JP2014527799A - 変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス - Google Patents

変異型ｐｂ２遺伝子セグメントを有する弱毒化生ワクチンとしてのインフルエンザウイルス Download PDF

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Abstract

本発明は、例えば多価ワクチンを生成するのに有用な、ＰＢ２ノックアウトウイルスである生体含有可能な組換えインフルエンザウイルス、該ウイルスの作製方法、および使用方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年８月２６日に出願された米国特許出願第６１／５２７、９３５号の出願日の利益を主張し、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
政府の権利に関する声明
本発明は、米国政府の支援を受け、米国国立衛生研究所により授与されたＡＩ０４７４４６を用いてなされた。米国政府は本発明についての一定の権利を有する。
インフルエンザウイルスは、毎年世界中にエピデミックを、時にはパンデミックを引き起こす。Ａ型インフルエンザウイルスは、毎年、接触伝染性の呼吸器疾患、軽度から重度の発熱、そして、時として死に至るという特徴を有するエピデミックを引き起こす（Ｐａｌｅｓｅ＆Ｓｈａｗ、２００７）。保健システムと世界経済に対する大きな負担を回避すべく、この命を奪いかねないウイルスを予防しコントロールすることに焦点を当てたワクチンおよび治療用抗ウイルスの研究が認可されている。鋭意研究の結果、インフルエンザ感染に対する治療的介入の発見に至ったが、しかしながら、ウイルスのポリメラーゼはエラーが発生しやすいので、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）インフルエンザウイルスタンパク質は抗原連続変異または遺伝的浮動として知られる点突然変異を受けやすい（Ｌｉｎら、２００４）。抗原連続変異または遺伝的浮動により、ウイルスは宿主の免疫応答から逃れることができ、あるいは、ある種の薬物に対し耐性になる結果になる（Ｍｏｓｓら、２０１０）。ワクチンの接種は、インフルエンザ関連の罹患および死亡を予防する最も有効な手段の一つである。
現在利用可能な治療的および予防的介入として、２つのタイプのワクチン（すなわち、不活化および生ワクチン）、並びに２つのクラスの抗ウイルス剤（すなわち、アマンタジンおよびリマンタジン等のＭ２イオンチャネル遮断薬、並びに、オセルタミビルおよびザナミビル等のノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤）がある（Ｄａｖｉｅｓら、１９６４；Ｈａｙｄｅｎ、２００１）。それにもかかわらず、季節性インフルエンザは、公衆衛生疫学的に最も強力な影響の一をもたらす伝染性疾患である。さらに、２００９年から２０１０年のインフルエンザシーズン中には、新型のＡ型インフルエンザウイルス株である２００９Ｈ１Ｎ１のパンデミックウイルスが出現して世界中に広がり、これにより、４０年ぶりにインフルエンザパンデミックとなり、地球規模で保健および経済に相当な影響を与えた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ａｂｏｕｔ／ｄｉｓｅａｓｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）。米国だけで、２７４０００人の入院および１２４７０人の死亡を含む推定６１００万のＨ１Ｎ１の症例が報告された（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｆｌｕ／ａｂｏｕｔ／ｓｅａｓｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）。
若年者、高齢者、または免疫不全者は、免疫系が未発達または低下しているため、特にインフルエンザなどの感染症に感染しやすい。日本で実施されたいくつかの研究により、学齢期の子供たちの間でインフルエンザワクチンの接種率が高いと、インフルエンザ感染を防ぎ、地域社会における感染が減少し、高齢者の発症および死亡も減少することが示唆された；２００１年の研究において、年間約３７０００〜４９０００人の死亡が予防されたが、学童のワクチン接種を中止したときは超過死亡率が上昇したと報告されている（Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、２００１）。
現在利用可能な不活化インフルエンザワクチンは、特に幼児や高齢者において、持続期間が短くまた有効性も限られている。不活化ワクチンは、細胞介在性の免疫を効果的に惹起できないため、一般に、弱毒化生ワクチンよりも免疫原性が低い、したがってあまり有効ではなく、そして、この弱毒化生ワクチンは、アメリカのような限られた数の国でしか使用が承認されていない。弱毒化生ウイルスの経鼻投与が小児にとって不活化ワクチンよりも優れていると考えられており、これは弱毒化生ウイルスが長期間持続する効力と関連して強力な粘膜免疫ならびに体液性および細胞性の免疫応答を誘発するためである（Ｃｏｘら、２００４）。しかし、弱毒化生ワクチンは現在、２歳から４９歳までの慢性的な病状がなく、妊娠中でも免疫低下でもない者にしか許可されていない。認可済み弱毒化生インフルエンザウイルスは、安全でかつ、復帰変異ウイルスの出現といった潜在的なリスクについて安定していると考えられているにもかかわらずである。
また、不活化ワクチンは、孵化卵においてウイルス増殖をするので、非経口的な投与により副作用又はアナフィラキシー反応と結びつくこともあり、また、これらのワクチンにおける卵タンパクの傾向として、感受性の高い宿主において過敏反応が生じてアレルギーを誘発することもある。卵ベースのワクチンの増殖が成功する前提条件として、孵化鶏卵に適した変異体を選択することがあるが、この基準に従うと、もはや循環ウイルスの抗原性と一致しない場合がある。さらに困難なことに、鳥インフルエンザパンデミックの爆発的な襲来を予測すると、鶏の在庫が枯渇する可能性が考えられ、よってワクチンの大量生産が危うくなる可能性がある。
弱毒化生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）は、もともとインフルエンザＡ型株（Ａ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／６／６０Ｈ２Ｎ２）及びＢ型株（Ｂ／Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ／１／６６）を低温訓化したものであり、特定の病原体をもたない初代ニワトリ腎細胞中で低温において連続的に継代したものである（Ｍａａｓｓａｂら、１９６８）。このプロセスの間に、ウイルスは、マスター供与体ウイルス（ＭＤＶ）の内部タンパク質遺伝子セグメント（すなわち、「内部」非グリコシル化タンパク質をコードする遺伝子）中に、低温訓化（ｃａ）、温度感受性（ｔｓ）、および弱毒化（ａｔｔ）という表現型を生ずるような複数の変異を獲得する。ＭＤＶは、ＬＡＩＶ遺伝子の主骨格であり、毎年、現在のインフルエンザウイルスのものからヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）遺伝子について更新されて、年ごとの三価製剤が製造される。よって、これら３種のインフルエンザウイルス株はそれぞれ、ｃａ、ｔｓ、ａｔｔ ＭＤＶ由来の６つの内部遺伝子セグメント、並びに世界保健機関（ＷＨＯ）及び米国公衆衛生局で毎年選択される野生型インフルエンザウイルス由来の（ＨＡおよびＮＡタンパク質をコードする）２つの遺伝子セグメント、を含む６：２遺伝子再集合体ウイルスである。
いくつかの遺伝子における複数の遺伝子座がＬＡＩＶワクチンウイルスのｃａ、ｔｓ、およびａｔｔの表現型を制御するので、ＬＡＩＶが復帰してこれらの表現型を失うとはとても考えにくい（Ｋｅｍｂｌｅら、２００３；Ｍｕｒｐｈｙら、２００２）。インフルエンザウイルスの複製中、ヌクレオチドの位置あたり組み込みエラーが１０-4〜１０-5というエラー率の場合で、各ＭＤＶの弱毒化の表現型は少なくとも５つの点突然変異が関与するという事実（Ｍｕｒｐｈｙら、２００２；Ｓｍｉｔｈら、１９８７）を考慮すると、５つの弱毒化の遺伝子座で突然変異が生じ野生型インフルエンザに戻るＬＡＩＶワクチンウイルスの確率は、少なくとも１０20複製サイクルのうち１つであろう。ワクチン接種を受けた幼児から回収された１３５のワクチン株の研究では、復帰の痕跡は見られなかった（Ｖｅｓｉｋａｒｉら、２００６）。
最初の経鼻投与ＬＩＡＶは、２００３年に米国で使用が承認され、ＦｌｕＭｉｓｔ（登録商標）［インフルエンザウイルス生ワクチン、経鼻用］として米国で販売された。ＬＡＩＶワクチンウイルスは、もともとは古典的に再集合を利用して製造されていたが、２００８年、その工程は逆遺伝学技術に移行した。その内の遺伝子再集合体ウイルスは、細胞培養における逆遺伝学技術を用いて調製される。これは、インフルエンザ遺伝子を含むＤＮＡプラスミドからインフルエンザウイルスを生成することができる技術である。三種のワクチン株を一緒に調合して単用量噴霧器入りのＬＡＩＶ三価ワクチンを製造する。経鼻用ＬＡＩＶは現在、２歳から４９歳までの者への使用について米国で承認されている。
弱毒化生ウイルスは、体液性および細胞性の免疫応答を誘発できるので、不活化ワクチンよりも優れており、ひいては、乳児や幼児をより良く防御できると考えられている（Ｃｏｘら、２００４）。特に、弱毒化生ワクチンを経鼻投与すると、長期間持続する防御的効力と関連して強力な粘膜免疫および細胞性応答を誘発する（Ｃｏｘら、２００４）。弱毒化生インフルエンザワクチンウイルスは、主に鼻咽頭粘膜の繊毛上皮細胞で複製し、（粘膜免疫グロブリンＩｇＡ、血清ＩｇＧ抗体、および細胞性免疫を経由して）免疫応答を誘発するが、ＬＡＩＶウイルスは、それより下方の気道および肺におけるような高温ではあまり増殖しない（Ｍｕｒｐｈｙら、２００２；Ｇｒｕｂｅｒら、２００２）。加えて、従来の卵ベースのワクチンの増殖システムに代わり、細胞ベースのもの（例えば、逆遺伝学を利用したウイルスの生成後にウイルスを増幅するのに用いられる細胞）を代替することによるいくつかの利点がある。細胞ベースのワクチン研究は、卵ベースのワクチン研究に比べより経済的に実現可能であり、より迅速で、そして労働密度がより少ないという点で、大きな利点を示し、また、労働密度が少ないので、その製造力をパンデミックの際には需要に合わせて容易にスケールアップできる。また、組換えＤＮＡに基づく技術によりウイルスを遺伝子操作すると、その病原性を安全化しながらウイルスの遺伝的寄生力の開発が可能になる。ウイルスを、複製不能および非病原性にすることができ、または受容宿主に外来遺伝子を導入し発現する操作ができる。
本発明は、多価ワクチンを製造するのに有用で、並びに、病原性および復帰についての安全上の懸念を満たす生体含有可能な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）組換えインフルエンザウイルスであって、該ウイルスは、任意で、外来遺伝子を安定的に発現してもよく、よって効果的に追跡可能で、そしてその複製が容易に評価可能な生体含有可能組換えインフルエンザウイルスを提供する。以下に開示されているように、そのＰＢ２ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のコード領域内に、例えば、ＧＦＰ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子といった蛍光タンパク質遺伝子等のレポーター遺伝子を有するＰＢ２−ノックアウト（ＰＢ２−ＫＯ）インフルエンザウイルスを生成した。ここで、このウイルスの複製はＰＢ２タンパク質を安定的に発現する細胞系に限定される。このレポーター遺伝子をコードするＰＢ２ ｖＲＮＡは、ＰＢ２を発現する細胞中での複製中に安定して子孫ウイルス中に取り込まれ、レポーター遺伝子がウイルス感染細胞中で発現し、この際、組換えＰＢ２ ｖＲＮＡおよびＰＢ２タンパク質ｍＲＮＡ間での組み換えを示す証拠は見られなかった。さらに、異なるウイルス株のＨＡおよびＮＡ遺伝子が容易にＰＢ２−ＫＯウイルスに収容された。細胞変性作用を観察するのではなく、ウイルス感染の指標としてレポーター遺伝子発現を用いることにより、インフルエンザウイルスに対する中和抗体をスクリーニングするための改良アッセイを、このＰＢ２−ＫＯウイルスを用いて確立した。これらの結果により、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、基礎および応用インフルエンザウイルス学の研究用に貴重なツールとなる可能性があること、並びに、例えば、ＰＡ−ＫＯウイルス又はＰＢ１−ＫＯウイルスといった他のポリメラーゼ遺伝子ノックアウトウイルスにも適用可能であることが示唆される。
一の実施形態では、本発明は、ウイルスＲＮＡポリメラーゼサブユニットの一つであってウイルス複製に欠かせないタンパク質であるＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの核酸配列を含まないウイルス遺伝子セグメント（変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント）を有し、単離された感染性生体含有可能インフルエンザウイルスを提供する。細胞培養内にこのようなウイルスを調製するために、トランスにＰＢ２を発現する細胞株を採用し、野生型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント用ではなく、インフルエンザウイルスｖＲＮＡ生産用のベクターと組み合わせ、一の実施形態では、インフルエンザウイルスｍＲＮＡタンパク質生産用のベクターと組み合わせる。得られるウイルスは、トランスにＰＢ２を発現しない細胞、または、ヘルパーウイルスに未感染の細胞に感染しても、ＰＢ２を発現することができないので「生体含有可能な」ウイルスになる。しかし、トランスにＰＢ２を発現する細胞から生産されるビリオンは、ＰＢ２を含む。このような変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントを有する、感染性生体含有可能インフルエンザウイルスを、トランスでＰＢ２を発現する複数の細胞系、例えば、ＰＢ２発現２９３ヒト胚腎臓（２９３）、ヒト肺腺癌上皮（Ａ５４９）、または２、６−結合シアル酸転移酵素を過剰発現するメイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞（ＡＸ４細胞）等、において生成した結果、少なくとも１０4、１０5、１０6、１０7もしくは１０8ＰＦＵ／ｍＬまたはそれ以上の高いウイルス力価が得られた。
ワクチン接種は、インフルエンザ感染に対する予防のための主要な手段である。本明細書に開示されるように、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、正常な未感染細胞（トランスでＰＢ２を発現しない細胞）ではなく、ＰＢ２を発現する細胞において高力価（＞１０8ＰＦＵ／ｍＬ）で複製し、異種インフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を収容し、子孫ＰＢ２−ＫＯビリオン内に連続的継代を通じ維持されるレポーター遺伝子を安定的に取り込み、そしてマウスで弱毒化さたので、ワクチンとしての可能性が示唆される。その抗原発現能およびそのワクチンとしての候補性をマウスモデルにおいて検査した。１用量のみのＰＢ２−ＫＯ（ＧＦＰ）ウイルスで免疫化したマウスの血清、鼻洗浄液、および気管支肺胞洗浄液のサンプルにおいて、不活化インフルエンザワクチンに比べ有意に高いレベルのＩｇＧおよびＩｇＡ抗体が誘導された。様々な致死量のＰＲ８を試みたところ、すべてのＰＢ２−ＫＯウイルス処理マウスが生存した。トランスでＰＢ２を発現する細胞中で生産されたウイルスは、その後宿主細胞（例えば、それでは自身ではＰＢ２を発現せずもしくは含まない、または野生型ＰＢ２ ｖＲＮＡを含まない宿主細胞）に感染すると、少量のＰＢ２タンパク質を搬送するので、限定的なウイルス複製がインビボで起こる。これにより、限られた量（例えば、１ラウンド程度）の複製は起こるが、主要な感染過程を経た複製（例えば、約１０００超のウイルス力価の増幅）は起こらない。インビボでのＫＯウイルスの複製は限定的なので、従来の不活化インフルエンザワクチンによって誘導されるよりも強力な免疫応答が可能になる。これらの免疫マウスが、免疫蛍光による測定によると、レポーターに対する抗体を生産することは注目に値し、これにより、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、多価ワクチンとしての可能性を有することが示唆される。ＰＢ２−ＫＯは、対照と比較して同等かそれ以上の安全性および有効性を示すので、インフルエンザウイルス感染対策として有望である。
一の実施形態では、本発明は、ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＨＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍ（Ｍ１およびＭ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメント、を含む８の遺伝子セグメントを含み、単離された感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルスを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＨＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＡ（ＮＡおよびＮＢ）ウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍ（Ｍ１およびＢＭ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメントを含む８の遺伝子セグメントを含み、単離された感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルスを提供する。一の実施形態では、上記感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルスは、Ｍ１およびＭ２のＭウイルス遺伝子セグメントを有する。一の実施形態では、上記感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルスは、ＮＢおよびＮＡのＮＡウイルス遺伝子セグメントを有する。一の実施形態では、上記感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルスは、ＨＥＦ遺伝子セグメントを有する。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍウイルス遺伝子セグメント、ＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＨＥＦウイルス遺伝子セグメントを含み、単離された感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルス遺伝子セグメントを提供する。一の実施形態では、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントは、任意で異種ヌクレオチド配列にフランキングしてもよい５’および／または３’ＰＢ２ウイルス非コードおよびコード組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まない。変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント中のＰＢ２オープンリーディングフレームは、例えば、形質移入または感染後に容易に検出可能なもの、例えば、ＧＦＰ遺伝子もしくはウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子といったルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子、または病原体からの抗原をコードする遺伝子等の異種ヌクレオチド配列により置換または破壊されてもよい。一の実施形態では、ＰＢ２コード領域は変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント中に、１以上のヌクレオチドの挿入または削除、または１以上のアミノ酸置換または停止コドンをもたらすもの、あるいはそれらの任意の組み合わせであって非機能性ＰＢ２コード配列となるような変異を含んでいてもよい。一の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、例えば、約１００〜約４５００又は約５００〜約４０００ヌクレオチドといった、約３０〜約５０００の間の長さである。
本発明の感染性生体含有可能ウイルスは、従って、宿主において免疫応答を誘導するインフルエンザワクチンとして使用してもよく、この際、感染または弱毒化から完全感染性形質となる遺伝的復帰に伴う症状のリスクがない。本発明の感染性生体含有可能ウイルスは、生ウイルスであるため、化学的に不活化されたウイルスよりも良好に免疫応答を誘発することができ、そして、さらに本発明のウイルスは、生体含有可能になっているため、しばしば弱毒化生ワクチンに伴い問題となる疾患の症状が出にくい。そして、複製不能なウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用とは対照的に、本発明のＫＯウイルスは、ウイルスに対する宿主の免疫応答を増強するアジュバントであるＲＮＡを含有する。本発明のＰＢ２−ＫＯインフルエンザウイルスについて得られる特性は驚くべきものである。というのは、類似のウイルスであるＭ２の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを欠くＭ２欠損ウイルス（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３：５９４４（２００９）参照）は、トランスでＭ２が供されないと、例えば、１０2〜１０3ＰＦＵ／ｍＬという低い力価にしか増殖せず、よって複製欠陥であるが生体含有可能になってはいないからである。
一の実施形態では、本発明は、ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、ＨＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ１およびＮＳ２ウイルス遺伝子セグメント、を含む７つの遺伝子セグメントを含み、単離された感染性生体含有可能組換えインフルエンザウイルス、すなわち、ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントを欠くウイルス、を提供する。
