KR20050114211A - 폐 질환의 치료 방법 - Google Patents

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KR20050114211A
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다니엘 알. 헨더슨
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아리제케 파마슈티칼즈 인크.
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Abstract

본 발명은 폐 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시하고 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 폐, 구인두 또는 비인두 경로를 통해 리간드에 결합되는 치료제 및 표적화 요소를 함유하는 화합물 또는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 리간드는 바람직하게는 pIgR 수용체 상의 에피토프이다.

Description

폐 질환의 치료 방법 {METHODS OF TREATING LUNG DISEASES}
본 발명은 폐 질환 치료용 조성물 및 폐 질환의 치료 방법 분야에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술에 관한 하기의 기재는 단지 본 발명의 이해를 돕고자 하는 것이며, 본 발명의 선행기술을 기재한 것이라든가 본 발명의 선행기술을 구성하는 것이 아니다.
폐 질환은 특정 스펙트럼의 증세와 병인(病因)을 포함하며, 잠재적 치료제를 전신 투여하여 치료하기에 특히 어려운 경우가 있다. 넓은 카테고리의 질환 분류에는 이러한 스펙트럼의 폐 질환이 예시된다. 많은 유형의 섬유증 등을 비롯하여 150여 종 이상의 간질(interstitium) 질환이 인지되어 있다. 또다른 카테고리에는 기체 교환 및 혈액 순환의 장애가 포함된다. 기도 질병 및 흉막 질병은 추가의 2가지 카테고리를 구성한다. 폐암에는 원발성 폐암과 여러가지 다른 장기 또는 조직의 원발성 암으로부터의 전이가 둘다 포함된다. 감염성 질환에는 바이러스, 박테리아 및 진균에 의한 감염원이 포함된다.
예를 들어 베타-안드로겐 길항제 등과 같은 저분자량 약물로 이루어진 치료 조성물의 폐 투여는 천식을 치료하는 것으로 관찰되었다. 폐에서 활성인 다른 치료제는 전신 투여되고 폐 흡수를 통해 표적화되어 왔다. 그러나, 모든 저분자량 약물이 폐를 통해 효능적으로 투여될 수 있는 것은 아니다. 또한, 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질 등과 같은 더 높은 분자량의 치료제를 폐 전달하는 것은 훨씬 더 어렵다.
폐의 해부학적 구조 및 생리는 폐 투여에 대한 여러가지 장벽을 제공한다. 초기에는, 흡입된 공기 (및 그 안에 함유된 임의의 입자)가 코 또는 구강을 통과한 후에 기관과 폐포 사이의 수많은 2분지형 분지체로 구성된 호흡수(respiratory tree)로 이동한다. 기관지, 세기관지 및 말단 세기관지는 전도 대역을 포함한다. 이들 전도성 기도의 상피는 유사-층형성되어 있어서 대개 섬모를 갖는다. 분지의 더욱 말단 부위는 호흡 세기관지, 폐포관 및 폐포로 이루어진 이행성(transitional) 호흡 대역을 형성하는데, 여기에서 기체 교환과 폐 흡수가 일어난다. 호흡 대역은 전도 대역과는 달리 섬모를 갖지 않으며 단일 세포층으로 이루어져 있다.
공기-혈액 장벽은 폐포 상피, 모세혈관 내피 및 이들 2개의 세포층을 분리하는 림프로 채워진 간질 공간으로 이루어진다. 폐포 상피에서는 인접한 세포들이 중첩되어 있고 빈틈없는 폐쇄소대(tight junction)에 의해 결합되어 있으며, 이것은 모세혈관 내피를 포함하는 빈틈없는 단일 세포층과 함께 유체, 세포, 염, 단백질 및 수많은 기타 거대분자들이 혈액 및 세포간 공간으로부터 폐포의 관강으로 이동하는 것을 제한한다. 폐 손상이 없을 때, 단백질 및 폴리펩티드 등을 비롯한 대부분의 분자들은 상기 장벽을 능동적으로 또는 수동적으로 통과하여 수송되어야 한다. 또한, 상피 세포 및 섬모로부터의 점막 분비는 잠재적 치료제 전달에 추가의 물리적 장벽을 제공한다.
또한, 폐포 관강 및 간질 공간에 존재하여 폐포 상피를 모세혈관 내피로부터 분리하는 다른 유형의 세포 역시 전달에 대한 장벽으로 기능할 수 있다. 폐포 대식세포는 혈액으로부터 공기-혈액 장벽을 통과하여 이동한다. 추가로, 호중구 및 림프구 등을 비롯한 다른 유형의 세포가 감염에 대한 반응으로 혈액으로부터 폐포로 이동할 수 있다.
오랫동안, 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원에 대한 면역요법은 안전하고 무해한 매력적인 종양 치료법이라고 여겨져 왔다. 그러나, 이러한 방법의 임상적 시행은 바램보다 다소 덜 성공적이었다. 많은 종양이 시험관내 또는 생체내 면역 반응 유발에 이용될 수 있는 항원을 발현하지만, 이러한 항원의 직접적인 표적화는 가장 효과적인 면역요법 제공 방식일 수 없다. 또한, 인터루킨-2 ("IL-2") 등과 같은 시토킨이 종양에 대한 면역 반응을 자극하는데 이용되기도 했다. 이러한 요법은 단독이든 또는 통상의 치료제와 병행하든 간에 악성 질환 및 비-악성 질환에서의 임상적 이점 달성에 더욱 매력적인 수단을 제공할 수 있다. 예를 들어 문헌 ([Xu et al., Cancer Res. 60:4475-84 (2000)], [Christ et al., Clinical Cancer Res. 7:1385-97 (2001)], [Steven A. Rosenberg, The Transformed Cell: Unlocking the Mysteries of Cancer, Putnam Group, 1992])을 참조한다.
여러 당업자들이 시토킨을 사용하여 특정 종양에 대한 실험적인 치료를 수행하였다. IL-2와 같은 시토킨의 전신 투여 (예를 들어 정맥내 주입 및(또는) 피하 투여)는 약간의 항-종양 반응을 입증하였다. 그러나, 이러한 치료법에서는 고열, 폐 혈관 누출, 체중 증가, 권태, 경직, 빈혈 및 혈소판감소증 등을 비롯한 심각한 부작용도 관찰되었다. 예를 들어 문헌 [Heinzer et al., J. Clin. Oncol. 17:3612-20 (1999)]을 참조한다. 더욱 최근에는, IL-2와 같은 시토킨의 에어로졸 전달이 중간 정도의 치료 이점을 제공하면서도 독성은 감소된 것으로 밝혀졌다. 예를 들어 문헌 ([Lorenz et al., Clin. Cancer. Res. 2:1115-22 (1996)], [Zissel et al., Cancer Immunol. Immunother. 42:122-26 (1996)], [Khanna et al., J. Pharm. Pharmacol. 49:960-71 (1997)])을 참조한다.
급성 호흡기 감염은 상부 또는 하부 호흡계 둘다에 영향을 미칠 수 있다. 상부 호흡기 감염은 전형적으로 귀, 코, 인후 또는 정맥동(sinus)을 포함한다. 상부 기도 감염의 예로는 감기 (전형적으로는 바이러스에 의한 감기), flu (인플루엔자 바이러스), 중이염, 인두염, 급성 또는 만성 정맥동염 및 편도염 (각각 중이, 인후, 정맥동 및 편도의 염증을 동반함) 등이 있다. 하부 호흡기 감염은 전형적으로 기관, 기관지 관 및 폐 자체를 포함한다. 하부 기도 감염의 예로는 기관지염 및 폐렴 등이 있다. 단일 감염의 경우에, 상부 및 하부 호흡계 중 하나 또는 둘다가 영향을 받을 수 있다.
기도 감염은 주로 박테리아, 바이러스, 또는 진균 기원으로 인한 것이지만, 기생충 감염 등과 같이 더 드문 유형도 있다. 폐 결핵 (TB)은 미코박테륨 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)에 의해 야기되는 전염성 박테리아 감염의 일례이다. 주로 폐가 감염되지만, 상기 감염이 다른 장기로 전파될 수 있다. TB는 전세계적으로 임상적으로 가장 중요한 감염 중 하나이며, 매년 1000만건이 새롭게 발병하고 3백만명이 사망한다. 위생 상태의 개선 및 항생 약물의 개발로 인해 사망률은 꾸준히 줄어들고 있다. 그러나, 대부분의 개발도상국에서는, 부분적으로는 개인들의 면역타협 (예를 들어 HIV-양성) 및 다중 약물-내성 (MDR, MultiDrug-Resistant) 미코박테륨 투베르쿨로시스 균주의 발생으로 인해 TB 감염이 다시 발생하고 있다.
중증 급성 호흡기 증후군 (SARS, Severe Acute Respiratory Syndrome)은 새롭게 인식된 바이러스 기도 감염이며, 2002년 후반에 중국에서 최초로 검출되었다. 바이러스원은 이전에는 인식되지 않았던 인간 코로나바이러스로 확인되었고, SARS-관련 코로나바이러스 (SARS-CoV)라고 불린다. SARS는 단일 유기체에 의해 상부 기도와 하부 기도가 둘다 감염되는 예이기도 하다. 초기 증상의 예로는 콧물이 나고 인후가 따갑다가 이후에는 호흡곤란이 오고 마른 기침을 하며, 기계적 환기의 개입이 요구되는 성인성 호흡 곤란 증후군으로 발전할 수 있다.
폐렴은 박테리아, 바이러스 또는 기생충에 의해 야기될 수 있는 기도 질환의 일례이다. 통상적으로, 폐렴은 폐의 백혈구가 폐포의 적절한 기능수행을 방해하는, 폐 조직의 염증으로 정의된다. 이러한 상태는 생명을 위협할 수 있다.
칸디다(Candida) 및 아스페르길루스(Aspergillus)는 가장 흔한 진균 기도 감염체로서, 이식 수용자 등과 같은 면역타협된 대상체에서 나타나는 경향이 있다. 칸디다는 주로 상부 기관기관지수(tracheobronchial tree)를 공격하면서 이따금씩만 전파되고, 아스페르길루스는 더욱 심부의 실질(實質)을 감염시킬 가능성이 있다. 다른 가능한 진균 병원체로는 크립토콕쿠스(Cryptococcus), 슈달레르쉐리아(Pseudallerscheria) 및 콕시디오이데스(Coccidioides) 등이 있다.
여러 당업자들이 시토킨을 사용하여 특정 감염에 대한 실험적인 치료를 수행하였다. 시토킨은 심각한 박테리아 감염 및 바이러스 감염 (특히, 약물 내성 유기체에 의해 야기되는 감염) 치료에 단독으로 사용되거나 공지된 치료제 또는 백신을 이용한 요법과 병행하여 사용되어 왔다. 호흡기 감염 치료시의 면역 조정에 대해 검토하기 위해서는 문헌 [Kolls and Nelson, Resp. Res. 1:9-11, 2000]을 참조한다. 예를 들어 전세계 이환율 및 사망률의 7번째 원인인 결핵은 에어로졸 형태의 재조합 인터페론-γ로 성공적으로 치료되었다 [Condos et al., Lancet 349:1513-5, 1997]. 또다른 예로서, 비측(鼻側) 인터페론-α 2b는 리노바이러스 감염을 예방하고 파라인플루엔자 감염과 관련된 증상을 약화시키는 것으로 나타났다 [Monto et al., J. Infect. Dis. 154:128-133, 1986]. 감염 치료를 위한 치료 분자의 다른 예로는 케모킨(chemokine), 예를 들어 감마-인터페론-유도가능한 단백질 10 (IP-10), 인터페론-유도가능한 T 세포 알파 화학주성인자 (I-TAC) 및 MIG (인터페론-감마에 의해 유도되는 모노킨) 등이 있다. 감염의 치료 및 예방 (예를 들어 백신) 둘다를 위한, 감염을 일으키는 감염원의 각종 에피토프에 대한 항체가 당업계에 공지되어 있다.
임의의 폐 질환 치료에 있어서 최대의 치료 효과를 달성하기 위해서는, 잠재적 치료제가 기도에 최적으로 직접 전달되어야 한다. 소분자, 핵산 및(또는) 단백질 또는 펩티드 조성물 등을 비롯하여 의학적으로 중요한 분자를 전달하기 위해서, 생체이용성을 개선시키고(시키거나) 신체내 특정 위치로의 전달을 표적화하고자 노력한 수많은 일반적 방법이 기술된 바 있다. 이러한 방법으로는 전구약물의 사용, 리포솜 또는 기타 입자로의 캡슐화, 흡수 증진 제제 중에서의 공동-투여 및 특이적 조직으로의 표적화 등이 있다. 이에 대하여 검토하기 위해서는 예를 들어 문헌 [Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, Stephen D. Bruck, ed., CRC Press, 1991]을 참조한다. IL-2와 같은 시토킨의 경우에, 폐 전달은 유리 시토킨 (단독으로 사용하거나 추가의 시토킨의 정맥내 전달과 병행함)의 흡입과 리포솜 제제의 흡입 둘다에 의존해 왔다. 예를 들어 문헌 ([Enk et al., Cancer 88:2042-46 (2000)], [Khanna et al., J. Pharm. Pharmacol. 49:960-71 (1997)])을 참조한다. 이러한 전달 방식은 폐 내의 시토킨 수준은 높이지만, 전신 시토킨 수준은 비교적 중간 정도일 수 있다.
의학적으로 중요한 분자를 전달하기 위한 특정 방식 (예를 들어 경구, 비인두, 구인두, 폐, 협측(頰側), 설하(舌下), 점막, 질 또는 직장 전달 방식)에는 전달될 관심 분자(들)이 2개의 상이한 표면을 갖는 "분극화(polarized)" 세포 (예를 들어 상피 세포)를 통과할 것이 요구된다. 폐 상피의 경우에, 이들 표면은 첨단부 표면 (수성 또는 기체성 매질에 노출되어 있으며, 여기에서 관심 분자(들)이 대상체에게 전달됨) 및 반대쪽의 기저외측부 (또한, 기저측부라고도 알려져 있음) (아래쪽의 기저 막 위에 존재하며 그에 의해 지지되고, 간질 공간 및 대순환계로의 접근을 제공함)라고 지칭된다. 인접한 상피 세포 사이의 폐쇄소대는 개개의 상피 세포의 첨단부와 기저외측부를 분리한다. 이와 같은 세포 극성을 제공하고 유지하는 생물학적 방법은, 이러한 방식으로 전달된 분자의 생체이용성을 제한하는 작용을 할 수도 있다.
분자는 여러 수단에 의해 세포 내로, 세포 밖으로, 세포 내에서 트래픽킹(trafficking)될 수 있으며, 전형적으로는 이들 수단이 경구, 비인두, 구인두, 폐, 협측, 설하, 점막, 질 또는 직장 전달 방식으로 전달된 분자에게 생체이용성을 부여한다고 여겨진다. "능동 수송"은 물질을 세포 막을 통과시켜 에너지 의존형으로 운반하는 것에 대한 일반적인 용어이다. "세포내이입(endocytosis)"은 분자의 세포내 내재화 과정, 즉 세포가 분자를 그의 환경으로부터 수동적으로 또는 능동적으로 흡수하는 과정에 대한 일반적인 용어이다. "세포외유출(exocytosis)"은 분자를 세포 내부에서 그 세포 주변의 매질로 수동적으로 또는 능동적으로 이동시키는 과정에 대한 일반적인 용어이다. "세포전달(transcytosis)"은 분자를 세포의 한 표면에서 또다른 표면으로 수송시키는 과정에 대한 일반적인 용어이다. "파라사이토시스(paracytosis)"는 분자를 세포 사이의 간질을 지나, 종종 폐쇄소대를 통과하여 이동시키는 과정에 대한 일반적인 용어이다. "수용체-매개된 세포내이입"은 세포가 분자, 바이러스, 박테리아 등을 내재화하는 특별한 유형의 트래픽킹 사건을 지칭한다. 그 명칭이 암시하듯이, 이것은 상기 분자와 세포 막에서 "수용체"라고 불리는 특이적 결합 단백질 사이의 상호작용에 의존한다. "전방향 수송"은 기저외측에서 첨단부 방향으로의 수송을 지칭하고, "역방향 수송"은 첨단부에서 기저외측 방향으로의 수송을 지칭한다.
전술한 배경기술 단락에서의 각 간행물 및 특허 출원서는 모든 표, 도면 및 청구의 범위 등을 비롯한 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
발명의 요약
본 발명은 폐 질환의 치료 방법을 개시한다. 상기 방법은, 대상체에게 치료제 및 폐 또는 비인두계통의 세포 표면에 존재하는 리간드에 결합하는 표적화 요소를 함유하는 화합물 또는 조성물을 폐, 구인두, 또는 비인두 경로를 통해 투여하는 단계를 포함한다. 리간드는 상기 화합물 또는 조성물에 분극화 상피 층을 통과하는 시험관내 또는 생체내 세포전달을 부여하는 것이 바람직하다. 치료제는 바람직하게는 시토킨 또는 케모킨이고, 더욱 바람직하게는 인터루킨 또는 인터페론, IP-10, I-TAC 또는 MIG이다. 또한, 치료제는 항체, 예를 들어 감염원에 대한 항체일 수도 있다. 본원은 pIgR 수용체상의 에피토프를 표적화하는 표적화 요소와 관련하여 본 발명을 상세하게 기재한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 표적화 요소는 시험관내 세포전달 분석에서 치료제에 첨단부에서 기저외측으로의 세포전달을 부여한다. 대상체는 예를 들어 폐 질환으로 진단되어 폐 질환의 치료가 필요하거나 폐 질환에 걸리기 쉬운 것으로 진단되어 폐 질환의 예방이 필요한 인간인 것이 바람직하다.
다양한 실시양태에서, 리간드의 예는 pIgR, pIgR 스톡(stalk), 트랜스페린 수용체, 아포-트랜스페린, 할로-트랜스페린, 비타민 B12 수용체, FcRn, 인테그린, Flt-1, Flk-1, Flt-4, GPI-연결 단백질, 스캐빈저 수용체, 폴레이트 수용체 및 저밀도 지단백질 수용체 중 1종 이상을 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리간드는 pIgR 또는 pIgR 스톡이다. 바람직한 실시양태에서, 표적화 요소는 pIgR의 비-분비 성분 영역에 결합한다. 추가의 실시양태에서, 치료제는 폴리펩티드, 바람직하게는 효소, 시토킨 또는 케모킨이다. 다양한 실시양태에서, 치료제는 효소, 인터루킨, 인터페론, 시토킨, 케모킨 또는 항체 중 1종 이상이다. 하기하는 목록의 인터루킨은 포괄적인 것이 아니라 단지 예시하기 위한 것이다. 기타 인터루킨, 기존의 인터루킨 및 아직 발견되지 않은 인터루킨 역시 본 발명에서의 사용에 대해 고려한다. 그러나, 예시적 목록의 인터루킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL- 6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21 및 전술한 이들 예시적 인터루킨의 기능성 유도체 중 임의의 것을 포함한다. 마찬가지로, 하기하는 목록의 인터페론은 포괄적인 것이 아니라 단지 예시하기 위한 것이다. 예시적 목록의 인터페론은 인터페론 α (인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파-2b를 포함함), 인터페론 β 및 인터페론 γ를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 인터루킨은 IL-2 또는 그의 기능성 유도체이고, 인터페론은 인터페론 α 또는 인터페론 β, 또는 이들 인터페론 α 또는 인터페론 β의 기능성 유도체이다. 바람직한 케모킨으로는 IP-10, I-TAC 및 MIG 등이 있다. 본원에서는 시토킨, 케모킨 또는 기타 치료제 중 임의의 2종 이상의 배합물 역시 제공된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 유도체"는 화합물의 화학적으로 변형된 버전, 유사체 또는 동족체를 지칭하며, 이들은 상기 화합물의 임의의 주어진 적용에 대해 관심이 있는 생물학적 기능을 보유한다. 폴리펩티드의 경우, 화학적 변형으로는 화합물에 화학적 기의 부가 (예를 들어 글리코실화, 인산화, 티올화, 페길화(pegylation), 아세틸화, 아미드화, 글리코실포스포이노시톨화 등), 화합물에서 관심 기능에는 영향을 주지 않는 부분의 제거 (단백질의 관심 활성을 보유하는 말단절단(truncate) 형태, 예를 들어 클레나우(Klenow) 단편의 제조), 화합물에 도메인 또는 기능을 부가하는 서열을 이용한 화합물의 연장 (예를 들어 융합 단백질의 제조), 폴리펩티드에서 1개 이상의 아미노산 세트의 변화 (뮤테인(mutein)의 제조) 등을 들 수 있으나, 이러한 예로 제한되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재한 치료 화합물의 기능성 유도체는 예를 들어 치료 화합물의 방출 또는 대사를 지연시켜서 폐에서의 치료 화합물 체류 시간을 연장시킨다.
유사체의 예로는 펩티드모방체(peptidomimetic) 등이 있고, 동족체는 생물학적 활성을 보유하고 다른 동물 종에서 기원한 폴리펩티드 (예를 들어 인간 및 돼지 인슐린, 인간 및 연어 칼시토닌 등) 또는 동일 동물 종(intraspecies)의 폴리펩티드 이성질체 (단백질 "족", 예를 들어 시토크롬 P450 족)이다. 예를 들어 IL-2의 뮤테인 및 페길화 기능성 유도체는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 ([Chapes et al., J. Appl. Physiol. 86:2065-76 (1999)], [Shanafelt et al., Nature Biotechnol. 18:1197- 202 (2000)])을 참조한다. 기능성 유도체의 IL-2 생물학적 활성은 IL-2-의존성 뮤린(murine) 세포독성 T 세포주인 CTLL-2의 증식을 유지하는 능력을 평가하여 시험하는 것이 바람직하다. 예를 들어 문헌 [Melani et al., Cancer Res. 58:4146-54 (1998)]을 참조한다. 마찬가지로, Fc 또는 인간 혈청 알부민에 연결된 IL-2의 기능성 유도체는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 ([Zheng et al., J. Immunol. 163:4041-48 (1999)], [Melder et al., Modulation of anti-infective responses in mice by Albuleukin, an Interleukin-2/human serum albumin fusion protein, Society for Biological Therapy Meeting. Nov. 2001])을 참조한다 .
"폐 경로"라는 것은, 대상체에서 기도를 통해 폐에 이르는 화합물 또는 조성물의 투여를 의미한다. 폐 경로는 기관, 후두, 세기관지, 기관지 및 폐포 등을 비롯한 모든 통로를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"비인두"는 비도(鼻道), 인두, 기관 및 후두 중 임의의 것을 지칭한다. "비인두 경로"라는 것은, 화합물이 비인두를 통해 대상체로 진입하는 것을 의미한다. 유사하게, "구인두"는 구강을 지칭하고, 혀의 뒤쪽 (혀 아래쪽), 연구개, 편도 및 그의 지주(支柱), 인후의 후방 벽 (인두 후벽), 인두, 기관 및 후두를 포함한다. 따라서, "구인두 경로"라는 것은 화합물이 임의의 1개 이상의 구인두 막을 통해 대상체로 진입하는 것을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 투여 방식은 점적주입, 연무화, 에어로졸화, 미립화, 미스트화(misting) 또는 흡입 투여이고, 가장 바람직한 것은 흡입 투여이다.
인두는 콧등으로부터 목 아래쪽 후두까지 뻗어있다. 기관은 후두와 기관지 관을 연결한다. 후두는 상부 목의 근육과 연골 구조이며, 후두에는 성대가 있다. 공기는 후두를 통과하여 기관으로 들어간 후에 폐로 들어간다.
본 발명의 바람직한 전달 방법으로는 점적주입, 또는 연무화, 에어로졸화, 미립화 및 미스트화로 생성된 물질의 흡입 등이 있다. "점적주입"은 액적(liquid drop) 중의 액체를 폐 통로에 직접 전달하는 것을 지칭한다. "흡입"은 가장 바람직한 투여 형태이며, 화합물을 함유하는 기체 (바람직하게는 공기)를 대상체의 폐 및(또는) 비인두로, 바람직하게는 대상체 스스로의 호흡력에 의해 흡입시키는 것을 지칭한다. "연무화"는 액체로부터 입자의 미세 분무 또는 미스트를 생성시키는 것을 지칭한다. "에어로졸화"는 기체 중 고체 또는 액체 입자의 분산액을 생성시키는 것을 지칭한다. "미립화"는 조성물을 입자 또는 미세 분무로 만드는 것을 지칭한다.
"항-종양제"는 대상체에서 종양 또는 암을 파괴하거나 수축시키거나 종양 또는 암의 성장을 정지시키는 작용제 또는 이것을 수용하는 대상체의 생명을 연장시키는 작용제이다. 당업자는 항-종양제가 이것을 수용하는 각 대상체에서 반드시 항-종양 효과를 발휘하지는 않음을 이해할 것이다. 오히려, 대상체에서 종양 또는 암을 파괴하거나 수축시키거나 종양 또는 암의 성장을 정지시키는 작용제인지 또는 대상체의 생명을 연장시키는 작용제인지의 여부는, 처치를 받은 집단에서의 측정치를 처치받지 않은 유사 집단과 비교한 통계상의 문제이다. 바람직하게는, 모든 항-종양제가 처치를 받지 않은 대상체와 비교할 때 대상체의 평균 수명을 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년, 5년 또는 그 이상 연장시키는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항-종양제는 대상체에서 전이성 질환, 가장 바람직하게는 폐 전이의 평균 발병률 또는 평균 발병 시간을 처치받지 않은 대상체에 비해 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 항-종양제는 항-혈관신생제일 수 있다. "항-혈관신생제"는 통상적으로 종양의 혈액 공급처 발달을 촉진시키는 혈관신생 인자의 기능을 차단하거나 방지하는 화합물이다. 종양 혈관신생은 충실성 종양 덩어리를 위한 적절한 혈액 공급처의 특이적 발달이고, 종양의 성장은 종양 덩어리 중 충분하고 기능적인 혈관계의 존재, 유지 및 지속적 발달에 의존한다. 이와 같이, 종양 혈관신생은 기존의 혈관에서 혈관 기저 막의 내피 세포 투과, 이후의 내피 세포 증식 및 이후에 혈관 주변 세포외 매트릭스의 침윤을 포함하며 새로 생성된 혈관 돌출부(spout)를 형성시킨다 (예를 들어 문헌 [Vernon and E. H. Sage, Am. J. Pathol. 147:873-883 (1995)] 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, "혈관신생 인자"는 혈관신생을 촉진시키는 화합물을 지칭한다. 이러한 인자의 예로는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 VEGF 수용체, 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 형질전이 성장 인자 (TGF) α 및 β, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 안지오포이에틴-2 및 Tie-2 수용체, 스캐터(scatter) 인자 (간세포 성장 인자, IL-8, 안지오제닌, 어드헤신 분자 (예를 들어 인테그린, 셀렉틴, 카드헤린), 프로스타글란딘 E1 및 E2, 안지오제닌 형질전이 성장 인자, 안지오트로핀, 과립구-콜로니 자극 인자, 태반 성장 인자 및 프롤리페린 등이 있다.
