 1996에 의해 검토됨). 세 단백질이 바이러스 막에 걸쳐 있다: 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA) 및 M2. HA 및 NA의 세포외 영역(엑토도메인)은, M2의 엑토도메인 영역이 A형 인플루엔자 바이러스 간에 필수적으로 불변인 반면, 상당히 가변적이다. 바이러스의 생활 주기는 일반적으로 세포 표면 수용체에 대한 부착, 세포로의 진입 및 바이러스 핵산의 탈피에 이은, 세포 내부에서의 바이러스 유전자의 복제를 포함한다. 바이러스 단백질 및 유전자의 새로운 카피의 합성 후, 이들 성분은 자손 바이러스 입자로 조립되고, 그 후 세포를 빠져나간다(Roizman 및 Palese, 1996에 의해 검토됨). 상이한 바이러스 단백질이 각각의 이들 단계에서 역할을 한다. A형 인플루엔자 바이러스에서, 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질(Pinto 등, 1992)은 숙주 세포 투과와 바이러스 RNA의 탈피 사이의 바이러스 생활 주기의 초기 단계에서 기능하는 것으로 생각된다(Martin 및 Helenius, 1991; Helenius, 1992에 의해 검토됨; Sugrue 등, 1990). 일단 비리온이 엔도시토시스를 거치면, 호모테트라머 나선 다발인, 비리온-결합된 M2 이온 채널은 양성자가 엔도 솜으로부터 비리온 내부로 흘러가도록 허용하여 산-불안정성 M1 단백질 - 리보핵단백질 복합체(RNP) 상호작용을 파괴함으로써, 세포질로의 RNP 방출을 촉진하는 것으로 믿어진다(Helenius, 1992에 의해 검토됨). 또한, HAs가 세포 내에서 절단되는 일부 인플루엔자 균주 중에서(예를 들어, A/가금 페스트/로스탁/34), M2 이온 채널은 트랜스-골지 네트웍의 pH를 상승시켜, 이 구획에서 낮은 pH 조건으로 인한 HA에서의 형태 변화를 방지하는 것으로 생각된다(Hay 등, 1985; Ohuchi 등, 1994; Takeuchi 및 Lamb, 1994).
M2 단백질이 이온 채널 활성을 갖는다는 증거는 제노푸스 래비스(Xenopus laevis)의 난모세포에서 이 단백질을 발현시키고 막 전류를 측정함으로써 얻어졌다(Pinto 등, 1992; Wang 등, 1993; Holsinger 등, 1994). M2 단백질 막횡단(TM) 영역의 특이적인 변화가 채널의 역학과 이온 선택성을 변화시켜, M2 TM 영역이 이온 채널의 공극을 구성한다는 강력한 증거를 제공하였다(Holsinger 등, 1994). 사실 상, M2 TM 영역 자체가 이온 채널로서 기능할 수 있다(Duff 및 Ashley, 1992). M2 이온 채널 활성을 차단하는, 아만타딘 하이드로클로라이드(Hay 등, 1993)가 바이러스 복제를 저해하므로, M2 단백질 이온 채널 활성은 인플루엔자 바이러스의 생활 주기에서 필수적인 것으로 생각된다(Kato 및 Eggers, 1969; Skehel 등, 1978).
오르쏘믹소비리대(Orthomyxoviridae) 훼밀리의 구성원인, B형 인플루엔자 바이러스의 게놈은 11개의 단백질을 코딩하는 8개의 (-)-쇄 RNA 분절로 구성되어 있다. 이들 중, 9개는 A형 인플루엔자 바이러스에서도 발견된다: 3개의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 서브유닛(PB1, PB2 및 PA), 헤마글루티닌(HA), 핵단백질(NP), 뉴라 미니다제(NA), 매트릭스 단백질(M1), 및 2개의 비구조 단백질(NS1 및 NS2). 두 단백질, NB와 BM2는 B형 인플루엔자 바이러스에 독특하다. BM2가 분절 7에 의해 코딩되는 반면, NB는 NA를 코딩하기도 하는 RNA 분절 6에 의해 코딩된다.
B형 인플루엔자 바이러스의 NB 단백질은 바이러스-감염된 세포의 표면 상에서 풍부하게 발현되는, Ⅲ형의 내재성(integral) 막 단백질이고(Betakova 등, 1996; Shaw 등, 1983; Shaw 등, 1984), 비리온으로 도입된다(Betakova 등, 1996; Brassard 등, 1996). 이 작은 단백질(100개 아미노산)은 18-잔기 N-말단 엑토도메인, 22-잔기 막횡단 영역 및 60-잔기 세포질 테일을 갖는다(Betakova 등, 1996: Williams 등, 1986). 막 전류를 측정한 이전 연구로부터, 또한 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질과의 유사성에 의해(Fisher 등, 2000; Fisher 등, 2001; Sunstrom 등, 1996), NB는 이온 채널 단백질로서 기능하는 것으로 생각되었다. 그러나, 지질 이중층 시스템에 기초한 NB 단백질의 전기생리적 측정은 중단하기 어렵다. 즉, 세포에서 이온 채널 활성을 결여하는 것으로 믿어지는, 소수성 영역을 함유하는 단백질과 펩티드가 지질 이중층에서 채널 기록을 생성할 수 있다(Lear 등, 1988; Tosteson 등, 1988; Tosteson 등, 1989). 더욱이, Fischer 등(2001), 및 Sunstrom 등(1996)의 연구에서, 아만타딘이, 이 약물이 B형 인플루엔자 바이러스 복제를 저해하지 못함에도 불구하고, NB 단백질에 의한 채널 활성의 상실을 입증하는데 사용되었다. 따라서, 입수가능한 증거가 NB 단백질이 이온 채널 활성을 갖는다는 개념에 이의를 제기한다.
바이러스 감염에 대한 면역성은 감염된 세포의 표면이나 비리온 상에 존재하 는 항원에 대한 면역 반응의 발생에 의존한다. 표면 바이러스 항원이 알려져 있으면, 성공적인 백신이 생산될 수 있다. 표면 상에 존재하는 몇몇 항원이 있을 수 있을지라도, 그들 중 일부만이 중화 면역성을 생성한다. 백신을 제조하는 한 방법은 바이러스를 "약독화"하는 것이다. 이것은 보통 감염성 바이러스를 외래 숙주로 계대시키고 수퍼 병원성 균주를 동정함으로써 행해진다. 정상적으로, 외래 숙주에서의 이들 수퍼 병원성 균주는 원래 숙주 세포에서는 덜 병원성이고, 그러므로 그들은 체액성 IgG 및 국소적 IgA의 형태로 우수한 면역 반응을 생성하므로 우수한 백신 후보이다.
일반적으로, 인플루엔자 백신은 고 역가로 자랄 수 있는 생, 약독화 바이러스나 사멸 바이러스로부터 제조되어 왔다. 생 바이러스 백신은 면역 체계의 모든 기를 활성화하고 보호 항원 각각에 대한 면역 반응을 자극하여, 불활성화 백신의 제조 동안 발생할 수 있는 보호 항원의 선별적 파괴에 있어서의 어려움을 미연에 방지한다. 또한, 생 바이러스 백신에 의해 생성된 면역성은 일반적으로 불활성화 백신에 의해 유도되는 것 보다 더 지속적이고, 더 효과적이며, 더 교차-반응성이다. 추가로, 생 바이러스 백신은 불활성화 바이러스 백신 보다 제조하는데 비용이 덜 든다. 그러나, 약독화 바이러스에서의 돌연변이가 자주 불명확하고 그들 돌연변이가 바이러스 항원 유전자에 있는 것으로 보인다.
따라서, 요구되는 것은 백신용 재조합 약독화 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 정해진 돌연변이(들)를 갖는 약독화 바이러스의 제조방법이다.
발명의 요약
본 발명은 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하지 않는, 돌연변이 막 단백질 유전자, 예를 들어, 돌연변이 Ⅲ형 내재성 막 단백질 유전자와 같은 돌연변이 내재성 막 단백질 유전자를 포함하는 단리 및/또는 정제된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 막 단백질 유전자를 결여하는 단리 및/또는 정제된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 재조합 인플루엔자 바이러스에서 내재성 막 단백질과 같은 기능적 막 단백질의 결여는 시험관 내에서는 복제하지만 생체 내에서는 약독화되는 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 일 태양에서, 재조합 바이러스는, 유전자가 세포에서 전사되고/거나 번역될 때, 기능적 막 단백질이나 그의 기능적 부분을 생성시키지 않는, 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 적어도 하나의 돌연변이가 단백질의 막횡단 영역에 상응하는 부위에 있지 않는, 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 막 단백질 유전자에 대해 적어도 두 개의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 막 단백질 유전자는, 세포에서 전사되고/거나 번역될 때, C-말단에 있는 야생형 서열의 부재, 즉, 말단절단된 막 단백질의 결과, 기능적 유전자 산물을 생성하지 않고/거나, 감소된, 예를 들어, 약 50%, 10%, 1% 미만 또는 검출불가능한 수준의 야생형 막 단백질을 생성하고/거나, 약 50% 미만, 바람직하게는 약 10% 미만, 보다 바람직하게는 약 1% 미만의 상응하는 야생형(기능적) 막 단백질 활성을 갖는 돌연변이 막 단백질을 생성한다. 본 발명의 일 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 상응하는 야생형 막 단백질 에 대해 적어도 하나의 아미노산 치환을 코딩한다. 일 태양에서, 치환(들)은 개시자 메티오닌의 약 1 내지 50 잔기 또는 그 내부에, 또는 그 사이에 있는 어느 정수, 예를 들어, 1 내지 20 또는 그 내부 또는 1 내지 3 잔기 또는 그 내부에 있다. 바람직한 일 태양에서, 적어도 하나의 치환이 개시자 메티오닌에 있다. 다른 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 개시제 코돈의 약 1 내지 50 코돈 또는 그 내부, 또는 그 사이의 어느 정수, 예를 들어, 1 내지 20 코돈 또는 그 내부에 하나 이상의 중지 코돈을 갖는다. 또 다른 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 결실을 포함한다. 일 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 유전자의 코딩 부위에서 제1 코돈의 약 150개 뉴클레오티드 또는 그 내부, 예를 들어, 1, 2, 3, 150개 이하 뉴클레오티드 또는 그 내부, 또는 그 사이에 있는 어느 정수에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 결실을 포함한다. 일 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 삽입을 포함한다. 일 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 유전자의 코딩 부위에서 제1 코돈의 약 150개 뉴클레오티드 또는 그 내부, 예를 들어, 1, 2, 3, 150개 이하 뉴클레오티드 또는 그 내부, 또는 그 사이에 있는 어느 정수에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 하나 이상의 삽입을 포함한다. 그러한 삽입(들) 및/또는 결실(들)은 바람직하게는 막 단백질 유전자의 리딩 프레임을 변화시킨다. 또 다른 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 두 개 이상의 돌연변이, 예를 들어, 메티오닌 이외의 아미노산의 코돈을 초래하는 개시 코돈에서의 뉴클레오티드 치환, 개시 코돈에서 중지 코돈을 초래하는 뉴클레오티드 치환, 코딩 서열에서 중지 코돈 을 초래하는 뉴클레오티드 치환, 코딩 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 결실, 코딩 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드 삽입, 또는 그들의 어느 조합을 포함하는 두 개 이상의 돌연변이를 포함한다. 일 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 벡터 내에 있고 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 예를 들어, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅲ 프로모터, T7 프로모터 및 T3 프로모터를 포함하지만, 그로 제한되지 않는, 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 태양에서, 돌연변이 막 단백질 유전자는 벡터 내에 있고 RNA 폴리머라제 Ⅰ 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 Ⅱ 전사 종결 서열 또는 RNA 폴리머라제 Ⅲ 전사 종결 서열을 포함하지만, 그로 제한되지 않는, 전사 종결 서열, 또는 리보자임에 연결된다.
여기에 설명된 바와 같이, B형 인플루엔자 녹아웃 바이러스가 역 유전학에 의해 생성되고 그들의 성장 특성 및 기타 성질이 시험관 내 및 생체 내에서 시험되었다. NB를 발현하지 않는 돌연변이는, 마우스에서는 그들이 야생형 바이러스에 대한 발견과 비교하여 제한된 성장을 나타낸 반면, 세포 배양에서는 야생형 바이러스 만큼 효율적으로 복제하였다. 따라서, NB 단백질은 세포 배양에서는 B형 인플루엔자 바이러스 복제에 필수적이지 않지만, 마우스에서는 효율적인 성장을 촉진한다. 생체 내에서 NB 녹아웃 바이러스가 약화된 성장을 하지만, 시험관 내에서는 그렇지 않다면, 이들 돌연변이 바이러스는 생 인플루엔자 백신의 개발에 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 바이러스를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물, 및 각각 척추동물을 면역화하거나 척추 동물에서 면역 반응을 유도하는 백신 또는 면역원성 조성물의 사용방법을 제공한다. 일 태양에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자를 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 B형 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자를 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 C형 인플루엔자 바이러스로부터의 유전자를 포함한다. 추가 태양에서, 본 발명의 재조합 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스, C형 인플루엔자 바이러스, 또는 그들의 어느 조합으로부터의 하나 이상의 유전자를 포함한다. 예를 들어, 재조합 바이러스는 B/Lee/40, B/Shiga/T30/98, B/Mie/1/93, B/Chiba/447/98, B/Victoria/2/87, B/Yamanashi/166/98, B/Nagoya/20/99, B/Kouchi/193/99, B/Saga/S172/99, B/Kanagawa, B/Lusaka/432/99, B/Lusaka/270/99, B/Quebec/74204/99, B/Quebec/453/98, B/Quebec/51/98, B/Quebec/465/98 및 B/Quebec/511/98(개시내용이 여기에 참조에 의해 구체적으로 도입되는, 기탁번호 AB036873, AB03672, AB036871, AB036870, AB036869, AB036868, AB036867, AB036866, D14855, D14543, D14542, AB059251, AB059243, NC 002209, AJ419127, AJ419126, AJ419125, AJ419124 및 AJ419123)의 NB 유전자로부터 유래된 돌연변이 NB 유전자를 포함할 수 있다. 일 태양에서, NB 유전자의 돌연변이(들)는 NA 유전자의 서열을 변화시키지 않는다. 다른 태양에서, NB 유전자의 돌연변이(들)는 또한 NA 유전자의 서열을 변화시키지만 상응하는 비-돌연변이된 NA 유전자에 의해 코딩되는 NA와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 NA를 생성시킨다. 여기에 사용된 바, "실질적으로 동일한 활성"은 상응하는 전장 폴리펩티드의 활성의, 약 0.1%, 1%, 10%, 30%, 50%, 예를 들어 100% 이하 또는 이상인 활성을 포함한다.
상응하는 야생형 막 단백질 유전자에 대하여 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하지 않는 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스의 제조방법이 또한 제공된다. 방법은 숙주세포를, 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는, 복수의 인플루엔자 벡터를 포함하는 조성물과 접촉시켜, 재조합 바이러스를 생성시키는 것을 포함한다. 예를 들어, B형 인플루엔자에 대해, 조성물은 a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 cDNA NA 및 NB에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터 (NB의 상기 cDNA 서열이 기능적 NB 막 단백질을 코딩하는 상응하는 NB 유전자에 대해 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 돌연변이 중 하나가 막횡단 영역에 있지 않고, 돌연변이 유전자에서 그의 존재가, 돌연변이 유전자가 숙주세포에서 전사되고 번역될 때, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 생성하지 않고, 임의로 기능적 NA 단백질을 생성시킴); 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 BM2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 NS를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터를 포함한다.