一の実施形態では、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントを有する８セグメントのＰＢ２−ＫＯインフルエンザウイルスとしては、該変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント中に、ＰＢ２コード配列の削除、ＰＢ２コード配列の削除および異種ヌクレオチド配列の挿入、又はＰＢ２コード配列を破壊する異種ヌクレオチド配列の挿入を有する。このウイルスは、ＰＢ２がトランスで供されるとインビトロで複製し、対応する野生型インフルエンザウイルスと比べ、実質的に同一かまたは多くとも１０１００または１０００倍低い力価となるが、しかし、ＰＢ２がトランスで供給されないとインビボ又はインビトロで弱毒化する。一の実施形態では、ＰＢ２コード配列の削除には、１以上のＰＢ２のコンティグ又はコンティグでないヌクレオチドを含んでもよく、また、例えば、７５９のアミノ酸をコードする領域等の全コード領域の削除を含んでもよい。一の実施形態では、削除には、ＰＢ２コード領域の少なくとも１０％、３０％、４０％、５０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、および最大９９％、又は、１０から９９の間の任意の整数であるパーセント数値を含むが、全ＰＢ２コード領域は含まない。一の実施形態では、ＰＢ２コード配列の削除には、例えば、３’または５’非コードＰＢ２配列にコンティグする配列等の、非コードＰＢ２組み込み配列のみを有する組換えウイルス遺伝子セグメントと比較して、得られるウイルス遺伝子セグメントをビリオン中へ取り込まれるのがより増強される５’または３’コード配列の削除は含まない。
一の実施形態では、該変異型ＰＢ２遺伝子セグメントは、例えば、フレームシフトをもたらし機能的ＰＢ２の発現を不能にするような１以上のヌクレオチドの挿入を含んでもよい。一の実施形態では、挿入には、非コードＰＢ２組み込み配列のみを有する組換え遺伝子セグメントと比較して、当該遺伝子セグメントをビリオン中へ取り込まれるのがより増強される５’または３’コード配列の変更は含まない。
一の実施形態では、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントは、対応する野生型ＰＢ２タンパク質と比較して少なくとも１のアミノ酸の置換をもたらす少なくとも１の変異を含んでもよく、例えば、開始コドンを削除または置換する変異、該コード領域中に１以上の終止コドンを導入する変異等の、感染後のウイルス遺伝子セグメントから機能的ＰＢ２が発現できないようなものが挙げられる。一の実施形態では、該開始コドンの削除または置換、あるいは該ＰＢ２のリーディングフレーム中への１以上の終止コドンの導入には、非コードＰＢ２組み込み配列のみを有する組換え遺伝子セグメントと比較して、当該遺伝子セグメントをビリオン中へ取り込まれるのがより増強される５’または３’コード配列の変更は含まない。
本発明の一の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、検出可能な表現型を付与する可能性のある異種タンパク質（糖タンパク質、または細胞質、核、もしくはミトコンドリア特異的タンパク質等の非インフルエンザウイルスタンパク質、あるいは微生物病原体由来の抗原といった任意の抗原タンパク質）をコードしてもよい。一の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、ＰＢ２コード配列の欠損部、例えば５’または３’ＰＢ２コード組み込み配列に対応するものと融合してもよく、任意でキメラタンパクを生成するものであってもよい。一の実施形態では、異種ヌクレオチド配列を、ウイルス遺伝子セグメントのコード領域内の組み込み配列を破壊しないように、ウイルス遺伝子セグメントのコード領域に対応するセグメント中の配列に置換するかまたは導入してもよい。例えば、異種ヌクレオチド配列は、非コード配列に隣接する５’および／または３’ＰＢ２コード領域から約３〜約４００ヌクレオチドにフランクキングしてもよい。一の実施形態では、３’ＰＢ２組み込み配列は、ＰＢ２コード領域のＮ末端および／またはＣ末端から３〜４００ヌクレオチド、３〜３００ヌクレオチド、３〜１００ヌクレオチド、３〜５０ヌクレオチド、又は３〜４００ヌクレオチドの間の任意の整数、に対応する。一の実施形態では、宿主細胞が該生体含有可能ＰＢ２−ＫＯウイルスに感染した後、削除されたＰＢ２タンパク質の残り残基のＮ末端および／またはＣ末端が融合した異種タンパク質が生成される。
変異型ＰＢ２遺伝子セグメントのｖＲＮＡ生産用ベクターは、ＰＡ ｖＲＮＡ、ＰＢ１ ｖＲＮＡ、ＮＰ ｖＲＮＡ、ＨＡ ｖＲＮＡ、ＮＡ ｖＲＮＡ、Ｍ ｖＲＮＡ、およびＮＳ（ＮＳ１および／またはＮＳ２）ｖＲＮＡのｖＲＮＡ生産用のベクター、並びに、１以上のＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２およびＮＰのｍＲＮＡ（タンパク質）生産用のベクター又はＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰのうち最大３つのｍＲＮＡ生産用のベクター、と共に細胞中に導入され、ここで、この細胞は、安定して残りのウイルスタンパクを発現し、そして任意に、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ、例えば、Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１および／またはＮＳ２を発現する。変異型ＰＢ２遺伝子セグメントのｖＲＮＡは、対応する野生型ＰＢ２ ｖＲＮＡと比べ、少なくとも１％、５％、１０％、もしくは３０％、または少なくとも５０％、の効率で、ビリオンに取り込んでもよい。
一の実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、全身性免疫および感染の主要な進入口における粘膜免疫の両方を誘発する。よって、本発明は、本発明の生体含有可能組換えウイルスを含む弱毒化生ワクチン又は免疫原性組成物、並びに、それぞれ鳥類もしくはヒトといった哺乳類等の脊椎動物を免疫するため、又は、脊椎動物における免疫応答を誘発するための該ワクチン又は免疫原性組成物の使用方法を提供する。一の実施形態では、該組成物又はワクチンは、経鼻投与用に調合される。一の実施形態では、ワクチン中の生体含有可能組換えウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９ ＨＡのＨＡ遺伝子セグメントを含む。一の実施形態では、ワクチン中の生体含有可能組換えウイルスにおけるＨＡは、ＨＡ開裂部位で修飾される。一の実施形態では、ワクチンは、本発明の生体含有可能組換えウイルとは異なる少なくとも１のインフルエンザウイルス株を含み、例えば、ワクチンは２または３の異なるインフルエンザウイルスを含む。
本発明は、ｖＲＮＡ生産用の転写カセット及びｍＲＮＡ生産用の転写カセットを含む１以上のベクターを有する感染性で生体含有可能な８セグメントのＡ型インフルエンザウイルスを調製するための、複数のベクターを提供する。ｖＲＮＡ生産用の転写カセットは、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、およびゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセットである。変異型ＰＢ２ ＤＮＡは、異種ヌクレオチド配列にフランキングする ５’および３’ 組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まない。ｍＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、そして任意で、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結された１以上のインフルエンザウイルスＰＢ２、ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１および／またはＭ２のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、である。また、これらのベクターを有する組成物、およびこれらのベクターを採用する方法も更に提供する。
また、本発明は、ｖＲＮＡ生産用の転写カセット及びｍＲＮＡ生産用の転写カセットを含む１以上のベクターを有し、感染性で生体含有可能な８セグメントのＢ型インフルエンザウイルスを調製するための、複数のベクターも提供する。ｖＲＮＡ生産用の転写カセットは、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対しに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡおよびＮＢ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、である。変異型ＰＢ２ ＤＮＡは、任意で異種ヌクレオチド配列にフランキングしてもよい５’および３’組み込み配列、を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まない。ｍＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、そして任意で、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結された１以上のインフルエンザウイルスＰＢ２、ＨＡ、ＮＡ、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｍ１および／またはＢＭ２のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、である。また、これらのベクターを有する組成物、およびこれらのベクターを採用する方法も更に提供する。
一の実施形態では、ｖＲＮＡベクター中のプロモーターは、ヒトＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモーターを含むが、これらに限定されない。一の実施形態では、１以上のｖＲＮＡベクターは、インフルエンザウイルス配列の５’側にＰｏｌＩＩプロモーターおよびリボザイム配列を含み、そして、該インフルエンザウイルス配列の３’側に同一または異なるリボザイム配列を含む。一の実施形態では、変異型ＰＢ２遺伝子セグメントは、ベクター中にあり、ヒトＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターといったＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモーター、を含むが、これらに限定されないプロモーターに対し作用可能に連結される。一の実施形態では、ｖＲＮＡベクターは、ＰｏｌＩ転写終結配列、ＰｏｌＩＩ転写終結配列、またはＰｏｌＩＩＩ転写終結配列を含むが、これらに限定されない転写終結配列、あるいは、１以上のリボザイムを含む。
本発明の複数のベクターは、物理的に連結されていてもよく、あるいは、各ベクターが個々のプラスミドまたは他の、例えば線状の、核酸送達ビヒクル上に存在していてもよい。一の実施形態では、各ｖＲＮＡ生産ベクターが別々のプラスミド上にある。一の実施形態では、各ｍＲＮＡ生産ベクターが別々のプラスミド上にある。一の実施形態では、１以上のｖＲＮＡ生産用のベクターが同じプラスミド上にある（例えば、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる公開された米国特許出願第２００６／０１６６３２１号参照）。一の実施形態では、１以上のｍＲＮＡ生産用のベクターが同じプラスミド上にある（例えば、米国特許出願第２００６／０１６６３２１号参照）。一の実施形態では、この方法で採用されるｖＲＮＡベクターが、１のプラスミド、または２もしくは３の異なるプラスミド上にある。一の実施形態では、この方法において採用されるＰＡ、ＰＢ１、およびＮＰ、ならびに任意でＰＢ２のｍＲＮＡベクターが、１のプラスミド、または２もしくは３の異なるプラスミド上にある。
また、ベクター発現ＰＢ２、例えば、ＰＢ２〜ＰＲ８または他のマスターワクチン株を含む宿主細胞も提供する。一の実施形態では、ＰＢ２は、配列番号３でコードされるＰＢ２に対し、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。一の実施形態では、例えばエピソームとして安定的に細胞内で維持されるベクター、又はレンチウイルス若しくはレトロウイルスベクター等の染色体に組み込まれるベクター、といったウイルスベクターで、宿主細胞が形質導入される。一の実施形態では、宿主細胞は更に、一過性ｖＲＮＡ生産用の転写カセットおよび一過性ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを含む１以上のベクターを含む。ｖＲＮＡ生産用の転写カセットは、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、インフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセット、およびインフルエンザウイルス様ｖＲＮＡ末端、例えば、ＰｏｌＩ転写終結配列、が得られるような転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し、ゲノムウイルスＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーター、例えば、ＰｏｌＩプロモーター、を含む転写カセットである。変異型ＰＢ２ ＤＮＡは、任意で異種ヌクレオチド配列にフランキングしてもよい５’および３’組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まない。ｍＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセットである。宿主細胞は、野生型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントのｖＲＮＡ生産用のＰＢ２コード配列に対応する配列を含まない。
また、本発明は、例えば、本発明の宿主細胞を用いて、インフルエンザウイルスを調製する方法を提供する。この方法は、細胞を、感染性インフルエンザウイルスを生成するのに有効な量で、例えば逐次的にまたは同時に本発明の複数のベクターに接触させることを含む。また、本発明は、複数のベクターに接触させた細胞からウイルスを分離することを含む。よって、本発明はさらに、単離されたウイルス及び本発明のウイルスに接触した宿主細胞を提供する。別の実施形態では、本発明は、細胞を１以上のベクターに接触させることを含み、ｖＲＮＡまたはタンパク質生産ベクターのいずれか一方を、該ｖＲＮＡまたはタンパク質生産ベクター以外の他のベクターより先に接触させることを含む。
一の実施形態では、本発明は、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントを含む組換えインフルエンザウイルスを調製する方法を提供する。この方法は、組換えウイルスを得るために、宿主細胞を、変異型ＰＢ２遺伝子セグメント配列を含むベクターを含む複数のインフルエンザベクターに接触させることを含む。例えば、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対し、転写終結配列、作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、および転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し作用可能に連結されたｖＲＮＡ生産用のプロモーターを含むベクター、を含むｖＲＮＡ生産用のベクターに、宿主細胞を接触させ；ここで、変異型ＰＢ２ ＤＮＡはゲノムｖＲＮＡを生産する方向にあり、任意で異種ヌクレオチド配列にフランキングしてもよい５’および３’組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２用の配列に対応するコンティグの配列を含まず；インフルエンザウイルスＰＡをコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、インフルエンザウイルスＰＢ１をコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、インフルエンザウイルスＮＰをコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、を含むｍＲＮＡ生産用のベクターに、宿主細胞を接触させ；ここで、該細胞は、ｖＲＮＡ生産用のＰＢ２コード配列に対応する配列には接触させない。任意で、宿主細胞を、インフルエンザウイルスＨＡをコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、インフルエンザウイルスＮＡをコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、インフルエンザウイルスＭ１をコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、Ｍ２タンパク質、例えば、変異型Ｍ２タンパク質、をコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクター、およびインフルエンザウイルスＮＳ１および／またはＮＳ２をコードするＤＮＡセグメントに対し作用可能に連結されたプロモーターを含むベクターに、接触させる。一の実施形態では、Ｍ１およびＭ２ ｍＲＮＡ並びに／又はＮＳ１およびＮＳ２ ｍＲＮＡについて別々のベクターを設けて用いる。
本発明の生体含有可能組換えインフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、各転写カセットが、プラスミドベクター上にある。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、１以上の転写カセットが、１以上のプラスミドベクター上にある、例えば、１のプラスミドベクターが、ＰＡ、ＰＢ１、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、ＮＳ１および／またはＮＳ２並びに変異型ＰＢ２ ｃＤＮＡのｖＲＮＡ生産用の転写カセット、を有する。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、１のプラスミドベクターが、１の上記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターが、その他の上記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、３のｍＲＮＡ生産用のプラスミドベクターを用い、それぞれが１の上記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、１のプラスミドベクターが、６の上記ｖＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターが、その他の上記ｖＲＮＡ生産用の転写カセットを有する。例えば、１のプラスミドベクターが、１の上記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターが、その他の上記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、３のｍＲＮＡ生産用のプラスミドベクターを用いる。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、１のプラスミドが３のｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、上記ＨＡ ｃＤＮＡは、非病原性の開裂部位をコードする。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、上記ＨＡおよびＮＡは、同一のウイルス単離物由来である。本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスを調製する方法の一の実施形態では、上記ＨＡは、Ｂ型ＨＡである。
ｖＲＮＡ中のプロモーターもしくは転写終結配列またはウイルスタンパク質発現ベクターは、プロモーターまたは他の任意のベクターに対し同一でも異なっていてもよい。一の実施形態では、インフルエンザｖＲＮＡを発現するベクター又はプラスミドは、プロモーターを含み、このプロモーターは、少なくとも１の特別な宿主細胞、例えば、鳥類またはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、又はヒト細胞を含む霊長類細胞などの哺乳類の宿主細胞、あるいは複数の宿主で発現するのに適している。一の実施形態では、各ＰｏｌＩ含有ベクターのＰｏｌＩプロモーターは同一である。一の実施形態では、上記ＰｏｌＩプロモーターは、ヒトＰｏｌＩプロモーターである。一の実施形態では、各ＰｏｌＩＩ含有ベクターのＰｏｌＩＩプロモーターは同一である。一の実施形態では、上記ＰｏｌＩＩ含有ベクターの２又はそれ以上のＰｏｌＩＩプロモーターは同一であるが全部のＰｏｌＩＩ含有ベクターのＰｏｌＩＩプロモーターは同一ではない。一の実施形態では、各ＰｏｌＩＩ含有ベクターのＰｏｌＩＩプロモーターは異なる。
別の実施形態では、この方法は、宿主細胞を、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター（双方向のカセット）、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それが変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、ＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクター、およびＰｏｌＩＩプロモーターがＰｏｌＩ転写終結配列に連結し、それがインフルエンザウイルスＮＳ１および／またはＮＳ２ ＤＮＡに連結し、それがＰｏｌＩプロモーターに連結し、それがＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結しているベクターに接触させることを含む。宿主細胞は、例えば、ニワトリベータ−アクチンプロモーター由来のものといったＰＢ２タンパク質を発現するをＰＢ２ ＤＮＡ含む。野生型ＰＢ２のｖＲＮＡ源がないので、複製不能なウイルスが得られる。
一の実施形態では、双方向のカセット中のｖＲＮＡ生産用のプロモーターとして、ヒトＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター等のＲＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＰｏｌＩＩ）プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。一の実施形態では、１以上のｖＲＮＡベクターは、インフルエンザウイルス配列の５’側にＰｏｌＩＩプロモーターおよびリボザイム配列を含み、並びに、該インフルエンザウイルス配列の３’側に同一または異なるリボザイム配列を含む。一の実施形態では、変異型ＰＢ２遺伝子セグメントは、ベクター内にあり、かつヒトＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーターといったＲＮＡ ＰｏｌＩプロモーター、ＲＮＡ ＰｏｌＩＩプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ７プロモーター、又はＴ３プロモータ等が挙げられるが、これらに限定されないプロモーターに対し作用可能に連結される。一の実施形態では、ｖＲＮＡベクターは、ＰｏｌＩ転写終結配列、ＰｏｌＩＩ転写終結配列、またはＰｏｌＩＩＩ転写終結配列等が挙げられるが、これらに限定されない転写終結配列、あるいは、１以上のリボザイムを含む。本発明の範囲内のリボザイムとしては、テトラヒメナリボザイム、ＲＮａｓｅ Ｐ、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、肝炎リボザイム、並びに合成リボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。一の実施形態では、少なくとも１のｖＲＮＡ用のベクターでは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターがリボザイム配列に連結し、それがウイルスコード配列に連結し、それが別のリボザイム配列に連結し、それが任意でＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列に連結している。一の実施形態では、少なくとも２、例えば、３、４、５、６、７または８のｖＲＮＡ生産用のベクターでは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、第１リボザイム配列を含み、これがウイルスコード配列を含むウイルス配列に対応する配列の５’側にあり、これが第２リボザイム配列の５’側にあり、さらにこれが転写終結配列の５’側にある。各ｖＲＮＡベクターにおける各ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、他の任意のｖＲＮＡベクターにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと同一であっても異なっていてもよい。同様に、各ｖＲＮＡベクターにおける各リボザイム配列は、他の任意のｖＲＮＡベクターにおけるリボザイム配列と同一であっても異なっていてもよい。一の実施形態では、単一のベクターにおけるリボザイム配列は同一ではない。
