KR20050115251A

KR20050115251A - 리포좀-유도된 보체의 활성화를 감소시키기 위한 리포좀조성물

Info

Publication number: KR20050115251A
Application number: KR1020057015777A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 자리프스키; 예케즈켈 바렌홀즈
Original assignee: 알자 코포레이션; 이섬 리서치 디벨러프먼트 컴파니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2005-12-07
Also published as: US20040213835A1; NO20054459L; JP2006519262A; BRPI0407660A; MXPA05009137A; EP1596829A2; WO2004078121A2; CA2517352A1; AU2004218489A1; WO2004078121A3; RU2005130172A

Abstract

포획된 치료제를 포함하는 리포좀 제제를 생체내 투여할 때 보체 활성화를 감소시키는 방법을 기술한다. 본 방법은 폴리에틸렌-글리콜-유도된 중성 리포폴리머를 갖는 리포좀을 제공하는 것을 포함한다.

Description

리포좀-유도된 보체의 활성화를 감소시키기 위한 리포좀 조성물{LIPOSOME COMPOSITION FOR REDUCTION OF LIPOSOME-INDUCED COMPLEMENT ACTIVATION}

본 발명은 생체내에서 리포좀-유도된 보체의 활성화를 감소시킬 때 사용하기 위한 리포좀 조성물에 관한 것이다.

리포좀은 치료적 목적, 특히 치료제의 리포좀 제제를 전신 투여하여 표적 세포로 치료제를 운반하기 위하여 사용된다. 리포좀-약물 제제는 약물의 방출이 조절되는 것과 같이 약물-전달 특성이 개선된 효과를 제공한다. 주사한 부위로부터 표적 부위, 세포 또는 위치로 리포좀이 도달하기 위해서는 순환 시간이 연장되어야 한다. 따라서, 리포좀을 전신투여할 때 리포좀을 상호작용이 없는 시약(noninteracting agent)으로 코팅, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친유성 폴리머로 코팅하여 리포좀의 혈액 순환 기간을 연장시키는 것이 바람직하다. 상기 표면이 변형된 리포좀을 통상 "장기간 순환" 또는 " 또는 입체학적으로 안정화된"리포좀으로 명명된다. 가장 보편적인 표면의 변형은 분자량이 1000- 5000인 PGE 쇄를 약 5몰%의, 리포좀을 구성하는 리피드에 결합시키는 것이다. 참조, 예: [Lasic, D. and Martin, F.,Eds.,"STEALTH LIPOSOME", CRC Press, Boca Raton, FL, 1995, pp. 108-100, ,및 그의 참조문헌]. 리포좀에 의해 제시되는 약동학은 간 및 지라 (단핵성 식세포계, MPS를 통해)에 의한 리포좀의 흡수에서 투여량-독립적 감소 및 비-표면-변형된 리포좀과 비교하여 현저히 연장된 혈액 순화 시간(혈액으로 신속하게 제거되고 간 및 지라에 축적시키는 경향이 있다(Id.))을 특징으로 한다.

가장 보편적으로 사용되고 상업적으로 이용가능한 PEG-치환된 포스포리피드는 양성 헤드 그룹이 (-) 전하를 띤 포스파티딜에탄올아민, 일반적으로 디스테아릴 포스파티딜 에탄올아민 (DSPE)에 기초한다. 예를 들면, 세포와의 상호작용(참조 예: Miller, C. M. et al., Biochemistry, 37: 12875-12883 (1998)) 및 약물이 유출될 수 있는 양이온 약물의 전달(참조, 예: Webb, M. S. et a/., Biochim. Biophys. Acta, 1372: 272-282 (1998))과 같은 일부와 관련하여 리포좀에서 표면의 (-) 전하는 단점이 될 수 있다.

몇몇 리폼 조성물을 생체내 투여함으로써 발생되는 인지된 문제는 보체 활성화 유도이다(Laverman, P. et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 18 (6): 551 (2001); Szebeni, J. et a/., Am. J. Physiol Heart Circ. Physio., 279:H1319 (2000); Szebeni, J. et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 15(1) : 57 (1998)). 보체 시스템은 면역계의 체액 부문의 중요한 작용기이고 거의 30개의 혈청 및 막 단백질로 구성된다. 초기 활성화 후, 다양한 보체 성분은 고도로 조절된 효소 캐스캐이드에서 상호작용하여 항원 제거 및 염증 반응 발생을 촉진시키는 반응 산물을 제조한다. 보체의 활성화에는 2개의 경로: 고전경로 및 대체경로가 존재한다. 2개의 경로는 다양한 세포, 박테리아 및 바이러스를 분해하는 고분자 막공격복합체(MAC)를 제조하는 공통적인 종결 반응 시퀀스를 갖는다(Kuby, Janis, IMMUNOLOGY, W. H. Freeman and Company, Chapter 14, 1997).

보체 반응 산물은 초기의 항원-항체 반응을 증폭시키고 반응을 더욱 효과가 방어로 전환시킨다. 보체의 활성화시 방출되는 다양한 작고, 확산성인 반응 산물은 국한 혈관확장을 유도하고 화학주성적으로 포식세포를 유인하여 염증 반응을 일으킨다. 항원이 보체 반응 산물을 코팅함에 따라

이들 보체 산물에 대한 수용체를 소지(bear)하는 포식 세포에 의해 식균 작용은 더욱 용이하게 진행된다(Kuby, Janis, IMMUNOLOGY, W. H. Freeman and Company, Chapter 14,1997).

보체의 활성화는 생체내 투여되는 리포좀 제제, 예로서, 상업적으로 이용가능한 페길화된 리포좀 제제 독소루비신 (Doxil^R, Calyx^R) 및 크론 결장염의 신티그래피 진단에 사용되는 페길화된 리포좀 제제 HYNIC-PEG에 의해 유발된 심장혈관 곤란에서 원인 작용을 갖는 것으로 보고되었다(Szebeni, J. et al., Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol., 279: H1319 (2000); Szebeni, J. et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 15 (1) : 57 (1998); Szebeni, J. et al., J. Liposome Res. , 12 (1 & 2) : 165 (2002)). 이들 제제의 주입으로 보고된 증상은 심폐곤란, 예로서, 호흡곤란, 빠른호흡, 저혈압 및/또는 고혈압, 흉통, 요통, 홍조, 두통, 및 오한을 포함한다(Szebeni, J. et al., Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol., 279: H1319 (2000)).

리포좀-유도된 보체의 활성화는 다수의 인자에 따라 달라지지만, 어떤 인자 또는 어떤 인자의 조합물이 주 원인제인지는 밝혀지지 않았다. 리포좀-유도된 보체의 활성화는 리피드 포화 정도, 콜레스테롤 함량, 및 하전된 포스포리피드의 존재, 및 리포좀 크기에 따라 다른 것으로 보여진다(Bradley, A. J., Archives of Biochem. and Biophys., 357 (2): 185 (1998)).

생체내 투여시 보체의 활성화를 감소시키는 리포좀 제제를 제공하는 것이 바람직할 것이다.

발명의 요약

일면으로, 본 발명은 포획된 치료제를 포함하는 리포좀을 생체내 투여할 때 리포좀에 의해 유도된 보체의 활성화를 감소시키는 방법을 포함한다. 본 발명은 1-10 mole%, 더욱 바람직하게 1-5 mole%의 하기 식을 갖는 중성 리포폴리머, 및 나머지로 소포-형성 리피드를 포함하는 리포좀을 제공하는 것을 포함한다:

상기 식에서, 각각의 R¹ 및 R²이 8 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐 쇄이고;

n= 10-300이고,

Z는 C₁-C₃ 알콕시, C₁-C₃ 알킬 에테르, n-메틸아미드, 디메틸아미드, 메틸카보네이트, 디메틸카보네이트, 카바메이트, 아미드, n-메틸아세트아미드, 하이드록시, 벤질옥시, 카복실 에스테르, 및 C₁-C₃ 알킬 또는 아릴 카보네이트로부터 선택되는 불활성 말단 그룹이고;

L은 (i) -X-(C=O)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=O)-, 및 (iii) -X-CH₂-(여기에서, X 및 Y은 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 단, L이 -X-(C=O)-인 경우, X는 NH가 아니다.

일면에서, X는 산소이고 Y는 질소이다.

또다른 일면으로, L은 카바메이트 결합, 에스테르 결합, 또는 카보네이트 결합이다. 다른 일면에서 L은 -O-(C=O)-NH-CH₂-(카바메이트 결합)이다.

일면에서 Z는 하이드록시 또는 메톡시이다.

바람직한 일면에서 중성 리포폴리머는 디스테아릴 (카바메이트-결합) 폴리에틸렌 글리콜 또는 메톡시-폴리에텔렌 글리콜 1,2 디스테아로일 글리세롤이다.

또다른 일면으로, 각각의 R¹ 및 R²이 8 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 비분지형 알킬 또는 알케닐이다. 바람직한 일면에서, 각각의 R¹ 및 R²이 C₁₇H₃₅이다.

또다른 일면으로, n은 약 20 내지 약 115이다.

일면에서 치료 약물은 화학요법제이다. 약물의 예로서, 안트라사이클린 항생제, 예로서, 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신을 포함한다. 약물의 다른 예로서 플래티늄-함유 화합물, 예를 들면, 시사플라틴 또는 카보플라틴, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, ((-)-(R)-2-아미노메틸피롤리딘 (1,1-사이클로부탄 디카복실라토)) 플래티늄, 제니플라틴, 엔로플라틴, 로바플라틴, (SP-4-3(R)-1,1-사이클로부탄-디카복실라토(2-)-(2-메틸-1,4-부탄디아민-N, N')) 플래티늄, 네다플라틴 및 비스-아세타토-암민-디클로로-사이클로헥실아민-플래티늄(IV)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시사플라틴 유사체를 포함한다.