본 발명은 추가로 상기한 것들과 같은 복수의 벡터를 포함하는 조성물, 및 그러한 조성물 또는 본 발명의 단리된 재조합 바이러스와 접촉되어, 예를 들어, 감염성 바이러스를 생성시키는 숙주세포를 제공한다. 다르게는, 숙주세포는 각각의 벡터, 또는 벡터의 서브셋과 순차적으로 접촉될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 B/Lee/40의 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 단리 및 /또는 정제된 핵산 분자(폴리뉴클레오티드), 또는 그의 일부, 또는 핵산 분자의 상보물이 추가로 제공된다. 일 태양에서, 단리 및/또는 정제된 핵산 분자는 서열 1-8 중 하나의 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M 또는 NS, 또는 그의 일부를 코딩한다. 여기에 사용된 바, "실질적으로 동일한 활성"은 상응하는 전장 폴리펩티드의 활성의, 약 0.1%, 1%, 10%, 30%, 50%, 예를 들어 100% 이하 또는 이상인 활성을 포함한다. 일 태양에서, 단리 및/또는 정제된 핵산 분자는 서열 1-8 중 하나에 적어도 80%, 예를 들어, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 99%의, 연속적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일 태양에서, 단리 및/또는 정제된 핵산 분자는 서열 1-8 중 하나 또는 그 상보체에 적어도 50%, 예를 들어, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상의, 연속적인 핵산 서열 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열 1-8 중 하나의 코딩 서열에 상동적이면, 서열 1-8 중 하나에 적어도 80%, 예를 들어, 90%, 92%, 95%, 97% 또는 99%의, 연속적인 아미노산 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 태양에서, 인플루엔자 바이러스 B/Lee/40의 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 단리 및/또는 정제된 핵산 분자 또는 그의 일부, 또는 핵산 분자의 상보물은 낮은 엄격도, 중간 엄격도 또는 엄격한 조건 하에서, 서열 1-8 중 하나, 또는 그의 상보물에 혼성화한다. 예를 들어, 아래 조건이 사용될 수 있다: 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 2×SSC, 0.1% SDS에서 세척, 보다 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 50 ℃ 에서 1×SSC, 0.1% SDS에서 세척, 보다 바람직하게는 여전히 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 0.5×SSC, 0.1% SDS에서 세척, 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 50 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척, 보다 바람직하게는 50 ℃에서 7% 도데실황산나트륨(SDS), 0.5 M NaP04, 1 mM EDTA, 65 ℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS에서 세척.
본 발명의 핵산 분자는 인플루엔자 단백질을 발현하기 위하여, 예를 들어, 다른 인플루엔자 바이러스 유전자를 포함하는 다른 바이러스 유전자와의 키메라 유전자를 제조하기 위하여 및/또는 재조합 바이러스를 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 인플루엔자 바이러스 B/Lee/40 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드, 재조합 바이러스 및 핵산 분자 또는 재조합 바이러스와 접촉된 숙주세포를 제공한다. 그러한 폴리펩티드, 재조합 바이러스 및 숙주세포는 예를 들어, 유전자 요법에서 보호성 면역 반응을 유도하는, 의학적 요법에 사용될 수 있다.
도 1. 확립된 역 유전학 시스템의 개략도. RNP 형질감염 방법(A)에서, 정제된 NP와 폴리머라제 단백질은 시험관 내 합성된 vRNA를 사용하여 RNPs로 조립된다. 세포는 RNPs로 형질감염된 후, 헬퍼 바이러스 감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ 방법(B)에서, RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 구제(rescue)되는 vRNA를 코딩하는 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드가 세포로 형질감염된다. RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의한 세포 내 전사는 합성 vRNA를 생성시키고, 헬퍼 바이러스로의 감염 시 자손 바이러스 입자로 팩키지된다. 양 방법으로, 형질감염체 바이러스(즉, 클로닝된 cDNA로부터 유래된 RNA를 함유하는 것들)는 헬퍼 바이러스 집단으로부터 선별된다.
도 2. RNA 폴리머라제 Ⅰ 제작물 생성의 개략도. 인플루엔자 바이러스로부터 유래된 cDNAs는 PCR에 의해 증폭되고, BsmBⅠ으로 분해되고, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터(P) 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터(T)를 포함하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 위치로 클로닝되었다(E. Hoffmann, Ph. D. thesis, Justus, Liebig-University, Giessen, Germany). 터미네이터 서열 상류 티미딘 뉴클레오티드(*T)는 인플루엔자 바이러스 RNA의 3' 말단을 나타낸다. A형 인플루엔자 바이러스 서열이 굵은 글자로 나타내어져 있다(서열 10-19 및 28-29).
도 3. 분절된 (-)-센스 RNA 바이러스를 생성시키는 제안된 역 유전학적 방법. RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터, 각각의 8개의 바이러스 RNA 분절에 대한 cDNA, 및 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드가 세포로 단백질 발현 플라스미드와 함께 형질감염된다. 비록 감염성 바이러스가 PA, PB1, PB2 및 NP를 발현하는 플라스미드로 생성될 수 있을지라도, 모든 나머지 구조 단백질([]에 나타냄)의 발현은 생성되는 바이러스에 따라 바이러스 생산의 효율을 증가시킨다.
도 4. NA 분절로 도입된 돌연변이의 개략도. 돌연변이는 굵게 나타내어져 있다(-, 결실; *, 삽입). 나타낸 수는 뉴클레오티드 위치이다(서열 20-27).
도 5. NB 단백질의 발현 분석. (A) 면역형광 어세이에 의한 감염된 MDCK 세포에서 NB 단백질의 검출. 각각, B/LeeRG, B/LeeRG-감염; WSN, A/WSN/33-감염; 대조군, 무감염; #1, #2 및 #3, BLeeNBstop#1, BLeeNBstop#2 및 BLeeNBstop#3-감염 세포. (B) 면역침전 어세이에 의한 바이러스-감염 MDCK 세포에서 NB 단백질의 검출. 방사성표지된 NB 단백질은 토끼 항-NB 펩티드 혈청으로 면역침전되고 4-20% 구배 폴리아크릴아미드 젤에서 분석되었다. #1, BLeeNBstop#1-감염: #2, BLeeNBstop#2-감염; #3, BLeeNBstop#3-감염: C, 무감염 세포 용해물. 분자량 마커(kDa)가 표시되어 있다.
도 6. B/LeeRG 및 돌연변이 바이러스의 성장 곡선. MDCK 세포를 바이러스 (0.001 PFU)로 감염시키고 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 감염 후 표시된 시간에, 바이러스 역가를 상등액에서 결정하였다. 값은 세 결정의 평균(±SD)이다.
도 7. 인플루엔자 바이러스 B/Lee/40의 서열(서열 1-8).
정의
여기에 사용된 바, 용어 "단리 및/또는 정제된"은 생체 내 물질과 결합되지 않거나, 시험관 내 물질로부터 실질적으로 정제되도록 하는, 본 발명의 벡터, 플라스미드 또는 바이러스의 시험관 내 제조, 단리 및/또는 정제를 말한다. 본 발명의 단리된 바이러스 제제는 일반적으로 시험관 내 배양과 증식에 의해 얻어지고 실질적으로 다른 감염성 물질이 결여되어 있다. 여기에 사용된 바, "실질적으로 결여된"은 특정 감염성 물질에 대한 그 물질에 대한 표준 검출 방법을 이용한 검출 수준 미만을 의미한다. "재조합" 바이러스는 예를 들어 바이러스 게놈에 변화를 도입하는 재조합 DNA 기술을 이용하여, 시험관 내에서 조작된 것이다.
여기에 사용된 바, 용어 "재조합 핵산" 또는 "재조합 DNA 서열 또는 분절"은 그 서열이 자연 발생적인 것이 아니거나, 그들이 원래 게놈에 위치된 바와 같이 위치하지 않는 자연 발생 서열에 상응하도록, 추후에 시험관 내에서 화학적으로 변형될 수 있는, 출처로부터 유래되거나 단리된 핵산, 예를 들어, DNA를 말한다.
출처로부터 "유래된" DNA의 예는 유용한 단편으로 동정되고, 그 다음에 필수적으로 순수한 형태로 화학 합성되는 DNA 서열이다. 출처로부터 "단리된" 그러한 DNA의 예는 그것이 유전공학의 방법론에 의해, 본 발명에서 사용하기 위하여, 추가로 조작, 예를 들어, 증폭될 수 있도록, 화학적 수단, 예를 들어, 제한 엔도뉴클라제의 사용에 의해 상기 출처로부터 절제 또는 제거되는 유용한 DNA 서열일 것이다.
"낮은" 엄격도 조건은 37 ℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS(도데실황산나트륨)의 완충용액으로의 혼성화와, 50 내지 55 ℃에서 1× 내지 2×SSC(20×SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산 삼나트륨)에서의 세척을 포함한다.
"중간" 엄격도 조건은 37 ℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 1% SDS(도데실황산나트륨)에서의 혼성화와, 55 내지 60 ℃에서 0.5× 내지 1×SSC에서의 세척을 포함한다.
서던 또는 노던 블럿의 필터 상에서 100 초과의 상보적 잔기를 갖는 상보적 핵산의 혼성화를 위한 "엄격한" 조건은 50% 포름아미드, 예를 들어, 37 ℃에서 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 1% SDS에서의 혼성화와, 60 내지 65 ℃에서의 0.1×SSC에서의 세척을 포함한다.
비교를 위한 서열의 정렬방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 어느 두 서열 간의 백분율 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 그러한 수학적 알고리즘의 바람직한, 비제한적 예는 Myers 및 Miller, 1988의 알고리즘; Smith 등, 1981의 국소 상동성 알고리즘; Needleman 및 Wunsch, 1970의 상동성 정렬 알고리즘: Pearson 및 Lipman, 1988의 유사성-검색 방법: Karlin 및 Altschul, 1993에서와 같이 변형된, Karlin 및 Altschul, 1990의 알고리즘이다.
이들 수학적 알고리즘의 컴퓨터 실행은 서열 동일성을 결정하기 위한 서열 비교에 사용될 수 있다. 그러한 실행은 PC/Gene 프로그램의 CLUSTAL(캘리포니아, 마운틴 뷰, 인텔리제네틱스로부터 입수가능); 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지, 버전 8의 ALIGN 프로그램(버전 2.0) 및 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(USA, 위스콘신, 매디슨, 사이언스 드라이브 575, 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG)으로부터 입수가능)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이들 프로그램을 이용한 정렬은 디폴트 지수를 이용하여 수행될 수 있다. CLUSTAL 프로그램은 Higgins 등, 1988: Higgins 등, 1989; Corpet 등, 1988; Huang 등, 1992; 및 Pearson 등, 1994에 의해 잘 설명되어 있다. ALIGN 프로그램은 상기 Myers 및 Miller의 알고리즘에 기초한 것이다. Altschul 등, 1990의 BLAST 프로그램은 상기 Karlin 및 Altschul의 알고리즘에 기초한 것이다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션을 통해 공개적으로 입수가능하다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열의 동일한 길이의 단어와 정렬될 때 어느 양의 값인 경계값 점수 T에 일치하거나 만족시키는, 질문 서열의 길이 W의 짧은 단어를 동정함으로써 높은 점수의 서열 쌍(HSPs)을 확인하는 것을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 경계치(neighborhood word score threshold)로 언급된다(Altschul 등, 1990). 이들 최초의 이웃 단어 히트는 그들을 함유하는 더 긴 HSPs를 발견하는 검색을 시작하기 위한 종자로서 작용한다. 그런 다음 단어 히트는 누적된 정렬 점수가 증가될 수 있는 한 각 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 점수는 뉴클레오티드 서열에 대해, 지수 M(일치하는 잔기 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0) 및 N(불일치하는 잔기에 대한 벌점; 항상 <0)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열에 대해, 채점 매트릭스가 누적 점수를 계산하기 위해 사용된다. 각 방향에서 단어 히트의 연장은 누적 정렬 점수가 그의 최대 달성 값으로부터 양 X 만큼 떨어지거나, 누적 점수가 하나 이상의 음-채점 잔기 정렬의 누적으로 인해 0 이하로 되거나, 어느 한 서열의 말단에 도달될 때 중단된다.
백분율 서열 동일성을 계산하는 것에 더하여, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 간의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다(예를 들어, Karlin & Altschul(1993)을 참조하라). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 일어나는 확률의 지표를 제공하는, 최소 합계 확률(smallest sum probability(P(N)))이다. 예를 들어, 시험 핵산 서열은 참조 핵산 서열과 시험 핵산 서열의 비교에서 최소 합계 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면 참조 서열과 유사한 것으로 간주된다.
비교 목적을 위해 갭을 갖는 정렬을 얻기 위하여, 갭트 BLAST(BLAST 2.0 중)를 Altschul 등, 1997에 기재되어 있는 바와 같이 이용할 수 있다. 다르게는, PSI-BLAST(BLAST 2.0 중)를 분자 사이에 먼 관계를 검출하는 반복된 검색을 수행하는데 사용할 수 있다. 상기 Altschul 등을 참조하라. BLAST, 갭트 BLAST, PSI-BLAST를 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 지수(예를 들어, 뉴클레오티드 서열에 대한 BLASTN, 단백질에 대한 BLASTX)를 사용할 수 있다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 단어길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=-4, 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 단어길이(W) 3, 기대값(E) 10, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스(Henikoff & Henikoff, 1989를 참조하라)를 사용한다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조하라. 정렬은 또한 조사에 의해 수동으로 수행될 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터로 입력되고, 서브서열 좌표가 필요한 경우 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 지수가 지정된다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 지수에 기초하여, 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 백분율 서열 동일성을 계산한다.
오르쏘믹소바이러스
인플루엔자 바이러스
A형 인플루엔자 바이러스는 총 10개의 단백질을 코딩하는 8개의 단일 가닥 (-)-센스 바이러스 RNAs(vRNAs)의 게놈을 갖는다. 인플루엔자 바이러스 생활주기는 숙주 세포의 표면 상의 시알산-함유 수용체에 대한 HA의 결합으로 시작하고, 수용체-매개된 엔토시토시스가 뒤따른다. 후기 엔도솜의 낮은 pH는 HA의 형태적 전이를 촉발함으로써, HA2 서브유닛의 N-말단(소위 융합 펩티드)을 노출시킨다. 융합 펩티드는 바이러스와 엔도솜 막의 융합을 개시시키고, 매트릭스 단백질(M1)과 RNP 복합체가 세포질로 방출된다. RNPs는 vRNA를 캡시드화하는 핵단백질(NP)과, PA, PB1 및 PB2 단백질에 의해 형성되는 바이러스 폴리머라제 복합체로 이루어진다. RNPs는 전사와 복제가 일어나는 핵으로 수송된다. RNA 폴리머라제 복합체는 세 상이한 반응을 촉매한다: 5' 캡 및 3' 폴리A 구조를 갖는 mRNA, 전장 상보적 RNA(cRNA) 및 주형으로서 cDNA를 이용하는 게놈 vRNA의 합성. 새로이 합성된 vRNAs, NP 및 폴리머라제 단백질은 그런 다음 RNPs로 조립되고, 핵으로부터 수출(export)되고, 자손 바이러스 입자의 출아가 일어나는 원형질막으로 수송된다. 뉴라미니다제(NA) 단백질은 감염 후기에 시알릴로올리고당으로부터 시알산을 제거함으로써 결정적인 역할을 하여, 새로 조립된 비리온을 세포 표면으로부터 방출하고 바이러스 입자의 자가 응집을 방지한다. 비록 바이러스 조립은 단백질-단백질 및 단백질-vRNA 상호작용을 포함하지만, 이들 상호작용의 성질은 대개 알려져 있지 않다.
비록 B형 및 C형 인플루엔자 바이러스가 A형 인플루엔자 바이러스와 구조적으로나 기능적으로 유사할지라도, 몇몇 차이가 있다. 예를 들어, B형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 유사하게, C형 인플루엔자 바이러스는 이온 채널 활성을 갖는 M2 단백질을 갖지 않는다. 그러나, CM1 단백질이 이 활성을 가질 것이다. 이온 채널 단백질의 활성은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, Holsinger 등(1994) 및 WO 01/79273을 참조하라.
본 발명에서 사용될 수 있는 세포주 및 인플루엔자 바이러스
본 발명에 따르면, 감소 또는 저하된 수준의 인플루엔자 바이러스의 수용체인 하나 이상의 시알산을 발현하는 돌연변이 세포를 포함하는, 인플루엔자 바이러스의 효율적인 복제를 지지하는 어떠한 세포도 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 방법에 의해 수득되는 바이러스는 재조합체(reassortant) 바이러스로 제조될 수 있다.
