CN1809633A - 跨膜蛋白基因中含有突变的重组流感病毒 - Google Patents

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Abstract

提供了带有突变膜蛋白基因的病毒的制备方法，以及用该方法所获得的病毒。

Description

跨膜蛋白基因中含有突变的重组流感病毒
                     相关申请的交叉引用
本申请要求于2003年4月23日申请的美国申请顺序号60/464,776和2003年4月24日申请的美国申请顺序号60/465,328的权益，所述申请记载的内容通过引用结合到本文中。
                        政府权利声明
本发明是在美国政府资助下完成的(美国国立卫生研究院(theNational Institutes of Health)的资助号为AI-47446)。美国政府在本发明中可以享有一定的权利。
                          发明背景
细胞膜由双层脂质分子组成，其中镶嵌着各种蛋白。因其疏水的内部，细胞膜的脂双层对大多数极性分子的通过起到屏障作用，因而对细胞活力至关重要。为了促进水溶性小分子进出细胞或胞内区室的转运，细胞膜具有载体蛋白和通道蛋白。对于包括肌细胞电兴奋性和神经***电信号传导在内的许多细胞功能来说，离子通道是必不可少的(有关综述参见Alberts等，1994)。它们不仅存在于所有动植物细胞和微生物细胞中，而且在病毒中也已鉴定出它们的存在(Ewart等，1996；Piller等，1996；Pinto等，1992；Schubert等，1996；Sugrue等，1990；Sunstrom等，1996)，据此认为它们在病毒生命周期中起到重要作用。
甲型流感病毒是有包膜的负链病毒，并且具有8个RNA区段，其上包裹着核蛋白(NP)(有关综述参见Lamb和Krug，1996)。有3种蛋白跨越病毒膜：血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和M2。HA和NA的胞外结构域(胞外域)极易变异，而M2的胞外域在甲型流感病毒中基本上不变异。病毒的生命周期通常包括与细胞表面受体的结合，进入细胞和病毒核酸脱壳，随后病毒基因在细胞内复制。当合成病毒蛋白和基因新拷贝后，这些组分装配成子代病毒颗粒，随后从细胞中释放(有关综述参见Roizman和Palese，1996)。不同的病毒蛋白在这些步骤的各步起作用。在甲型流感病毒中，认为具有离子通道活性的M2蛋白(Pinto等，1992)在病毒生命周期的早期即穿入宿主细胞和病毒RNA脱壳之间起作用(Martin和Helenius，1991；有关综述参见Helenius，1992；Sugrue等，1990)。据信，一旦病毒体经过胞吞作用，病毒体相关M2离子通道(一种同型四聚体螺旋束)就允许质子从胞内体流到病毒体内部，以破坏酸不稳定M1蛋白-核糖核蛋白复合体(RNP)的相互作用，从而促进RNP释放到细胞质中(有关综述参见Helenius，1992)。另外，在HA在细胞内被切割的某些流感病毒株(例如A/fowl plagues/Rostock/34)中，其M2离子通道被认为会升高跨高尔基体网络的pH，从而避免了在此区室由于低pH条件引起的HA构象变化(Hay等，1985；Ohuchi等，1994；Takeuchi和Lamb，1994)。
通过有爪蟾蜍(Xenopus laevis)***表达M2蛋白并测量膜电流，证实了该蛋白具有离子通道活性(Pinto等，1992；Wang等，1993;Holsinger等，1994)。M2蛋白跨膜(TM)结构域的特定变化改变了通道的动力学特性和离子选择性，为M2 TM结构域构成离子通道孔提供了强有力的证据(Holsinger等，1994)。事实上，M2 TM结构域自身就可以起到离子通道的作用(Duff和Ashley，1992)。人们认为，M2蛋白离子通道活性在流感病毒生命周期中是必不可少的，因为阻断M2离子通道活性的盐酸金刚烷胺(Hay等，1993)，能抑制病毒复制(Kato和Eggers，1969；Skehel等，1978)。
乙型流感病毒是正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的成员，其基因组由8个负链RNA区段组成，并且编码11种蛋白。在甲型流感病毒中也发现了其中的9种：3种RNA依赖性RNA聚合酶亚基(PB1、PB2和PA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(M1)和2种非结构蛋白(NS1和NS2)。NB和BM2两种蛋白是乙型流感病毒所特有的。RNA区段6编码NB，也编码NA，而区段7编码BM2。
乙型流感病毒NB蛋白是III型膜内在蛋白，其在病毒感染的细胞表面上大量表达(Betakova等，1996；Shaw等，1983；Shaw等，1984)，并且掺入到病毒体中(Betakova等，1996；Brassard等，1996)。这种小蛋白(100个氨基酸)具有18个残基的N-端胞外域，22个残基的跨膜结构域和60个残基的胞质尾(Betakova等，1996；Williams等，1986)。根据以前测量膜电流的研究并根据甲型流感病毒M2蛋白进行类推(Fisher等，2000；Fisher等，2001；Sunstrom等，1996)，认为NB的功能是作为离子通道蛋白。然而，基于脂双层***的NB蛋白电生理学测定是难以中断的。换句话说，含有疏水结构域的蛋白和肽(据信在细胞中缺乏离子通道活性)在脂双层中能产生通道记录(Lear等，1988；Tosteson等，1988；Tosteson等，1989)。此外，在Fischer等(2001)和Sunstrom等(1996)的研究中，金刚烷胺被用来证明NB蛋白通道活性的缺乏，尽管该药物并不能抑制乙型流感病毒复制。因此，现有的证据挑战了NB蛋白具有离子通道活性的说法。
针对病毒感染的免疫力取决于响应感染细胞表面或病毒体上存在的抗原的免疫应答的产生。如果知道了这些表面病毒抗原，就可以成功地生产出疫苗。尽管在表面有多种抗原，但其中只有某些抗原才产生中和免疫性。生产疫苗的方法之一是使病毒“减毒”。通常的做法是将感染性病毒传代到外源宿主并鉴定超强毒株。通常，这些在外源宿主中的超强毒株在原始宿主细胞中毒性要弱些，因而是良好的候选疫苗，因为它们产生以体液IgG和局部IgA形式的良好的免疫应答。
通常从培养至高滴度的活病毒、减毒病毒或灭活病毒来制备流感疫苗。活病毒疫苗能激活免疫***的所有时相并刺激针对每种保护性抗原的免疫应答，这避免了制备灭活疫苗时要选择性地破坏保护性抗原的困难。另外，由活病毒疫苗产生的免疫性通常比灭活疫苗更持久、更有效、更具有交叉反应性。此外，活病毒疫苗的生产成本比灭活病毒疫苗更低廉。然而，减毒病毒中的突变通常并不清楚，并且这些突变看来是在病毒抗原基因中。
因此，所需要的是制备供疫苗用的重组减毒流感病毒的方法，所述病毒例如是具有确定突变的减毒病毒。
                       发明概述
本发明提供一种分离和/或纯化的重组流感病毒，所述病毒包含突变膜蛋白基因，例如突变膜内在蛋白基因，例如突变III型膜内在蛋白基因，所述基因不编码功能性膜蛋白或其功能性部分。本发明也提供一种分离和/或纯化的重组流感病毒，所述病毒缺乏膜蛋白基因。重组流感病毒中缺乏功能性膜蛋白(例如膜内在蛋白)，提供了在体外能复制但在体内被减毒的重组流感病毒。在一个实施方案中，所述重组病毒包含突变膜蛋白基因，所述基因包含一个或多个突变，当所述基因在细胞中转录和/或翻译时，不能产生功能性膜蛋白或其功能性部分。在另一个实施方案中，相对于编码功能性膜蛋白的相应膜蛋白基因来说，所述突变膜蛋白基因包含至少两个突变，其中至少一个突变不在对应于所述蛋白跨膜结构域的区域内。例如，所述突变膜蛋白基因，当在细胞中转录和/或翻译时，不产生功能性基因产物，而产生水平降低(例如小于约50％、10％、1％或无法检测)的野生型膜蛋白，和/或产生这样的突变膜蛋白：其活性小于约50％、优选小于约10％、更优选小于约1％的相应野生型(功能性)膜蛋白的活性，例如是由于其C-端缺乏野生型序列，即为截短的膜蛋白。在本发明的一个实施方案中，相对于相应野生型膜蛋白来说，所述突变膜蛋白基因编码至少一个氨基酸取代。在一个实施方案中，所述取代在起始甲硫氨酸的约1-50个残基上或内部，或者其间的任意整数，例如在1-20个残基上或内部，或者在1-3个残基上或内部。在一个优选的实施方案中，至少一个取代就位于起始甲硫氨酸。在另一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因具有一个或多个终止密码子，所述终止密码子在起始密码子的约1-50个密码子上或内部，或者其间的任意整数，例如在1-20个密码子上或内部。在又一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的一个或多个缺失。在一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的一个或多个缺失，所述缺失在所述基因编码区第一个密码子的约150个核苷酸上或内部，例如在1、2、3......150个核苷酸上或内部，或者其间的任意整数。在一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的一个或多个***。在一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的一个或多个***，所述***在所述基因编码区第一个密码子的约150个核苷酸上或内部，例如在1、2、3......150个核苷酸上或内部，或者其间的任意整数。所述***和/或缺失优选改变膜蛋白基因的读框。在又一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因包含2个或更多个突变，例如包括以下突变在内的2个或更多个突变：在起始密码子中产生不是甲硫氨酸的氨基酸密码子的核苷酸取代，导致起始密码子变为终止密码子的核苷酸取代，导致在编码序列中产生终止密码子的核苷酸取代，编码序列中的一个或多个核苷酸缺失，编码序列中的一个或多个核苷酸***，或它们的任何组合。在一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因在载体上并且操作性连接包括但不限于以下的启动子：RNA聚合酶I启动子(例如人RNA聚合酶I启动子)、RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子、T7启动子和T3启动子。在另一个实施方案中，所述突变膜蛋白基因在载体上并且操作性连接包括但不限于以下的转录终止序列：RNA聚合酶I转录终止序列、RNA聚合酶II转录终止序列或RNA聚合酶III转录终止序列或核酶。
如本文所述，已通过反求遗传学产生乙型流感敲除病毒，对其生长特征和其它特性都做了体外试验和体内试验。在细胞培养物中，不表达NB的突变体与野生型病毒的复制一样有效，而在小鼠中它们与野生型病毒相比显示出受限制的生长。因此，NB蛋白对于细胞培养的乙型流感病毒来说并非必不可少，但是在小鼠中能促进有效生长。假定NB敲除病毒在体内、而不是在体外减慢生长，那么这些突变病毒就可用于流感活疫苗的开发。
因此，本发明还提供包含本发明重组病毒的疫苗或免疫原性组合物，以及使用所述疫苗或免疫原性组合物来免疫脊椎动物或者诱导脊椎动物的免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明的重组病毒包含来自甲型流感病毒的基因。在另一个实施方案中，本发明的重组病毒包含来自乙型流感病毒的基因。在又一个实施方案中，本发明的重组病毒包含来自丙型流感病毒的基因。在再一个实施方案中，本发明的重组病毒包含一个或多个来自甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或其任何组合的基因。例如，所述重组病毒可包含来自以下的NB基因的突变NB基因：B/Lee/40、B/Shiga/T30/98、B/Mie/1/93、B/Chiba/447/98、B/Victoria/2/87、B/Yamanashi/166/98、B/Nagoya/20/99、B/Kouchi/193/99、B/Saga/S172/99、B/Kanagawa、B/Lusaka/432/99、B/Lusaka/270/99、B/Quebec/74204/99、B/Quebec/453/98、B/Quebec/51/98、B/Quebec/465/98和B/Quebec/511/98(检索号AB036873、AB03672、AB036871、AB036870、AB036869、AB036868、AB036867、AB036866、D14855、D14543、D14542、AB059251、AB059243、NC002209、AJ419127、AJ419126、AJ419125、AJ419124和AJ419123，其公开内容都通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，NB基因中的突变不会改变NA基因的序列。在另一个实施方案中，NB基因中的突变也会改变NA基因的序列，但产生的NA具有与相应非突变型NA基因所编码的NA基本相同的活性。本文所用的“基本相同的活性”包括约为相应的全长多肽活性的0.1％、1％、10％、30％、50％、例如直到100％或更高的活性。