また、本発明の複数のベクター、組成物、および宿主細胞は、異種配列を含む他のｖＲＮＡ生産もしくはタンパク質生産用のベクターを含んでもよい。例えば、異種配列には、癌関連抗原または、細菌、非インフルエンザウイルス、真菌、もしくは他の病原体等の病原体に対する免疫原といった目的の治療的または予防的遺伝子の配列がある。例えば、目的の遺伝子またはｃＤＮＡを含むベクターまたはプラスミドを、インフルエンザウイルス遺伝子用のベクター又はプラスミドの代わりに用いてもよく、あるいは全インフルエンザウイルス遺伝子用のベクターまたはプラスミドに追加してもよい。よって、本発明の別の実施形態は、上述の組成物又は複数のベクターを含み、ここで該ベクターの１つは、任意で５’インフルエンザウイルスコード配列またはその一部を含んでもよい５’インフルエンザウイルス配列が所望のｃＤＮＡといった所望の核酸配列に連結し、これが任意で３’インフルエンザウイルスコード配列またはその一部を含んでもよい３’インフルエンザウイルス配列に連結するもので置換されている、又はこれを追加的に含む。一の実施形態では、ｃＤＮＡなどの所望の核酸配列は、アンチセンス（アンチゲノム）方向にある。このようなベクターを上述の他のベクターと共にインフルエンザウイルス複製を許容する宿主細胞へ導入すると、該ベクターの異種配列に対応するｖＲＮＡを含む組換えウイルスが得られる。
一の実施形態では、本発明の組換えウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス由来の１以上の遺伝子を含む。別の実施形態では、本発明の組換えウイルスは、Ｂ型インフルエンザＨＡ遺伝子などのＢ型インフルエンザウイルス由来の１以上の遺伝子を含んでもよい。さらに別の実施形態では、本発明の組換えウイルスは、Ｃ型インフルエンザウイルス由来の１以上の遺伝子を含んでもよい。ＮＡのｖＲＮＡの産生用のＤＮＡは、例えば、任意のＮ１〜Ｎ９、キメラＮＡ配列、または非天然ＮＡ配列等のいかなるＮＡ由来であってよく、そして、ＨＡのｖＲＮＡの産生用のＤＮＡは、例えば、任意のＨ１〜Ｈ１６、キメラＨＡ配列、または非天然ＨＡ配列等のいかなるＨＡ由来であってよい。一の実施形態では、ｖＲＮＡの産生用のＤＮＡは、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルスのためのものであってよい。一の実施形態では、他の弱毒化変異がベクターに導入されていてもよく、例えば、ＨＡ開裂部位における変異であってこれが開裂されなくなるようなものを導入してもよい。ＮＡおよびＨＡのｖＲＮＡの生産用のＤＮＡは異なる株または単離物由来（６：１：１再集合体）であってもよく、同一株または単離物由来（６：２再集合体）であってもよく、ＮＡは内部遺伝子と同一株または単離物由来（７：１再集合体）、あるいは内部遺伝子の１であってもよく、ＮＡおよびＨＡは、同一株または単離物由来（５：３再集合体）であってもよい。
本発明の範囲における再集合体用の内部遺伝子を提供できるウイルスとしては、ベロ細胞では、例えば、力価が少なくとも１０6ＰＦＵ／ｍＬ、１０7ＰＦＵ／ｍＬまたは１０8ＰＦＵ／ｍＬといった少なくとも約１０5ＰＦＵ／ｍＬである高い力価；孵化卵では、例えば、力価が少なくとも１０8ＥＩＤ50／ｍＬ、１０9ＥＩＤ50／ｍＬまたは１０10ＥＩＤ50／ｍＬといった少なくとも約１０7ＥＩＤ50／ｍＬである高い力価；ＡＸ５細胞等のＭＤＣＫでは、例えば、力価が少なくとも１０8ＰＦＵ／ｍＬといった少なくとも約１０7ＰＦＵ／ｍＬである高い力価；あるいはこれらの宿主細胞の２またはそれ以上において高い力価を有するウイルスが挙げられる。一の実施形態では、ＰＢ１ ｖＲＮＡ、変異型ＰＢ２ ｖＲＮＡ、ＰＡ ｖＲＮＡ、ＮＰ ｖＲＮＡ、Ｍ（Ｍ１および／もしくはＭ２またはＭ１および／もしくはＢＭ２）ｖＲＮＡ、ならびに／あるいはＮＳ（ＮＳ１および／またはＮＳ２）ｖＲＮＡのｖＲＮＡ生産用のＤＮＡは、ＡＸ４細胞、ベロ細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、および、任意で、孵化卵、といった培養哺乳動物細胞中で高力価に複製するインフルエンザウイルス、および／または、例えば、ヒトに重大な疾患を引き起こさないようなワクチンウイルス由来の配列を有していてもよい。
例えば、他のＰＲ８単離物またはワクチンウイルス由来の内部遺伝子を有する再集合体を、本発明の組換え再集合体ウイルスに採用できる。特に、ＰＲ８（ＵＷ）ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＭ（「５」）並びにＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ（「１」）を有する５：１：２再集合体；ＰＲ８（ＵＷ）ＮＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、およびＭ（「６」）並びにＰＲ８（Ｃａｍ）ＮＳ（「１」）遺伝子セグメントを有する６：１：１再集合体；および、ＰＲ８（ＵＷ）ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、ＮＡ、およびＮＳ（「７」）遺伝子セグメントを有する７：１再集合体を採用できる。
一の実施形態では、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＰ、Ｍ、およびＮＳの内部遺伝子のＤＮＡは、配列番号１〜６又は１０〜１５の１によってコードされる対応ポリペプチドと実質的に同じ活性を有するタンパク質をコードする。本明細書で用いる場合、「実質的に同じ活性」とは、それぞれ、対応する完全長ポリペプチドの約０．１％、１％、１０％、３０％、５０％、９０％、例えば、最大１００％またはそれ以上の活性、もしくは約８０％、９０％またはそれ以上の検出可能なタンパク質レベルを含む。一の実施形態では、核酸は、例えば、配列番号１〜６または１０〜１５の１によりコードされるポリペプチドと同一なコンティグのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％（８０および９９の間のいかなる整数も含む）の割合で実質的に同じポリペプチドをコードする配列を含む。一の実施形態では、単離および／または精製された核酸分子は、例えば、配列番号１〜６または３３〜３８の１と同一なコンティグの核酸配列と、少なくとも５０％、例えば、６０％、７０％、８０％または９０％（５０および１００の間のいかなる整数も含む）の割合で実質的に同じヌクレオチド配列を含み、並びに一の実施形態では、単離および／または精製された核酸分子は、例えば、配列番号１〜６または１０〜１５の１によりコードされるポリペプチドに同一なコンティグのアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、９０％、９２％、９５％、９７％または９９％（８０〜９９のいずれの整数も含む）の割合で実質的に同じポリペプチドをコードする。一の実施形態では、インフルエンザウイルスポリペプチドは、１以上の、例えば２、５、１０、１５、２０又はそれ以上の保存的アミノ酸置換、例えば、配列番号１〜６または１０〜１５の１によりコードされるポリペプチドに対し最大１０％または２０％の残基の保存的置換を有する。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基が互いに変換することをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群はシステインおよびメチオニンである。一の実施形態では、保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン；フェニルアラニン−チロシン；リジン−アルギニン；アラニン−バリン；グルタミン酸‐アスパラギン酸；およびアスパラギン−グルタミンである。一の実施形態では、インフルエンザウイルスポリペプチドは、配列番号１〜６または１０〜１５の１によりコードされるポリペプチドに対し１以上の、例えば２、３又は４の、非保存的アミノ酸置換を有する。
ヘルパーウイルスの感染を必要としない本明細書に記載のウイルスを生産する方法は、ウイルスの突然変異誘発の研究、並びにワクチン（例えば、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ライノウイルス、フィロウイルス、マラリア、ヘルペス、および手足口病用）および遺伝子治療ベクター（例えば、癌、ＡＩＤＳ、アデノシンデアミナーゼ、筋ジストロフィー、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、および中枢神経系腫瘍用）の製造に有用である。よって、医学的治療（例えば、ワクチンまたは遺伝子治療用）において使用するためのウイルスが提供される。
この方法は、宿主生物、例えば、哺乳類に、有効量の本発明のインフルエンザウイルスを投与することを含み、例えば、生または不活化ウイルス調製物を、任意で、アジュバントおよび／または担体と組み合わせて、そのウイルスまたは抗原的に密接に関連するウイルスにより哺乳類などの動物の感染症を予防または改善するのに有効な量で投与することなどがある。一の実施形態ではウイルスを筋肉内投与するが、別の実施形態ではウイルスを経鼻投与する。いくつかの投与プロトコルでは、すべての用量を筋肉内または経鼻投与してもよいが、他のプロトコルでは、筋肉内および経鼻投与を組み合わせて使用する。一の実施形態では、２〜３の用量を投与する。ワクチンは、異種ヌクレオチド配列を本発明のインフルエンザウイルスのウイルス遺伝子セグメントに導入する結果として多価になってもよい。ワクチンは、更に、例えば、組換えインフルエンザウイルス、他の病原体、追加の生物剤又は微生物成分を含むインフルエンザウイルスの他の単離物を含有してもよく、例えば、多価ワクチンを形成してもよい。一の実施形態では、例えば不活化インフルエンザウイルスを含有する経鼻ワクチン接種、および粘膜アジュバントにより、鼻咽頭でのウイルス特異的ＩｇＡおよび中和抗体、加えて、血清ＩｇＧを誘導し得る。
本発明のインフルエンザウイルスは、例えば、アマンタジン、リマンタジン、および／またはノイラミニダーゼ阻害剤といった他の抗ウイルス剤と共に用いてもよく、また、例えば、投与前、投与時、および／または投与後にそれらの抗ウイルス剤と組み合わせて別々に投与してもよい。
一の実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスおよび少なくとも一つの他の病原体、例えばウイルス性もしくは細菌性病原体、用のワクチンベクターであってもよく、または、インフルエンザウイルス以外の病原体用のワクチンベクターであってもよい。病原体としては、これらに限定されないが、ＨＩＶ等のレンチウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＣＭＶまたはＨＳＶ等のヘルペスウイルス、***ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトライノウイルス、呼吸器合胞体ウイルスおよび１型ヒトパラインフルエンザウイルス等のパラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、ニパウイルス、ハンタウイルス、日本脳炎ウイルス、ロタウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス、肺炎球菌、結核菌、百日咳菌、またはインフルエンザ菌などが挙げられる。例えば、本発明の生体含有可能インフルエンザウイルスは、麻疹ウイルスのＨタンパク質、風疹ウイルスのウイルスエンベロープタンパク質Ｅ１、流行性耳下腺炎ウイルスのＨＮタンパク質、ヒトライノウイルスのＲＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、呼吸器合胞体ウイルスのＧタンパク質、コロナウイルスのＳタンパク質、ニパウイルスのＧまたはＦタンパク質、ハンタウイルスのＧタンパク質、日本脳炎ウイルスのＥタンパク質、ロタウイルスのＶＰ６、デング熱ウイルスのＥタンパク質、西ナイルウイルスのＥタンパク質、肺炎球菌のＰｓｐＡ、結核菌由来のＨＳＰ６５、百日咳菌のＩＲＰ１〜３、ヘム利用タンパク質、保護表面抗原Ｄ１５、ヘム結合タンパク質Ａ、またはインフルエンザ菌の外膜タンパク質Ｐ１、Ｐ２、Ｐ５もしくはＰ６の配列を含んでもよい。
さらに、脊椎動物の生理学的サンプルにおいて、選択インフルエンザウイルス株に対する中和抗体を検出する方法を提供する。この方法は、サンプル、選択株のＨＡおよび／またはＮＡを発現する本発明の組換えウイルス、およびインフルエンザウイルス感染に感受性のある細胞を接触させることを含む。細胞中におけるレポーターまたは抗原の存在またはその量を検出し、ここで、サンプル中においてレポーターまたは抗原が存在しないこと、あるいは対照サンプルと比較してレポーターまたは抗原の量が少ないことが、脊椎動物がインフルエンザウイルス株に感染したという指標になる。
変異型ＰＢ２ ｖＲＮＡの模式図およびそれらのビリオン形成およびビリオン取り込みの効率。ＶＬＰ数および変異型ＰＢ２ ｖＲＮＡのビリオンの取り込み効率は、ＷＳＮ ＨＡおよびＧＦＰを発現する細胞数を基準として用いることにより決定した。全ての変異体を、負のセンス方向で示す。各変異体は、ＧＦＰリーディングフレーム（緑色のバー）；３’および５’非コード領域の各２７および３４ヌクレオチド（灰色のバー）；並びに様々な長さのコード領域（黒色のバー）を含む。点線は、ＰＢ２コード領域中の削除された配列を表す。ＰＢ２（−）はこのｖＲＮＡを欠く（すなわち、７のｖＲＮＡセグメントのみを使用してＶＬＰが生成された）ことを示す。
例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号１および２）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号２および３）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号３〜５）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号５〜７）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号７、８、および１０）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号１０および１１）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号１１〜１３）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号１３〜１５）。 例示としてのワクチンウイルスの内部遺伝子配列（配列番号１５）。
ＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰウイルスの特性評価。Ａ）野生型ＰＢ２およびＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）ｖＲＮＡの模式図。ＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）ｖＲＮＡは３’非コード領域、ＰＢ２ ｖＲＮＡのコード配列の１２０ヌクレオチド、ＧＦＰ遺伝子、並びにＰＢ２ ｖＲＮＡの３’コードおよび５’非コード領域の１２０ヌクレオチドを有する。ＰＢ２ ｖＲＮＡ非コード領域およびコード領域を、それぞれ灰色と赤色のバーで表す。ＧＦＰ遺伝子を、緑色のバーで表す。Ｂ）ＡＸ４／ＰＢ２細胞（ＡＸ４細胞はＭＤＣＫ細胞由来）におけるＰＢ２遺伝子発現。ＲＮＡを、野生型ＡＸ４およびＡＸ４／ＰＢ２細胞の両者から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲをオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて実施し、続いて、ＰＢ２（上のパネル）又はイヌβ−アクチン（下のパネル）に特異的なプライマーを用いてｃＤＮＡ合成およびＰＣＲを行った。Ｃ）ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＢ２タンパク質発現。細胞を、抗ＰＢ２抗体１８／１（Ｈａｔｔａら、２０００）（左のパネル）及びＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（右のパネル）と反応させた。スケールバー、５０μｍ。Ｄ）７２時間にわたりモニターしたＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰの成長速度。野生型ＡＸ４細胞（上のパネル）およびＡＸ４／ＰＢ２細胞（下のパネル）を、０．００１のＭＯＩで、野生型ＰＲ８（赤）またはＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰ（緑）ウイルスに感染させた。図に示す各時点で採取した上清についてＡＸ４／ＰＢ２細胞における感染性ウイルスをプラークアッセイでアッセイした。
ＰＢ２−ＫＯウイルスにおける様々なＨＡ遺伝子の収容。ＰＢ２−ＫＯウイルス感染細胞におけるＨＡ発現。ＡＸ４／ＰＢ２細胞を、ＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰ、ＷＳＮ／ＰＢ２−ＧＦＰ、ＣＡ０４／ＰＢ２−ＧＦＰ、またはＶＮ１２０３／ＰＢ２−ＧＦＰに感染させた。感染から１６時間後、細胞をＷＳＮ、ＣＡ０４、又はＶＮ１２０３ ＨＡタンパク質に特異的なモノクローナル抗体で染色した。ＨＡおよびＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡を用いて調べた。
ＰＢ２−４５６ ＫＯウイルスにおける様々なレポーター遺伝子の収容。Ａ）ＰＢ２−ＫＯウイルス感染細胞におけるルシフェラーゼ活性。野生型ＡＸ４およびＡＸ４／ＰＢ２細胞を、図に示す各ＭＯＩで、ＰＲ８／ＰＢ２−Ｆｌｕｃ（上のグラフ）およびＰＲ８／ＰＢ２−Ｒｌｕｃ（下のグラフ）に感染させた。感染から８時間後、細胞におけるＦｌｕｃおよびＲｌｕｃ活性をデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを用いて測定した。ウイルス感染細胞の結果は、非感染細胞のもの（「０」で表す）と比較し、Ｐ値をスチューデントｔ検定を用いて計算した。＊、Ｐ＜０．０５。ＲＬＵ、相対発光単位。Ｂ）ＰＢ２−ＫＯウイルス感染細胞におけるＧＦＰ強度。ＡＸ４／ＰＢ２細胞を図に示す各ＭＯＩで、ＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰに感染させた。感染から８時間後、ＧＦＰ強度を無限Ｍ１０００マイクロプレートリーダーを用いて測定した。ウイルス感染細胞の結果は、非感染細胞のもの（「０」で表す）と比較し、Ｐ値をスチューデントｔ検定を用いて計算した。＊、Ｐ＜０．０５。ＲＦＵ、相対蛍光単位。
ＰＢ２−ＫＯウイルスに基づく微量中和アッセイ。ＡＸ４／ＰＢ２細胞を、あらかじめ３連ウェル中に連続希釈したフェレット血清と混合した１００ＰＦＵのＣＡ０４／ＰＢ２−Ｒｌｕｃに感染させた。細胞中のＲｌｕｃ活性を、感染から２４時間後に、レニラルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。ウイルス感染細胞の結果は、血清処理をしていないウイルスに感染させた細胞のもの（「血清（−）」で表す）と比較し、Ｐ値をスチューデントｔ検定を用いて計算した。 ＊、Ｐ＜０．０５。ＲＬＵ、相対発光単位。
マウスのチャレンジ後の体重変化。図示の材料で１回（Ａ）、２回（Ｂ）、又は３回（Ｃ）免疫したマウスを、ＭＬＤ50の０．５倍（ｉ）又は５倍（ｉｉ）のＰＲ８ウイルスでチャレンジした。数値は、平均の体重変化±ＳＤとして表す（ｎ＝３）。
免疫マウスにおけるウイルス特異的抗体応答。精製ＰＲ８ウイルスを抗原として用い、培地、ホルマリンで不活化したウイルス、またはＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したモックマウスの血清、鼻洗浄液、およびＢＡＬ液（それぞれ上部、中央部、下部）におけるＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の力価を分析した。血清（上部パネル）は、異なる時点、すなわち、ワクチン接種前（バーＡ）、２回目のワクチン接種前（バーＢ）、３回目のワクチン接種前（バーＣ）、およびチャレンジ前（バーＤ）に得た。鼻洗浄液およびＢＡＬ液（それぞれ、中央および下部のパネル）は、ワクチン接種を１回（バー１）、ワクチン接種を２回（バー２）、又はワクチン接種を３回（バー３）行ったマウスのチャレンジ１日前に得た。数値は、平均吸光度±標準偏差（ＳＤ）として表す（ｎ＝３）。不活化ウイルス及びＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスから得たサンプル間において、統計的有意性が示された。
チャレンジ後の免疫マウスの肺および鼻甲介（ＮＴ）におけるウイルス力価。ｘ軸上の数字は、ワクチン接種の回数を示す。群当たり３匹のＢＡＬ液Ｂ／ｃマウスを、図に示す各ＰＲ８ウイルスの用量（マウス当たり５０μｌ）で経鼻感染させ、感染から３および６日後に屠殺しウイルス力価を測定した。バーは、それぞれのマウスの各器官におけるウイルス力価を示す。バーが無い箇所は、器官当たりのウイルス力価が５ＰＦＵ／ｍＬの検出限界未満であったことを示す。
ＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスの血清における抗ＧＦＰ抗体の検出。一過性にＧＦＰを発現するコンフルエントな２９３細胞を、培地（Ａ）、ホルマリンで不活化したウイルス（Ｂ）、またはＰＢ２−ＫＯウイルス（Ｃ）を接種したマウスから得られた血清（１／２０希釈）、あるいは、市販の抗ＧＦＰ 抗体（Ｄ）で処理した。ＤＮＡは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した（第１列）。ＧＦＰは、ＧＦＰ発現用のプラスミドで形質移入した細胞を表す（第２列）。ＧＦＰ抗体は、サンプル中のＧＦＰ抗体の存在を表す（第３列）。これら３枚の画像を統合した（第４列）。スケールバー、２０μｍ。
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のｐｓｐＡ配列を有するＰＢ２−ＫＯウイルスを細胞に感染した後の異種抗原発現の検出。抗インフルエンザウイルス抗体および抗ＰｓｐＡ抗体を用いて、ＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰ又はＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡ感染細胞におけるインフルエンザウイルス及びＰｓｐＡタンパク質の発現を検出した。