바람직하게는, 세포는 WHO 인증된, 또는 인증가능한, 연속 세포주이다. 그러한 세포주를 인증하기 위한 요건은 가계, 성장 특성, 면역학적 마커, 바이러스 감수성, 발암성 및 저장 조건 중 적어도 하나에 관하여, 또한 동물, 알 및 세포 배양에서의 시험에 의한 특성분석을 포함한다. 그러한 특성분석은 세포가 검출가능한 외래 물질이 결여된 것을 확인하는데 사용된다. 일부 국가에서, 핵학이 또한 요구될 수 있다. 또한, 발암성은 바람직하게는 백신 생산을 위해 사용되는 것들과 동일한 계대 수준에 있는 세포에서 시험된다. 바이러스는 바람직하게는 백신 생산을 위해 불활성화되거나 약독화되기 전에, 일관된 결과를 제공하는 것으로 나타난 방법에 의해 정제된다(예를 들어, World Health Organization, 1982를 참조하라).
최종 산물의 순도에 대한 적절한 시험이 포함될 수 있도록, 사용되는 세포주의 완전한 특성분석을 확립하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용되는 세포의 특성분석을 위해 사용될 수 있는 데이터는 (a) 그의 기원, 유래 및 계대 내력에 관한 정보; (b) 그의 성장 및 형태학적 특성에 관한 정보; (c) 외래 물질의 시험 결과; (d) 세포가 다른 세포주 중에서 명확하게 인식되도록 하는 생화학적, 면역학적 및 세포유전학적 양상과 같은, 구별되는 특징; 및 (e) 발암성에 대한 시험결과를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 숙주세포의 계대 수준, 또는 집단 이배체화는 가능한 한 낮다.
세포에서 생산되는 바이러스는 백신이나 유전자 요법 제제 이전에 고도로 정제되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 정제 과정은 세포 DNA, 기타 세포 성분 및 외래 물질의 광범위한 제거를 일으킬 것이다. DNA를 광범위하게 분해하거나 변성시키는 과정도 사용될 수 있다. 예를 들어, Mizrahi, 1990을 참조하라.
백신
본 발명의 백신은 어느 병원체의 당단백질을 포함하는 면역원성 단백질, 예를 들어, 하나 이상의 세균, 바이러스, 효모 또는 진균으로부터의 면역원성 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 일 태양에서, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 또는 HIV와 같은 렌티바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, CMV 또는 HSV와 같은 허피스 바이러스 또는 족구 질환 바이러스를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 기타 바이러스 병원체의 백신 벡터일 수 있다.
완전한 비리온 백신은 한외여과에 의해 농축된 후 구역 원심분리나 크로마토그래피에 의해 정제된다. 그것은 정제 전이나 후에 예를 들어, 포르말린이나 베타-프로피오락톤을 이용하여 불활성화된다.
서브유닛 백신은 정제된 당단백질을 포함한다. 그러한 백신은 아래와 같이 제조될 수 있다: 계면활성제로의 처리에 의해 단편화된 바이러스 현탁액을 이용하여, 표면 항원은 예를 들어 초원심분리에 의해 정제된다. 따라서 서브유닛 백신은 주로 HA 단백질과, NA도 포함한다. 사용되는 계면활성제는 예를 들어, 헥사데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(Bachmeyer, 1975)와 같은 양이온성 계면활성제, 암모늄 데옥시콜레이트(Laver & Webster, 1976; Webster 등, 1977)와 같은 음이온성 계면활성제; 또는 명칭 TRITON X100 하에 시판되고 있는 것과 같은 비온성 계면활성제일 수 있다. 헤마글루티닌은 또한 브로멜린과 같은 프로테아제로 비리온을 처리한 후 단리된 다음, Grand 및 Skehel(1972)에 의해 기재된 것과 같은 방법에 의해 정제될 수 있다.
스플릿(split) 백신은 지질을 용해시키는 물질로의 처리에 가해진 비리온을 포함한다. 스플릿 백신은 아래와 같이 제조될 수 있다: 불활성화되거나 되지 않은, 위와 같이 수득된 정제 바이러스의 수성 현탁액을 교반 하에 계면활성제와 결합된, 에틸에테르나 클로로포름과 같은 지질 용매에 의해 처리한다. 바이러스 외피 지질의 용출은 바이러스 입자의 단편화를 일으킨다. 그들의 원래 지질 환경이 제거된 주로 헤마글루티닌과 뉴라미니다제, 및 코어 또는 그 분해 산물로 구성된, 스플릿 백신을 함유하는 수상이 회수된다. 그런 다음 이것이 이미 행해지지 않은 경우 잔여 감염성 입자가 불활성화된다.
불활성화 백신. 본 발명의 불활성화 인플루엔자 바이러스 백신은 포르말린 또는 β-프로피오락톤 처리와 같은, 그러나 그로 제한되지 않는, 공지의 방법을 이용하여 본 발명의 복제된 바이러스를 불활성화함으로써 제공된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 불활성화 백신 타입은 전체-바이러스(WV) 백신 또는 서브비리온(SV)(스필릿) 백신을 포함할 수 있다. SV 백신이 지질-함유 바이러스 외피를 가용화하는 계면활성제로 파쇄된 후, 잔여 바이러스가 화학적 불활성화된 정제된 바이러스를 함유하는 반면, WV 백신은 손상되지 않은, 불활성화 바이러스를 함유한다.
또한, 사용될 수 있는 백신은 표면 항원 또는 서브유닛 백신으로 언급되는, 단리된 HA 및 NA 표면 단백질을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, SV 및 표면 항원(즉, 정제된 HA 또는 NA) 백신에 대한 반응은 유사하다. 유행성 바이러스와 면역학적으로 관련된 NA 항원과 관련되지 않은 HA를 함유하는 실험적 불활성화 WV 백신은 통상적인 백신(Orga 등, 1977) 보다 덜 효과적인 것 같다. 두 관련 표면 항원을 함유하는 불활성화 백신이 바람직하다.
생 약독화 바이러스 백신. 생 약독화 인플루엔자 바이러스 백신 또한 공지의 방법 단계에 따라 인플루엔자 바이러스 감염을 예방하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 약독화는 바람직하게는 공지의 방법에 따른 약독화된 공여자 바이러스로부터 복제된 단리물 또는 재조합체 바이러스로의 약독화된 유전자의 전달에 의해 단일 단계로 달성된다(예를 들어, Murphy, 1993을 참조하라). A형 인플루엔자 바이러스에 대한 내성은 HA 및 NA 당단백질에 대한 면역반응의 발생에 의해 매개되므로, 이들 표면 항원을 코딩하는 유전자는 재조합체 바이러스 또는 고 성장 임상적 단리물로부터 나와야 한다. 약독화된 유전자는 약독화된 부모로부터 유래된다. 이 접근법에서, 약독화를 부여하는 유전자는 바람직하게는 HA 및 NA 당단백질을 코딩하지 않는다. 아니면, 이들 유전자는 임상적 바이러스 단리물의 표면 항원을 갖는 재조합체로 전달될 수 없다.
많은 공여자 바이러스가 인플루엔자 바이러스를 재현가능하게 약독화하는 그들의 능력에 대해 평가되어 왔다. 비제한적 예로서, A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2) 저온 적응(ca) 공여자 바이러스가 약독화된 백신 생산을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, Edwards, 1994; Murphy, 1993을 참조하라). 부가하여, 생 약독화된 재조합체 바이러스 백신은 ca 공여자 바이러스를 본 발명의 병원성의 복제된 바이러스와 교배함으로써 생성될 수 있다. 재조합체 자손은 그런 다음 약독화된 A/AA/6/60(H2N2) ca 공여자 바이러스의 표면 항원을 갖는 바이러스의 복제를 저해하는 H2N2 항혈청 존재 하에, 25 ℃(병원성 바이러스의 복제를 위해 제한적인)에서 선별된다.
큰 시리즈의 H1N1 및 H3N2 재조합체가 인간에서 평가되었고 만족스럽게 (a) 감염성, (b) 혈청음성 소아와 면역학적으로 준비된 성인을 위해 약독화, (c) 면역원적 및 (d) 유전적으로 안정한 것으로 확인되었다. ca 재조합체의 면역원성은 그들의 복제 수준과 평행한다. 따라서, 새로운 야생형 바이러스에 의한 ca 공여자 바이러스의 6개의 도입가능 유전자의 획득은 감수성 성인 및 소아를 백신접종하는데 사용하기 위하여 이들 바이러스를 재현가능하게 약독화하였다.
다른 약독화 돌연변이가 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 인플루엔자 바이러스 유전자로 도입되어 이들 돌연변이 유전자를 함유하는 감염성 바이러스를 구제할 수 있다. 약독화 돌연변이는 게놈의 비-코딩 부위, 및 코딩 부위로 도입될 수 있다. 그러한 약독화 돌연변이는 또한 HA 또는 NA 이외의 유전자, 예를 들어, PB2 폴리머라제 유전자(Subbarao 등, 1993)로 도입될 수 있다. 따라서, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 도입되는 약독화 돌연변이를 갖는 새로운 공여자 바이러스도 생성될 수 있으며, 그러한 새로운 공여자 바이러스는 A/AA/6/60 ca 공여자 바이러스에 대해 상기된 것과 유사한 방식으로 생 약독화 재조합체 H1N1 및 H3N2 백신 후보의 감소에 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 공지의 적당한 약독화 공여자 균주가 본 발명의 인플루엔자 바이러스와 재조합되어 포유류의 백신접종에 사용하기 위해 적당한 약독화 백신을 얻을 수 있다(Ewami 등, 1990; Muster 등, 1991; Subbarao 등, 1993).
그러한 약독화 바이러스는 원래 임상적 단리물의 것들과 실질적으로 유사한 항원 결정기를 코딩하는 바이러스로부터의 유전자를 유지하는 것이 바람직하다. 이것은 약독화 백신의 목적이, 백신이 백신접종되는 포유류에서 심각한 병원성 이상을 유도하는 최소한의 변화를 유발하는 정도로 감염성을 결여함과 동시에, 바이러스의 원래 임상적 단리물과 실질적으로 동일한 항원성을 제공하는 것이기 때문이다.
따라서 바이러스는 동물, 예를 들어, 포유류에서 면역 반응을 유도하는 백신으로서, 공지의 방법에 따라, 약독화 또는 불활성화되고, 제제화되고 투여될 수 있다. 그러한 약독화 또는 불활성화된 백신이 임상 분리물 또는 그로부터 유래된 고 성장 균주의 것과 유사한 항원성을 유지하는지 여부를 결정하기 위한 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러한 공지의 방법은 공여자 바이러스의 항원 결정기를 발현하는 바이러스를 제거하기 위한 항혈청 또는 항체의 사용; 화학적 선별(예를 들어, 아만타딘 또는 리만티딘): HA 및 NA 활성 및 저해; 및 항원 결정기를 코딩하는 공여자 유전자(예를 들어, HA 또는 NA 유전자)가 약독화 바이러스에 존재하지 않는지를 확인하기 위한 DNA 스크리닝(프로브 혼성화 또는 PCR과 같은)을 포함한다. 예를 들어, Robertson 등, 1988; Kilbourne, 1969; Aymard-Henry 등, 1985; Robertson 등, 1992를 참조하라.
약제학적 조성물
접종이나 비경구 또는 경구 투여를 위해 적당한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약독화 또는 불활성화 인플루엔자 바이러스를 포함하고, 임의로 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀전을 추가로 포함한다. 조성물은 추가로 당업계에 알려져 있는 바와 같은 보조제나 부형제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow 등, 1987; Goodman 등, 1990; Avery's Drug Treatment, 1987; Osol, 1980; Katzung, 1992를 참조하라. 본 발명의 조성물은 일반적으로 개개 용량(단위 용량) 형태로 제공된다.
통상적인 백신은 일반적으로 그들 조성물로 들어가는 균주 각각으로부터의 헤마글루티닌 약 0.1 내지 200 ㎍, 바람직하게는 10 내지 15 ㎍을 함유한다. 본 발명의 백신 조성물의 주요 성분을 형성하는 백신은 A, B 또는 C형의 바이러스, 또는 그의 어느 조합, 예를 들어, 세 타입 중 적어도 2개, 상이한 서브타입의 적어도 2개, 동일한 타입의 적어도 2개, 동일한 서브타입의 적어도 2개, 또는 상이한 단리물(들) 또는 재조합체(들)을 포함할 수 있다. 인간 인플루엔자 바이러스 A형은 H1N1, H2N2 및 H3N2 서브타입을 포함한다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액, 및/또는 에멀전을 포함하며, 당업계에 알려진 보조제나 부형제를 함유할 수 있다. 비수성 용매의 예는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브유와 같은 식물유, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사용 유기 에스테르를 포함한다. 담체나 폐색성 드레싱이 피부 투과성을 증가시키고 항원 흡수를 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 제형은 일반적으로 액체 제형을 함유하는 리포좀 용액을 포함할 수 있다. 리포좀을 현탁하기 위해 적당한 형태는 정제수와 같은 당업계에 보편적으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 에멀전, 현탁액, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 불활성 희석제 이외에, 그러한 조성물은 또한 애주번트, 습윤제, 유화 및 현탁제, 또는 감미제, 향료, 또는 방향제를 포함할 수 있다. 예를 들어, Berkow 등, 1992; Goodman 등, 1990; Avery's, 1987: Osol, 1980: 및 Katzung, 1992를 참조하라.
본 발명의 조성물이 개체에 투여하기 위해 사용될 때, 추가로 염, 완충액, 애주번트, 또는 조성물의 효능을 향상시키기 위해 바람직한 기타 물질을 포함할 수 있다. 백신을 위해, 애주번트, 특정 면역 반응을 강화할 수 있는 물질이 사용될 수 있다. 정상적으로, 애주번트와 조성물은 면역 체계에 제공하기 전에 혼합되거나, 별도로, 그러나 면역화되는 유기체의 동일한 위치로 제공된다. 백신 조성물에서 사용하기에 적당한 재료의 예는 Osol(1980)에 제공되어 있다.
백신에서의 불균일성은 2-50개 균주나 그 안의 어느 범위나 값과 같은, 적어도 두개 인플루엔자 바이러스 균주 대신 복제된 인플루엔자 바이러스를 혼합함으로써 제공될 수 있다. 현대적 항원 조성물을 갖는 A 또는 B형 인플루엔자 바이러스 균주가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 백신은 당업계에 알려진 기술을 이용하여 인플루엔자 바이러스의 단일 균주에서 변이를 위해 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 화학요법 화합물, 예를 들어 유전자 요법을 위해, 면역억제제, 항염증제 또는 면역증강제, 및 백신을 위해, 감마 글로불린, 아만타딘, 구아니딘, 하이드록시벤즈이미다졸, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양괴사인자-알파, 티오세미카바존, 메티사존, 리팜핀, 리바비린, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 포스카르네트, 포스포노아세트산, 어사이클로비르, 디데옥시뉴클레오사이드, 프로테아제 저해제, 또는 강시클로비르를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 화학요법제를 추가 또는 부가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, Katzung(1992), 및 각각 798-800 및 680-681면의 거기에 인용된 참조문헌을 참조하라.
조성물은 또한 다양하지만 소량의 무-엔도톡신 포름알데히드와, 조성물이 투여되는 유기체에서 안전하고 바람직하지 않은 영향에 기여하지 않는 것으로 확인된 보존제를 함유할 수 있다.
약제학적 목적
조성물(또는 그것이 유발하는 항혈청)의 투여는 "예방" 또는 "치료" 목적일 수 있다. 예방적으로 투여되는 경우, 백신인 본 발명의 조성물은 병원체 감염의 어느 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 어느 후속 감염을 예방하거나 약화하는 역할을 한다. 예방적으로 제공될 때, 본 발명의 유전자 요법 조성물은 질환의 어느 증상이 나타나기 전에 제공된다. 조성물의 예방적 투여는 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 예방하거나 약화하는 역할을 한다.
치료적으로 제공될 때, 약독화 또는 불활성화 바이러스 백신은 실제 감염의 증상이 검출될 때 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 어느 실제적 감염을 약화하는 역할을 한다. 예를 들어, Berkow 등, 1992; Goodman 등, 1990; Avery, 1987; 및 Katzung, 1992를 참조하라. 치료적으로 제공될 때, 유전자 요법 조성물은 질환의 증상이나 징후가 검출되면 제공된다. 화합물(들)의 치료적 투여는 그 질환의 증상이나 징후를 약화하는 역할을 한다.
따라서, 본 발명의 약독화 또는 불활성화 백신 조성물은 감염의 발병 전에(예상되는 감염을 예방하거나 약화하기 위하여) 또는 실제 감염의 시작 후에 제공될 수 있다. 유사하게, 유전자 요법을 위하여, 조성물은 장애나 질환의 어느 증상이 발현되기 전이나 하나 이상의 증상이 검출된 후 제공될 수 있다.