본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적 및 특징은 하기 기술하는 본 발명의 상세한 설명을 첨부하는 도면과 함께 봄으로써 더욱 잘 이해하게 될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 명세서에서 PEG-DS로 언급하는 카바메이트-결합 비전하 리포폴리머 제제에 대한 합성 도식이고;

도 2A-2D는 에테르-, 에스테르-, 아미드- 및 케토-결합 비전하 리포폴리머 제제에 대한 합성 도식이고;

도 3A-3C는 혈액, 간 및 지라에서 3 mole % PEG-DS (도 3A); 5 mole % PEG-DSPE (도 3B); 또는 5 mole% PEG-DS (도 3C)을 함유하는 HSPC/Chol 리포좀의 생체분포를 나타내는 그래프이고;

도 4는 PEG 리피드를 함유하지 않는 수소화된 소이(soy) 포스파티딜콜린 리포좀(십자형), 5 mole % PEG-DSPE (삼각형), 또는 5 mole % PEG-DS (원형)를 함유하는 수소화된 소이 포스파티딜콜린 리포좀의 혈액내 지체를 나타내는 그래프이고;

도 5는 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜글리세롤과 같이 자연발생된 포스포리피드로부터 유도된 중성-쯔비터 이온성(zwitterionic) mPEG-리피드 컨쥬게이트 제제에 대한 합성 도식을 나타내고;

도 6은 SC5b-9 유도체 의해 측정된 번호 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 및 10번 제제에 대한 시험관내에서의 인간 혈청내 보체 활성화 유도를 나타내고, 이는 인산 완충처리된 완충액(PBS)을 통해 SC5b-9 유도(%)로 표시한다.

I. 정의

본 명세서에서 사용되는 바, "중성" 리포폴리머는 순하전(net charge)을 갖지 않는 비전하의 것으로서, 즉, 어느 경우든 동일한 갯우의 (+) 및 (-) 전하가 존재한다.

"소포-형성 리피드"는 소수성 및 극성 헤드 그룹 부위를 갖고, 예로서, 포스포리피드와 같이 물에서 자발적으로 이중층 소포를 형성할 수 있거나, 안정적으로 리피드 이중층으로 혼입되는 양친매성 리피드를 의미하고, 내부와 접촉하고 있는 소수성 부위, 이중층 막의 소수성 영역, 및 막 외부, 극성 표면으로 향하고 있는 극성 헤드 그룹을 포함한다. 이러한 타입의 소포-형성 리피드는 통상 하나 또는 두개의 소수성 아실 탄화수소 쇄 또는 스테로이드 그룹을 포함하고, 극성 헤드 그룹에 아민, 산 아스테르, 알데히드 또는 알코올과 같은 화학적 반응 그룹을 포함할 수 있다. 두개의 탄화수소 쇄 길이는 통상 약 14-22개의 탄소 원자로 되어 있고 다양한 불포화도를 갖는 포스포리피드, 예로서 포스파티딜 콜린 (PC), 포스파티딜 에탄올아민 (PE), 포스파티드산 (PA),포스파티딜 이노시톨(PI), 및 스핑고마이엘린 (SM)가 이 부류에 포함된다. 다른 소포-형성 리피드는 글리코리피드, 예로서 세레브로시드 및 갱글리오사이드, 및 스테롤, 예로서 콜레스테롤을 포함한다. 본 명세서에 기술된 조성물을 위해 본 명세서에 기술된 포스포리피드, 예로서 PC 및 PE, 콜레스테롤, 및 중성 리포폴리머가 바람직한 화합물이다.

"알킬"은 탄소 및 수소를 포함하는 전체적으로 포화된 1가 라디칼을 언급하고, 분지쇄 또는 직쇄일 수 있다. 알킬 그룹의 예로서, 메틸, 에틸, n-부틸, t-부틸, n-헵틸, 및 이소프로필을 포함한다. "저급 알킬"은 1 내지 6개의 탄소 원자의 알킬 라디칼을 언급하고, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-부틸, i-부틸, t-부틸, 이소아밀, n-펜틸, 및 이소펜틸이다.

"알케닐"은 탄소 및 수소를 포함하는 1가 라디칼을 언급하고, 하나 이상의 이중 결합을 포함한다.

약어 : PEG: 폴리에틸렌 글리콜 ; mPEG : 메톡시-종결 폴리에틸렌 글리콜 ; Chol : 콜레스테롤 ; PC: 포스파티딜 콜린 ; PHPC : 부분적으로 수소화된 포스파티딜 콜린 ; PHEPC: 부분적으로 수소화된 난(egg) 포스파티딜 콜린 ; HSPC: 수소화된 소이 포스파티딜 콜린 ; DSPE: 디스테아릴 포스파티딜 에탄올아민 ; DSP 또는 PEG-DS: 디스테아릴 (카바메이트-결합) PEG; APD: 1-아미노-2, 3-프로판디올; DTPA: 디에틸렌테트라아민 펜타아세트산; Bn: 벤질.

II. 보체의 활성화를 감소시키는 방법.

일면으로, 본 발명은 리포좀 제제를 인간에 생체 투여할 때 보체의 활성화가 유도되는 것을 감소시키는 방법을 제공한다. 이하 기술하는 바, 본 방법은 중성 리포폴리머, 또는 다른 일면에서 중성-쯔비터 이온성 리포폴리머를 포함하는 리포좀 제제를 제공하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 리포좀 제제를 생체 투여할 때 보체의 활성화가 유도되는 것을 감소시키기 위하여 사용하기 위한 중성 리포폴리머, 또는 다른 일면에서 중성-쯔비터 이온성 리포폴리머를 포함하는 리포좀 조성물을 포함한다. 추가로, 본 발명은 대상에서 보체의 활성화를 감소시키기 위하여 사용하는 약제를 위한 리포좀 조성물의 용도에도 주시하고 있다.

A. 리포좀 제제

본 발명의 PEG-치환 중성 리포폴리머는 하기 구조를 갖는다:

n은 약 10 내지 약 300이고;

L은 (i) -X-(C=O)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=O)-, 및 (iii) -X-CH₂-(여기에서, X 및 Y은 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

말단 그룹인 Z는 보체의 활성화를 유도하는 생체내 성분과 최소로 상호작용하도록 선택된다. Z는 바람직하게 물과 결합하고 수소 결합 공여체로서 작용할 수 없는 수소 결합 수령체로서 작용한다. Z로서 적절한 불활성 부위의 예는 C₁-C₅ 알콕시, 더욱 바람직하게 C₁-C₃ 알콕시, C₁-C₅알킬 에테르, 더욱 바람직하게 C₁-C₃ 알킬 에테르, n-메틸아미드, 디메틸아미드,메틸카보네이트, 디메틸카보네이트, 카바메이트, 아미드, n-메틸아세트아미드, 하이드록시, 벤질옥시, 카복실 에스테르, 및 C₁-C₃ 알킬 또는 아릴 카보네이트를 포함한다. 바람직한 Z 부위는 메톡시, 에톡시, 및n-메틸아세트아미드를 포함한다.

리포폴리머는 PEG-포스포리피드, 예로서 PEG-DSPE의 하전된 인산 결합을 대신하는 중성 결합 (L)을 포함하고, 이는 입체적으로 안정화된 리포좀에서 주로 사용된다. L은 순하전이 0인 경우 하전된 부위를 포함할 있고, 예를 들면, L은 쯔비터 이온성이다. 중성 결합은 예로서, 카바메이트, 에스테르, 아미드, 카보네이트, 우레아, 아민, 에테르, 황, 또는 이산화황일 수 있다. 생체내에서 지정된 순환 시간후에 PEG 쇄를 제거하는 것이 바람직할 수 있는 적용에서는 가수분해가능하거나, 다르게는 절단가능한 결합, 예로서 카보네이트 및 에스테르가 바람직하다. 이러한 특성은 리포좀이 그의 표적에 도달한 후에 약물을 방출시키거나 세포내로의 흡수를 촉진시키는데 유용할 수 있다(Martin, F. J. et al., U. S. Patent 번호 5번,891, 468 (1999); Zalipsky, S.et al., PCT Publication No. WO 98/18813 (1998)).

결합 그룹에 부착된 PEG 그룹의 분자량은 약 1000 내지 15000이고; 즉, n은 약 20 내지 약 340이 된다. 더욱 바람직하게, 분자량은 약 1000 내지 12000 (n= 약 20-275)이고 가장 바람직하게 약 1000 내지 5000(n= 약 20-115)이다. R¹ 및 R² 그룹의 길이는 16-20개의 탄소 원자로 되고, R¹⁼ R²=C₁₇H₃₅(COOR이 스테아릴 그룹이 되도록)이 특히 바람직하다.

상기 언급한 바와 같이, 리포좀내로의 비전하 리피드 혼입은 캡슐화된 양친매성 약 염기성 또는 산성 약물의 유출을 감소시키는 것과 같은 잇점을 제공할 수 있다. 또다른 잇점은 리포좀 표면과 표적 세포 및 RES의 상호작용을 조절함에 있어우수한 탄력성을 갖는다는 점이다(Miller, C. M. et a/., Biochemistry, 37: 12875-12883 (1998)). PEG-치환 합성 세라마이드를 입체적으로 안정화된 리포좀의 비전하 성분으로서 사용하여 왔지만(Webb, M. S. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1372: 272-282 (1998)); 이 분자들은 제조하기 복잡사고 비싸며, 일반적으로 포스포리피드 이중층 및 디아실 글리세로포스포리피드내로 팩킹하지 못한다.