ＰＢ２を発現しない細胞および安定的にＰＢ２を発現する細胞におけるＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡの成長速度。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡまたはＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰで３回免疫したマウスの血清、ＢＡＬ液、および鼻洗浄液中のインフルエンザ抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫したマウス血清中のＰｓｐＡ特異的ＩｇＧ。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫したマウスのＢＡＬ液および鼻洗浄液中のＰｓｐＡ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫し、１０ＬＤ50または１００ＬＤ50のインフルエンザウイルスをチャレンジしたマウスについてチャレンジ後の生存率。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫し、１０ＬＤ50または１００ＬＤ50のインフルエンザウイルスをチャレンジしたマウスについてチャレンジ後３日目の気道におけるウイルス複製。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡまたはＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰで３回免疫し、マウス当たり１０2ＣＦＵのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＥＦ３０３０）をチャレンジしたマウスの鼻洗浄液における肺炎球菌数。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫し、マウス当たり２×１０7ＣＦＵのｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ ＷＵ２（致死株）をチャレンジしたマウスについてのチャレンジ後の生存率。
定義
本明細書中で用いる場合、「感染性生体含有可能」ウイルスとは、ウイルスが正常細胞において子孫を産生することができない、又はインビトロまたはインビボにおいて大量の複製ができない、例えば、トランスで安定的に供給されるヘルパーウイルスまたはウイルスタンパク質の非存在下で約１０2〜１０3ＰＦＵ／ｍＬ未満の力価であるものを意味する。
本明細書中で用いる場合、「複製欠損」ウイルスとは、ウイルスがインビトロまたはインビボにおいて一定の限度で複製可能である、例えば、トランスで供給されるヘルパーウイルスまたはウイルスタンパク質の非存在下で少なくとも約１０2〜１０3ＰＦＵ／ｍＬの力価であるものを意味する。
本明細書中で用いる場合、用語「単離」とは、例えばベクターまたはプラスミドなどの核酸分子、ペプチドまたはポリペプチド（タンパク質）、あるいは本発明のウイルスを、インビボの物質と関連しないように、又は、インビトロの物質から実質的に精製するようにインビトロで調製および／または単離することを指す。単離ウイルス調製物は、一般に、インビトロでの培養および増殖、ならびに／または卵における継代により得られ、そして実質的に他の感染因子を含まないものである。
本明細書中で用いる場合、「実質的に精製」とは、対象の種が優勢な種であること、例えば、モルベースで、組成物において他の個々の種よりも多く存在すること意味し、好ましくは組成物中に存在する種のうちの少なくとも約８０％であり、そして、任意で、９５％、９８％、９９％以上といった９０％以上であってもよい。
本明細書中で用いる場合、「実質的に含まない」とは、ある特定の感染因子について、その因子に標準的な検出方法を用いて検出できるレベルに満たないことを意味する。
「組換え」ウイルスとは、インビトロで操作されたものであり、例えば組換えＤＮＡ技術を用いて、ウイルスゲノムの変化をもたらすようなものである。再集合体ウイルスは、組換えまたは非組換え技術により調製可能である。
本明細書中で用いる場合、用語「組換え核酸」または「組換えＤＮＡ配列もしくはセグメント」とは、供給源に由来し又は供給源から単離され、その後インビトロで化学的に改変し得る核酸、例えば、ＤＮＡで、その配列が天然に存在しないようなもの、又は天然ゲノム中での位置とは異なる位置付を有するような天然配列に対応するものを指す。供給源に「由来する」ＤＮＡの一例としては、有用な断片として同定された後、本質的に純粋な態様で化学的に合成されるＤＮＡ配列がある。供給源から「単離された」ＤＮＡの一例としては、有用なＤＮＡ配列があり、本発明で用いるために遺伝子工学的方法によりさらに操作、例えば増幅ができるよう、例えば制限エンドヌクレアーゼの使用といった化学的手段により上記供給源から切断または取り出したものである。
本明細書中で用いる場合、「異種ヌクレオチド配列」とは、親インフルエンザウイルス以外に由来するものをいい、例えば、レポーター遺伝子、他のウイルスもしくは細菌などの他の生物由来の遺伝子、または、例えば、完全長のインフルエンザウイルス遺伝子セグメントのサブセットおよび欠損ＰＢ２コード配列に融合したような非天然型の配列等のインフルエンザウイルス由来だがの天然のインフルエンザウイルスゲノムの模倣ではない配列がある。
本明細書中で用いる場合、「異種」インフルエンザウイルス遺伝子または遺伝子セグメントは、例えば、再集合体等の組み換えインフルエンザウイルスにおける主要な他のインフルエンザウイルス遺伝子または遺伝子セグメントとは異なるインフルエンザウイルスから由来したものである。
用語「単離ポリペプチド」、「単離ペプチド」、または「単離タンパク質」は、ｃＤＮＡ若しくは組換えＲＮＡ又はそれらの組み合わせ（合成由来のものを含む）によりコードされるポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質を含む。
本明細書中で用いる場合、用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」とは、組換えＤＮＡ分子から発現したタンパク質分子を指す。逆に、本明細書中で用いる場合、用語「天然タンパク質」とは、天然に存在する供給源（すなわち、組換え体でないもの）から単離されたタンパク質を指す。分子生物学的技術を用いて、そのタンパク質の天然形態と比べて同一の特性を有するようなタンパク質の組換え形態を作製してもよい。
比較用の配列のアラインメントの方法は当技術分野で周知である。よって、任意の２つの配列間の同一性の割合は、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。
コンピューターを用いてこれらの数学的アルゴリズムを実行して配列を比較することで配列の同一性を決定することができる。これらのプログラムを用いたアラインメントは、デフォルトパラメーターを使用して実施できる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。このアルゴリズムには、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインした場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴに一致する又は満たすようなクエリ配列における長さＷの短いワードを同定することによる、ハイスコア配列ペア（ＨＳＰ）を第１に同定することを含んでもよい。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる。これらの初期の近傍ワードのヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索開始の種として作用する。次いで、該ワードのヒットを、累積アライメントスコアが増加され得る限り各配列に沿って双方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列にパラメーターＭ（マッチする残基ペアとしての報酬スコア；常に＞０）及びＮ（マッチしない残基としてのペナルティスコア；常に＞０）を使用して計算する。アミノ酸配列については、スコアマトリクスを使用して該累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの拡張は、該累積アライメントスコアが、その得られた最大値から数量Ｘ単位で減少するとき、該累積スコアが、１又は複数の負のスコアである残基アライメントが蓄積することでゼロ又はそれ以下となるとき、あるいは、各配列の末端に至ったとき、に停止する。
配列同一性の割合を計算することに加え、該ＢＬＡＳＴアルゴリズムを実施して２つの配列間の類似性についての統計分析を実施してもよい。該ＢＬＡＳＴアルゴリズムによる類似性の測定値の一つとしては、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））があり、これは２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列が偶然マッチする確率を示すものである。例えば、もし参照核酸配列と検査核酸配列との比較における該最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、該検査核酸配列は該参照配列と類似すると考えられる。
（ヌクレオチド配列の場合）ＢＬＡＳＴＮプログラムに、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用いて両鎖の比較をしてもよい。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムに、デフォルトとして、ワード長３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてもよい（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ１ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。また、アラインメントは、人の目視によって実施してもよい。
配列を比較する場合、典型的には、１の配列が参照配列として機能し、検査配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、検査配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要なら部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する検査配列の配列同一性の割合を計算する。
インフルエンザウイルス
ウイルスのライフサイクルには、一般に、細胞表面受容体への結合、細胞へのウイルス核酸の侵入及び脱殻、それに続く細胞内でのウイルス遺伝子の複製が含まれる。ウイルスタンパク質および遺伝子の新しいコピーが合成されると、これらの構成要素が集合して子孫ウイルス粒子となり、細胞から出る（ＲｏｉｚｍａｎおよびＰａｌｅｓｅ、１９９６参照）。異なるウイルスタンパク質が、これらの各ステップにおいて様々な役割を果たす。
Ａ型インフルエンザウイルスは、エンベロープに包まれ、８つのＲＮＡセグメントを持ち、核タンパク質（ＮＰ）と共にキャプシド化されたマイナス鎖ウイルスである（ＬａｍｂおよびＫｒｕｇ、１９９６参照）。この８つの一本鎖マイナスセンスウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、合計１０から１１のタンパク質をコードする。インフルエンザウイルスのライフサイクルは、宿主細胞の表面にあるシアル酸含有受容体へヘマグルチニン（ＨＡ）が結合することにより開始し、続いて受容体媒介性エンドサイトーシスが起こる。後期エンドソーム中のｐＨが低くなるとＨＡの立体配座の転換が起こり、それによりＨＡ２サブユニットのＮ末端が曝露する（いわゆる融合ペプチド）。融合ペプチドは、ウイルスおよびエンドソーム膜の融合を開始し、マトリックスタンパク質（Ｍ１）およびＲＮＰ複合体が細胞質中に放出される。ＲＮＰは、ｖＲＮＡをキャプシド化する核タンパク質（ＮＰ）ならびにＰＡ、ＰＢ１およびＰＢ２タンパク質により形成されるウイルスポリメラーゼ複合体からなる。ＲＮＰは核中に輸送され、ここで転写および複製が起こる。ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、３つの異なる反応を触媒する：５’キャップおよび３’ポリＡ構造を有するｍＲＮＡの合成、全長相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の合成、ならびに鋳型としてｃＤＮＡを用いたゲノムｖＲＮＡの合成、である。新たに合成されたｖＲＮＡ、ＮＰ、およびポリメラーゼタンパク質は次に、ＲＮＰに集合し、核から輸出され、そして形質膜に輸送され、ここで子孫ウイルス粒子の出芽が起こる。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質は、感染後期に、シアリルオリゴ糖からシアル酸を除去するという重要な役割を演じ、これにより新しく集合したビリオンを細胞表面から放出し、ウイルス粒子の自己凝集を防止する。ウイルス集合体はタンパク質−タンパク質およびタンパク質−ｖＲＮＡ相互作用に関与しているが、しかしこれらの相互作用の性質はほとんど未知である。
Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスはＡ型インフルエンザウイルスと構造的および機能的に類似するが、いくつかの差異が存在する。例えばＢ型インフルエンザウイルスのＭセグメントは、２種類のタンパク質Ｍ１及びＢＭ２をタンデム・シストロンの終結−再開スキームを介してコードしており、そしてＮＡセグメントは、２シストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）のｍＲＮＡよりＮＡ及びＮＢタンパク質をコードしている。７のｖＲＮＡセグメントを有するＣ型インフルエンザウイルスは、スプライシング転写産物に依存してＭ１タンパク質を産生し、スプライシングされていないｍＲＮＡ産物はタンパク質分解により切断されてＣＭ２タンパク質を産生する。加えて、Ｃ型インフルエンザウイルスは、個々のＨＡ及びＮＡタンパク質ではなくＨＡエステラーゼ（ＨＥＦ）をコードする。
Ａ型インフルエンザウイルスのウイルス膜にまたがるのは、３種のタンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、およびＭ２である。ＨＡおよびＮＡの細胞外ドメイン（外部ドメイン）は、非常に可変であるが、Ｍ２の細胞外ドメインは、インフルエンザＡ型ウイルス間で本質的に不変である。イオンチャネル活性を有するＭ２タンパク質（Ｐｉｎｔｏら、１９９２）は、宿主細胞への侵入およびウイルスＲＮＡの脱殻の間のウイルスのライフサイクルの初期状態で機能すると考えられている（ＭａｒｔｉｎおよびＨｅｌｅｎｉｕｓ、１９９１；Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、１９９２；Ｓｕｇｒｕｅら、１９９０参照）。一旦ビリオンがエンドサイトーシスを受けると、ビリオン関連Ｍ２イオンチャネルであるホモ四量体のヘリックス束を通ってプロトンがエンドソームからビリオンの内部へと流入できるようになるため、酸に不安定なＭ１タンパク質−リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の相互作用を妨げ、よって細胞質へのＲＮＰの放出が促進されると考えられている（Ｈｅｌｅｎｉｕｓ、１９９２参照）。加えて、ＨＡが細胞内で開裂するいくつかのインフルエンザ株（例えばＡ／ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅｓ／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４）では、Ｍ２イオンチャネルがトランス・ゴルジ網のｐＨを上昇させることでトランス−ゴルジ網の内部が低ｐＨ条件になるためにＨＡの構造変化が抑制されると考えられている（Ｈａｙら、１９８５；Ｏｈｕｃｈｉら、１９９４；ＴａｋｅｕｃｈｉおよびＬａｍｂ、１９９４）。
本発明に使用できる細胞系
インフルエンザウイルスの効率的な複製に寄与する任意の細胞、例えば、２９３ＴまたはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞等のヒト、若しくはイヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ミンクのＭｖＬｕｌ細胞等のげっ歯類、若しくはＣＨＯ細胞等のハムスター、Ｖｅｒｏ細胞等の非ヒト霊長類、若しくはＭＤＣＫ細胞等の非霊長高等脊椎動物細胞、及びＡＸ４細胞等のこれらの変異細胞を含む任意の鳥類または哺乳類細胞がインフルエンザウイルスを単離および／または増殖させるのに使用できる。単離ウイルスは、再集合体ウイルスを調製するのに使用できる。一の実施形態では、ワクチン生産のための宿主細胞は、哺乳動物または鳥類の連続細胞系または細胞株である。最終生成物の純度についての適切な検査を含めることができるよう、使用する細胞を完全に特性評価してもよい。細胞の特性評価に使用できるデータとして、（ａ）その起源、由来、及び系統に関する情報；（ｂ）その成長および形態学的特徴に関する情報；（ｃ）外来性物質についての検査結果；（ｄ）他の細胞系から当該細胞を明らかに識別できるようにするための、生化学的、免疫学的、及び細胞遺伝学的パターンといった明確な特徴；並びに、（ｅ）腫瘍原性についての検査結果などが挙げられる。一の実施形態では、使用する宿主細胞の継代レベルまたは集団倍加はなるべく低い。
一の実施形態では、これらの細胞は、ＷＨＯ承認済みまたは承認可能な連続細胞系である。このような細胞系を承認するための要件としては、動物、卵および細胞培養を検査することに加え、系統、増殖特性、免疫学的マーカー、ウイルス感受性、腫瘍形成能および貯蔵条件のうちの少なくとも１つに関する特性評価を行うことが挙げられる。このような特性評価は、細胞が検出可能な外因性物質を含有しないことを確認するために用いられる。いくつかの国では、核学的評価も必要な場合がある。加えて、腫瘍形成能を、ワクチン製造のために用いるものと同一の継代レベルにある細胞について検査する。ウイルスは、ワクチン製造の前に、一貫性のある結果を出すことが示されている方法によって精製してもよい（例えばＷｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、１９８２参照）。
宿主細胞により産生されるウイルスは、ワクチンまたは遺伝子治療用として調合する前に高純度に精製してもよい。一般的に、精製過程で、細胞ＤＮＡ、その他の細胞構成成分、および外因性物質などが広範に除去される。ＤＮＡを広範に分解するかまたは変性する手法を用いてもよい。
インフルエンザワクチン
本発明のワクチンとしては、本発明の単離組換インフルエンザウイルスが挙げられ、及び任意で、その他の単離インフルエンザウイルス等の１以上のその他の単離ウイルス、あるいは、１以上の単離インフルエンザウイルスまたは１以上のその他病原体に対する１以上の免疫原性タンパク質または糖タンパク質、例えば、１以上の細菌、非インフルエンザウイルス、酵母または真菌由来の免疫原性タンパク質、あるいは、１以上の本発明の単離インフルエンザウイルスの免疫原性タンパク質を含む１以上のウイルスタンパク質（例えば、ＤＮＡワクチン）をコードする単離核酸を含んでもよい。一の実施形態では、本発明のインフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスまたはその他の病原体に対するワクチンベクターであってもよい。
完全ビリオンワクチンは、限外濾過により濃縮し、その後ゾーン遠心分離またはクロマトグラフィーにより精製してもよい。多価ワクチンに含まれるウイルス等の本発明のウイルス以外のウイルスは、例えば、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンを用いた精製の前または後に不活化してもよい。
サブユニットワクチンは、精製糖タンパク質を含む。このようなワクチンは次のように調製してもよい：洗剤を用いた処理により断片化したウイルス懸濁液を用いて、例えば超遠心分離により、表面抗原を精製する。したがってサブユニットワクチンは、主としてＨＡタンパク質を、そしてＮＡも含有する。用いられる洗剤は、例えば臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムといった陽イオン性洗剤、（Ｂａｃｈｍｅｙｅｒ、１９７５）、デオキシコール酸アンモニウムといった陰イオン性洗剤、（Ｌａｖｅｒ＆Ｗｅｂｓｔｅｒ、１９７６；Ｗｅｂｓｔｅｒら、１９７７）、または例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００の名称で市販されているもののような非イオン性洗剤であってもよい。ヘマグルチニンを、ブロメリン等のプロテアーゼでビリオンを処理後に単離し、その後に精製してもよい。その後、もし残りの感染性粒子が不活化されていない場合は、これらを不活化する。サブユニットワクチンを、本発明の弱毒化ウイルスと組み合わせて多価ワクチンとしてもよい。
スプリットワクチンは、脂質を溶解する溶解剤で処理したビリオンを含む。スプリットワクチンは、次のように調製してもよい：上記のようにして得られた（不活化されたまたは不活化されていない）精製ウイルスの水性懸濁液を、撹拌しながら、例えばエチルエーテルまたはクロロホルムといった洗剤と会合する脂質溶媒により処理する。ウイルスエンベロープ脂質が溶解する結果、ウイルス粒子が断片化される。主にヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼからなり、それらの元の脂質環境が取り除かれたスプリットワクチン、ならびにコアまたはその分解産物を含んだ水性相が回復される。スプリットワクチンを、本発明の弱毒化ウイルスと組み合わせて多価ワクチンとしてもよい。
不活化ワクチン
不活化インフルエンザウイルスワクチンは、既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトン処理により、複製ウイルスを不活化することにより得られる。本発明に用いられ得る不活化ワクチンの型として、全ウイルス（ＷＶ）ワクチンまたはサブビリオン（ＳＶ）（スプリット）ワクチンが挙げられる。ＷＶワクチンは、無傷の不活化ウイルスを含有し、一方、ＳＶワクチンは、脂質含有ウイルスエンベロープを可溶化し、その後、残留ウイルスを化学的に不活化する洗剤で破壊した精製ウイルスを含有する。
加えて、用いられ得るワクチンとしては、表面抗原またはサブユニットワクチンと呼ばれる単離ＨＡおよびＮＡ表面タンパク質を含有するものが挙げられる。
弱毒化生ウイルスワクチン
例えば、本発明の組換えウイルスを含む弱毒化生インフルエンザウイルスワクチンも、インフルエンザウイルス感染の予防または治療に用いることができる。弱毒化は、既知の方法に従って、弱毒化供与体ウイルスから複製単離物または再集合ウイルスに弱毒化遺伝子を移入することにより、単一の工程で達成できる。Ａ型インフルエンザウイルスに対する耐性は、まず、ＨＡおよび／またはＮＡ糖タンパク質に対する免疫応答が発達することで仲介されるため、これらの表面抗原をコードする遺伝子は再集合ウイルスまたは臨床単離物由来のものである。弱毒化遺伝子は、弱毒化された親に由来する。このアプローチでは、弱毒化を付与する遺伝子は、一般に、ＨＡおよびＮＡ糖タンパク質をコードしない。
