KR20050100616A

KR20050100616A - 전신성 홍반성 낭창의 치료를 위한 펩티드의 비경구 제제

Info

Publication number: KR20050100616A
Application number: KR1020057013097A
Authority: KR
Inventors: 쉐런 코헨-베레드; 에스미라 나프탈리; 베라 베인스테인; 아드리안 길버트; 에티 클링거
Original assignee: 테바 파마슈티컬 인더스트리즈 리미티드
Priority date: 2003-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2005-10-19
Also published as: US20040180059A1; NO20053761D0; EA008438B1; CA2513331A1; UA83816C2; EA200501129A1; NO20053761L; CR7936A; BRPI0406737A; WO2004064788A2; CN1761477A; ZA200506205B; EP1587525A4; AU2004206844A1; MXPA05007552A; US7294687B2; ECSP055960A; WO2004064788A3; JP2006516034A; EP1587525A2

Abstract

본 발명은, 수용성 캐리어; NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지며, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 약제학적으로 타당한 염의 조성물; 및 상기 수용성 캐리어에 상기 펩티드를 용해시키기 위한 효과적인 양을 가진 치환된 β-시클로덱스트린을 포함하고, 상기 조성물은 4와 9 사이의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 준비를 위한 방법, 및 대상 인간에게 상기 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 징후를 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

전신성 홍반성 낭창의 치료를 위한 펩티드의 비경구 제제{Parenteral formulations of a peptide for the treatment of systemic lupus erythematosus}

본 출원은 그의 전체 내용들이 여기에 참조로 결합되어 있는 2003년 1월 14일에 제출된 미국 가출원번호 60/439,950의 이익을 주장한다.

이 출원을 통하여, 다양한 공개공보들이 충분한 인용들에 의하여 참조된다. 이들 공개공보들의 전체로서의 개시들은 여기에서 설명되고 주장된 본 발명일의 시점에서 그 안에서 통상의 지식을 가진 자들에게 알려진 것처럼 기술의 상태를 보다 충분히 설명하기 위하여 이 출원에 참증으로 결합된다.

전신성 홍반성 낭창(SLE), 또는 루퍼스는 인체를 약화시키는 자기면역 질병으로서, dsDNA, 핵 항원 및 리보핵단밸질에 대한 항체들을 포함하는 자가 항체들의 배열의 존재를 특징으로 한다. SLE는 2000명 중에서 약 1명에게 영향을 미친다(미국의 경우 여성 200명 중 1한 명). 이 질병은 주로 여성에게 영향을 미치는데, 여성 : 남성의 비율은 9 : 1이다.

전신성 루퍼스는 신체의 거의 어떠한 기간이나 계에 영향을 미칠 수 있다. 전신성 루퍼스는 그 징후가 있더라도 분명하지 않은 시기 ("소강상태")와 그 질병이 더 활발하게 되는 시기 ("발적")의 주기들을 포함한다. 사람들이 "루퍼스"를 언급할 때, 가장 빈번하게 질병의 전신성 형태라고 한다.

코르티코스테로이드(corticosteroids)는 전신성 자가면역 질병들을 치료하는데 있어서 주된 성분이다. SLE의 생명 위협, 심각하게 불구가 되는 징후들은 고량의 글루코코르티코이드(glucocorticoids) (1-2 mg/kg/일)로 치료된다. 만성적인 글루코코르티코이드의 바람직하지 않은 효과들은 쿠신고이드 체질, 중심 비만, 고혈압, 감염, 모세관 약화, 다모증, 가속화된 골다공증, 백내장, 당뇨병, 근질환 및 정신병과 같은 분명한 역효과들의 배열을 포함한다. 코르티코스테로이드 독성외에도, 투약 계획에 대한 환자의 순응도는 또한 심각한 문제를 야기한다.