표준 합성법을 사용하여 리포폴리머를 제조할 수 있다. 도 1에 나타낸 바와 같이 예를 들면, mPEG의 말단 하이드록실 말단을 p-니트로페닐 클로로포름에이트와 반응시켜 p-니트로페닐 카보네이트를 수득한 후, 1-아미노-2, 3-프로판디올와 반응시켜 중간체 카바메이트를 수득하여 카바메이트-결합 화합물 (L=-O-(C=O)-NH-CH₂-)을 제조한다. 이어서 인접한 디올 부위의 하이드록실 그룹을 아실화하여 최종 산물을 수득한다. 1-아미노-2,3-프로판디올 대신 글리세롤을 사용하는 유사한 경로를 사용하여 카보네이트-결합 산물 (L=-O-(C=O)-O-CH₂-)을 제조할 수 있다. 실시예 1 및 2에 카바메이트-결합 디스테아로일 및 디에코사노일리포폴리머 제조에 대하여 기술한다.

도 2A에 나타낸 바와 같이, mPEG-OH의 말단 하이드록실을 글리시딜 클로라이드 (예: 에피클로로하이드린)와 반응시키고, 생성된 에폭시드를 가수분해하고 생성된 디올을 아실화하여 에테르-결합 리포폴리머 (L=-O-CH₂-)를 용이하게 제조한다. 예를 들면, 도 2B에 나타낸 바와 같이, mPEG-OH를 글리세린산 아세토니드의 활성화된 유도체(2,2-디메틸- 1,3-디옥솔란-4-카복실산) 또는 4-탄소 유사체, 2, 2-디메틸-1,3-디옥솔란-4-아세트산와 반응시켜 에스테르-결합 리포폴리머(L=-O-(C=O)- 또는 -O-(C=O)-CH₂-)를 제조할 수 있다. 이어서 디올을 탈보호화하고 아실화한다.

mPEG-OH를 대신하여 예를 들면, Zalipsky, S. et al. (Eur. Polym. J. , 19 : 1177-1183 (1983)) 방법에 의해 제조된 mPEG-NH₂를 사용하는 상응하는 반응을 사용하여 아미드, 우레아 또는 아민 결합(즉, L=-NH-(C=O)-NH-,-NH-(C=O)-CH₂-, -NH-(C=O)-NH-CH₂-, 또는 -NH-CH₂-)을 갖는 리포폴리머를 제조할 수 있다.

활성화된 카복실-종결된 PEG (하이드록실-종결된 PEG를 산화시키고 카복실 그룹을 활성화시켜, 예를 들면, 니트로페닐 에스테르로 전환시키거나 DCC와 반응시켜 제조됨)를 각각의 1,2,3-프로판에트리올 또는 1-아미노-2,3-프로판디올와 반응시켜 L이 -X-(C=O)-(여기에서, X는 O 또는 NH이다)인 화합물을 제조할 수 있다(도 2C). 알데히드 종결된 PEG (하이드록실-종결된 PEG를 경미하게 산화시켜 제조됨))를 예를 들면, 1-브로모-2,3-프로판디올 아세토니드의 그리나드 시약으로 축합시킨 후(도 2D) 비산성 조건하에서 케톤으로 산화시키고 아세토니드를 디올로 가수분해하여 케토-결합 화합물(즉, X는 이중 결합이다)을 제조할 수 있다. 각 경우에 있어서, 통상적으로 이후에 디올을 아실화한다.

글리세롤 부위에 결합되어 있지 않은 PEG 올리고머의 말단(α-말단; 상기 그룹 Z)은 통상 하이드록시 또는 메톡시이지만, 본 발명에 따라 리포좀을 특정 세포 또는 조직 타입으로 표적하거나 다르게는 약물 전달을 촉진시킬 때 사용하기 위하여 다양한 분자와 중성 리포폴리머가 결합하는 것을 촉진시키도록 작용화될 수 있다. 결합할 수 있는 분자는 예를 들면, 펩티드, 사카라이드, 항체 또는 비타민을 포함할 수 있다. 이하 실시예 2-3에 상기 기술한 것과 유사한 경로에 따라 α-작용화된 리포폴리머를 제조하는 단계를 기술하고, 단, 말단이 그룹, 예로서 t-부틸 에테르 or 벤질 에테르으로 치환되고 분자의 리피드 부분이 합성된 후 하이드록실로 용이하게 전환되는 상업적으로 이용가능한 PET 올리고머를 사용하여 출발한다. α-니트로페닐카보네이트로 전환되는 경우, 이 말단은 활성화된다.

중성 리포폴리머의 또다른 일례를 도 5에 도시한다. 폴리머 PEG 및 리피드 DSPG을 사용하여 중성-쯔비터 이온성-리피드의 합성을 예시한다. 다른 친수성 폴리머 및 다른 리피드 또한 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다; 예: mPEG 알데히드을 사용하는 포스파티디에탄올아민의 환원적 알킬화. 간단하게, 실시예 4에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, DSPG를 소듐 페리오데이트로 처리하여 산화시킨 후 보란-피리딘 존재하에 mPEG-NH₂와 반응시켜 중성-쯔비터 이온성 mPEG-DSPE 폴리머를 형성하였다. 쯔비터 이온성 리포폴리머는 생리학적 pH에서 순(net) 중성 전하를 갖는다. 중성 리포좀 이중층의 경우 리포좀 입자에서 바람직하지 못한 전하를 제거할 것이다.

B. 리포좀 약동학

지속적-순환(long-circulating) 리포좀은 1-10 mole %, 더욱 바람직하게 1-5 mole %, 및 더욱 바람직하게 3-10 mole %의 중성 리포폴리머, 또는 중성-쯔비터 이온성 폴리머를 소포-형성 리피드로 구성된 리포좀에 혼입시킴으로써 형성도니다. 이를 설명하기 위하여, 3 내지 5 mole %의 mPEG₂₀₀₀-DspE (디스테아로일 포스파티딜 에탄올아민) 또는 카바메이트 결합 리포폴리머 mPEG₂₀₀₀-DS를 혼입하고 있는 리포좀을 실시예 5에 기술된 바와 같이 제조하였다. 리피드의 밸런스는 몰비 1.5 : 1의 HSPC 및 콜레스테롤로 구성되었다. 리포좀에 마커 ¹²⁵I-티라미닐이눌린을 로딩하였다. 실시예 5에 기술된 바와 같이 각 제제 샘플을 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고 다양한 시점에 조직 분포를 측정하였다. 혈액, 간 및 지라에서 나타난 수준을 표 1 A-1C에 제시하고 도 3A-3C에 그래프로 나타내었다. 데이타에 나타낸 바와 같이 PEG-DS-함유 리포좀의 약동학은 PEG-DSPE 함유 리포좀의 것과 매우 유사하였다.

표 1A : 혈액내의 리포좀 분포

표 1B : 간내의 리포좀 분포

표 1C : 지라내의 리포좀 분포

유사한 연구에서 PEG 리피드를 함유하지 않는 대조군 제형에 대하여 두개의 PEG 리피드 성능을 비교하였다. 도 4에 PEG 리피드 함유하지 않거나(십자형), 5 mole % PEG₂₀₀₀-DSPE (삼각형), 또는 5 mole% PEG₂₀₀₀-DS (원형)을 함유하는 2: 1 HSPC 리포좀의 혈액내에서의 지체를 나타낸다.

몰비 5: 55: 40의 mPEG₂₀₀₀-DS: PHPC: Chol을 함유하는 리포좀을 사용하여 추가의 연구를 수행하였다. 인듐-DTPA 컴플렉스를 혼입시켜 리포좀을 표지시켰다. 24시간째 혈액 및 다양한 조직에서 주사량(%)을 측정하였다. 결과를 표 2A-2C에 나타낸다. 다시, 리포좀은 평균 지체량이 4시간 후 > 70%의 주사량, 및 24시간 후 > 30%의 주사량으로써 통상의 지속적-순환 약동학을 나타내었다.

표 2A. 혈액내 인듐 주사량(%)

표 2B. 24시간째 조직내 주사량(%)

표 2C. 24시간째 조직내 1그램당 주사량(%)

* 1ml당 주사량(%)

5 mole% mPEG₂₀₀₀-DS 또는 mPEG₂₀₀₀-DSPE 및 나머지는 PHEPC를 함유하는 리포좀을 투여 후 24시간까지 혈액 남아 있는 것(%)과 관련하여 비교하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 약동학은 사실상 24시간 후 대략 40% 지체율로서 일치하였다.

C. 시험관내에서 보체 활성화 측정

보체 활성화에 대한 중성 리포폴리머로 구성된 리포좀 제제의 효과를 평가하기 위하여 실시예 6에 기술된 바와 같이 12개의 리포좀 제제 및 2개의 미셀 제제를 제조하였다. 실시예 6의 표 3네 제제의 리피드 조성을 상세히 설명한다. 표 4를 참고하여 간단히 말하며, 제제는 하기를 포함한다:

제제 번호 1번, 2번, 3번: 포획(entrapped) 약물만이 상이하고, 리피드 조성이 동일하고 2개의 약물-로딩된 리포좀, 독소루비신(Doxil^R) 및 시사플라틴 (제제 번호 1번 및 2번), 및 리피드 조성은 동일하지만 포획된 치료제는 함유하지 않는 제제, 즉 플라스보(제제 번호 3번);

제제 번호 4번: 0.6 mole% PEG_2ooo-DSPE를 함유하는 제제를, 동일하지만 단지 다량 (4.5 mole%)의 PEG₂₀₀₀-DSPE를 함유하는 제제 번호 3번과 비교하여 보체 활성화 유도에 대한 PEG₂₀₀₀-DSPE의 양에 따른 효과를 평가하였다;

제제 번호 5번, 6번, 7번: 제제 번호 3번 (플라스보 내지 Doxil^R 및 시사플라틴리포좀 제제 번호 1 및 2)를 (-) 전하 PEG₂₀₀₀-DSPE가 제거되거나(제제 번호 6), 두개의 중성 리포폴리머 PEG₂₀₀₀-DS(제제 번호 7번) 및 PEG₂₀₀₀-DSG(제제 번호 6번)(여기에서, DSG=디스테아로일 글리세롤; 참조, 도 2A의 mPEG-DSG 구조)으로 대체된 리포좀 제제와 비교하여 PEG-DSPE의 (-) 전하의 효과를 연구하였다;

제제 번호 8번, 9번: 350 Daltons (제제 번호 8), 2000 Daltons (제제 번호 3), 및 12,000 Daltons (제제 번호 9)으로서 PEG 분자량이 상이한, (-) 전하 PEG-DSPE를 갖는 리포좀을 비교하여 보체의 활성화 유도에 대한 PEG 부위 크기에 따른 효과를 연구하였다.