インフルエンザウイルスを再現可能に弱毒化できるウイルス（供与体インフルエンザウイルス）が利用可能である、例えば、寒冷順応（ｃａ）供与体ウイルスを、弱毒化ワクチン製造用に使用できる。弱毒化再集合体生ウイルスワクチンは、ｃａ供与体ウイルスを有毒複製ウイルスと交配することにより生成できる。次に、弱毒化ｃａ供与体ウイルスの表面抗原を保有するウイルスの複製を阻害する適切な抗血清の存在下で、再集合体の子孫を、２５℃（有毒ウイルスの複製に限定）において選択する。使用可能な再集合体は：（ａ）感染性がある、（ｂ）血清反応陰性の非成体哺乳動物および免疫学的に感作された成体の哺乳類に対しても弱毒である、（ｃ）免疫原性を有する、そして（ｄ）遺伝的に安定なものである。ｃａ再集合体の免疫原性は、それらの複製レベルに平行する。したがって新規の野生型ウイルスがｃａ供与体ウイルスの６つの移入可能遺伝子を獲得すると、これらのウイルスは再現可能に弱毒化され、感受性のある哺乳類成体および非成体の双方へのワクチン接種に使用できる。
他の弱毒化突然変異も、これら突然変異体遺伝子を保有する感染性ウイルスが生き残れるような部位特異的突然変異によりインフルエンザウイルス遺伝子中に導入することができる。弱毒化突然変異は、コード領域に加えゲノムの非コード領域にも導入することができる。このような弱毒化突然変異は、ＨＡまたはＮＡ以外の遺伝子、例えばＭ２遺伝子中に導入することもできる。したがって、部位特異的突然変異により導入された弱毒化突然変異を保有する新規の供与体ウイルスが生成され、そしてこのような新規の供与体ウイルスは、ｃａ供与体ウイルスに関して上記されたものと同様の方法で、弱毒化再集合体生ワクチンの候補を製造するのに用いることができる。同様に、その他の既知で適切な弱毒化供与体株は、インフルエンザウイルスと再集合でき、哺乳類のワクチン接種用に適した弱毒化ワクチンを得ることができる。
一の実施形態では、このような弱毒化ウイルスは、元の臨床単離物のものと実質的に同様の抗原決定基をコードするウイルス由来の遺伝子を保持する。これは、弱毒化ワクチンの目的が、ウイルスの元の臨床単離物と実質的に同一の抗原性を提供しつつ、同時に、ワクチンを接種をされた哺乳類において重篤な病態を起こす最小要因となる程度の感染性を引き起さないことだからである。
したがって多価ワクチン中のこれらのウイルスを、動物、例えば哺乳類における免疫応答を誘導するためのワクチンとして、既知の方法に従い弱毒化または不活化し調合および投与することができる。このような弱毒化または不活化ワクチンが臨床単離物またはそれに由来する高増殖株のものと類似の抗原性を有する否かを確認するための方法は、当該技術分野で周知である。このような既知の方法として、供与体ウイルスの抗原決定基を発現するウイルスを排除するための抗血清または抗体の使用；化学的選択（例えばアマンタジンまたはリマンチジンによる）；ＨＡおよびＮＡの活性化および阻害；ならびに抗原決定基をコードする供与体遺伝子（例えばＨＡまたはＮＡ遺伝子）が弱毒化ウイルス中に存在しないことを確認するための核酸スクリーニング（例えばプローブハイブリダイゼーションまたはＰＣＲ）が挙げられる。
医薬組成物
例えば経鼻、非経口、又は経口投与などの接種に適した本発明の医薬組成物として、例えば、１以上の弱毒化または不活化インフルエンザウイルス等の１以上のインフルエンザウイルス単離物、それらのサブユニット、それらの単離タンパク質、および／または１以上のそれらのタンパク質をコードする単離核酸を含み、さらに任意で滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液を含む。この組成物は、さらに、当該技術分野で既知の助剤または賦形剤を含むこともできる。本発明の組成物は一般に、個別用量（単位用量）の形態で提供される。
従来のワクチンは、一般に、組成物中において約０．１〜２００μｇ、例えば、３０〜１００μｇの各株由来のＨＡを含有する。本発明のワクチン組成物の主要成分を構成するワクチンは、単種のインフルエンザウイルスからなれるものであってもよく、または、例えば１以上の再集合体を含む少なくとも２または３種のインフルエンザウイルスの組み合わせであってもよい。
非経口投与用の調製物としては、滅菌された水性もしくは非水性の溶液、懸濁液、および／または乳液が挙げられ、これらは当該技術分野で既知の助剤または賦形剤を含んでもよい。非水性の溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油といった植物油、およびオレイン酸エチルといった注射可能な有機エステルがある。担体または閉鎖包帯を、皮膚浸透性を増大し抗原吸収を増強するために用いてもよい。経口投与用の液体剤形は、一般に、液体剤形を含むリポソーム溶液を含んでもよい。リポソームを懸濁するための適切な形態としては、当該技術分野で一般的に用いられる不活性希釈剤、例えば精製水を含有する乳液、懸濁液、溶液、シロップ、およびエリキシルが挙げられる。このような組成物は、不活性希釈剤のほかに、アジュバント、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、または甘味剤、風味剤、若しくは香料等を含んでもよい。
本発明の組成物を個体への投与に用いるとき、さらに、塩、緩衝剤、アジュバントまたは該組成物の効力の向上に望ましい他の物質を含むことができる。ワクチンのために、特定の免疫応答を増大できる物質であるアジュバントを用いることができる。通常は、アジュバントおよび組成物を混合してから免疫系へ提示するか、あるいは免疫感作を受ける生物の同一の部位に別々に提示する。
少なくとも２種のインフルエンザウイルス株、例えばその内２〜２００株または任意の範囲もしくは数値内の複製のインフルエンザウイルスを混合することにより、ワクチンが異種性となる。ワクチンは、当該技術分野で既知の技法を用いてインフルエンザウイルス単一株のバリエーションにしてもよい。
本発明の医薬組成物は、さらにまたは付加的に、例えば遺伝子治療、免疫抑制剤、抗炎症剤、または免疫増強剤の用途、およびワクチン用に、少なくとも１つの化学療法化合物を含んでもよく、化学療法剤としては、ガンマグロブリン、アマンタジン、グアニジン、ヒドロキシベンズイミダゾール、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−アルファ、チオセミカルバルゾン、メチサゾン、リファムピン、リバビリン、ピリミジン類似体、プリン類似体、フォスカルネット、ホスホノ酢酸、アシクロビル、ジデオキシヌクレオシド、プロテアーゼ阻害剤またはガンシクロビルが挙げられるが、これらに限定されない。
また、この組成物は、可変で少量の内毒素無含有のホルムアルデヒド、ならびに安全かつ該組成物を投与する生物体中で望ましくない作用に関与しないと判明した防腐剤を含有することもできる。
医薬目的
組成物の投与（またはそれから生じる抗血清）は、「予防」または「治療」目的のいずれかであってもよい。予防目的の場合、ワクチンである本発明の組成物は、病原体感染による症状または臨床的兆候が顕在化する前に投与する。組成物を予防的に投与すると、その後の感染を防止または弱めるのに役立つ。予防目的の場合、本発明の遺伝子治療組成物は、病気のある種の症状または臨床的兆候が顕在化する前に投与する。組成物を予防的に投与すると、疾患に関連した１以上の症状または臨床的兆候を防止または弱めるのに役立つ。
治療目的の場合、ウイルスワクチンは、実際の感染による症状または臨床的兆候を検出してから投与する。組成物を治療的に投与すると、実際の感染を弱めるのに役立つ。治療目的の場合、遺伝子治療組成物は、疾患による症状または臨床的兆候を検出してから投与する。当該化合物を治療的に投与すると、その疾患による症状または臨床的兆候を弱めるのに役立つ。
したがって、本発明のワクチン組成物は、（予期される感染を防止もしくは弱めるため）感染のが起こる前に投与してよい、または実際の感染が起こった後に投与してよい。同様に、遺伝子治療用途として、この組成物を、病気もしくは疾患の症状または臨床的兆候が顕在化する前、あるいは、１または複数の症候を検出した後に投与してもよい。
ある組成物について、それを投与してもレシピエントの哺乳類が耐えうる場合、「薬理学的に許容可能」であるといわれる。このような物質について、その投与量が生理学的に有意である場合、「治療的有効量」で投与されると言われる。本発明の組成物について、それの存在による結果としてレシピエント患者の生理機能に検出可能な変化がある場合、例えば、感染性インフルエンザウイルスの少なくとも１つの株に対する一次的または二次的な体液性または細胞性免疫応答のうち少なくとも１つを増強するような場合、生理学的に有意である。
供される「防御」が絶対的である必要はない、すなわち、インフルエンザ感染は、哺乳類の集団または組と比較して、統計学的に有意な改善があるなら、全体的に防止または根絶される必要はない。防御については、インフルエンザウイルス感染の症状もしくは臨床的兆候の発現の重症度または速度を緩和するものに限定してもよい。
製剤投与
本発明の組成物は、受動免疫法または能動免疫法のいずれかにより、１以上の病原体、例えば、１以上のインフルエンザウイルス株に耐性を付与するものであってもよい。能動免疫法では、弱毒化生ワクチン組成物を宿主（例えば哺乳類）に予防的に投与し、宿主が投与に対して免疫応答することにより感染および／または疾患から防御する。受動免疫法では、誘発された抗血清を回収し、少なくとも１のインフルエンザウイルス株により感染したと疑われるレシピエントに投与する。本発明の遺伝子治療組成物は、予防的または治療的レベルの所望の遺伝子産物を能動免疫法により産生してもよい。
一の実施形態では、ワクチンは、（胎盤を通じてまたは母親の乳汁中に抗体を受動的に混入することにより）雌および胎児の両者または新生児を防御するための免疫応答形成を引き起こすのに十分な時間および量があるという条件の下、（妊娠もしくは分娩時またはその前の）哺乳類の雌に投与される。
したがって、本発明は、例えば病原体の少なくとも１つの株による感染などの病気または疾患を防止または弱めるための方法を包含する。本明細書中で用いる場合、ワクチンを投与すると、疾患の臨床的兆候または状態が全体的または部分的に弱まり（即ち抑制）、あるいはその疾患に対し個体に全体的または部分的な免疫が生ずるような場合、ワクチンは疾患を防止または弱めると言う。本明細書中で用いる場合、遺伝子治療組成物を投与すると、疾患の臨床的兆候または状態が全体的または部分的に弱まり（即ち抑制）、あるいはその疾患に対し個体に全体的または部分的な免疫が生ずるような場合、遺伝子治療組成物は疾患を防止または弱めると言う。
弱毒化した１のウイルスおよび１以上の他の単離ウイルス、それらの１以上の単離ウイルスタンパク質、それらの１以上のウイルスタンパク質をコードする１以上の単離核酸分子、あるいはこれらの組み合わせ、を含む本発明の少なくとも１つのインフルエンザウイルスを有する組成物は、意図した目的を達成するような任意の手段により投与できる。
例えば、このような組成物の投与は、種々の非経口経路、例えば皮下、静脈内、皮膚内、筋肉内、腹腔内、経鼻、経口または皮膚経路によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注入又は時間をかけた緩やかな灌流によって達成できる。
インフルエンザウイルスに関連する病変を予防し、抑制し、または治療するための典型的レジメンは、本明細書中に記載されるような有効量のワクチン組成物の投与、単一治療としての投与、あるいは１週間〜約２４ヶ月以内、あるいはその中の任意の範囲または数値を含む期間にわたる強化または追加投与としての反復投与を包含する。
本発明によれば、組成物の「有効量」は、所望の生物学的作用を達成するのに十分な量のことである。有効投与量は、レシピエントの種、年齢、性別、健康状態および体重、もしあれば、併用療法の種類、治療の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存すると理解される。以下に示す有効用量の範囲は、本発明を限定して用量の範囲を示すという意図ではない。
哺乳類成体生物等の動物用の弱毒化生ウイルスワクチンまたは死滅ウイルスワクチンの投与量は、例えば１０3〜１０12等の約１０2〜１０15のプラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｋｇ、またはその中の任意の範囲もしくは数値であってもよい。不活化ワクチンの用量は、ＨＡタンパク質なら、例えば、約１５μｇといった１０〜１００μｇ等の約０．１〜１０００の範囲内であってもよい。しかしながら投与量は、出発点として既存のワクチンを用いて慣用法により決定する場合、安全且つ有効な量であるべきである。
複製ウイルスワクチンの各用量での免疫反応性ＨＡの投与量は、適量、例えば、約１５μｇといった３０〜１００μｇまたはその中の任意の範囲もしくは数値、あるいは政府機関もしくは認識専門機関が推奨する量になるよう標準化してもよい。また、ＮＡの量も標準化することができるが、この糖タンパク質は精製および貯蔵中に不安定になるおそれがある。
複製ウイルスワクチンの各用量での免疫反応性ＨＡの投与量は、適量、例えば、１〜５０μｇまたはその中の任意の範囲もしくは数値、あるいは米国公衆衛生局（ＰＨＳ）が推奨する量、通常、３歳以上の小児用には構成成分あたり１５μｇ、そして３歳未満の小児用には構成成分あたり７．５μｇになるよう標準化することができる。また、ＮＡの量も標準化することができるが、しかし、この糖タンパク質はプロセッサー精製および貯蔵中に不安定になるおそれがある（Ｋｅｎｄａｌら、１９８０；Ｋｅｒｒら、１９７５）。各０．５ｍｌ用量のワクチンにつき、約１〜５００億のウイルス粒子、好ましくは１００億の粒子を含有してもよい。
以下の非限定的な実施例により、本発明をさらに説明する。
実施例１
ＰＢ２組み込み配列
Ａ型インフルエンザウイルスの最も欠損しているＲＮＡセグメントは、それぞれの遺伝子セグメントの５’および３’末端に対応する１５０〜３００ヌクレオチドを保有する（Ｄｕｈａｕｔら、１９９８；Ｊｅｎｎｉｎｇｓら、１９８３；Ｎｏｂｌｅら、１９９５；およびＯｄａｇｉｒｉら、１９９０）。このことより、これらの３００〜６００ヌクレオチドが効率的なゲノムパッケージングに必要な構造的特徴を有している可能性が示唆される。ＰＢ２、ＰＢ１、およびＰＡ ｖＲＮＡにおけるｖＲＮＡビリオンの取り込みおよびビリオンの形成に重要な領域を同定するために、ＧＦＰ遺伝子が、非コード領域および両末端に由来するコード領域の一部にフランキングされているプラスミド［ＰＢ２（３００）ＧＦＰ（３００）、ＰＢ１（３００）ＧＦＰ（３００）、およびＰＡ（１２０）ＧＦＰ（１２０）］を作製した。このようなプラスミドを、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰタンパク質の発現プラスミド（ｖＲＮＡの転写および複製に最小限の構成要素）と共に２９３Ｔ細胞へ形質移入したところ、細胞においてＧＦＰの発現がみられる結果となった。このことより、キメラｖＲＮＡが、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩによって合成され、発現プラスミドによって生産されたウイルスタンパク質によりｍＲＮＡに転写されたことが示唆される。
ｖＲＮＡビリオンの取り込み効率を計算するには、検査ｖＲＮＡを含むビリオンの数をＶＬＰの合計数と比較する必要がある。ＶＬＰの総数は、細胞をＶＬＰで接種した後、所定のインフルエンザウイルスからの保護を発現する細胞の数をカウントすることによって決定できた。この方法により決定された感染性ＶＬＰの数がマーカーとして選択されるウイルス遺伝子産物により大きな影響を受けなかったことを確認するために、我々は、ＨＡまたはＮＰのいずれかを発現する細胞の数を決定した。ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡ ｖＲＮＡの取り込み効率を検査するので、機能性ポリメラーゼタンパク質を供するヘルパーウイルスが必要であった。（ＷＳＮウイルス由来の）検査ＶＬＰから発現したＨＡおよびＮＰタンパク質と、ヘルパーＰＲ８ウイルスから発現したものとを区別するために、我々はＷＳＮ ＨＡおよびＮＰタンパク質を認識するがＰＲ８ウイルスの対応物は認識しない抗生物質を使用した。
生成したＶＬＰの数の評価が可能な系を確立するために、２９３Ｔ細胞を、（ＰＢ２、ＰＢ１、またはＰＡセグメント由来の）検査ｖＲＮＡの転写用プラスミド、残りのｖＲＮＡ生産用の７のプラスミド、およびウイルスタンパク質（すなわち、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、およびＮＳ２）発現用の１０の発現プラスミドで形質移入した。４８時間後、形質移入細胞に由来するＶＬＰを含有する上清を、ＰＲ８ヘルパーウイルスと混合し、ＭＤＣＫ細胞に感染させた。感染から１２時間後に、ＨＡまたはＮＰタンパク質のいずれかを発現した細胞の数を決定した。３つ全てのｖＲＮＡについて、ＨＡとＮＰ発現細胞数の差は３倍未満であった、例えば、ＰＢ２（３００）ＧＦＰ（３００）検査ｖＲＮＡでは、２４０８００のＨＡ発現細胞に対し３５３２００のＮＰ発現細胞が検出された。したがって、その後の実験では、ＨＡ発現細胞の数を、感染性ビリオン形成の効率の指標として用いた。検査ｖＲＮＡの取り込み効率は、よって、（検査ｖＲＮＡのマーカーとしての）ＧＦＰ発現細胞の数を（ビリオンの数のマーカーとしての）ＨＡ発現細胞の数およびＧＦＰ発現細胞の数の和で割ることによって計算した。
ＰＢ２ ｖＲＮＡのコード領域中の配列は、感染性ビリオンの形成およびｖＲＮＡビリオンの取り込みに影響する。ビリオン形成および／またはｖＲＮＡビリオン取り込みのために重要なＰＢ２ｖＲＮＡにおける配列を明らかにするために、ＰＢ２ ｖＲＮＡの非コード領域に加え、ＧＦＰを発現し、両末端由来のＰＢ２コード領域の一部を含むＰＢ２ ｖＲＮＡ生産用の一連のプラスミドを作製した（図１）。ＶＬＰ数および検査ｖＲＮＡの取り込み効率は、上述のように決定した。
ＰＢ２ ｖＲＮＡの５’および３’コード領域に対応する３００ヌクレオチドを含むＰＢ２（３００）ＧＦＰ（３００）については、ｍＬ当たり約２．８×１０6のＶＬＰが検出された。ｖＲＮＡの３’末端におけるコード配列（３’コード領域と呼ぶ）を段階的に削除しても、ＶＬＰ生産効率にはほんのわずかな影響しか示さず、３’末端の全コード配列を欠くＰＢ２（０）ＧＦＰ（１２０）でもｍＬ当たり約１×１０6ＶＬＰの生産があった。しかし、ｖＲＮＡの５’末端におけるコード配列（５’コード領域と呼ぶ）を削除すると［ＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（０）］、ＶＬＰ生産がＰＢ２（３００）ＧＦＰ（３００）の９８％も減少し、ＰＢ２ ｖＲＮＡ無しの場合［ＰＢ２（−）］に匹敵するほどのＶＬＰ数であった。この結果により、ＰＢ２ ｖＲＮＡの５’コード領域中の配列が感染性ビリオンの効率的な生成に重要であることが示唆される。さらなる分析により、この作用には、５’コード領域の３０ヌクレオチドが［ＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（０）およびＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（３０）のＶＬＰ数に比較すると］重要であることが明らかになった。
ｖＲＮＡビリオンの取り込みの効率に関し、５４．７％のＶＬＰがＰＢ２（３００）ＧＦＰ（３００）検査ｖＲＮＡを保有しており、これは、両端の３００末端ヌクレオチドが存在すればビリオンの取り込みに十分であることを示している。野生型セグメントでみられるような取り込み効率を達成するには、おそらく内部ＰＢ２コード配列が必要であろう。３０又はこれ以上のヌクレオチドを保持したまま、ＰＢ２ ｖＲＮＡの３’コード領域中のヌクレオチドを段階的に削除しても、ＶＬＰ生産効率にはほんのわずかな影響しか見られなかったが、しかし、これら残りの３０ヌクレオチドを削除すると、ビリオンの取り込み効率がＰＢ２（０）ＧＦＰ（１２０）については２９．５％減少した。これは、この領域がビリオンへＰＢ２ ｖＲＮＡの効率的な取り込みに重要であることを示している。５’コード領域における配列は、３’コード領域における機能的パッケージング配列を欠くＰＢ２ｖＲＮＡによるビリオン取り込みに寄与しており、これはＰＢ２（０）ＧＦＰ（０）検査ｖＲＮＡが取り込み不可であることにより示される。
対照的に、５’コード領域のみを削除しても、取り込み効率に影響を及ぼさない。これはＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（０）における７５．７％という取り込み率によりわかる。よって、この検査ｖＲＮＡを使用すると、非常に少数の感染性ＶＬＰを生産しながら効率的に検査ｖＲＮＡをこれらの粒子中に取り込めた。この知見は、ＰＢ２ ｖＲＮＡの中の配列が、生物学的に異なる２つのプロセスに関与していることを示唆している：つまり、効率的な感染性ビリオンの形成（５’コード領域に存在する機能）および粒子中への効率的なｖＲＮＡの取り込み（主として３’コード領域に存在する機能）である。
パッケージング効率の差が、２９３Ｔ細胞における検査ｖＲＮＡの転写レベルの差を反映している可能性がある。この可能性を除外するために、プラスミドで形質移入した２９３Ｔ細胞におけるＰＢ２（０）ＧＦＰ（０）およびＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）のレベルを、リアルタイムＰＣＲを用いて調べた。ＰＢ２（０）ＧＦＰ（０）ｖＲＮＡの量は、ＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）の５２％であったが、この差がＶＬＰ生成における９９％の減少およびｖＲＮＡのビリオン取込み抑止の原因になると説明できる可能性は低い。
ＰＢ２ ｖＲＮＡは、効率的な感染性ビリオンを生成にとってＰＢ１またはＰＡ ｖＲＮＡよりも重要である。このように、ＰＢ２ ｖＲＮＡが他のｖＲＮＡビリオンの効率的な取り込みのために重要である一方、他のセグメントが欠落してもある程度耐えうるという階層が存在している可能性がある。
ＰＢ２ ｖＲＮＡを欠くとＶＬＰ生産が約３０倍減少する結果となり、一方、他のｖＲＮＡセグメントを欠いても１．４〜５．１倍しか減少しないという結果となった。これらの結果は、他のｖＲＮＡ セグメントの取り込みにおける個々のｖＲＮＡの重要性に関しｖＲＮＡセグメント間において階層があるというさらなる証拠となった。
実施例２
複製不能なインフルエンザウイルスで外来遺伝子が安定的に発現すると、遺伝子操作ウイルスを効果的に追跡できる。ウイルス学の分野で幅広く応用できる生体含有可能外来遺伝子発現ウイルスを目的として、ＰＢ２タンパク質、ウイルス複製に必須な三量体ウイルスＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの一部を形成するインフルエンザウイルスポリメラーゼサブユニットを選択した。ＰＢ２ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）の３’および５’末端の部分コード配列は、ｖＲＮＡの階層において他のｖＲＮＡよりも、効率的な感染性ビリオン生成における重要な役割を与えるものである（実施例１およびＭｕｒａｍｏｔｏら、２００６）。この知見により、ＰＢ２ ｖＲＮＡのコードおよび非コード配列にフランキングされたレポーター遺伝子を有するＰＢ２ノックアウト（ＰＢ２−ＫＯ）インフルエンザウイルスが、安定して、レポーター遺伝子を発現しつつＰＢ２発現細胞のみにおいて複製することが示される。
安定的にＰＢ２タンパク質を発現する細胞株を確立し、これを使用してＧＦＰ遺伝子を有するＰＢ２−ＫＯウイルスの特性評価をおこなった。また、ＰＢ２−ＫＯウイルスに収容される種々のウイルス株由来のＨＡおよびＮＡ遺伝子並びに他のレポーター遺伝子の能力についても調べた。さらに、このＰＢ２−ＫＯウイルスを、２００９年のパンデミックウイルスに対する中和抗体をスクリーニングするためのプラットフォームとして用いた。
方法
細胞