SLE는 오늘까지 어떤 확실한 치료약물이나 치료방법이 없는 염증성 질환이다. 이 질환은 급성 그리고 만성의 합병증을 일으킨다. 유일하게 가능한 치료방법은 일시적 완화 요법이며 이것은 급성적 증후를 가라앉히고 만성적 합병증을 예방하는데 목적을 둔 것으로 종종 심각한 부작용을 동반한다. 그러므로 이 분야에는 충족되지 못하는 요구사항이 있고, 의사와 환자 모두가 이 질환의 원하지 않는 증상의 발현을 잠재적으로 제거하거나 또는 감소시킬 수 있는 새로운 치료방법을 환영할 것이다.

펩티드는 SLE와 연관된 반응들을 면역적으로 조정할 수 있는 인간 단일세포 유래 항체인 anti-DNA 16/6Id 항체(Human monoclonal anti-DNA 16/6Id )의 상보성-결정 부분에 근거한 것으로서, PCT 국제 출원 번호 WO 02/067848 A2에서 개시되어 있고, 그 전체 내용은 여기서 참조로 결합되었다. 특히 CDR1 부분은 SLE 환자의 인간 anti-DNA 16/6Id 항체(Human anti-DNA 16/6Id ) mAB에 대한 말초 혈액 림프구(PBL)의 급속히 확산되는 반응을 억제하고 자발적이거나 또는 실험적으로 발병된 SLE를 앓고 있는 쥐의 질병 발현을 개선시키는 것으로 밝혀졌다.

도 1에 제시된 인간 CDR1, 화합물 1은 16/6 Id (Waisman, A., 등 " 병원성 anti-DNA 단일세포 유래항체의 상보성 결정 부분에 근거한 펩티드들을 이용한 쥐의 전신 홍반성 난창의 조정" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), 94(4): 4620-4625)에 개술된 인간 anti-dsDNA mAB의 상보성 결정 부문 1(CDR1)에 근거한 9개의 아미노산의 합성 펩티드이다.

mCDR 근거 펩티드 또는 화합물 1로 치료받은 실험적 SLE 모델들-BA1B/C 쥐와 SLE 경향의 쥐,즉 (NZBxNZW)F1 쥐 -에서 SLE 관련 발현들- 특히 신장에서의 면역 복합성 침전물(ICD),단백뇨, 백혈구감소증-이 현저히 감소되었다. 그 치료법은 16/6 Id의 특정 항체 반응( Waisman, A.,등 " 병원성 anti-DNA 단일세포 유래항체의 상보성 결정 부분에 근거한 펩티드들을 이용한 쥐의 전신 홍반성 난창의 조정" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), 94(4): 620; Eilat, E., 등," (NZBxNZW)F1 쥐에서 병원성 자가항체의 펩티드에 근거한 CDR1- 과 CDR3- 로 치료법을 이용한 전신 홍반성 난창 계통의 질환 예방" J. Clin, Immunol. (2000): 268 ; Eilat, E., 등,"병원성 anti-DNA 항체의 상보성 결정 부분 1(CDR1)에 근거한 펩티드들에 의한 기전은 실험적인 SLE를 개선한다" (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 1148)에서는 아무 효과가 없었다.

이들 펩티드들은 많은 펩티드처럼 아주 가용성인 것은 아니다. 그러므로 펩티드의 용해도를 증진시킬 수 있는 제법이 요구된다.

도 1은 아세테이트 아세테이트 염으로서의 인간 CDR1(화합물 1)으로서, hCDR1의 분자식과 구조식, 아미노산 서열, 그리고 물리적인 변수들을 보여준다.

도 2는 세포들이 PBS에서 화합물 1의 용액으로 활성화된 후 화합물 1과 캅티솔(등록상표) 용액으로 처리된 생쥐로부터 얻어진 세포들로부터의 IL-2 분비로서,

-■- 화합물 1 (RS) 50㎍/생쥐

-▲- 화합물 1 (RS) 200㎍/생쥐

-□- DP 50㎍/생쥐

-△- DP 200㎍/생쥐

-ㅇ- 12% 앰플로 된 캅티솔.