제제 번호 10번: 미셀-형성 리포폴리머 PEG₂₀₀₀-DSPE을 통해 (-) 전하가 도입되고 거대 헤드 그룹을 갖는 리포좀(제제 번호 3번)과 비교하기 위하여 리포좀-형성 포스포리피드 수소화된 소이 포스파티딜 글리세롤 (HSPG)을 통해 도입된 (-) 전하를 갖는 리포좀을 제조하였다;

제제 번호 11번, 12번: 리포좀-양성 대조군으로서, 입자 크기가 크고, 몰 분획이 50% (제제 번호 11번) 및 71 % (제제 번호 12번)이 콜레스테롤과 함께 DMPC/chol/DMPG로 구성되어 있는 리포좀이며, 이 들 제제는 피그에서 보체-의존성 심폐 곤란을 포함하는 보체 시스템의 활성에서 고도로 효능이 있다;

제제 번호 13번, 14번: 다른 리피드는 함유하지 않는 PEG₂₀₀₀-DSPE가 보체 활성화를 유도하는지를 측정하기 위하여 PEG₂₀₀₀-DSPE (제제 번호 13번) 및 PEG₂₀₀₀-DS(제제 번호 14번)의 미셀을 제조하였다.

리포좀-형성포스포리피드 HSPG를 통해 도입된 (-) 전하를 갖는 리포좀은 노출된 (-) 전하을 갖고, 리포폴리머 PEG₂₀₀₀-DSPE를 통해 도입된 (-) 전하를 갖는 리포좀은 PEG 쇄에 의해 은폐된 (-) 전하를 갖기 때문에 노출된 (-) 전하와 은폐 (-) 전하 사이의 차이를 연구하기 위하여 리포좀 제제 번호 10번과 리포좀 제제 번호 3번을 비교하였다.

표 4에 리포좀 및 미셀 제제를 요약하고 크기, 표면 전하(Ψ₀), 및 Zeta 전위를 나타낸다.

표 4: 리포좀 조성물의 특징

¹ 이하 실시예 6에서 리피드 조성물 설명에 대한 표 3 참조

²실시예 6의 방법 참조

실시예 6에 기술하는 바와 같이 인간 혈청을 다양한 리포좀 제제와 함께 인큐베이션시킬 때 보체 활성화의 마커로서 S-단백질-결합 C 말단 컴플렉스 (SC5b-9) 형성을 측정하여 시험관내 보체의 활성화 유도를 측정하였다. 전형적인 연구에서 리포좀 제제를 혈청과 혼합하고 약 30분동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 반응을 중지시키고 SC5b-9의 양을 효소면역측정법에 의해 측정하였다. 제제 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10번에 대한 결과를 도 6에 나타낸다.

도 6은 인산 완충처리된 염수와 함께 인큐베이션된 세포에서의 SC5b-9 유도율(%)로서 지정된 리포좀 제제에 대한 SC5b-9 유도를 보여준다. 리포좀 제제 5 및 6번은 중성 전하를 띤다(제제 번호 6번은 중성 리포폴리머 PEG-DS를 포함하고 제제 번호 5번은 중성 리피드 HSPC/Chol로 구성된다). 이들 중성 제제는 SC5b-9 형성에 있어 측정가능할 만한 변형을 일으키지 않었다. 0.6% PEG₂₀₀₀-DSPE를 함유하는 제제 번호 5번은 또한 보체 활성화를 거의 일으키지 않았다. 그러나, 다른 리포좀 제제 모두는 PBS와 비교하여 SC5b-9를 현저히 증가시켰다. 제제 번호 3번, "Doxil^R 플라스보" 및 (-) 전하의 HSPG-함유 리포좀인 제제 번호 10번은 SC5b-9 형성에 있어 중간 정도로, 약 2배 증가시키고 제제 번호 1번, Doxil^R은 SC5b-9를 7배로 매우 현저하게 증가시켰다. 이 데이트를 통해 (-) 전하, 및 특히 Doxil^R에서 독소루비신이 보체 활성화에 원인이 되는 인자라는 것이 제안되었다. 이 결과는 리포좀 제제 번호 1번, Doxil^R과 동일한 조성물 및 크기를 갖는 리포좀 제제 번호 2번, 시사플라틴-로딩된 리포좀은 보체를 활성화시키지 않거나 소수 활성화시킨다(데이타로 나타내지 않음)는 사실을 통해 확인되었다. 제제 번호 7번에서와 같이 HSPC를 EPC로 대체하였을 때(제제 번호 6번과 비교), 2/3의 시험 혈청중에서 중간 정도이지만 현저한 보체를 활성화시켰다.

인간 혈청의 농도를 증가시키면서 미셀을 가하여 제제 번호 13번(PEG₂₀₀₀-PE 미셀)의 보체 활성화 효과를 평가하였다. Doxil^R(제제 번호 1번)은 현저하게 활성화시키는(데이타로 나타내지 않음) 조건하에서 미셀은 모든 혈청에서 SC5b-9를 조금도 증가시키지 않았다. 실제로, 제제 번호 1번, Doxil^R보다 10배 이하의 높은 농도로 첨가된 미셀은 보체를 활성화시켰다. 따라서, 이중층 막상의 보체 결합 부위의 공간적 배열이 리포좀-유도된 보체의 활성화에 있어 추가적으로 중요한 인자라 할 수 있다.

D. 생체내 보체 활성화 측정

실시예 7에 기술하는 바와 같이, 피그에 제제를 투여하여 상기 기술된 바와 같이 리포좀 제제에 의해 유도된 보체 활성화를 생체내에서 평가하였다. 피그에서 리포좀-유도된 과민(HSR)을 기초로 하는 다중의 생리학적 변화를 통합적으로 정량하기 위하여 이 반응을 I 등급 내지 IV 등급으로 검정하는 스코어 시스템을 개발하였다. 스코어 시스템을 실시예 7에 상세히 설명하고 무반응, 중간, 중증, 및 치사 반응의 생리학적 반응을 각각 I, II, III 및 IV으로 지정하였다. 상이한 리포좀에 대한 피그의 심폐 반응의 투여량 의존도, 빈도, 및 등급을 표 5에 요약한다.

표 5: 상이한 리포좀에 대한 피그의 심폐 반응

¹등급에 대한 정의는 실시예 7을 참조한다

²제제의 조성물은 실시예 6 표 3에 제시된다.

제제 번호 1번(Doxil^R), 및 (-) 전하 PE-함유 리포좀 (제제 번호 8, 9, 10번)은 시험관내 인간 혈청에서 효능이 있는 보체 활성자라고 관찰된 바와 같이(도 6), 이들 동일 리포좀은 3-150 nmole 포스포리피드/kg을 포함하고 > 90 %의 시험에서 중증 내지 치산 반응을 유발하는 피그 심폐곤란에서 가증 효능이 있는 유도자였다. 과민 반응을 유발하는 제제 번호 1번(Doxil^R)의 최소량은 2 mg/mL 독소루비신 및 12.8 mg/mL 포스포리피드를 포함하는 오리지날 비알로부터 50㎕이고, 이는 15-30초간 최초 주입 후 혈액에 거의 다 도달하는 인간 치료제 투여량의 1/400 내지 1/1000 부(part)와 상응한다. 인간 및 피그에서의 Doxil^R부반응(reactogenicity)의투여량 의존도는 실질적으로 일치하였다.

시험관내 보체 활성화와 일치하여 동등량의 제제 번호 3번(플라스보 Doxil^R)는 또한 피그에서 낮은 비율(67%)로 과민반응을 일으켰고, 제제 번호 4번(PEG2000- DSPE), 제제 번호 8번(PEG₃₅₀-DSPE), 및 제제 번호 6번(PEG₂₀₀₀-DS) 및 제제 번호 13,14번(PEG₂₀₀₀미셀)은 고투여량에서도 반응을 일으키지 않거나 경미한 반응을 일으켰다. 시험관내 활성화 및 돼지의 과민반응간의 유일한 겉보기 차이는 3개의 시험중 2개에서 나타난 제제 번호 9번(PEG₁₂₀₀₀-DSPE 리포좀)에 대한 중증반응이고, 이는 인간 혈처에서는 보체 활성화를 일으키지 않거나 소수 일으켰다.

제제 번호 6번 및 제제 번호 7번을 중성 리피드로부터 제조하였다. 제제 번호 6번은 HSPC, 콜레스테롤, 및 PEG-DS로부터 형성되었다. 제제 번호 7번은 상업적으로 이용가능한 중성 폴리머로 PEG-DSG및 EPC로 형성되었다(참조 실시예 6). 그러나, 상기 두개의 제제의 시험관내 반응은 제제 번호 7번은 보체의 활성화를 충분하게 중증으로 유도하여 시험 동물을 사망시켰다는 점에서 상이하였다. 대조적으로, 제제 번호 6번에 대한 반응은 4마리의 시험 동물중 3마리에서 I 등급 또는 최소 반응이고, 한마리의 동물에서 0 등급(무반응)이었다. 이 결과를 통해 모든 중성 리포폴리머가 리포좀 제제의 생체내 투여시 유발된 보체 활성화 유도를 감소시킬 수 있는 것은 아니라는 것이 제안되었다.