따라서, 항-혈관신생제 중 하나, 예를 들어 VEGF에 대한 항체는 이들 혈관신생제의 정상적인 기능을 차단할 수 있다. 또한, 통상적으로 생체내 혈관신생제들의 균형을 조절하는 천연 항-혈관신생제 또는 천연 항-혈관신생 인자도 있다. 항-혈관신생 인자로는 안지오스타틴, 엔도스타틴, IFN-α 및 IFN-β, IFN-γ 유도가능한 단백질 10, IL-1, IL-6, IL-12, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘-1, 2-메톡시오에스트라디올, 메탈로프로테이나제의 조직 억제제, 레티노산, 프롤락틴, 염기성 섬유아세포 성장 인자 가용성 수용체, 형질전이 성장 인자-β (TGF-β), 태반 프롤리페린-관련 단백질, TNF-α, I-TAC 및 MIG 등이 있다. 본 발명의 치료제는 이러한 항-혈관신생제를 포함하거나 또는 이러한 항-혈관신생제를 제2 치료제로서 병용하여 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료제는 아포프토시스(apoptosis) 유도제일 수 있다. 아포프토시스는 프로그래밍된 세포 사멸이라고도 지칭되며, 막의 수포형성(blebbing) 및 핵의 DNA 단편화를 특징으로 하는 세포 사멸 형태이다. 아포프토시스의 조절곤란은 암을 비롯한 수많은 인간 질환과 관련되어 왔다. 아포프토시스에 의한 세포 사멸은, 초기에는 예를 들어 Fas 세포 표면 분자의 라이게이션과 같은 수용된 특이적 사멸 신호에 의해 촉발되지만 아포프토시스 경로의 수행은 Ced-3/ICE (카스파제) 족의 시스테인 프로테아제의 구성원이 활성화된 후에만 발생한다. 카스파제 족에는 부위-특이적 절단을 일으킨 후에 각종 표적 분자의 활성화/불활성화를 초래하는 활성을 갖는 10종 이상의 공지된 구성원이 존재한다. FLICE 및 관련 카스파제는 CPP32 (카스파제-3) 등을 비롯한 하류 카스파제 캐스케이드를 활성화시켜서 아포프토시스를 개시할 수 있다. 특이적 사멸 신호에 대한 반응에 아포프토시스 수행 경로가 관여하는지의 결정은, p53 및 Bcl-2/Bax 세트 포인트(set point) 등을 비롯한 각종 세포내 아포프토시스 조절자의 상태에 의존한다. Bcl-2/Bax 세트 포인트는 Bcl-2/Bcl-XL 족의 저해자와 촉진자 사이에서의 이종이량체화에 의해 생성되며, 이때의 이종이량체화 파트너의 비율이 각종 사멸 신호에 대한 반응에서의 결과가 세포 사멸인지 또는 세포 생존인지를 결정한다. 더욱 관계가 먼 족의 구성원인 Bad는 상기 세트 포인트에 대하여 인산화에 의해 지배되는 메카니즘에 의한 직접적인 조절자로 작용한다. 이때의 인산화는 Raf-1 키나제의 Bcl-2-의존성 동원(動員)에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "아포프토시스 유도제"는 아포프토시스 경로와 상호작용하여 세포 사멸을 촉발하거나 아포프토시스를 방지하는 또다른 분자의 기능을 차단하는 분자이다. 본 발명의 치료제는 이러한 아포프토시스 유도제를 포함하거나 또는 이러한 아포프토시스 유도제를 제2 치료제로서 병용하여 투여할 수 있다.
"항-감염제"는 감염원에 의한 감염을 예방하거나, 감염원에 의한 감염의 중증도를 감소시키거나, 정상적인 감염 경로를 방해하거나, 감염원에 의한 감염을 정지시키거나, 감염원의 성장 기능을 손상시키거나 또는 감염원을 사멸시키는 작용제이다. 당업자는 항-감염제가 이것을 수용하는 각 대상체에서 반드시 항-감염 효과를 발휘하지는 않음을 이해할 것이다. 오히려, 상기 작용제가 효과적인지의 여부는, 처치를 받은 집단에서의 측정치를 처치받지 않은 유사 집단과 비교한 통계상의 문제이다.
"리간드", "표적 분자" 또는 "분자 표적"은 화합물, 2종 이상의 화합물의 분자 복합체, 잔기 (화합물의 일부) 또는 2종 이상의 화합물 사이에 형성된 계면이며 세포 표면과 결합되어 있고, 표적화 요소와 특이적으로 결합한다. 바람직한 리간드는 막 단백질이고, 가장 바람직하게는 pIgR, pIgR 스톡, 트랜스페린 수용체, 아포-트랜스페린, 할로-트랜스페린, 비타민 B12 수용체, FcRn, 인테그린, Flt-1, Flk-1, Flt-4, GPI-연결 단백질, 스캐빈저 수용체, 폴레이트 수용체 및(또는) 저밀도 지단백질 수용체이다.
용어 "표적화 요소"는 분자 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 유형의 조성물 또는 화합물을 포함한다. 용어 "특이적 결합"은 표적화 요소가 오로지 그의 의도된 표적하고만 결합한다는 것을 나타내는 것이 아니다. 오히려, 표적화 요소가 그의 의도된 표적에 대하여 갖는 친화도가 비-표적 분자와의 친화도에 비해 약 2-배 더 높은 경우, 상기 표적화 요소는 특이적으로 결합한다. 바람직한 표적화 요소의 표적 분자에 대한 친화도는, 비-표적 분자에 대한 친화도의 적어도 약 5-배, 바람직하게는 10-배, 더욱 바람직하게는 25-배, 훨씬 더욱 바람직하게는 50-배, 가장 바람직하게는 100-배 또는 그 이상이다. 이러한 표적화 요소를 포함하는 화합물 또는 조성물은 표적 분자에 "특이적 결합되도록 개조"되었다고 일컬어진다. 바람직한 표적화 요소는 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 단일-쇄 가변성 영역 단편, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 올리고당, 다당, 탄수화물, 시클릭 폴리펩티드, 펩티드모방체 및 압타머(aptamer)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 용어들은 본원에서 정의된 바와 같다.
세포 표면 성분에 특이적으로 결합하는 표적화 요소를 포함하는 화합물 또는 조성물이 상기 표적화 요소가 없는 유사 조성물에 비해 더 높은 속도로 또는 더 높은 절대량까지 세포 내로, 세포 주위로 또는 세포를 통과하여 (관여하는 수송의 유형에 따라 달라짐) 수송되는 경우에는 상기 세포 표면 성분이 수송, 능동 수송, 세포내이입 또는 세포전달을 "촉진"한다고 일컫는다. 속도 또는 양에 있어서 2-배, 5-배, 10-배, 100-배 또는 1000-배 증가가 달성되는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "화합물"은 단일 공유 연결된 분자를 지칭한다. 화합물은 1종 이상의 표적화 요소에 공유 연결된 1종 이상의 치료제를 포함하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조성물"은 비-공유 수단으로 결합된 복수개의 화합물을 지칭한다. 조성물은 1종 이상의 표적화 요소에 공유 연결된 1종 이상의 치료제를 포함하는 화합물 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 별법으로, 조성물은 2002년 8월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 제60/402,029호 (상기 문헌의 전문은 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같은 입자 또는 캡슐에 넣은 1종 이상의 치료제 및 1종 이상의 표적화 요소를 지칭하는 것일 수도 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소분자"는 3000 달톤 미만, 바람직하게는 2000 또는 1500 달톤 미만, 보다 더 바람직하게는 1000 달톤 미만, 가장 바람직하게는 600 달톤 미만의 분자량을 갖는 화합물을 의미한다. 반드시 그런 것은 아니지만, 소분자는 올리고펩티드가 아닌 것이 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합에 의해 인접 아미노산 단위에 연결된 2개 이상의 단량체 아미노산 단위를 포함하는 공유결합 어셈블리를 의미한다. "올리고펩티드"는 짧은 아미노산 서열 (즉, 2개 내지 10개의 아미노산)을 포함하는 폴리펩티드이다. 올리고펩티드는 일반적으로 화학적 합성에 의해 또는 더 큰 폴리펩티드를 단편화함으로써 제조된다. 폴리펩티드 약물의 예로는 치료 항체, 인슐린, 부갑상선 호르몬, 폴리펩티드 백신, 및 항생제, 예를 들어 반코마이신을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 신규 폴리펩티드 약물은 파지 디스플레이 방법에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 당업자에 의해 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 중쇄, 및 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 경쇄로 언급된 2개의 결합 영역에 의해 형성된 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 분자를 의미한다. 면역원성 반응의 시험관내 또는 생체내 발생에 의해 얻어지는 경우, 중쇄 및 경쇄는 별도의 폴리펩티드들로서 발현되어 디술피드 결합에 의해 연결된다. 이 경우, 중쇄 및 경쇄는 환원 조건하에 분리될 수 있다. 이러한 항체로는 폴리클로날, 단일특이적 및 모노클로날 항체, 및 그의 항원 결합 단편 (예, Fab 단편, Fab' 단편 등) 둘 다를 들 수 있다. "면역원성 반응"은 단백질의 하나 이상의 부분이 에피토프로서 기능하도록 하는 방식으로 적절한 세포를 하나 이상의 단백질 또는 그의 폴리펩티드 유도제와 접촉시킨 후, 상기 단백질에 대하여 결합되는 항체가 생성되는 반응이다.
하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 분자를 재조합적으로 형성시키는 경우, 상기 논의한 바와 같이, 디술피드 결합에 의해 중쇄 및 경쇄를 연결시킬 수 있다. 그러나, 다양한 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄는 비-환원성 공유결합 링커에 의해 연결된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 가변성 영역 단편" 또는 "sFv"는 경쇄 및 중쇄 부분이 항원 결합 부위를 형성시키기에 충분한 길이를 갖는 공유결합 연결에 의해 함께 연결된 단일 항체 경쇄 및 항체 중쇄의 가변성 항원-결합 결정 영역을 의미한다. 이러한 링커는 공유결합으로는 짧을 수 있으며, 바람직한 링커는 아미노산 2개 내지 50개, 보다 바람직하게는 아미노산 5개 내지 25개의 길이이다. 항원 결합 부위가 경쇄 및 중쇄 부분의 분자내 결합으로부터 형성될 필요는 없으며, 오히려 2개의 별도의 sFv가 이하 기재된 바와 같은 다중결합 항원 결합 분자 (예, 디아바디 (diabody)를 형성시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 전형적으로 포스포디에스테르 결합에 의해 인접 리보스 단위의 3' 및 5' 히드록실을 통해 연결된 뉴클레오티드의 공유결합 어셈블리를 포함하는 분자를 의미한다. "올리고뉴클레오티드"는 짧은 염기 서열 (즉, 뉴클레오티드 2개 내지 10개)을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 둘 다 포함하고, 햄머헤드(hammerhead), 헤어핀(hairpin), 덤벨(dumbbell) 등과 같은 3-차원 형태로 추정될 수 있으며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 약물은 리보짐, 및 폴리뉴클레오티드 백신을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오티드 유사체"는 올리고뉴클레오티드의 구조 및 기능을 모방하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 뉴클레오티드의 공유결합 어셈블리는 아닌 분자를 의미한다. N-(2-아미노에틸)-글리신 단위의 주쇄 연결을 통해 연결된 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 펩티드 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체의 예이다.
본원에 사용된 바와 같이, "탄수화물"은 당의 임의의 형태이다. 탄수화물의 예로는 간단한 당 또는 올리고당 (예, 1000 미만의 전형적인 분자량을 갖는 단당, 이당 등) 및 거대분자 (고분자 또는 다당) 물질, 예를 들어 전분, 글리코겐, 및 셀룰로스 다당 (약 105 내지 106의 분자량을 가질 수 있음)을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 용어 "다당"은 본원에 사용된 바와 같이 공유결합으로 연결된 2개 이상의 당 단위를 포함하는 탄수화물을 의미한다. "올리고당"은 짧은 당 서열 (즉, 2개 내지 10개의 당 단위)을 포함하는 다당이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "시클릭 폴리펩티드"는 각각 아미드 결합에 의해 2개 이상의 인접 아미노산 단위에 연결되어 거대고리를 형성하는 단량체 아미노산 단위의 공유결합 어셈블리를 포함하는 분자를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드모방체"는 폴리펩티드의 구조 및 기능을 모방하지만 아미드 결합에 의해 연결된 아미노산의 공유결합 어셈블리는 아닌 분자를 의미한다. N-치환된 글리신 단위의 중합체인 펩토이드는 펩티드모방체의 예이다.
용어 "압타머"는 본원에 사용된 바와 같이 비-폴리뉴클레오티드 표적 분자 (예, 폴리펩티드 또는 소분자)에 결합하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "면역계 조절인자"는 본원에 사용된 바와 같이 통상적으로 생성되고(되거나) 면역계 세포를 통해 효과가 입증된 천연 또는 재조합 분자를 의미한다.
"인터루킨"은 백혈구 및 기타 세포 유형 (예, 내피 세포, 단핵구, 섬유아세포 및 수지상 세포)에 의해 생성되는, 잘 특성화된 시토킨 군의 일반명이다. 인터루킨은 폭넓게 다양한 세포 유형의 활성 및 능력을 조절하는, 넓은 범위의 기능적 활성을 갖는다. 인터루킨은 염증 및 면역 반응을 조절하는 시토킨 네트워크의 구성원으로서 특히 중요하다.
시토킨은 세포 자체 기능 (자가분비 효과) 또는 인접 세포의 기능 (주변분비 효과)을 변화시키기 위해 하나의 세포에 의해 분비되는 비교적 저분자량의 약리학적 활성 단백질의 다수의 배열을 나타낸다. 많은 경우, 각각의 시토킨은 여러가지 생물학적 활성을 갖는다. 상이한 시토킨들이 동일한 활성을 가질 수도 있는데, 이는 염증 및 면역계내에서 기능적 중복성을 제공한다.
용어 "시토킨"은 본원에 사용된 바와 같이 천연 분자의 아미노산 서열, 글리코실화 및 기타 변이체를 포함하는 것으로 고려된다. 이들 변이체는 천연 분자의 정상적인 생물학적 활성 수준을 증가시킬 수 있거나, 이와는 달리 천연 분자에 대해 길항적으로 작용할 수도 있다. 또는, 변이체는 산화에 대한 안정성 및 연장된 생물학적 반감기 등과 같은 향상된 특징에 대하여 선택된다. 이러한 변이체는 공지되어 있거나, 향후 본원 발명에 사용하기에 적합하도록 발생될 것이다.
인터루킨은 특히 백혈구들 사이에서 매개자로 작용하는 시토킨이다. 하기 표는 몇몇 유형의 인터루킨의 주요 공급원 및 효과를 나타낸다.
IL 주요 공급원 주요 효과
IL-1 대식세포 T 세포 및 항원-제시 세포의 자극. B-세포 성장 및 항체 생성. 조혈 (혈액 세포 형성) 자극.
IL-2 활성화된 T 세포 활성화된 T 세포의 증식.
IL-3 T 림프구 혈액 세포 전구체의 성장.
IL-4 T 세포 및 비만 세포 B-세포 증식. IgE 생성.
IL-5 T 세포 및 비만 세포 호산구 성장.
IL-6 활성화된 T 세포 IL-1 또는 TNFα와의 상승 효과.
IL-7 흉선 및 골수 기질 세포 T 세포 및 B 세포 전구체의 발생.
IL-8 대식세포 호중구를 화학물질로 유인.
IL-9 활성화된 T 세포 T 세포 및 비만 세포의 성장 촉진.
IL-10 활성화된 T 세포, B 세포 및 단핵구 염증 및 면역 반응 억제.
IL-11 기질 세포 조혈에 대한 상승 효과.
IL-12 대식세포, B 세포 TH1 세포를 촉진하면서 TH2 기능을 억제함.
IL-13 TH2 세포 IL-4 효과와 유사.
IL-15 상피 세포 및 단핵구 IL-2 효과와 유사.
IL-16 CD8 T 세포 CD4 T 세포를 화학물질로 유인.
IL-17 활성화된 메모리 T 세포 T 세포 증식 자극.
IL-18 대식세포 IFNγ 생성 유도.
인터페론 (IFN)은 감염에 대해 세포 면역성을 활성화하는데 관여하는, 면역 자극/조정 활성을 갖는 시토킨 또는 세포 신호전달 단백질의 클래스이다. 인터페론은 주로 바이러스 감염에 대해 반응하고 또한 합성 또는 생물학적 유도제에 대해 반응하여 세포에 의해 생체내에서 제조 및 분비되는, 약 15,000 내지 27,600 달톤 (약 15 내지 27 kDa)의 분자량을 갖는 작은 단백질 및 당단백질의 패밀리이다. 지식 및 기술의 진보에 의해, 동일한 세포 유형에 의해 다양한 인터페론 (명명법에 있어서는 한가지 기준을 가짐)이 생성되는 것으로 밝혀졌고, 상이한 종 및 형태의 인터페론이 발견되었으며, 몇몇 형태는 기존에 보고된 다른 것들과 동일한 것으로 확인되었다. IFN-α (알파(alpha) 또는 알파(alfa)), IFN-β (베타), 및 IFN-γ (감마)의 세가지 주요 클래스가 존재한다.
인터페론은 세포 표면상의 특정한 막 수용체에 결합함으로써 그의 세포 활성을 나타낸다. 일단 세포막에 결합하면, 인터페론은 여러 다른 시토킨의 상향조절, 여러 효소의 유도, 세포 증식의 억제, 면역조정 활성, 예를 들어 대식세포의 식세포 활성의 증대 및 표적 세포에 대한 림프구의 특정한 세포독성 (세포 면역성)의 증가, 및 바이러스-감염된 세포에서 바이러스 복제의 억제를 비롯한 세포내 반응의 복잡한 순서를 개시한다. IFN은 다중약물-내성 폐 결핵과 같은 기도 및 폐 감염을 비롯한 각종 호흡기 질병을 치료하는데 사용되어 왔다.
미국에서 현재 승인 및 시판되는 인터페론 제품으로는 a) 하나의 천연 (인간 세포-유도된) α-인터페론 제품, 인터페론 알파-n3 (인간 백혈구 유도된) 또는 알페론(Alferon) N 인젝션(Injection); b) 세가지 형태의 재조합 α-인터페론 - 인터페론 알파-2b (인트론(Intron) A), 인터페론 알파-2a (로페론(Roferon) A), 및 인터페론 알파콘(alfacon)-1 또는 인페르겐(Infergen); c) 세가지 형태의 재조합 β-인터페론 - 인터페론 베타-1b 또는 베타세론(Betaseron) 및 인터페론 베타-1a (예, 아보넥스(Avonex) 또는 레비프(Rebif)); 및 d) 하나의 γ-인터페론 - 인터페론 감마-1b 또는 악티뮨(Actimmune)을 들 수 있다. 천연 α-인터페론, 인터페론 알파-n1, 림프아구 또는 웰페론(Wellferon)은 1999년에 승인되었지만, 미국에서 시판 개시 전에 포기되었다. 추가로, 두가지 상이한 형태의 페길화된 재조합 α-인터페론이 FDA 승인을 기다리고 있거나 또는 최근에 만성 C형 간염의 치료에 대하여 쉐링-플라우 코포레이션(Schering-Plough Corp.)의 페그인터페론 (Peginterferon) 알파-2b 또는 PEG-INTRON 및 호프만-라 로쉬 인크.(Hoffmann-La Roche Inc.)의 페그인터페론 알파-2a 또는 페가시스 (Pegasys)가 둘 다 승인되었다. 페길화는 인터페론 분자의 약동학 특성을 향상(그의 반감기를 연장)하기 위해 인터페론 분자에 불활성 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 중합체 측쇄를 부착하는 것을 포함한다.
몇몇에 의해 다수의 인터페론 유형 또는 종을 함유하는 "천연" (세포 배양-유래) 인터페론 제품은 단일-종 재조합 인터페론 제품보다 잠재적으로 더 우수한 치료 효능을 제공하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 천연 α-인터페론은 콘딜로마 (성기 사마귀)를 치료하는데 있어서 재조합 인터페론 α 제품보다 4배 더 낮은 투여량으로 사용될 수 있다. 천연 α-인터페론은 일반적으로 인간 림프아구 또는 백혈구 세포의 의도적인 바이러스 감염 자극에 의해 생성되며, 크로마토그래피 및 전기영동 기술에 의해 정제된다. 천연 인간 β-인터페론은 일반적으로 인터페론 발현에 대해 충분히 입증된 유도제인 폴리-IC (폴리리보이노신산-폴리리보시티딜산 중합체)로 인간 섬유아세포 배양물을 과유도(superinduction)하여 제조되며, 크로마토그래피 및 전기영동 기술에 의해 단리 및 정제된다.
β-인터페론 제품은 현재 다발성 경화증 적응증에 대하여만 승인된 상태이다. β-인터페론은 MS에서 다음과 같은 여러 경로로 작용할 수 있다: T-세포 기능, 예를 들어 활성화, 증식 및 억제자 세포 기능의 조절; 시토킨 생성 조정; 염증유발성 시토킨 및 인터페론 감마의 하향조절; 억제성 항-염증성 시토킨의 상향조절; 혈액 뇌 장벽을 통해 T-세포가 중추신경계로 이동 및 침윤되는 것을 조절.
인터페론 제품의 명명법은 복잡하다. 명명법은 시간에 따라 변화되어 왔으며, 동일 또는 상이한 분자들을 언급하기 위해 여러 협약(또는 없음) 및 기술어들이 사용된다. 한가지 전통적인 방법에 따르면, 백혈구, 섬유아세포 및 면역 인터페론의 세가지 종류의 인터페론이 존재한다. 이들 인터페론은 그들의 공급원에 대하여 대강 명명되며, 예를 들어 백혈구 또는 섬유아세포 세포에 의해 또는 바이러스 또는 기타 면역 감염에 반응하여 분비된다. 최초에는 세포가 한가지 유형의 인터페론만을 분비하였다고 가정되었다. 그러나, 현재는 인터페론-발현 세포가 다수 유형의 인터페론 및 다수의 아형 (아종, 예를 들어 알파-2a 또는 알파-2b)을 생성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 각각의 주요 종/유형에 대해 다수의 인터페론 아종, 예를 들어 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파-2b가 확인되었다. 두가지 주요 종류의 인터페론 (즉, 유형-I 및 유형-II; 한가지 분류 체계에 따름)이 확인되었다. 모든 유형-I 인터페론은 인터페론과 세포-표면 수용체의 결합에 의해 발생되는 공통의 생물학적 활성을 공유하며, 여러 인터페론-자극된 유전자 생성물을 생성시킨다. 유형-I 인터페론은 25 유형 (종) 초과의 인터페론 α 패밀리 및 인터페론 베타 및 인터페론 ω 종을 포함한다. 현재 승인된 모든 인터페론 제품은 유형 I이다. 유형-I 인터페론은 항바이러스, 항증식 및 면역조정 효과, 세포 표면 주조직적합성 항원 (HLA 클래스 I 및 클래스 II)의 조절, 및 다른 시토킨 발현의 유도 및 조절을 포함하는 다면발현성(pleiotropic) 생물학적 반응을 유도한다. 인터페론-자극된 유전자 생성물의 예로는 2'5' 올리고아데닐레이트 신테타제 (2'5' OAS) 및 베타-2 미크로글로불린을 들 수 있다.
더 새롭고 보다 통상적으로 사용되는 명명법 시스템은 상이한 세포 유형에 의해 생성되는 인터페론 유형에 대한 초기 특징규명을 기초로 한다. 예를 들어, 25 종 초과의 α-인터페론이 대식세포 및 B-, 비-B- 및 비-T-림프구에 의해 생성된다. 이러한 명명법은 아종 (흔히, 확인된 순서로 명명됨)을 나타내는 숫자 또는 로마 소문자와 함께 그리스 문자, 예를 들어 α (백혈구 및 림프아구 세포 인터페론의 경우), β (섬유아세포 인터페론의 경우), 및 γ (면역 인터페론의 경우)를 사용한다. 용어 '알파(alpha)' 또는 '알파(alfa)'는 예를 들어 FDA 적정명으로 시판되는 α-인터페론 제품을 언급하는 경우에 사용될 수 있다. 각 인터페론 클래스내에서, 인터페론은 상당한 상동성을 공유하는데, 즉 이들의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 매우 유사하다. 다른 공급원 (미국 특허 제5,676,942호)는 다음과 같은 알파 인터페론 종 용어의 등가물을 보고한다: aA, a2a, aM, a4a; a2b; a2c, a4b; aB, a8a, aMI, a4a; aB', a8c; aB2, a8b, aN, a14c; aC, a1Oa, aO, a16 ; aD, a1a, aI, a17a; a1b, aI', a17b; a5, 88, 또는 a17c; aH, a14a, aIl, a17d; aJ, a7a, af, a21a; aJ1, a7c; aJ2, a7b, a(Ovch); a21b; aK, a6. 어떤 인터페론 종 (예, α, β 또는 γ)내의 모든 인터페론은 유사한 생물학적 효과를 갖지만, 해당 클래스내의 각 인터페론 아종이 모든 활성을 공유하는 것은 아니다. 많은 경우, 활성 정도는 각 인터페론 아종 (예, α2a, α2b)에 대하여 실질적으로 달라진다. 천연 (인간 세포-유래) 및 재조합 인터페론 제품은 둘 다 본 발명에 포함된다.
케모킨은 백혈구-매개된 염증 및 면역성의 중요한 조절체인 화학주성 시토킨이다. 케모킨은 보존된 N-말단의 시스테인 모티프 (C, CC, CXC 및 CX3C, 여기서 "X"는 비보존된 아미노산임)의 수 및 배열에 따라 네가지 주요 카테고리 (하기 표 참조)로 그룹화되었다. CXC 케모킨 및 CC 케모킨은 4개의 시스테인 잔기를 함유하는 각 구성원을 갖는 가장 큰 패밀리이다. 대부분의 케모킨은 8 내지 10 kDa의 크기이고, 중성 pH에서 양이온성이며, 20 내지 70％의 아미노산 서열 상동성을 공유한다. CXC 케모킨은 보존된 CXC 영역의 N-말단의 트리펩티드 모티프 Glu-Leu-Arg (ELR)의 존재 또는 부재를 기준으로 2가지 클래스로 추가로 세분된다. 모티프 (ELR+)를 함유하는 구성원은 호중구에 대한 강력한 화학주성인자 및 혈관신생 프로모터이지만, 모티프 (ELR-)를 함유하지 않는 구성원은 단핵 세포에 대해 강력한 화학주성인자이며 인터페론-감마에 의해 유도가능한 이 군은 혈관신생의 강력한 억제제이다.
대부분의 케모킨은 이량체를 형성하며, 희석하게 되면 생물학적으로 활성인 단량체들로 분리된다. 케모킨 활성은 7-막횡단-도메인 G 단백질 커플링된 수용체에 의해 매개된다. 케모킨은 혈관신생 및 종양 억제에서 역할을 수행하며 CD4와 함께 HIV-1에 대한 결합 부위로서 인식된 케모킨 수용체와의 상호작용에 의해 HIV-억제 인자로서 확인되었다. 또한, 다양한 케모킨들이 디펜신-유사 항미생물 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
디펜신은 삼중-가닥 베타-시트 형태 구조를 생성시키는 6개의 불변 시스테인을 포함하는 항미생물 및 세포독성 펩티드 (아미노산 잔기 약 29개 내지 35개 길이)의 패밀리이다. 디펜신은 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 진균 및 몇몇 외피보유 바이러스에 대한 항-감염제인 것으로 알려져 있다. 또한, 디펜신은 넓은 범위의 정상 및 악성 표적에 대해 세포독성인 것으로 밝혀졌다. 디펜신은 세포막에 삽입되어 세포막을 투과가능하게 함으로써 작용하는 것으로 보인다. 알파 및 베타-디펜신의 두가지 주요 클래스가 확인되었다. 알파-디펜신은 호중구 및 장의 파네트(Paneth's) 세포에 의해 생성된다. 베타-디펜신은 주로 상피 세포에 의해 생성된다. 알파-디펜신은 각종 만성 염증성 폐 질병에 걸린 환자의 기도 분비물 중에 존재하며, 기도 상피 세포에 대해 세포독성이고 여러 세포 유형에서 케모킨 분비를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
하기 표는 시판되는 (R & D Systems, Minneapolis, MN) 대표적인 케모킨을 나타낸다.