도 3은 세포들이 EM-1 (2.5 ×10⁶ cells/well)에서 화합물 1의 용액으로 활성화된 후 화합물 1로 치료된 생쥐로부터 취하여진 세포들로부터의 IFN-γ분비로서,

-◆- 플라시보

-●- 화합물 1 50㎍/생쥐 (치료 투여량)

-△- 화합물 1 100㎍/생쥐 (치료 투여량)

-X- 화합물 1 200㎍/생쥐 (치료 투여량).

도 4는 세포들이 EM-1 (5 ×10⁶ cells/well)에서 화합물 1의 용액으로 활성화된 후 화합물 1로 치료된 생쥐로부터 취하여진 세포들로부터의 IFN-γ분비로서,

-◇- 플라시보

-□- 화합물 1 25㎍/생쥐

-△- 화합물 1 50㎍/생쥐

-X- 화합물 1 100㎍/생쥐

-*- 화합물 1 200㎍/생쥐.

도 5는 캅티솔®내의 화합물 1로 10회 주사후 (NZBxNZW) F1 생쥐에서 안티-dsDNA 항체들 [OD=광학 밀도; 화합물 1 (C)=캅티솔®에 용해된 화합물 1]

-□- 플라시보

-◇- 화합물 1 50㎍/생쥐

-ㅇ- 화합물 1 25㎍/생쥐.

도 6은 면역 복합 침전물들의 세기를 보여주는 (NZBxNZW) F1 생쥐로부터 신장 단면 사진들이다. 상측 행 단면들은 캅티솔®-처치된 생쥐로부터 얻어진 것들이고, 중앙행 단면들은 50㎍/생쥐 화합물 1로 치료된 생쥐로부터 얻어진 것들이고, 하측 행 단면들은 25㎍/생쥐 화합물 1로 치료된 생쥐로부터 얻어진 것들이다. 확대: 좌측: x100, 우측: x00. FITC 면역조직학.

본 발명은, 수용성 캐리어; NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지며, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 약제학적으로 타당한 염의 조성물; 및 상기 수용성 캐리어에 상기 펩티드를 용해시키기 위한 효과적인 양을 가진 치환된 β-시클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 4와 9 사이의 pH를 갖는다.

또한, 본 발명은, 수용성 캐리어; NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지며, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 아세테이트 염의 조성물; 및 70 mg/ml 내지 170 mg/ml의 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 상기 펩티드와 상기 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린은 상기 수용성 캐리어 내에 용해되고, 상기 조성물은 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는다.

또한, 본 발명은 대상인 사람에게서 몸 전체의 홍반성 낭창(SLE)의 징후를 완화하는데 효과적인 양으로 상기한 약제학적 조성물들 중 어느 것을 상기 사람에게 투여하는 것을 포함하는 SLE의 징후를 완화하기 위한 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은,

a) 치환된 β-시클로덱스트린 용액을 소정 농도로 수용성 캐리어 내에 준비하는 단계; b) 상기 단계 a)의 용액에 CH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 갖는 펩티드의 약학적으로 타당한 염을 소정량 첨가하는 단계;

c) 상기 펩티드가 상기 용액에 용해될 때까지 상기 단계 b)의 용액의 pH를 조절하는 단계; 및

d) 필요하다면, 단계 c)의 용액의 pH를 4-9로 조절하여 상기 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기한 약제학적 조성물을 냉동건조시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은,

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -40℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -40℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 20℃로 올리는 단계;

d) 소정의 시간 동안 상기 온도를 20℃로 유지하는 단계; 및

e) 압력을 10μbar로 낮추어 상기 약제학적 조성물을 냉동건조시키는 단계를 포함한다.