也提供了制备包含突变膜蛋白基因的重组流感病毒的方法，相对于相应野生型膜蛋白来说，所述膜蛋白基因不编码功能性膜蛋白或其功能性部分。该方法包括使宿主细胞与包含多种流感载体的组合物接触，所述载体包括含有突变膜蛋白基因的载体，所以产生重组病毒。例如，对于乙型流感来说，所述组合物包含：a)至少两种选自以下的载体：包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒cDNA NA和NB操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中相对于编码功能性NB膜蛋白的相应NB基因来说，NB的cDNA序列包括至少两个突变，其中的一个突变不在跨膜结构域内，而存在于所述突变基因中，当突变基因在宿主细胞中转录和翻译时，不能产生功能性膜蛋白或其功能性部分，而任选产生功能性NA蛋白；和b)至少两种选自以下的载体：包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒BM2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NS的DNA区段操作性连接的启动子的载体。
本发明还提供包含多种载体(例如上述载体)的组合物和与所述组合物或本发明分离的重组病毒接触的宿主细胞，例如以便得到感染性病毒。或者，可以使所述宿主细胞与每种载体或者与载体亚群序贯接触。
还提供分离和/或纯化的核酸分子(多核苷酸)或核酸分子的互补序列，所述核酸分子编码至少一种流感病毒B/Lee/40蛋白或其部分。在一个实施方案中，所述分离和/或纯化的核酸分子编码HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M或NS，或其部分，它们具有与SEQ ID NO：1-8之一的相应多肽基本相同的活性。本文所用的“基本相同的活性”包括为相应的全长多肽活性的约0.1％、1％、10％、30％、50％、例如直到100％或更高的活性。在一个实施方案中，所述分离和/或纯化的核酸分子编码的多肽与SEQ ID NO：1-8之一有至少80％、例如90％、92％、95％、97％或99％的毗连氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述分离和/或纯化的核酸分子包括与SEQ ID NO：1-8之一有至少50％、例如60％、70％、80％或90％或更高的毗连核酸序列同源性的核苷酸序列或其互补序列，并且如果与SEQ ID NO：1-8之一的编码序列同源的话，那么编码与SEQ ID NO：1-8之一有至少80％、例如90％、92％、95％、97％或99％的毗连氨基酸序列同一性的多肽。在另一个实施方案中，在低严格性、中等严格性和严格性条件下，使编码至少一种流感病毒B/Lee/40蛋白或其部分的分离和/或纯化的核酸分子或所述核酸分子的互补序列，与SEQ ID NO：1-8之一或其互补序列杂交。例如，可以采用以下条件：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，于50℃杂交，用2X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤；更好是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM EDTA中，于50℃杂交，用1X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤；还更好是在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中，于50℃杂交，用0.5X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤；优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，于50℃杂交，用0.1X SSC、0.1％SDS于50℃洗涤；更优选在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中，于50℃杂交，用0.1XSSC、0.1％SDS于65℃洗涤。
本发明的核酸分子可用于表达流感蛋白，以制备嵌合基因(例如含有其它病毒基因，包括其它流感病毒基因)和/或制备重组病毒。因此，本发明也提供分离的多肽、重组病毒和与包含流感病毒B/Lee/40序列的核酸分子或重组病毒接触的宿主细胞。所述多肽、重组病毒和宿主细胞可用于药物治疗(例如诱导保护性免疫应答)或用于基因治疗。
                        附图简述
图1.已建立的反求遗传学***的示意图。在RNP转染方法(A)中，纯化的NP和聚合酶蛋白与体外合成的vRNA一起装配成RNP。细胞用RNP转染，随后通过辅助病毒感染。在RNA聚合酶I方法(B)中，使含有RNA聚合酶I启动子、有待拯救的编码vRNA的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒转染细胞。通过RNA聚合酶I进行胞内转录，得到合成的vRNA，其在辅助病毒感染后包装到子代病毒颗粒中。采用这两种方法，转染病毒(即含有来自克隆cDNA的RNA的病毒)选自辅助病毒群体。
图2.产生RNA聚合酶I构建体的示意图。通过PCR扩增来自流感病毒的cDNA，用BsmBI消化，克隆到pHH21载体的BsmBI位点上(E.Hoffmann，博士论文，Justus，Liebig-University，Giessen，德国)，该载体含有人RNA聚合酶I启动子(P)和小鼠RNA聚合酶I终止子(T)。终止序列上游的胸腺嘧啶核苷酸(*T)代表流感病毒RNA的3′端。甲型流感病毒序列用粗体字母表示。(SEQ ID NO：10-19和28-29)。
图3.产生分节段负义RNA病毒的反求遗传学方法。将含有RNA聚合酶I启动子、8种病毒RNA区段的cDNA和RNA聚合酶I终止子的质粒与蛋白表达质粒一起转染到细胞中。尽管可以用表达PA、PB1、PB2和NP的质粒产生感染性病毒，但是所有其余的结构蛋白(用圆框表示)的表达提高了病毒产生的效率，这取决于所产生的病毒。
图4.将突变导入NA区段的示意图。突变以黑体表示(-，缺失；*，***)。数字表示核苷酸位置。(SEQ ID NO：20-27)。
图5.NB蛋白表达的分析。(A)通过免疫荧光测定，检测感染MDCK细胞中的NB蛋白。分别为B/LeeRG，B/LeeRG-感染的细胞；WSN，A/WSN/33-感染的细胞；对照，未感染细胞；#1，#2和#3，BLeeNBstop#1，BLeeNBstop#2和BLeeNBstop#3-感染的细胞。(B)通过免疫沉淀测定，检测病毒感染的MDCK细胞中的NB蛋白。放射性标记的NB蛋白用兔抗NB肽血清进行免疫沉淀，然后在4-20％的梯度聚丙烯酰胺凝胶上进行分析。#1，BLeeNBstop#1-感染的细胞裂解物；#2，BLeeNBstop#2-感染的细胞裂解物；#3，BLeeNBstop#3-感染的细胞裂解物；C，未感染细胞裂解物。标明了分子量标记(kDa)。
图6.B/LeeRG和突变病毒的生长曲线。MDCK细胞用病毒(0.001PFU)感染，于37℃孵育。感染后在指定时间里，测定上清液中的病毒滴度。数值是3次测定的平均值(±SD)。
图7.流感病毒B/Lee/40序列(SEQ ID NO：1-8)。
                      发明详述
定义
本文所用的术语“分离和/或纯化”是指本发明的载体、质粒或病毒的体外制备、分离和/或纯化，使得不再结合体内物质，或者说基本上从体外物质中纯化出来。本发明的分离的病毒制备物通常是通过体外培养和扩增而得到的，并且基本上不含其它感染因子。本文所用的“基本上不含”是指对特定感染因子来说，低于用标准检测方法对其进行检测的检出水平。“重组”病毒是已经经过体外操作(例如使用重组DNA技术)而改变其病毒基因组的病毒。
本文所用的术语“重组核酸”或“重组DNA序列或区段”是指这样的核酸例如DNA：其衍生或分离自同一来源，随后可在体外因化学修饰而改变，致使其序列不是天然存在的，或者对应于天然存在的序列但其定位与在天然基因组中的定位不同。
“衍生”自同一来源的DNA的一个实例可以是已鉴定为有用片段并随后以基本纯的形式化学合成的DNA序列。“分离”自同一来源的DNA的一个实例可以是用化学方法(例如用限制性内切核酸酶)从其来源切下或取出的有用的DNA序列，致使其可通过基因工程方法进行进一步操作如扩增，供本发明使用。
“低”严格性条件包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中于37℃杂交，然后在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50-55℃洗涤。
“中等”严格性条件包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，然后在0.5X-1X SSC中于55-60℃洗涤。
对于DNA印迹或RNA印迹的滤膜上有超过100个互补残基的互补核酸杂交，“严格性”条件为：在50％甲酰胺，例如50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中于37℃杂交，然后在0.1X SSC中于60-65℃洗涤。
用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。因此，可以运用数学算法求出任何两个序列间的同一性百分率。这些数学算法的优选非限制性实例是Myers和Miller(1988)的算法、Smith等(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)的相似性搜索方法、Karlin和Altschul(1990)的算法，后来Karlin和Altschul(1993)又作了修改。
可以在计算机上实施这些数学算法以进行序列比较，求出序列同一性。这些实施包括但不限于：PC/Gene程序中的CLUSTAL(可得自Intelligenetics，Mountain View，California)；ALIGN程序(第2.0版)和Wisconsin Genetics软件包(第8版)(可得自Genetics ComputerGroup(GCG)，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以用缺省参数运行这些程序，进行比对。Higgins等，1988；Higgins等，1989；Corpet等，1988；Huang等，1992；和Pearson等，1994已经详细介绍了CLUSTAL程序。ALIGN程序是根据Myers和Miller(出处同上)的算法。Altschul等(1990)的BLAST程序是根据Karlin和Altschul(出处同上)的算法。