I-TAC, 인터페론-유도성 단백질 10 (IP-10) 및 감마 인터페론 (MIG)에 의해 유도된 모노킨은 CXC ELR-케모킨이며, CXCR3 수용체에 결합한다. 이들 각각은 강력한 항-혈관신생 인자이며, IL-2dp 의해 활성화된 T-세포 (Th1)에 대한 화학주성인자이지만 자극되지 않은 T-세포에 대한 화학주성인자는 아니다. I-TAC는 CXCR3에 대한 가장 높은 친화성을 가짐으로써 CXCR3에 대해 우성 리간드이면서 화학주성인자로서 IP-10 또는 MIG보다 더 강력해진다 [Neote et al., J Exp Med. 1998 Jun 15; 187 (12):2009-21].
CXC ELR+ 케모킨은 CXCR1 및 CXCR2에 결합하는 인터루킨-8 (IL-8)을 포함한다. IL-8은 호중구에 대한 화학주성인자이며, 혈관신생의 강력한 유도제이다.
Th1 및 Th2는 면역계에서 다양한 역할을 제공한다. Th 표현형은 그가 생성하는 시토킨을 특징으로 한다 (하기 표 참조).
Th1 및 Th2 세포는 이들이 분비하는 시토킨으로 인해 특정한 면역 반응과 관련된다. Th1-유형 시토킨의 경우, IFN-γ는 포식작용을 촉진하며, 미생물 사멸을 상향조절한다. 특히, 그는 박테리아를 식균(opsonize)하는 것으로 알려진 IgG 2A (마우스에서)를 유도한다. IFN-γ는 대부분의 외부 미생물을 제거하는데 필요한 모든 수단을 제공한다. IL-4는 전형적인 Th2 시토킨이며, 그의 분비는 IFN-γ의 반응과 유사한 다수의 반응을 개시한다. IL-4는 중화 항체 (IgG) 및 IgE로서 알려진 비만 세포/호산구 탈과립성 항체의 생성을 촉진한다. 또한, IL-4는 비만 세포, 호산구 및 대식세포 상에서 IgE 수용체의 상향조절을 촉진한다. IL-4 및 IFN-γ는 흔히 길항 관계로 존재한다. IFN-γ는 IgE 및 IgG1 생성을 차단하며, IL-4는 IgG2A 분비를 차단한다.
Th1 세포는 CCR5 및 CXCR3을 우선적으로 발현한다. Th2 세포는 CCR4, CCR8 및 더 적은 정도로 CCR3을 우선적으로 발현한다. 따라서, Th1 및 Th2 세포의 이동을 선택적으로 유도할 수 있는 것으로 보인다. Th1 세포는 세포-매개 면역성에 관여하며, 자가면역 질병 및 동종이식 거부와 관련된다. Th2 세포는 알레르기 염증 및 만성 섬유증식성 질병을 매개하는데 관여하며, 상기 염증 및 질병으로는 천식, 아토피성 피부염, 특발성 폐 섬유증 및 전신성 섬유증을 들 수 있다. 자극제가 성공적이지 않은 Th1 반응을 유도할 수 있으며 이후의 숙주 반응이 Th2 시토킨에 의해 좌우되는 반응을 보조할 수 있는 경우, 질환 시나리오가 성립될 수 있다. 이는 섬유증을 유도하는 한가지 방식이다. I-TAC를 투여함으로써 CXC ELR-케모킨에 대한 케모킨 균형을 변화시켜 Th1 반응을 회복시키는 것은 특정한 섬유증식성 질병을 치료하는데 있어서 효과적일 수 있다.
용어 "GPI-연결 단백질"은 본원에 사용된 바와 같이 카르복시-말단 종결부에서 글리코실포스포이노시톨 지질 (GPI) 개질된 진핵생물 단백질의 클래스를 의미한다. GPI 잔기는 번역 이후에 생체내 소포체에서 단백질에 부가되며, 단백질이 외부 원형질막에 막 앵커링하는 수단으로 작용한다. 극성화된 세포, 예를 들어 MDCK 세포에서, GPI-연결 단백질은 첨단부 세포 표면으로 우선적으로 분리되며, 여기서 상기 단백질은 "래프츠(rafts)"로서 알려진 마이크로도메인과 회합될 수 있다. 래프츠 및 그들의 GPI-연결 함유물은 특정 조건하에, 예를 들어 GPI-연결 단백질의 항체-유도된 가교결합에 의해 내부화될 수 있다. 이들 내부화된 래프츠의 적어도 일부분은 극성화된 세포에 의해 세포전달될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Verkade et al., J. Cell Biol. 148: 727-39 (1999); Muniz and Riezman, EMBO J. 19:10-15 (2000)] 참조).
용어 "스캐빈저 수용체"는 본원에 사용된 바와 같이 저밀도 지단백질 ("LDL")을 비롯하여 개질된 형태의 지단백질의 수용을 매개하는 단백질 클래스를 의미한다. 대식세포, 내피 세포, 장 상피 세포 및 평활근 세포와 같은 세포 유형은 개질된 지단백질에 대한 스캐빈저 수용체를 갖는 것으로 밝혀졌으며, 스캐빈저 수용체 패밀리는 HDL로부터 콜레스테롤을 '스캐빈징(scavenging)'함으로써 콜레스테롤 수송을 매개하는 세포 표면 수용체를 포함하게 된다. 또한, 스캐빈저 수용체는 개질된 지단백질 이외의 일정 범위의 다가음이온 리간드와 결합한다 (예를 들어, 문헌 [Platt and Gordon, Chem. Biol. 5:R193-203 (1998); Werder et al., Biochemistry 40: 11643-50 (2001); Zingg et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 22: 412-17 (2002)] 참조).
폴리이뮤노글로불린 수용체 (pIgR) 분자는 다음과 같이 정의되는 구조적 및 기능적으로 상이한 여러 영역들을 갖는다. 당업계에서, pIgR 분자는 "스톡" 및 "분비 성분" (SC)이라 불리는, 대강 정의된 두가지 상이한 영역들로 구성되는 것으로 기술되는 것이 일반적이다. 의도된 생물학적 기능을 수행하는 경우, pIgR 분자는 기저외측 측면에서 고분자 이뮤노글로불린 (IgA 또는 IgM)과 결합하며, 이후에 이뮤노글로불린을 첨단부 측면으로 수송한다. pIgR의 단백질분해 절단은 SC와 스톡 사이의 상피 세포의 첨단부 측면 상에서 일어난다. SC 분자는 세포막으로부터 방출되며, 이뮤노글로불린과 결합한 채로 남아 이뮤노글로불린을 보호하지만, 스톡 분자는 세포막과 결합한 채로 남는다 (문헌 ["Mucosal Immunoglobulins" by Mestecky et al. in: Mucosal Immunology, edited by P. L. Ogra, M. E. Lamm, J. Bienenstock, and J. R. McGhee, Academic Press, 1999] 참조). 본 발명의 개시내용에서 특별한 관심의 대상이 되는 pIgR 분자의 도메인으로는 도메인 5, 도메인 6, B 영역, 스톡, 막횡단 도메인, 분비 성분, 및 세포내 도메인을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
특히 바람직한 pIgR 분자는 미국 특허 제6,042,833호에 기재된 것들, 및 미국 특허 출원 제60/266,182호 (대리인 기록 번호 제057220.0701호)(2001년 2월 1일 출원, 발명의 명칭: "Compositions and Methods for Identifying, Characterizing, Optimizing and Using Ligands to Transcytotic Molecules" by Houston, L. L., and Sheridan, Philip L.)에 기재된 원숭이(simian) pIgR이다. 그러나, 본 발명에 있어서, pIgR은 또한 이 수용체의 패밀리 또는 수퍼패밀리 구성원의 임의의 것, 다른 생물에서 확인된 상기 수용체의 임의의 동족체, 이들 수용체의 임의의 이소폼, 임의의 pIgR-유사 분자, 및 임의의 단편, 유도제, 돌연변이, 또는 기도, 위장관, 요로 및 생식통로, 비강, 구강, 눈 표면, 피부 표면 및 임의의 다른 점막 상피 세포에 위치하는 것들과 같은 세포 상에서 또는 상기 세포에 의해 발현되는 기타 개질물을 의미한다. 바람직한 pIgR 및 pIgR-유사 단백질은 단백질의 상피 세포로의 또는 상피 세포를 가로지른 세포내이입 또는 세포전달을 지시하는 것들이다. pIgR은 매우 큰 이뮤노글로불린 수퍼패밀리의 부분이다. 이 분자의 세포외 IgA 결합부는 5개의 Ig-유사 도메인을 함유한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분비 성분" 및 "SC"는 이뮤노글로불린 (IgA 및 IgM)과 결합하는 능력을 보유하는 첨단부 단백질분해된 pIgR 분자의 최소의 (가장 짧은 아미노산 서열) 부분을 의미한다. pIgR의 단백질분해 절단 후, 일부 아미노산 잔기는 SC:이뮤노글로불린 복합체와 회합된 채로 남지만, 결국에는 그러한 복합체로부터 분해되고(되거나) 제거된다 [Ahnen et al., J. Clin. Invest. 77:1841-1848, 1986]. 본원에 사용된 분비 성분의 정의에 따르면, 상기 아미노산은 SC의 부분이 아니다. 본 발명의 어떤 실시양태에서, SC를 인식하지 않거나 SC와 결합하지 않는 pIgR-표적화 요소가 바람직하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스톡"은 pIgR로부터 유도된 아미노산 서열을 갖는 분자를 의미하며, 여기서 스톡 서열은 SC로부터 유도된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 스톡 분자는 첨단부 단백질분해 절단이 일어나는 경우에 상기 절단 이후에 첨단부 막에 결합한 채로 남아 있는 pIgR 아미노산 서열 및 이러한 절단에 필요한 pIgR 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 스톡 분자는 그와 결합된 리간드에 한가지 이상의 세포전달 특성을 부여한다. 결합된 화합물 또는 조성물 (예, 리간드)에 대해 첨단부로부터 기저외측으로의 세포전달을 수행하는 능력을 부여하는 스톡 분자가 가장 바람직하다.
다양한 실시양태에서, 폐 질환은 폐암, 기도 또는 폐 감염, 간질 질환, 기체 교환 또는 혈액 순환 장애, 기도 질환 또는 흉막 질병일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "폐암"은 원발성 폐 종양 (예를 들어, 기관지유래 암종 또는 기관지 유암종) 또는 원발성 종양의 또 다른 기관 또는 조직으로의 전이 (예를 들어, 유방, 결장, 전립선, 신장, 갑상선, 위, 자궁경부, 직장, 고환, 골 또는 흑색종)를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기도 또는 폐 감염"은 호흡기계의 어떤 부분이 임의의 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충으로 감염된 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "간질 질환"은 섬유증을 비롯한 임의의 간질 장애 (예를 들어, 간질 폐 섬유증, 간질 폐렴, 간질 폐 질환, 랑게르한스(Langerhans') 세포 육아종증, 사르코이드증, 또는 특발성 폐 헤모시데린증)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기체 교환 또는 혈액 순환 장애"는 기체가 혈액 및 폐로 들어가거나/혈액 및 폐로부터 나오는 분포 및(또는) 교환에 영향을 주는 임의의 이상증 (예를 들어, 폐 부종, 폐 색전증, 호흡 부전 (예, 근육 약화에 기인함), 급성 호흡 장애 증후군, 또는 폐 고혈압)을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "기도 질환"은 유전적 및 환경적 병인론의 질병을 비롯하여 규칙적인 호흡 패턴의 임의의 질병 (예를 들어, 천식, 만성 기관지염, 세기관지염, 낭성 섬유증, 기관지확장증, 공기증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 미만성 범세기관지염(diffuse panbronchiolitis) 또는 림프관근종증(lymphangiomyomatosis))을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "흉막 질병"은 예를 들어 흉막 삼출물 (예, 혈흉 (흉막 공간내 혈액), 또는 공기증 (흉막 공간내 고름), 기흉 (공기, 예를 들어 외상성, 자발성, 또는 장력), 흉막염 또는 흉막 섬유증 또는 석회화를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 화합물은 흡입을 통해 액체 입자 및(또는) 고체 입자 (예, 에어로졸, 연무제, 미스트, 분무화 샘플, 액적 등)와 같은 형태로 투여된다. 화합물 또는 그의 치료 부분은 바람직하게는 유효 투여량의 화합물 또는 그의 치료 부분을 전달하는 약동학 프로파일로 폐로 전달된다. 바람직한 실시양태에서, 투여된 화합물 또는 그의 치료 부분 또는 대사산물의 1％ 이상, 보다 바람직하게는 5％ 이상, 보다 더 바람직하게는 10％ 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20％ 이상, 가장 바람직하게는 30％ 이상이 바람직하게는 폐 관강에서 첨단부로부터 기저외측으로의 세포전달을 수행한다.
본 발명의 화합물 또는 치료제의 "유효 투여량"은 본 발명의 화합물 또는 치료제를 투여한 대상체에서 이러한 화합물 또는 치료제를 투여하지 않은 동등한 대상체에 비해 폐 질환을 치료하거나, 폐 질환의 진행을 반전시키거나, 폐 질환의 진행을 중지시키거나 또는 폐 질환의 발생을 방지할 수 있는 양이다.
"항-종양 화합물 또는 제제의 유효 투여량"은 암 세포를 사멸시키거나, 암 또는 종양 매스 크기의 확대를 억제하거나, 전이성 질환의 발현을 지연 또는 억제하거나, 대상체의 수명을 연장할 수 있는 화합물의 양이다. 예를 들어, 한 실시양태에 있어서, 유효 투여량은 암 또는 종양 매스의 크기를 축소시킨다. 또 다른 실시양태에 있어서, 유효 투여량은 치료 부위에 전이된 암 세포를 사멸시키고(거나) 세포가 전이성 매스를 형성하지 못하도록 한다.
특정 실시양태에서, 대상체에서의 종양은 원발성 종양이고, 가장 바람직하게는 폐의 원발성 종양이지만; 보다 바람직하게는 대상체에서의 종양은 속발성 종양이고, 가장 바람직하게는 폐의 종양이 아닌 원발성 종양으로부터의 폐 전이이다. 다양한 실시양태에서, 원발성 종양은 육종, 선암종, 융모막암종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 종양은 결장 선암종, 유방 선암종, 유윙 육종, 또는 골육종이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 원발성 종양은 신 세포 암종이고, 속발성 종양은 폐의 종양이다. 다양한 실시양태에서, 폐 전이의 임상적 발현은 고립성 전이, 캐논볼, 암종성 림프관염, 또는 흉막 삼출이다. "원발성" 종양은 대상체에서의 최초 종양이다. "속발성" 종양은 최초에 다른 기관에서 발현되어 또 다른 기관으로 전이된 암이다.
"항-감염 화합물 또는 제제의 유효 투여량"은 감염원에 의한 감염을 예방하거나, 감염원에 의한 감염의 중증도를 저하시키거나, 정상 감염 경로를 방해하거나, 감염원에 의한 감염을 억제하거나, 감염원의 성장 기능을 손상시키거나, 감염원을 사멸시킨다. 감염원은 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충, 또는 국소 또는 전신 감염을 유발하는 임의의 기타 감염원일 수 있다. 바람직하게는, 감염은 기도 감염 또는 폐의 감염이다. 특정 실시양태에서, 감염은, 예를 들어, 결핵을 유발하는 박테리아 감염이다. 다른 실시양태에서, 감염은, 예를 들어, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)을 유발하는 바이러스 감염이다. 다른 실시양태에서, 감염은 진균 감염이다. 또 다른 실시양태에서, 감염은 다양한 유형의 감염원에 의해, 예를 들어, 폐렴을 유발할 수 있다.
상기 정의된 유효한 치료용 화합물의 양은 상기 화합물이 병용 요법에서 사용되는 추가의 실시양태하에 변화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, "병용 요법"은 하나 이상의 치료용 화합물을 후속적으로 또는 동시에 투여하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 제1 치료제를 포함하는 본 발명의 화합물은 또 다른 본 발명의 화합물로서 제제화되거나 또는 비개질된 제2 치료제와 함께 병용 요법으로 투여할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 치료제를 포함하는 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 감염원에 대해 유도된 백신, 암-유발원 또는 암-관련 폴리펩티드와 함께 병용 요법으로 투여할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 표적화 요소는 LRKED, QLFVNEE, LNQLT, YWCKW, GWYWC, STLVPL, SYRTD, QDPRLF 및 KRSSK로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 pIgR 또는 pIgR 스톡 상에서 에피토프에 결합한다. 보다 바람직한 실시양태에서, 표적화 요소는 하기로부터 선택된 영역에서 pIgR 또는 pIgR 스톡에 결합한다:
R1 KRSSK 내지 pIgR의 카르복시 말단;
R2a SYRTD 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R2b SYRTD 내지 KRSSK,
R3a STLVPL 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R3b STLVPL 내지 KRSSK,
R3c STLVPL 내지 SYRTD,
R4a GWYWC 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R4b GWYWC 내지 KRSSK,
R4c GWYWC 내지 SYRTD,
R4d GWYWC 내지 STLVPL,
R5a YWCKW 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R5b YWCKW 내지 KRSSK,
R5c YWCKW 내지 SYRTD,
R5d YWCKW 내지 STLVPL,
R5e YWCKW 내지 GWYWC,
R6a LNQLT 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R6b LNQLT 내지 KRSSK,
R6c LNQLT 내지 SYRTD,
R6d LNQLT 내지 STLVPL,
R6e LNQLT 내지 GWYWC,
R6f LNQLT 내지 YWCKW,
R7a QLFVNEE 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R7b QLFVNEE 내지 KRSSK,
R7c QLFVNEE 내지 SYRTD,
R7d QLFVNEE 내지 STLVPL,
R7e QLFVNEE 내지 GWYWC,
R7f QLFVNEE 내지 YWCKW,
R7g QLFVNEE 내지 LNQLT,
R8a LRKED 내지 pIgR의 카르복시 말단,
R8b LRKED 내지 KRSSK,
R8c LRKED 내지 SYRTD,
R8d LRKED 내지 STLVPL,
R8e LRKED 내지 GWYWC,
R8f LRKED 내지 YWCKW,
R8g LRKED 내지 LNQLT, 및
R8h LRKED 내지 QLFVNEE.
추가의 실시양태에서, 화합물은 또한 제1 표적화 요소와 실질적으로 동일할 수 있는 제2 표적화 요소를 함유할 수 있다. 표적화 요소는 리간드에 대한 결합 부위 (예를 들어, 단량체 sFv로서)를 가질 수 있는 한편, 바람직한 실시양태에서는, 표적화 요소는 2개 내지 4개의 결합 부위를 가지며, 보다 바람직하게는 표적화 요소는 항체, Fab 단편, 단일 쇄 가변성 영역 단편 (sFv) 디아바디로부터 선택된다. 달리, 제2 표적화 요소는 제1 표적화 요소와 상이할 수 있다.
다른 실시양태에서, 표적화 요소는 2개 내지 4개의 단일 쇄 가변성 영역 단편 (sFv)을 가지며, 여기서 각각의 sFv는 경쇄 가변성 도메인에 직접적으로 또는 폴리펩티드 링커를 통해 공유 연결된 중쇄 가변성 도메인을 갖는다. sFv는 치료제와 공유적으로 또는 비공유적으로 결합된다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 sFv는 pIgR에, 및 보다 바람직하게는 pIgR의 비-분비 성분 영역, 및 가장 바람직하게는 pIgR 스톡에 결합한다. 다양한 실시양태에서, 표적화 요소는 모노클로날 항체, 또는 Fab 단편, sFv 단편, 또는 항체의 가변성 영역의 단편을 비롯한 항체의 단편일 수 있다. sFv 항체 단편은 편리하게 이. 콜라이 (E. coli)에서 발현시키고 크로마토크래피 분리에 의해 정제할 수 있다.
관련된 측면에서, 본 발명의 복합체 및 화합물은 추가로 PTD 또는 MTS를 포함한다. "단백질 형질도입 도메인" (PTD) 및 "막 수송 신호" (MTS)는 세포에 의한 단백질 및 다른 폴리펩티드의 취입을 촉진시키거나, 증진시키거나 유도하는 전형적으로 약 10-35개 아미노산 길이의 폴리펩티드이다. PTD는 HIV-TAT, HSV-VP22 및 안테나페디아 (Antenapedia) (페네트라틴의 공급원)로부터 유도되고, 양으로 하전된 아르기닌 (Arg) 및 리신 (Lys) 잔기의 함량이 높은 것을 특징으로 한다. MTS는 막 지질 이층 중 소수성 층으로 분배되는, 분비 신호 서열로부터 유도된 매우 소수성인 펩티드이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기술된 화합물 또는 조성물의 폐 전달을 위해 구성되고 배열된 장치에 관한 것이다. 이러한 장치는 흡입 또는 점적주입에 의한 전달에 적합한 매질에 분산된 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 장치는 연무기 또는 흡입기이다. 이러한 약물의 전달을 위한 장치는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 모든 표, 도면 및 청구의 범위를 비롯한 전문이 본원에 참고로 인용되어 있는 미국 특허 제6,488,027호, 동 제6,453,900호, 동 제6,427,688호, 동 제6,427,683호, 동 제6,415,784호, 동 제6,338,443호, 동 제6,076,519호, 동 제5,906,198호, 및 동 제5,653,223호를 참조한다.
상기한 본 발명의 요약은 비제한적이며, 다른 본 발명의 도면 및 이점은 바람직한 실시양태의 하기 상세한 설명 뿐만 아니라, 청구의 범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 sFv 도메인 구조, 및 이량체 "디아바디" 구조를 형성하는 sFv들 사이의 상호작용의 모델의 도식도를 제공한다.
도 2는 시아노 원숭이에서의 이량체 sFv 디아바디의 기관내 점적주입 (프로테아제 억제제 1 mg/kg)에 의해 수득된 sFv의 혈장 농도의 도표도를 제공한다.
도 3은 사이노몰구스 원숭이로의 에어로졸 전달에 의해 수득된 sFv의 혈장 농도를 75％ 1회 호흡량 및 40％ 폐활량 흡기 후 시간의 함수로서 제공한다.
도 4는 에어로졸, 점적주입, 및 IV 전달 경로에 의해 수득된 sFv의 혈장 농도의 비교를 전달 후 시간의 함수로서 제공한다.
도 5는 예시적인 pIgR-결합 sFv의 코딩 서열 (APL10)을 도시한다.
도 6는 예시적인 pIgR-결합 sFv-II-2 융합 단백질의 코딩 서열을 도시한다.
도 7은 예시적인 IL-2-sFv 발현 작제물의 맵을 제공한다.
재조합 인간 시토킨 및 케모킨은 주로, 그러나 비배제적으로 면역계에서 다양한 세포 기능의 강력한 조절인자이다. 결과로서, 이들은 암 및 감염 질환의 관리에 대해 매력있는 접근법을 제공한다. 이들 시토킨 중 최선으로 개발되고 가장 빈번하게 사용되는 인터루킨-2 (IL-2)는 임상 실습에서 현재 사용되는 가장 중요한 인터루킨 중 하나이다. 인터루킨-2는 진행성 신 세포 암종, 전이성 악성 흑색종 및 급성 비-림프구성 백혈병을 가진 환자에서 사용된다. 유사하게는, α-인터페론은 모발상 세포 백혈병, AIDS-관련 카포시 육종, 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 방광 암종, 비-호지킨 림프종, 결장직장 암종, 피부 T-세포 림프종, 여포성 림프종, 신 세포 암종 및 악성 흑색종과 같은 종양의 치료에 사용된다.
인터루킨 치료법의 주요 단점은 다기관 독성이다. 전이성 신장 암은 생명-위협적인 질환이며, 인터루킨-2는 이러한 질환을 가진 환자에서 유용하다. 인터루킨-2는 보다 높은 투여량 투여를 사용할 경우에 보다 유효하다. 하지만, 인터루킨-2로 인한 독성은 종종 매우 심각한 문제이다. 인터루킨-2의 투여는 종종 독성 효과를 완화시키기 위한 제제의 공동-투여를 수반한다. 유사하게는, α-인터페론 치료법은 치명적이거나 생명-위협적인 신경정신성, 자가면역, 허혈 및 감염 상태를 유발하거나 악화시킬 수 있다.
여전히 의약적으로 유효한 시토킨 투여량을 제공하면서 상기 독성 부작용을 감소시키는 의약을 투여하는 방식을 갖는 것이 매우 유리할 것이다. 이러한 투여 방식은 치료된 대상체가 시토킨 및 케모킨 치료법, 및 상기 약물을 포함하는 다른 치료법으로부터 이익을 얻으면서 임의의 유해한 영향으로부터 보호되도록 할 것이다. 또한, 이러한 기술은 투여가능한 다른 방식보다 높은 투여량에서도 비독성인 약물을 사용할 수 있도록 확장될 수 있다.
본 발명은 시토킨을 비롯한 치료제의 전달을 위한 다능형 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법을 사용하여 폐 질환에 노출되거나 폐 질환을 가질 수 있는 대상체를 폐 질환의 예방 또는 치료 목적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 폐의 간질성 공간 또는 혈관에서 치료제의 국소적으로 높은 농도를 제공하기 위한 방법을 기술하기 때문에, 본 발명은 바람직하게는 질환 또는 장애가 폐 조직에 확산된 경우에 적용된다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법을 사용하여 속발성 종양의 존재 또는 부재하에 원발성 종양을 갖는 대상체를 속발성 종양의 발현 억제 또는 지연, 기대 수명의 연장 및(또는) 존재하는 원발성 또는 속발성 종양의 크기 감소 목적으로 치료할 수 있다. 본 발명은 폐의 간질성 공간 또는 혈관에서 항-종양제의 국소적으로 높은 농도를 제공하기 위한 방법을 기술하기 때문에, 본 발명은 바람직하게는 원발성 또는 속발성 종양이 폐 종양인 경우에 적용된다. 가장 바람직하게는, 본 발명은 원발성 종양이 신 세포 암종인 경우에 적용된다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 폐가, 예를 들어, 결핵, 또는 바이러스 감염, 예컨대 SARS를 유발하는 박테리아에 감염된 경우에 적용된다.
본 발명은 또한 전신 순환에서 치료제의 상당한 생체이용성을 제공할 수 있기 때문에, 본 발명은 또한 폐 이외의 체내의 종양, 및 기도 범위를 넘어서 확산된 전신 감염을 치료하는 방법에서 사용할 수 있다. 상기 방법을 이용하여 혈류내에 치료제를 위치시킬 수 있으며, 이는 종양 또는 감염원이 존재하는 경우에 체내의 다른 부위에 운반된다. 표적화 요소를 사용하여 폐, 비인두, 또는 구인두 상피를 가로지르는 첨단부에서 기저외측으로의 세포전달을 달성할 수 있다. 추가의 표적화 요소는 또한 실제 감염 부위를 표적화할 수 있는 화합물 또는 조성물 상에 존재할 수 있다.
예시적인 폐암 및 전이
하기 암성 상태를 예시 목적으로 제공하지만, 본원에 기술된 방법, 조성물 및 장치를 폐암, 및 다른 기관 또는 조직의 원발성 종양의 폐로의 전이의 치료에 일반적으로 사용할 수 있다.