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -45℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -45℃에서 소정 시간 동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 -20℃로 올리는 단계;

d) 상기 용액의 온도를 25℃까지 올리는 단계; 및

e) 상기 온도를 25℃로 소정 시간 동안 유지하여 상기 약제학적 조성물을 냉동건조시키는 단계를 포함한다.

본 발명은 수용성 캐리어; NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지는, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 약제학적으로 타당한 염의 조성물; 및 상기 수용성 캐리어에 상기 펩티드를 용해시키기 위한 효과적인 양을 가진 치환된 β-시클로덱스트린을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는데, 상기 조성물은 4와 9 사이의 pH를 갖는다.

일실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 적어도 0.5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 2.5 mg/ml 내지 5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 5 mg/ml 내지 7 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 7 mg/ml 내지 8.5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 8.5 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 9 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 10 mg/ml 내지 15 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 15 mg/ml 내지 20 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 1.0 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 2.5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 10 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 염의 농도는 15 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 염의 농도는 0.1 mg/ml 내지 0.5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 염의 농도는 0.1 mg/ml 내지 0.2 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 염의 농도는 0.2 mg/ml 내지 0.3 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 염의 농도는 0.3 mg/ml 내지 0.4 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 염의 농도는 0.4 mg/ml 내지 0.5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 7.5와 8.5 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 4와 5 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 5와 6 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 6과 7 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 7과 8 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 8과 9 사이의 pH를 갖는다.

또 다른 실시예에서, 상기 약제학적으로 타당한 염은 아세테이트 염이다.

또 다른 실시예에서, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 하이드록시프로필, 술포부틸 에테르, 또는 술포프로필 에테르 치환된 β-시클로덱스트린이다.

또 다른 실시예에서, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 술포부틸 에테르 치환된 β-시클로덱스트린이다.

또 다른 실시예에서, 상기 약제학적으로 타당한 염은 아세테이트 염이고, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린이다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 상기 약제학적 조성물의 pH를 4-9의 범위로 만들기에 적합한 양과 유형의 약제학적으로 타당한 완충제를 추가로 포함한다.

또한, 본 발명은, 수용성 캐리어; NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지며, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 아세테이트 염의 조성물; 및 70 mg/ml 내지 170 mg/ml의 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린의 조성물을 포함하고, 상기 펩티드와 상기 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린은 상기 수용성 캐리어 내에 용해되고, 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는 약제학적 조성물을 제공한다.

일 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 적어도 0.5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.5 mg/ml 범위이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 1.0 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 2.5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 5 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 10 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 15 mg/ml이다.

또 다른 실시예에서, 상기 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린의 농도는 120 mg/ml이고, 상기 조성물의 pH는 7.5와 8.5 사이이다.

또한 본 발명은, 대상인 사람에게서 몸 전체의 홍반성 낭창(SLE)의 징후를 완화하는데 효과적인 양으로 상기한 약제학적 조성물들을 상기 사람에게 투여하는 것을 포함하는 SLE의 징후를 완화하기 위한 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 대상인 사람에게서 SLE를 치료하는데 사용하기 위한 상기한 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은, 상기한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은,

a) 치환된 β-시클로덱스트린 용액을 소정 농도로 수용성 캐리어 내에 준비하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 용액에 NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 갖는 펩티드의 약학적으로 타당한 염을 소정량 첨가하는 단계;

일 실시예에서, 상기 약제학적 조성물에서 상기 치환된 β-시클로덱스트린 의 결과적인 최종 농도는 70 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위이다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 80 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 90 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 100 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 110 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 120 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 130 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 140 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 150 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 160 mg/ml 내지 170 mg/ml 범위의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 일 실시예에서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 120 mg/ml의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

또 다른 실시예에서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 적어도 0.1 mg/ml의 펩티드의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

또 다른 실시예에서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 적어도 0.5 mg/ml의 펩티드의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

또 다른 실시예에서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 적어도 2.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 또는 0.1 mg/ml의 펩티드의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

또 다른 실시예에서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 적어도 5 mg/ml, 10 mg/ml, 또는 15 mg/ml의 펩티드의 최종 농도로 귀결되도록 한다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서, 상기 단계 b)는 상기 용액을 1시간 동안 혼합하는 것을 더 포함한다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서, 상기 단계 c)에서 pH는 HCl 또는 NaOH 1.ON을 이용하여 조절된다.