피그에서 수행된 또다른 연구에서 4개의 리포좀 제제를 실시예 8과 같이 제조하였다. 제제 4개의 리피드 조성물 및 특성은 표 6에 나타낸다.

표 6: 보체의 활성화 유도에 대한 생체내 평가를 위한 리포좀 제제

¹실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 중성 리포폴리머

² (-) 전하, 수소화된 소이 포스파티딜글리세롤

제제 번호 16, 17, 및 19번 모두 HSPC 및 콜레스테롤를 포함하지만, 리포폴리머만은 상이하였다. 제제 번호 16번은 상기 기술된 제제 번호 3번과 유사한 PEG-DSPE를 포함하였다. 제제 번호 17번은 PEG-DS를 포함하고 제제 번호 19은 HSPG를 포함하였다.

실시예 8에 기술하는 바와 같이 리포좀 제제 번호 16-19번 및 제제 번호 1번(Doxil^R)을 픽에 투여하였다. 주사 후 약 3-6분째 통상의 혈류역학적 변화, 예를 들면, 폐동맥압 (PAP)의 30-300% 상승, 전신 동맥혈압(SAP)의 다양한 상승 및 하강, 차후 서맥부정맥을 동반하거나 동반하지 않는 빈맥 및 Hb 산소 포화도 감소가발생하였다. 몇몇 동물에서는 PAP의 주된 상승없이 중증의 서맥부정맥으로 입증되는 심장 대 폐 반응에 대한 성향이 관찰되었지만, 이들 변화는 통상 서로서로 비례한다.

표 7에 시험 동물의 혈류역학적 변화를 요약한다. P1-P12로 넘버링된 12마리의 피그를 사용하고, 각개 반응은 표 7에 나타낸다. 각개 파라미터에서의 변화를 주사전 기준에 대하여 (%) 검정하고, 각 리포좀 제제에 대한 전체 반응은 실시예 7에 기술한 등급 스코어링 시스템(없음(0), 최소(I), 경미(II), 중증(III), 치사(IV))에 따라 임의적으로 검정하였다. 50-100㎕의 제제 번호 1번(Doxil^R)을 주사했을 때 9/9(9마리중 9마리) 피그에서 중증 내지 치사 심폐 반응을 일으켰고, 제제 번호 18(HSPC/Chol 소포)은 100배의 고투여량에서도 시험된 6마리의 피그 모두에서 어떤 반응도 일으키지 못했다. 제제 번호 16번 (HSPC/Chol/PEG-DSPE)은 제제 번호 19 (HSPC/Chol/HSPG)와 같이 4/5 피그에서 경미 내지 치하 반응을 일으켰다. 본 발명의 중성 리포폴리머를 함유하는 제제 번호 17(HSPC/Chol/PEG-DS)은 최대 투여량에서만 유도되는 경미한 반응을 일으켰다.

표 7: 리포좀 제제 투여에 대한 혈류역학적 반응

¹ 각 제제의 리피드 조성물에 대한 설며은 표 6 및 3을 참조한다.

² 등급 스코어링에 대한 설명은 실시예 7을 참조한다.

본 명세어세 기술된 연구에서 독소루비신 또는 시사플라틴을 함유하는 리포좀 제제, 또는 빈(empty) 플라스보 리포좀를 연구용 모델로서 선택하였다. 중성 리포폴리머 PEG-DS가 보체이 활성화 유도를 감소시킨다는 결과를 포획 약물 또는 치료제를 함유하는 리포좀 제제에 적용시킬 수 있음을 이해할 것이다. 약제의 예로서, 화학요법제, 항바이러스제, 항균제 등을 포함한다. 화학요법제인 독소루비신은 안트라사이클린 항생제이고 다른 화합물, 예로서 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신도 주시되고 있다. 시사플라틴은 또한 플래티늄-함유 화학요법제이고, 다른 플래니튬-함유 약물, 예로서, 본 분야에 공지된 다양한 시사플라틴 유사체, 예를 들면, 제한하는 것은 아니지만, 카보플라틴, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, ((-)-(R)-2- 아미노메틸피롤리딘 (1,1-사이클로부탄 디카복실라토)) 플래티늄, 제니플라틴, 엔로플라틴, 로바플라틴, (SP-4-3 (R)-1,1-사이클로부탄-디카복실라토 (2-)- (2-메틸- 1,4-부탄디아민-N, N')) 플래티늄, 네다플라틴, 및 비스-아세타토-암민-디클로로-사이클로헥실아민-플래티늄 (IV)을 주시하고 있다. 그러나 본 발견을 통해 모든 약물 또는 치료제가 적용될 수 있음을 이해할 것이다.

III. 실시예

하기 실시예를 통해 본 발명을 설명하고 어느 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1A

mPEG-DS (mPEG 아미노프로판디올디스테아로일 ; α-메톡시-ω-2, 3-디 (스테아로일옥시)프로필카바메이트 폴리(에틸렌옥사이드)) 합성

mPEG₂₀₀₀(20 g, 10 mol)을 톨루엔(50 mL,120℃)중 공비 건조시켰다. 상기 용액의 온도가 25℃에 도달한 후 니트로페닐클로로포름에이트 (3.015 g, 15 mol)로 처리한 후 TEA (2.01 mL, 15mol)로 처리하였다. 혼합물을 1시간동안 반응시켰다. TEA-염을 여과하고 용매를 제거하여 조 mPEG₂₀₀₀-니트로페닐클로로포름에이트을 수득하고, 여기에 아세토니트릴(50 mL)중 아미노프로판디올 (3 g, 30 mol) 용액을 가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 불용성 물질을 여과하여 제거하고 용매를 증발시켰다. 산물을 이소프로판올로부터 2회에 걸쳐 재결정하였다.

산물, mPEG₂₀₀₀아미노프로판디올 (2.3 g, 1.08 mol, 2.17 meq의 OH)을 톨루엔(30 mL)에 용해시키고 공비 증류시키고 약 10 mL의 용액을 제거하였다. 용액을 실온까지 냉각시켰다. 피리딘 (4 mL, 20%)을 피펫으로 가한 후 스테아릴 클로라이드 (1 g, 4.3mol)을 가하였다. 즉시 백색 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 120℃에서 밤새도록 환류시키고 냉각시켰다 .반응 플라스크의 온도가 약 40℃에 도달했을 때 피리딘 염을 여과하였다. 여액을 증발시켰다. 산물(PEG₂₀₀₀-DS)을 이소프로판올(2 x 30 mL)로부터 2회에 걸쳐 재결정하여 정제하고 P₂0₅상에서 진공하에 건조시켰다. 수율: 2. 26 g, 80%. TLC (클로로포름 : 메탄올, 90: 10): mPEG 아미노프로판디올 R_f= 0.266 ; PEG-DS R_f= 0.533.

유사한 방법에 의해 분자량이 750, 5000, 및 12000인 mPEG 폴리머를 사용하여 mPEG-DS를 제조하였다. 구조는 ¹H-NMR 및 질량 분광법에 의해 확인하였다. MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption/lonization)에 의해 측정된 분자량을 하기에 제공한다.

실시예 1 B

mPEG-DE (mPEG 아미노프로판디올 디에코사노일 ; α-메톡시-ω-2, 3-디 (디에코사노일옥시)프로필카바메이트 폴리(에틸렌옥사이드)) 합성

100 mL의 둥근 바닥 플라스크에서 에코산산(ecosanoic acid)(500 mg, 1.6mmol)을 톨루엔(20 mL)중에 용해시키고 옥살릴 클로라이드 (147㎕, 1.68mmol)을 피펫으로 가하였다. 교반 반응물에 1% DMF를 가하였다. DMF를 가할 때 가스를 방출시켜 이 가스가 어느 것과도 접촉할 수 없도록 하였다. 10분 후 톨루엔을 증발시키고 추가로 20ml의 톨루엔을 가하고 증발시켜 과량의 옥살릴 클로라이드를 제거하였다. 잔류물을 10 mL의 톨루엔에 용해시켰다. 상기 기술된 바와 같이 mPEG-아미노프로판디올(1.19 g, 0.56mmol)을 용액에 가하고 환류 축합기를 부착하고 혼합물을 밤새도록 환류시켰다. TLC에 의한 분석(메탄올 및 클로로포름, 9: 1)을 통해 반응이 종결되었음을 나타내었다. 반응 혼합물을 냉각시킨 후 용해되지 않은 물질을 여과하고 여액을 건조시켰다. 산물을 이소프로판올로부터 3회에 걸쳐 재결정하여 정제하고 P₂0₅상에서 진공하에 건조시켰다.

실시예 2

t-Bu-O-PEG-O-숙신아미드를 매개로 하는 t-Bu-O-PEG-아미노프로판디올의 제조

A. t-Bu-O-PEG-O-숙신아미드

Polymer Labs (10 g, 5mmol)으로부터의 tBu-O-PEG-2000를 120 mL의 톨루엔에 용해시키고 약 20ml의 용매를 제거하고, Dean Stark 트랩내의 물을 수거하여 공비 증발시켰다.