IV기 전이성 흑색종은 생존 시간이 평균 1년 미만인 일반적으로 치명적인 결과를 갖는 질환이다. 전이성 흑색종에서 특히 통상적인 문제는 IV기 사례의 30-50％에서 발생하는 폐 전이이다. 폐로의 전이는 종종 대상체의 삶의 질을 심각하게 제한하는 호흡 문제를 유발한다. 종래 화학요법을 동반한 전이성 흑색종에서의 IL-2의 폐 전달은, 예컨대, 문헌 [Enk et al., Cancer 88: 2042-46 (2000)]에 개시되어 있다.
신 세포 암종은 미국에서 매년 약 30,000건 진단되는 신장으로부터 발생하는 가장 흔한 종양이다. 신장에 제한된 작은 종양으로서 조기에 진단될 경우에, 이러한 질환은 수술에 의해 치유될 수 있다. 그러나, 신 세포 암종의 대부분의 경우는 보다 이후의 발생 단계까지 진단되지 않으며, 신 암종을 갖는 환자 중 30％가 전이성 질환을 함께 나타낸다. 신 세포 암종을 갖는 환자 중 50％가 조기 단계에 치유되는 반면, IV기 질환에 대한 결과는 불량하다. 롭슨 (Robson) 단계화 시스템을 사용하여 질환의 단계를 기술하며, 다음과 같다:
I기 - 신장 피막 내에 제한된 종양.
II기 - 신장주위 지방에 침윤하였으나 여전히 제로타 근막에 포함된 종양.
III기 - 신정맥 또는 하대정맥에 침윤한 종양 (A), 또는 국소 림프절 침범 (B), 또는 양쪽 (C).
IV기 - 근위 내장 (동측 부신 제외)에 침윤한 종양 또는 원위 전위.
치유 가능성은 종양 전이의 단계 또는 정도에 직접 연관된다. 유효한 치료는 면역요법, 방사선 요법, 또는 특정 경우에 수술을 이용한 환자의 일부에서 증상 및 생존율을 개선시킬 수 있다. 화학요법 약물은 신 세포 암종에 대부분 무효하며, 그 자체로 거의 사용되지 않는다. 한편, 면역요법 약물은 신 세포 암종에 대해 적당한 활성을 나타낸다. 신 세포 암종에 대해 사용된 면역요법 약물은 인터루킨-2, 인터페론-알파, 및 인터페론-감마를 포함한다. 전이성 질환을 가진 선택된 환자는 면역요법에 반응하나, 다수의 환자에게는 단지 완화 치료법만을 제공할 수 있다. 참조예 [Huland et al., J. Urology 147: 344-48 (1992); Huland et al., Cancer J. Sci. Am. 3: S98-S105 (1997); Huland et al., Anticancer Res. 19: 2679-84 (1999).]
폐암은 하나 또는 양쪽 폐에서의 비정상 세포의 비조절된 성장이다. 정상 세포 조직은 재생되어 건강한 폐 조직으로 발육하는 반면, 상기 비정상 세포는 급속하게 재생되나, 정상 폐 조직으로 되지 않는다. 이어서, 암 세포 (종양)의 매스는 형성되고 폐를 파괴하여, 이를 적합하게 기능하기에 곤란하도록 만든다.
폐암 중 87％ 이상이 흡연과 관련되어 있다. 그러나, 모든 흡연자에서 폐암이 발생하는 것은 아니다. 이전 흡연자는 흡연 경험이 없는 사람들보다 폐암에 대해 위험률이 높게 유지되더라도, 금연은 개체의 위험을 상당히 감소시킨다. 다른 발암물질, 예컨대 석면 및 라돈 기체는 또한 특히 궐련 또는 시가 흡연을 겸할 경우에 개체의 위험률을 또한 증가시킨다.
비-소세포 폐암 (NSCLC)은 ELR+ (혈관신생) 및 ELR- (혈관신생정지) CXC 케모킨의 발현에서 불균형을 가져, 혈관신생 및 종양 성장을 촉진한다. ELR+ 케모킨, 예컨대 IL-8은 증가하는 반면, ELR- 케모킨 (I-TAC, IP-10 및 MIG)은 정상 수준을 유지하며, 이는 ELR- 케모킨이 ELR+ 케모킨을 역조절할 수 있는 수준으로 존재하지 않음을 제시한다. 연구자들은 NSCLC를 갖는 SCID 마우스 모델에서의 IP-10 또는 MIG의 투여는 종양 성장을 억제한다는 것을 입증하였다.
예시적인 감염 질환 및 감염원
하기 감염 질환 및 감염원은 예시 목적으로 제공하지만, 본원에 기술된 방법, 조성물 및 장치를 감염 치료에 일반적으로 사용할 수 있다.
미코박테륨 투베르쿨로시스는 대식세포를 감염시키는 세포내 병원체이다. 대부분의 흡입된 바실러스는 활성화된 폐포 대식세포에 의해 파괴된다. 그러나, 생존하는 바실러스는 대식세포에서 배가되어, 세포 괴사시 방출될 수 있으며, 이는 림프구, 단핵구 및 대식세포의 부위로의 침윤을 신호화한다. 바실러스-적재된 대식세포의 용해는 지연형 과민증 (DTH)에 의해 매개되고, 감염된 세포의 부위를 둘러싸고 있는 고형 건락성 결핵결절의 발생을 유발한다. 지속적인 DTH는 결핵결절을 액화시키고, 이에 의해 포획된 바실러스를 방출시킨다. 세포외 바실러스의 고투여량은 추가의 DTH를 유도하고, 이에 의해 기관지 손상 및 림프성, 혈행성 및 기관지성 경로에 의한 전이를 유발하고, 결국에는 감염성 바실러스를 호흡에 의해 전파되도록 한다.
TB를 치료하기 위해 사용되는 항-감염제는, 예를 들어, 이소니아지드, 리팜핀, 피라진아미드, 에탐부톨 및 스트렙토마이신을 포함한다. 예방화학요법은 고도로 유효하고 일반적으로 성인의 경우 6 내지 9개월 동안 300 mg/일 투여량의 이소니아지드로 구성된다. 유아의 경우에, 투여량은 단일 아침 투여량으로서 제공된 10 mg/kg/일, 300 mg까지이다.
슈도모나스 아에루기노사는 만성 호흡기 감염을 유발하고, 낭포성 섬유증 (CF)에서의 높은 이환율 및 사망률의 주요 원인이다. 초기에 콜로니화된 피. 아에루기노사 균주는 비점액성이나, CF 환자의 폐에서 이들은 점액을 생산하기 시작하고, 이는 공격적 항균 요법하에서도 환자가 감염을 제거할 수 없도록 한다. 피. 아에루기노사의 점액 형태의 출현은 추가의 질환 악화 및 불량한 예후와 관련된다. 피. 아에루기노사는 또한 중환자실에서의 감염의 두번째로 가장 흔한 원인 및 폐렴의 빈번한 원인이다. HIV-감염된 환자는 또한 위험한 상태이다.
티카르실린, 피페라실린, 메즐로실린 및 아즐로실린을 비롯한 여러 페니실린은 슈도모나스에 대해 활성이다. 다른 항-감염제는, 예를 들어, 세프타지딤, 세페핌, 아즈트레오남, 이미페넴, 메로페넴 및 시프로플록사신을 포함한다. 티카르실린은 가장 종종 16 내지 20 g/일 IV의 투여량으로 사용된다. 피페라실린, 아즐로실린, 세페핌, 세프타지딤, 메로페넴 및 이미페넴은 티카르실린에 내성인 특정 균주에 대해 시험관내에서 활성이다.
탄저병의 원인균인 바실러스 안트라시스 (Bacillus anthracis)는 그람-양성이고 조건적 혐기성이며 캡슐로 싸여있는 막대형의 큰 미생물이다. 이는 포자를 형성함으로써 살균제 및 열에 의한 파괴에 내성을 나타내어, 토양 및 동물 산물에서 수십년 동안 생존할 수 있다. 인간 감염은 대체로 피부를 통해 일어나고, 드물게는 GI관을 통해 일어나며, 포자를 흡입하면 잠재적으로 생명을 앗아갈 수 있는 폐 탄저병에 걸리게 된다.
배양물 여액으로 구성된 탄저병 백신은 탄저병에 걸릴 위험성이 높은 사람들 (군인, 수의사, 실험실 기술자, 수입 염소털을 가공하는 직물 제작소의 피고용인)에게 입수 가능하다. 확실한 보호를 위해 반복된 백신 접종이 필요할 수 있으며, 백신 그 자체에 대한 국소 반응이 발생할 수 있다.
대부분의 탄저병 균주는 페니실린에 감수성이 있다. 그러나, 이 유기체에는 종종 유도가능한 베타-락타마제가 나타나기 때문에 페니실린 또는 세팔로스포린의 단일-약물 요법은 권장되지 않는다. 노출시 예방을 위해서는 경구용 시프로플록사신 500 mg (1일 2회) 또는 독시시클린 100 mg (60일 동안 1일 2회), 또는 아목시실린 500 mg (1일 3회)이 필요하다. 베타-락타마제 내성의 유도는 예방 용도에 있어 존재하는 유기체의 수가 적어 덜 중요하다. 폐 탄저병은 대개 생명을 앗아가지만, 조기에 치료하고 폐 및 순환계를 철저하게 지지해주면 생존도 가능하다. 코르티코스테로이드가 유용할 수 있지만, 적당한 것으로 평가되지 않았다.
폐렴은 매우 다양한 박테리아, 바이러스, 진균류, 및 기도를 감염시키는 다른 유형의 유기체에 의해 발병하는 증상이다. 감염원은 구강을 통해 들어갈 수 있고, 호흡하는 동안에 폐에 도달할 수 있다. 흡연은 기도 내부의 섬모를 손상시키기 때문에 폐렴의 원인이 된다. 영양 실조, 또는 신장 기능부전이나 겸상 적혈구 질환과 같은 증상도 폐렴 유발 미생물을 제거하는 폐의 기능을 손상시킬 수 있다. 더욱이, 상부 기도의 바이러스 감염은 보호성 섬모를 손상시킴으로써 폐렴에 걸리기 쉽게 할 수 있다.
12세 이하의 어린이 중에서, 폐렴의 가장 빈번한 원인은 뉴모코쿠스 (pneurnococcus) 박테리아이다. 청년기 및 젊은 성인 중에서, 가장 빈번한 감염원은 미코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)라 불리우는 박테리아-유사 미생물이다.
박테리아성 폐렴은 또한 인플루엔자 A의 합병증을 수반하며, 2차 감염은 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 또는 (가장 심각하게는) 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)에 의해 가장 빈번하게 발생한다.
하기 표는 각종 폐렴과 관련된 유기체를 제시한다.
박테리아 바이러스
스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 인플루엔자
스트렙토코쿠스 피오제네스(Streptococcus pyogenes) (Grp A) 파라인플루엔자
스트렙토코쿠스 아갈락티아(Streptococcus agalactie) (Grp B) 시토메갈로바이러스
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 아데노바이러스
바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis) 엡스타인-바 바이러스
기타 바실러스 (Bacillus) 종 헤르페스 심플렉스 바이러스
노카르디아 (Nocardia) 종 바리셀라-조스터
엔테로박테리아과 콕사키에바이러스
슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 홍역
아시네토박터 (Acinetobacter) 종 리노바이러스
부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei) 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus)
부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei) 진균류
예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 아스페르길루스 (Aspergillus) 종
프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 무코랄레스 (Mucorales) 종
헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenzae) 칸디다 (Candida) 종
보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis) 히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)
네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis) 블라스토미세스 데르마티티디스(Blastonayces dermatitidis)
레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)
레지오넬라-유사 박테리아 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis)
박테로이데스 멜라니노제니쿠스(Bacteroides melaninogenicus) 파라콕시디오이데스 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)
푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 뉴모시스티스 카리니이(Pneumocystis carinii)
펩토스트렙토코쿠스 (Peptostreptococcus) 종 기생충 - 원충류
펩토코쿠스 (Peptococcus) 종 플라즈모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)
악티노미세스 (Actinomyces) 종 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica)
미코박테륨 투베르쿨로시스 톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii)
기타 미코박테륨 (Mycobacterium) 종 레이슈마니아 도노바니(Leishmania donovani)
미코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma neumoniae) 기생충 - 선충류
브라나멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis) 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides)
클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 톡소카라 (Toxocara) 종
클라미디아 프시타시(Chlamydia psittaci) 안시클로스토마 두오데날레(Ancyclostoma duodenale)
클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumoniae) 기생충 - 촌충류
콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii) 에치노코쿠스 그라눌로수스(Echinococcus granulosus)
피코르나바이러스, 특히 리노바이러스 및 특정 에코바이러스 및 콕사키에바이러스는 급성이며 대체로 비발열성인 바이러스 기도 감염으로서 정의되는 감기를 유발하며, 이 경우 코, 부비동 (paranasal sinuses), 인후, 후두, 및 종종 기관 및 기관지를 비롯한 기도의 모든 또는 어느 일부에서 염증이 나타난다.
면역성은 혈청형 또는 균주에 의해 바이러스에 대해 특이적이기 때문에, 한 균주에 대한 면역성이 다른 균주로의 후속 감염에 대해 보호하지는 못한다. 몇몇 리노바이러스, 아데노바이러스 및 파라믹소바이러스에 대해 효과적인 실험 백신이 개발되기는 했지만, 상업용 백신은 아직 입수할 수 없다. 예방성 인터페론은, 천식 또는 기관지염과 같은 감기로부터의 다른 합병증으로 인한 질병 상태의 위험에 처해 있는 환자에게 치료 가능성을 제공한다. 비강내 투여된 인터페론-알파는 리노바이러스 또는 코로나바이러스의 감염을 제한하여 바이러스 유입을 감소시키지만, 장기간의 노출 후에는 출혈을 동반한 비강 염증을 유발할 수 있다.
인플루엔자 바이러스 (오르토믹소바이러스)는 인플루엔자를 유발하며, 이는 발열, 코감기, 기침, 두통, 불쾌감, 및 염증성 호흡기 점막을 유발하는 바이러스인 인플루엔자로의 급성 바이러스 호흡기 감염으로 정의된다. 인플루엔자는 온대성 기후 지역에서 매년 가을과 겨울 동안에 광범위한 산발성 호흡기 질병을 유발하며, 이 질병은 대체로 단일 혈청형 전염병에 초점이 맞춰져 있고, 가장 흔하게는 인플루엔자 A (H3N2) 바이러스에 의해 유발된다. 인플루엔자 B 바이러스는 전형적으로 경증 호흡기 질환을 유발하지만, 전염 동안에 심각한 질병 상태 및 사망을 초래할 수도 있다.
자연 감염 또는 면역화에 의한 인플루엔자 바이러스에의 노출은 일시적으로 동일한 바이러스 유형으로의 재감염에 대한 내성을 초래한다. 유행하는 인플루엔자 바이러스 균주를 포함하는 백신은, 면역화 및 감염 균주의 HA 및(또는) NA가 매치되는 경우에 백신 접종을 받은 사람들에게서 감염 발생율을 감소시킨다. 인플루엔자 A형에 대한 항-감염제에는 아만타딘 및 리만타딘이 있으며, 이는 100 mg을 1일 2회 경구 투여한다. 아만타딘 및 리만타딘은 신경 과민, 불면증 또는 기타 CNS 부작용을 유발할 수 있으며, 약물 내성이 빈번하게 발생한다.
최근, 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)이 새로운 코로나바이러스인 SARS-CoV와 관련성이 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 새로운 코로나바이러스가 SARS의 병인성 물질이라는 강력한 증거가 있기는 하지만, 몇몇 SARS의 경우에 다른 병원체가 역할을 할 수도 있다.
질환 제어 및 예방 센터 (Centers for Disease Control and Prevention)에서는 현재 SARS 환자로 하여금 중증 집단-획득 비정형 폐렴 (serious community-acquired atypical pneumonia)에 걸린 임의의 환자들에게 이용될 수 있는 치료와 동일한 치료를 받도록 권장하고 있다. 현재, 가장 효능있는 어떠한 치료 처방도 알려져 있지 않다. 몇몇 지역에서는 치료법에 오셀타미비르 또는 리바비린과 같은 항바이러스제가 포함되었다. 또한, 스테로이드도 리바비린 및 기타 항미생물제와 함께 환자에게 경구 또는 정맥내 투여되었다. 그러나, 제어된 임상 시험이 없어서, 이러한 처방의 효능은 미지의 상태로 남아 있다. 초기 실험 정보에서는 리바비린이 시험된 새로운 코로나바이러스의 한 단리물의 세포-대-세포 유포 또는 바이러스 증식을 억제하지 못함을 시사하고 있다. 효과적인 치료법이 발견될 수 있는지의 여부를 파악하기 위해 리바비린 및 기타 항바이러스 약물에 대한 추가의 시험을 수행하고 있다.
파라인플루엔자 바이러스는 파라믹소바이러스 1, 2, 3 및 4형이고, 이들은 감기에서부터 인플루엔자-유사 폐렴에 이르는 다수의 다양한 호흡기 질병 (가장 공통적인 급성 징후가 발열성 후두염임)을 유발하는 밀접한 관련성의 바이러스이다.
아데노바이러스는 다수의 바이러스로 이루어진 군이며, 이들 중 몇몇은 호흡기와 안구 점막의 염증, 및 피하 및 국부 림프 조직의 비대라는 특징이 있는 급성 발열 질병을 유발한다. 급성 발열 호흡기 질환은 어린이에게서 아데노바이러스 감염의 전조가 되는 통상적인 징후이다. 급성 호흡기 질환 (ARD)으로 명명된 증후군은 군대 징병 기간 동안에 신병에게서 관찰되었다.
살아 있는 아데노바이러스 4 및 7형을 함유하는 백신은 군대 집단에서 ARD를 현저하게 감소시켰지만, 이는 일반인에게 권장할만 하지도 않고 일반인이 입수할 수도 없다. 다른 몇몇 혈청형의 백신이 개발되었으나, 상업적으로 시판되지는 않는다.
특별한 부류의 대상체, 구체적으로 폐 이식을 받은 대상체는 다수의 추가 감염원에 노출된다. 시토메갈로바이러스가 가장 통상적인 바이러스 감염이며, 질병 상태의 주요 원인이다. 아데노바이러스 감염도 보고된 바 있는데, 이는 급성 기관지염/세기관지염으로 나타나 폐포 손상을 확산시킨다. 엡스타인 바 바이러스는 단핵구증-유사 증후군으로부터 이식후 림프증식성 질병에 이르는 다양한 징후를 나타낸다. 뉴모시스티스 카리니이 (Pneumocystis carinii) 폐렴은 종종 세포성 면역능의 저하로 인해 발생한다. 기타 갖가지 감염으로는 아스페르길루스증을 모방하는 슈달러스케리아 보이디이 (Pseudallerscheria boydii); 기관지폐렴, 농양 형성, 공간형성 및 농흉을 비롯한 징후를 나타내는 노카르디아 (nocardia); 레지오넬라 뉴모니아 (Legionella pneumonia); 및 톡소플라즈마 곤디이 (Toxoplasma gondii)가 있다.
기타 예시적 폐 질병
천식은 기도가 차단되거나 좁아지는 소기도 (small airway)의 만성 염증성 질환이다. 이러한 효과는 대체로 일시적이며 가역적이지만, 숨이 차는 현상, 호흡 곤란 및 기타 증상을 유발한다. 천식 에피소드는 환경에 존재하는 요소에 의해 촉발된다. 이러한 촉발 요소는 개인별로 다르지만, 공통적인 것으로는 찬 공기; 운동; 먼지 진드기, 곰팡이, 화분, 동물 비듬 또는 바퀴벌레 잔해와 같은 알레르기원; 및 몇몇 유형의 바이러스 감염이 있다.
기도가 천식 촉발 요소와 접촉하는 경우, 기관지 및 세기관지 내부의 조직에 염증이 생긴다. 동시에, 기도 바깥쪽의 근육이 수축하여 기도를 좁아지게 한다. 점도가 높은 유체 (점액)가 기도에 유입되면 기도가 팽창한다. 호흡 통로가 더욱 더 좁아져서, 호흡이 어려워진다.
천식 발병은 Th2 및 호산구의 작용에 따른 것이다. 천식의 특징으로는 점막하 조직의 단핵세포, 호산구 및 비만세포 침윤, 및 섬유증 및 신생혈관형성을 비롯한 점막하 리모델링이 있다. 상부 기도 바이러스 감염은 어린이의 경우 천식 악화의 80％와 관련이 있었고, 성인의 경우 모든 천식 에피소드의 50％와 관련이 있었다. 인간 리노바이러스는 천식 에피소드와 관련된 가장 통상적인 바이러스로서 연루되었다. 논쟁의 여지가 있는 주제이기는 하지만, 바이러스는 천식의 진전에 소정의 역할을 할 수 있다. 일반적으로, 질환 악화는 알레르기성인 자극으로부터 비롯된다.
케모킨, 특히 에오탁신 및 단핵구 화학유인 단백질은 효능있는 호산구 화학유인물질 및 히스타민 방출 인자이며, 따라서 이들은 알레르기성 염증의 생성에 특히 중요하다. 사실상, 이들 케모킨은 항원 및 IgE 항체의 부재시 주요 히스타민-방출 인자일 수 있다. Th2 세포는 IgE의 생성, 및 비만세포, 호염기구 및 호산구 (알레르기 반응의 1차적인 작용물질)의 증식 및 분화를 조절한다.
현행 치료법은 기관지 확장제, 항-염증성 의약 (항-류코트리엔 포함) 및, 최근에는 항-IgE 치료를 포함한다. 기관지 확장제는 공기 튜브에서 근육을 이완시킴으로써 천식을 완화시킨다. 항-염증성 의약은 공기 튜브를 열린 상태로 유지하여 천식 발병을 예방한다. IgE에 결합한 알레르기원은 알레르기 반응을 생성하는 화학 매개체 (히스타민, 류코트리엔 및 프로스타글란딘)를 방출하는 비만세포 및 호염기구를 활성화시킨다. IgE에 결합함으로써 이를 격리시키는 항-IgE 항체를 사용하면, IgE가 비만세포 및 호염기구에 결합하는 것을 방해하여 알레르기 반응의 감소를 돕는다.
만성 폐색성 폐 질환 (COPD)은 공기증 및 만성 기관지염과 관련된 공기 흐름 방해를 설명하기 위해 사용되는 포괄적인 용어이다. 공기증은 폐 내에서 공기 주머니를 약하게 하거나 파괴시킴으로써 비가역적인 폐 손상을 유발한다. 폐 조직의 탄성이 상실되어, 기도가 허탈(collapse)되고 공기 흐름이 방해되는 현상이 발생한다. 만성 기관지염은 폐 내의 소기도에서 시작되어 점차적으로 대기도로 진행되는 염증성 질환이다. 이는 기도 내에 점액을 증가시키고 기관지에서 박테리아 감염을 증가시켜 공기 흐름을 방해한다.
COPD는 폐가 산소를 흡수하고 이산화탄소를 제거하는 능력을 감소시킨다. 이 질환이 진행됨에 따라, 소기도의 벽 및 폐포는 탄성을 상실하게 된다. 기도 벽이 허탈되어, 소기도 통로 중 일부가 닫히게 되고 대기도가 좁아진다. 공기 흡입으로 폐가 확장될 때 공기는 계속 폐포에 도달하지만, 공기 통로가 호기(呼氣) 동안에 허탈되어 폐에 "퀴퀴한 (stale)" 공기가 포획되는 경향이 있기 때문에, 종종 호기 동안에 공기가 빠져나오지 못하는 경우가 있다.
COPD의 악화는 질병 상태 및 사망의 주요 원인이다. COPD 악화에 대한 공통적인 병인학적 인자는 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 오염물질이다. COPD 환자에서의 공기 폐색은 이 개체가 보다 쉽게 감염되도록 할 수 있다. COPD가 악화된 COPD 환자 중 대략 50％가 박테리아에도 감염되어 있다. 가장 통상적인 박테리아 감염은 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae)에 의한 것이다. 바이러스 감염은 병이 악화된 입원 환자 중 23 내지 45％ (겨울에는 더 많음)와 관련이 있다. 또한, 박테리아 감염은 안정한 COPD 환자에도 존재하지만, 이는 병이 악화된 환자에서 약 2배만큼 더 흔하다. 환자는 항생제로 치료했을 때, 특히 대부분의 증상을 갖는 것으로 치료했을 때 보다 신속하게 개선되는 것으로 입증되었다.
장기 흡연이 COPD의 가장 흔한 원인이다. 이는 모든 병례의 80 내지 90％를 차지한다. 흡연자는 비흡연자에 비해 COPD로 인한 사망 가능성이 10배 더 높다. COPD의 징후로는 만성 기침, 흉부 압박, 숨이 차는 현상, 호흡을 위한 노력 증가, 점액 생성 증가, 및 빈번한 헛기침이 있다.
COPD의 임상적 발달은 전형적으로 미국 흉부 학회 (American Thoracic Society)에 의해 정의된 3단계로 기재된다.
1 단계 : 폐 기능 (FEV1 또는 1초에 내쉰 호흡 부피를 측정함)이 예상된 정상 폐 기능의 50％ 이상이다. 건강과 관련한 삶의 질에 극미한 영향만 있다. 이 단계 동안에 증상이 진전될 수 있으며, 환자는 심각한 호흡 곤란 경험을 시작하여 폐 전문의에 의한 평가가 필요할 수 있다.
2 단계 : FEV1 폐 기능이 예상된 정상 폐 기능의 35 내지 49％이며, 건강과 관련한 삶의 질에 상당한 영향이 있다.
3 단계 : FEV1 폐 기능이 예상된 정상 폐 기능의 35％ 미만이며, 건강과 관련한 삶의 질에 심각한 영향이 있다.
흡연 금단현상 이외에, 질환의 중증도에 따라, 치료법은 폐에서 공기 통로를 개방시키는 기관지 확장제, 항-염증성 의약, 항생제, 점액 분비물의 배출을 돕는 거담제, 및 근육 강화 운동을 포함할 수 있다. COPD 환자는 궁극적으로 산소 공급이 필요할 수 있으며, 질환의 마지막 단계에는 기계적 호흡 보조장치에 의존해야만 할 수 있다.
또한, 다른 의약이 COPD와 관련된 증상의 관리를 위해 처방될 수 있다. 여기에는, 우측 심장 기능부전 (몇몇 COPD 환자에서 발생할 수 있음)과 관련된 과량의 수분 체류를 피하기 위한 요법으로서 제공되는 이뇨제; 심장박동의 힘을 강화시키는 강심제 (대체로 디작신 (digoxin)의 형태)가 포함될 수 있다. 이는 COPD 환자에서 주의하여 사용되어야 하고, 특히 혈액의 산소압이 낮은 경우에 주의해야 하는데, 이는 이러한 약물 (호흡을 어느 정도 감소시키기 때문에 주의해서 사용해야 하는 진통제, 기침 억제제 및 수면제)을 섭취했을 때 부정맥 상태가 되기 쉽기 때문이다.
폐 이식은 그 수행 회수가 증가하고 있고, 중증 기종을 앓고 있는 사람에게 선택사항일 수 있다. 또한, 폐 용적 감소 수술은 장래성이 입증되었고, 그 수행 빈도수가 증가하고 있다. 그러나, 최근 연구 결과, 호흡시 가스 교환 능력이 제한되거나 폐 전반에 고르게 손상이 분포하는 중증 폐 폐색을 앓고 있는 기종 환자가 상기 시술에 의해 사망할 위험성이 높은 것으로 밝혀졌다.