２９３Ｔヒト胚腎臓細胞（シミアンウイルス４０Ｔ抗原遺伝子を挿入した２９３株の派生株（ＤｕＢｒｉｄｇｅら、１９８７））を、１０％ウシ胎児（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｏｎｚａ）内で保持した。メイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、５％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含有最小必須培地（ＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で保持した。ＭＤＣＫ細胞由来でかつヒト２，６−シアル酸転移酵素のｃＤＮＡで形質移入したＡＸ４細胞（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、２００５）を、５％ＮＣＳ／ＭＥＭ＋ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）内で保持した。レトロウイルスベクターで形質導入することにより確立したＡＸ４／ＰＢ２細胞（ＰＢ２タンパク質を安定して発現するＡ／ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４由来のＡＸ４細胞（Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）（結果の欄を参照）を、５％ＮＣＳ／ＭＥＭ＋ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）＋ブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）内で保持した。全ての細胞を、３７°Ｃ、５％ＣＯ2で保持した。
逆遺伝学的手法およびウイルス増殖
ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターとの間にＰＲ８ウイルス遺伝子のｃＤＮＡを含有するプラスミド（ＰｏｌＩプラスミドと呼ぶ）及び、真核生物タンパク質発現プラスミド（ＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）を用い、Ｎｅｕｍａｎｎら（１９９９）に記載のようなニワトリβ−アクチンプロモーター（Ｎｉｗａら、１９９１）の制御下で逆遺伝学的手法を行った。簡潔に言うと、野生型ＰＲ８ウイルスを、あらかじめ作製した８のＰＲ８由来野生型構築物（Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、２００７）を用いて遺伝子操作し、一方、ＰＢ２−ＫＯ変異体を、ｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）（図３Ａ）（Ｍｕｒａｍｏｔｏら、２００６）および残りの７つのセグメントのＰｏｌ１プラスミドから構成した。このｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）プラスミドは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１、ＷＳＮ）由来３’ＰＢ２非コード領域、ｖＲＮＡの３’末端のＰＢ２コード配列に対応する１２０ヌクレオチド、それに続いて、ＧＦＰコード配列、ｖＲＮＡの５’末端のＰＢ２コード配列に対応する１２０ヌクレオチド、そして最後に、５’ＰＢ２非コード領域、を含む（Ｍｕｒａｍｏｔｏら、２００６）。同様に、ｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）Ｆｌｕｃ（１２０）およびｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）Ｒｌｕｃ（１２０）を構築し、それぞれ、ホタルルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）またはウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）遺伝子を有するＰＢ２−ＫＯウイルスを作製した。８のＰｏｌＩプラスミドおよびタンパク質発現プラスミドを、形質移入試薬ＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）と混合し室温で１５分間インキュベートして、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した１０6の２９３Ｔ細胞に加えた。形質移入から４８時間後、野生型ＰＲ８またはＰＢ２−ＫＯウイルスを含む上清を採取し、それぞれ、１０日齢の孵化鶏卵またはＡＸ４／ＰＢ２細胞内で増殖させた。また、野生型ＣＡ０４も、Ｙａｍａｄａら（２０１０）に記載のような逆遺伝学的手法を用いて生成し、ＭＤＣＫ細胞内で増殖させた。これらの増殖ウイルスを、ＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイを用いて滴定しウイルスのプラーク形成単位（ＰＦＵ）を決定した。
ＰＢ２タンパク質の免疫蛍光染色
３５ｍｍのガラスボトムディッシュ（旭テクノグラス社）に播種したコンフルエントなＡＸ４およびＡＸ４／ＰＢ２細胞を、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬株式会社）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。細胞を抗ＰＢ２抗体クローン１８／１（Ｈａｔｔａら、２０００）と共にインキュベートし、さらにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４−標識抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内でインキュベートした。サンプルは、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）下で観察した。
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＢ２ ｍＲＮＡを検出するために、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて抽出した。ウイルスＲＮＡを、ＱＩＡｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてビリオンから単離した。逆転写およびｃＤＮＡ合成を、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。ＲＴマイナスサンプルを陰性対照として調製した。合成されたｃＤＮＡを、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）およびＰＢ２特異的プライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。プライマー配列は次の通りである：フォワードプライマー、ＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＡ（配列番号９）、及びリバースプライマーＧＣＣＡＣＡＡＴＴＡＴＴＧＣＴＴＣＧＧＣ（配列番号１６）。
成長速度およびウイルス力価測定
ウイルスの増殖率を決定するために、コンフルエントなＡＸ４またはＡＸ４／ＰＢ２細胞の３連ウェルを０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。ウイルス吸着の１時間後に、細胞を０．３％ＢＳＡ含有するＭＥＭ中で洗浄し、Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）で処理したトリプシン（０．５μｇ／ｍＬ）を含有するＭＥＭで重層した。上清を３日間１２時間ごとに回収し、ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるプラークアッセイで感染性ウイルスについてアッセイした。
免疫染色
ＧＦＰレポーター遺伝子のＰＢ２−ＫＯウイルス内への取り込みの安定性を評価するために、ＡＸ４／ＰＢ２細胞を様々なＰＢ２−ＫＯウイルス希釈液に感染させた（希釈なし〜１０-10）。細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された２番目〜最後のウェルより上清を採取し、その後の感染用に希釈した。ウイルス継代５ラウンドからの上清について、標準的なウイルスプラークアッセイを行った。形成されたプラーク数を計数した後、寒天を除去し、プラークを含むウェルを１００％メタノールで３０分間固定した。その後ウェルをＰＢＳで洗浄し、モノクローナル抗ＧＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ ＧＦＰ−２０；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に１時間室温でインキュベートした。免疫組織化学的染色を、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキットの説明書（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に従い、ビオチン化抗マウス抗体を用いて行った。ＧＦＰ陽性プラークを、Ｓｉｇｍａ Ｆａｓｔ ３，３’−ジアミノベンジジン錠剤（Ｓｉｇｍａ）を用いて可視化し、ＧＦＰ陽性プラークの数を、各ウェルに形成されたプラーク総数に対する割合として計算した。
ＨＡタンパク質の免疫蛍光染色
ＰＲ８、ＷＳＮ、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（ＣＡ０４）、またはＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４（ＶＮ１２０３）由来のＨＡおよびＮＡ ｖＲＮＡを保有しＧＦＰをコードするＰＢ２−ＫＯウイルスを、上述したような逆遺伝学的手法を用いて生成し、ＡＸ４／ＰＢ２細胞内で増殖させた。ＶＮ１２０３ ＨＡ開裂部位における複数の塩基性アミノ酸残基を、非病原性型の開裂配列で置換した。コンフルエントなＡＸ４／ＰＢ２細胞を、０．２〜１のＭＯＩでこれらのウイルスに感染させた。感染から１６時間後に、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した。次いで、細胞を、抗ＷＳＮ ＨＡ抗体（ＷＳ ３−５４）、抗ＣＡ０４ ＨＡ抗体（ＩＴ−０９６；ｅＥＮＺＹＭＥ）、および抗Ｈ５ ＨＡ抗体（ＶＮ０４−１０；Ｒｏｃｋｌ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）と共にインキュベートし；その後さらにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。サンプルを蛍光顕微鏡下で観察した。
ルシフェラーゼアッセイ
ＦｌｕｃまたはＲｌｕｃ遺伝子をコードするＰＢ２−ＫＯウイルスに感染した細胞を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、その説明書に従い、感染から８時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。ＦｌｕｃおよびＲｌｕｃ活性を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００（Ｔｅｃａｎ）プレートリーダーを用いて測定した。
微量中和アッセイ
血清は、１０6ＰＦＵの野生型ＣＡ０４に感染後３週間の２匹のフェレットおよび２匹の非感染フェレットから回収した。受容体破壊酵素（デンカ生研株式会社）の２倍希釈系列で処理したフェレットの血清を、１００ＰＦＵの野生型ＣＡ０４またはＣＡ０４由来のＨＡおよびＮＡ ｖＲＮＡを有しＲｌｕｃをコードするＰＢ２−ＫＯウイルス（ＣＡ０４／ＰＢ２−Ｒｌｕｃ）に混合した。３７℃で１時間インキュベートした後、野生型ＡＸ４またはＡＸ４／ＰＢ２細胞は、３連ウェル中でそれぞれ野生型ウイルス血清混合物またはＰＢ２−ＫＯウイルス血清混合物を接種し、野生型ウイルスまたはＰＢ２−ＫＯウイルスについてそれぞれ３日間または２４時間ンキュベートした。フェレット血清の中和活性を、野生型ウイルスまたはＰＢ２−ＫＯウイルスのそれぞれについて、顕微鏡で観察したＣＰＥ又はウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定したＲｌｕｃ活性に基づき決定した。
結果
ＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰウイルスの特性評価
安定的にＰＢ２タンパク質を発現する細胞系を確立するために、野生型ＭＤＣＫ細胞と比較して臨床的インフルエンザ単離物をより良好に複製できるメイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞由来でかつヒト２，６−シアル酸転移酵素を過剰発現するＡＸ４細胞（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、２００５）を、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１、ＰＲ８）ＰＢ２タンパク質のｃＤＮＡ、続いて脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム侵入部位配列、およびブラストサイジン耐性遺伝子を有するレトロウイルスベクターで形質導入した。ブラストサイジン耐性細胞クローンをＡＸ４／ＰＢ２と命名した。ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＢ２タンパク質のｍＲＮＡの発現を確認するために、全ＲＮＡをＡＸ４／ＰＢ２および野生型ＡＸ４細胞から抽出し、ＰＢ２特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行った。ＡＸ４／ＰＢ２細胞ではＰＢ２ ｍＲＮＡが検出されたが、野生型ＡＸ４細胞では検出されなかった（図３Ｂ）。さらにＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＢ２タンパク質の発現を検証するために、ＡＸ４／ＰＢ２細胞の免疫蛍光染色をＰＢ２特異的モノクローナル抗体を用いて行った。ＡＸ４／ＰＢ２細胞およびいくつかのＰＢ２タンパク質発現プラスミドで形質移入されたＡＸ４細胞（陽性対照として使用）では蛍光シグナルが検出されたが、野生型ＡＸ４細胞ではシグナルが検出されなかった（図３Ｃ）。これらの結果により、ＡＸ４／ＰＢ２細胞がＰＢ２タンパク質を安定的に発現していることが示される。
ＰＢ２発現細胞がＰＢ２−ＫＯウイルス複製をサポートしているのか否かを調べるために、ＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰと呼ばれる、ＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）ｖＲＮＡを有するＰＲ８ベースのＰＢ２−ＫＯウイルス（図３Ａ）を作製し（表１）、ＡＸ４／ＰＢ２および野生型ＡＸ４細胞に感染させた（図３Ｄ）。野生型ＡＸ４細胞では感染性ウイルスが検出されなかったが、ＡＸ４／ＰＢ２細胞では野生型ＰＲ８に匹敵するＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰウイルスの複製がみられた（図３Ｄ）。これらの結果により、ＰＢ２−ＫＯウイルスの複製はＰＢ２を発現する細胞に限定的であることが示される。
ＰＢ２−ＫＯウイルスにおけるレポーター遺伝子の安定性を、ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰウイルスの連続継代により確認した。形成された総プラークに対するＧＦＰ発現プラークを計算し、ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するプラーク形成ウイルスの割合を決定したところ（表２）、５継代にわたり、８０％〜９０％のプラーク形成ウイルスがＧＦＰを発現した。ＰＢ２−ＫＯウイルスは、ＡＸ４／ＰＢ２細胞で５連続継代した後であっても、野生型細胞においてプラークを形成できなかった。このことにより、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、ＰＢ２−ＧＦＰ ｖＲＮＡおよび細胞により発現されたＰＢ２ ｍＲＮＡ間での組み換えによる複製可能な遺伝子型への復帰が起こりにくいことが示唆される。７つのｖＲＮＡセグメントを有するＰＢ２遺伝子欠損ウイルス（ＰＲ８ΔＰＢ２、表１）を救出する試みを行ったが、ＰＲ８ΔＰＢ２形質移入後の上清を接種したＡＸ４／ＰＢ２または野生型ＡＸ４細胞において、細胞変性効果（ＣＰＥ）およびＮＰタンパク質発現のいずれも見られなかった（データは図示せず）。これらの結果により、感染性ビリオンの効率的な生成には、ＰＢ２ ｖＲＮＡが重要であること（Ｍｕｒａｍｏｔｏら、２００６）が強調される。
*それぞれのウイルス上清について、コンフルエントなＡＸ４／ＰＢ２細胞中で標準的なウイルスプラークアッセイを行った。ウェル当たり１０プラークをマークして、その後、抗ＧＦＰ抗体を用いた免疫検出アッセイを行いＧＦＰを発現するウイルスプラークを検出した。全プラーク中で茶色に染色されたプラークの割合を示す。３つの独立した実験（実験１〜３）の結果を示す。
ＰＢ２−ＫＯウイルスにおける異なるＨＡおよびＮＡ遺伝子の機能的発現
Ａ型インフルエンザビリオン上の２つの表面糖タンパク質、赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）が主要な防御抗原である（Ｗｒｉｇｈｔら、２００７）。特に、ＨＡは細胞接着を仲介するので、ＨＡに対する抗体がウイルス中和に重要である。ＰＲ８ウイルスベースのＰＢ２−ＫＯウイルスの関連糖タンパク質が、他のウイルス株由来ものに置換可能か否かについて検査した。この目的のために、ＰＲ８ ＨＡおよびＮＡ ｖＲＮＡを実験Ｈ１Ｎ１株Ａ／ＷＳＮ／３３（ＷＳＮ／ＰＢ２−ＧＦＰ）、２００９パンデミック（Ｈ１Ｎ１）株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（ＣＡ０４／ＰＢ２−ＧＦＰ）、又は高病原性Ｈ５Ｎ１株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３／ＰＢ２−ＧＦＰ）由来のものに置換してＧＦＰをコードするＰＢ２−ＫＯウイルスを作製した（表１）。ＡＸ４／ＰＢ２細胞を、これらのウイルスに感染させ、種々の抗ＨＡモノクローナル抗体を用いた免疫蛍光アッセイを行った。ＧＦＰ陽性のウイルス感染細胞において、ウイルス株特異的ＨＡの発現を検出した（図４）。対応するＮＡ ｖＲＮＡがビリオンに取り込まれたことを配列決定により確認した（データは図示せず）。これらの結果により、他のインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子もまたＰＢ２−ＫＯウイルス内に収容することができ、従って、ウイルス感染細胞において発現できることが示される。
ＰＢ２−ＫＯウイルスにおける代替レポーター遺伝子の発現
ルシフェラーゼレポーター遺伝子の活性は、容易に定量可能であり、従って、それをＰＢ２−ＫＯウイルスに組み込めばルシフェラーゼ活性に基づくウイルス複製の測定が可能なはずである。この可能性を調べるために、ＰＢ２ ｖＲＮＡの中のホタル（ＰＲ８／ＰＢ２−Ｆｌｕｃ）またはウミシイタケ（ＰＲ８／ＰＢ２−Ｒｌｕｃ）ルシフェラーゼ遺伝子のいずれかを有するＰＢ２−ＫＯウイルスを生成した（表１）。ＡＸ４／ＰＢ２および野生型ＡＸ４細胞を、種々な感染多重度（ＭＯＩ）でこれらのウイルスに感染させ、感染から８時間後にルシフェラーゼアッセイを行った。ウイルスに感染したＡＸ４／ＰＢ２細胞では、ＦｌｕｃおよびＲｌｕｃ活性が用量依存的に検出され、それぞれ０．１および０．００１のＭＯＩでのウイルス感染だと、有意なＦｌｕｃとのＲｌｕｃ活性の検出に適切であった（図５Ａ）。対照的に、ウイルス感染細胞において有意なＧＦＰの強度を検出するには、１以上のＭＯＩでＰＲ８／ＰＢ２−ＧＦＰを感染させる必要があった（図５Ｂ）。これらの結果により、Ｆｌｕｃ及びＲｌｕｃ遺伝子がＰＢ２−ＫＯウイルス内に収容可能で、そしてＧＦＰ遺伝子の場合よりもより定量的なウイルス複製の指標となることが示される。ＰＲ８／ＰＢ２−ＦｌｕｃおよびＰＲ８／ＰＢ２−Ｒｌｕｃに感染した野生型ＡＸ４細胞もまた、それぞれ、検出可能なＦｌｕｃおよびＲｌｕｃ活性を示し、それぞれＰＲ８／ＰＢ２−Ｆｌｕｃでは１を上回るＭＯＩ、ＰＲ８／ＰＢ２−Ｒｌｕｃでは０．０１のＭＯＩであったが、両レポーター遺伝子の活性はＡＸ４／ＰＢ２細胞において検出されたものに比べて１０分の１より低かった（図５Ａ）。ＰＢ２タンパク質は、野生型ＡＸ４細胞にトランスで供されないので、これらのレポーター遺伝子が発現する場合は、導入ウイルス由来のウイルスリボ核タンパク質（すなわちＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、及びＮＰ）が、野生型ＡＸ４細胞において有意に高いレベルでＰＢ２−ＫＯウイルスのＰＢ２ ｖＲＮＡの転写を仲介していることが示唆される。
ＰＢ２−ＫＯウイルスに基づく微量中和
レポーター遺伝子を発現する生体含有可能インフルエンザウイルスは、プレートリーダーアッセイによって成長を定量できるので、従来のウイルス複製評価システムの一部を代替できる可能性がある。抗血清の中和活性は、典型的には、従来の微量中和アッセイを用いて決定される（Ｉｔｏｈら、２００９；Ｋｏｂａｓａら、２００４）。これは、酵素結合免疫吸着アッセイを用いた検出によるウイルス感染誘発性ＣＰＥ又はウイルス抗原の有無に基づいて中和抗体の検出を可能にするものである。ＰＢ２−ＫＯウイルスを使用して２００９パンデミックウイルスに対する中和抗体を検出するために、Ｒｌｕｃ遺伝子をコードするＰＢ２ ｖＲＮＡおよびＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９由来のＨＡおよびＮＡ ｖＲＮＡを有するＰＢ２−ＫＯウイルスを生成した（ＣＡ０４／ＰＢ２−Ｒｌｕｃ）。ＣＡ０４／ＰＢ２−Ｒｌｕｃ（１００ＰＦＵ）をＣＡ０４に感染したフェレットから回収した抗血清の連続希釈液と混合し、３７℃で１時間インキュベートした。非感染フェレットからの血清をネガティブコントロールとした。ウイルス血清混合物をＡＸ４／ＰＢ２細胞に接種した。感染から２４時間後、細胞内のＲｌｕｃ活性をウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。検出感度を比較するために、ＣＰＥに基づく従来の微量中和アッセイを使用して、野生型ＣＡ０４および野生型ＡＸ４細胞を用いて同一の抗血清についての中和活性を検査した。ＰＢ２−ＫＯウイルスに基づくアッセイでは、１：１２８０および１：６４０倍に希釈したフェレットの血清がウイルス感染細胞内のＲｌｕｃ活性の有意な減少を引き起こした（図６）。対照的に、従来の微量中和アッセイにおいて決定された同一のフェレット血清の中和力価は、１６０及び８０であった（データは図示せず）。これらの結果により、ＰＢ２−ＫＯウイルスおよびＰＢ２発現細胞の組み合わせにより、従来の微量中和アッセイよりも感度が高い中和抗体の検出方法が提供できることが示される。
考察
ここで、ＰＢ２−ＫＯインフルエンザウイルスは、野生型細胞において複製不能であるが、ＰＢ２タンパク質発現細胞においては複数の複製サイクルを行い得ることが示されている（図３Ｄ）。加えて、ＰＢ２ ｖＲＮＡパッケージングシグナルによりフランキングされたレポーター遺伝子は、安定して子孫ウイルス中に維持され（表１）、ウイルス感染細胞において発現された（図４および５）。また、異なるウイルス株由来のＨＡおよびＮＡ遺伝子もＰＢ２−ＫＯウイルスに収容されたことを確認した（図４）。これらの結果は、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、インフルエンザウイルス学の分野において幅広く使用できる可能性があることを示している。