조성물은 그의 투여가 수혜 환자에 의해 견뎌질 수 있으면 "약학적으로 허용되는"이라고 말해진다. 그러한 물질은 투여되는 양이 생리학적으로 유의하면 "치료 유효량"으로 투여된다고 말해진다. 본 발명의 조성물은 그의 존재가 수혜 환자의 생리에 검출가능한 변화를 일으키면, 예를 들어, 감염성 인플루엔자 바이러스의 적어도 하나의 균주에 대한 적어도 하나의 일차 또는 이차 체액성 또는 세포성 면역반응을 증진시키면 생리학적으로 유의하다.
제공되는 "보호"는 절대적일 필요는 없으며, 즉, 대조 집단이나 환자 셋에 비해 통계학적으로 유의한 개선이 있으면 인플루엔자 감염이 완전히 예방되거나 근절될 필요는 없다. 보호는 인플루엔자 바이러스 감염 증상의 중증도나 개시 신속성을 완화하는 것으로 제한될 수 있다.
약제학적 투여
본 발명의 조성물은 수동 면역화 또는 능동 면역화에 의해 하나 이상의 병원체, 예를 들어, 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 내성을 부여할 수 있다. 능동 면역화에서, 불활성화 또는 약독화 생 백신 조성물은 숙주(예를 들어, 포유류)에게 예방적으로 투여되며, 투여에 대한 숙주의 면역반응은 감염 및/또는 질환으로부터 보호한다. 수동 면역화를 위해, 유발된 항혈청이 회수되고 적어도 하나의 인플루엔자 바이러스 균주에 의해 유발되는 감염을 갖는 것으로 의심되는 수혜자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 유전자 요법 조성물은 능동 면역화에 의해 예방적 또는 치료적 수준의 목적하는 유전자 산물을 생성시킬 수 있다.
일 태양에서, 백신은 여성 및 태아나 신생아(태반을 가로지르거나 모유에 있는 항체의 수동적 도입을 통해) 둘다를 보호하는 역할을 하는 면역반응의 생성을 유발하기에 충분한 시간과 양의 조건 하에서, 포유류 여성(임신 또는 출산시나 이전)에게 제공된다.
따라서 본 발명은 장애나 질환, 예를 들어, 적어도 하나의 병원체 균주에 의한 감염의 예방 또는 약화방법을 포함한다. 여기에 사용된 바, 백신은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화(또는 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화한다고 말해진다. 여기에 사용된 바, 유전자 요법 조성물은 그의 투여가 질환의 증상이나 상태의 완전 또는 부분적 약화(즉, 억제)나, 질환에 대한 개체의 완전 또는 부분적 면역성을 일으키면 질환을 예방하거나 약화한다고 말해진다.
본 발명의 적어도 하나의 불활성화 또는 약독화 인플루엔자 바이러스, 또는 그의 조성물은 이미 기재된 약제학적 조성물을 이용하여, 의도한 목적을 달성하는 어떠한 수단에 의해서도 투여될 수 있다.
예를 들어, 그러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피부내, 근육내, 복강내, 비내, 경구 또는 경피 경로와 같은 다양한 비경구 경로에 의할 수 있다. 비경구 투여는 볼루스 주사에 의하거나 시간에 걸친 점진적 관류일 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 바람직한 양식은 근육내 또는 피하 적용에 의한 것이다. 예를 들어, Berkow 등, 1992; Goodman 등, 1990; Avery, 1987: 및 Katzung, 1992를 참조하라.
인플루엔자 바이러스 관련된 병리를 예방, 억제 또는 치료하기 위한 전형적 투여계획은 단일 치료로서 투여되거나, 1 주 내지 약 24 개월, 또는 그 안의 어느 범위나 값 이하와 그를 포함하는 기간에 걸쳐, 증가 또는 부스터 용량으로서 반복되는, 여기에 기재된 유효량의 백신 조성물의 투여를 포함한다.
본 발명에 따르면, 조성물의 "유효량"은 목적으로 하는 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 것이다. 유효 용량은 수혜자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 존재하는 경우, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 원하는 효과의 성질에 의존할 것임이 이해되어야 한다. 아래 제공되는 유효 용량의 범위는 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며 바람직한 용량 범위를 나타낸다. 그러나, 가장 바람직한 용량은 당업자에 의해 이해되고 결정될 수 있는 바와 같이, 개개 대상에게 맞추어질 것이다. 예를 들어, Berkow 등, 1992; Goodman 등, 1990; Avery's, 1987; Ebadi, 1985; 및 Katsung, 1992를 참조하라.
포유류(예를 들어, 인간) 또는 조류 성체 유기체를 위한 약독화 바이러스 백신의 용량은 약 103-107 플라크 형성 단위(PFU)/㎏, 또는 그 안의 어느 범위나 값일 수 있다. 불활성화 백신의 용량은 약 0.1 내지 200, 예를 들어, 50 ㎍의 헤마글루티닌 단백질 범위일 수 있다. 그러나, 용량은 현존 백신을 출발점으로 사용하여, 통상적 방법에 의해 결정되는 바 안전하고 유효한 양이어야 한다.
복제된 바이러스 백신의 각 용량 중의 면역활성 HA의 용량은 적당한 양, 예를 들어, 1-50 ㎍ 또는 그 안의 어느 범위나 값, 또는 보통 3세 이상의 소아를 위해 성분 당 15 ㎍, 및 <3세 소아를 위해 성분 당 7.5 ㎍인, U.S. 퍼블릭 헬스 서비스(PHS)에 의해 권장되는 양을 함유하도록 표준화될 수 있다. NA의 양 또한 표준화될 수 있지만, 이 당단백질은 가공 정제와 저장 동안 불안정할 수 있다(Kendal 등, 1980; Kerr 등, 1975). 각 0.5-㎖ 용량의 백신은 바람직하게는 대략 10-500억개 바이러스 입자, 바람직하게는 100억개 입자를 함유한다.
본 발명은 아래 비제한적 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 및 바이러스. 293T 인간 배아 신장세포 및 Madin-Darby 개 신장 세포(MDCK)를 각각 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 둘베코즈 변형 이글 배지(DMEM) 및 5% 신생 송아지 혈청을 함유하는 변형 이글즈 배지(MEM)에서 유지하였다. 모든 세포를 5% CO2에서 37 ℃에 유지하였다. 인플루엔자 바이러스 A/WSN/33(H1N1) 및 A/PR/8/34(H1N1)를 10-일령 알에서 증식시켰다.
플라스미드의 제작. RNA 폴리머라제 Ⅰ 제작물을 생성시키기 위하여, A/WSN/33 또는 A/PR/8/34 바이러스 RNA로부터 유래된 클로닝된 cDNAs를 RNA 폴리머라제 Ⅰ의 프로모터와 터미네이터 서열 사이에 도입하였다. 간략하게, 클로닝된 cDNAs를 BsmBⅠ 위치를 함유하는 프라이머로 PCR에 의해 증폭하고, BsmBⅠ으로 분해하고, BsmBⅠ 위치에 의해 분리된, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 pHH21 벡터의 BsmBⅠ 위치로 클로닝하였다(도 2). A/WSN/33 균주의 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS 유전자를 아래 플라스미드를 이용하여 PCR-증폭하였다: 각각, pSCWPB2, pGW-PB1, 및 pSCWPA(모두 유니버시티 오브 캘리포니아 로스 엔젤레스의 Debi Nayak 박사로부터 얻음), 및 pWH17, pWNP152, pT3WNA15(Castrucci 등, 1992), pGT3WM 및 pWNS1. 인플루엔자 A/PR/8/34 바이러스의 PB1 유전자를 주형으로 pcDNA774(PB1)(Perez 등, 1998)을 이 용하여 증폭하였다. 유전자가 원치않는 돌연변이를 갖지 않음을 보장하기 위해, PCR-유래된 단편을 자동서열결정기(미국 캘리포니아주 소재, 어플라이드 바이오시스템 Inc.)로 제조자에 의해 권장되는 프로토콜에 따라 서열결정하였다. A/WSN/33 바이러스의 HA, NP, NA 및 M1 유전자를 코딩하는 cDNAs를 기재된 바와 같이(Huddleston 등, 1982) 클로닝하고 진핵 발현 벡터 pCAGGS/MCS(닭 β-액틴 프로모터에 의해 제어됨)로 서브클로닝하여(Niwa 등, 1991), 각각 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0-14, pCAGGS-WNA15 및 pCAGGS-WSN-M1-2/1를 생성하였다. A/PR/8/34 바이러스로부터의 M2 및 NS2 유전자를 PCR에 의해 증폭하고 pCAGGS/MCS로 클로닝하여, pEP24c 및 pCA-NS2를 생성시켰다. 마지막으로, pcDNA774(PB1), pcDNA762(PB2) 및 pcDNA787(PA)를 사이토메갈로바이러스 프로모터의 제어 하에 PB2, PB1 및 PA 단백질을 발현시키는데 사용하였다(Perez 등, 1998).
감염성 인플루엔자 입자의 생성. 293T 세포(1×106)를 트랜스 IT LT-1(위스콘신, 매디슨, 판베라)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 상이한 양의 최대 17개 플라스미드로 형질감염시켰다. 간략하게, DNA와 형질감염 시약을 혼합하고(DNA ㎍ 당 2 ㎕ 트랜스 IT-LT-1), 실온에서 45 분간 인큐베이션하고 세포에 가하였다. 6 시간 후, DNA-형질감염 시약 혼합물을 0.3% 소혈청 알부민 및 0.01% 송아지 태아 혈청을 함유하는 Opti-MEM(메릴랜드주 게이터스버그 소재, 깁코/BRL)으로 대체하였다. 형질감염 후 상이한 시간에, 바이러스를 상등액으로부터 수획하고 MDCK 세포 상에서 적정하였다. 헬퍼 바이러스가 이 과정에 의해 요구되지 않으므로, 회수된 형질감염체 바이러스를 플라크 정제 없이 분석하였다.
바이러스를 생산하는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율 결정. 형질감염 24 시간후, 293T 세포를 0.02% EDTA로 단일 세포로 분산시켰다. 그런 다음 세포 현탁액을 10-배 희석하고 24-웰 플레이트에 있는 MDCK 세포의 컨플루언트 단일층으로 옮겼다. 바이러스를 헤마글루티닌 어세이에 의해 검출하였다.
면역염색 어세이. 인플루엔자 바이러스로의 감염 9 시간후, 세포를 인산염-완충 염수(PBS)로 2회 세척하고 실온에서 20 분간 3.7% 파라포름알데히드(PBS 중)로 고정하였다. 다음에, 그들을 0.1% Triton X-100으로 처리하고 Neumann 등(1997)에 의해 기재된 바와 같이 처리하였다.
결과
바이러스 RNA 분절, 세 폴리머라제 서브유닛 및 NP 단백질의 플라스미드-주도된 발현에 의한 감염성 바이러스의 생성. 정제된 비리온으로부터 추출된 RNPs의 혼합물로의 세포의 형질감염이 감염성 인플루엔자 입자를 생성하였을지라도, 이 전략은 8개의 상이한 시험관 내 생성된 RNPs와 사용될 때 효율적일 것 같지 않다. cDNAs로부터 감염성 인플루엔자 바이러스를 완전히 생산하기 위하여, 8개의 바이러스 RNPs를 생체 내에서 생성시켰다. 따라서, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터에 의해 연결된, A/WSN/33 바이러스의 전장 바이러스 RNAs에 대한 cDNAs를 함유하는 플라스미드를 제조하였다. 원칙적으로, 이들 8개의 플라스미드의 진핵세포로의 형질감염은 모든 8개의 인플루엔자 vRNAs의 합성을 일으켜야만 한다. 그런 다음 단백질 발현 플라스미드의 공형질감염에 의해 생성된, PB2, PB1, PA 및 NP 단백질은 vRNAs를 복제 및 전사되는 기능적 vRNPs로 조립하여, 궁극적으로 감염성 인플루엔자 바이러스를 형성한다(도 3). 1×106개 293T 세포를 단백질 발현 플라스미드(1 ㎍의 pcDNA762(PB2), 1 ㎍의 pcDNA774(PB1), 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA), 및 1 ㎍의 pCAGGS-WSN-NP0/14) 및 1 ㎍의 각각의 아래 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(pPolⅠ-WSN-PB2, pPolⅠ-WSN-PB1, pPolⅠ-WSN-PA, pPolⅠ-WSN-HA, pPolⅠ-WSN-NP, pPolⅠ-WSN-NA, pPolⅠ-WSN-M 및 pPolⅠ-WSN-NS)로 형질감염시켰다. 감소된 양의 pcDNA787(PA)를 사용하는 결정은 이전 관찰(Mena 등, 1996)과, 바이러스-유사 입자(VLPs)의 생성을 위한 최적 조건에 대한 데이터(결과 미도시)에 기초하였다. 293T 세포의 형질감염 24 시간후, ㎖ 당 7×103 pfu의 바이러스를 상등액에서 발견하여(실험 1, 표 1), 플라스미드로부터 A형 인플루엔자 바이러스를 완전히 생산하는 역 유전학의 능력을 처음으로 입증하였다.
클로닝된 cDNA로부터 인플루엔자 바이러스를 생산하는데 사용된 플라스미드 셋*
실험
RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드:+ 1 2 3 4 5 6 7 8
PB1 + + - - - - - -
PR8-PB1 - - + + + + + +
PB2 + + + + + + + +
PA + + + + + + + +
HA + + + + + + + +
NP + + + + + + + +
NA + + + + + + + +
M + + + + + + + +
NS + + + + + + + +
단백질 발현 플라스미드:
PB1 + + + + - + + +
PB2 + + + + + - + +
PA + + + + + + - +
NP + + + + + + + -
HA - + - + + + + +
NA - + - + + + + +
M1 - + - + + + + +
M2 - + - + + + + +
NS2 - + - + + + + +
바이러스 역가(pfu/㎖) 7×103 7×103 1×103 3×104 0 0 0 0
* 293T 세포를 표시된 플라스미드로 형질감염시켰다. 24(실험예 1 및 2) 또는 48 시간(실시예 3-8) 후, 상등액 중 바이러스 역가를 MDCK 세포 상에서 결정하였다.
+ 다르게 표시되지 않으면, 플라스미드를 A/WSN/33 바이러스의 RNAs를 나타내는 cDNAs로 제작하였다.
모든 바이러스 구조 단백질의 공동발현으로의 인플루엔자 바이러스 생산의 효율. 바이러스 NP 및 폴리머라제 단백질의 발현이 인플루엔자 바이러스의 플라스미드-주도된 생성을 위해 충분할지라도, 효율이 향상될 수 있는 것이 가능하였다. 이전 연구에서, 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M1, M2 및 NS2)의 발현은 리포터 클로람페니콜-아세틸트랜스퍼라제 유전자(Mena 등, 1996)를 코딩하는 인공적 vRNA를 함유한 VLPs를 생성하였다. 따라서, 단지 바이러스 RNA 복제와 전사에 요구되는 것들 대신, 구조 단백질의 전체 성분의 이용가능성은 바이러스 생산의 효율을 향상시킬 수 있다. 이 목적을 위해, 293T 세포를 최적량의 바이러스 단백질 발현 플라스미드(VLP 생산에 의해 판단됨; 비공개 데이터): 1 ㎍의 pcDNA762(PB2) 및 pcDNA774(PB1); 0.1 ㎍의 pcDNA787(PA); 1 ㎍의 pEWSN-HA, pCAGGS-WSN-NP0/14, 및 pCAGGS-WNA15; 2 ㎍의 pCAGGS-WSN-M1-2/1; 0.3 ㎍의 pCA-NS2; 및 0.03 ㎍의 pEP24c(M2를 위한)를, 1 ㎍의 각 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(실험예 2, 표 1)와 함께, 형질감염시켰다. 재조합체 바이러스를 생성하기 위한 노력으로, pPolⅠ-PR/8/34-PB1이 PA, PB1, PB2 및 NP만을 발현하는 플라스미드(실험예 3, 표 1) 또는 모든 인플루엔자 구조 단백질을 발현하는 것들(실험예 4, 표 1)과 함께, 치환되는 PB1 유전자를 제외하고는, 두번째 셋의 세포를 동일한 셋의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드로 형질감염시켰다. WSN 바이러스의 수율은 형질감염 후 24 시간(실험 1 및 2, 표 1) 또는 36 시간(결과 미도시)에 그다지 상이하지 않았다. 그러나, PR/8/34-PB1으로의 바이러스의 수율에서 10-배 초과의 증가가 모든 인플루엔자 바이러스 구조 단백질이 제공되었을 때 발견되었다(실험 3 및 4, 표 1). NP 단백질의 PA, PB1, PB2의 발현을 위한 플라스미드 중 하나가 결여된 음성 대조군은 바이러스를 생성하지 않았다(실험 5-8, 표 1). 따라서, 생성되는 바이러스에 따라, 모든 A형 인플루엔자 바이러스 구조 단백질의 발현이 역 유전학 방법의 효율을 상당히 향상시켰다.