치료제의 폐 전달 증진
상기와 같은 질환을 앓고 있는 대상체에서 치료제를 폐에 전달하는 것은 폐 시스템 내부의 극성화된 상피에 의해 제공되는 장벽에 의해 제한된다. 그러한 상피 세포는 "극성화된" 것이라고 언급되는데, 즉 이 상피 세포는 독특한 수송 및 투과 특성을 지닌 표면으로 인해 자신이 분리하고 있는 구획들 사이에 구배를 형성할 수 있다 (검토를 위해서는 문헌 [Knust, Curr. Op. Genet. Develop. 10:471-475, 2000], [Matter, Curr. Op. Genet. Develop. 10:R39-R42, 2000], [Yeaman et al., Physiol. Rev. 79:73-98, 1999] 참조).
치료 분자, 진단 분자, 예방 분자 또는 영상화 분자를 극성화된 세포 내로 및(또는) 극성화된 세포를 통해 전달하기 위해 개조된 조성물, 및 분자를 전반적인 순환계로 전달하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법이 기재되었다. 예를 들어, 모든 표, 도면 및 청구항을 비롯하여 그 전문이 본원에 포함되는 국제 특허 공개 WO02/28408호를 참조할 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 치료 분자, 진단 분자, 예방 분자 또는 영상화 분자를, 상피 세포 표면에서 발현되어 이 세포 내로의 또는 세포를 가로지른 수송을 매개하는 분자에 대한 표적화 요소와 결합시키는 것을 포함한다. 다수의 분자가 이 분자를 세포 표면으로의 또는 세포 표면으로부터의 수송을 매개하는 성분과 결합함으로써 생물학적 시스템으로 유입 또는 유출되는 것으로 알려져 있다. 그러한 분자의 예로는 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 슈도모나스 독소, 콜레라 독소, 리신 (ricin), 아브린 (abrin), 콘카나발린 A; 특정 바이러스 (라우스 육종 바이러스, 아데노바이러스 등); 트랜스페린; 저밀도 지단백질; 트랜스코발라민 (비타민 B12); 호르몬 및 성장 인자, 예컨대 인슐린, 상피 성장 인자, 성장 호르몬, 갑상선 자극 인자, 칼시토닌, 글루카곤, 프로락틴, 황체 호르몬, 갑상선 호르몬, 혈소판 유래 성장 인자, 및 VEGF; 및 항체, 예컨대 IgA 및 IgM이 있다.
본 발명에서 표적 잔기에 의해 표적화될 리간드로 사용하기에 특히 바람직한 세포 표면 성분으로는 수용체, 예컨대 pIgR, 스캐빈저 수용체, GPI-연결 단백질, 트랜스페린 수용체, 비타민 B12 수용체, FcRn, 인테그린, 저밀도 지단백질 수용체; pIgR 스톡과 같은 카르고(cargo) 담체 단편, PGDF, FGF 및 VEGF 수용체 패밀리의 구성원(예컨대, Flt-1, Flk-1, Flt-4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4) 및 표면 항원이 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 이와 같이 상기 성분을 나열한 것은 이를 한정하려는 의미가 아니다. 다른 바람직한 수용체로는 스캐빈저 수용체(예컨대, CLA-I/SR-B1, CD-36, 내인성 인자, 쿠빌린(cubilin), 메갈린(megalin), GP 330), p75NTR(뉴로트로핀(Neurotrophin) 수용체), 렙틴(Leptin) 수용체, TGF-β 수용체, TGF β 수용체 II, 환원된 폴레이트 담체, 만노스-6-포스페이트 수용체, CaR(칼슘 수용체), A2b 아데노신 수용체, IGF-I 수용체, IGF-II 수용체, 에브네린(ebnerin)(미각), 67 kD 라미닌 수용체, 라미닌 수용체 전구체(LRP), TGF-β 수용체 III, 트랜스코발라민 수용체, HGF-SF(간세포 증식 인자/확산 인자, c-met) 수용체, CD4 수용체, TGF-β I 수용체, c-erbB(EGF 수용체), ASGP-R(아시알로당단백질 수용체), LRP(저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질) 수용체, CFTR(세포 섬유형성 막횡단 전도성 조절자), 수크로스 이소말타제, 독소, 바이러스 및 박테리아 수용체(예컨대, GM1 강글리오시드(콜레라 독소), 갈락토실 세라마이드(HIV), 탄저병 보호 항원 수용체, CD 46(홍역), 85 kD CSL 수용체(크립토스포리듐), GD1b(이. 콜라이 제II형 온도 민감성 장내 독소(LTIIa)), GC-C 구아닐릴 시클라제(이. 콜라이 열 안정성 장내 독소(STa)), 잠복기 간염 A 수용체, 톨(Toll)-유사 수용체 5(TLR5)), 수송자/교환자(예컨대, PepT1, ENaC(나트륨), GLUT-5, SGLT-1, CaT1(칼슘), EcaC(칼슘), NHE 3(Na+/H+ 교환자)), 아포지단백질(예컨대, 아포지단백질 A1, A2, A3, A4, A5, B, C1, C2, C3, C4, D 및(또는) E), 아쿠아포린, 고밀도 지단백질 결합 단백질(예컨대, ATP 결합 카세트 단백질-1, 스캐빈저 수용체-BI), 바이러스 수용체(예컨대, 콕스사키(coxsakie) 아데노바이러스 수용체, αv 인테그린, 시알산-함유 당단백질, CD4) 및 프로테아제(예컨대, 에피텔리아신, 아미노펩티다제 N, 디펩티딜펩티다제)가 있다.
pIgR 및 pIgR 단편의 예시 표적화
pIgR 분자는 다음과 같이 정의된 구조 및 기능적으로 구분되는 영역을 여러개 포함한다. pIgR 분자는 기저외측 측면 상에서 중합체성 이뮤노글로불린(IgA 또는 IgM)과 결합한 후에 이 이뮤노글로불린을 첨단부 측면으로 수송한다. pIgR은 SC와 스톡 사이의 상피 세포 첨단부 측면 상에서 단백질가수분해에 의해 절단되며, 이 때 SC는 이뮤노글로불린과 결합된 상태로 남아있어 이 이뮤노글로불린을 보호하고, 스톡은 첨단부 막 결합된 상태로 남아있게 된다(문헌 ["Mucosal Immunoglobulins" by Mestecky et al., in: Mucosoal Immunology, edited by P. L. Ogra, M. E. Lamm, J. Bienenstock, and J. R. McGhee, Academic Press, 1999] 참조). 세포의 첨단부 측면 상에 진열된 "스톡"에 결합된 화합물 및 조성물은 역방향 세포전달, 즉 세포의 첨단부 측면으로부터 그의 기저외측 측면으로의 정방향 세포전달과는 반대 방향인 세포전달을 수행할 수 있다. 역방향 세포전달에서, pIgR 분자 또는 그의 부분은 기관의 관강을 연결하는 세포의 첨단부 표면으로부터 이 세포의 기저외측 표면으로 이동한다. 예컨대, 미국 특허 제6,072,041호(그의 모든 표, 도면 및 청구항을 비롯한 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함)를 참조한다.
여러 종으로부터 유래한 pIgR 분자의 세포외 도메인 1 내지 6이 문헌 [Piskurich et al., J. Immunol. 154: 1735-1747, 1995]의 도 3에 기재되어 있다. 토끼 pIgR에서, 도메인 2 및 3은 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 결실되기도 하는 단일 엑손에 의해 코딩된다. 막횡단 도메인도 세포내 도메인으로서 pIgR에 존재한다. 세포내 도메인은 세포전달 및 세포내이입에 대한 신호를 함유한다. 본 개시문에서 특히 관심있는 pIgR 분자의 도메인으로는 도메인 5, 도메인 6, B 영역, 스톡, 막횡단 도메인, 분비 성분 및 세포내 도메인이 있지만, 이들로 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "스톡"은 pIgR로부터 유래된 아미노산 서열 갖지만, 분비 성분으로부터 유래된 아미노산 서열은 포함하지 않는 분자를 나타낸다. 스톡 분자는, 첨단부가 단백질가수분해에 의한 절단될 필요가 있으며, 이러한 절단이 발생했을 경우 절단 후에도 첨단부 막에 결합된 상태로 남아있는 pIgR 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 스톡 분자는 자신과 결합되어 있는 리간드에게 1종 이상의 세포전달 특성을 부여한다. 자신과 결합되어 있는 화합물 또는 조성물에게 첨단부로부터 기저외측 방향으로의 세포전달 능력을 부여하는 스톡 분자가 가장 바람직하다.
놀랍게도, 세포의 첨단부 측면 상에 진열된 정방향(즉, 기저외측에서 첨단부 방향) 세포전달을 매개하는 분자에 결합된 화합물 또는 조성물이 역방향 세포전달, 즉 정방향 세포전달과는 반대 방향(즉, 세포의 첨단부 측면으로부터 그의 기저외측 측면으로의 방향)으로 세포전달을 수행할 수 있었다. 역방향 세포전달에서, pIgR 분자 또는 그의 부분은 기관의 관강을 연결하는 세포의 첨단부 표면으로부터 이 세포의 기저외측 표면으로 이동한다. pIgR-매개된 역방향 세포전달은 제제를 관강(예컨대, 장 내부 또는 폐의 기도)으로부터 세포간 공간, 순환계, 또는 예컨대 림프계, 유리액, 혈액, 뇌척수액 등(이들로 한정되지 않음)을 비롯한 일부 다른 내부계, 기관, 조직신체의 일부 또는 체액으로 전달하는 데 사용할 수 있다. 역방향 세포전달을 수행하는 pIgR의 부분에 결합하는 요소를 갖는 화합물 또는 조성물은, 그 자체가 pIgR 스톡과 관련되어 있기 때문에, 세포의 기저외측 측면으로 운반될 수 있으며, 여기서 상기 화합물 또는 조성물은 세포간 공간, 혈류 등과 접촉하거나 세포간 공간, 혈류로 방출된다(예컨대, 2000년 4월 23일 출원된 미국 가출원 제60/199,423호, 제목 ["Compositions Comprising Carriers and Transportable Complexes"]; 2000년 3월 27일에 출원된 PCT/US01/09699, 제목 ["Ligands Directed to the Non-Secretary Component, Non-Stalk Region of pIgR and Methods of Use Thereof"]; 2001년 10월 10일에 출원된 PCT/US01/30832, 제목 ["Compositions and Methods for Identifying, Characterizing, Optimizing and Using Ligands to Transcytotic Molecules"]; 2001년 10월 2일에 출원된 미국 특허 출원 제09/969,748호; 2002년 4월 2일에 출원된 미국 특허 출원 제60/369,548호; 및 2003년 1월 9일에 출원된 미국 출원 제60/439,372호(Atty Docket No. 057220-2401)(상기 각 문헌은 모든 표, 도면 및 청구항을 비롯한 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함) 참조).
바람직한 표적화 요소
바람직한 표적화 요소로는 상피 세포 표면 분자로 유도되는 항체, 단일 쇄 가변성 영역 단편, Fab, Fab' 등을 비롯한 이뮤노글로불린 및 이뮤노글로불린-유사 폴리펩티드가 있다. 야생형 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄, 즉 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 갖는다. 두 가지 유형의 폴리펩티드 쇄는 동일군의 항체(즉, IgA, IgM 등)에서 변화하지 않거나 최소한으로 변화하는 불변성 영역, 및 가변성 영역을 갖는다. 하기 설명한 바와 같이, 가변성 영역은 특정 항체에 대해 독특하고, 에피토프 인지 요소를 포함한다.
항체의 경쇄 각각은 하나의 중쇄와 연관되어 있으며, 이 2개의 쇄는 항원 결합 도메인의 일부분을 구성하는 각 쇄의 아미노 말단 영역으로부터 멀리 떨어져 있는, 각 쇄의 카르복시-말단 영역의 시스테인 잔기 사이에 형성된 디술피드 가교에 의해 연결되어 있다. 항체 분자는 중쇄와 경쇄 사이에 디술피드 가교가 형성된 위치보다 중쇄의 카르복시 말단 위치에 더 가까운, 힌지(hinge) 영역으로 공지된 영역의 2개의 중쇄 사이에 형성된 디술피드 가교에 의해 추가로 안정화된다. 또한, 힌지 영역은 항체의 항원-결합 부분에 대한 가요성(flexibility)을 제공한다.
폴리클로날 항체는 다수의 에피토프를 갖는 단백질에 대한 면역 반응에서 생성된다. 따라서, 폴리클로날 항체의 조성물은 단백질 내에서 동일한 및 상이한 에피토프로 유도되는 다수의 상이한 항체를 포함한다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-37 to 11-41] 참조).
단일특이적 항체(항펩티드 항체로도 공지되어 있음)는 단리된 에피토프가 유래되는 단백질의 몇몇(바람직하게는, 1개) 단리된 에피토프에 상응하는 짧은(통상적으로, 5 내지 20개의 아미노산 길이) 면역 폴리펩티드에 대한 체액 반응에서 생성된다. 다수의 단일특이적 항체는 단백질의 특이적 부분, 즉 에피토프를 하나 이상, 바람직하게는 하나만 함유하는 아미노산 서열로 유도되는 다른 항체들을 다수 포함한다. 단일특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Cooper et al., Section III of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-42 to 11-46] 참조).
모노클로날 항체는 면역 단백질의 단일 특이적 에피토프를 인지하는 특이적 항체이다. 모노클로날 항체를 단리하기 위해, 우선 특정 모노클로날 항체를 발현, 진열 및(또는) 분비하는 클론 세포주를 동정하고; 이 클론 세포주를 본 발명의 한 항체 제조 방법에 사용할 수 있다. 클론 세포주 및 이들에 의해 발현되는 모노클로날 항체의 제조 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Fuller et al., Section II of Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York, 1992, pages 11-22 to 11-11-36] 참조).
항체의 변이체 및 유도제는 항원 결정 인자에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체 및 T-세포 수용체 단편을 포함한다. 바람직한 단편으로는 Fab 단편(즉, 항원-결합 도메인을 함유하며 디술피드 결합에 의해 가교결합된 경쇄와 중쇄의 일부를 포함하는 항체 단편); Fab'(힌지 영역을 통해 Fab와 추가로 중쇄의 일부분을 포함하는 단일 항-결합 도메인을 함유하는 항체 단편); F(ab')2(중쇄의 힌지 영역에서 쇄간(interchain) 디술피드 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 분자; 이 Fab' 분자는 동일하거나 상이한 에피토프를 향해 유도될 수 있음); 이중특이적 Fab(각각 상이한 에피토프 방향으로 유도될 수 있는 2개의 항원 결합 도메인을 갖는 Fab 분자); 가변성 영역을 포함하는 단일 쇄 Fab 쇄(sFv로도 공지되어 있음)(10 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 쇄에 의해 연결된 항체의 단일 경쇄 및 중쇄의 가변성 항원-결합 결정 영역); 디술피드-연결된 Fv (또는, dsFv; 디술피드 결합에 의해 연결된 항체의 단일 경쇄 및 중쇄의 가변성 항원-결합 결정 영역); 카멜화된 VH(VH 경계면에 위치한 일부 아미노산이 자연 발생 카멜 항체의 중쇄에서 발견되는, 항체의 단일 중쇄 가변성 항원-결합 결정 영역); 이중특이적 sFv(각각 상이한 에피토프로 유도될 수 있는 2개의 항원-결합 도메인을 갖는 sFv 또는 dsFv 분자); 디아바디(제1 sFv의 VH 도메인을 제2 sFv의 VL 도메인과 조립하고, 제1 sFv의 VL 도메인을 제2 sFv의 VH 도메인과 조립하는 경우에 형성되는 이량체화된 sFv; 디아바디의 2개의 항원-결합 영역은 동일하거나 상이한 에피토프 방향으로 유도될 수 있음); 및 트리아바디(triabody)(삼량체화된 sFv, 디아바디와 유사한 방식으로 형성되지만 단일 복합체에서 3개의 항원-결합 도메인이 생성됨; 이 3개의 항원 결합 도메인은 동일하거나 상이한 에피토프 방향으로 유도될 수 있음)가 있다. 또한, 항체의 유도제는 항체 결합 부위의 CDR 서열을 하나 이상 포함한다. CDR 서열은 2개 이상의 CDR 서열이 존재하는 경우 스캐폴드(scaffold) 상에서 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 단편은 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 생체내에서(폴리클로날 및 단일특이적 항체의 경우), 세포 배양액에서(통상적으로 모노클로날 항체의 경우와 같이, 목적하는 항체를 발현시키는 하이브리도마 세포는 적절한 조건하에서 배양함), 시험관내 번역 반응에 의해, 및 재조합 DNA 발현 시스템(이 마지막 단백질 제조 방법은 본원의 "융합 단백질을 제조하는 방법"이라는 제목의 섹션에 보다 상세하게 개시되어 있음)에 의해 제조될 수 있다. 항체 및 항체 변이체는 다양한 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 특히 바람직하게는 뮤린 및 인간 세포로부터 제조될 수 있다. 항체의 항원 결합 부위(들)에 의해 부여된 목적하는 항원 표적화 능력만을 보유하는 자연적으로 발생하지 않은 항체 및 T-세포 수용체 변이체를 포함하는 항체는 공지된 세포 배양 기술 및 재조합 DNA 발현 시스템에 의해 제조될 수 있다(예컨대, 문헌 [Johnson et al., Methods in Enzymol. 203: 88-98, 1991]; [Molloy et al., Mol. Immunol. 32: 73-81, 1998]; [Schodin et al., J. Immunol. Methods 200: 69-77, 1997] 참조). 재조합 DNA 발현 시스템은 통상적으로, 예컨대 이중특이적 항체 및 sFv 분자와 같은 항체 변이체의 제조에 사용된다. 바람직한 재조합 DNA 발현 시스템은 특정 단백질을 고농도로 제조하도록 공학적으로 설계된 숙주 세포 및 발현 작제물을 사용하는 방법을 포함한다. 바람직한 숙주 세포 및 발현 작제물로는 플라스미드 또는 바이러스(박테리오파지)로부터 유래된 발현 작제물이 적재된 에스케리치아 콜리(Escherichia coli); 에피솜 또는 염색체적으로 통합된 발현 작제물이 적재된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모; Sf 9 세포 및 바큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 세포 및 바이러스; 및 에피솜 또는 염색체적으로 통합된(예컨대, 레트로바이러스) 발현 작제물이 적재된 포유동물 세포 (문헌 [Verma et al., J. Immunol. Methods 216: 165-181, 1998] 참조)가 있다. 또한, 항체는 식물에서나(미국 특허 제6,046,037호; 문헌 [Ma et al., Science 268: 716-719, 1995]) 또는 파지 디스플레이 기술(문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455, 1994])에 의해 제조될 수 있다.
항-종양제/병용 요법
종양 치료에 사용하기 적합한 제제가 문헌 [Chabner and Longo, Cancer Chemotherapy 및 Biotherapy, 3rd Ed., Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2001](그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함)에 기재되어 있다. 바람직한 항-종양제로는 화학요법에 통상적으로 사용되는 소분자, 예컨대
클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 에스트라무스틴(estramustine), 이포스파미드(ifosfamide), 메클로레타민(mechlorethamine) 및 멜팔란(melphalan)과 같은 질소 머스타드를 비롯한 알킬화제; 티오테파(thiotepa)와 같은 아지리딘(aziridine); 부르술판(bursulfan)과 같은 알킬 술포네이트; 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine) 및 스트렙토조신(streptozocin)과 같은 니트로스우레아(nitrosurea); 카르보플라틴(carboplatin) 및 시스플라틴(cisplatin)과 같은 백금 착제; 및 알트레타민(altretamine), 다카르바진(dacarbazine), 프로카르바진(procarbazine) 및 테모조아미드(temozoamide)와 같은 비전형적인 알킬레이터(alkylator); 메토트렉세이트(methotrexate)와 같은 폴레이트 유사체를 비롯한 항대사산물; 플루다라빈(fludarabine), 머캅토퓨린(mercaptopurine) 및 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린 유사체; 클라드리빈(cladribine) 및 펜토스타틴(pentostatin)과 같은 아데노신 유사체; 카페시타빈(capecitabine), 시타라빈(cytarabine), 데포싯(depocyt), 플록스우리딘(floxuridine), 플루오로우라실(fluorouracil) 및 겜시타빈(gemcitabine)과 같은 피리미딘 유사체; 히드록시우레아와 같은 치환된 우레아; 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 다우녹솜(DaunoXome), 독소루비신(doxorubicin), 독실(doxil), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 미토마이신(mitomycin)과 같은 항종양 항생제; 에토포시드(etoposide) 및 테니포시드(teniposide)와 같은 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin); 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine) 및 비노렐빈(vinorelbine)과 같은 미세소관 제제; 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan)과 같은 캄프토테신(camptothecin) 유사체가 있다. 하기 목록은 통상적인 화학요법제를 추가로 함유한다:
류코보린(Leucovorin) 칼슘
레바미졸(Levamisole)
로무스틴
메게스트롤(Megestrol)
멜팔란-L-페닐알라닌 머스타드, L-사르콜리신
멜팔란 히드로클로라이드
MESNA
메클로레타민(Mechlorethamine), 질소 머스타드
메틸프레드니솔론(Methylprednisolone)
메토트렉세이트-아메토프테린(Methotrexate-Amethopterin)
마이토마이신-마이토마이신-C(Mitomycin-Mitomycin-C)
미톡산트론
머캅토퓨린
파클리탁셀 프레드니손(Paclitaxel Prednisone)
플라카마이신-미트라마이신(Plicamycin-Mithramycin)
프로카르바진
스트렙토조신 - 스트렙토조신(Streptozotocin)
타목시펜(Tamoxifen)
6-티오구아닌
티오테파-트리에틸렌 티오포스포라미드
빈블라스틴
빈크리스틴
비노렐빈 타르트레이트
알트레타민(Altretamine)(헥살렌; Hexalen)
아살레이(Asaley)
AZQ(카르밤산, 디아지쿠온)
BCNU(카르무스틴)
비세폭시드 디안히드로갈락티톨(a Bisepoxide dianhydrogalactitol)
부술판(미엘란(myleran), BSF)
카르복시프탈레이토플래티늄
CBDCA(카르보플라틴, 파라플라틴)
CCNU(로무스틴, CeeNu)
CHIP(이프로플라틴)
클로람부실(류케란; leukeran)
클로로조토신
시스-플래티늄(Cis-platinum)(시스플라틴, 플라티놀)
클로메손(Clomesone)
시아노모르폴리노독소루비신(Cyanomorpholinodoxorubicin)
시클로디손(Cyclodisone)
시클로포스파미드(시톡산; cytoxan)
디안히드로갈락티톨
플루오로도판(Fluorodopan)
글리아델 웨이퍼(Gliadel wafer)(카르무스틴 임플란트를 사용하는 프롤리퍼프로산(proliferprosan) 20)
E09
에스트라무스틴 포스페이트 나트륨(엠시스트; emcyst)
헵술팜(Hepsulfam)
헥사메틸멜라민
히칸톤(Hycanthone)
이포스파미드(IFEX)
메클로레타민(메클로레타민 히드로클로라이드, 머스타르겐(mustargen), 질소 머스타드)
멜팔란(L-PAM, 알케란; alkeran)
메스나(Mesna)
메틸 CCNU(세무스틴; semustine)
마이토마이신 C
미토졸라미드 옥사플라틴(Mitozolamide Oxaliplatin)
PCNU
피페라진
피페라진디온
피포브로만(Pipobroman)
포페라진디온(Poperazinedione)
포르피로마이신(Porfiromycin)
프로카르바진(Procarbazine)(마툴란; matulane)
스피로히드안토인(Spirohydantoin) 머스타드
스트렙토조신(자노사르; zanosar)
테모다르(Temodar)(테모졸로미드; temozolomide)
테록시론(Teroxirone)
테트라플라틴(Tetraplatin)
티오포르포라미드
티오-테파(티오플렉스(thioplex), TSPA, TESPA, 트리에틸렌티오포스포라미드)
트리아지네이트(Triazinate)
트리에틸렌멜라민(Triethylenemelamine)
우라실 질소 머스타드
요시(Yoshi)-864
특히 바람직한 항-종양제는 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(TNF) 및 치료적 항체를 비롯한 폴리펩티드이다. 인터루킨의 예로는, 임의로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL- 13, IL-15, IL-18, IL-21, 및 이들의 기능성 유도체가 있다. 인터페론의 예로는 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 및 이들의 기능성 유도체가 있다.
추가의 바람직한 항-종양제는 효소를 포함한다. 바람직한 효소에 의한 항암 방법은 항체-결합 효소 전구약물 치료법(ADEPT)과 관련되어 있다. 항체(또는 그의 단편)은 효소를 포함하는 조성물을 종양 부위로 유도하며, 관련 효소는 종양 부위에서 전구약물을 활성 약물로 전환시킨다. 따라서, 상기 전략은 다른 비독성 전구약물을 독성 물질로 전환시키는 효소를 종양 세포에서, 이 근처에서 또는 종양 세포로 도입함으로써 표적 부위에서 종양 또는 암세포를 사멸시키는 것이다.
예를 들어, 티미딘 키나아제는 화합물인 간시시비르(gancicivir)를 인산화시켜 DNA 합성을 억제함으로써 세포를 사멸시킨다. 이 효소는 조성물에 함유시키거나 적절한 표적화 요소에 부착시킬 수 있다. 이어서, 간시시비르를 전신에 투여한다. 또다른 예는 이. 콜라이에서 발견되며 5-플루로시토신을 독성 화학요법제인 5-플루오로우라실로 전환시키는 시토신 데아미나제이다. 따라서, 정상적인 체세포에 해를 끼치지 않고 암세포에 치사량으로 전달되도록 다량의 5-플루로시토신을 대상체에게 투여할 수 있다. 본 발명의 방법은 "바이스탠더(bystander) 효과"에 의해 종양 및 암세포 사멸에 더 이로울 수 있다. 즉, 종양을 완전히 제거하기 위해 종양 내 모든 세포가 조성물에 의해 표적화될 필요는 없다. 따라서, 일단 종양 세포가 사멸되면 세포독성 약물은 이웃하는 세포로 확산되어 이들도 또한 사멸시킬 수 있다. 세포 중 10％만 성공적으로 표적화시켜도 종양을 100％ 파괴할 수 있다.
다른 예에서, 유방암 치료에 유용한 약물은 카페시타빈이며, 이는 효소인 티미딘 포스포릴라제에 의해 5-플루오로우라실(5-FU)로 전환된다. 따라서, 티미딘 포스포릴라제는 조성물의 표적화 요소, 및 종양 부위에 결합한 조성물 상에 포함된 표적화 요소에 부착될 수 있다. 환자는 카페시타빈으로 처치하며, 이에 따라 5-FU가 종양 부위로 전달된다. 이 실시양태는 특정 유형의 암(예를 들어, 유방암)을 유발시킬 수 있는 다른 약물(예를 들어, 탁소테레(taxotere))를 함께 투여하여 티미딘 포스포릴라제의 생성을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 치료 효과가 향상된다.
추가의 실시양태에서, 니트로 에덕타제, 티미딘 키나아제 및 아데노신 데데아미나제를 사용하여 전구약물, 예컨대 CB1954, 간시클로비르(ganciclovir) 및 5-FC를 세포독성 약물로 전환시킬 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 추가의 항-종양제는 RNA 간섭("RNAi")에 의한 종양 관련 핵산(들)의 유전자 사일런싱을 제공하도록 설계된 이중-가닥 RNA(예를 들어, 문헌 [Paddison et al., Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 99: 1443-8(2002)]; 및 [Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12: 225-32(2002)] 참조); 종양 관련 핵산(들)의 발현을 억제하도록 설계된 안티센스 핵산(문헌 [Bavisotto, J. Exp. Med. 174: 1097-1101(1991)] 참조); 종양 관련 핵산(들)을 파괴하도록 설계된 유전자 치료법 작제물("넉아웃(knockout)" 작제물); 치료적 핵산(들)을 과발현시키도록 설계된 유전자 치료법 작제물; 또는 임의의 상기 조성물의 조합물을 비롯한 핵산이지만, 이들로 한정되지는 않는다.