公众可通过国立生物工程信息中心(National Center forBiotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获取进行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定在查询序列中与数据库序列中相同长度的字串比对时或者匹配或者满足某些正数值最低分值T的长度W的短字串，来鉴定高分序列配对(HSP)。T被称为邻近字串最低分值(Altschul等，1990)。这些原始邻近字串命中作为起始搜索以发现含有它们的更长HSP的种子。只要累积序列比对分值可以增加，字串命中则以两个方向沿每个序列延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖分(reward score)；总是＞0)和N(错配残基的罚分(penalty score)；总是＜0)，计算累积分值。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积分值。字串命中在每个方向的延伸当遇到下述情况之一时终止：累积序列比对分值比其获得的最大值低数量X；累积分值为零或零以下，这是由于一个或多个负打分残基比对的累积所致；或者到达任一序列的末端。
除了计算序列同一性百分率外，BLAST算法也可进行两个序列间相似性的统计学分析(参见例如Karlin & Altschul(1993))。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小和概率(P(N))，它提供两个核苷酸序列或两个氨基酸序列可能偶然发生匹配的概率的指标。例如，如果待测核酸与参比核酸比较中的最小和概率低于大约0.1，更优选低于大约0.01，最优选低于大约0.001，则认为待测核酸与参比序列相似。
为了得到空位比对供比较用，可以使用Altschul等(1997)介绍的Gapped BLAST(在BLAST2.0中)。或者，可以使用PSI-BLAST(在BLAST2.0中)来进行反复搜索，以检查分子间距离关系。参见Altschul等(出处同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST、PSI-BLAST时，可以使用各自程序(例如用于核苷酸序列的BLASTN，用于蛋白的BLASTX)的缺省参数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)中使用的缺省字长(W)为11，期望值(E)为10，阈值为100，M＝5，N＝-4，进行两条链之间的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序中使用的缺省字长(W)为3，期望值(E)为10，BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，1989)。参见 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.也可通过人工序列比对和目测检查。
关于序列比较，通常将一个序列作为参比序列，将待测序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将待测序列和参比序列输入计算机，必要时指定亚序列坐标，并且指定序列算法程序参数。根据所指定的程序参数，序列比较算法则计算出待测序列相对于参比序列的序列同一性百分比。
正粘病毒
流感病毒
甲型流感病毒具有8条单链负义病毒RNA(vRNA)的基因组，总共编码10种蛋白。流感病毒生命周期起始于HA与宿主细胞表面含唾液酸受体的结合，其后是受体介导的胞吞作用。后期胞内体的低pH触发HA变构，因而暴露出HA2亚基的N端(所谓融合肽)。融合肽促使病毒和胞内体膜融合，然后基质蛋白(M1)和RNP复合体释放到细胞质内。RNP由核蛋白(NP)组成，其中包裹着vRNA和病毒聚合酶复合体，该聚合酶复合体是由PA、PB1和PB2蛋白所形成的。RNP转运到细胞核中，在此进行翻译和复制。RNA聚合酶复合体催化3个不同的反应：以cDNA为模板合成具有5′帽子和3′多聚腺苷酸结构的mRNA，用该mRNA为模板合成全长互补RNA(cRNA)，最后合成基因组vRNA。随后，新合成的vRNA、NP和聚合酶蛋白装配成RNP，从核中输出，转运到质膜，在此进行子代病毒颗粒的出芽。通过除去唾液酸寡糖中的唾液酸，从细胞表面释放出新装配的病毒体，阻止病毒颗粒的自我聚集，神经氨酸酶(NA)蛋白在感染后期起到至关重要的作用。尽管病毒装配包括蛋白-蛋白相互作用和蛋白-vRNA相互作用，但是这些相互作用的性质基本上尚未知晓。
尽管乙型和丙型流感病毒在结构和功能上均类似于甲型流感病毒，但是还是有一些差异。例如，乙型流感病毒没有具离子通道活性的M2蛋白。同样，丙型流感病毒也没有具离子通道活性的M2蛋白。然而，CM1蛋白可能具有这一活性。可通过本领域众所周知的方法，参见例如Holsinger等(1994)和WO01/79273，测定离子通道蛋白的活性。
本发明可以使用的细胞系知流感病毒
根据本发明，任何支持流感病毒有效复制的细胞都可用于本发明，所述细胞包括表达减少或降低水平的一个或多个唾液酸(流感病毒受体)的突变细胞。由该方法得到的病毒可以制成重配(reassortant)病毒。
优选所述细胞是经WHO检验或确认的连续细胞系。证明这些细胞系的要求包括对至少一个谱系、生长特征、免疫学标记、病毒易感性、致瘤性和储藏条件进行表征，以及通过在动物、鸡胚和细胞培养在做实验进行表征。所述表征用于证实所述细胞没有可检测的外来因子(adventitious agents)。在一些国家，还需要做细胞核学实验。另外，致瘤性优选在与用于疫苗生产的细胞具有相同传代水平的细胞中进行试验。在进行疫苗生产的灭活或减毒之前，病毒优选通过已显示能得到稳定结果的方法进行纯化(参见例如世界卫生组织(World Health Organization)，1982)。
优选建立待用细胞系的完整表征，使其包括用于终产物纯度的合适试验。可用于表征本发明所用细胞的数据包括：(a)有关其来源、衍生过程和传代史的信息；(b)有关其生长和形态学特征的信息；(c)外来因子的试验结果；(d)区别特征，例如将这些细胞与其它细胞系清楚地区分开来的生物化学、免疫学和细胞遗传学模式；和(e)致瘤性试验结果。优选所用宿主细胞的传代水平或群体倍增尽可能低。
优选所述细胞中生产的病毒在配制疫苗或基因治疗制剂之前已经高度纯化。一般而言，纯化过程使得细胞DNA、其它细胞组分和外来因子完全除去。也可使用完全降解或变性DNA的方法。参见例如Mizrahi，1990。
疫苗
本发明的疫苗可包括免疫原性蛋白，所述蛋白包括任何病原体的糖蛋白，例如来自一种或多种细菌、病毒、酵母或真菌的免疫原性蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的流感病毒可以是流感病毒的疫苗载体或包括但不限于以下的其它病毒病原体的疫苗载体：慢病毒，例如HIV、乙肝病毒、丙肝病毒，疱疹病毒例如CMV或HSV或***病毒。
通过超滤，浓缩完整病毒体的疫苗，然后通过区带离心或层析进行纯化。可以在纯化前后使用***或β-丙内酯等来灭活。
亚单位疫苗包括纯化的糖蛋白。所述疫苗可按以下方法制备：使用经去垢剂处理而破坏的病毒悬液，通过例如超速离心纯化表面抗原。因此，亚单位疫苗主要含有HA蛋白，但也含有NA。所用的去垢剂可以是阳离子去垢剂例如十六烷基三甲基溴化铵(Bachmeyer，1975)，阴离子去垢剂例如脱氧胆酸铵(Laver&Webster，1976)；Webster等，1977)；或非离子去垢剂例如商品名为TRITON X100的去垢剂。也可以在蛋白酶例如菠萝蛋白酶处理病毒体后，分离血凝素，然后通过例如Grand和Skehel(1972)所介绍的方法进行纯化。
片段疫苗(split vaccine)包括经过溶解脂质的试剂处理的病毒体。片段疫苗可以如下制备：在搅拌下，用脂质溶剂例如***或氯仿以及去垢剂，处理如上获得的纯化病毒的含水悬液(灭活或未灭活)。病毒包膜脂质的分解产生病毒颗粒片段。回收水相，其中含有片段疫苗，其主要由血凝素和神经氨酸酶(其原有的脂质环境被去除)以及核心或其降解产物组成。然后，将残留的感染性颗粒灭活，如果之前尚未灭活的话。
灭活疫苗.可以用已知方法灭活本发明的复制型病毒，提供本发明的灭活流感病毒疫苗，所述方法例如但不限于***或B-丙内酯处理。用于本发明的灭活疫苗类型可包括全病毒(WV)疫苗或亚病毒颗粒(SV)(片段)疫苗。WV疫苗含有完整的灭活病毒，而SV疫苗含有用去垢剂破坏而溶解含脂质病毒包膜、接着通过化学方法灭活残余病毒的纯化病毒。
另外，可以使用的疫苗还包括含有分离的HA和NA表面蛋白的疫苗，所述疫苗称为表面抗原或亚单位疫苗。一般而言，针对SV和表面抗原(即纯化的HA或NA)疫苗的应答都是类似的。一种含有与流行病毒免疫相关的NA抗原和无关HA的实验灭活WV疫苗看来有效性要比常规疫苗差些(Ogra等，1977)。优选含有这两种相关表面抗原的灭活疫苗。
减毒活病毒疫苗.根据已知的方法步骤，减毒活流感病毒疫苗也可用于预防或治疗流感病毒感染。优选按照已知方法(参见例如Murphy，1993)，通过将来自减毒供体病毒的减毒基因转移到分离的或重配的(reassorted)复制型病毒中，用一步法完成减毒过程。因为抗甲型流感病毒的抗性是由产生抗HA和NA糖蛋白的免疫应答介导的，所以编码这些表面抗原的基因必须来自重配病毒或高度生长的临床分离株。减毒基因来自减毒亲本。在这一方法中，赋予减毒作用的基因优选不编码HA和NA糖蛋白。另外，这些基因不能转移给带有临床病毒分离株表面抗原的重配子。
已经对许多供体病毒再现减毒流感病毒的能力进行了评价。作为非限制性实例，A/Ann Arbor(AA)/6/60(H2N2)冷适应(ca)供体病毒可以用于减毒疫苗生产(参见例如Edwards，1994；Murphy，1993)。另外，可以通过将ca供体病毒与本发明的强毒复制型病毒交配，产生减毒活重配病毒疫苗。然后在H2N2抗血清的存在下，在25℃选择重配子代(限制强毒病毒的复制)，所述抗血清抑制带有减毒A/AA/6/60(H2N2)ca供体病毒表面抗原的病毒的复制。
已经对在人类中的一系列H1N1和H3N2重配病毒进行了评价，并且发现是令人满意的：(a)感染性，(b)对血清反应阴性儿童和初次免疫的成人来说是弱毒的，(c)免疫原性，(d)遗传稳定性。ca重配子的免疫原性平行于其复制水平。因此，由新野生型病毒获得ca供体病毒的6个可转移基因，可以重复地减毒这些病毒，用于接种易感性成人和儿重。
其它减毒突变可以经定点诱变引入流感病毒基因，以拯救带有这些突变基因的感染性病毒。减毒突变可以引入基因组非编码区以及编码区。这些减毒突变也可以引入HA或NA以外的基因，例如PB2聚合酶基因(Subbarao等，1993)。因此，也可以产生带有经定点诱变引入的减毒突变的新的供体病毒，而所述新的供体病毒可用于减少活的减毒重配H1N1和H3N2候选疫苗，其方式类似于上述A/AA/6/60ca供体病毒。同样，其它已知的合适减毒供体株可以与本发明的流感病毒重配，以得到适于哺乳动物免疫接种的减毒疫苗(Ewami等，1990；Muster等，1991；Subbarao等，1993)。
优选所述减毒病毒保留来自编码与原始临床分离株的抗原决定簇基本类似的病毒的基因。这是因为减毒疫苗的目的是为了提供与原始临床分离病毒株基本相同的抗原性，而同时缺乏感染性，以至于疫苗在接种的哺乳动物中最小可能地引起严重致病性。
因此，可以按照常规方法，将所述病毒减毒或灭活，配制并作为疫苗给药，以在动物例如哺乳动物体内诱导免疫应答。下述方法在本领域中是众所周知的：确定这些减毒或灭活疫苗是否保留与临床分离株或由其衍生的高生长株相似的抗原性。所述已知方法包括利用抗血清或抗体消除表达供体病毒抗原决定簇的病毒；化学选择(例如金刚烷胺或金刚乙胺)；HA和NA活化和抑制；DNA筛选法(例如探针杂交或PCR)，以证实减毒病毒中不存在编码抗原决定簇的供体基因(例如HA或NA基因)。参见例如Robertson等，1988；Kilbourne，1969；Aymard-Henry等，1985；Robertson等，1992。
药物组合物
适于接种或胃肠外或口服给药的本发明药物组合物包含减毒流感病毒或灭活流感病毒，任选还包含无菌的水性或非水性溶液剂、混悬剂和乳剂。所述组合物还可包含本领域已知的助剂或赋形剂。参见例如Berkow等，1987；Goodman等，1990； Avery′s Drug Treatment，1987；Osol，1980；Katzung，1992。本发明的组合物通常为单剂量(单位剂量)形式。
常规疫苗通常含有约0.1-200μg、优选10-15μg血凝素，这来自加入其组合物的各毒株。构成本发明疫苗组合物主要成分的疫苗可包括甲型、乙型、丙型病毒或其任何组合，例如，这三种型别中的至少两种，不同亚型的至少两种，同型中的至少两种，相同亚型的至少两种或不同的分离株或重配株。人甲型流感病毒包括H1N1、H2N2和H3N2亚型。