다음으로, 세포의 형질감염 후 바이러스 생산의 역학을 A/PR/8/34-PB1 유전자를 갖는 바이러스를 생성시키는데 사용된 플라스미드 셋을 이용하여 결정하였다. 세 실험 중 둘에서, 바이러스가 형질감염 24 시간 후 처음 검출되었다. 그 때 측정된 역가, >103 pfu/㎖은 형질감염 후 48 시간에 의해 >106 pfu/㎖로 증가하였다(표 2). 바이러스를 생산하고 있는 플라스미드-형질감염된 세포의 백분율을 측정하기 위하여, 293T 세포를 형질감염 24 시간 후 EDTA(0.02%)로 처리하여 세포를 분산시킨 후, 제한 희석 연구를 수행하였다. 이 실험에서, 유리 바이러스가 이 시점에 배양 상등액에서 발견되지 않았다. 결과는 103.3개 세포 중 하나가 감염성 바이러스 입자를 생성하고 있음을 가리켰다.
293T 세포로의 플라스미드 형질감염 후 바이러스 생산의 역학*
플라스미드 형질감염 후 시간 배양 상등액 중 바이러스 역가(pfu/㎖)
실험
1 2 3
6 0 ND ND
12 0 ND 0
18 0 ND 0
24 0 2×103 6×103
30 ND 5×104 9×104
36 6×102 >1×105 7×105
42 ND >1×106 5×106
48 8×104 >1×106 1×107
* 293T 세포를 A/PR/8/34 바이러스로부터 유래된, PB1 유전자를 제외하고 A/WSN/33 바이러스 유전자를 코딩하는 8개의 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드와, 본문에 기재되어 있는 9개의 단백질 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 상이한 시점에, MDCK 세포에 있는 배양 상등액 중 바이러스를 적정하였다. ND = 행해지지 않음.
NA 단백질에서 FLAG 에피토프를 함유하는 인플루엔자 바이러스의 회수. 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스의 게놈으로 돌연변이의 도입을 허용하였는지를 검증하기 위하여, NA 단백질에 FLAG 에피토프(Castrucci 등, 1992)를 함유하는 바이러스를 생성하였다. 293T 세포를 요구되는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 및 단백질 발현 플라스미드와 함께, NA 단백질과 단백질 머리의 바닥에 FLAG 에피토프를 모두 코딩하는 cDNA를 함유하는 RNA 폴리머라제 Ⅰ 플라스미드(pPolⅠ-WSN-NA/FL79)로 형질감염시켰다. 회수된 바이러스(PR8-WSN-FL79)가 사실상 NA-FLAG 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여, PR8-WSN-FL79 또는 A/WSN/33 야생형 바이러스로 감염된 세포의 면역염색 어세이를 수행하였다. FLAG 에피토프에 대한 모노클로날 항체는 PR8-WSN-FL79로 감염된 세포를 검출하였지만, 야생형 바이러스로 감염된 것들은 그러하지 않았다. PR8-WSN-FL79 바이러스의 회수는 태그되지 않은 야생형 바이러스(결과 미도시)에 대한 것만큼 효율적이었다. 이들 결과는 새로운 역 유전학 시스템이 A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 돌연변이를 도입하는 것을 허용함을 가리킨다.
PA 유전자에 돌연변이를 함유하는 감염성 인플루엔자 바이러스의 생성. PA 유전자에 돌연변이를 갖는 바이러스를 생산하기 위하여, 두 침묵 돌연변이를 제한 엔도뉴클레아제에 대한 새로운 인식 서열(mRNA의 위치 846의 Bsp120Ⅰ 및 위치 1284의 PvuⅡ)을 만들어 도입하였다. 이전에는, 신뢰할만한 선별 체계의 결여로 인해, 역 유전학에 의해 이 유전자를 변형시키는 것이 불가능하였다. 형질감염체 바이러스, PA-T846C 및 PA-A1284를 회수하였다. 회수된 형질감염체 바이러스를 두 연속적 제한 희석에 의해 생물학적으로 클로닝하였다. 회수된 바이러스가 정말 PA 유전자에 돌연변이를 갖는 형질감염체인지를 검증하기 위하여, PA 유전자에 대한 cDNA를 역전사효소-PCR에 의해 수득하였다. PA-T846C 및 PA-A1284C 바이러스는 새로 도입된 제한 위치의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, PA 유전자 내에 예상된 돌연변이를 가졌다. 역전사 단계가 없는 동일한 바이러스 샘플과 프라이머의 PCR은 어떠한 산물도 생산하지 못하여(결과 미도시), PA cDNA가 정말로 바이러스를 생성하는데 사용된 플라스미드 대신 vRNA로부터 기원하였음을 나타내었다. 이들 결과는 돌연변이된 유전자를 갖는 바이러스가 어떻게 헬퍼 바이러스를 사용하지 않고 생산 및 회수될 수 있는지를 설명한다.
논의
여기에 기재된 역 유전학 시스템은 완전히 클로닝된 cDNAs로부터 A형 인플루엔자 바이러스를 효율적으로 생산할 수 있도록 한다. Bridgen 및 Elliott(1996) 또한 분얌웨라(Bunyamwera) 바이러스(분야비리대(Bunyaviridae) 훼밀리)를 생성하는데 역 유전학을 사용하였지만, 그것은 단지 세 분절의 (-)-센스 RNA만을 함유하고, 그 생산 효율은 102 pfu/107개 세포로 낮았다. 비록 바이러스 수율은 실험간에 상이하였지만. 일관되게 > 103 pfu/106개 세포가 8개 분절을 함유하는 인플루엔자 바이러스에 대해 관찰되었다. 여기 위에서 기재된 역 유전학 시스템의 높은 효율에 대한 몇몇 설명이 있다. 시험관 내에서 RNPs를 생산하는 대신(Luytjes 등, 1989), RNPs를 RNA 폴리머라제 Ⅰ을 사용하여 vRNAs의 세포 내 합성과 바이러스 폴리머라제 단백질 및 NP의 플라스미드-주도 발현을 통해 생체 내에서 생성하였다. 또한, 플라스미드로 쉽게 형질감염되는 293T 세포(Goto 등, 1997)의 사용이 큰 집단의 세포가 바이러스 생산을 위해 필요한 모든 플라스미드를 받는 것을 보장하였다. 또한, 성장하는 세포에서 가장 풍부하게 발현되는 효소 중 하나인, RNA 폴리머라제 Ⅰ에 의해 생산된 다수의 전사체가 아마도 시스템의 총 효율성에 기여하였다. 이들 특징은 상응하여 풍부한 수의 vRNA 전사체 및 적당한 양의 vRNA의 캡드시화를 위한 바이러스 단백질, 핵에서의 RNPs의 형성 및 이들 복합체의 새로운 바이러스가 조립되고 방출되는 세포 막으로의 수송에 이르게 하였다.
이전에 확립된 역 유전학 시스템(Enami 등, 1990;: Neumann 등, 1994; Luytjes 등, 1989; Pleschka 등, 1996)은 헬퍼-바이러스 감염과 따라서 소수의 형질감염체가 방대한 수의 헬퍼 바이러스로부터 회수되는 것을 허용하는 선별 방법을 요구하였다. 그러한 전략은 아래 cDNA-유래된 유전자 중 하나를 갖는 인플루엔자 바이러스를 생성하는데 사용되었다: PB2(Subbarao 등, 1993), HA(Enami 등, 1991: Horimoto 등, 1994), NP(Li 등, 1995), NA(Enami 등, 1990), M(Castrucci 등, 1995; Yasuda 등, 1994) 및 NS(Enami 등, 1991). HA 및 NA 유전자에 적용가능한 것들을 제외한, 대부분의 선별 방법은 성장 온도, 숙주 범위 제한, 또는 약물 민감성에 의존하여, 유전자 산물의 기능적 분석을 위한 역 유전학의 유용성을 제한한다. 신뢰할만한 항체-주도 선별 시스템이 이용가능한 HA 및 NA 유전자로조차, 유망한 성장 결함을 갖는 바이러스를 생산하는 것이 어렵다. 반대로, 여기에 기재된 역 유전학은 헬퍼 바이러스를 요구하지 않고 어느 유전자 분절에서 돌연변이나 심각한 성장 결함을 갖는 형질감염체를 생성하는 것을 허용한다. 이 장점은 돌연변이된 PA 유전자를 갖는 형질감염체 바이러스의 회수를 나타내는, 도 5에 입증되어 있다. A형 인플루엔자 바이러스 게놈에 어느 유효한 돌연변이를 도입하는 기술을 갖는 것은 연구자가 바이러스 게놈의 비번역 부위의 조절 서열의 성질, 바이러스 단백질의 구조-기능 관계, 및 숙주-범위 제한 및 바이러스 병원성의 분자적 기초와 같은, 많은 오래된 문제를 해결할 수 있게 할 것이다.
비록 불활성화 인플루엔자 백신이 이용가능할지라도, 그들의 효능은 부분적으로 국소 IgA 및 세포독성 T 세포 반응을 유발하는 그들의 제한된 능력으로 인해 최적 이하이다. 지금 진행 중인 저온-적응 생 인플루엔자 백신의 임상시험은, 그들이 인플루엔자 증상을 유발하지 않지만, 여전히 보호 면역성을 유도하도록, 최적으로 약독화됨을 암시한다(Keitel & Piedra, 1998에서 검토). 그러나, 예비적 결과는 이들 생 바이러스 백신이 최상의 불활성화 백신(Keitel & Piedra, 1998에서 검토) 보다 유의하게 더 유효하지 않아, 추가 개량의 여지가 있음을 나타낸다. 하나의 가능성은 상기된 역 유전학 시스템으로 저온-적응 백신을 변형하는 것일 것이다. 대안으로는, 내부 단백질을 코딩하는 유전자에 여러 약독화 돌연변이를 갖는 "주" A형 인플루엔자 균주를 생산하는데 역 유전학 시스템을 사용함으로써 무에서 시작할 수 있다. 여기에 기재된 역 유전학의 가장 매력적인 적용은 인플루엔자 바이러스의 새로운 HA 또는 NA 서브타입이 연루되는 의심되는 세계적 유행병의 경우 약독화 생-바이러스 백신의 신속한 생산에 있을 수 있다.
이 새로운 역 유전학 시스템은 대개 백신 벡터로서의 인플루엔자 바이러스의 사용을 증가시킬 것이다. 바이러스는 인플루엔자 바이러스 단백질에 더하여 외래 단백질이나 면역원성 에피토프를 발현하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 9개의 분절(Enami 등, 1991)로서 외래 단백질을 갖는 바이러스를 생성할 수 있고 그들을 생 백신으로 사용할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 강력한 세포-매개 및 체액성 면역반응을 자극할 뿐 아니라, 그들은 광범위한 어레이의 비리온 표면 HA 및 NA 단백질(예를 들어, 15 HA 및 9 NA 서브타입 및 그들의 유행성 변이체)을 제공하여, 동일한 표적 집단의 반복된 면역화를 허용할 수 있다.
리포터 유전자를 코딩하는 인공적 vRNA를 갖는 인플루엔자 VLPs를 바이러스 구조 단백질과 vRNA를 백시니아-T7 폴리머라제 시스템(Mena 등, 1996)을 이용하여 발현시켜 생산하였다. 역 유전학을 이용하여, 이제 vRNA 전사 및 복제에 요구되는 단백질(즉, PA, PB1, PB2 및 NP)을 코딩하는 vRNAs, 및 관심있는 단백질을 코딩하는 vRNAs를 함유하는 VLPs를 생성할 수 있다. 그러한 VLPs는 유용한 유전자 전달 비히클일 수 있다. 중요하게는, 그들의 바이러스 구조 단백질을 코딩하는 유전자의 결여는 VLP-유전자 요법 후 감염성 바이러스가 생산되지 않음을 보장할 것이다. 인플루엔자 바이러스 게놈은 숙주 염색체로 통합되지 않기 때문에, VLP 시스템은 세포의 단기 형질도입만을 요구하는 상황(예를 들어, 암 치료를 위해)에서 유전자 요법에 적당할 것이다. 아데노바이러스 벡터(Kovesdi 등, 1997)와 반대로, 인플루엔자 VLPs는 HA 및 NA 변이체 모두를 함유하여, 표적 집단의 반복된 치료를 허용할 수 있다.
훼밀리 오르쏘믹소비리대는 A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스, 및 최근에 분류된 토고토바이러스(Thogotovirus)를 포함한다. 완전히 여기에 기재된 클로닝된 cDNAs로부터 감염성 A형 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 전략은 어떠한 오르쏘믹소바이러스, 및 아마도 다른 분절된 (-)-센스 RNA 바이러스(예를 들어, 분야비리대, 아레나비리대(Arenaviridae))에도 적용될 것이다. 기술적 제한 없이 바이러스 게놈을 조작하는 능력은 바이러스 생활주기 및 그들의 조절, 바이러스 단백질의 기능 및 바이러스 병원성의 분자적 기작의 연구를 위해 심오한 의미를 갖는다.
실시예 2
재료 및 방법
세포, 바이러스 및 항체. 293T 인간 배아 신장세포 및 Madin-Darby 개 신장 세포(MDCK)를 각각 10% 송아지 태아 혈청이 보충된 DMEM 및 5% 신생 송아지 혈청을 함유하는 MEM에서 유지하였다. 293T 세포는 원숭이 바이러스 40 T 항원의 유전자가 삽입된 293 주의 유도체이다(DuBridge 등, 1987). 모든 세포를 5% CO2에서 37 ℃에 유지하였다. B/Lee/40 및 그의 돌연변이 바이러스를 10일령 배아를 가진 달걀에서 증식시켰다. 바이러스를 차동 원심분리와 10-50% 수크로스 구배를 통한 침강에 의해 요낭액으로부터 정제하였다. 항-MB 토끼 혈청을 키홀 림펫 헤모시아닌에 커플링된 합성 펩티드 NKRDDISTPRAGVD(서열 9; NB 단백질의 아미노산 잔기 70-83)에 대해 생성하였다.
플라스미드의 제작. B/Lee/40 바이러스의 cDNAs를 바이러스 RNA의 보존된 3' 말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 바이러스 RNA의 역전사에 의해 합성하였다. cDNA를 BsmBⅠ 위치를 함유하는 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머로 PCR에 의해 증폭하고, PCR 산물을 pT7Blueblunt 벡터(WI, 매디슨, 노바젠)로 클로닝하였다. BsmBⅠ으로 분해한 후, 단편을 BsmBⅠ 위치에 의해 분리된, 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터와 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터를 함유하는 플라스미드 벡터의 BsmBⅠ 위치로 클로닝하였다. vRNA의 발현을 위한 이들 플라스미드는 "PolⅠ" 제작물이라 언급된다. B/Lee/40 바이러스의 PB2, PB1, PA 및 NP 유전자를 코딩하는 cDNAs를 진핵 발현 벡터 pCAGGS/MCS(닭 β-액틴 프로모터에 의해 제어되는)(Kobasa 등, 1997; Niwa 등, 1991)로 클로닝하여, 각각 PB2, PB1, PA 및 NP 단백질을 발현하는 pCABLeePB2, pCABLeePB1, pCABLeePA 및 pCABLeeNP를 생성하였다.