항-감염제/병용 요법
본 발명의 화합물 제조에 사용하기 특히 바람직한 항-감염제는 인터루킨, 인터페론, 종양 괴사 인자(TNF) 및 치료적 항체를 비롯한 폴리펩티드이다. 인터루킨의 예로는, 임의로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-21, 및 이들의 기능성 유도체가 있다. 인터페론의 예로는 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 및 이들의 기능성 유도체가 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 본 발명의 화합물은 다양한 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염제에 대해 유효한 것으로 공지된 항-감염제를 사용하는 병용 요법에 사용될 수 있다. 상기 제제는 당업계에 기재 및 확인되어 있다.
하기 목록은 항-감염제의 예시군 및 예시 유형을 제공한다. 당업자는 특정 감염제에 대해 적절한 병용 요법 전략을 용이하게 결정할 수 있다.
항-박테리아제
b-락탐 항생제(페니실린, 페니실린 G-유사 약물(페니실린 G, 페니실린 V, 프로카인 페니실린, 벤자틴 페니실린) 포함)
페니실리나제-내성 페니실린
클록사실린(Cloxacillin)
디클록사실린
메티실린(Methicillin)
나프실린(Nafcillin)
옥사실린(Oxacillin)
암피실린-유사 약물(암피실린, 암피실린 + 술박탐(sulbactam), 아목시실린(amoxicillin), 아목시실린 + 클라불라네이트(clavulanate) 포함)
바스암피실린(bacampicillin)
넓은-스펙트럼(항-슈도모날(pseudomonal)) 페니실린
아즐로실린(Azlocillin)
카르베니실린(Carbenicillin)
메즐로실린(Mezlocillin)
피페라실린(Piperacillin)
피페라실린 + 타조박탐
티카르실린(Ticarcillin)
티카르실린 + 클라불라네이트
세팔로스포린스(Cephalosporins)
이미페넴(Imipenem) 및 메로페넴(meropenem)
아즈트레오남(Aztreonam)
클라불란산, 술박탐 및 타조박탐
아미노글리코시드류(Aminoglycosides)
아미카신(Amikacin)
젠타미신(Gentamycin)
카나마이신(Kanamycin)
네오마이신(Neomycin)
네틸미신(Netilmicin)
스트렙토마이신(Streptomycin)
토브라마이신(Tobramycin)
마크롤리드(Macrolide), 린코마이신(Lincomycin) 및 클린다마이신(Clindamycin)(아지트로마이신(azithromycin), 클라리트로마이신(clarithromycin), 클린다마이신(clindamycin))
에리트로마이신(Erythromycin)
린코마이신(Lincomycin)
테트라사이클린(Tetracycline)
데메클로사이클린(Demeclocycline)
독시사이클린(Doxycycline)
미노사이클린(Minocycline)
옥시테트라사이클린(Oxytetracycline)
테트라사이클린
클로로암페니콜(Chloroamphenicol)
반코마이신(Vancomycin)
퀴누프리스틴(Quinupristin)/달포프리스틴(Dalfopristin)
메트로니다놀(Metronidazole)
리팜핀(Rifampin)
스펙디노마이신(Spectinomycin)
니트로푸란토인(Nitrofurantoin)
퀴놀론류(Quinolones)
시녹사신(Cinoxacin)
날리딕산(Nalidixic acid)
플루오로퀴놀론류(Fluoroquinolones)
시프로플록사신(Ciprofloxacin)
에녹사신(Enoxacin)
그레파플록사신(Grepafloxacin)
레보플록사신(Levofloxacin)
로메플록사신(Lomefloxacin)
노르플록사신(Norfloxacin)
오플록사신(Ofloxacin)
스파르플록사신(Sparfloxacin)
트로바플록사신(Trovafloxacin)
바시트라신(Bacitracin)
콜리스틴(Colistin)
폴리믹신(Polymyxin) B
술폰아미드류
항바이러스제:
이독스우리딘(Idoxuridine)(IDU)
비다라빈(Vidarabine)(아데닌 아라비노시드, ara-A)
트리플루리딘(트리플루오로티미딘)
아시클로비르(Acyclovir)
팜시클로비르(Famciclovir)
펜시클로비르(Penciclovir)
랄라시클로비르(Ralacyclovir)
간시클로비르(Ganciclovir)
포스카넷(Foscarnet)
리바비린(Ribavirin)
아만타딘(Amantadine)
리만타딘(Rimantadine)
시도포르비르(Cidoforvir)
안티센스 올리고뉴클레오티드류
면역 글로불린류
지도부딘(Zidovudine)(ZDV, AZT)
디다노신(Didanosine)(ddI)
잘시트라빈(Zalcitrabine)(ddC)
스타부딘(Stavudine)(d4T)
라미부딘(Lamivudine)(3TC)
역방향 트랜스크립타제 억제제(네비라핀(nevirapine), 델라비르딘(delavirdine))
바이러스 프로테아제 억제제
성분의 커플링
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 제2(또는 제3, 제4 등) 요소(예컨대, 표적화 요소)에 몇가지 방식으로 "커플링된" 제1 요소(예컨대, 치료제)를 포함한다. 당업자는 상기 잔기들이 간단하게 단일 분자의 2개의 부분(상기 2개의 영역의 예는 항체 상의 Fc 영역 및 Fab 영역일 수 있음), 선상 연결(tethering) "링커 잔기"에 의해 연결된 2개의 분자일 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 상기 "커플링된" 분자를 제공하기 위해 다양한 방법을 이용할 수 있다. 별법으로, 이 부분들은 전통적인 링커를 사용하기 않고, 예를 들어 화학적으로 커플링되거나, 또는 단일 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 내에서 커플링될 수 있다.
예를 들어, 임의의 2개의 성분(예컨대, 이 2개의 성분은 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 단일-쇄 가변성 영역 단편, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 올리고당, 다당, 시클릭 폴리펩티드, 펩티드모방체 및 압타머, 폴리(에틸렌 옥시드), 덱스트란 등으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)은 각 성분 상의 부위와 상용성인 화학 구조를 갖는 링커에 의해 화학적으로 교차-연결될 수 있다. 크로스링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 필요에 따라 상업적으로 입수하거나(예컨대, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Pierce Chemical Company Catalog and Handbook 1994-95, pages O-90 through O-110] 참조) 또는 합성할 수 있다.
별법으로, 2개의 성분이 모두 펩티드인 경우, 이 성분들은 "유전적으로" 커플링될 수 있다. 즉, 제1 및 제2 요소는 키메라 단백질 또는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 예를 들어, 데이비스(Davis) 등의 미국 특허 제6,072,041호는 pIgR의 분비 성분으로 유도되는 융합 단백질을 개시하고 있다. 문헌 [Ferkol et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 161: 944-951, 2000]은 인간 pIgR 및 인간 알파(1)-항트립신의 분비 성분(SC)으로 유도되는 단일-쇄 가변성 영역 단편으로 이루어진 융합 단백질을 개시하고 있다. 모스토브(Mostov) 등의 미국 특허 제6,042,833호는 리신(ricin) A, 폴리-(L)-Lys 또는 파지 표면 단백질을 포함하는 "유전적 융합물" 및 "융합 단백질"을 개시하고 있다.
유사한 방법으로, 분자 생물학을 이용하여 제2 성분 상의 상보성 도메인과 조합할 수 있는 성분으로 도메인을 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 코일드-코일(coiled-coil) 도메인 서열을 제1 표적화 요소 및 제2 표적화 요소에 부착시켜 이 2개의 요소 사이에 결합을 형성시키는 데 필수적인 상보성을 제공할 수 있다. 별법으로, 시스테인 잔기를 디술피드-결합 복합체 형성에 사용되는 2개의 표적화 요소에 도입시킬 수 있다.
다른 접근법에서, 본원에 기재된 조성물의 다양한 성분은 입자 또는 캡슐과 관련되어 있을 수 있다. 생물학적으로-관련된 분자를 전달하기 위한 특정 투여 시스템을 제조하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다. 상기 입자는 바람직하게는 다공성이고(이거나) 생분해가능하기 때문에 입자에 함유된 분자(예를 들어, 약물, 백신, 비타민, 폴리펩티드, 항체 등)를 우선 방출시키고 순환계로 전달할 수 있지만, 비다공성이고(이거나) 생분해가능하지 않은 입자(예를 들어, 리포솜)도 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 입자 및 캡슐(마이크로입자, 나노입자, 마이크로캡슐 및 나노캡슐 포함)은, 예를 들어 미국 특허 제5,702,727호; 동 제5,620,708호; 동 제5,607,691호; 동 제4,610,896호; 동 제5,149,794호; 동 제6,197,349호; 동 제6,159,502호; 동 제5,785,976호; 문헌 [Chiu et al., Biomaterials 23: 1103-12(2002)]; [Andrianov et al., Biomaterials 19: 109-115(1998)]; [Soppimath et al., J. Controlled Release 70: 1-20(2001)]; [McPhail et al., Intl. J. Pharmaceutics 200: 73-86(2000)]; [Mueller et al., Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 50: 161-177(2000)]; [Franssen et al., J. Controlled Release 60: 211-21(1999)]; [Prokop et al., Biotechnol. and Bioeng. 75: 228-232(2001)]; [Allemand et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 34: 171-89(1998)]; [Vinogradov et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 135-47(2002)]; [Jung et al., Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 50: 147-60(2000)]; [Martin et al., Biomaterials 19: 69-76(1998)]; [Vervoort et al., Intl. J. Pharmaceutics 172: 137-45(1998)]; [J. Controlled Release 65: 49-54(2000)]; [Davda and Labhasetwar, Intl. J. Pharmaceutics 223: 51-9(2002)]; [Duezguenes and Nir, Adv. Drug Deliv. Rev. 40: 3-18(1999)]; [Nagayasu et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 40: 75-87(1999)]; [Leroueil-Le Verger et al., Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 46: 137-143(1998)]; [Breton et al., Biomaterials 19: 271-81(1998)]; [Konan et al., Intl. J. Pharmaceutics 233: 239-52(2002)]; [Duncan et al., Eur. polymer J. 37: 1821-6(2001)]; 및 [Stenekes et al., Biomaterials 22: 1891-8(2001)],(각각 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된 것으로 간주함))에 개시되어 있다.
제약 조성물
본 발명의 조성물은 치료를 요하는 대상체에게 치료제를 전달하기 위해 제공한다. 또한, 본 발명의 조성물은 다른 화학적 성분, 예컨대 희석제 및 부형제를 추가로 포함할 수 있다. "희석제"는 치료제가 용매 중에 보다 용이하게 용해되도록 작용하는, 용매, 바람직하게는 수성 용매에 희석시킨 화합물이며, 이는 표적화 요소 또는 그의 1종 이상의 성분의 생물학적으로 활성인 형태를 안정화시키는 데에도 사용할 수 있다. 완충 용액에 용해된 염은 당업계에서 희석제로 사용된다. 예를 들어, 바람직한 희석제는 1종 이상의 다른 염을 함유하는 완충 용액이다. 바람직한 완충 용액은 포스페이트 완충된 염수(특히, 제약 투여용으로 처방된 조성물과 관련하여)인데, 이는 인간 혈액 중 염의 상태와 유사하기 때문이다. 완충액 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 조절할 수 있기 때문에, 완충된 희석제는 생물학적으로 활성인 펩티드의 생물학적 활성을 거의 변형시키지 않는다.
"부형제"는 적합한 성질, 예를 들어 적합한 경도를 부여하거나 약물을 형성하기 위해 조성물에 첨가할 수 있는 임의의 소정의 불활성 물질이다. 적합한 부형제 및 담체로는 특히 충전제, 예컨대 당 (락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨 셀룰로스 제제, 예컨대 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 한천, 펙틴, 크산탄검, 구아검, 로커스트빈검(locust bean gum), 히알루론산, 카세인 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트, 폴리아크릴레이트, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스 및(또는) 폴리비닐피롤리돈 (PVP)을 포함함)이 있다. 경우에 따라, 붕해제로는 또한 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨이 있다. 다른 적합한 부형제 및 담체로는 히드로겔, 겔화성 히드로콜로이드 및 키토산이 있다. 키토산 미세구 및 미세캡슐은 담체로 사용할 수 있다. WO 98/52547 (이는 하나 이상의 활성 성분을 함유하는 내부 코어 (임의로 겔화 히드로콜로이드를 포함함), 활성 성분(들)의 방출률을 제어하는 수불용성 중합체 (예를 들어, 에틸 셀룰로스)로 이루어진 막, 및 생점착성 음이온 중합체, 예를 들어 음이온성 다당, 음이온성 단백질 및(또는) 합성 음이온성 중합체로 이루어진 외피 층을 포함하는 제제인 위에 대한 표적 화합물을 위한 미세구 제형을 기재하고 있음) 및 미국 특허 제4,895,724호를 참조한다. 전형적으로, 키토산은 적합한 작용제, 예를 들어 글루타르알데히드, 글리옥살, 에피클로로히드린 및 숙신알데히드를 사용하여 가교되어 있다. 담체로서 키토산을 사용하는 조성물은 활성 성분(들)의 제어 방출을 제공하는 형태를 비롯한 환제, 정제, 미립자 및 미세구를 포함하는 각종 투여량 형태로 제형화될 수 있다. 다른 적합한 생점착성 음이온성 중합체로는 산성 젤라틴, 폴리갈락토스아민, 폴리아미노산, 예컨대 폴리리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리쿼터너리(polyquaternary) 화합물, 프롤아민, 폴리이민, 디에틸아미노에틸덱스트란 (DEAE), DEAE-이민, DEAE-메트아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-덱스트란, DEAE-셀룰로스, 폴리-p-아미노스티렌, 폴리옥세탄, 코폴리메트아크릴레이트, 폴리아미도아민, 음이온성 전분, 폴리비닐피리딘 및 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌이 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 적합한 방식으로 제제화될 수 있다. 적합한 제제로는 건립자 및 액상 제제가 있다. 건조 제제로는 냉동 건조된 산제 및 동결 건조된 산제가 있으며, 이들은 특히 정맥동 또는 폐로 에어로졸 전달하거나, 또는 장기간 보관한 다음 적합한 희석제 중에 용해시켜 투여하기에 매우 적합하다. 전달하는 생물학적 활성 성분의 특정 양은 달성될 효과, 조성물이 전달될 기관의 유형, 전달 경로, 투여량 섭생법, 및 연령, 건강, 및 유기체의 성별을 비롯한 다수의 요인에 따를 것이다. 이에 대하여, 특정 투여량은 당업자의 판단에 따른다. 또한, 입도는 기관 (예를 들어, 폐)의 특정 영역으로의 최적의 전달을 달성하기 위해 조절될 수 있다. 바람직한 입도는 약 1 μm 내지 약 20 μm, 바람직하게는 약 1 μm 내지 약 10 μm, 보다 더 바람직하게는 약 2 μm 내지 약 7 μm, 가장 바람직하게는 약 3 μm 내지 약 5 μm이다. 본원에서의 용어 "약"은 제시된 측정값의 +/- 10％를 나타낸다.
본원에 기재된 방법 및 적용에 대한 다른 적합한 변형 및 변경이 본 발명 또는 그의 임의의 실시양태의 범위에서 벗어나지 않게 수행될 수 있음이 당업자에게는 용이하게 명백할 것이다. 이제 본 발명을 자세히 설명하면서, 하기 실시예 (이는 단지 예시를 위한 목적으로 본원에 포함되었으며 본 발명을 제한하려는 의도는 아님)를 참조하여 본 발명이 보다 명확하게 이해될 것이다.
실시예 1 - 투여
본 발명에 따라 투여되는 화합물은 특정 적용에 따른 다양한 방법, 예컨대 점적주입, 흡입, 비강 및(또는) 구강 막에 대한 노출 (예를 들어, 흡입(sniffing) 또는 점비), 정맥내 투여 또는 복강내 투여에 의해 투여할 수 있다. 점적주입 및 흡입은 특히 효과적인 투여 방법이다. 조성물은 또한 연무하거나, 에어로졸화하거나, 분무하거나 또는 미스트로 제조할 수 있으며, 흡입 또는 점적주입을 통해 투여할 수 있다. 가장 바람직한 투여 방식은 임의의 특정 적용으로 결정될 수 있으나, 화합물의 흡입은 가장 바람직한 투여 방식으로 수술적 개재 또는 의료 종사자들의 존재 없이도 행할 수 있으며, 대상체에 의해 자가 투여될 수 있다.
실시예 2 - 다합체 sFvs
시험관내에서 유전학적 조작을 이용함으로써 sFvs의 번역 프레임을 변경시켜 활성 부위를 함유한 아미노산으로 치환하거나 삽입한 유도제를 생성시켰다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제09/969,748호의 실시예 6 및 국제 출원 제WO02/28408호의 실시예 6을 참조하며, 이들 각각은 이 거명을 통해 본원에 포함된 것으로 간주한다. sFv의 2개의 가변성 영역은 V(H) 및 V(L)로 공지되어 있으며, 이들은 결합하여 리간드 결합 부위를 형성한다. 단량체 sFv에서, 각 분자의 V(H) 및 V(L)은 서로 결합되어 있다. 이량체 sFv의 한 유형은 한 단량체 [V(H)1]의 V(H)가 또다른 단량체 [V(L)2]의 V(L)과 결합되어 있으며, 이들의 역도 가능하다 [즉, V(H)2는 V(L)1과 결합되어 있다].
V(H)와 V(L) 영역 사이의 링커의 길이 및 조성물은 단량체 또는 다합체를 형성하기 위한 sFv의 경향에 영향을 미치는 하나의 요인이다 (문헌 [Todorovska et al., Design and application of diabodies, triabodies and tetrabodies for cancer targeting, J. Immunol. Meth. 248: 47-66 (2001)]; [Arndt et al., Biochemistry 37 12918-12926 (1993)]). 예를 들어, V(H) 및 V(L) 영역 사이의 상대적으로 짧은 링커가 존재하는 sFv 분자는 자체로 접혀서 단량체를 형성할 거 같지는 않을 것이다. 이와 같이, "짧은 링커" sFv 유도제는 그들의 V(H) 및 V(L) 영역이 제2 sFv 분자의 각각의 V(L) 및 V(H)의 영역과 한쌍이 되어야 하는 것처럼 보다 빈번하게 이량체를 형성한다. 종종, V(H) 및 V(L) 영역 사이의 상대적으로 긴 링커를 갖는 sFv 유도제는 자체적으로 접혀서 단량체를 형성하는데 더 큰 경향을 가질 수 있다. 따라서, V(H) 및 V(L) 영역 사이에 긴 링커를 갖는 일부 sFv 유도제는 다합체를 형성하는 특정한 경향을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물에서 적합한 스페이서로서 역할할 수 있는 각종 아미노산 서열이 공지되어 있다 (개관을 위해, 문헌 [Simons, Spacers, probability, and yields, Bioconjug Chem 1999 Jan-Feb; 10(1): 3-8] 참조). sFv에 사용되는 일부 비제한적인 서열의 예로는 EGKSSGSGSESKEF (서열 10), 하나 이상의 카피의 GGGGS [또한, (G4S)x로도 공지되어 있음], [Newton et al., Angiogenin single-chain immunofusions: influence of peptide linkers and spacers between fusion protein domains, Biochemistry 1996 Jan 16; 35(2): 545-53], GSGS [또한, (GSGS)x로도 공지되어 있음] 및 GSSG [또한, (GSSG)x로도 공지되어 있음]가 있다.
APL10은 일례의 sFv 코딩 서열이다. 친화성 정제를 촉진하기 위해, 단백질 A는 APL10의 VH쇄와 상호작용한다.
실시예 3 - IL-2-sFv 컨쥬게이트
인간 IL-2는 20개의 아미노산 소수성 리더 서열을 포함하는 153개의 아미노산을 함유한 전구체 단백질로서 합성된다. IL-2 분자는 분자량이 약 15.4 kD이며, 약 염기성 pI값을 갖는다. 상기 단백질은 IL-2의 생물학적 활성에 필요한 단일 분자내 디술피드 결합 (Cys58-CyslO5)을 포함한다 [Yamada et al., Importance of disulfide linkage for constructing the biologically active human interleukin-2, Arch Biochem Biophys 257: 194-199, 1987].
IL-2의 일부 유형은 화학적 변형을 포함한다. O-글리코실화가 소의 IL-2의 Thr3에서 일어나며, 글리코실화에 의해 상이한 질량을 갖는 변이체가 존재함이 보고되어 있다. 그러나, 비-글리코실화 IL-2는 생물학적 활성을 유지한다 [Kuhnle et al., Bovine Interleukins 2 and 4 expressed in recombination bovine herpesvirus 1 are biologically active secreted glycoproteins, J Gen Virol 77 (Pt 9): 2231-2240, 1996].
이. 콜라이 또는 COS 세포에서 발현되는 재조합 인간 IL-2는 시험관내에서 단백질 키나제 C에 의해 인산화되는 것으로 제시되어 있다 [Kung et al., Phosphorylation of human interleukin-2 (IL-2), C Mol Cell Biochem 89: 29-35, 1989]. 인산화 트립신분해 펩티드는 위치 7의 세린 잔기 (Ser7)에서 단일 인산화 부위를 함유하는 N-말단 단편으로서 규명되었다. T 세포 성장 분석에 의해 측정된 바와 같이 비-인산화 및 인산화 IL-2간의 생물학적 활성에 있어서 어떠한 차이도 없었다.
IL-2를 코딩하는 mRNA를 생성시키고 단리하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 준비하고, 이를 마우스 항-인간 CD3 모노클로날 항체 (캘리포니아주 샌 디에고 소재의 비디 파밍겐(BD PharMingen))으로 미리 코팅시킨 플레이트 웰로 이동시켰다. 상기 플레이트를 항-CD3 10 μg/ml로 처리하고, 3회 세척한 다음 세포를 웰에 첨가하였다; 입수가능한 플레이트 (시판 전에 항-CD3으로 코팅됨)를 또한 사용할 수 있다 (비디 파밍겐사의 비디 바이오코트 T-세포 활성화 플레이트(BD BioCoat T-cell Activation Plate)). 이어서, 마우스 항-인간 CD28 모노클로날 항체 (비디 파밍겐)을 1 μg/ml에 첨가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다.
제조자 지시서에 따라 본질적으로 트리졸 (메릴랜드주 게이더스버그 소재의 라이프테크놀로지즈(LifeTechnologies))을 사용하여 자극된 세포로부터 전체 세포내 RNA를 추출하였다. 제조자 권고서에 따라 본질적으로 올리고(dT) 프라이머 및 써모스크립트(ThermoScript) RT-PCR 시스템 (라이프테크놀로지즈)을 이용하여 IL-2 메시지의 단일 가닥 cDNA 카피를 생성시켰다.
프라이머 "IL-2FormMut3" 및 "IL-2_Rev2"를 사용하여 PCR을 통해 IL-2 코딩 서열 및 합성 링커의 일부를 증폭시켰다:
IL-2ForMut3 (서열 1):
IL-2_Rev2 (서열 2):
PCR을 약 60 ℃에서 25회 사이클 동안 수행하였다.
IL-2 cDNA의 서열 (젠뱅크 (Genbank) 기탁 번호 E00210, ATG는 밑줄 침)은 하기와 같다 (서열 3):
IL-2 cDNA의 코딩 서열은 하기와 같다 (서열 4):
하기 실시예는 융합 단백질로서의 IL-2-sFv 컨쥬게이트의 제조법이 기재되어 있으나, 당업자들은 추가 방법 (예를 들어, 화학적 가교법, 입자내 캡슐화 등)을 이용하여 IL-2를 적절한 표적화 요소와 결합시킬 수 있음을 이해할 것이다.
오버랩 PCR (이 거명에 의해 본원에 포함된 것으로 간주하는 미국 특허 출원 제09/969,748호 및 국제 출원 제WO02/28408호에 기재된 바와 같은 2개의 PCR 생성물을 함께 결합시키는 일종의 PCR)을 이용하여 IL-2 PCR 생성물을 sFv-코딩 PCR 생성물과 합하였다. 상기 방법에서, 의도된 접합 서열은 PCR 프라이머 (그의 5' 말단에서)내로 디자인된다. 각 개별 폴리펩티드-코딩 서열의 초기 증폭에 이어, 각종 생성물을 희석하고, 합하고, 변성시키고, 아닐링시키고, 확장시켰다. 이어서, "최종" 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 또다른 표준 PCR을 수행하였다.
오버랩 PCR에 사용되는 프라이머는 sFv 폴리펩티드에 연결된 합성 링커를 코딩하는 서열을 포함하도록 디자인되었다. 상기 링커는 13개의 아미노산 스페이서 (Gly-Ser-Thr-Ser-Gly-Ser-Gly-Lys-Ser-Ser-Glu-Gly-Lys; 서열 5) (이는 IL-2, 및 알파-폴레이트 수용체에 결합하는 sFv간의 융합 단백질의 정확한 폴딩을 촉진시키는 것으로 이미 제시되어 있음)를 포함한다 [Melani et al., Targeting of interleukin 2 to human ovarian carcinoma by fusion with a single-chain Fv of antifolate receptor antibody, Cancer Res 58 (18): 4146-4154, 1998]. 상기 sFv를 먼저 플라스미드 DNA로부터 증폭시켰다 (5A sFv를 발현하는 박테리아 발현 벡터 pSyn인 pSyn5AF; 미국 특허 출원 제09/969,748호 및 국제 출원 제WO02/2840호 참조). 하기와 같은 프라이머를 사용하였다.
sFvFor (서열 6):
sFvRev4 (서열 7):
상기 PCR을 약 72 ℃에서 약 25회 사이클 동안 수행하였다.
상기의 프라이머를 사용하여 IL-2와 sFv PCR 생성물의 혼합물로부터 IL-2, 링커 및 sFv 서열을 증폭시켰다. PCR의 3회 사이클을 약 45 ℃에 이어 약 25회 사이클을 약 68 ℃에서 수행하였다.
오버랩 PCR로부터의 PCR 생성물을 겔 정제하고, 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO (등록상표) 발현 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐 (Invitrogen))로 바로 클로닝하였다. 상기 발현 벡터는 고수준, 구성 발현을 위한 CMV-유도된 프로모터; 항-V5 항체를 사용하여 검출될 수 있는 C-말단 V5 에피토프 태그; 및 항-6xHis 태그 항체를 사용하여 검출될 수 있거나, 또는 IL-2-5A 융합 단백질을 정제하는데 사용할 수 있는 추가의 C-말단 6xHis 태그를 포함한다. 항-V5 및 항-6xHis 항체를 인비트로겐으로부터 입수가능하다.
별도로, pIgR 및 재조합 IL-2에 특이적인 sFv로 이루어진 이특이성 리간드를 생성시키기 위해, pel-B 리더를 코딩하는 서열과 sFv 코딩 서열의 개시부 사이에 삽입된 IL-2 코딩 서열 (예를 들어, pcDNA3.1/huCH3-IL-2 벡터가 기재된 문헌 [Christ et al., Clin. Cancer Res. 7: 1385-97 (2001)] 참조) 내에 유전학적 융합을 제작하였다.
클로닝 벡터와 상용가능한 임의의 적합한 유기체에서 작제물을 발현시킬 수 있고, 단백질-A 친화성 칼럼을 이용하는 FPLC에 이어 고정 금속 친화성 칼럼 상에서 정제함으로써 정제된 단백질을 단리하였다.