용액을 실온으로 냉각시키고, 포스펜(15 mL)을 가하였다. 혼합물을 밤새도록 실온에서 반응시켰다. 반응 종결 후, 회전식 증발기에 의해 용매를 제거하였다. 약 50 mL의 톨루엔을 새로 가하고 회전식 증발기에 의해 제거하였다. 잔류물을 건 톨루엔(30 mL) 및 메틸렌 클로라이드 (10 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 N-하이드록시숙신이미드 (1.7 g, 14.8mmol) 및 트리에틸아민(2.1 mL, 14.9mmol)를 가하고 혼합물을 밤새도록 실온에서 반응시킨 후 TLC에 의해 반응을 종결시켰다.

염을 반응 혼합물로부터 여과하고, 증발시켜 용매를 제거하고 고체를 이소프로필 알코올로부터 2회에 걸쳐 재결정하고 P₂0₅상에서 건조시켰다.

B.t-Bu-O-PEG-아미노프로판디올

DMF (10 mL)중 아미노프로판디올 (300 mg, 3.2mmol) 용액에 t-Bu-PEG-OSc (5 g, 2.29mmol)를 가하고 밤새도록 반응시켰다. 모든 NHS 에스테르를 사용하여 TLC상에 하나이 스팟을 나타내는 혼합물을 수득하였다.

미리 세척한 산성의 이온 교환 수지(~1g)를 반응 혼합물에 가하고 30분 후 여과하여 제거하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 200ml의 이소프로필 알코올로부터 재결정하였다. 고체를 수거하고 P₂0₅상에서 건조시켰다.

실시예 3

p -니트로페닐카보네이트-PEG-DS 제조

A.Bn-O-PEG-니트로페닐카보네이트 (NPC)

Shear물Polymers로부터의 Bn-O-PEG-2000(Huntsville, LA; 5 g, 2. 41mmol)을 120 mL의 톨루엔에 용해시키고 약 20ml의 용매를 제거하고, Dean Stark 트랩내의 물을 수거하여 공비 증발시켰다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 남은 용매는 감압하에 증발시켰다.

잔류물을 30 mL의 메틸렌 클로라이드/에틸 아세테이트(60: 40), 및 p-니트로페닐클로로포름에이트 (729 mg, 3.6mmol)에 용해시키고 트리에틸아민(1 mL, 7.2mmol)을 가하였다. 16시간동안 4℃에서 반응을 수행하였따. 이 방법은 반응 속도를 늦추지만 비스 PEG-카보네이트의 형성을 제거한다. GF 실리카 플레이트상의 UV 가시 스팟은 반응이 종결되었음을 나타내었다.

반응 혼합물을 미리 세정된 산성 및 염기성 이온 교환 수지로 30분동안 처리하고, 여과하고 완전하게 건조시켰다. 산물을 이소프로필 알코올로 재결정하고 P₂0₅상에서 건조시켰다. 수율: 4.4 g, 80%.

B. Bn-O-PEG-아미노프로판디올

DMF (10 mL)중 아미노프로판디올 (260 mg, 1.9mmol) 용액에 상기 제조된 Bn-O-PEG-NPC(4.3 g, 2.9mmol)를 가하고 5시간동안 반응시켰다. Bn-O-PEG-NPC 모두 사용하여 TLC(클로로포름:메탄올 :물 90: 18: 2)상에 하나의 스팟을 갖는 반응 혼합물을 수득하였다.

반응 혼합물을 미리 세정된 산성 및 염기성 이온 교환 수지로 30분동안 처리하고, 여과하고 완전하게 건조시켰다. 산물을 이소프로필 알코올로 재결정하고 P₂0₅상에서 건조시켰다. 수율: 3. 8 g, 91 %.

C.Bn-O-PEG-디스테아로일

Bn-O-PEG-아미노프로판디올 (3 g, 1.36mmol), 스테아르산(1.94 g, 6.79mmol), 및 촉매로서 DPTS (4- (디메틸아미노) 피리디늄 4- 톨루엔설포네이트)(408 mg, 1.36mmol) 용액을 20분동안 실온에서 교반하였다. 디이소프로필카보디이미드(1.28 mL, 8.16mmol)를 피펫으로 가하고 혼합물을 밤새도록 반응시켰다. TLC (클로로포름:메탄올, 90: 10)는 디올 반응이 종결되었을 나타내었다.

염기성 이온 교환 수지(~5g)을 반응 혼합물에 가하였다. 30분동안 진탕시킨 후 수지를 여과하고 여액을 건조시켰다. 잔류물을 이소프로판올(100 mL)로부터 재결정하고 P₂0₅상에서 건조시켰다. 수율: 4 g, 80%.

D. HO-PEG-디스테아로일

Bn-O-PEG-DS의 벤질 그룹을 탈보호하기 위하여 2개의 상이한 접근법을 채택하였다.

방법 1. 수소 첨가 분해 : 탄소상의 팔라듐에 의한 탈보호

5 mL의 메탄올중 Bn-O-PEG-DS (218 mg, 0.08mmol) 용액에 10% Pd/C (110 mg) 및 암모늄 포름에이트 (107 mg, 0.8mmol)를 가하고 혼합물을 밤새도록 실온에서 반응시켰다.

Pd/C를 Celte^R상에서 여과하여 제거하고 여액을 건조시켰다. 잔류물을 클로로포름에 용해시키고 포화 NaCL로 3회에 걸쳐 세척하였다. 클로로포름 상을 수거하고, MgS0₄로 건조시키고, 여과하고 농축시켰다. 고체 잔류물을 tBuOH로부터 냉동시키고 생성된 분말을 P₂0₅상에서 건조시켰다. 수율: 80%, 175 mg.

방법 2. 티타늄 테트라클로라이드 탈보호

메틸렌 클로라이드 (10 mL)중 Bn-O-PEG-DS(1.18 g, 0.43 mmol) 용액을 5분동안 얼음 배쓰에서 냉각시켰다. 티타늄 테트라클로라이드(3 mL, 21.5 mol, 과량)을 오븐 건조된 시린지를 통해 실리된 반응 플라스크로 이동시켰다. 5분 후 얼음 배쓰를 제거하고 밤새도록 실온에서 탈보호 반응을 수행하였다. 탈보호 종결은 GF 실리카 TLC 플레이트상의 (출발 물질 보다) 아래의 쉬프트 스팟으로 나타내었다.

약 40 mL의 클로로포름을 반응 혼합물에 가하고 혼합물을 40 mL의 포화된 NaHCO₃을 포함하는 분리 깔때기로 이동시켰다. 혼합물을 (에멀젼 형성을 막기 위하여) 서서히 진탕시키고 클로로포름 층을 수거하였다. 이 추출법을 3회 반복하고 클로로포름 상을 수거하고 프레쉬한 포화된 NaHCO₃일부를 사용하여 한번더 추출하여 TiCl₄를 완전하게 제거하였다. 수거한 클로로포름상을 MgS0₄로 건조시키고 여과하고 농축시켰다.

상기 잔류물을 1 mL의 클로로포름에 용해시키고 분취용 실리카겔 칼럼(200-400 메쉬, 60Å)에 가하였다. 산물이 10% 메탄올/90% 클로로포름에서 용출될 때까지 유동상(클로로포름)의 극성을 2% 증강식으로 가하여 증가시켰다. 산물을 수거하고 회전식 증발기에 의해 용매를 제거하였다. 용매를 tBuOH로부터 냉동시키고 P₂0₅상에서 건조시켰다. 수율: 70%, 800 mg.

E. p-니트로페닐카보네이트-PEG-DS

반응 플라스크, 교반막대, 시린지 및 출발물질(HOPEG-DS, 상기와 같이 제조) 를 반응하기 앞서 꼼꼼히 건조시켰다.

10 ml의 메틸렌 클로라이드/에틸 아세테이트(60: 40)중 HO-PEG-DS (1.2 g, 0.45 mmol) 용액에 p-니트로페닐카보네이트 (136 mg, 0.65 mmol) 및 트리에틸아민(188㎕, 1.35 mmol)을 가하였다. (bisPEG-카보네이트의 혀성을 막기 위하여) 4℃에서 8-16시간동안 반응을 수행한 후 GF 실리카겔 TLC에 의해 반응을 종결시켰다.

반응 혼합물을 미리 세정된 산성 및 염기성 이온 교환 수지로 30분동안 처리하고, 여과하고 완전하게 건조시켰다. 여액을 완전하게 건조시키고 잔류물을 이소프로필 알코올로부터 재결정화하였다. 고체를 P₂0₅상에서 건조시켰다.

실시예 4

mPEG-NH ₂ 및 페리오데이트-산화된 DSPG의 환원적 아민화 커플리에 의한 중성-쯔비터 이온성 mPEG-DSPE 제조

1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-rac[(1-글리세롤)] 또는 디스테아릴 포스파티딜글리세롤 (DSPG, 200 mg, 0.25mmol)를 소듐 아세테이트 염수 완충액(1.5 mL, 50 mM, pH= 5) 에 현탁시키고 현탁액을 초음파처리하면서 4시간동안 소듐 페리오데이트 (348 mg, 1.6mmol) 로 처리하였다. TLC (클로로포름 : 메탄올 : 물= 90: 18: 2)은 DSPG가 모두 사용되었음을 나타내었다. 원심분리한 후 불용성 산물을 용액으로부터 분리한 후 물(1 mL), 물/아세토니트릴, 1: 1 (2mL, 2회), 및 아세토니트릴로만(1 mL, 3회) 세척하였다. 산물을 1.5시간동안 진공하에 P₂0₅상에서 건조시키고 mPEG-NH2 (1 g, 0.5mmol, 2 당량)를 벤젠(3ml)으로 산화된 DSPG에 가하고 용매를 회전식으로 증발시켜 남은 물을 제거하였다. 벤젠 증발 단계를 2회 이상 반복하였다. 건성 메탄올 (6 mL) 및 분말 분자 시브(4Å, 320 mg)를 혼합물에 가한 후 보란트-피리딘 (8M, 1.6 mL, 12mmol)에 가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 15시간동안 교반하였다. TLC를 통해 리포폴리머 산물의 형성을 확인하였다. 과량의 비반응 mPEG-NH₂를 제거하기 위하여 산물 혼합물을 물(3 mL)로 희석하고 스펙트로포어 CE 투석막(MWCO 300,000)으로 이동시키고 4℃에서 염수 용액(~50 mM, 1000 mL, 3회)에 대해 투석시킨 후 탈이온수(3회)에 대해 투석시켰다. 조 산물 (TLC에 의해, 일부 산화된 DSPG로 오염됨)을 냉동시키고 진공하에 P₂0₅상에서 건조시키고 추가로 용리제로서 클로로포름중 메탄올 구배(0-15%) 를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 리포폴리머 산물을 포함하는 분획을 풀링하고, 증발시켜 141 mg (20%)의 고체를 수득하였다.