NB 녹아웃 돌연변이를 아래와 같이 제작하였다. 돌연변이된 NA 유전자(도 4 참조)를 B/Lee/40 NA 유전자를 함유하는 PolⅠ 제작물로부터 PCR에 의해 증폭한 후 BsmBⅠ으로 분해하였다. BsmBⅠ-분해된 단편을 PolⅠ 플라스미드의 BsmBⅠ 위치로 클로닝하였다. 생성된 제작물을 pPolBLeeNBstop#l, pPolBLeeNBstop#2 및 pPolBLeeNBstop#3으로 명명하였다. 모든 제작물을 원치않는 돌연변이가 존재하지 않음을 보증하기 위하여 서열결정하였다.
플라스미드-기초 역 유전학. 형질감염체 바이러스를 앞서 보고된 바와 같이 생성하였다(실시예 1). 간략하게, 12개의 플라스미드(8개의 RNA 분절에 대한 8개의 PolⅠ 제작물 및 폴리머라제 단백질 및 NP에 대한 4개의 단백질-발현 제작물)를 형질감염 시약(트랜스 IT-LT-1[위스콘신주 매디슨 소재, 판베라])과 혼합하고, 실온에서 10 분간 인큐베이션하고 0.3% BSA를 함유하는 Opti-MEM(인비트로젠)에서 배양된 1×106 293T 세포에 가하였다. 48 시간후, 상등액 중 바이러스를 모으고 스탁 바이러스의 생산을 위해 MDCK 세포에서 증폭하였다.
간접 면역형광 어세이. MDCK 세포를 세포 당 1 내지 약 2 플라크-형성 단위(PFU)의 감염 다중도(MOI)로 바이러스로 감염시켰다. 감염 8 시간 후, 세포를 3% 포름알데히드 용액으로 고정하고 0.1% Triton X-100으로 투과화하였다. 항원을 일차 항체로서 항-NB 펩티드 토끼 혈청 및 이차 항체로서 FITC-컨쥬게이션된 항-토끼 IgG로 검출하였다.
면역침전. B형 인플루엔자 바이러스-감염 MDCK 세포(5 PFU/세포의 MOI)를 2 시간 동안 감염 7 시간 후 [35S]Met와 [35S]Cys(각각 50 μCi/㎖)의 혼합물(Tran 35S-표지: ICN 바이오케미컬즈)로 표지하였다. 방사성표지된 세포를 10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 0.5% Triton X-100을 함유하는 RIPA 완충액에서 용해시킨 후 원심분리하였다. 항-NB 토끼 혈청을 상등액에 가하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음 단백질 A-세파로스 비드를 가하고 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 면역 복합체를 세척하고 4-20% 구배 폴리아크릴아미드 젤(유타주 케이스빌 소재, ISC 바이오익스프레스)에서 분리하였다. 젤을 건조하고 오토래디오그래피에 의해 검사하였다.
형질감염체 바이러스의 복제 성질. MDCK 세포를 세포 당 0.001 PFU의 MOI로 바이러스로 감염시키고, ㎖ 당 0.5 ㎍의 트립신을 함유하는 MEM 배지로 중층하고, 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 상등액을 MDCK 세포 상의 플라크 어세이에서 감염성 바이러스에 대해 상이한 시간에 어세이하였다.
실험적 감염. 메톡시플루란으로 마취된 5주령 자성 BALB/c 마우스를 50 ㎕의 바이러스로 비내 감염시켰다. 50%의 마우스에게 치명적인 용량(MLD50)을 Gao 등(1999)에 의해 이전에 기재된 바와 같이 결정하였다. 바이러스의 복제 능력을 Bilsel 등(1993)에 의해 기재된 바와 같이, 마우스를 비내 감염(1.0×104 PFU)시키고 감염 3 일 후 기관에서의 바이러스 역가를 결정함으로써 결정하였다.
결과
역 유전학에 의한 B/Lee/40 바이러스의 생성. 바이러스 복제에서 NB 단백질의 역할(들)을 결정하는데 제1 단계로서, B/Lee/40(B/Lee) 바이러스를 플라스미드-기초 역 유전학(Neumann 등, 1999)을 이용하여, 클로닝된 cDNA로부터 완전히 생성하였다. 플라스미드는 인간 RNA 폴리머라제 Ⅰ 프로모터 및 마우스 RNA 폴리머라제 Ⅰ 터미네이터에 의해 연결된, 모든 8개 분절의 B/Lee 바이러스를 코딩하는 cDNAs를 함유하였다. 그런 다음 293T 세포를 B/Lee 바이러스의 PA, PB1, PB2 및 NP 단백질을 발현하는 4개의 플라스미드와 B/Lee 바이러스의 8개의 바이러스 RNA 분절의 생산을 지시하는 8개의 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 48 시간후, B/LeeRG로 명명된 바이러스를 293T 세포의 상등액으로부터 회수하였다(103.5 50% 조직 배양 감염 용량, TCID50).
NB 단백질-녹아웃 바이러스가 살아있다. 이 역 유전학 시스템을 이용하여, NB 단백질을 발현하지 않는 돌연변이 바이러스를 생성하였다. pPolBLeeNBstop#l, pPolBLeeNBstop#2 및 pPolBLeeNBstop#3으로 명명된 세 돌연변이 PolⅠ 제작물을 제조하였다(도 4). 모든 돌연변이 제작물에서, NB 단백질의 개시 코돈을 ATG로부터 GCG로(Met에서 Ala로) 전환시키고, NB 단백질의 아미노산 위치 41의 코돈을 AAA로부터 TAA(중지 코돈)로 변화시켰다. pPolBLeeNBstop#2는 NB 단백질의 리딩 프레임을 변화시킬 것으로 예상되는 돌연변이된 개시 코돈 하류에 단일 뉴클레오티드 결실을 갖는다. pPolBLeeNBstop#3는 역시 NB 단백질의 리딩 프레임을 변화시킬 것으로 예상되는 돌연변이된 개시 코돈 하류에 단일 뉴클레오티드 삽입을 갖는다. 7개의 다른 PolⅠ 플라스미드와 4개의 단백질 발현 플라스미드와 함께, 각 돌연변이 NA polⅠ 플라스미드로의 293T 세포의 형질감염 후 48 시간에, BLeeNBstop#1, BLeeNBstop#2 및 BLeeNBstop#3를 상등액으로부터 회수하여(103.5 TCID50), NB 단백질이 결여된 모든 바이러스가 야생형 B/Lee 바이러스에 대한 것과 균등한 효율로 생성되었음을 나타내었다. 상등액에 존재하는 형질감염체 바이러스를 MDCK 세포에서 성장시키고 스탁 바이러스로 사용하였다. 각 스탁 바이러스의 NA 유전자의 서열결정이 원하는 돌연변이의 안정성을 확인하고 부가적 돌연변이의 도입을 배제시켰다.
의도된 바와 같이, 세 돌연변이 바이러스가 NB 단백질을 발현하지 않음을 확인하기 위하여, 간접 면역형광 어세이와 면역침전 어세이를 바이러스-감염 MDCK 세포를 이용하여 수행하였다(도 5). NB를 발현하는 B/LeeRG 바이러스와 반대로, 돌연변이 중 어느 것도 양성이 아니었다. 면역침전 연구에서, NB 단백질은 이전에 보고된 결과(Williams 등, 1986; Williams 등, 1988)에 일치하게 1.8-kDa 단백질(고-만노스 형태) 및 약 30- 내지 50-kDa 단백질(이종 형태)로 동정되었다. BLeeNBstop#l 바이러스로 감염된 몇몇 세포는 면역침전 어세이에서 희미한, 퍼진 세포질 염색을 나타내었고, 이는 대체 개시와 도입된 중지 코돈의 리드 쓰루(read through)에 의해 생산된 짧은 NB 펩티드의 생산을 나타낼 수 있다. 따라서, 모든 세 돌연변이 바이러스는 살아있었고 전장 NB 단백질을 발현하지 않았다.
세포 배양에서 NB-녹아웃 바이러스의 성장 성질. MDCK 세포를 세포 당 0.001 PFU의 MOI로 B/LeeRG, BLeeNBstop#1, BLeeNBstop#2 또는 BLeeNBstop#3 바이러스로 감염시키고 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 상등액을 감염 후 상이한 시간에 모으고, 바이러스 역가를 MDCK 세포에서 플라크 어세이에 의해 결정하였다. BLeeNBstop#1, BLeeNBstop#2 및 BLeeNBstop#3 바이러스는 바이러스 역가가 36 시간 감염 후에 107 PFU/㎖에 도달하여, B/LeeRG의 것과 유사한 성장 역학을 나타내었다(도 6). 이들 결과는 세포 배양에서, B형 인플루엔자 바이러스가 NB 단백질 없이 여러 주기의 복제를 수행할 수 있고 잘 성장할 수 있음을 가리킨다.
마우스에서 NB 녹아웃 바이러스의 복제. 생체 내에서 B형 인플루엔자 바이러스 복제에서 NB의 역할을 결정하기 위하여, 야생형 및 돌연변이 바이러스의 MLD50을 비교하였다(표 3). NB 녹아웃 바이러스의 MLD50 값은 B/LeeRG의 값 보다 적어도 1 로그 높았다. 104 PFU의 바이러스로 감염된 마우스의 폐와 비개골(NT)에서의 바이러스 복제 시험에서(표 3), 일반적으로 돌연변이 바이러스의 역가 보다 1 로그 초과로 더 낮은 바이러스 역가에 의해 나타난 바와 같이, 돌연변이 바이러스의 성장은 제한됨에 비해, B/LeeRG는 두 위치 모두에서 잘 자랐다. 따라서, 비록 세포 배양에서 성장에 요구되지는 않을지라도, NB 단백질은 마우스에서 효율적인 B형 인플루엔자 바이러스 복제를 위해 중요한 것 같다.
마우스에서의 바이러스 복제에서 NB의 역할a
바이러스 바이러스 역가(평균 로그 PFU±SD/g) MLD50(PFU)
폐 비개골
B/LeeRG 7.9±0.2 6.5±0.2 2.1×103
BLeeNBstop#1 5.2±0.6 4.9±0.3 4.3×104
BLeeNBstop#2 5.7±0.1 3.9±0.2 >1.5×105
BLeeNBstop#3 6.6±0.04 3.4±0.4 1.5×104
a메톡시플루란으로 마취된 BALB/c 마우스를 50 ㎕의 바이러스(1×104 PFU)로 비내 감염시켰다. 각 바이러스-감염 그룹으로부터의 세 마우스를 바이러스 적정을 위해 감염 후 3 일에 희생시켰다. MLD50을 Gao 등(1999)이 기재된 바와 같이 결정하였다.
논의
위에서 여기에 나타낸 바와 같이, NB 단백질은 세포 배양에서 B형 인플루엔자 바이러스 복제를 위해 필수적이지 않지만, 생체 내에서 효율적인 복제를 촉진한다. 이 점에 관하여, 생체 내 복제 중 NB에 대한 요구가 M2 단백질에 대한 것 보다 덜 엄격한 것 같지만, NB는 A/WSN/33 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질과 유사하다. M2의 막횡단 및 세포질 영역을 결여한 A/WSN/33 돌연변이는 마우스에서 심각하게 약독화되었고(Watanabe 등, 2001), M2 단백질의 아미노산 잔기 29 내지 31을 코딩하는 뉴클레오티드를 결여한 A/Udorn/72(H3N2)의 돌연변이는 세포 배양에서조차 약독화되었다(Takeda 등, 2001). M2의 이온 채널 활성이 실험적으로 잘 확립되어 있을지라도(Duff 등, 1992; Holsinger 등, 1994; Pinto 등, 1992; Sugrue 등, 1990; Sugrue 등, 1991), 그러한 활성은 NB 단백질에 대해 만장일치로 입증되지 않았다. 따라서, NB 기능에 대한 B형 인플루엔자 바이러스의 제한된 의존성은 바이러스가 A형 인플루엔자 바이러스가 그러한 것 만큼 이온 채널 활성에 의존하지 않거나 NB가 이온 채널 활성 이외의 기능을 가짐을 암시할 수 있다. NB는 B형 인플루엔자 균주 간에 고도로 보존되어 있으므로, 그러한 기능(들)은 자연 셋팅에서 바이러스 복제를 위해 중요한 것임에 틀림없다.
현재 인간 백신은 바이러스 감염의 중증도를 감소시키지만, 그를 예방하는 그들의 능력이 제한된 불활성화 백신이다. 저온-적응 생 약독화 백신의 임상 시험이 효능과 안전성 둘다에 관하여 유망한 결과를 나타내었다(Abbasi 등, 1995; Alexandrova 등, 1986: Anderson 등, 1992; Belshe 등, 1998; Cha 등, 2000; Hrabar 등, 1977; Obrosova-Serova 등, 1990; Steinhoff 등, 1990; Tomoda 등, 1995; Wright 등, 1982). 그러나, B형 인플루엔자 바이러스의 주 백신 균주의 약독화를 위한 분자적 기초는 알려지지 않은 채 남아있다. 따라서, 공지의 약독화 돌연변이로 B형 인플루엔자 바이러스를 생산하는 것이 중요하다. 백신 생산을 위해 단지 HA와 NA 유전자만이 배경 균주의 것들로의 대체를 필요로 하도록, HA와 NA 이외의 유전자에서 배타적으로 약독화 돌연변이를 함유하는 주 백신 균주를 생산하는 것이 이상적일 것이다. 그러나, 역 유전학의 발명으로, 백신 생산을 위해 HA와 NA 유전자 조차 변형하는 것이 더 이상 어렵지 않다. 따라서, 세포 배양에서 NB 녹아웃 바이러스로 성장 결함이 검출되지 않았음을 고려하면, NB 발현을 녹아웃하는 돌연변이가 백신 균주내로, 다른 약독화 돌연변이에 더하여, 포함될 수 있다.
NB 녹아웃 바이러스의 복제 능력은 MDCK 세포에서 서로 유사할지라도, 그들은 마우스에서 상이하였다. 마우스 돌연변이 사이의 복제 능력에서의 이 차이는 상이한 수준의 NA 발현으로부터 기원할 수 있다. NB 발현을 녹아웃하기 위해, NA 단백질의 상류 서열을 변형하였다. 이것은 NA 단백질 발현 수준을 변형시켜, 생체 내에서 다양한 정도의 약독화를 일으킬 수 있다.
따라서 지금까지, 5개의 바이러스 단백질이 이온 채널로 작용하는 것으로 보고되어 있다: A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질, B형 인플루엔자 바이러스의 NB 단백질, 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 Vpu 및 Vpr 및 콜레라 바이러스의 Kcv(Ewart 등, 1996; Piller 등, 1996; Plugge 등, 2000; Schubert 등, 1996: Sugrue 등, 1990; Sugrue 등, 1991; Sunstrom 등, 1996). Vpr 및 Kcv 단백질은 바이러스 생활 주기에서 중요한 역할을 하는 것으로 입증되어 있다. HIV-1의 Vpu 유전자는 시험관 내에서 HIV-1 복제를 완전히 파괴하지 않으면서 결실될 수 있다. 본 연구에서, NB 단백질이 세포 배양에서는 바이러스 성장을 위해 필요하지 않지만, 마우스에서 효율적인 B형 인플루엔자 바이러스 복제를 위해 요구되는 것으로 나타났다. 따라서, NB 돌연변이가 백신 균주로, 임의로 다른 약독화 돌연변이와 함께, 도입될 수 있다.