실시예 4 - IL-2-sFv 컨쥬게이트의 발현
실시예 3으로부터의 DNA를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시키고, 벡터가 암피실린 내성 유전자를 포함한 경우 암피실린을 사용하여 형질전환체를 선별하였다. 개별 콜로니를 선별하여 암피실린을 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 8개의 콜로니로부터의 플라스미드 DNA의 소규모 프랩 (미니-프랩)을 제조하였다. XbaI으로 절단하고, 절단된 DNA를 겔 전기영동하여 4개의 독립적으로 선별된 플라스미드의 예상 구조를 확인하였다. 4개의 모든 후보물은 예상 생성물과 일치하는 전기영동 패턴을 나타냈다. 발현 작제물에서 발견되며 IL-2-sFv 융합 단백질을 코딩하는 키메라 번역 프레임의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 PCR 반응의 정확성 및 충실도를 확인하였다.
서열-확인된 형질전환체 중 하나로부터의 플라스미드 DNA의 대규모 프랩을 제조하고, 이 DNA를 사용하여 제조자 지시서에 따라 본질적으로 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 (매사추세츠주 게이더스버그 소재의 라이프 테크롤로지즈)을 이용함으로써 일시적으로 COS-1 세포를 형질감염시켰다 (문헌 [Whitt et al., Unit 9.4, pages 9-11 to 9-12, and Unit 16.13, Aruffo, pages 16-53 to 16-55 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., editors, John Wiley and Sons, New York, 1992] 참조). 항-sFv 폴리클로날 항체를 사용하여 sFv 폴리펩티드를 함유한 융합 단백질을 검출하였다. 또한, 인간 IL-2 (젠자임)에 대한 항체 및 V5 에피토프에 대한 항체를 사용하는 ELISA 또는 웨스턴 분석에 의해 IL-2-sFv 융합 단백질의 생성 및 분비에 대한 형질감염체를 스크리닝하였다. 인간 IL-2에 대한 항체는, 예를 들어 리서치 다이그노스틱스 인크.(Research Diagnostics, Inc.;뉴저지주 플랜더스 소재) 및 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Corp.; 미주리주 세인트 루이스 소재))로부터 입수가능하다. 목적하는 융합 단백질은 3가지의 모든 항체에 의해 검출될 것이다. 특정한 경우에 IMAC 크로마토그래피로 최소한 반-정제한, 형질감염된 세포로부터의 상등액을 추가의 실험에 사용하였다.
IMAC 크로마토그래피를 이용하여 일시적으로 형질감염된 세포로부터의 IL-2-sFv 융합 단백질을 정제하였다. 간단히, 48시간 내지 144시간 동안 인큐베이션한 형질감염된 COS-1 세포로부터의 배지 약 400 ml를 수확하였다. 상기 배지를 풀링하고 이미다졸을 최종 농도가 10 mM이 되게 첨가하였다. 펠리콘 카젯트(Pellicon cassette) 시스템 (매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어 바이오사이언스(Millipore Bioscience)을 이용하여 풀의 최종 부피가 약 75 ml가 되게 농축하였다. 이어서, 6xHis 태그가 결합된 니켈 칼럼을 이용하여 농축된 샘플을 정제하였다.
실시예 5 - IL-2-sFv 융합 단백질을 코딩하는 박테리아 발현 작제물의 제조
그의 신호 펩티드가 없는 IL-2를 도 5에 도시된 sFv의 AvrII 부위로 클로닝함으로써 이량체 sFv 형성에 적합하도록 디자인된 pIgR-결합 sFv를 함유한 IL-2의 카르복시 말단 융합을 제작하였다. (Gly3 Ser)2로 이루어진 링커는 5' 올리고뉴클레오티드에 포함되어 있으며, 2개의 정지 코돈은 3'올리고뉴클레오티드에 포함되어 있다.
하기 프라이머를 사용하여 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO에 클로닝된 IL-2/5A로부터 그의 신호 서열이 없는 IL-2를 증폭시켰다.
AvrII_gggsX2_IL2_For (서열 8):
IL2_STOP_Xho1_ReV(서열 9):
PCR 5회 사이클을 55 ℃에서 수행한 다음 30회 사이클을 60 ℃에서 수행하였다. PCR 생성물을 중간 벡터 pCR-블런트(Blunt)II-TOPO (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)에 클로닝하였다. AvrII 및 EcoRI을 사용하여 상기 중간 벡터로부터 IL-2 PCR 생성물을 절단하고, 박테리아 발현 벡터 pSyn [Griffiths et al., EMBO J. 13: 3245-60, 1994]의 pIgR-결합 sFv의 AvrII 부위로 클로닝하였다. pSyn 작제물의 플라스미드 맵이 도 7에 제공되었다.
별도로, AvrII 및 XhoI을 사용하여 상기 중간 벡터로부터 IL-2 PCR 생성물을 절단하고, 박테리아 발효 발현 벡터 pELK [Nielsen et al., Biochim. Biophys. Acta 1591: 109-18, 2002]의 sFv의 AvrII 부위로 클로닝하였다. pELK 작제물의 플라스미드 맵도 또한 도 7에 제공되었다. 상기 DNA를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시키고, 벡터가 암피실린 내성 유전자를 포함한 경우 암피실린을 사용하여 형질전환체를 선별하였다. 개별 콜로니를 선별하여 암피실린을 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 8개의 콜로니로부터의 플라스미드 DNA의 소규모 프랩 (미니-프랩)을 제조하였다. 발현 작제물에서 발견되며 IL-2-sFv 융합 단백질 (도 6)을 코딩하는 키메라 번역 프레임의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 PCR 반응의 정확성 및 충실도를 확인하였다.
실시예 6 - IL-2-sFv 컨쥬게이트의 발현
pSyn에 클로닝된 서열 확인된 형질전환체의 서열 중 하나로부터의 플라스미드 DNA의 대규모 프랩을 제조하고, 이를 사용하여 이. 콜라이 BL21-코돈플러스(CodonPlus) 콤피턴트 세포 (스트라타젠(Stratagene))를 형질전환시켰다. 융합 단백질의 발현을 IPTG [De Bellis ＆ Schwartz, 1990]로 유도하고, 배양물을 25 ℃에서 밤새 성장시켰다. 융합 단백질을 원형질로부터 수확하고 [Breitling et al., 1991], 정제하기 위해 1 ml의 단백질 A 칼럼 상에 로딩하였다. 단백질 A는 APL10의 VH쇄와 상호작용하여 친화성 정제를 허용한다.
박테리아 발현 후에 단백질 A 친화성 정제에 의해 생성되는 융합 단백질을 세포전달 분석에 사용하였다. sFv에 대한 폴리클로날 항체 또는 IL-2에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 첨단부 및 기저외측 배지 둘다에서 APL10-IL-2 융합 단백질을 검출하였다. 세포전달이 대조군 (비-형질감염된) MDCK 세포에서 관찰되지 않았다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 세포전달은 pIgR 스톡의 존재에 의존하였다.
실시예 7 - 트랜스웰(Transwell) 세포전달 분석
이번 실시예는 표적화 요소가 치료제에 첨단부에서 기저외측으로의 세포전달을 제공하는지를 결정하는데 사용될 수 있는 시험관내 세포전달 분석법을 제공한다.
분극화된 세포, 예컨대 마딘-다르비 카닌(Madin-Darby Canine) 신장 세포를 사용하여 세포전달 분석을 수행할 수 있었다. 예를 들어, 문헌 [Brown et al., Traffic 1: 124-40 (2000)]을 참조한다. 세포전달 분석에 사용하기에 적절한 다른 세포로는 CaLu-3, Caco-2, HT29, 또는 바람직하게는 적합한 배양 시스템에서 분극화된 세포층을 형성하는 기타 적절한 세포가 있다. 상기 세포는 경우에 따라 형질감염시켜서 리간드, 특히 이특이성 또는 다중특이성 리간드의 결합에 적절한 표적을 발현시킬 수 있다.
pIgR을 발현시키는 MDCK 세포를 트랜스웰 (등록상표) 투과성 조직 배양 지지체 (코스타르(Costar)) (이 지지체는 세포가 세포 단층의 상부 및 하부로부터 영양물을 받는 것을 가능하게 함)에서 성장시켰다. 12-웰 트랜스웰 (등록상표) 플레이트의 각 투과성 웰을 5 x 105개의 세포로 시딩하여 3일 내지 5일 동안 성장시켰다. MDCK 세포층이 융합될 때, 위를 향하는 그의 첨단부 막으로 상기 세포를 향하게 하였다. 단단한 접합이 세포간에 형성되어 단백질의 세포외로의 이동을 방지하였다.
IL-2-sFv 융합 단백질을 트랜스웰 (등록상표) 컵의 첨단부 (300 ㎕ 배지 중 2 ㎍)에 첨가하는 한편, 기저외측 챔버는 배지 800 ㎕를 함유하였다. 상기 플레이트를 37 ℃의 인큐베이터에 16시간 동안 위치시켰다. 첨단부 및 기저외측 배지를 미세원심분리 튜브로 옮기고, 상기 세포층을 냉 PBS (10 mM 인산나트륨 (pH 7.3), 150 mM NaCl)로 3회 세척하고, 이어서 PBS 중의 1％ NP-40 250 ㎕로 용해시켰다. 상기 세포 용해물을 미세원심분리 튜브로 옮기고, 16,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 핵을 침사(pellet)하였다. 가용성 용해물을 새로운 튜브로 옮기고, 10％ 단백질 A-세파로스 비드 100 ㎕를 각 첨단부 튜브, 기저외측 튜브 및 세포 용해물 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 회전 플랫폼 상에 4 ℃에서 밤새 위치시키고, 융합 단백질의 sFv 부분이 단백질 A에 결합하도록 하였다.
단백질 A-세파로스 비드를 PBS로 3회 세척한 후에 비-환원된 샘플 완충액 100 ㎕를 각 튜브에 첨가하고, 90 ℃에서 3분 동안 가열하였다. 상기 샘플을 4％ 내지 15％ SDS-PAGE 겔 상에서 러닝하고, 이어서 PVDF 막으로 옮겼다. IL-2-sFv 융합 단백질의 sFv 부분에 특이적인 토끼 항체로 프로빙하여 PVDF 막 상에서 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 알칼리 포스파타제에 컨쥬게이트된 당나귀 항-토끼 항체를 제2 항체로 사용하였다. 브로모-클로로-인돌릴 포스페이트 (BCIP) 및 니트로-블루 테트라졸륨 (NBT)을 사용하여 밴드를 검출하였다.
상기 분석을 이용하여 세포전달을 조사하면, 화합물이 세포의 첨단부에서 기저외측으로 세포전달됨이 입증되면서 기저 배지로부터의 IL-2-sFv 융합 단백질을 회수하는 것이 가능하였다.
각종 방법 및 조성물을 사용하여 IL-2-sFv 융합 단백질을 검출하고 정량할 수 있었다. 이들은, 비-제한적인 실시예의 방법으로 입수가능한 IL-2 ELISA (미네소타주 미네아폴리스 소재의 듀오셋트 ELISA 디벨롭먼트 키트, 알 앤드 디 시스템즈, 인크.(DuoSet ELISA Development Kit, R ＆ D Systems, Inc))를 사용할 수 있음을 포함한다. IL-2의 각종 모노클로날 항체는 공지되어 있어 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Redmond et al., Monoclonal antibody for purification and assay of IL-2, 17: Lymphokine 5: S29-S34, 1986] 참조)
실시예 8 - IL-2-sFv 융합 단백질을 코딩하는 포유동물 발현 작제물의 제조
그의 신호 펩티드를 함유한 IL-2를 도 5에 나타낸 sFv의 NheI 부위에 클로닝함으로써 sFv 이량체 형성에 적합하도록 디자인된 sFv를 함유한 IL-2의 아미노 말단 융합을 제작하였다. (Gly2Ser)2로 이루어진 링커는 이미 상기 sFv의 5' 말단에 라이게이션시켰다.
하기 프라이머를 사용하여 pcDNA3.1D/V5-His-TOPO에 클로닝된 IL-2/5A로부터 그의 신호 서열을 함유한 IL-2를 증폭시켰다.
IL2_EcoRV_For (서열 11):
IL2_NheI_ReV(서열 12):
PCR의 25회 사이클을 58 ℃에서 수행하였다. PCR 생성물을 중간 벡터 pCR-블런트II-TOPO (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐) 내로 클로닝하였다. EcoRV 및 NheI를 사용하여 상기 중간 벡터로부터 IL-2 PCR 생성물을 절단하고, 겔 정제하여 포유동물 발현 벡터 pDIZ 내의 (Gly2Ser)2-sFv의 NheI 부위로 클로닝하였다. pDIZ를 하기와 같이 제작하였다: 4882bp SpeI/EcoRV 단편을 pcDNA 3.1 히그로(Hygro) (캘리포니아주 소재의 인비트로겐)로부터 단리하고, gWiz (진 세라피 시스템즈 인크.(Gene Therapy Systems Inc.)로부터의 SpeI/XmnI 단편에 라이게이션하였다. pDIZ의 플라스미드 맵을 도 7에 나타냈다.
상기 DNA를 사용하여 이. 콜라이를 형질전환시키고, 벡터가 암피실린 내성 유전자를 포함한 경우 암피실린을 사용하여 형질전환체를 선별하였다. 개별 콜로니를 선별하여 암피실린을 함유한 LB 배지에서 성장시켰다. 8개의 콜로니로부터의 플라스미드 DNA의 소규모 프랩 (미니-프랩)을 제조하였다. 발현 작제물에서 발견되며 IL-2-APL10 융합 단백질을 코딩하는 키메라 번역 프레임의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 PCR 반응의 정확성 및 충실도를 확인하였다.
실시예 9 - IL-2-sFv 컨쥬게이트의 생물학적 활성
IL-2-의존성 뮤린 세포독성 T 세포주인 CTLL-2의 증식을 지속시키는 능력을 평가함으로써 IL-2-sFv 융합 단백질의 IL-2 생물학적 활성을 시험하였다 [Melani et al., Targeting of interleukin 2 to human ovarian carcinoma by fusion with a single-chain Fv of antifolate receptor antibody, Cancer Res. 58 (18): 4146-4154, 1998]. 상기 융합 단백질은 상기 분석에서 농도-의존성 방식으로 T 세포의 증식을 지속시켰다.
융합 단백질이 리간드, 예컨대 가용성 IL-2-수용체 폴리펩티드 (문헌 [Dracheva et al., Protein Expr. Purif. 6: 737-47, 1995]; [Junghans et al., J. Biol. Chem. 271: 10453-60, 1996]) 또는 지질타이코산 [Plitnick et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8(5): 972-9, 2001]와 결합하는 능력을 표면 상에 고정시켜서 직접 측정하거나 또는 ELISA 분석에서 항체에 IL-2 결합을 경쟁적으로 억제시키는 능력에 의해 간접적으로 측정할 수 있었다. IL-2의 양 및 생물학적 활성을 측정하기 위한 다른 방법은 문헌 [Gately et al. in: Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, New York, 2000; Indrova et al., Folla Biol. (Praha) 43: 45-47, 1997]에 기재되어 있다.
실시예 10 - 진핵 세포의 형질감염 및 발현
서열-확인된 형질전환체 중 하나로부터의 플라스미드 DNA의 대규모 프랩을 제조하고, 이 DNA를 사용하여 제조자 지시서에 따라 본질적으로 리포펙타민 2000 (캘리포니아주 소재의 인비트로겐)을 이용함으로써 일시적으로 CHO 세포를 형질감염시켰다 (문헌 [Whitt et al., Unit 9.4, pages 9-11 to 9-12, and Unit 16.13, Aruffo, pages 16-53 to 16-55 in: Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Ed., Ausubel et al., editors, John Wiley and Sons, New York, 1992] 참조). 항-sFv 폴리클로날 항체를 사용하여 sFv 폴리펩티드를 함유한 융합 단백질을 검출하였다. 또한, 인간 IL-2 (캘리포니아주 소재의 케미콘 인크. (Chemicon Inc.))에 대한 항체를 사용하는 ELISA 또는 웨스턴 분석에 의해 IL-2-sFv 융합 단백질의 생성 및 분비에 대한 형질감염체를 스크리닝하였다. 또한, 인간 IL-2에 대한 항체는, 예를 들어 리서치 다이그노스틱스 인크.(뉴저지주 플랜더스 소재) 및 시그마 케미칼 코포레이션(미주리주 세인트 루이스 소재))로부터 입수가능하다. 목적하는 융합 단백질은 2가지 항체에 의해 검출되었다. 형질감염된 세포로부터의 상등액을 sFv의 VH쇄와 상호작용하며 친화성 정제를 허용하는 1 ml의 단백질 A 칼럼에 로딩하였다.
실시예 11 - sFv-α-인터페론 융합 단백질을 코딩하는 포유동물 발현 작제물의 제조
C-말단 인간 α-인터페론 (α-IFN)-sFv 키메라 벡터를 조작하기 위하여, 등록된 젠뱅크 서열 (기탁 #J00207)로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 α-IFN 유전자를 먼저 인간 태반 DNA (미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마; cat.# D-4642)로부터 단리하였다. 제조자 지시서에 따라 'IFNA 091302-1TPF 정방향' (서열 13) 및 'IFNA 091302-2TPR 2 역방향' (서열 14)을 사용하고, 반응물 100 ㎕ 중 벤트(Vent) DNA 폴리머라제 (매사추세츠주 버버리 소재의 뉴 잉글런드 바이오랩스(New England Biolabs))를 사용하여 태반 DNA 1 ㎍을 증폭시켰다. 3-단계 PCR 증폭은 아닐링 온도 50 ℃를 포함하는 5회 사이클에 이어 55 ℃에서의 30 사이클을 포함하였다.
IFNA 091302-1TPF 정방향 프라이머 (서열 13):
IFNA 091302-2TPR 역방향 프라이머 (서열 14):
PCR 반응물 100 ㎕를 겔 정제에 적용시키고, 퀴아퀵 칼럼 (캘리포니아주 발레시아 소재의 퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 567 bp PCR 생성물을 정제하였다. 정제된 생성물 2 ㎕를 제조자 지시서에 따라 T4 DNA 리가제 (매사추세츠주 소재의 버버리 NEB)를 사용하여 pCR 4 블런트 TOPO 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐)와 라이게이션시켰다. 미니프랩 DNA의 프랩을 제조하고 (퀴아젠 미니프랩 키트 cat.# 27106), 양성 클론을 서열분석하였다. 클론 #6은 하기와 같이 α-IFN 유전자 및 N-말단 신호 서열을 함유하였다:
α-IFN 유전자 서열: (서열 15):
sFv-α-IFN 키메라를 제작하기 위해, 벤트 DNA 폴리머라제, 및 프라이머'112202-1TPF AvrII-G4S-IFNA2B 정방향' (서열 16) 및 '112202-2TPR IFN2b NheI-SalI 역방향' (서열 17)을 사용하여 pCR 4 블런트 TOPO IFN-α 클론 #6 주형 DNA 100 ng을 증폭시켰다:
112202-1TPF AvrII-G4S-IFNA2B 정방향 (서열 16):
112202-2TPR IFN2b NheI-SalI 역방향 5 (서열 17):
α-IFN 544 bp PCR 생성물을 생산하기 위해 사용되는 정방향 프라이머를 프레임으로 C-말단 sFv 폴리펩티드에 연결된 5개의 아미노산 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 코딩하는 합성 링커를 코딩하는 서열을 포함하도록 디자인하였다. 3-단계 PCR 증폭 반응은 아닐링 온도가 55 ℃인 5회 사이클, 이어서 60 ℃인 30회 사이클을 포함하였다. 544 bp PCR 생성물은 겔 정제하고, pCR 블런트 II TOPO 중간 벡터 내로 클로닝하였다. 미니프랩 DNA를 제조하고, PCR 생성물에 대한 양성 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 서열 확인 후에, 맥시프랩 DNA를 AvrII 및 SalI 제한 효소로 절단하고, 이어서 AvrII/SalI 절단 APL-10 pELK 벡터 DNA 내로 T4 DNA 리가제를 사용하여 라이게이션함으로써 PCR 생성물을 절단하였다. 미니프랩 DNA를 제조하고, 양성 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 양성 벡터 클론을 도 1에 나타내고, 상기 클론은 하기 단백질 도메인 구조적 배향을 함유하는 키메라 단백질을 코딩하는 키메라 DNA 서열 (서열 18)을 함유한다: (NH2)-pel-B 리더-sFv-Gly4Ser 링커-α-IFN-(COOH).
sFv-α-IFN 키메라 DNA 서열 (서열 18):
상기 실시예는 융합 단백질로서의 sFv-α-IFN 컨쥬게이트의 제조를 기재하지만, 당업자는 추가 방법 (예컨대, 화학적 가교법, 입자 중의 캡슐화 등)이 α-IFN을 적절한 표적화 요소와 결합시키는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. sFv-α-IFN 작제물을 이. 콜라이에서 발현시키고, sFv-Il-2 작제물에 대해 본원에 기재한 바와 같이 단백질-A 친화성 칼럼을 사용하는 FPLC에 의해 정제된 단백질을 단리하였다.
항바이러스 생분석을 사용하여 세계보건기구에 대해 조정된 바와 같이 뇌심근염 바이러스의 세포변성 영향으로부터 인간 포피 섬유모세포 FS-71 세포를 보호하는 α-IFN의 능력에 기초하여 α-IFN 활성을 측정할 수 있다.
실시예 12 - sFv-β-인터페론 융합 단백질을 코딩하는 포유동물 발현 작제물의 제조
등록된 젠뱅크 서열 (기탁 #M28622)로부터 디자인된 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 인간 β-인터페론 (β-IFN) 유전자를 인간 태반 DNA (미국 세인트 루이스 소재의 시그마; cat.#D-4642)로부터 단리하였다. '인간 IFN-β1 5'pcr XhoI- EcoRV-X' (서열 19) 및 '인간 IFN-β1 3'pcr X-NheI-정지-BglII-XbaI' (서열 20) 프라이머를 아닐링 온도가 55 ℃인 5회 사이클, 이어서, 60 ℃인 30회 사이클을 포함하는 PCR 증폭 반응에 사용하였다.
인간 IFN-β1 5'pcr 프라이머 XhoI-EcoRV-X (서열 19):
인간 IFN- 1 3'pcr 프라이머 X-NheI-정지-BglII-XbaI (서열 20):
PCR 반응물 100 ㎕를 QIAquick PCR 정제 칼럼 (cat.# 28104, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠)을 사용하여 정제하였다. 정제 생산물 2 ㎕를 pCR II 블런트 TOPO 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스바드 소재의 인비트로겐) 내로 라이게이션하였다. 콜로니를 피킹하고, 미니프랩 DNA를 제조하였다 (퀴아젠 미니프랩 키트 #27106). 양성 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. pCR II 블런트 TOPO Hum-β-IFN (pCRIIBT HIFNβ)은 하기와 같이 인간 β-IFN 유전자 및 야생형 N-말단 신호 펩티드를 함유하였다:
β-IFN 유전자 서열: (서열 21):
β-IFN 유전자를 NheI 부위를 통해 APL10의 N-말단에 융합시켜 pDIZ HIFNβ-APL10을 제조하였다. sFv-β-IFN 키메라를 작제하기 위해, 벤트 DNA 폴리머라제 및 프라이머 '122602-1TPF AvrII-G4S-IFN 베타 정방향' (서열 22) 및 '122602-2TPR IFN 베타 NheI-SalI-XhoI 역방향' (서열 23)을 사용하여 pDIZHIFN β-APL10 100 ng을 PCR 증폭에 대한 주형으로서 사용하였다:
122602-1TPF AvrII-G4S-IFN 베타 정방향 (서열 22):
122602-2TPR IFN 베타 NheI-SalI-XhoI 역방향 (서열 23):
부분적 APL-10-β-IFN 551 bp PCR 생성물을 생산하기 위해 사용되는 정방향 프라이머를 프레임으로 sFv 폴리펩티드 APL-10의 C-말단에 삽입될 수 있는 5개의 아미노산 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)을 코딩하는 합성 링커를 코딩하는 서열을 포함하도록 디자인하였다. 3-단계 PCR 증폭 반응은 아닐링 온도가 55 ℃인 5회 사이클, 이어서 60 ℃인 30회 사이클을 포함하였다. 551 bp PCR 생성물을 QIAquick 칼럼 정제하고, pCR 블런트 II TOPO 중간 벡터 내로 클로닝하였다. 미니프랩 DNA를 제조하고, 양성 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 서열 확인 후에, PCR 생성물을 APL-10E 벡터 (pELK 벡터 유도제)의 AvrII/SalI 부위 또는 AvrII/XhoI 절단 APL-2005S 벡터 (pSyn 벡터 유도제) DNA 내에 삽입하였다. 미니프랩 DNA를 제조하고, 양성 클론을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 양성 벡터 클론을 도 2에 나타내고, 상기 클론은 하기 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 코딩하고 N-말단으로부터 배향되는 키메라 DNA 서열 (서열 24)을 함유한다: (NH2)-pel-B 리더-sFv-Gly4Ser 링커-β-IFN-(COOH).
sFv-β-IFN 키메라 DNA 서열 (서열 24):
포유동물 세포에서의 sFv-β-IFN의 발현은 적합한 신호 펩티드 서열의 사용을 요구하였다. PelB 신호 펩티드는 이. 콜라이 신호 서열이다. 포유동물 세포의 경우, 본 발명자들은 조직 플라스미노겐 활성인자 (TPA) 신호 펩티드 (젠뱅크 #NM_033011)를 사용하였다. PCR 프라이머 MG TPA- APL10 5'프라이머 (서열 25) 및 MG APL10 3'프라이머 (서열 26)를 통해 TPA 신호 펩티드를 sFV에 융합시켰다.
MG TPA-APL10 5'프라이머 (서열 25):
MG APL10 3'프라이머 (서열 26):
생성된 TPA 신호 펩티드 (tpa SigP)-APL10 pcr 생성물을 EcoRV 및 NotI로 절단하고, 아가로스 겔 전기영동을 통해 단리하였다. 절단된 tpa-SigP-APL10을 동일한 효소로 절단한 pgWIZ 내로 삽입하였다. pgWIZtpaSigP-APL10의 생성된 클론을 스크리닝하고, 하나를 선택하고, 서열을 확인하였다.
프라이머 MG sigP(-)HIFNβ 5' (서열 27) 및 MG HIFN 3' (서열 28) 및 주형으로서 pDIZ HIFNβ-APL10을 사용하는 PCR에 의해 IFNβ 영역을 증폭하였다. 야생형 신호 펩티드를 제거하고, (Gly-Gly-Gly-Ser)x2 링커와 교체하였다. 신호 펩티드 마이너스 HIFNβ pcr 생성물을 AvrII 및 NotI로 절단하고, 동일한 효소로 절단한 pgWIZtpaSigP-APL10 내로 삽입하여 pgWIZtpaSigP-APL10-HIFNβ를 제조하였다. 생성된 생성물을 미니프랩으로 스크리닝하고, 서열분석으로 확인하였다. tpaSigP-APL10-HIFNβ를 pDIZ 내로 서브클로닝하기 위해, pgWIZtpaSigP-APL10-HIFNβ를 EcoRV 및 NotI로 절단하고, tpaSigP-APL10-HIFNβ 단편을 겔 정제하였다.
MG sigP(-)HIFNβ 5' (서열 27):
MG HIFNβ 3' (서열 28):
tpaSigP-APL10-HIFNβ 단편을 EcoRV 및 NotI로 절단한 pDIZ 내로 삽입하여 pDIZtpaSigP-APL10-HIFNβ를 제조하였다. 전장 삽입물을 서열분석하고, 올바른지를 확인하였다.