MALDI-TOFMS는 동일하게 44 Dalton 간격의 공간을 갖고 2770 Daltons에 집중된 종-모양의 이온 분포를 제작하였다(분자량: 계산치:2813 Daltons)

실시예 5

PEG-DSPE- 및 PEG-DS-함유 리포좀의 제조 및 생체분포 연구

하기 비율의 HSPC: Chol : PEG-리피드 혼합물로부터 용해시키고 용매를 제거하겨 리피드 필름을 형성하였다:

A: 58: 39: 3; PEG-리피드= PEG-DS

B: 57: 38: 5; PEG-리피드= PEG-DSPE

C: 57: 38: 5; PEG-리피드= PEG-DS

필름을 140 mM NaCl를 함유하는 25 mM HEPES중 새로 제조된 ¹²⁵I-티라미닐리뉼린에서 수화시키고, 압출시켜 100-105nm의 지름을 갖는 리포좀을 형성하였다. 0.22μm Millipore (Millipore Corporation, Bedford, MA) 저분자 단백질-결합 시린지-엔드 필터를 통해 여과시켜 리포좀을 멸균시켰다. 분취량을 카운팅하여 ¹²⁵I의 주사 계수를 측정하였다. 리포좀 제제의 인산 함량을 분석하여 리피드 농도를 결ㄹ정하고, 리포좀 제제를 최종 2.5μmol/mL로 멸균 완충액에 희석시켰다. 각 마우스에 0.5 pmol의 포스포리피드가 투여되도록 희석된 리포좀 0.2ml을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 i.v. 주사하여 하였다. 다양한 시점에 할로세인 마취시킨 후 경추 이탈시켜 마우스를 희생시키고 심장 출혈에 의해 혈액을 샘플링하고, 혈액 및 다양한 장기를 ¹²⁵I에 대해 분석하였다.

실시예 6

시험관내에서의 보체 활성화 측정

재료

디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC), 미미리스토일 포스파티딜-글리세롤 (DMPG), 콜레스테롤(Chol) 및 난황 렉시틴(EPC)을Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)로부터 구입하고 전체적으로 수소화된 소이 포스파티딜콜린 (HSPC) 및 전체적으로 수소화된 소이포스파티딜글리세롤 (HSPG)은 Lipoid Inc.(Ludwigshafen, Germany)로부터 입수하였다. 리피드 모두의 순도는 ≥97%였다. Zymosan을 Sigma Chem. Co. (St. Louis,MO)로부터 입수하였다.

시판되는 Doxil^R은 ALZA Corp (Mountain View, CA)으로부터 입수하고, 이는 독소루비신 HCl, 2 mg/mL (4.22 mM), 리포좀 리피드, 16 mg/mL, 암모늄 설페이트, ~ 0.2 mg/mL; 히스티딘, 10 mM (pH 6.5) 및 수크로오스, 10%를 포함하였다. 리피드 성분은 HSPC, 9.58 mg/mL; Chol, 3.19 mg/mL;PEG2000-DSPE, 3. 19 mg/mL (전체 포스포리피드, 12.8 mg/mL, 13.3mM)를 포함한다.

350 Daltons, 2000 Daltons, 및 12,000 Daltons의 PEG 부위를 갖는 N-카바밀-폴리(에틸렌 글리콜 메틸 에테르)-1, 2-디스테아로일-sn-글리세롤-3-포스포에탄올-아민 트리에틸 암모늄 염(PEG-DSPE)(PEG₃₅₀-DSPE; PEG₂₀₀₀-DSPE 및PEG₁₂₀₀₀-DSPE, 또는 각각 0.35 K-PEG-DSPE; 2.0 K PEG-DSPE; 12.0 K PEG-DSPE으로도 언급됨)를 Alza Corporation로부터 입수하였다.

2000 Da의 폴리에틸렌글리콜 PEG 부위를 갖는 3-메톡시 폴리에틸렌 글리콜-옥시카보닐 3-아미노-1,2 프로판디올 디스테아릴 에스테르(PEG₂₀₀₀-DS, 2K-PEG-DS로도 언급됨)를 상기 기술한 바와 같이 제조하였다.

3-메톡시-폴리에텔렌 글리콜 1,2 디스테아릴 글리세롤(PEG₂₀₀₀-DSG, 2K-PEG-DSG로도 언급됨) (Sunbright DSG-2H)을 Nippon Oil & Fat Co. , Ltd (Tokyo, Japan)로부터 입수하였다.

인간 혈청은 자원한 건강한 기증자로부터 입수하였다. 혈청을 사용할 때까지 -70℃에 유지시켰다.

방법

포스포리피드 농도 측정: Bartlett 방법을 수정하여 포스포리피드 농도를 측정하였다.

입자 크기 분포 측정 : ALV-5000/EPP 복합 디지탈 상관계를 포함하는 High Performance Particle Sizer ALV-NIBS/HPPS(ALV-Laser Vertriebsgesellschaft GmbH, Langen, Germany), 또는 Nicomp Model 370 (Pacific Scientific, Silver Spring, MD) 초미세 입자 치수 측정기를 사용하여 동적 광산란에 의해 입자 크기 분포를 결정하였다.

리포좀 표전 전위 측정(Ψ 전위): 리포좀의 전기적 표면 전위를 측정하기 위하여 광범위한 범위의 pH 값에서의 HC 이온화도를 측정하였다. 30㎕의 리포좀 분취량을 1.5 ml의 완충애게 희석하였다. 적정량의 진한 수산화나트륨 및 염산을 가하여 pH를 조절하였다. 수조에서 모든 샘플을 약 5초간 초음파처리하여 거대 단층(unilamellar) 소포(LUV)의 내부 및 외부 사이의 pH를 평형화하였다. HC 이온화 상태를 측정하기 위하여 LS550B 발광 분광계(Perkin Elmer, Norwalk, CT)를 사용하여 실온(22℃에서) HC 형광 여기 스펙트럼을 기록하였다. 두개의 여기 파장; 330 nm(pH와 무관하고(등흡광점) 리피드 환경하에서 전체 HC의 양(비이온화 + 이온화된 HC)을 나타낸다), 및 380 nm(이온화된 HC^-만을 반영한다)에서 측정하였다. 여기 파장 둘 모두에 대하여 방출 파장은 450 nm이었다. 2.5 nm의 여기 및 방출 주파수폭을 사용하였다. 각 리피드 조성물에 대한 HC의 겉보기 pKa는 벌크 pH의 함수로서 여기 파장 380/330의 비 변화로부터 계산하였다. 겉보기 양성자 결합 상수를 나타내는 HC의 겉보기 pKa에서 참고의 중성 표면과 비교에 대한 쉬프트가 HC 형광단 중간 환경하에 표면 pH 및 전기적 표면 전위를 표시한다. 전기적 표면 전위에 대한 값은 하기 식을 사용하여 계산하였다:

Zeta 전위 측정: Zetasizer 3000 HAS(Malvern Instruments Ltd,Malvern, UK)를 사용하여 25℃에서 Zeta 전위를 측정하였다. 분취량의 40㎕의 리포좀을 20 ml의 10mM NaCl(pH 6.7)에 희석시키고 용애을 0.2-㎛ 시린지 필터(Minisart, Sartorius, Germany)에 통과시켰다. 측정 원리는 하기와 같다: 전해질내 하전된 입자의 현탁액에 전장(electrical field)을 적용시킬 때 반대 극성을 갖는 전극쪽으로 이동하는 그의 속도는 장의 세기, 유전(dielectric) 상수, 매질의 점성, 및 Zeta 전위에 따라 달라진다. 단위 전장내 입자의 속도와 Zeta 전위의 관계(전기영동 이동도)를 Henry 등식으로 기술한다:

여기에서, UE=전기영동 이동도, z= zeta 전위, c= 유전상수, 및 η= 속도이다. f(Ka)는 입자 지름과 전기적 이중층 두께이 함수이다. 수성 매질 또는 중간 정도의 전해질 농도에서(10 mM NaCI), f(Ka) 값은 1.5이고 이는 Smoluchowski 근사치에 사용된다:

25℃에서, zeta 전위는 대략 이다.

A. 리포좀 제제

표 3의 다양한 리피드 조성물로 구성된 리포좀을 하기와 같이 제조하였다. 각 제형의 리피드 성분을 3급 부탄올에 용해시켰다. 정제된 용액을 냉동건조시켰다. 2- 3분동안 70℃에서 와동시켜 10 mL의 뜨거운(65℃) 멸균 피로겐이 없는 염수에서 분말을 수화시켜 다층 소포 (MLV)을 형성하였다. Northern Lipids Inc. (이전의 Lipex, Vancouver, BC, Canada)로부터 입수한 TEX 020 10 mL 배럴 압출기를 사용하여 2개의 압출 단계에서 포어 크기가 0.4 및 0.1㎛인 폴리카보네이트 피터를 통해 62℃에서 각 10회씩 통과시켜 MLVs를 소형화하였다. 리포좀 제조의 모든 단계는 무균처리하여 수행하였다. 리포좀을 0.15 MNaCl/5 mM 히스티딘 완충액(pH 6.5)에 현탁시켰다 모든 리포좀 제제는 멸균되었고 피로겐을 포함하지 없었다.