実用的な応用例として、ＰＢ２−ＫＯウイルスに基づく微量中和アッセイを開発し２００９年パンデミックウイルスに対する中和抗体を検出するのに使用した（図６）。このＰＢ２−ＫＯウイルスに基づくアッセイは、中和抗体の検出という点で従来の微量中和アッセイよりも高感度であることが判明した。スクリーニングのプラットフォームとして複製不能ＰＢ２−ＫＯウイルスを使用すると（図３Ｃおよび３Ｄ）、Ｈ５Ｎ１および１９１８株といった通常ＢＳＬ３施設やバイオセーフティーレベル２下の封じ込めをして取り扱わなくてはならない高病原性ウイルスに対する中和抗体の検出が可能になる。ただし、生物学上の安全性を保つ追加手段（例えば、ＨＡ開裂部位のアミノ酸配列の改変等）は必要であろう。Ｋｏｎｇら（２００６）は、先に、インフルエンザＨＡ偽型レンチウイルスに基づく中和抗体スクリーニングシステムを開発したが、これもバイオセーフティーレベル３の物質に対する中和抗体の検出を可能にするものである。しかしながら、これらのレンチウイルスは、インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼを発現しないので、これはＨＡと共に中和抗体を誘導する可能性がある（Ｎａｙａｋら、２０１０）。従って、ＰＢ２−ＫＯウイルスに基づくアッセイは、より正確に中和抗体の力価を反映すべきである。また、レポーター遺伝子をコードするインフルエンザｖＲＮＡを安定的に発現する細胞でも中和抗体の高感度検出が可能であることが示されたが（Ｈｏｓｓａｉｎら、２０１０；Ｌｉら、２００９）、これらの組換え細胞に基づくアッセイには感染性ウイルスが必要である。
ＰＢ２−ＫＯウイルスについてその他の可能性のある応用例としては、新型インフルエンザワクチンとしての使用があり、我々はこれを次の理由で実現可能であると考えている。第一に、ＰＢ２−ＫＯウイルスはＡＸ４／ＰＢ２細胞系において高い力価（＞１０8ＰＦＵ／ｍＬ）になる（図３Ｄ）ことがある。第二に、ＨＡおよびＮＡタンパク質を発現することができるという事実（図４）により、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、所望の抗原をコードするようにカスタマイズ可能だと示されていることがある。第三に、ＰＢ２−ＫＯウイルス感染細胞（図５Ａ）で起こるｖＲＮＡの転写により、二本鎖ＲＮＡを生産することで細胞の先天性免疫を刺激できるということがある。そして、第四に、ＰＢ２ ｖＲＮＡに挿入された外来遺伝子が安定的に維持されるので（表２）、追加的な抗原の担体として機能し、安全な多価ワクチンとしてＰＢ２−ＫＯの操作ができる可能性があることがある。
今日までに、特定のウイルスタンパク質を欠くいくつかの組換えインフルエンザウイルスは、欠損タンパク質がトランスで提供されれば細胞培養において野生型ウイルスと同等に複製することが示されている。Ｍ２を欠くインフルエンザウイルスは、Ｍ２を発現する細胞内で効率的に複製し、弱毒化生ワクチンとしての可能性があることを示した（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００９）。そのＭ２対応物を超えるＰＢ２−ＫＯウイルスの明確な利点として、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、正常細胞で複製不能なので、つまり安全だということがある。また、Ｍ２タンパク質コード領域内にコードされる外来遺伝子が、子孫ウイルスに取り込まれウイルス感染細胞内で発現できるか否かは未だ不明なことがある。
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｏｂｒｉｄｏら（２０１０）は、ＨＡ ｖＲＮＡのパッケージングシグナルにフランキングされたＧＦＰ遺伝子を有するインフルエンザウイルスを用いて中和抗体の迅速な検出のために改良されたスクリーニングアッセイを開発した。このＨＡ−ＫＯウイルスはＨＡタンパク質を発現した細胞のみで複数の複製サイクルを行ったが、このＨＡ−ＫＯウイルスにおけるレポーター遺伝子の安定性は該研究では検査されなかった。実際、７のｖＲＮＡセグメントを有するＨＡ ｖＲＮ欠損ウイルスは、ＰＢ２ ｖＲＮＡを欠損するＰＲ８ＡＰＢ２ウイルスとは対照的に（上記参照）、ＨＡを発現するＭＤＣＫ細胞において複数の複製ラウンドを行ったので（データは図示せず）、このことより、ＨＡ−ＫＯウイルスにおけるレポーター遺伝子をコードするＨＡ ｖＲＮＡはＨＡ発現細胞における複製の間に簡単に消失する可能性が示唆される。また、自己のＮＡ ｖＲＮＡ中にＧＦＰ遺伝子を有する複製可能ウイルスも、中和抗体を検出するのに使用される（Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら、２０１１）。トランスで細菌性シアリダーゼがあると、このＮＡ−ＫＯウイルスの複製における制限が改善され妥当なウイルス力価の回復が可能であったが、しかしながら、ＮＡ−ＫＯウイルスのレポーター遺伝子の安定性は不明なままである。
より最近では、ＧＦＰ遺伝子を有する複製可能インフルエンザウイルスは、組換えＮＳ（Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙら、２０１０）またはＮＡ（Ｌｉら、２０１０）遺伝子を用いて生成されている。これらのウイルスは研究ツールとしての可能性を有するが、それらには複製能があるので生物学的安全性の問題があるが、一方ＰＢ２−ＫＯウイルスではその心配がない。まとめて言うと、本研究で生産したＰＢ２−ＫＯウイルスは安定的に外来遺伝子を発現するが複製不能であるという事実により、ＰＢ２−ＫＯウイルスが信頼性と生物学的安全性の面で理想的である。
結論として、ウイルスＰＢ２遺伝子をレポーター遺伝子に置換することにより、外来遺伝子を発現する生体含有可能インフルエンザウイルスを作製した。ウイルスの複製は、トランスでＰＢ２タンパク質を発現する細胞に限られていた。レポーター遺伝子は、安定的にＰＢ２発現細胞中での複製の間に子孫ウイルスに継承された。種々のＨＡ、ＮＡ、およびレポーター遺伝子を、ＰＢ２−ＫＯウイルス内に収容した。そのため、このウイルスは、インフルエンザウイルスの基礎及び応用研究のための多数の用途において有望であることが示される。
実施例３
インフルエンザウイルスのＰＢ２タンパク質は、三量体ウイルスＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼサブユニットの必須成分である。ＰＢ２は、宿主の抗ウイルス免疫経路の調節、従って、毒性に関与し、そして他の個々のｖＲＮＡセグメントの取り込みにおいて主要な役割を果たしている（Ｍｕｒａｍｏｔｏら、２００６）。実施例２では、ＰＢ２ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）のコード領域内に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子を有するＰＢ２−ノックアウト（ＰＢ２−ＫＯ）インフルエンザウイルスを説明する。ＰＢ２−ＫＯウイルスの複製は、安定してＰＢ２タンパク質を発現する細胞系のみに限定され、そこでは１０8ＰＦＵ／ｍＬ超の高い力価となる。また、レポーター遺伝子をコードするＰＢ２ ｖＲＮＡは複製の間に、安定的に子孫ビリオンに取り込まれ、連続的継代を通じ維持された。また、任意のインフルエンザウイルスのＨＡおよびＮＡ ｖＲＮＡをＰＢ２−ＫＯウイルスに収容でき、ウイルス感染細胞内で発現できた。したがって、主なインフルエンザ抗原であるＨＡおよびＮＡの所望の組み合わせをコードするようにＰＢ２−ＫＯウイルスを仕立てることができ、よって、ＰＢ２−ＫＯウイルスを、多価ワクチンプラットフォームとして使用できることが示唆される。ここで、我々は、マウスを免疫化し、マウスにおける抗体応答および防御効力を調べることにより、ＰＢ２−ＫＯウイルスのワクチンとしての可能性を調べた。
材料と方法
細胞
２９３および２９３Ｔ（シミアンウイルス４０Ｔ抗原遺伝子を挿入した２９３株の派生株（ＤｕＢｒｉｄｇｅら、１９８７））ヒト胚腎臓細胞を、１０％ウシ胎児（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）内で保持した。メイディン・ダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を、５％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）含有最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内で保持した。インフルエンザウイルスに対するヒト型レセプターの発現が増強されたＭＤＣＫ細胞由来株であり、ヒトα−２，６−シアル酸転移酵素を発現するプラスミドで安定的に形質移入することにより作製したＡＸ４細胞（Ｈａｔａｋｅｙａｍａら、２００５）を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）含有５％ＮＣＳ-ＭＥＭ内で保持した。レトロウイルスベクターで形質導入することにより確立したＡＸ４／ＰＢ２細胞（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／８／３４由来でＰＢ２タンパク質を安定的に発現するＡＸ４細胞［Ｈ１Ｎ１，ＰＲ８］）（Ｏｚａｗａら、２０１１）を、ピューロマイシン（２μｇ／ｍＬ）およびブラストサイジン（１０μｇ／ｍＬ）を含有する５％ＮＣＳ−ＭＥＭ内で保持した。全ての細胞を、３７°Ｃ、５％ＣＯ2の加湿インキュベーター内で保持した。
プラスミドによる逆遺伝学的手法
前述の通り（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９９９）、本研究において使用した野生型ＰＲ８およびＰＢ２−ＫＯウイルスを、逆遺伝学的手法を用いて操作した。ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を発現するために、プラスミドは、ヒトＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよびマウスＲＮＡポリメラーゼＩターミネーターの間にＰＲ８遺伝子のクローンｃＤＮＡを含む（ＰｏｌＩプラスミドと呼ぶ）。ＰＢ２セグメントコードするＰｏｌＩプラスミドを置換し、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）由来３’ＰＢ２非コード領域、ｖＲＮＡの３’末端のＰＢ２コード配列に対応する１２０ヌクレオチド、それに続いて、ＧＦＰコード配列、ｖＲＮＡの５’末端のＰＢ２コード配列に対応する１２０ヌクレオチド、そして最後に、５’ＰＢ２非コード領域、を含むプラスミド［ｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）］を構築した（Ｍｕｒａｍｏｔｏら、２００６）。ＰＢ２−ＫＯウイルスを作製するために、ＴｒａｎｓＩＴ２９３形質移入試薬（Ｍｉｒｕｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、その説明書に従い、ｐＰｏｌＩＰＢ２（１２０）ＧＦＰ（１２０）および残りの７ＰｏｌＩプラスミドを、Ａ／ＷＳＮ／３３由来のＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、およびＮＰの真核生物タンパク質発現プラスミドと共に、２９３Ｔ細胞へ同時形質移入した。形質移入から４８時間後、ＰＲ８またはＰＢ２−ＫＯウイルスを含む上清を採取し、それぞれ、１０日齢の孵化鶏卵またはＡＸ４／ＰＢ２細胞内に接種した。両ウイルスを、ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるプラークアッセイを用いて滴定した。
ホルマリン不活化ウイルスの調製
卵で増殖させたＰＲ８ウイルスを濃縮し、感染尿膜液を用いた１０％〜５０％ショ糖密度勾配による超遠心分離で精製し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。精製ＰＲ８ウイルスにホルマリン（最終濃度０．１％）を加え、４℃で１週間不活化させた。ウイルスの不活化は、ＭＤＣＫ細胞で２回ウイルスを継代し、細胞変性効果またはその欠如を調べることによって確認した。
ＰＢ２−ＫＯウイルスによるマウスの感染実験
マウスにおけるＰＢ２−ＫＯウイルスの安全性を検査するために、６匹の４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに１匹当たり１０6ＰＦＵのウイルスを経鼻接種した。感染マウスの体重および生存率を接種後１４日間毎日モニターした。また、接種後１日目、３日目、および６日目に、接種マウスから肺および鼻甲介を採取、均質化し、プラークアッセイを行いウイルスの存在を検出した。
免疫および防御についての検査
８、６、又は４週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（各群３匹のマウス）をイソフルランで麻酔し、５０μｌの培地（０．３％ウシ血清アルブミン分画Ｖを含むＭＥＭ）、ホルマリンで不活化したＰＲ８（６４ヘマグルチニン単位、１０6ＰＦＵのＰＢ２−ＫＯウイルスに相当）、またはＰＢ２−ＫＯウイルス（１０6ＰＦＵ）を、２週間に１回、２回、または３回の間隔で、それぞれ経鼻接種した。最後の接種から３週間後、マウスに対し５０％マウス致死量（ＭＬＤ50）の０．５又は５倍のＰＲ８ウイルスで経鼻的にチャレンジした。感染後３日目および６日目に、マウス（各群３匹のマウス）の肺および鼻甲介を採取し、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて１ｍｌのＰＢＳ中で均質化し、低速遠心分離（４℃で１０分間、５，０００ｒｐｍ）により清澄化した。ホモジネート中のウイルス力価はＡＸ４／ＰＢ２細胞を用いたプラークアッセイにより決定した。残りのチャレンジ後のマウス（各群３匹のマウス）の体重と生存率を１４日間毎日モニターした。
ウイルス特異的抗体の検出
マウス（各群３匹のマウス）の血清を、それぞれの接種前は下顎静脈出血より、そしてチャレンジ１日前は大腿動脈より得た。また、鼻洗浄および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液のサンプルもチャレンジ１日前に頸椎脱臼により屠殺したマウスから（各群３匹のマウス）得た。切開部を設け、気管にカニューレを挿入した。肺は、シリンジを用いて１ｍｌのＰＢＳで灌流した。洗浄液を回収し、マイクロチューブに入れ氷上で保存した。鼻洗浄液は、４００μｌのＰＢＳを鼻腔に通過させることにより回収した。血清、鼻洗浄液、およびＢＡＬ液サンプル中のＩｇＧおよびＩｇＡ抗体を、先述の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｋｉｄａら、１９８２）を用いて検出した。各ウェルを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．６Ｍ ＫＣｌを含有する０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で破砕した精製ＰＲ８で覆った。検査サンプルを載せたウイルス被覆プレートをインキュベーションした後、サンプル中のＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を結合したヤギ抗マウスＩｇＡまたはＩｇＧ抗体を用いて検出した。また、免疫マウスの血清における中和抗体の力価を先述のように（Ｉｗａｔｓｕｋｉ−Ｈｏｒｉｍｏｔｏら、２０１１）評価した。簡潔に言うと、ウイルス（５０％組織培養感染量［ＴＣＩＤ50］の１００倍）をレセプター破壊酵素で処理した血清の２倍連続希釈液とともに３３℃で３０分間インキュベートし、その混合物を９６ウェルマイクロプレートに載せたコンフルエントなＭＤＣＫ細胞に添加して中和活性を決定した。
ＧＦＰに対する抗体検出のためのＩＦＡ
３５ｍｍのガラスボトムディッシュ（旭テクノグラス社）中で増殖させた２９３細胞をＧＦＰ発現プラスミドで形質移入し、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）前４８時間インキュベートした。細胞を、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬株式会社）を含むＰＢＳ中で１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５分間透過処理した。これらを、培地、ホルマリンで不活化したＰＲ８、またはＰＢ２−ＫＯウイルスウイルスで免疫したモックマウスから採取した血清の２０倍希釈液と共に１時間インキュベートした。抗ＧＦＰ抗体（ｃｌｏｎｅ ＧＦＰ−２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した細胞を、陽性対照として用いた。その後、全細胞を、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４標識ヤギ抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に更に１時間インキュベートしそれぞれＧＦＰ抗体および核染色の検出用とした。サンプルは、共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。
結果
マウスにおけるＰＢ２−ＫＯウイルスの特性評価
ＰＢ２−ＫＯウイルスはＡＸ４細胞において複製不能であったが、ＡＸ４／ＰＢ２細胞におけるＰＲ８と同様の高い力価が得られた。ＰＢ２−ＫＯウイルスがインフルエンザワクチンとして機能できるか否かを判断するために、その安全性のプロファイルを、ＰＢ２−ＫＯウイルスを経鼻接種したマウス（１匹当たり５０μＬ中１０6ＰＦＵ）の体重を２週間モニターして評価した。マウスは安定した成長に伴い着実に体重増加し、ＰＢ２−ＫＯウイルス感染による影響は見られなかった（データは図示せず）。接種後１日目、３日目、および６日目に得た肺および鼻甲介を、均質化しＡＸ４／ＰＢ２細胞中でのプラークアッセイを行って、マウスにおけるＰＢ２−ＫＯウイルスの増殖を評価した。ＰＢ２−ＫＯウイルスに感染したマウスの器官ではプラークは検出されなかったが、１０6ＰＦＵのＰＲ８ウイルスに感染したマウスの肺組織では高いウイルス力価（１０8ＰＦＵ／ｇ）がみられた。これらの結果は、マウスでＰＢ２−ＫＯウイルスが増殖しなかったこと、および複製能力のあるウイルスへの復帰が起こらなかったことを示している。
ＰＢ２−ＫＯウイルスを接種したマウスにおけるウイルス特異的抗体応答
ＰＢ２−ＫＯウイルスにより誘発される抗体応答のレベルを、２週間に１回、２回、または３回の間隔でＰＢ２−ＫＯウイルスを経鼻接種したマウスにおいて調べた。比較として、培地または１０6ＰＦＵのＰＢ２−ＫＯウイルス相当量のホルマリン不活化ＰＲ８ウイルスで免疫したモックマウスも用いた。血清を様々な時点で回収し、経時的に様々なレベルの抗体の存在を決定した。また、最後の接種から３週間後に血清、鼻洗浄液、およびＢＡＬ液サンプル中のＰＲ８に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体のレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて調べた（図８）。培地を接種したマウスでは、どのサンプルにおいてもＩｇＧおよびＩｇＡ応答のいずれも感知可能ではなかった。対照的に、ホルマリン不活化ＰＲ８およびＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスは、血清ＩｇＧおよびＩｇＡレベルの時間依存的な増加を示した。３回の免疫後、同レベルの抗体が、不活化ウイルス及びＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスの両者において検出された。興味深いことに、マウスを１回または２回免疫したときは、ＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスにおいて、ホルマリン不活化ウイルスで免疫したマウスよりもそれぞれ有意に高い血清ＩｇＧまたはＩｇＡ力価がみられた（図８、上のパネル）。ＰＢ２−ＫＯウイルスを２回接種したマウスの鼻洗浄液および１回または２回接種したマウスのＢＡＬ液では、ＩｇＧおよびＩｇＡレベルがホルマリン不活化ウイルスを接種したマウスよりも有意に高かった（図８、それぞれ、中央および下のパネル）。従って、このマウスモデルにおいてＰＢ２−ＫＯウイルスは効率的にＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答を誘発した。培地で免疫したモックマウスから得られた血清は中和抗体を有さず、一方、ＰＢ２−ＫＯ処理マウスから得られた血清は１：１６の中和抗体力価を有していた。これは、不活化ウイルスで処理したマウスから得られた血清よりも約２倍高いものであった（データは図示せず）。中和活性は、どの鼻洗浄サンプル又はＢＡＬ液でも検出されなかった（データは図示せず）。
ＰＢ２−ＫＯウイルスのワクチン有効性
ＰＢ２−ＫＯウイルスのワクチン有効性を評価するために、マウスに対しＭＬＤ50の０．５または５倍のＰＲ８ウイルスでチャレンジした。前者のチャレンジの用量は、自然界での感染を模倣したもので、自然界では通常、個体は比較的低いウイルス量（確実に致死量ではない）で感染する。
（ｉ）チャレンジ後の体重変化および免疫マウスの生存率
ＰＢ２−ＫＯウイルスのワクチン有効性を評価するために、ＰＲ８ウイルスでのチャレンジ後にＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスの体重変化及び生存率を調べた。培地で免疫し、ＭＬＤ50の０．５倍のＰＲ８でチャレンジしたモックマウスは、かなり体重が減少したが実質的に回復した（図７、左のパネル）。一方、培地で免疫し、ＭＬＤ50の５倍のＰＲ８でチャレンジしたマウスはすべて、かなり体重が減少し、感染後約１週間で死亡した（図２、右のパネル）。ホルマリン不活化又はＰＢ２−ＫＯウイルスで１回免疫したマウスは、各チャレンジの服用後に体重が減少した（１５％）（図７Ａ）。ホルマリン不活化ウイルスで１回免疫した３匹のマウスのうち１匹はＭＬＤ50の５倍のＰＲ８ウイルスでチャレンジした感染後８日目に死亡したのに対し、ＰＢ２−ＫＯウイルスで１回免疫したマウスは１００％が生存していたことは注目に値する（データは図示せず）。不活化およびＰＢ２−ＫＯウイルスで２回および３回免疫したマウスは全て生存しており体重減少もほとんどなかった（図７ＢおよびＣ）。
（ｉｉ）肺および鼻甲介におけるウイルス複製
ＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスの肺および鼻甲介におけるウイルス複製を評価するために、両器官をＰＲ８ウイルスでのチャレンジ後３日および６日目に採取した。図９はこれらの器官におけるウイルス複製の程度を示す。ＰＲ８ウイルスは、すべてのモック免疫マウスの肺および鼻甲介で高力価に複製した。ＰＢ２−ＫＯワクチンの効力は１回免疫したマウスにおけるホルマリン不活化ワクチンのものと同様であったものの、２回または３回のワクチン接種を受けたマウスでは、ＰＢ２−ＫＯワクチンはホルマリン不活化ワクチンよりも有効であり、ＰＢ２−ＫＯワクチンで免疫したマウスでの双方の器官におけるウイルス力価はホルマリン不活化ワクチンで免疫したものに比べかなり低かった。まとめると、これらの結果は、ＰＢ２−ＫＯウイルスがホルマリン不活化ウイルスよりもインフルエンザワクチンとしてより良好な効力を有することを示している。
ＰＢ２−ＫＯウイルスを接種したマウスにおけるＧＦＰに対する抗体の検出