供胃肠外给药用制剂包括无菌水性或非水性溶液剂、混悬剂和/或乳剂，其可含有本领域已知的助剂或赋形剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(例如橄榄油)以及注射用有机酯类，例如油酸乙酯。载体或闭合敷料(occlusive dressings)可用于增加皮肤渗透性并增加抗原吸收。供口服给药用液体剂型通常可包括含有所述液体剂型的脂质体溶液剂。用于悬浮脂质体的合适的形式包括乳剂、混悬剂、溶液剂、糖浆剂和酏剂，其含有本领域通常使用的惰性稀释剂，例如纯净水。除了惰性稀释剂外，所述组合物也可包括佐剂、润湿剂、乳化剂和悬浮剂，或者甜味剂、矫味剂或芳香剂。参见例如Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery′s，1987；Osol，1980；Katzung，1992。
当本发明的组合物用于给予个体时，它还可包含可提高所述组合物功效的盐类、缓冲剂、佐剂或其它物质。对于疫苗来说，可以使用能增强特异性免疫应答的佐剂。通常，佐剂和组合物可以混合在一起，然后给予免疫***，或者可以单独给予，但是给予免疫生物体的同一部位。Osol(1980)提供了适用于疫苗组合物的材料的实例。
通过将至少2株流感病毒株、例如2-50株或其中任意范围或数值的复制型流感病毒进行混合，提供疫苗的异质性。优选具有现代抗原组合的甲型或乙型流感病毒株。按照本发明，可以使用本领域已知技术，在单株流感病毒中提供用于变异的疫苗。
本发明的药物组合物还可包含或者另外包含至少一种化疗化合物，例如用于基因治疗和疫苗的化合物，用于基因治疗的化合物例如免疫抑制剂、抗炎药或免疫增强剂，用于疫苗的化合物包括但不限于γ-球蛋白、金刚烷胺、胍、羟基苯并咪唑、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、缩氨基硫脲类、美替沙腙、利福平、利巴韦林、嘧啶类似物、嘌呤类似物、膦甲酸、膦乙酸、阿昔洛韦、二脱氧核苷、蛋白酶抑制剂或更昔洛韦。参见例如Katzung(1992)及其中引用的参考文献，第798-800页和第680-681页。
所述组合物也可含有可变的、但是少量的无内毒素甲醛和防腐剂，其已发现是安全的并且在接受所述组合物的生物体内不会产生不想要的效果。
药用目的
给予所述组合物(或其诱导的抗血清)可以是为了“预防”或者“治疗”目的。当用于预防目的时，在出现病原体感染的任何症状之前，给予作为疫苗的本发明组合物。预防性给予所述组合物的作用是预防或缓解任何其后的感染。当用于预防目的时，在出现任何疾病症状之前，给予本发明的基因治疗组合物。预防性给予所述组合物的作用是预防或缓解一种或多种与所述疾病有关的症状。
当用于治疗目的时，在检测到有实际感染症状时，给予减毒或灭活病毒疫苗。治疗性给予所述化合物的作用是缓解任何实际感染。参见例如Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；Katzung，1992。当用于治疗时，当检测到疾病症状或指征时，给予基因治疗组合物。治疗性给予所述化合物的作用是缓解所述疾病症状或指征。
因此，本发明减毒或灭活疫苗组合物可以在感染发作之前(以预防或缓解预期的感染)或实际感染开始之后给予。同样，对于基因治疗，所述组合物也可以在出现障碍或疾病的任何症状之前或者在检测到一种或多种症状之后给予。
所述组合物是“药理学上可接受的”，是指受体患者可以耐受给予所述组合物。所述药物是以“治疗有效量”给予，是指所给予的用量在生理上是有意义的。本发明的组合物在生理上是有意义的，是指其存在产生在受体患者生理学上可检测的变化，例如增强至少一个针对感染性流感病毒至少一个毒株的初次或继发的体液或细胞免疫应答。
所提供的“保护性”并不是绝对的，即流感感染并不总是可以预防或根除的，虽然与对照群体或一组患者相比，有统计学显著性改善。保护性可仅限于减轻流感病毒感染症状发作的严重程度或减慢其速度。
给药
本发明的组合物可通过或者被动免疫或者主动免疫而赋予抗一种或多种病原体例如一种或多种流感病毒株的抗性。在主动免疫中，预防性给予宿主(例如哺乳动物)灭活或减毒活疫苗组合物，给药宿主的免疫应答可避免感染和/或疾病。对于被动免疫，可以回收诱导的抗血清，然后给予怀疑受到至少一种流感病毒株感染的接受者。本发明的基因治疗组合物可通过主动免疫而产生预防或治疗水平的所需基因产物。
在一个实施方案中，将所述疫苗在足以产生免疫应答的时间和用量的条件下给予雌性哺乳动物(在受孕或分娩时或之前)，所述免疫应答起到同时保护母体和胎儿或新生儿的作用(通过被动给予穿过胎盘的抗体或母乳中的抗体)。
因此，本发明包括预防或缓解障碍或疾病(例如由至少一株病原体引起的感染)的方法。本文所说的疫苗预防或缓解疾病，是指如果其给药则会引起症状或病症全部或部分缓解(即抑制)，或者引起个体对所述疾病的全部或部分免疫力。本文所说的基因治疗组合物预防或缓解疾病，是指如果其给药则会引起症状或病症全部或部分缓解(即抑制)，或者引起个体对所述疾病的全部或部分免疫力。
可以通过达到预期目的的任何方式，使用上述药物组合物，给予本发明的至少一种灭活或减毒流感病毒或其组合物。
例如，可以通过各种胃肠外途径，例如皮下、静脉内、皮内、肌内、腹膜内、鼻内、口服或经皮途径，给予所述组合物。胃肠外给药可以通过快速浓注或者通过长时间逐渐输注的方式进行。使用本发明药物组合物的优选方式是通过肌内或皮下给药。参见例如Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery，1987；Katzung，1992。
对于预防、抑制或治疗流感病毒相关病理，通常的方案包括给予有效量的上述疫苗组合物，可以作为单次给药，或者在1周和约24个月之间的周期内或者其间的任何范围内，作为加强或增强剂量重复给药。
按照本发明，组合物的“有效量”是指足以达到所需生物学效果的用量。人们知道，有效量将取决于接受者的年龄、性别、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的特点。下面提供的有效剂量的范围并不是对本发明的限制，而是代表优选的剂量范围。然而，最优选剂量将因各受试者而异，这是本领域技术人员可理解和可确定的。参见例如Berkow等，1992；Goodman等，1990；Avery′s，1987；Ebadi，1985；Katsung，1992。
对于哺乳动物(例如人)或鸟类成年生物体，减毒病毒疫苗的剂量可为约103-107噬斑形成单位(PFU)/kg，或其中任意范围或数值。灭活疫苗剂量范围可为约0.1-200μg、例如50μg血凝素蛋白。然而，通过常规方法检定、使用现有疫苗作为出发点，所述剂量应当是安全有效的。
可以将每剂复制型病毒疫苗中免疫反应性HA的剂量标准化，使其含有合适的量，例如1-50μg或其中任意范围或数值，或者为美国公共卫生服务部(U.S.Public Health Service，PHS)推荐量，通常是对于3岁以上儿童每份15μg，对于3岁以下儿童每份7.5μg。NA的用量也可以标准化，然而，该糖蛋白在加工、纯化和储藏中可能不太稳定(Kendal等，1980；Kerr等，1975)。每剂0.5ml的疫苗优选含有约10-500亿个病毒颗粒，优选100亿个病毒颗粒。
下面通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
                          实施例1
材料与方法
细胞与病毒.将293T人胚肾细胞和Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞分别在补充10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)和含有5％新生小牛血清的改良Eagle培养基(MEM)中进行培养。所有细胞都维持在37℃/5％CO2。流感病毒A/WSN/33(H1N1)和A/PR/8/34(H1N1)在10日龄鸡胚中繁殖。
质粒的构建.为了产生RNA聚合酶I构建体，将衍生自A/WSN/33或A/PR/8/34病毒RNA的克隆cDNA引入到RNA聚合酶I启动子和终止序列之间。简而言之，使用含有BsmBI位点的引物，通过PCR扩增该克隆cDNA，用BsmBI消化，克隆到pHH21载体的BsmBI位点，所述载体含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子，其间被BsmBI位点间隔开(图2)。分别通过使用以下质粒：pSCWPB2、pGW-PB1、pSCWPA(都得自Debi Nayak博士，Universityof California Los Angeles)和pWH17、pWNP152、pT3WNA15(Castrucci等，1992)、pGT3WM、pWNS1，将A/WSN/33株的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因进行PCR扩增。流感A/PR/8/34病毒的PB1基因通过使用pcDNA774(PB1)(Perez等，1998)作为模板进行扩增。为了确保这些基因不含不需要的突变，用自动测序仪(AppliedBiosystem Inc.，CA，USA)，按照生产商推荐的方案，对来自PCR的片段进行测序。按照Huddleston等(1982)介绍的方法，对编码A/WSN/33病毒HA、NP、NA和M1基因的cDNA进行克隆并亚克隆到真核表达载体pCAGGS/MCS(处于鸡β-肌动蛋白启动子的控制下)中(Niwa等，1991)，分别得到pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NPO-14、pCAGGS-WNA15和pCAGGS-WSN-M1-2/1。来自A/PR/8/34病毒的M2和NS2基因通过PCR扩增并克隆到pCAGGS/MCS中，得到pEP24c和pCA-NS2。最后，用pcDNA774(PB1)、pcDNA762(PB2)和pcDNA787(PA)，在巨细胞病毒启动子的控制下表达PB2、PB1和PA蛋白(Perez等，1998)。
感染性流感病毒颗粒的产生.使用Trans IT LT-1(Panavera，Madison，Wisconsin)，按照生产商的说明书，用最多达17种质粒以不同数量转染293T细胞(1×106)。简而言之，将DNA和转染试剂混合在一起(每μg DNA 2μl Trans IT LT-1)，在室温下孵育45分钟，然后加入到细胞中。6小时后，用含有0.3％牛血清白蛋白和0.01％胎牛血清的Opti-MEM(Gibco/BRL，Gaithersburg，Maryland)更换DNA-转染试剂混合物。转染后，在不同时间收获上清液中的病毒，在MDCK细胞上测定其滴度。因为该方法不需要辅助病毒，所以回收的转染病毒无需噬斑纯化就可直接进行分析。
质粒转染细胞产生的病毒百分率测定.转染后24小时，293T细胞用0.02％EDTA分散成单细胞。然后将细胞悬液进行10倍稀释，转移到长满单层MDCK细胞的24孔板中。通过血细胞凝集试验来检测病毒。
免疫染色测定.用流感病毒感染后9小时，细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤2次，用3.7％低聚甲醛(溶于PBS)在室温下固定20分钟。然后，按照Neumann等(1997)介绍的方法，用0.1％Triton X-100处理和加工。
结果
通过质粒驱动的病毒RNA区段、3种聚合酶亚基和NP蛋白的表达，产生感染性病毒.尽管用纯化病毒体提取的RNP混合物转染细胞，产生感染性流感病毒颗粒，但是当用8种不同的体外产生的RNP时，该策略不一定有效。为了完全从cDNA产生感染性流感病毒，体内产生8种病毒RNP。因此，制备含有A/WSN/33病毒全长病毒RNA的cDNA的质粒，所述cDNA邻接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。原则上来说，这8种质粒转染到真核细胞，将导致所有8种流感病毒vRNAD的合成。然后，通过蛋白表达质粒共转染所产生的PB2、PB1、PA和NP蛋白将与vRNA一起装配成可复制和转录的功能性vRNP，最终形成感染性流感病毒(图3)。用蛋白表达质粒(1μg pcDNA762(PB2)、1μg pcDNA774(PB1)、0.1μgpcDNA787(PA)和1μg pCAGGS-WSN-NPO/14)和各1μg以下RNA聚合酶I质粒(pPolI-WSN-PB2、pPolI-WSN-PB1、pPolI-WSN-PA、pPolI-WSN-HA、pPolI-WSN-NP、pPolI-WSN-NA、pPolI-WSN-M和pPolI-WSN-NS)，转染1×106293T细胞。使用减少量的pcDNA787(PA)的做法是根据以前的观察结果(Mena等，1996)，并根据用于产生病毒样颗粒(VLP)的最佳条件的数据(数据未显示)。293T细胞转染后24小时，在上清液中发现7×103pfu病毒/ml(实验1，表1)，首次证明采用反求遗传学完全能够从质粒产生甲型流感病毒。