TPA SigP-APL10-IFNβ (서열 29):
하나의 올바른 클론을 선택하고, 플라스미드 DNA (pDNA)를 퀴아젠 맥시프랩으로 수득하였다. DNA (pDIZ-tpa SigP-APL10-IFNβ)를 리포펙타민 2000 (인비트로겐)으로 CHO dhfr(-) 세포 내로 형질감염시키고, AZ-IFBC 단백질 발현 및 분비를 3일 후에 웨스턴 블롯으로 조사하였다. 본 발명자들은 항-인간 IFN-β 모노클로날 항체 (R & D 시스템즈, cat. #MAB814)를 사용하였다. 상기 단백질을 단백질 A 세파로스 칼럼 1 ml에 가하여 정제 가능성을 조사하였다. 정제된 AZ-IFBC를 APL10 도메인의 기능성에 대해 상기 기재한 바와 같이 Rat D6에 대한 결합에 대해 분석하였다. IFNβ 도메인을 하기 기재하는 바와 같이 바이러스-유도 (수포성 구내염 바이러스, VSV) 세포변성 영향 (cpe)의 억제에 의해 조사하였다.
상기 실시예는 융합 단백질로서의 sFv-β-IFN 컨쥬게이트의 제조를 기재하지만, 당업자는 추가 방법 (예컨대, 화학적 가교, 입자 중의 캡슐화 등)이 β-IFN을 적절한 표적화 요소와 결합시키는 데 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. sFv-β-IFN을 이. 콜라이 및 포유동물 CHO-dhfr(-) 세포에서 발현시켰다. 발현시킨 sFv-β-IFN은 sFv-IL-2에 대해 본원에 기재한 바와 같이 단백질-A- 세파로스 친화성 칼럼을 사용하는 FPLC에 의해 정제하였다.
β-IFN 활성은 이전에 기재된 바와 같이 세포변성 영향 억제 분석을 사용하여 측정할 수 있다 [Rubinstein, S., Familletti, P.C., and Pestka, S. (1981) "Convenient Assay for Interferons," J. Virol. 37,755-758; Familletti, P.C., Rubinstein, S., and Pestka, S. (1981)" A Convenient and Rapid Cytopathic Effect Inhibition Assay for Interferon," in Methods in Enzymology, Vol. 78 (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York, 387-394]. β-IFN에 대한 항바이러스 분석에서, β-IFN의 약 1 단위/ml가 세포 배양액 단층의 50％를 보호하기 위해 요구되는 양이다. 상기 단위는 미국 국립 보건원에 의해 제공된 β-IFN에 대한 국제적 참조 표준에 관하여 결정한다 [Pestka, S. (1986) "Interferon Standards and General Abbreviations, in Methods in Enzymology (S. Pestka, ed.), Academic Press, New York 119, 14-23].
실시예 13 - sFv-I-TAC 융합 단백질을 코딩하는 발현 작제물의 제조
PBMC를 인터페론-알파로 3시간 동안, 이어서 전체 RNA로 자극시키고, cDNA를 이전 실시예에 약술한 바와 같이 제조하였다. PCR 증폭을 사용하여 증폭된 I-TAC를 APL10 코딩 서열에 Gly4Ser 링커로 연결하였다.
I-TAC를 그의 천연 리더 서열 및 APL10과 함께 코딩하는 서열은 PCR을 통해 하기 프라이머로 증폭하였다:
PCR을 약 60 ℃에서 25회 사이클 동안 수행하였다.
I-TAC의 서열 (젠뱅크 기탁 번호 AF30514; 밑줄친 서열을 코딩함)은 하기와 같다 (서열 36):
PCR 생성물을 상기 실시예에 기재한 바와 같이 이어서 적절한 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 이어서, 재조합 I-TAC 융합 단백질의 기능적 활성은 당업계에 공지된 바와 같이 변경된 보이덴 (Boyden) 챔버를 사용하는 시험관내 화학주성 분석으로 8-14일 동안 IL-2와 배양한 PHA-자극 T 림프구인 표적 세포를 사용하며 평가하였다.
실시예 14 - 동물 점적주입 연구
도 1은 하기 생체내 수송 연구에 사용되는 pIgR 에피토프에 결합되는 sFv의 도식적 구조를 나타낸다. Pelb 리더 (이. 콜라이로부터의 분비물에 결합하는 리더 서열); 링커 (아미노산 서열 (gly-gly-gly-gly-ser)n); H6, (6xHis 태그); 시스테인 태그 (아미노산 서열 gly-gly-gly-gly-cys); 및 sFv의 중쇄 및 경쇄를 나타낸다. 선별된 sFv는 변형된 FR2 영역, 쌍이 아닌 내부 시스테인, C-말단 His 태그, 및 단일 링커 반복을 포함한다. 이 작제물은 거의 상동성인 이량체 sFv 형성물에 결합한다.
pIgR 에피토프에 결합하고, 이전 실시예에 따라 제조한 "디아바디" sFv를 래트 및(또는) 사이노몰구스 (마카 파스시쿨라리스 (Macca fascicularis)) 원숭이에 투여하였다. 래트에 투여하는 경우에, 기관을 작은 절개로 노출시키고, 가느다란 바늘을 기관의 고리 사이에 삽입하였지만, 일부 실험에서는, 튜브를 래트의 기관 내로 입을 통해 삽입하였다. 원숭이 투여의 경우에, 사이노몰구스 원숭이를 케타민 (10 mg/kg, IM)으로 마취시켰다. 소아과 굴곡성 기관지경을 사용하여 단일 투여량의 화합물을 오른쪽 폐의 상부 기관지 내로 스며들게 하였다. 투여량을 1분 당 대략 1 ml의 속도로 주입하였다. 투여량 부피는 0.5 ml/kg에서 유지하였다. 제제는 또한 1 mg/ml의 태아 혈청 알부민 (BSA)을 담체 단백질로서 함유하였다.
혈액 샘플을 각종 시간대에서 수집하고, 혈장을 혈액으로부터 수득하였다. 화합물의 혈장 농도는 2가지 상이한 방식의 분석 형식을 사용하여 탐지하였다. 제1 분석에서, GST-도메인 6 (pIgR 스톡을 함유함)을 사용하여 특이적으로 화합물을 포착하고 (활성 결합 부위가 화합물 상에 요구됨), 화합물을 인식하는 폴리클로날 항체를 사용하여 탐지를 달성하였다. 제2 형식에서, 포착 및 탐지는 모두 화합물에 대한 폴리클로날 항체를 사용하여 달성하였다 (샌드위치 분석). 이 형식에서, 항체 조합 부위가 기능적으로 반드시 필요하지는 않지만, 다른 경우라면 분자는 무손상이어야 한다.
사용하는 재조합 단백질을 모두 HBSS 완충액 또는 HSN 완충액에서 배합하였다. HBSS 완충액은 1.26 mM CaCl2, 5.36 mM KCl, 156.9 mM NaCl, 25 mM D-글루코스, 22.9 mM HEPES, 1.64 mM MgSO4, 0.44 mM KH2PO4, 0.62 mM Na2HPO4, 4.35 mM NaHCO3 (pH 7.0로 조정함)을 함유하였다. HSN 완충액은 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 및 146 mM 수크로스 (pH 7.0)를 함유하였다. 계산된 오스몰농도가 545 mOsm이었다. 생리학적 오스몰농도는 대략 300 mOsm이었다.
화합물의 반감기는 화합물 0.8 mg을 정맥내 주사하고, 시간 함수로서 혈장 농도를 측정함으로서 측정하였다. 혈장 및 담즙 중의 전달된 제제의 농도에서 대략 4 로그 감소를 24시간에 걸쳐 관찰하였다. 원숭이의 담관을 캐뉼러삽입하여 샘플을 수집하고, 화합물 존재에 대해 분석할 수 있었고, 화합물이 담즙에 유의한 양으로 존재하지 않았음을 측정하였다.
실시예 15 - pIgR 스톡 sFv를 갖는 원숭이 연구
제2 화합물 (AZ2로 지정) 및 음성 대조군과 비교하여 이전 실시예에서 얻은 결과를 확인하기 위해 제2 원숭이 실험 (AZ1로 지정)을 디자인 하였다. 음성 대조군은 pIgR을 인식하지 않는 c-erbB-2에 결합하는 항체 단편이었다. c-erbB-2는 폐에서 저수준으로 발현될 수 있는 종양유전자 생성물이다. 9마리의 원숭이를 사용하고, 각 군 당 3마리의 원숭이로 3 군으로 나누었다. 제1 군에 AZ1 (1 mg/kg)을 투여하고, 제2 군은 AZ2 1 mg/kg 투여하고, 제3 군은 음성 대조군 (1 mg/kg)을 투여하였다. 3가지 리간드는 모두 동일한 분자량 (56 kD)을 가졌다. 화합물은 각각 상부 기관지를 향하는 소아과 기관지경을 사용하여 투여하였다.
도 2는 화합물 AZ1이 혈액 내로 12시간의 Tmax로 수송되었음을 나타낸다. 또한, 계산된 평균 생체이용성은 35.6 +-9.6％이었다. 이전 실시예 연구에서, 상부 기관에 화합물을 투여한 2마리의 원숭이는 기관지에 투여된 2마리의 원숭이에 비해 더 낮은 Cmax를 나타냈다. 이 불일치는 전체 평균 생체이용성을 낮추며, 이는 점액섬모 청소 메카니즘에 의해 기대되는 더 빠른 청소율과 관련될 수 있다.
도 2에 나타낸 결과는 또한 IT 투여 후에 AZ2 유사물질을 혈액 내로 수송하였음을 나타낸다. 얻어진 평균 Cmax는 329 +-45 ng/ml이고, Tmax는 12시간째에 도달하였다. 이들 약동학 파라미터는 AZ1로 얻어진 결과 (평균 Cmax = 397 +- 202 ng/ml 및 Tmax = 12시간)와 유의하게 상이하지 않았다. 대조적으로, 내부-기관 투여 후에 pIgR에 결합하지 않는 음성 대조군은 더 낮은 정도로 수송되었다. 음성 대조군에 대한 평균 Cmax는 80 +-48 ng/ml이고, Tmax는 8시간까지 도달하였다. 이들 결과는 음성 대조군이 AZ1 및 AZ2 화합물과는 상이한 메카니즘에 의해 수송되었음을 나타낸다.
실시예 16 - 원숭이 에어로졸 투여 연구
pIgR 에피토프에 결합하고, 실시예 5에 따라 제조한 "디아바디" sFv를 또한 사이노몰구스 원숭이에 에어로졸 제제로서 투여하였다. 이 실시예에서, 아에로네브 프로 (Aeroneb Pro) 연무기 (미국 캘리포니아주 써니베일 소재의 아에로겐, 인크. (aerogen, Inc.))를 사용하여 sFv의 액체 제제를 에어로졸화시켰다. 에어로졸 생성을 수용 동물의 호흡 사이클의 흡기상 동안 수행하고, 이를 기관내 튜브를 통해 전달하였다. 대상체 동물에서 프로포폴 (8-10 mg/kg)의 IV 볼루스로 마취를 유도하고, 동일한 마취제를 0.4 mg/kg/분으로 IV 주입함으로써 유지하였다. 대상체 동물을 철폐 ("스팡러 박스 (Spangler Box)")에 두어서 동물의 호흡 사이클을 제어하였다.
동물을 3개의 노출 군으로 나누었다:
군 총 흡입 투여량 PSD 폐활량 (％) 호흡 중지
1 1.5 mg/kg 2-3 ㎛ 75％ 예
2 1.5 mg/kg 2-3 ㎛ 40％ 아니오
3 5 mg/kg 75％ 예
호흡 사이클을 1분 당 6-8회 호흡으로 고정하고, 각 동물을 표적 투여량을 전달하기에 충분한 회수의 흡기에 노출시켰다. 투여량 1.5 mg/kg을 선택하여 sFv의 흡입 투여량 1 mg/kg을 달성하였다. PSD는 에어로졸화된 물질의 입자 크기 분포를 나타낸다; 폐활량 (％)은 폐활량의 백분율로서 1회 호흡량의 크기를 나타낸다. 1 및 3군 동물을 전달 동안 각 흡기에 대해 4초 호흡 중지에 노출시켰다.
1.5 mL 혈액 샘플을 동물 연구의 말초 정맥으로부터 수집하였다. 샘플을 노출 전, 및 노출 약 1, 2, 4, 6, 8, 12, 18, 24, 36, 48 및 72 시간 후에 수집하였다.
1회 호흡량 75％ 및 40％에서 달성한 혈장 농도를 도 3에 나타낸다. 달성된 결과의 생체이용성은 1회 호흡량 75％ 및 40％에 대해 각각 45.4％ 및 27.1％이었다. 에어로졸, 점적주입 및 IV 전달의 비교 (도 4)는 pIgR에 결합하는 sFv의 폐 전달 방법들 모두가 첨단부에서 기저외측으로의 유효한 제제 전달을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
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본 발명은 본원에 넓게 및 일반적으로 기재되었다. 포괄적 개시내용 내에 속하는 더 좁은 종 및 더 낮은 포괄적 분류 각각도 본 발명의 부분을 형성한다. 여기에는 삭제된 물질이 본원에 구체적으로 인용되는지와는 무관하게 해당 속으로부터 임의의 대상체물을 삭제하는 단서 또는 음성적 제한과 함께 본 발명의 포괄적 기재가 포함된다.
기타 실시양태도 하기 청구의 범위 내에 속한다. 또한, 본 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 군의 용어로 기재되는 경우에, 당업자는 본 발명이 마쿠쉬 군의 임의의 개별 구성원 또는 그 구성원의 하위군의 용어로 그에 의해 기재되는 것으로도 인식될 것이다.
관련 출원
본 출원은 미국 가출원 제60/439,373호 (2003년 1월 9일 출원), 동 제60/480,047호 (2003년 6월 20일 출원) 및 동 제60/494,841호 (2003년 8월 12일 출원)의 이점을 청구하며, 상기 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
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<220> <223> Description of Artificial Sequence: sFv-alpha-IFN chimera nucleotide sequence <400> 18 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggcccagg tacagctgca gcaatcaggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atgctatgca ctgggtccgc 180 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca 240 tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaacgc caagaactca 300 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gatacccgag ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 420 ggcggagggt catctgagct gactcaggac cctgctatgt ctgtggcctt gggacagaca 480 gtcagaatca catgtcaagg ggacagtctc agaaagtatc atgcaagctg gtatcagcag 540 aagccagggc aggcccctgt tcttgtcatc tatggtaaga atgaacgtcc ctcagggatc 600 ccagagcgat tctctgggtc cacctcagga gacacagctt ccttgaccat cagtgggctc 660 caggcggaag atgaggctga ctattactgt cactcccgag actctaatgc tgatcttgtg 720 gtgttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtggtg gcggagggtc 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Sequence: Primer <400> 26 cgcggccgct caacctagga cggtgacctt ggtccctccg ccgaacacca 50 <210> 27 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 27 gtcctaggtg gcggcggaag cggcggaggc tccatgagct acaacttgct tggattccta 60 caaagaagca gca 73 <210> 28 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 28 tgcggccgct tagctagctt attagtttcg gaggtaacct gtaagtctgt taatgaagta 60 aaagttcct 69 <210> 29 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: TPA SigP-APL10-IFN-beta <400> 29 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccagcc aggtacagct gcagcaatca gggggaggcg tggtccagcc tgggaggtcc 120 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatgctat gcactgggtc 180 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcagcta ttagtggtag tggtggtagc 240 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac 300 tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg 360 agagataccc gagggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcctca 420 ggtggcggag ggtcatctga gctgactcag gaccctgcta tgtctgtggc cttgggacag 480 acagtcagaa tcacatgtca aggggacagt ctcagaaagt atcatgcaag ctggtatcag 540 cagaagccag ggcaggcccc tgttcttgtc atctatggta agaatgaacg tccctcaggg 600 atcccagagc gattctctgg gtccacctca ggagacacag cttccttgac catcagtggg 660 ctccaggcgg aagatgaggc tgactattac tgtcactccc gagactctaa tgctgatctt 720 gtggtgttcg gcggagggac caaggtcacc gtcctaggtg gcggcggaag cggcggaggc 780 tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag 840 ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tactgcctca aggacaggat gaactttgac 900 atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc 960 tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg 1020 aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag 1080 acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gatttcacca ggggaaaact catgagcagt 1140 ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt 1200 cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga 1260 cttacaggtt acctccgaaa ctaa 1284 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 gactgatatc gccaccatga gtgtgaaggg catggct 37 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 31 atcaaaaaag ttgaaagaaa gaattttggg ggtggaggca gc 42 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 32 gctgcctcca cccccaaaat tctttctttc aacttttttg at 42 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 gggggtggag gcagccaggt acagctgcag caatca 36 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 34 caaggtcacc gtcctaggtt aagcggccgc 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 35 gcggccgctt aacctaggac ggtgaccttg 30 <210> 36 <211> 1371 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctccttccaa gaagagcagc aaagctgaag tagcagcaac agcaccagca gcaacagcaa 60 aaaacaaaca tgagtgtgaa gggcatggct atagccttgg ctgtgatatt gtgtgctaca 120 gttgttcaag gcttccccat gttcaaaaga ggacgctgtc tttgcatagg ccctggggta 180 aaagcagtga aagtggcaga tattgagaaa gcctccataa tgtacccaag taacaactgt 240 gacaaaatag aagtgattat taccctgaaa gaaaataaag gacaacgatg cctaaatccc 300 aaatcgaagc aagcaaggct tataatcaaa aaagttgaaa gaaagaattt ttaaaaatat 360 caaaacatat gaagtcctgg aaaagggcat ctgaaaaacc tagaacaagt ttaactgtga 420 ctactgaaat gacaagaatt ctacagtagg aaactgagac ttttctatgg ttttgtgact 480 ttcaactttt gtacagttat gtgaaggatg aaaggtgggt gaaaggacca aaaacagaaa 540 tacagtcttc ctgaatgaat gacaatcaga attccactgc ccaaaggagt ccagcaatta 600 aatggatttc taggaaaagc taccttaaga aaggctggtt accatcggag tttacaaagt 660 gctttcacgt tcttacttgt tgtattatac attcatgcat ttctaggcta 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 38 Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 39 Leu Asn Gln Leu Thr 1 5 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Tyr Trp Cys Lys Trp 1 5 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gly Trp Tyr Trp Cys 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Ser Thr Leu Val Pro Leu 1 5 <210> 43 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ser Tyr Arg Thr Asp 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gln Asp Pro Arg Leu Phe 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Lys Arg Ser Ser Lys 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 46 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 47 Gly Ser Gly Ser 1 <210> 48 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 48 Gly Ser Ser Gly 1 <210> 49 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 49 His His His His His His 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 50 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 51 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 52 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 52 Gly Gly Gly Gly Cys 1 5 <210> 53 <211> 774 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Nucleotide sequence of pIgR-directed sFv (APLP10) <400> 53 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggcccagg tacagctgca gcaatcaggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atgctatgca ctgggtccgc 180 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca 240 tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaacgc caagaactca 300 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gatacccgag ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 420 ggcggagggt catctgagct gactcaggac cctgctatgt ctgtggcctt gggacagaca 480 gtcagaatca catgtcaagg ggacagtctc agaaagtatc atgcaagctg gtatcagcag 540 aagccagggc aggcccctgt tcttgtcatc tatggtaaga atgaacgtcc ctcagggatc 600 ccagagcgat tctctgggtc cacctcagga gacacagctt ccttgaccat cagtgggctc 660 caggcggaag atgaggctga ctattactgt cactcccgag actctaatgc tgatcttgtg 720 gtgttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggttaat aagtcgacct cgac 774 <210> 54 <211> 1197 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Nucleotide sequence of pIgR-directed sFv-IL-2 fusion construct <400> 54 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60 atggcccagg tacagctgca gcaatcaggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120 agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atgctatgca ctgggtccgc 180 caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca 240 tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaacgc caagaactca 300 ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360 gatacccgag ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 420 ggcggagggt catctgagct gactcaggac cctgctatgt 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Claims (52)

  1. 리간드에 결합되는 치료제 및 표적화 요소를 포함하는 화합물을 대상체에 폐, 구인두 또는 비인두 경로를 통해 투여하는 것을 포함하며, 여기서 표적화 요소는 시험관내 세포전달 분석에서 첨단부에서 기저외측으로의 세포전달을 치료제에 부여하는, 대상체에서의 폐 질환의 치료 또는 예방 방법.
  2. 제1항에 있어서, 리간드가 pIgR, pIgR 스톡 (stalk), 트랜스페린 수용체, 아포-트랜스페린, 할로-트랜스페린, 비타민 B12 수용체, FcRn, 인테그린, Flt-1, Flk-1, Flt-4, GPI-연결 단백질, 스캐빈저 수용체, 폴레이트 수용체 및 저밀도 지단백질 수용체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 리간드가 pIgR 스톡인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 표적화 요소가 pIgR의 비-분비 성분 영역에 결합하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 치료제가 폴리펩티드 또는 핵산인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 치료제가 면역계 조절인자인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 치료제가 항-종양제, 항-감염제, 항-혈관신생제 및 아포프토시스 유도제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 치료제가 효소, 인터루킨, 인터페론, 시토킨, 케모킨, TNF, 탁솔, 항체 및 이들 2 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 치료제가 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론-γ, IP-10, I-TAC, MIG, 이들의 기능성 유도체 및 이들 2 이상의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 치료제가 IL-2, 인터페론 α, 인터페론 β 및 이들의 기능성 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 화합물을 흡입을 통해 투여하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 조성물이 액체 입자 및 고체 입자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 조성물을 평균 크기 약 1 ㎛ 내지 약 20 ㎛의 액체 입자로서 투여하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 조성물을 평균 크기 약 1 ㎛ 내지 약 10 ㎛의 액체 입자로서 투여하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 화합물 또는 그의 치료적 부분이 유효 투여량의 화합물 또는 그의 치료적 부분의 전달을 발생시키는 약동학 프로파일로 폐 내에 전달되는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 대상체에 투여된 10％ 이상의 화합물, 또는 그의 치료적 부분 또는 대사산물이 폐 관강으로부터 첨단부에서 기저외측으로 세포전달되는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 대상체에 투여된 20％ 이상의 화합물, 또는 그의 치료적 부분 또는 대사산물이 폐 관강으로부터 첨단부에서 기저외측으로 세포전달되는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 표적화 요소가 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드, 항체, 항체 단편, 단일-쇄 가변성 영역 단편, 소분자, 올리고뉴클레오티드, 올리고당, 다당, 탄수화물, 시클릭 폴리펩티드, 펩티드모방체 및 압타머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 폐 질환이 폐의 원발성 종양인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 폐 질환이 원발성 종양으로부터의 폐 전이인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 원발성 종양이 육종, 선암종, 융모막암종 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 원발성 종양이 결장 선암종, 유방 선암종, 유윙 육종, 골육종 및 신 세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 제20항에 있어서, 원발성 종양이 신 세포 암종인 방법.
  24. 제20항에 있어서, 폐 전이의 임상적 지표가 고립성 전이, 캐논볼, 암종성 림프관염 및 흉막 삼출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 폐 질환이 기도 감염인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 폐 질환이 폐 감염인 방법.
  27. 제1항에 있어서, 폐 질환이 박테리아 감염인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 박테리아 감염이 결핵을 유발하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 폐 질환이 바이러스 감염인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 바이러스 감염이 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)을 유발하는 것인 방법.
  31. 제1항에 있어서, 폐 질환이 진균 감염인 방법.
  32. 제1항에 있어서, 폐 질환이 폐렴을 유발하는 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 폐 질환이 간질 (interstitium) 장애인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 폐 질환이 기체 교환 또는 혈액 순환 장애인 방법.
  35. 제1항에 있어서, 폐 질환이 기도 질환인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 폐 질환이 흉막 질병인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 폐 질환이 COPD인 방법.
  38. 제1항에 있어서, 폐 질환이 천식인 방법.
  39. 제1항에 있어서, 대상체에 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  40. 제1항에 있어서, 대상체에 감염원에 대한 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  41. 제1항에 있어서, 대상체에 암성 제제에 대한 백신 또는 암-관련 폴리펩티드에 대한 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  42. 제2항에 있어서, 표적화 요소가 LRKED, QLFVNEE, LNQLT, YWCKW, GWYWC, STLVPL, SYRTD, QDPRLF 및 KRSSK로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 pIgR 또는 pIgR 스톡 상의 에피토프에 결합하는 것인 방법.
  43. 제2항에 있어서, 표적화 요소가
    KRSSK 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R1,
    SYRTD 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R2a,
    SYRTD 내지 KRSSK의 R2b,
    STLVPL 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R3a,
    STLVPL 내지 KRSSK의 R3b,
    STLVPL 내지 SYRTD의 R3c,
    GWYWC 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R4a,
    GWYWC 내지 KRSSK의 R4b,
    GWYWC 내지 SYRTD의 R4c,
    GWYWC 내지 STLVPL의 R4d,
    YWCKW 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R5a,
    YWCKW 내지 KRSSK의 R5b,
    YWCKW 내지 SYRTD의 R5c,
    YWCKW 내지 STLVPL의 R5d,
    YWCKW 내지 GWYWC의 R5e,
    LNQLT 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R6a,
    LNQLT 내지 KRSSK의 R6b,
    LNQLT 내지 SYRTD의 R6c,
    LNQLT 내지 STLVPL의 R6d,
    LNQLT 내지 GWYWC의 R6e,
    LNQLT 내지 YWCKW의 R6f,
    QLFVNEE 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R7a,
    QLFVNEE 내지 KRSSK의 R7b,
    QLFVNEE 내지 SYRTD의 R7c,
    QLFVNEE 내지 STLVPL의 R7d,
    QLFVNEE 내지 GWYWC의 R7e,
    QLFVNEE 내지 YWCKW의 R7f,
    QLFVNEE 내지 LNQLT의 R7g,
    LRKED 내지 pIgR의 카르복시 말단의 R8a,
    LRKED 내지 KRSSK의 R8b,
    LRKED 내지 SYRTD의 R8c,
    LRKED 내지 STLVPL의 R8d,
    LRKED 내지 GWYWC의 R8e,
    LRKED 내지 YWCKW의 R8f,
    LRKED 내지 LNQLT의 R8g 및
    LRKED 내지 QLFVNEE의 R8h로 이루어진 군으로부터 선택되는 영역으로 pIgR 또는 pIgR 스톡에 결합하는 것인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 화합물이 추가로 PTD 또는 MTS를 포함하는 것인 방법.
  45. 제1항에 있어서, 화합물이 추가로 제2 표적화 요소를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 제2 표적화 요소가 제1 표적화 요소와 동일한 실질적으로 동일한 것인 방법.
  47. 제1항에 있어서, 표적화 요소가 리간드에 대한 2 내지 4개의 결합 부위를 포함하는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 표적화 요소가 항체, Fab 단편 및 단일 쇄 가변성 영역 단편 (sFv) 디아바디로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  49. 제1항에 있어서, 표적화 요소가 2 내지 4개의 단일 쇄 가변성 영역 단편 (sFv)을 포함하며, 각각의 sFv가 경쇄 가변성 도메인에 직접 또는 폴리펩티드 링커를 통해 공유결합 연결된 중쇄 가변성 도메인을 포함하며, 여기서 하나 이상의 sFv는 치료제와 공유결합 또는 비-공유결합된 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 하나 이상의 sFv가 pIgR에 결합하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 하나 이상의 sFv가 pIgR의 비-분비 성분 영역에 결합하는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 하나 이상의 sFv가 pIgR 스톡에 결합하는 것인 방법.
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