最後に、ＰＢ２−ＫＯウイルスが、ＧＦＰに対する抗体を誘導し得るか否かを判断した、なぜなら、ここで使用されるＰＢ２−ＫＯウイルスがそのＰＢ２コード領域にＧＦＰ遺伝子を有しているからであり、ＧＦＰがＰＢ２−ＫＯウイルス感染培養細胞中で発現したからである（データは図示せず）。ＰＢ２−ＫＯウイルスを接種したマウスの血清中に抗ＧＦＰ抗体が検出されたことは、インフルエンザウイルスベースの多価ワクチンの開発のためのプラットフォームとしてこの系が可能性があることを示唆している。よって、チャレンジから３日目後にマウスから血清を採取しＩＦＡで検査した。ＧＦＰはモック免疫マウス由来の血清または不活化ワクチンで免疫したマウス由来の血清では検出されなかったが（図１０）、ＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウス由来の血清では、市販の抗ＧＦＰ抗体（ポジティブコントロールとして）と同様にＧＦＰ発現が検出された。これらの結果は、ＧＦＰに対する抗体がＰＢ２−ＫＯウイルスで免疫したマウスにおいて誘導されたことを示しており、多価ワクチンとしてＰＢ２−ＫＯウイルスを応用できることを示唆している。
考察
ここで、複製不能ＰＢ２−ＫＯウイルスがウイルス特異的防御抗体応答を誘発し、また、このウイルスはそのＰＢ２セグメントのコード領域においてコードされるレポータータンパク質に対する抗体も誘導することが示された。特に、ＰＢ２−ＫＯワクチンは、Ｈ１Ｎ１ ＰＲ８ウイルスの致死量投与からマウスを防御するので、Ａ型インフルエンザ感染に対するこのワクチンの可能性が示唆される。ＰＢ２−ＫＯウイルスを接種したマウスの血清中においてＧＦＰに対する抗体が検出できたので、レポーター遺伝子、このケースではＧＦＰ、を別の病原体の抗原領域に置き換えると、組換えウイルスを接種したマウスが二次病原体に対する抗体を発現することが示唆され；翻って、多価ワクチンとしての可能性が示唆される。従って、ＰＢ２コード領域を別の病原体の抗原部分に置き換えれば、複製不能ＰＢ２−ＫＯウイルスを、インフルエンザワクチンのプラットフォームとしてのみでなく、多価ワクチンとして役立てることができる。
遺伝子ノックアウトウイルスを含む不活化および弱毒化生ワクチンは致命的なインフルエンザ感染に対しマウスを成功裏に免疫することが報告されている。貫通および細胞質尾部ドメインを欠くＭ２−ＫＯウイルスはＭ２を発現する細胞内で効率的に複製し、弱毒化生ワクチンとしての可能性が示されている（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００９）。また、ＨＡ−ＫＯも、構成的にＨＡタンパク質を発現する細胞において複数回の複製サイクルを行うことが示された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｏｂｒｉｄｏら、２０１０）。しかしながら、防御的効果を発揮するには高い力価で十分なＨＡタンパク質を生じるような大量のウイルスが必要であると思われる。レポーター遺伝子の安定的な取り込みおよび維持についてはＭ２−ＫＯでもＨＡ−ＫＯ系でも研究されていない。先に、複製不能ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、マウスモデルにおいて効率的に粘膜および全身性の免疫応答を誘発することが実証された。ＮＳ２を欠くＶＬＰは、様々な致死量のインフルエンザウイルスに対しマウスを保護する（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００２）。しかし、構成的にＮＳ２を発現する細胞系が存在しないと、防御的効果を誘発するのに十分なＶＬＰの効率的な生産ができない。
上述のＭ２−ＫＯ、ＨＡ−ＫＯ、および／またはＶＬＰとは対照的に、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、ＰＢ２を発現した細胞系で調製でき、高い力価を生じ、安定的に取り込まれ、そしてウイルス複製の間にＧＦＰ遺伝子を維持することができた（Ｏｚａｗａら、２０１１）。これらのデータは、明らかに、この系が効率的なワクチン製造のために使用できることを立証している。
ワクチンとしてのウイルスの利用可能性を検討する際、安全性が最も重要となる。細胞ベースのワクチンは欧州で認可されているものの、現在、弱毒化生インフルエンザワクチンおよび不活化インフルエンザワクチンの大部分のいずれも孵化鶏卵で増殖している。卵ベースのワクチン増殖を成功させる前提条件として、実施時孵化鶏卵に適した変異体を選択しなくてはならないので、ワクチン中のウイルスは抗原性の点において循環ウイルスとわずかに異なる場合がある（Ｆｕｌｖｉｎｉら、２０１１；Ｈａｒｄｙら、１９９５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９９３）。アレルギーを誘発するこれらのワクチンにおける卵タンパク質の傾向として、卵中で生産された不活化ワクチンを非経口的に投与すると、副作用又はアナフィラキシー反応に結びつく個体もある（Ｈａｌｐｅｒｉｎら、２００２）。他の問題として、病原性の高い鳥インフルエンザパンデミックの発生の際には、鶏の在庫が枯渇する可能性が考えられ、よってワクチンの大量生産が危うくなる可能性がある（Ｈａｍｐｓｏｎ、２００８）。
対照的に、従来の卵ベースのワクチンの増殖に代わり細胞ベースのものを代替することによるいくつかの利点がある。製造力を需要に合わせて容易にスケールアップできることがある。また、卵で増殖させたウイルスとは異なり、細胞内で増殖させたウイルスの抗原性は、動物およびヒトのものに適合するということがある（Ｋａｔｚら、１９９０；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９９１）。
ＰＢ２を安定的に発現する細胞系が確立され、ＰＢ２−ＫＯウイルスは当該細胞系において効率的（すなわち、野生型ウイルスに匹敵するレベル）に複製した（Ｏｚａｗａら、２０１１）。トランスでＰＢ２を発現しない細胞において、複製不能ＰＢ２−ＫＯウイルスは、複製のサイクルを１回しか行わないので、感染性粒子の形成にはつながらない。従ってＰＢ２−ＫＯウイルスは、感染性ウイルスの複製を許容せずに防御抗体応答を誘導する。そのため、細胞ベースのＰＢ２−ＫＯワクチンでは、ワクチン製剤および送達における様々な障害が除かれる。
さらに、ＰＢ２遺伝子をノックアウトすると、複製サイクルを複数回行ったとしても、ＰＲ８インフルエンザウイルスは、組換えＰＢ２ ｖＲＮＡおよびＰＢ２タンパク質ｍＲＮＡ間の組換えを示すことなく、複製ができなくなってしまう。
ホルマリンで不活化したワクチンで免疫応答を誘発することによりＰＲ８ウイルスの致死量を用いたチャレンジからマウスを効果的に防御できた（図７〜９）。しかしながら、生存率および体重減少の点ではホルマリン不活化ワクチンおよびＰＢ２−ＫＯワクチンで免疫したマウスは同様であったにもかかわらず（図７）、ホルマリン不活化ワクチンで免疫したマウスの肺および鼻甲介のウイルス力価は、ＰＢ２−ＫＯワクチンで免疫したマウスのものよりも高かった（図９）。この知見は、おそらく、免疫応答のレベルの違いを反映しているものと考えられる（図８）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答については本研究で検討されなかったが、不活化抗原はＣＴＬ応答を誘導しないと考えられるので、ＣＴＬ応答は、ホルマリン不活化ウイルスではなくＰＢ２−ＫＯウイルスによって活性化されたとするのが妥当である。
定義では、多価（ｍｕｌｔｉ−ｖａｌｅｎｔまたはｐｏｌｙ−ｖａｌｅｎｔ）ワクチンとは、複数の感染因子または単一の因子における複数の異なる抗原決定基に対する免疫応答を誘発するように設計されたワクチンを指す。他のレポーター遺伝子ならびに異なるウイルス株のＨＡおよびＮＡ遺伝子をＰＢ２−ＫＯウイルス中に収容できるという事実に基づき、多価ワクチンの設計および製造が実現可能になる。その結果、ＰＢ２−ＫＯワクチンが、いくつかの異なる抗原性のインフルエンザ株、あるいはインフルエンザおよび／または他の病原体の亜型に対して防御できると考えられる。付与される利点としては、ワクチンの粘膜送達が可能になり、針を用いてワクチンを皮下注射する必要が排除されること等がある。
結論として、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、有効な免疫応答を誘発し、そのＰＢ２セグメント中にコードされたレポーター遺伝子産物に対する抗体を誘導し、容易に増殖し、安全にワクチンとして投与できるので、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、信頼でき安全で、かつ効果的なワクチン候補となる。
実施例４
肺炎球菌は、インフルエンザウイルス感染に続く以下の二次的な細菌感染症を引き起こす呼吸器系の病原体で、高齢者の死亡率の上昇に関連する。呼吸器合胞体ウイルスおよび１型ヒトパラインフルエンザウイルス等のパラインフルエンザウイルスは、乳児に重度の症状を引き起こす呼吸器病原体である。パラインフルエンザウイルスのために利用可能なワクチンは現在存在しない。ＰＢ２セグメントのコード領域中にコードされたレポーター遺伝子産物（この場合ＧＦＰ）に対する抗体が、真正のＰＢ２の代わりにに誘発されたため（図１０）、ＰＢ２−ＫＯウイルスが多価ワクチンとして利用できるだろう。ＰＢ２セグメント中のコード領域内に病原体の主要な抗原も同様にコードされている場合は、ＰＢ２−ＫＯウイルスは、インフルエンザウイルスタンパク質に対する免疫応答と同様に抗原に対する免疫応答も誘導できるので、それにより、乳幼児や高齢者をこれらの深刻な呼吸器疾患から守ることができる。
図１１に、ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡを有する細胞における肺炎球菌のＰｓｐＡの発現およびインフルエンザウイルス抗原の発現、ならびにＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰを有する細胞におけるインフルエンザウイルス抗原の発現を示す。ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡはトランスでＰＢ２を発現する細胞中では、野生型インフルエンザウイルスと同様の成長速度であるが、トランスにＰＢ２を発現しない細胞においては成長することができない（図１２）。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡまたはＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰに感染したマウスは、血清、ＢＡＬ液、および鼻洗浄液中にインフルエンザ特異的ＩｇＧおよびＩｇＡを有していた（図１３）。ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡに感染したマウスは肺炎球菌特異的ＩｇＧを、血清中（図１４）、ＢＡＬ液および鼻洗浄液中（図１５）に有していたが、ＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰで感染したマウスは有していなかった。
ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡで３回免疫したマウスは、インフルエンザウイルスによるチャレンジ（図１６）および肺炎球菌によるチャレンジ（図１９）を生き延びた。対照および免疫化マウスにおいては、チャレンジ後３日目に鼻甲介および肺でインフルエンザウイルスを検出できた（図１７）。チャレンジ後、ＰＢ２−ＫＯ−ＰｓｐＡでは細菌量が減少したが、ＰＢ２−ＫＯ−ＧＦＰや免疫化マウスではこのような減少は見られなかった。
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の明細書において、本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載し、多くの詳細について例示目的で説明したが、本発明は追加の実施形態も可能であり、その詳細のいくつかは、本明細書本発明の基本原理から逸脱することなく、相当な種々の変更を加えることができることは当業者にとって明らかであろう。

Claims (39)

  1. ｉ）ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＨＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍ（Ｍ１およびＭ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメント、を含む８の異なる遺伝子セグメント、ｉｉ）ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＨＡウイルス遺伝子セグメント、ＮＡ（ＮＡおよびＮＢ）ウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍ（Ｍ１およびＢＭ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメント、を含む８の異なる遺伝子セグメント、またはｉｉｉ）ＰＡウイルス遺伝子セグメント、ＰＢ１ウイルス遺伝子セグメント、変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメント、ＨＥＦウイルス遺伝子セグメント、ＮＰウイルス遺伝子セグメント、Ｍ（Ｍ１およびＣＭ２）ウイルス遺伝子セグメント、ならびにＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ウイルス遺伝子セグメント、を含む７の異なる遺伝子セグメント、を含む単離された弱毒化インフルエンザウイルスであって；
    該変異型ＰＢ２ウイルス遺伝子セグメントは、異種ヌクレオチド配列にフランキングする３’または５’コードおよび非コード組み込み配列を含む５’および３’組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まない、単離された弱毒化インフルエンザウイルス。
  2. 前記異種ヌクレオチド配列はレポーター遺伝子配列を含む、請求項１に記載のウイルス。
  3. 前記異種ヌクレオチド配列は抗原の配列を含む、請求項１に記載のウイルス。
  4. 前記抗原が糖タンパク質である、請求項３に記載のウイルス。
  5. Ｍ１およびＭ２のＭウイルス遺伝子セグメントを有する、請求項１に記載のウイルス。
  6. ＮＢおよびＮＡのＮＡウイルス遺伝子セグメントを有する、請求項１に記載のウイルス。
  7. ＨＥＦ遺伝子セグメントを有する、請求項１に記載のウイルス。
  8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のウイルスを有効量含むワクチン。
  9. 前記組換えウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡのＨＡ遺伝子セグメントを含む、請求項８に記載のワクチン。
  10. Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９ ＨＡを含む、請求項９に記載のワクチン。
  11. 前記組換えウイルスにおけるＨＡはＨＡ開裂部位で修飾される、請求項１０に記載のワクチン。
  12. 異なるインフルエンザウイルスを更に含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
  13. ２の異なるインフルエンザウイルスを更に含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
  14. 脊椎動物を請求項８〜１３のいずれか１項に記載のワクチンに接触させることを含む脊椎動物を免疫する方法。
  15. 前記脊椎動物は鳥類である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記脊椎動物は哺乳類である、請求項１４に記載の方法。
  17. 前記脊椎動物はヒトである、請求項１４に記載の方法。
  18. ベクターを安定して宿主細胞ゲノムに取り込むインフルエンザウイルスＰＢ２を発現するベクターを含む宿主細胞。
  19. ｖＲＮＡ生産用の転写カセット及びｍＲＮＡ生産用の転写カセットを含む１以上のベクターを更に含む、請求項１８に記載の宿主細胞であって、
    該ｖＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、であり、
    変異型ＰＢ２ ＤＮＡは、異種ヌクレオチド配列にフランキングしている３’または５’コードおよび非コード組み込み配列を含む５’および３’組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まず；並びに
    該ｍＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、であり、
    該宿主細胞は、野生型ＰＢ２遺伝子セグメントのｖＲＮＡを生産するＰＢ２コード配列に対応する配列を含まない、請求項１８に記載の宿主細胞。
  20. ２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＤＦ−１細胞、Ａ５４９細胞、ベロ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である、請求項１８又は１９に記載の宿主細胞。
  21. 宿主細胞を、ｖＲＮＡ生産用の転写カセット及びｍＲＮＡ生産用の転写カセットを含む１以上のベクターに接触させること、並びに
    該宿主細胞から生体含有可能な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）ウイルスを単離することを含む、
    生体含有可能な８セグメントのＡまたはＢ型インフルエンザウイルスを調製する方法であって、
    該ｖＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結された変異型インフルエンザウイルスＰＢ２ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＨＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＡ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＭ ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＳ（ＮＳ１およびＮＳ２）ＤＮＡに対し、ｖＲＮＡを生産する方向で作用可能に連結されたＰｏｌＩプロモーターを含む転写カセット、であり、
    該変異型ＰＢ２ ＤＮＡは、異種ヌクレオチド配列にフランキングしている３’または５’コードおよび非コード組み込み配列を含む５’および３’組み込み配列を含み、機能的ＰＢ２をコードする配列に対応するコンティグの配列を含まず；並びに
    該ｍＲＮＡ生産用の転写カセットは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＡのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ１のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、およびＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＮＰのＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、であり、
    該宿主細胞のゲノムは、ＰｏｌＩＩ転写終結配列に連結されたインフルエンザウイルスＰＢ２のＤＮＡコード領域に対し作用可能に連結されたＰｏｌＩＩプロモーターを含む転写カセット、と共に安定して増幅し、そして、
    該宿主細胞は、野生型ＰＢ２遺伝子セグメントのｖＲＮＡを生産するＰＢ２コード配列に対応する配列を含まない、
    生体含有可能な８セグメントのＡまたはＢ型インフルエンザウイルスを調製する方法。
  22. 前記細胞を、その他のベクターより先にＰＢ２のｍＲＮＡ生産用のベクターに接触させる、請求項２１に記載の方法。
  23. 各転写カセットがプラスミドベクター上にある、請求項２１に記載の方法。
  24. １以上の転写カセットが１以上のプラスミドベクター上にある、請求項２１に記載の方法。
  25. １のプラスミドベクターが、ＰＡ、ＰＢ１、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、ＮＳ１および／またはＮＳ２並びに変異型ＰＢ２ ｃＤＮＡのｖＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２４に記載の方法。
  26. １のプラスミドベクターが１の前記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターがその他の前記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. ３のｍＲＮＡ生産用プラスミドベクターを有し、それぞれのｍＲＮＡ生産用プラスミドベクターが１の前記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２４または２５に記載の方法。
  28. １のプラスミドベクターが６の前記ｖＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターがその他の前記ｖＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２４に記載の方法。
  29. １のプラスミドベクターが１の前記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有し、他の１のプラスミドベクターがその他のｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２８に記載の方法。
  30. ３のｍＲＮＡ生産用のプラスミドベクターを有する、請求項２８に記載の方法。
  31. １のプラスミドが３の前記ｍＲＮＡ生産用の転写カセットを有する、請求項２５、２６、又は２９のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記異種ヌクレオチド配列はマーカーまたは選択可能な遺伝子配列である、請求項２１に記載の方法
  33. 前記生体含有可能なウイルスが６：２再集合体である、請求項２１に記載の方法。
  34. 前記ＨＡはＡ型ＨＡである、請求項２１に記載の方法。
  35. ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、またはＨ９ ＨＡである、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＨＡ ｃＤＮＡは、非病原性の開裂部位をコードする、請求項２１に記載の方法。
  37. 前記ＨＡおよびＮＡは、同一のウイルス単離物由来である、請求項２１又は３３に記載の方法。
  38. 前記ＨＡはＢ型ＨＡである、請求項２１に記載の方法。
  39. 脊椎動物の生理学的サンプルにおいて、選択インフルエンザウイルス株に対する中和抗体を検出する方法であって、下記：
    ａ）該サンプル、該選択インフルエンザウイルス株のＨＡおよび／またはＮＡを発現する請求項２又は３のウイルス、およびインフルエンザウイルス感染に感受性のある細胞を接触させること；並びに
    ｂ）該細胞中におけるレポーターまたは抗原の存在または量を検出することを含み、
    ここで、該サンプル中において該レポーターまたは抗原が存在しないこと、あるいは対照サンプルと比較して該レポーターまたは抗原の量が少ないことが、脊椎動物が該インフルエンザウイルス株に感染したという指標になる方法。
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