表1.用于从克隆cDNA产生流感病毒的质粒系列*
                               实验
  RNA聚合酶I质粒+：   1   2   3   4   5   6   7   8
  PB1   +   +   -   -   -   -   -   -
  PR8-PB1   -   +   +   +   +   +   +
  PB2   +   +   +   +   +   +   +   +
  PA   +   +   +   +   +   +   +   +
  HA   +   +   +   +   +   +   +   +
  NP   +   +   +   +   +   +   +   +
  NA   +   +   +   +   +   +   +   +
  M   +   +   +   +   +   +   +   +
  NS   +   +   +   +   +   +   +   +
  蛋白表达质粒：
  PB1   +   +   +   +   -   +   +   +
  PB2   +   +   +   +   +   -   +   +
  PA   +   +   +   +   +   +   -   +
  NP   +   +   +   +   +   +   +
  HA   -   +   -   +   +   +   +   +
  NA   -   +   -   +   +   +   +   +
  M1   -   +   -   +   +   +   +   +
  M2   -   +   -   +   +   +   +   +
  NS2   -   +   -   +   +   +   +   +
  病毒滴度(pfu/ml)   7×103   7×103   1×103   3×104   0   0   0   0
*293T细胞用指定质粒转染。24小时(实验1和2)或48小时(实验3-8)后，测定MDCK细胞上清液中的病毒滴度。
+除非另有说明，否则质粒用代表A/WSN/33病毒RNA的cDNA来构建。
用所有病毒结构蛋白共表达，产生流感病毒的效率.尽管病毒NP和聚合酶蛋白的表达对质粒驱动流感病毒的产生是足够的，但是其效率还可以提高。在先前的研究中，所有流感病毒结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2和NS2)的表达，产生VLP，所得VLP含有编码氯霉素-乙酰转移酶报道基因的人工vRNA(Mena等，1996)。因此，结构蛋白完整组分的利用度、而不仅是病毒RNA复制和转录所需要的那几种，可以提高病毒生产效率。为此，用以下最佳数量的病毒蛋白表达质粒(根据VLP产生而判断；未发表的数据)转染293T细胞：1μg pcDNA762(PB2)和pcDNA774(PB1)；0.1μgpcDNA787(PA)；1μg pEWSN-HA、pCAGGS-WSN-NP0/14和pCAGGS-WNA15；2μg pCAGGS-WSN-M1-2/1；0.3μg pCA-NS2；和0.03μg pEP24c(对于M2)，以及各1μg RNA聚合酶I质粒(实验2，表1)。用相同系列的RNA聚合酶I质粒(除了PB1基因之外，因为pPolI-PR/8/34-PB1被取代，以便产生重配病毒)以及仅表达PA、PB1、PB2和NP的质粒(实验3，表1)或表达所有流感结构蛋白的质粒(实验4，表1)，转染第二系列细胞。得到的WSN病毒在转染后24小时(实验1和2，表1)或36小时并无很大差异(数据未显示)。然而，当提供所有流感病毒结构蛋白时，发现带有PR/8/34-PB1的病毒产量增加10倍以上(实验3和4，表1)。缺乏一个表达PA、PB1、PB2、NP蛋白的质粒的阴性对照不能得到任何病毒(实验5-8，表1)。因此，根据所产生的病毒，所有甲型流感病毒结构蛋白的表达极大提高了反求遗传学方法的效率。
随后，使用用于产生带有A/PR/8/34-PB1基因的病毒的质粒系列，来测量细胞转染后病毒产生的动力学。在3次实验有2次，在感染后24小时首次检出病毒。当时测定的滴度＞103pfu/ml，在转染后48小时增加到＞106pfu/ml(表2)。为了估计质粒转染细胞产生病毒的百分率，将293T细胞在转染后24小时用EDTA(0.02％)处理以分散细胞，然后进行有限稀释研究。在该实验中，在该时间点在培养上清液中没有发现游离病毒。该结果表明，每1033个细胞中有1个细胞会产生感染性病毒颗粒。
表2.质粒转染到293T细胞后病毒产生的动力学*
  质粒转染后的小时数      培养上清液中的病毒滴度(pfu/ml)
                   实验
  1   2   2
  6   0   ND   ND
  12   0   ND   0
  18   0   ND   0
  24   0   2×103   6×103
  30   ND   5×104   9×104
  36   6×102   ＞1×105   7×105
  42   ND   ＞1×106   5×106
  48   8×104   ＞1×106   1×107
*用编码除PB1基因外的A/WSN/33病毒基因的8种RNA聚合酶I质粒，以及如上所述9种蛋白表达质粒，来转染293T细胞，该A/WSN/33来自A/PR/8/34病毒。在不同时间点，我们测定了MDCK细胞培养上清液中的病毒滴度。ND＝未做。
在NA蛋白中含有FLAG表位的流感病毒的回收.为了证实新反求遗传学***允许将突变引入到甲型流感病毒基因组中，产生在NA蛋白中含有FLAG表位的病毒(Castrucci等，1992)。用RNA聚合酶I质粒(pPolI-WSN-NA/FL79)以及所需的RNA聚合酶I和蛋白表达质粒来转染293T细胞，所述RNA聚合酶I质粒含有同时编码NA蛋白以及在所述蛋白头部下面的FLAG表位的cDNA。为了证实回收病毒(PR8-WSN-FL79)确实能表达NA-FLAG蛋白，对感染PR8-WSN-FL79或A/WSN/33野生型病毒的细胞进行免疫染色测定。抗FLAG表位的单克隆抗体检出感染PR8-WSN-FL79的细胞，而不是感染野生型病毒的细胞。PR8-WSN-FL79病毒的回收率与未标记的野生型病毒相同(数据未显示)。这些结果表明，新反求遗传学***允许将突变引入到甲型流感病毒基因组中。
在PA基因中含有突变的感染性流感病毒的产生.为了产生在PA基因中具有突变的病毒，引入2个沉默突变，产生限制性内切核酸酶的新识别序列(Bsp120I，在mRNA的846位，以及PvuII，在mRNA的1284位)。先前，不能通过反求遗传学修饰该基因，因为缺乏可靠的选择***。回收了转染病毒PA-T846C和PA-A1284。通过2次连续有限稀释，将回收的转染病毒进行生物学无性繁殖。为了证实回收的病毒确实是在PA基因中带有突变的转染子，通过逆转录酶-PCR得到PA基因的cDNA。PA-T846C和PA-A1284C病毒在PA基因中具有预期突变，新引入限制位点的存在证明了这一点。没有逆转录步骤的相同病毒样品和引物通过PCR扩增没有产生任何产物(数据未显示)，表明PA cDNA确实来源于vRNA，而不是用于产生病毒的质粒。这些结果说明，不用辅助病毒时，怎样产生和回收带有突变基因的病毒。
讨论
本文所述的反求遗传学***允许完全从克隆cDNA有效产生甲型流感病毒。Bridgen和Elliott(1996)也使用反求遗传学产生了布尼奥罗病毒(Bunyamwera virus)(布尼亚病毒科(Bunyaviridae))，但是它仅含有3个负义RNA区段，并且其产生的效率低，仅为102pfu/107细胞。尽管病毒在实验中产量不同，对于含有4个区段的流感病毒来说，始终观察到＞103pfu/106细胞。对于上述反求遗传学***的高效率来说，有几种解释。与体外产生RNP不同(Luytjes等，1989)，RNP在体内是通过使用RNA聚合酶I进行vRNA的胞内合成并且通过质粒驱动的病毒聚合酶蛋白和NP的表达而产生。另外，使用容易用质粒转染的293T细胞(Goto等，1997)，确保大量细胞得到所有病毒产生所需质粒。另外，RNA聚合酶I(这在生长细胞中是最丰富表达的酶)产生大量转录，可能有助于***的总效率。这些特点导致相当丰富的vRNA转录物和足够量的病毒蛋白，用于包裹vRNA，在核中形成RNP，并将这些复合体输出到细胞膜，在此新病毒进行装配，然后释放。
以前建立的反求遗传学***(Enami等，1990；Neumann等，1994；Luytjes等，1989；Pleschka等，1996)需要辅助病毒感染，并因此需要选择方法，以允许从极大量的辅助病毒中回收少量的转染子。已经采用所述策略产生带有一个以下来自cDNA基因的流感病毒：PB2(Subbarao等，1993)、HA(Enami等，1991；Horimoto等，1994)、NP(Li等，1995)、NA(Enami等，1990)、M(Castrucci等，1995；Yasuda等，1994)和NS(Enami等，1991)。大多数选择方法除了适用于HA和NA基因之外，依赖于生长温度、宿主范围限制或药物敏感性，因此限制了反求遗传学在基因产物功能性分析中的应用。甚至是在可以使用具有HA和NA基因用于可靠的抗体驱动的选择***时，仍然难以产生具有显著生长缺陷的病毒。相比之下，本文描述的反求遗传学***不需要辅助病毒，并允许产生在任何基因区段中都带有突变的转染子或者带有严重生长缺陷的转染子。在图5中已证明了这一优点，其中回收到带有突变型PA基因的转染病毒。有了该项技术，就可将任何可行的突变引入甲型流感病毒基因组中，将使研究人员致力于许多长期课题的研究，例如病毒基因组非翻译区中的调节序列的性质、病毒蛋白结构与功能的关系和宿主范围限制和病毒致病性的分子基础。
尽管灭活流感疫苗是可用的，但是其功效还不是最佳的，这部分是因为其诱导局部IgA和细胞毒性T细胞应答的有限能力。目前正在进行的冷适应活流感疫苗的临床试验表明，所述疫苗是最佳减毒的，所以它们不会引起流感症状，但是仍会诱导保护性免疫力(有关综述参见Keitel&Piedra，1998)。然而，初步结果表明，这些活病毒疫苗的效果将不会比最好的灭活疫苗更显著(有关综述参见Keitel.&Piedra，1998)，这尚需要作进一步改进。一个可能的做法是用上述反求遗传学***来修饰冷适应疫苗。或者，可以通过从使用反求遗传学开始，产生一种编码内部蛋白的基因中带有多重减毒突变的“母种”甲型流感株。上述反求遗传学***最令人着迷的用途可能是，如果发生怀疑包括流感病毒新HA或NA亚型在内的大流行，能快速生产出减毒活病毒疫苗。
这一新反求遗传学***可能会加强流感病毒作为疫苗载体的应用。病毒可以经工程改造，使其除表达流感病毒蛋白之外，还表达外源蛋白或免疫原性表位。人们可以例如产生具有外源蛋白作为第9区段的病毒(Enami等，1991)并将其用作活疫苗。流感病毒不仅刺激强烈的细胞介导的免疫应答和体液免疫应答，而且还提供各种各样的病毒体表面HA和NA蛋白(例如15种HA和9种NA亚型及其流行变异株)，允许对同一目标群体进行重复免疫。
已经通过使用痘苗-T7聚合酶***来表达病毒结构蛋白和vRNA，产生了具有编码报道基因的人工vRNA的流感VLP(Mena等，1996)。使用反求遗传学，人们现在可以产生含有vRNA的VLP，所述vRNA编码vRNA转录和复制所需的蛋白(即PA、PB1、PB2和NP)，以及编码目标蛋白。所述VLP可以是有用的基因传递载体。重要的是，它们缺乏编码病毒结构蛋白的基因，这将确保VLP-基因治疗后将不会产生感染性病毒。因为流感病毒基因组不整合到宿主染色体中，所以VLP***将适用于仅需要短期转导细胞的基因治疗(例如用于癌症治疗)。与腺病毒载体(Kovesdi等，1997)不同，流感VLP可同时含有HA和NA变异体，允许对目标群体进行重复治疗。
正粘病毒科(Orthomyxoviridae)包括甲、乙、丙型流感病毒，以及最近分类的Thogotovirus。完全从本文描述的克隆cDNA产生感染性甲型流感病毒的策略将适用于任何正粘病毒，并且也可能适用于其它分节段负义RNA病毒(例如布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae))。不受技术限制地操纵病毒基因组的能力，对病毒生命周期及其调控、病毒蛋白的功能和病毒致病性的分子机制的研究来说，具有深远意义。