참조문헌
Figure 112005059813533-PCT00001
Figure 112005059813533-PCT00002
Figure 112005059813533-PCT00003
Figure 112005059813533-PCT00004
Figure 112005059813533-PCT00005
Figure 112005059813533-PCT00006
모든 간행물, 특허 및 특허출원은 여기에 참조에 의해 도입된다. 상기 명세서에서 본 발명을 그의 특정 바람직한 태양에 관하여 설명하고, 많은 상세내용을 설명 목적을 위해 기재하였지만, 본 발명이 부가적인 태양을 가질 수 있고 여기에 설명된 특정 상세내용은 본 발명의 기본 원리로부터 벗어나지 않으면서 상당히 변화될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> WARF - Wisconsin Alumni Research Foundation Kawaoka, Yoshihiro <120> Viruses Encoding Mutant Membrane Protein <130> 800.036WO1 <150> US 60/464,776 <151> 2003-04-23 <150> US 60/465,328 <151> 2003-04-24 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 2396 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 1 agcagaagcg gagcgttttc aagatgacgt tggctaaaat tgaactacta aagcagctgt 60 taagggacaa tgaagccaaa acggtgttga gacagacaac ggtagaccaa tacaacataa 120 taagaaaatt caatacatca agaattgaaa agaacccttc attaagaatg aagtgggcca 180 tgtgttccaa ttttccctta gctctgacca agggtgatat ggcaaatcga atccccttgg 240 aatacaaggg aatacaactt aaaacaaatg ctgaagacat aggaactaaa ggacaaatgt 300 gttcaatagc agcagttacc tggtggaata catatgggcc cataggggat actgaagggt 360 ttgaaaaggt ctacgaaagc ttttttctca gaaagatgag acttgacaat gccacttggg 420 gccgaatgac ctttggccct gttgagagag taagaaaaag agtactacta aacccgctca 480 ccaaggaaat gcccccagat gaagcgagca atgtaataat ggaaatatta ttccctaaag 540 aagcaggaat accaagagaa tctacttgga tacatagaga actgataaaa gaaaaaagag 600 aaaaattgaa gggaacgatg ataactccca ttgtactggc atacatgctt gagagagaac 660 tagttgcccg aagaaggttc ctgccagtag caggagcaac atcagcagag ttcatagaaa 720 tgctacattg cttacaaggt gaaaattgga gacaaatata tcatccagga gggaataaac 780 taactgaatc tagatctcaa tcaatgattg tagcttgcag gaagataatc agaagatcaa 840 tagttgcatc aaacccacta gagctagctg tagagattgc aaataagact gtgatagaca 900 ctgaaccttt aaagtcatgt ctggcagccc tagatggagg tgatgtagcc tgtgacataa 960 taagagctgc attaggatta aaaattagac aaagacaaag atttgggaga cttgaactaa 1020 agagaatatc agggagagga ttcaaaaatg atgaagagat attaatcgga aacggaacaa 1080 tacaaaagat tggaatatgg gacggagaag aggaattcca tgtaagatgt ggtgaatgca 1140 gggggatatt gaaaaaaagc aaaatgagaa tggaaaaact actgataaat tcagccaaaa 1200 aggaggacat gaaagattta ataatcttat gcatggtatt ttctcaagac accaggatgt 1260 tccaaggagt gagaggagag ataaattttc ttaatcgagc aggccaactt ttatccccca 1320 tgtaccaact ccaacgatac tttttgaata ggagcaatga cctttttgat caatggggat 1380 atgaggaatc acctaaagca agtgagctac atgggataaa tgaattaatg aatgcatctg 1440 actatacatt gaaaggggtt gtagtaacaa aaaatgtgat tgatgatttt agttctactg 1500 aaacagaaaa agtatctata acaaaaaatc ttagtttaat aaaaaggact ggggaagtta 1560 taatgggagc caatgacgta agtgaattag aatcacaagc acagctaatg ataacgtatg 1620 atacacccaa gatgtgggaa atgggaacaa ccaaagaact ggtacaaaac acttaccaat 1680 gggtgcttaa aaatttagta acattgaagg ctcagtttct tttgggaaaa gaagacatgt 1740 tccaatggga tgcatttgaa gcatttgaaa gcataatccc tcagaagatg gctggtcagt 1800 acagtggatt tgcaagagca gtgctcaaac aaatgagaga ccaagaggtt atgaaaactg 1860 accaattcat aaaattgttg cctttctgtt tttcgccacc aaaattaagg agcaatggag 1920 agccttatca atttttgagg cttatgctga aaggaggagg ggaaaatttc atcgaagtaa 1980 ggaaagggtc ccccttgttc tcctacaatc cacaaacgga aatcctaact atatgcggca 2040 gaatgatgtc attaaaagga aaaattgagg atgaagaaag aaatagatca atggggaatg 2100 cagtactggc aggctttctt gttagtggca aatatgaccc agatcttgga gatttcaaaa 2160 ccattgagga acttgaaaga ctaaaaccgg gagaaaaagc caacatctta ctttaccaag 2220 gaaagcccgt taaagtagtt aaaaggaaaa gatatagtgc tttatccaat gatatttcac 2280 aagggattaa gagacaaaga atgacagttg agtccatggg gtgggccttg agctaatata 2340 aatttatcca tcaattcaat aaatacaatt gagtgaaaaa tgctcgtgtt tctact 2396 <210> 2 <211> 2368 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 2 agcagaagcg gagctttaag atgaatataa atccatattt tcttttcata gatgtaccta 60 tacaggcagc aatttcaaca acattcccat acaccggtgt tcccccttat tctcatggaa 120 cgggaacagg ctacacaata gacaccgtga ttagaacaca cgagtactca aacaagggaa 180 aacaatacat ttctgatgtt acaggatgtg taatggtaga tccaacaaat gggccattac 240 ccgaagacaa tgaaccgagt gcctatgcac aattggattg tgttctggag gctttggata 300 gaatggatga agaacatcca ggtctgtttc aagcagcctc acagaatgcc atggaggcac 360 taatggtcac aacagtggac aaattgactc aggggagaca gacctttgat tggacggtgt 420 gtagaaacca acctgctgca acggcactga acacaacaat aacctctttt aggttgaatg 480 atttaaatgg agccgacaag ggtggattag tgcccttttg ccaagatatc attgattcat 540 tagacaaacc tgaaatgatt ttcttctcag taaagaatat aaagaaaaaa ttgcctgcta 600 aaaacagaaa gggtttcctt ataaaaagaa tacctatgaa ggtaaaagac agaataacaa 660 gagtggaata catcaaaaga gcattatcat taaacacaat gactaaagat gctgaaagag 720 gcaaactaaa aagaagagca attgccaccg ctgggataca aatcagagga tttgtattag 780 tagttgaaaa cttggctaaa aatatctgtg aaaatctaga gcaaagtggt ttacccgtag 840 gtgggaacga aaagaaggcc aaactatcaa atgcagtggc taaaatgctc agtaattgtc 900 caccaggagg gatcagtatg actgtgacag gagacaatac taaatggaat gaatgcttaa 960 atccaagaat ctttttggct atgactgaaa gaataaccag agacagccca atttggttcc 1020 gggatttttg tagtatagca ccggtcttgt tctccaataa aatagctaga ttgggaaaag 1080 ggttcatgat aacaagtaaa acaaaaagac taaaagctca aataccttgt cccgatctgt 1140 ttaatatacc attagaaaga tataatgaag aaacaagggc aaaactgaaa aagctaaaac 1200 ctttcttcaa tgaagaagga acggcatctc tttcgccagg aatgatgatg ggaatgttta 1260 atatgctatc tacagtatta ggagtagccg cactagggat aaaaaacatt ggaaacaaag 1320 aatacttatg ggatggactg cagtcttccg atgattttgc tctgtttgtt aatgcaaaag 1380 atgaagagac atgtatggaa ggaataaacg atttttaccg aacatgtaag ctattgggaa 1440 taaacatgag caaaaagaaa agttactgta atgaaactgg gatgtttgaa tttaccagca 1500 tgttttacag agatggattt gtatctaatt ttgcaatgga actcccttca tttggagtcg 1560 ctggagtgaa tgaatcagca gacatggcaa taggaatgac aataataaag aacaatatga 1620 tcaacaatgg gatgggccca gcaacggcac aaacagccat acaattattc atagctgatt 1680 atagatacac ctacaaatgc cacaggggag attccaaagt ggaagggaag agaatgaaaa 1740 ttataaagga gctatgggaa aacactaaag gaagagatgg tctattagta gcagatggtg 1800 ggcctaatct ttacaatttg agaaacctgc atattccaga aatagtatta aaatacaaca 1860 taatggaccc tgagtacaaa ggacggttac tgcatcctca aaatcccttt gtaggacatt 1920 tgtctattga gggtatcaaa gaagcagata taacacctgc acatggccca ataaagaaaa 1980 tggactacga tgcggtatct ggaactcata gttggagaac caaaaggaac agatctatac 2040 taaacactga tcagaggaac atgattcttg aggaacaatg ctacgctaag tgttgcaacc 2100 tttttgaggc ttgctttaac agtgcgtcat acaggaaacc agtaggccag cacagcatgc 2160 ttgaagctat ggcccacaga ttaagaatgg atgcacgact ggactatgag tcaggaagga 2220 tgtcaaaaga ggatttcgaa aaagcaatgg ctcaccttgg tgagattggg tacatgtaag 2280 ctccggaaat gtctatgggg ttattggtca tcgttgaata catgcggtgc acaaatgatt 2340 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cccttagtat 780 cagttacacc caaaaagttg aaatgggagg acctgagacc catagggcct cacatttaca 840 accatgagct accagaagtt ccatataatg cctttctcct catgtctgat gagttggggc 900 tggccaatat gactgaagga aagtccaaga aaccgaagac cttagctaag gaatgtctag 960 aaaggtattc aacactacgt gatcaaactg acccaatatt gataatgaaa agcgaaaaag 1020 ctaacgaaaa cttcttatgg aggttatgga gggactgtgt aaatacaata agcaatgagg 1080 aaacaggcaa cgaattacag aaaaccaatt atgccaagtg ggccacagga gatggactaa 1140 cataccaaaa aataatgaaa gaagtagcaa tagatgacga aacgatgtac caagaagaac 1200 ccaaaatacc caataaatgt agagtggctg cttgggttca ggcagagatg aatctactga 1260 gtactctgac aagtaaaagg gccctggatc tgccagaaat agggccagat gtagcacccg 1320 tggagcatgt agggagtgaa agaaggaaat actttgttaa tgaaatcaac tactgtaaag 1380 cctctacagt tatgatgaag tatgtacttt ttcacacttc attattaaat gaaagcaatg 1440 ctagtatggg aaaatataaa gtaataccaa tcaccaacag agtggtaaat ggaaaagggg 1500 aaagctttga catgctttat ggtctggcgg ttaaggggca atctcatttg cggggggaca 1560 cggatgttgt aacagttgtg actttcgagt ttagtagtac agatcctaga gtggactcag 1620 gaaagtggcc aaaatatact gtctttaaaa ttggctccct atttgtgagt ggaagagaaa 1680 aacctgtgta cctatattgc cgagtgaatg gtacaaacaa aatccaaatg aaatggggaa 1740 tggaagctag aagatgtctg cttcaatcaa tgcaacaaat ggaggcaatt gttgatcaag 1800 aatcatcgat acaagggtat gatatgacca aagcttgttt caagggagac agagtgaata 1860 atcccaaaac tttcagtatt gggactcagg aaggcaaact agtaaaaggg tcctttggga 1920 aagcactaag agtaatattc accaaatgtt tgatgcatta tgtatttgga aatgctcaat 1980 tggaggggtt tagtgccgaa tctaggagac ttctactgtt aattcaggca ttaaaagaca 2040 ggaagggccc ttgggtattt gacttagagg gaatgtactc tggagtagag gaatgtatta 2100 gtaacaatcc ttgggtaata cagagtgcat actggtttaa tgaatggttg ggcattgaaa 2160 aagaaggaag taaagtgtta gaatcaatag atgaaataat ggatgaatga acgaagggca 2220 tagcgctcaa tttagtacta ttttgttcat tatgtattta aacatccaat aaaagaattg 2280 agaattaaaa atgcacgtgt ttctact 2307 <210> 4 <211> 1882 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 4 agcagaagcg ttgcattttc taatatccac aaaatgaagg caataattgt actactcatg 60 gtagtaacat ccaatgcaga tcgaatctgc actgggataa catcgtcaaa ctcacctcat 120 gtggttaaaa ctgccactca aggggaagtc aatgtgactg gtgtgatacc actaacaaca 180 acacctacta gatctcattt tgcaaatctc aaaggaacac agaccagagg aaaactatgc 240 ccaaactgtt ttaactgcac agatctggac gtggccttgg gcagaccaaa atgcatgggg 300 aacatacctt ccgcaaaagt ctcaatactc catgaagtca aacctgttac atctggatgc 360 tttcctataa tgcacgacag aacaaaaatc agacaactac ctaatcttct cagaggatat 420 gaaaacatca ggttatcaac cagtaatgtt atcaatacag agacggcacc aggaggaccc 480 tacaaggtgg ggacctcagg atcttgccct aacgttacta atgggaacgg cttcttcaac 540 acaatggctt gggttatccc aaaagacaac aacaagatag caataaatcc agtaacagta 600 gaagtaccat acatttgttc agaaggggaa gaccaaatta ctgtttgggg gttccactct 660 gatgacaaaa cccaaatgga aagactctat ggagactcaa atcctcaaaa gttcacctca 720 tctgccaatg gagtaaccac acattatgtt tctcagattg gtggcttccc aaatcaaaca 780 gaagacgaag ggctaaaaca aagcggcaga attgttgttg attacatggt acaaaaacct 840 ggaaaaacag gaacaattgt ttatcaaaga ggcattttat tgcctcaaaa agtgtggtgc 900 gcaagtggca ggagcaaggt aataaaaggg tccttgcctt taattggtga agcagattgc 960 ctccacgaaa agtacggtgg attaaataaa agcaagcctt actacacagg agagcatgca 1020 aaggccatag gaaattgccc aatatgggtg aaaacaccct tgaagctggc caatggaacc 1080 aaatatagac cgcctgcaaa actattaaag gaaagaggtt tcttcggagc tattgctggt 1140 ttcttggaag gaggatggga aggaatgatt gcaggttggc acggatacac atctcatgga 1200 gcacatggag tggcagtggc agcagacctt aagagtacac aagaagctat aaacaagata 1260 acaaaaaatc tcaactcttt aagtgagcta gaagtaaaaa accttcaaag actaagcgga 1320 gcaatgaatg agcttcacga cgaaatactc gagctagacg aaaaagtgga tgatctaaga 1380 gctgatacaa taagctcaca aatagagctt gcagtcttgc tttccaacga agggataata 1440 aacagtgaag atgagcatct tttggcactt gaaagaaaac tgaagaaaat gctgggcccc 1500 tctgctgtag aaatagggaa tgggtgcttt gaaaccaaac acaaatgcaa ccagacttgc 1560 ctagacagga tagctgctgg cacctttaat gcaggagatt tttctcttcc cacttttgat 1620 tcattaaaca ttactgctgc atctttaaat gatgatggct tggataatca tactatactg 1680 ctctactact caactgctgc ttctagcttg gctgtaacat tgatgatagc tatcttcatt 1740 gtctacatgg tctccagaga caatgtttct tgttccatct gtctgtgagg gagattaagc 1800 cctgtgtttt cctttactgt agtgctcatt tgcttgtcac cattacaaag aaacgttatt 1860 gaaaaatgct cttgttacta ct 1882 <210> 5 <211> 1557 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 5 agcagaagca gagcatattc ttagaactga agtgaacagg ccaaaaatga acaatgctac 60 cttcaactgt acaaacatta accctattac tcacatcagg gggagtatta ttatcactat 120 atgtgtcagc ctcattgtca tacttattgt attcggatgt attgctaaaa ttttcatcaa 180 caaaaacaac tgcaccaaca atgtcattag agtgcacaaa cgcatcaaat gcccagactg 240 tgaaccattc tgcaacaaaa gagatgacat ttccaccccc agagccggag tggacatacc 300 ctcgtttatc ttgccagggc tcaacctttc agaaggcact cctaattagc cctcataggt 360 tcggagagat caaaggaaac tcagctccct tgataataag agaacctttt gttgcttgtg 420 gaccaaaaga atgcagacac tttgctctga cccattatgc agctcagccg gggggatact 480 acaatggaac aagaaaggac agaaacaagc tgaggcatct agtatcagtc aaattgggaa 540 aaatcccaac tgtggaaaac tccattttcc acatggcagc ttggagcgga tccgcatgcc 600 atgatggtag agaatggaca tatatcggag ttgatggtcc tgacaatgat gcattggtca 660 aaataaaata tggagaagca tatactgaca catatcattc ctatgcacac aacatcctaa 720 gaacacaaga aagtgcctgc aattgcatcg ggggagattg ttatcttatg ataacagacg 780 gctcagcttc aggaattagt aaatgcagat ttcttaaaat tagagagggt cgaataataa 840 aagaaatact tccaacagga agagtggagc acactgaaga gtgcacatgc gggttcgcca 900 gcaataaaac catagaatgt gcctgtagag acaacagtta cacagcaaaa agaccctttg 960 tcaaattaaa tgtggaaact gatacagctg aaataagatt gatgtgcaca aagacttatc 1020 tggacactcc cagaccggat gatggaagca tagcagggcc ttgcgaatct aatggagaca 1080 agtggcttgg aggcatcaaa ggaggatttg tccatcaaag aatggaatct aagattggaa 1140 gatggtactc ccgaacgatg tctaaaacta acagaatggg gatggaactg tatgtaaagt 1200 atgatggtga cccatggact gacagtgatg ctcttactct tagtggagta atggtttcca 1260 tagaagaacc tggttggtat tcttttggct tcgaaataaa ggacaagaaa tgtgatgtcc 1320 cttgtattgg gatagagatg gtacacgatg gtggaaaaga tacttggcat tcagctgcaa 1380 cagccattta ctgtttgatg ggctcaggac aattgctatg ggacactgtc acaggcgttg 1440 atatggcttt ataatagagg aatggttgga tctgttctaa accctttgtt cctattttat 1500 ttgaacagtt gttcttacta gatttaattg tttctgaaaa atgctcttgt tactact 1557 <210> 6 <211> 1841 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 6 agcagaagca cagcattttc ttgtgagctt cgagcactaa taaaactgaa aatcaaaatg 60 tccaacatgg atattgacag tataaatacc ggaacaatcg ataaaacacc agaagaactg 120 actcccggaa ccagtggggc aaccagacca atcatcaagc cagcaaccct tgctccgcca 180 agcaacaaac gaacccgaaa tccatcccca gaaaggacaa ccacaagcag tgaaaccaat 240 atcggaagga aaatccaaaa gaaacaaacc ccaacagaga taaagaagag cgtctacaac 300 atggtggtaa aactgggtga attctacaac cagatgatgg tcaaagctgg acttaatgat 360 gacatggaaa ggaatctaat ccaaaatgca caagctgtgg agagaatcct attggctgca 420 actgatgaca agaaaactga ataccaaaag aaaaggaatg ccagagatgt caaagaaggg 480 aaagaagaaa tagaccacag caagacagga ggcacctttt ataagatggt aagagatgat 540 aaaaccatct acttcagccc tataaaaatt acctttttaa aagaagaggt gaaaacaatg 600 tataagacca ccatggggag tgatggtttc agtggactaa atcacattat gattggacat 660 tcacagatga acgatgtctg tttccaaaga tcaaaggcac tgaaaagggt tggacttgac 720 ccttcattaa tcagtacttt tgccggaagc acactaccca gaagatcagg tacaactggt 780 gttgcaatca aaggaggtgg aactttagtg gcagaagcca tccgatttat aggaagagca 840 atggcagaca gagggctact gagagacatc aaggccaaga cggcctatga aaagattctt 900 ctgaatctga aaaacaagtg ctctgcgcct caacaaaagg ctctagttga tcaagtgatc 960 ggaagtagga