염수중 2K-PEG-DSPE 또는 2K-PEG-DS을 2 mg/mL로 대량으로 와동시킨 후 0. 22㎛ 필터를 통해 여과시켜 미셀을 제조하였다.

표 3: 리포좀 조성물

B. 시험관내 보체 활성화 측정

리포좀을 진탕 수조(80 사이클/분)내 희석시키지 않은 인간 혈청과 함께 인큐베이션시키고 보체 말단 컴플렉스 SC5b-9 형성을 측정하여 보체 활성화를 예측하였다. 통상의 실험에서, 10㎕의 리포좀을 Eppendorf 튜브에서 40㎕의 혈청과 혼합하고 진탕 수조(진탕 속도 80rpm)에서 30분동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 20 용량의 10mM EDTA, 25mg/ml 소혈청알부민, 0.05% Tween 20 및 0.01% 티메로살(pH 7.4)(즉, EDTA로 보충된 SC5b-9ELISA 키트의 "샘플 희석액")을 가하여 반응을 종결시켰다. (Szebeni,J. etal. J. Natl. Cancer Inst., 90: 300(1998))에 기술된 효소면역측정법(Quidel Co. , San Diego, CA)에 의해 SC5b-9를 측정하였다.

실시예 7

생체내에서의 보체 활성화 측정

실시예 6에 기술된 바와 같이 제조된 리포좀을 하기와 같이 피그에 투여하였다. 25-40 kg 범위의 요크셔 돼지 암수 모두를 입수하였다. i.m. 케타민(500mg)으로 동물을 안정시키고 마취기를 사용하여 2% 이소플루란으로 마취시켰다. 폐동맥 카테터를 우측내경정맥을 경유하여 우심방을 통해 폐동맥으로 전진시켜 폐동맥쐐기압(PAP)을 측정하였다. 전신 동맥압(SAP)은 대퇴동맥에서 측정하였다. 수술, 기기조작, 및 혈류역학 분석에 대한 다른 상세한 것은 (Szebeni, J. etal., Circulation, 99:2302 (1999))에 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다.

지정량의 각 리포좀 제제를 1 mL PBS에 희석하고 카테터 삽입기를 통해 목정맥내로, 또는 폐동맥 카테터를 통해 폐동맥에 직접 주사하였다. 이 주사법은 혈류역학적 변화를 유도한다는 점에서 동일하였다. 리포좀을 5-10-mL PBS와 함께 순환으로 분출시켰다. 리포좀 반응물의 조성을 측정하기 위하여 하기의 생리학상 이상중 하나에 대하여 관찰하여 임의적 등급화 분류에 의해 혈류역학적 변화를 검정하였다:

이상

PAP 상승

전신 동맥혈압(SAP)의 상승 및 감소

심장박출량 감소

EKG 이상

호기 CO₂의 감소

심장박동수 상승 또는 감소

혈장 TXB2 상승

폐 및 전신 혈관저항 상승

분출(Flushing)

피그에서의 리포좀-유도된 심장혈관 반응은 하기와 같이 등급화하였다 :

등급	증상
0(무반응)	ECG 또는 혈류역학적 파라미터에서 현저한 변화는 없음
I(최소)	일시적(<2분) 하기 파라미터중 하나 이상에서 명확하게 식별할 수 있는 <20%의 변화: 심장박동수, ECG, SAP, PAP, Hb 산소 포화도
II(경미)	일시적(<2분), 하기 파라미터중 하나 이상에서 >20% ~ <50%의 변화: 심장박동수, ECG, SAP, PAP, Hb 산소 포화도
III(중증)	더욱 장기간(10분 이하), 상기 파라미터 + 서맥부정맥중 하나 이상에서 >50% 변화
IV(치사)	치사 반응: 4분 이내 에피네프린 및/또는 세동제거과 함께 CPR을 필요로 하는 순환허탈. 통상 SAP는 < 40 mm Hg까지 하강하고, PAP는 최대값(cc 60 mmHg)으로 상승하고, 빈맥 후 부정맥과 함께 중증의 서맥이 뒤따르고, 결국에는 심장정지 및 사망을 일으킴

실시예 8

리포좀 제제의 생체내 특성

4개의 리포좀(LUV) 제제를 제조하였다. 리포좀 조성물 및 특징은 표 6에 기술하였다. 각 제형을 제조할 때 제형의 모든 리피드 성분을 3급 부탄올에 용해시켰다. 정제된 용액을 냉동 건조시켰다. 1분동안 70℃에서 와동시켜 10 mL의 뜨거운(65℃) 멸균 피로겐이 없는 염수에서 분말을 수화시켜 MLV을 형성하였다. Northern Lipids Inc. (이전의 Lipex, Vancouver, BC, Canada)로부터 입수한 TEX 020 10 mL 배럴 압출기를 사용하여 2개의 압출 단계에서 포어 크기가 0.4 및 0.1㎛인 폴리카보네이트 피터를 통해 62℃에서 각 10회씩 통과시켜 MLVs를 소형화하였다. 리포좀 제조의 모든 단계는 무균처리하여 수행하였다.

시판용 Doxil^R을 사용하였다(포스포리피드 농도 13.3 mM, 150μg 독소루비신/μmol 포스포리피드). 모든 다른 리포좀을 염수(0.9% NaCl)에서 제조하고) (NH₄SO₄)는 없었다. 사용하는 리포좀 크기는 모두 105 nm ± 35 nm 범위였다(참조 표 6).

지정량의 Doxil^R 및 다른 시험 리포좀을 1 mL PBS에 희석시키고 카테터 삽입기를 통해 목정맥내로, 또는 폐동맥 카테터를 통해 폐동맥에 직접, 또는 우심실에 주사하였다. 리포좀을 10mL PBS와 함께 순환으로 분출시켰다. 이전 결과를 통해, 작은 리포좀 볼루스의 혈류역학적 효능은 비속성내성을 나타내고 동일 동물에서 수회에 걸쳐 양적으로 재현성을 갖기 때문에 반응이 발생할 때까지, 또는 반응이 없을 시에는 특정의 미리예정된 최대 투여량을 시험할 때까지 각 피그에 동일한 타입의 리포좀의 양을 증가시키면서 주사하는 것이 제안되었다.

본 발명은 특정 방법 및 일례를 참고로 하여 기술되었고, 본 발명으로부터 벗어나지 않고 다양하게 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims

소포-형성 리피드와 1-10 mole%의 하기 식을 갖는 중성 리포폴리머로 구성된 리포좀을 포함하고 나머지가 소포-형성 리피드인, 포획된 치료제를 포함하는 리포좀을 생체내 투여할 때 리포좀에 의해 유도된 보체의 활성화를 감소시키는 약제의 제조에서 사용하기 위한 리포좀 조성물:

상기 식에서,

각각의 R¹ 및 R²이 8 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐 쇄이고;

n= 10-300이고,

Z는 C₁-C₃ 알콕시, C₁-C₃ 알킬 에테르, n-메틸아미드, 디메틸아미드, 메틸카보네이트, 디메틸카보네이트, 카바메이트, 아미드, n-메틸아세트아미드, 하이드록시, 벤질옥시, 카복실 에스테르, 및 C₁-C₃ 알킬 카보네이트 및 아릴 카보네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

L은 (i) -X-(C=O)-Y-CH₂-, (ii) -X-(C=O)-, 및 (iii) -X-CH₂-(여기에서, X 및 Y은 산소, NH, 및 직접 결합으로부터 독립적으로 선택된다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 단, L이 -X-(C=O)-인 경우, X는 NH가 아니다.
제 1항에 있어서, X가 산소이고 Y가 질소인 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, L이 카바메이트 결합, 에스테르 결합, 또는 카보네이트 결합인 조성물.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, L이 -O-(C=O)-NH-CH₂-(카바메이트 결합)인 조성물.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, Z가 하이드록시 또는 메톡시인 조성물.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 리포좀이 1 mole% 내지 10 mole%의 중성 리포폴리머 디스테아릴 (카바메이트-결합) 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 조성물.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 리포좀이 1 mole% 내지 10 mole%의 중성 리포폴리머 메톡시-폴리에틸렌 글리콜 1,2 디스테아로일 글리세롤을 함유하는 조성물.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R¹ 및 R²이 8 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 비분지형 알킬 또는 알케닐인 조성물.
제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R¹ 및 R²이 C₁₇H₃₅인 조성물.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, n이 약 20 내지 약 115인 조성물.
제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 치료 약물이 화학요법제인 조성물.
제 11항에 있어서, 화학요법제가 안트라사이클린 항생제인 조성물.
제 12항에 있어서, 화학요법제가 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 및 이다루비신로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조성물.
제 11항에 있어서, 화학요법제가 플래티늄-함유 화합물인 조성물.
제 14항에 있어서, 플래티늄-함유 항생제가 시사플라틴 또는 카보플라틴, 오르마플라틴, 옥살리플라틴, ((-)-(R)-2-아미노메틸피롤리딘 (1,1-사이클로부탄 디카복실라토)) 플래티늄, 제니플라틴, 엔로플라틴, 로바플라틴, (SP-4-3(R)-1,1-사이클로부탄-디카복실라토(2-)-(2-메틸-1,4-부탄디아민-N, N')) 플래티늄, 네다플라틴 및 비스-아세타토-암민-디클로로-사이클로헥실아민-플래티늄(IV)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 시사플라틴 유사체인 조성물.