                        实施例2
材料与方法
细胞、病毒与抗体.将293T人胚肾细胞和Madin-Darby狗肾(MDCK)细胞分别维持在补充10％胎牛血清的DMEM和含有5％新生小牛血清的MEM中。293T细胞系来源于293细胞系，其中***了猿猴病毒40T抗原基因(DuBridge等，1987)。所有细胞都维持在37℃/5％CO2。B/Lee/40及其突变病毒在10日龄鸡胚中繁殖。通过10-50％蔗糖梯度的差速离心和沉淀，从尿囊液中纯化病毒。针对与匙孔血蓝蛋白偶联的合成肽NKRDDISTPRAGVD(SEQ ID NO：9；NB蛋白氨基酸残基70-83)，产生抗NB兔血清。
质粒的构建.通过病毒RNA的逆转录，用与病毒RNA保守3′端互补的寡核苷酸，合成B/Lee/40病毒的cDNA。使用含有BsmBI位点的基因特异性寡核苷酸引物，通过PCR扩增cDNA，然后将PCR产物克隆到pT7Blueblunt载体(Novagen，Madison，WI)中。用BsmBI消化后，将所得片段克隆到质粒载体的BsmBI位点，该质粒载体含有人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子，其间被BsmBI位点间隔开。这些用于表达vRNA的质粒称为“PolI”构建体。将编码B/Lee/40病毒PB2、PB1、PA和NP基因的cDNA克隆到真核表达载体pCAGGS/MCS(处于鸡β-肌动蛋白启动子的控制下)中(Kobasa等，1997；Niwa等，1991)，得到pCABLeePB2、pCABLeePB1、pCABLeePA和pCABLeeNP，它们分别表达PB2、PB1、PA和NP蛋白。
按照以下方法构建NB敲除突变体。从含有B/Lee/40NA基因的PolI构建体，通过PCR扩增突变型NA基因(参见图4)，然后用BsmBI消化。将BsmBI消化的片段克隆到PolI质粒的BsmBI位点。所得构建体命名为pPoIBLeeNBstop#1、pPolBLeeNBstop#2和pPolBLeeNBstop#3。所有构建体都进行测序以确保没有不想要的突变。
基干质粒的反求遗传学.按照较早报道的方法(实施例1)，产生转染病毒。简而言之，将12种质粒(8种PolI构建体，用于8个RNA区段；4种蛋白表达构建体，用于聚合酶蛋白和NP)与转染试剂(TrahsIT LT-1[Panvera，Madison，WI])一起混合，在室温下孵育10分钟，然后加入到在含有0.3％BSA的Opti-MEM(Invitrogen)中培养的1×106293T细胞中。48小时后，收集上清液中的病毒并在MDCK细胞中扩增以产生病毒母种。
间接免疫荧光测定.用病毒以1至约2噬斑形成单位(PFU)/细胞的感染复数(MOI)感染MDCK细胞。感染8小时后，细胞用3％甲醛溶液固定并用0.1％TritonX-100透化。用兔抗NB肽兔血清作为第一抗体和FITC-缀合的抗兔IgG作为第二抗体，检测抗原。
免疫沉淀.感染后7小时，用[35S]Met和[35S]Cys(各50uCi/ml)(Tran35S-label；ICN Biochemicals)的混合物，标记乙型流感病毒感染的MDCK细胞(MOI为5PFU/细胞)达2小时。放射性标记的细胞在含有10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、1mM EDTA和0.5％Triton X-100的RIPA缓冲液中裂解，然后进行离心。向上清液中加入抗NB兔血清，于4℃孵育过夜。然后加入A蛋白-琼脂糖珠，在室温下孵育1小时。洗涤免疫复合物，在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(ISC BioExpress，Kaysville，UT)上进行分离。干燥所得凝胶，用放射自显影进行检查。
转染病毒的复制特性.MDCK细胞用病毒以0.001PFU/细胞的MOI感染，涂布含有0.5μg胰蛋白酶/ml的MEM培养基，在37℃孵育。在不同时间用MDCK细胞上的噬斑来测定上清液中的感染性病毒。
实验性感染.5周龄雌性BALB/c小鼠，用甲氧氟烷麻醉，然后经鼻内给予50μl病毒。按照Gao等(1999)介绍的方法，测定小鼠50％致死剂量(MLD50)。通过鼻内感染小鼠(1.0×104PFU)测定病毒的复制能力，并按照Bilsel等(1993)介绍的方法，测定感染后3天器官中的病毒滴度。
结果
通过反求遗传学产生B/Lee/40病毒.确定NB蛋白在病毒复制中的作用的第一步，是使用基于质粒的反求遗传学，完全从克隆cDNA产生B/Lee/40(B/Lee)病毒(Neumann等，1999)。质粒含有编码B/Lee病毒所有8个区段的cDNA，其邻接人RNA聚合酶I启动子和小鼠RNA聚合酶I终止子。然后，用4种表达B/Lee病毒PA、PB1、PB2和NP蛋白的质粒以及8种指导B/Lee病毒的8个病毒RNA区段产生的质粒转染293T细胞。转染后48小时，从293T细胞上清液中回收病毒(称为B/LeeRG)(103.550％组织培养感染量，TCID50)。
NB蛋白敲除病毒是活的。使用该反求遗传学***，产生不表达NB蛋白的突变病毒。制备3种突变型PolI构建体，命名为pPolBLeeNBstop#1、pPolBLeeNBstop#2和pPolBLeeNBstop#3(图4)。在所有突变构建体中，NB蛋白起始密码子从ATG变为GCG(Met→Ala)，而NB蛋白的41位氨基酸密码子从AAA变为TAA(终止密码子)。pPolBLeeNBstop#2在突变的起始密码子下游有一个核苷酸缺失，这预期会改变NB蛋白的读框。pPolBLeeNBstop#3在突变的起始密码子下游有一个核苷酸***，这预期也会改变NB蛋白的读框。293T细胞用每种突变型NA PolI质粒以及7种其它Poll质粒和4种蛋白表达质粒转染后48小时，从上清液中回收BLeeNBstop#1、BLeeNBstop#2和BLeeNBstop#3(103.5TCID50)，表明产生了所有缺乏NB蛋白的病毒，其效率等同于野生型B/Lee病毒。让上清液中存在的转染病毒在MDCK细胞中生长，用作病毒母种。对每个病毒母种的NA基因测序证实了所需突变的稳定性并排除了其它突变的引入。
为了证实这3种突变病毒正如所预期的一样不表达NB蛋白，用病毒感染的MDCK细胞进行间接免疫荧光测定和免疫沉淀测定(图5)。这些突变体都不是阳性，相比之下，B/LeeRG病毒表达NB。在免疫沉淀研究中，NB蛋白鉴定为1.8kDa蛋白(高甘露糖形式)和约30-50kDa蛋白(不均一形式)，与先前所报道的结果一致(Williams等，1986；Williams等，1988)。几个感染了BLeeNBstop#1病毒的细胞在免疫荧光测定中显示出模糊弥散性胞质染色，可表明产生了由替代起始序列一直读到引入的终止密码子所产生的短NB肽。因此，所有3个突变病毒都是活的，并且不表达全长NB蛋白。
NB敲除病毒在细胞培养中的生长特性.用B/LeeRG、BLeeNBstop#1、BLeeNBstop#2或BLeeNBstop#3病毒以0.001PFU/细胞的MOI感染MDCK细胞，于37℃孵育。感染后，在不同时间收集上清液，通过噬斑测定，检测MDCK细胞中的病毒滴度。BLeeNBstop#1、BLeeNBstop#2和BLeeNBstop#3病毒显示出与B/LeeRG类似的生长动力学，在感染后36小时，病毒滴度达到107PFU/ml(图6)。这些结果表明，在细胞培养中，乙型流感病毒可以在没有NB蛋白的情况下进行多轮复制并生长良好。
NB敲除病毒在小鼠中的复制.为了确定NB在乙型流感病毒体内复制中的作用，比较了野生型和突变型病毒的MLD50(表5)。NB敲除病毒的MLD50值比B/LeeRG的MLD50值至少高一个log。在用104PFU病毒感染的小鼠肺部和鼻管(NT)的病毒复制试验(表3)中，B/LeeRG在这两处均生长良好，而突变病毒生长受到限制，比起突变病毒来说，其病毒滴度通常要低不止一个log。因此，尽管在细胞培养中生长是不需要的，但是NB蛋白看来对小鼠体内有效的乙型流感病毒复制来说是重要的。
表3.NB在小鼠病毒复制中的作用a
  病毒   病毒滴度(平均log PFU±SD/g)：   MLD50(PFU)
  肺   鼻管
  B/LeeRGBLeNBstop#1BLeNBstop#2BLeNBstop#3   7.9±0.25.2±0.65.7±0.16.6±0.04   6.5±0.24.9±0.33.9±0.23.4±0.4   2.1×1034.3×104＞1.5×1051.5×104
a用甲氧氟烷麻醉的BALB/c小鼠经鼻内给予50μl病毒(1×104PFU)感染。在感染后3天，处死病毒感染的每组3只小鼠，进行病毒滴度定量测定。按照Gao等(1999)介绍的方法，测定MLD50。
讨论
如上所述，NB蛋白在细胞培养物中并非乙型流感病毒复制所必要的，但是能促进体内有效复制。基于此点，NB类似于A/WSN/33流感病毒M2蛋白，尽管体内复制对NB的需要看来并没有对M2蛋白的需要更迫切。缺乏M2跨膜结构域和胞质结构域的A/WSN/33突变体在小鼠中是明显减毒的(Watanabe等，2001)，而缺乏编码M2蛋白氨基酸残基29-31的核苷酸的A/Udorn/72(H3N2)突变体甚至在细胞培养物中也是减毒的(Takeda等，2001)。尽管在实验中已经完全清楚M2离子通道活性(Duff等，1992；Holsinger等，1994；Pinto等，1992；Sugrue等，1990；Sugrue等，1991)，但是NB蛋白的所述活性仍然没有完全明确。因此，乙型流感病毒对NB功能的有限依赖性可能显示，或者所述病毒并不象甲型流感病毒那样更多依赖于离子通道活性，或者NB具有除离子通道活性以外的功能。因为NB在乙型流感株中是高度保守的，所述功能对于天然背景下的病毒复制来说可能是重要的。
目前的人用疫苗是灭活疫苗，该疫苗降低了病毒感染的严重程度，但是也限制了其预防病毒感染的能力。冷适应减毒活疫苗的临床试验在功效和安全性方面已经获得了有希望的结果(Abbasi等，1995；Alexandrova等，1986；Anderson等，1992；Belshe等，1998；Cha等，2000；Hrabar等，1977；Obrosova-Serova等，1990；Steinhoff等，1990；Tomoda等，1995；Wright等，1982))。然而，乙型流感病毒疫苗株母种减毒的分子机制仍未了解。因此，产生具有已知减毒突变的乙型流感病毒是重要的。产生这样的疫苗株母种是理想的：其中仅在并非HA和NA的基因中含有减毒突变，因而仅后者基因需要用野生株替换供疫苗生产用。然而，有了反求遗传学的发明，修饰HA和NA基因用于疫苗生产，不再是困难的了。因此，疫苗株中除了包括其它减毒突变外，还可以包括敲除NB表达的突变，因为在细胞培养中用NB敲除病毒没有检出生长缺陷。
尽管NB敲除病毒的复制能力在MDCK细胞中彼此类似，但是它们在小鼠中是不同的。在小鼠中突变体间复制能力的这一差异可能源于不同水平的NA表达。为了敲除NB表达，对NA蛋白的上游序列进行了修饰。这可能会改变NA蛋白表达水平，导致在体内不同程度的减毒。
迄今为止，已经报道了5种病毒蛋白的作用是作为离子通道：甲型流感病毒M2蛋白、乙型流感病毒NB蛋白、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Vpu和Vpr及小球藻病毒Kcv(Ewart等，1996；Piller等，1996；Plugge等，2000；Schubert等，1996；Sugrue等，1990；Sugrue等，1991；Sunstrom等，1996)。已经证明Vpr和Kcv蛋白在病毒生命周期中起到重要作用。HIV-1的Vpu基因可以缺失，而不会完全消除HIV-1体外复制。在目前的研究中，已经表明NB蛋白在细胞培养中对病毒生长来说并非是必要的，但是对在小鼠中有效的乙型流感病毒复制来说是需要的。因此，可以将NB突变，任选和其它减毒突变一起，引入到疫苗株中。
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所有出版物、专利和专利申请都通过引用结合到本文中。尽管在上述说明书中已经用某些优选实施方案描述了本发明，而且为了说明目的，给出了大量细节，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不偏离本发明基本原则的情况下，本发明允许其它的实施方案并且可以对某些本文描述的细节进行各种修改。