acccagggat tgcagacata gaagacctaa ctctgcttgc cagaagcatg 1020 gtagttgtca gaccctctgt agcgagcaaa gtggtgcttc ccataagcat ttatgctaaa 1080 atacctcaac taggattcaa tatcgaagaa tactctatgg ttgggtatga agccatggct 1140 ctttataata tggcaacacc tgtttccata ttaagaatgg gagatgacgc aaaagataaa 1200 tctcaactat tcttcatgtc gtgcttcgga gctgcctatg aagatctaag agtgttatct 1260 gcactaacgg gcaccgaatt taagcctaga tcagcactaa aatgcaaggg tttccatgtc 1320 ccggctaagg agcaagtaga aggaatgggg gcagctctga tgtccatcaa gcttcagttc 1380 tgggccccaa tgaccagatc tggagggaat gaagtaagtg gagaaggagg gtctggtcaa 1440 ataagttgca gccctgtgtt tgcagtagaa agacctattg ctctaagcaa gcaagctgta 1500 agaagaatgc tgtcaatgaa cgttgaagga cgtgatgcag atgtcaaagg aaatctactc 1560 aaaatgatga atgattcaat ggcaaagaaa accagtggaa atgctttcat tgggaagaaa 1620 atgtttcaaa tatcagacaa aaacaaagtc aatcccattg agattccaat taagcagacc 1680 atccccaatt tcttctttgg gagggacaca gcagaggatt atgatgacct cgattattaa 1740 agcaataaaa tagacactat ggctgtgact gtttcagtac gtttgggatg tgggtgttta 1800 ctcttattga aataaatgta aaaaatgctg ttgtttctac t 1841 <210> 7 <211> 1191 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 7 agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt 60 tcactaatag aagatggaga aggcaaagca gaactagctg aaaaattaca ctgttggttc 120 ggtgggaaag aatttgacct agattctgct ttggaatgga taaaaaacaa aaggtgccta 180 actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccaa 240 gaaagaaaaa ggagattcat cacagagccc ctgtcaggaa tgggaacaac agcaacaaag 300 aagaaaggcc taattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtaagctt tcatgaagca 360 tttgaaatag cagaaggcca cgaaagctca gcattactat attgtcttat ggtcatgtac 420 ctaaaccctg aaaactattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttatgcgag 480 aaacaagcat cgcactcgca tagagcccat agcagagcag caaggtcttc ggtacctgga 540 gtaagacgag aaatgcagat ggtttcagct atgaacacag caaagacaat gaatggaatg 600 ggaaagggag aagacgtcca aaaactagca gaagagctgc aaaacaacat tggagtgttg 660 agatctctag gagcaagtca aaagaatgga gaaggaattg ccaaagatgt aatggaagtg 720 ctaaaacaga gctctatggg aaattcagct cttgtgagga aatacttata atgctcgaac 780 cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc atggcttgga 840 caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa ataaggaatc 900 caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac caaaaggaaa 960 tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta ttgggtgacc 1020 acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa acagttttgg 1080 aggtggaaga attgcaatga gcccaatttt cactgtattt cttactatgc atttaagcaa 1140 attgtaatca atgtcagtga ataaaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac t 1191 <210> 8 <211> 1096 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 8 agcagaagca gaggatttat ttagtcactg gcaaacggaa agatggcgga caacatgacc 60 acaacacaaa ttgaggtggg tccgggagca accaatgcca ctataaactt tgaagcagga 120 attctggagt gctatgaaag gttttcatgg caaagagccc ttgactatcc tggtcaagac 180 cgcctacaca gactaaaacg aaaattagaa tcaagaataa agactcacaa caagagtgag 240 cctgagaata aaaggatgtc tcttgaagag agaaaagcaa ttggggtaaa aatgatgaaa 300 gtgcttctgt ttatggatcc ctctgctgga attgaagggt ttgagccata ctgtgtgaaa 360 aatccctcaa ctagcaaatg tccaaattac gattggaccg attaccctcc aaccccagga 420 aagtaccttg atgacataga agaagagccg gaaaatgtcg atcacccaat tgaggtagta 480 ttaagggaca tgaacaataa agatgcacga caaaagataa aggatgaagt aaacactcag 540 aaagagggga aattccattt gacaataaaa agggatatac gtaatgtgtt gtccttgaga 600 gtgttggtga acggaacctt cctcaagcac cctaatggag acaagtcctt atcaactctt 660 catagattga atgcatatga ccagaatgga gggcttgttg ctaaacttgt tgctactgat 720 gatcttacag tggaggatga aaaagatggc catcggatcc tcaactcact cttcgagcgt 780 tttgatgaag gacattcaaa gccaattcga gcagctgaaa ctgcggtggg agtcttatcc 840 caatttggtc aagagcaccg attatcacca gaagagggag acaattagac tggccacgga 900 agaactttat ctcttgagta aaagaattga tgatagtata ttgttccaca aaacagtaat 960 agctaacagc tccataatag ctgacatgat tgtatcatta tcattactgg aaacattgta 1020 tgaaatgaag gatgtggttg aagtgtacag caggcagtgc ttatgaatgt aaaataaaaa 1080 tcctcttgtt actact 1096 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic peptide. <400> 9 Asn Lys Arg Asp Asp Ile Ser Thr Pro Arg Ala Gly Val Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 10 gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 11 ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc 33 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> 11 <223> N = A, T G or C <400> 12 ttttgctccc ngagacg 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> n = A, T, G or C <400> 13 cgtctcnggg agcaaaa 17 <210> 14 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 14 tattagtaga a 11 <210> 15 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 15 gggagcaaaa 10 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 16 gggttattag tagaa 15 <210> 17 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 17 ttctactaat aaccc 15 <210> 18 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 18 ttttgctccc ccc 13 <210> 19 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 19 ggggggagca aaa 13 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 20 gccaaaaatg aacaatgcta cc 22 <210> 21 <211> 11 <212> DNA <213> Influenza virus B/Lee/40 <400> 21 ctaaaatttt a 11 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 22 gccaaaagcg aacaatgcta cc 22 <210> 23 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 23 cttaaatttt a 11 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 24 gccaaaagcg acaatgctac c 21 <210> 25 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 25 cttaaatttt a 11 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 26 gccaaaagcg aaacaatgct acc 23 <210> 27 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <400> 27 cttaaatttt a 11 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> 7 <223> N = A, T, G or C <400> 28 cgtctcntat tagtagaa 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic oligonucleotide. <220> <221> misc_feature <222> 12 <223> N = A, T, G or C <400> 29 ttctactaat angagacg 18

Claims (44)

  1. 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하지 않는 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함하고, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 막 단백질 유전자에 대하여 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 그 돌연변이 중 하나가 막횡단 영역에 상응하는 막 단백질 유전자의 부위에 있지 않는 것인, 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 적어도 하나의 아미노산 치환을 코딩하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 개시자 메티오닌의 코돈에서의 치환을 코딩하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자의 하나의 돌연변이가 개시자 메티오닌의 코돈 대신 중지 코돈인 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자의 하나의 돌연변이가 막 단백질의 코딩 부위에 있는 중지 코돈인 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  6. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  7. 제6항에 있어서, 상기 결실이 막 단백질의 리딩 프레임을 변화시키는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  8. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 삽입이 막 단백질의 리딩 프레임을 변화시키는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  10. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하고 아미노산 치환을 코딩하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  11. 제1항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함하고 아미노산 치환을 코딩하는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  12. 제1항에 있어서, 상기 막 단백질이 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 단백질인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  13. 제1항에 있어서, 상기 막 단백질이 B형 인플루엔자 바이러스의 NB 단백질인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  14. 제1항에 있어서, 상기 막 단백질이 C형 인플루엔자 바이러스의 CM1 단백질인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  15. 제1항에 있어서, 병원체의 이종 면역원성 단백질 또는 치료 단백질을 추가로 포함하는 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  16. 제1항에 있어서, 병원체의 이종 면역원성 단백질 유전자 또는 치료 단백질 유전자를 추가로 포함하는 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  17. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 바이러스의 시험관 내 복제를 변화시키지 않지만 생체 내에서 바이러스의 약독화와 관련되어 있는 것인 단리된 재조합 인플루엔자 바이러스.
  18. 제1항의 단리된 재조합 바이러스를 포함하는 백신.
  19. (ⅰ) 숙주 세포를 복수의 하기 a) 및 b)를 포함하는 인플루엔자 벡터와 접촉시켜 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 단계: a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 NA 및 NB에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터 (NB 및 NA에 대한 상기 cDNA 서열이, 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 NB 유전자에 대비해 NB 서열에서 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이 중 하나는 막횡단 영역에 있지 않고, 돌연변이 유전자에서 그의 존재가, 돌연변이 유전자가 숙주세포에서 전사되고 번역될 때, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 생성하지 않고, 임의로 기능적 NA 단백질을 생성시킴); 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이 러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터; 및
    (ⅱ) 바이러스를 단리하는 단계
    를 포함하는, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하지 않는 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스의 제조방법.
  20. (ⅰ) 숙주 세포를 복수의 하기 a) 및 b)를 포함하는 인플루엔자 벡터와 접촉시켜 재조합 인플루엔자 바이러스를 생성시키는 단계: a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 전사 종결 서열에 연결된 돌연변이 M2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터 (상기 돌연변이 M2 cDNA가, 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 M2 유전자에 대비해 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이 중 하나는 막횡단 영역에 있지 않고, 돌연변이 유전자에서 그의 존재가, 돌연변이 유전자가 숙주세포에서 전사되고 번역될 때, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 생성하지 않음); 및 b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하 게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터; 및
    (ⅱ) 바이러스를 단리하는 단계
    를 포함하는, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 코딩하지 않는 돌연변이 막 단백질 유전자를 포함하는 재조합 인플루엔자 바이러스의 제조방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 적어도 하나의 아미노산 치환을 코딩하는 것인 방법.
  22. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자의 하나의 돌연변이가 개시자 메티오닌의 코돈 대신 중지 코돈인 방법.
  23. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자의 하나의 돌연변이가 막 단백질의 코딩 부위의 중지 코돈인 방법.
  24. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 결실이 막 단백질의 리딩 프레임을 변화시키는 것인 방법.
  26. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 삽입이 막 단백질의 리딩 프레임을 변화시키는 것인 방법.
  28. 제19항 또는 제20항에 있어서, 적어도 하나의 돌연변이가 개시자 메티오닌의 치환을 코딩하는 것인 방법.
  29. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 포함하고 적어도 하나의 아미노산 치환을 코딩하는 것인 방법.
  30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 돌연변이 막 단백질 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입을 포함하고 아미노산 치환을 코딩하는 것인 방법.
  31. 척추동물을 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스와 접촉시키는 것을 포함하는, 척추동물을 면역화하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 척추동물이 조류인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 척추동물이 포유류인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 척추동물이 인간인 방법.
  35. a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 NB 및 NA에 대한 인플루엔자 바이러스 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 및 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터 (NB 및 NA에 대한 상기 cDNA 서열이, 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 NB 유전자에 대비해 NB에 대한 서열에서 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이 중 하나는 막횡단 영역에 있지 않고, 돌연변이 유전자에서 그의 존재가, 돌연변이 유전자가 숙주세포에서 전사되고 번역될 때, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 생성하지 않고, 임의로 기능적 NA 단백질을 생성시킴); 및
    b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 돌연변이 NB를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터
    를 포함하는 인플루엔자 벡터를 복수개 포함하는 조성물.
  36. a) 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 PB2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 HA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NP cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NA cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 M1 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 전사 종결 서열에 연결된 인플루엔자 바이러스 NS cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 전사 종결 서열에 연결된 돌연변이 M2 cDNA에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터 (상기 돌연변이 M2 cDNA가, 기능적 막 단백질을 코딩하는 상응하는 M2 유전자에 대비해 적어도 두 개의 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이 중 하나는 막횡단 영역에 있지 않고, 돌연변이 유전자에서 그의 존재가, 돌연변이 유전자가 숙주세포에서 전사되고 번역될 때, 기능적 막 단백질 또는 그의 기능적 부분을 생성하지 않음); 및
    b) 인플루엔자 바이러스 PA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 PB2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NP를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 HA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 NA를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프 로모터를 포함하는 벡터, 인플루엔자 바이러스 M1을 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터 및 인플루엔자 바이러스 NS2를 코딩하는 DNA 분절에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터로부터 선택되는 적어도 두 개의 벡터
    를 포함하는 인플루엔자 벡터를 복수개 포함하는 조성물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 안티센스 배향으로 관심있는 DNA 단편에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 벡터를 추가로 포함하는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 벡터가 병원체의 면역원성 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 치료 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 포함하는 것인 조성물.
  39. 제19항 또는 제20항의 방법에 의해 제조된 단리된 바이러스.
  40. 제1항 또는 제39항의 바이러스와 접촉된 숙주세포.
  41. 인플루엔자 바이러스 B/Lee의 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분절, 또는 그의 일부를 포함하고, 서열 1 내지 8 중 하나의 상응하는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는, HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M1, NB 또는 NS, 또는 그의 일부를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레 오티드의 상보물.
  42. 인플루엔자 바이러스 B/Lee의 단백질 중 적어도 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분절, 또는 그의 일부를 포함하고, 서열 1 내지 8 중 하나 또는 그의 상보물에 혼성화하는, HA, NA, PB1, PB2, PA, NP, M1, NB 또는 NS, 또는 그의 일부를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레오티드의 상보물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 서열 1 내지 8 중 하나 또는 그의 상보물과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  44. 제42항에 있어서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드가 서열 1 내지 8 중 하나에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
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