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<211>2396
<212>DNA
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agcagaagca cgcactttct taaaatgtcg ctgtttggag acacaattgc ctacctgctt    60
tcactaatag aagatggaga aggcaaagca gaactagctg aaaaattaca ctgttggttc    120
ggtgggaaag aatttgacct agattctgct ttggaatgga taaaaaacaa aaggtgccta    180
actgatatac aaaaagcact aattggtgcc tctatatgct ttttaaaacc caaagaccaa    240
gaaagaaaaa ggagattcat cacagagccc ctgtcaggaa tgggaacaac agcaacaaag    300
aagaaaggcc taattctagc tgagagaaaa atgagaagat gtgtaagctt tcatgaagca    360
tttgaaatag cagaaggcca cgaaagctca gcattactat attgtcttat ggtcatgtac    420
ctaaaccctg aaaactattc aatgcaagta aaactaggaa cgctctgtgc tttatgcgag    480
aaacaagcat cgcactcgca tagagcccat agcagagcag caaggtcttc ggtacctgga    540
gtaagacgag aaatgcagat ggtttcagct atgaacacag caaagacaat gaatggaatg    600
ggaaagggag aagacgtcca aaaactagca gaagagctgc aaaacaacat tggagtgttg    660
agatctctag gagcaagtca aaagaatgga gaaggaattg ccaaagatgt aatggaagtg    720
ctaaaacaga gctctatggg aaattcagct cttgtgagga aatacttata atgctcgaac    780
cacttcagat tctttcaatt tgttctttca ttttatcagc tctccatttc atggcttgga    840
caatagggca tttgaatcaa ataagaagag gggtaaacct gaaaatacaa ataaggaatc    900
caaataagga ggcaataaac agagaggtgt caattctgag acacaattac caaaaggaaa    960
tccaagccaa agaaacaatg aagaaaatac tctctgacaa catggaagta ttgggtgacc    1020
acatagtagt tgaagggctt tcaactgatg agataataaa aatgggtgaa acagttttgg    1080
aggtggaaga attgcaatga gcccaatttt cactgtattt cttactatgc atttaagcaa    1140
attgtaatca atgtcagtga ataaaactgg aaaaagtgcg ttgtttctac t             1191
<210>8
<211>1096
<212>DNA
<213>流感病毒B/Lee/40
<400>8
agcagaagca gaggatttat ttagtcactg gcaaacggaa agatggcgga caacatgacc    60
acaacacaaa ttgaggtggg tccgggagca accaatgcca ctataaactt tgaagcagga    120
attctggagt gctatgaaag gttttcatgg caaagagccc ttgactatcc tggtcaagac    180
cgcctacaca gactaaaacg aaaattagaa tcaagaataa agactcacaa caagagtgag    240
cctgagaata aaaggatgtc tcttgaagag agaaaagcaa ttggggtaaa aatgatgaaa    300
gtgcttctgt ttatggatcc ctctgctgga attgaagggt ttgagccata ctgtgtgaaa    360
aatccctcaa ctagcaaatg tccaaattac gattggaccg attaccctcc aaccccagga    420
aagtaccttg atgacataga agaagagccg gaaaatgtcg atcacccaat tgaggtagta    480
ttaagggaca tgaacaataa agatgcacga caaaagataa aggatgaagt aaacactcag    540
aaagagggga aattccattt gacaataaaa agggatatac gtaatgtgtt gtccttgaga    600
gtgttggtga acggaacctt cctcaagcac cctaatggag acaagtcctt atcaactctt    660
catagattga atgcatatga ccagaatgga gggcttgttg ctaaacttgt tgctactgat    720
gatcttacag tggaggatga aaaagatggc catcggatcc tcaactcact cttcgagcgt    780
tttgatgaag gacattcaaa gccaattcga gcagctgaaa ctgcggtggg agtcttatcc    840
caatttggtc aagagcaccg attatcacca gaagagggag acaattagac tggccacgga    900
agaactttat ctcttgagta aaagaattga tgatagtata ttgttccaca aaacagtaat    960
agctaacagc tccataatag ctgacatgat tgtatcatta tcattactgg aaacattgta    1020
tgaaatgaag gatgtggttg aagtgtacag caggcagtgc ttatgaatgt aaaataaaaa    1080
tcctcttgtt actact                                                    1096
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>9
Asn Lys Arg Asp Asp Ile Ser Thr Pro Arg Ala Gly Val Asp
 1               5                  10
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>10
gggttattgg agacggtacc gtctcctccc ccc                                 33
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>11
ggggggagga gacggtaccg tctccaataa ccc                                 33
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<222>11
<223>N＝A、T、G或C
<400>12
ttttgctccc ngagacg                                                   17
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<222>7
<223>n＝A、T、G或C
<400>13
cgtctcnggg agcaaaa                                                   17
<210>14
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>14
tattagtaga a                                                         11
<210>15
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>15
gggagcaaaa                                                           10
<210>16
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>16
gggttattag tagaa                                                     15
<210>17
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>17
ttctactaat aaccc                                                     15
<210>18
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>18
ttttgctccc ccc                                                       13
<210>19
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>19
ggggggagca aaa                                                       13
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>流感病毒B/Lee/40
<400>20
gccaaaaatg aacaatgcta cc                                             22
<210>21
<211>11
<212>DNA
<213>流感病毒B/Lee/40
<400>21
ctaaaatttt a                                                         11
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>22
gccaaaagcg aacaatgcta cc                                             22
<210>23
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>23
cttaaatttt a                                                         11
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>24
gccaaaagcg acaatgctac c                                              21
<210>25
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>25
cttaaatttt a                                                         11
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>26
gccaaaagcg aaacaatgct acc                                            23
<210>27
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>27
cttaaatttt a                                                         11
<210>28
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<222>7
<223>N＝A、T、G或C
<400>28
cgtctcntat tagtagaa                                                  18
<210>29
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>其他特征
<222>12
<223>N＝A、T、G或C
<400>29
ttctactaat angagacg                                                  18

Claims (44)

1.一种分离的重组流感病毒，所述病毒包含不编码功能性膜蛋白或其功能性部分的突变膜蛋白基因，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应膜蛋白基因来说，所述突变膜蛋白基因包含至少两个突变，其中的一个突变不在对应于跨膜结构域的膜蛋白基因区内。
2.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因编码至少一个氨基酸取代。
3.权利要求2的分离的重组病毒，其中至少一个突变编码位于起始甲硫氨酸密码子的取代。
4.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因中的一个突变是起始甲硫氨酸密码子变为终止密码子。
5.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因中的一个突变是所述膜蛋白编码区内的终止密码子。
6.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的缺失。
7.权利要求6的分离的重组病毒，其中所述缺失改变了所述膜蛋白的读框。
8.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的***。
9.权利要求8的分离的重组病毒，其中所述***改变了所述膜蛋白的读框。
10.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的缺失并且编码氨基酸取代。
11.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的***并且编码氨基酸取代。
12.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述膜蛋白是甲型流感病毒M2蛋白。
13.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述膜蛋白是乙型流感病毒NB蛋白。
14.权利要求1的分离的重组病毒，其中所述膜蛋白是丙型流感病毒CM1蛋白。
15.权利要求1的分离的重组病毒，所述病毒还包含病原体的异源免疫原性蛋白或治疗性蛋白。
16.权利要求1的分离的重组病毒，所述病毒还包含病原体的异源免疫原性蛋白基因或治疗性蛋白基因。
17.权利要求1的分离的重组病毒，其中至少一个突变不改变所述病毒的体外复制，但与所述病毒的体内减毒有关。
18.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求1的分离的重组病毒。
19.一种制备包含突变膜蛋白基因的重组流感病毒的方法，所述膜蛋白基因不编码功能性膜蛋白或其功能性部分，所述方法包括：
(i)使宿主细胞与多种流感载体接触，以便产生重组流感病毒，其中所述多种载体包括：a)至少两种选自以下的载体：包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NB和NA的cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应NB基因来说，所述NB和NA的cDNA序列包括至少两个在NB序列中的突变，其中的一个突变不在跨膜结构域内，而存在于所述突变基因中，当所述突变基因在所述宿主细胞中转录和翻译时，不产生功能性膜蛋白或其功能性部分，而任选产生功能性NA蛋白；和b)至少两种选自以下的载体：包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体；和
(ii)分离所述病毒。
20.一种制备包含突变膜蛋白基因的重组流感病毒的方法，所述膜蛋白基因不编码功能性膜蛋白或其功能性部分，所述方法包括：
(i)使宿主细胞与多种流感载体接触，以便产生重组流感病毒，其中所述多种载体包括：a)至少两种选自以下的载体：包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与突变型M2 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应M2基因来说，所述突变型M2 cDNA包括至少两个突变，其中的一个突变不在跨膜结构域内，而存在于所述突变基因中，当所述突变基因在所述宿主细胞中转录和翻译时，不产生功能性膜蛋白或其功能性部分；和b)至少两种选自以下的载体：包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体；和
(ii)分离所述病毒。
21.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因编码至少一个氨基酸取代。
22.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因中的一个突变是起始甲硫氨酸密码子变为终止密码子。
23.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因中的一个突变是所述膜蛋白编码区内的终止密码子。
24.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的缺失。
25.权利要求24的方法，其中所述缺失改变了所述膜蛋白的读框。
26.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的***。
27.权利要求26的方法，其中所述***改变了所述膜蛋白的读框。
28.权利要求19或20的方法，其中至少一个突变编码位于起始密码子甲硫氨酸的取代。
29.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的缺失并且编码至少一个氨基酸取代。
30.权利要求19或20的方法，其中所述突变膜蛋白基因包含一个或多个核苷酸的***并且编码氨基酸取代。
31.一种免疫脊椎动物的方法，所述方法包括：使所述脊椎动物与有效量的权利要求1-17中任一项的重组病毒接触。
32.权利要求31的方法，其中所述脊椎动物是禽类。
33.权利要求31的方法，其中所述脊椎动物是哺乳动物。
34.权利要求31的方法，其中所述脊椎动物是人。
35.一种包含多种流感载体的组合物，所述组合物包含：
a)至少两种选自以下的载体：包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NB和NA的cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应NB基因来说，所述NB和NA的cDNA序列包括至少两个在NB序列中的突变，其中的一个突变不在跨膜结构域内，而存在于所述突变基因中，当所述突变基因在所述宿主细胞中转录和翻译时，不产生功能性膜蛋白或其功能性部分，而任选产生功能性NA蛋白；和
b)至少两种选自以下的载体：包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒突变NB的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体。
36.一种包含多种流感载体的组合物，所述组合物包含：
a)至少两种选自以下的载体：包含与流感病毒PA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒PB2cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒HA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NP cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒NA cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与流感病毒M1 cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，以及包含与流感病毒NS cDNA操作性连接的启动子及转录终止序列的载体，包含与突变型M2 cDNA区段操作性连接的启动子及转录序列的载体，其中相对于编码功能性膜蛋白的相应M2基因来说，所述突变型M2 cDNA包含至少两个突变，其中的一个突变不在跨膜结构域内，而存在于所述突变基因中，当所述突变基因在所述宿主细胞中转录和翻译时，不产生功能性膜蛋白或其功能性部分；和
b)至少两种选自以下的载体：包含与编码流感病毒PA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒PB2的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NP的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒HA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒NA的DNA区段操作性连接的启动子的载体，包含与编码流感病毒M1的DNA区段操作性连接的启动子的载体，以及包含与编码流感病毒NS2的DNA区段操作性连接的启动子的载体。
37.权利要求35或36的组合物，所述组合物还包括含以反义方向与目标DNA片段操作性连接的启动子的载体。
38.权利要求37的组合物，其中所述载体包含编码病原体免疫原性多肽或肽或者治疗性蛋白的DNA片段。
39.通过权利要求19或20的方法制备的分离的病毒。
40.一种与权利要求1或39的病毒接触过的宿主细胞。
41.一种包含核酸区段的分离的多核苷酸，其包含编码至少一种流感病毒B/Lee蛋白或其部分的序列或所述多核苷酸的互补序列，其中所述分离的多核苷酸编码HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M1、NB或NS或其部分，它们具有与SEQ ID NO：1-8之一的相应多肽基本相同的活性。
42.一种包含核酸区段的分离的多核苷酸，其包含编码至少一种流感病毒B/Lee蛋白或其部分的序列或所述多核苷酸的互补序列，其中所述分离的多核苷酸编码HA、NA、PB1、PB2、PA、NP、M1、NB或NS或其部分，并且能与SEQ ID NO：1-8之一或其互补序列杂交。
43.权利要求42的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸具有与SEQ ID NO：1-8之一或其互补序列基本相同的核苷酸序列。
44.权利要求42的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸编码的多肽具有与SEQ ID NO：1-8之一所编码的多肽基本相同的活性。
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