또 다른 실시예에서, 상기 방법은 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 상기 단계 d)의 용액을 여과하는 것을 더 포함한다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서,

상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 120 mg/ml의 치환된 β-시클로덱스트린의 최종 농도로 귀결되도록 되고;

상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 적어도 2.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 또는 0.1 mg/ml의 펩티드의 최종 농도로 귀결되도록 되고;

상기 단계 b)는 상기 용액을 1시간 동안 혼합하는 것을 더 포함하고; 그리고

상기 단계 c)에서 pH는 HCl 또는 NaOH 1.ON을 이용하여 조절되고,

셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 상기 단계 d)의 용액을 여과하는 것을 더 포함한다.

또한 본 발명은 상기한 방법으로 준비된 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기한 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은,

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -40℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -40℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 20℃로 올리는 단계;

d) 상기 온도를 20℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계; 및

e) 상기 온도를 25℃로 소정 시간동안 유지하여 상기 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 단계를 포함한다.

상기 방법의 일실시예에서, 상기 단계 a)는 2시간 이내에 수행된다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서, 상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행된다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서, 상기 단계 c)는 13시간 이상 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 c)는 110μbar의 압력으로 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 d)는 13시간 이상 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 d)는 110μbar의 압력으로 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 e)에서 압력이 10μbar로 감소한다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 e)는 5시간 이상 수행된다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서,

상기 단계 a)는 2시간 이내에 수행되고;

상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되고;

상기 단계 c)는 13시간 이상 110 μbar의 압력으로 수행되고;

상기 단계 d)는 13시간 이상 110 μbar의 압력으로 수행되고; 그리고

상기 단계 e)는 5시간 이상으로 수행되고 상기 압력은 10 μbar로 감소된다.

또한, 본 발명은 상기한 방법으로 준비되는 냉동 건조된 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은,

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -45℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -45℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 -20℃로 올리는 단계;

d) 상기 용액의 온도를 25℃까지 올리는 단계; 및

일 실시예에서, 상기 단계 a)는 6시간 이내에 수행된다.

다른 실시예에서, 상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 c)는 19시간 이상 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 c)는 150μbar의 압력으로 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 d)는 13시간 이상 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 d)는 150μbar의 압력으로 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 e)는 8시간 이상 수행된다.

또 다른 실시예에서, 상기 단계 e)는 150μbar의 압력으로 수행된다.

상기 방법의 또 다른 실시예에서,

상기 단계 a)는 6시간 이내에 수행되고;

상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되고;

상기 단계 c)는 19시간 이상 150 μbar의 압력으로 수행되고;

상기 단계 d)는 13시간 이상 150 μbar의 압력으로 수행되고; 그리고

상기 단계 e)는 8시간 이상 150μbar의 압력으로 수행된다.

상기 냉동 건조된 약제학적 조성물의 일 실시예에서, 상기 조성물의 물 함량은 5%미만이다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물의 물 함량은 4.0%미만이다.

또 다른 실시예에서, 상기 조성물의 물 함량은 3.5%미만이다.

또한, 본 발명은 냉동 건조된 약제학적 조성물을 제공하는데, 이 조성물은

NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지는 펩티드의 약제학적으로 타당한 염; 및

치환된 β-시클로덱스트린을 포함한다.

또한, 본 발명은

패키징 재료; 및

상기한 소정량의 냉동 건조된 약제학적 조성물로 구성된 패키지 형태로 된 약제학적 조성물을 포함한다.

본 발명의 조제품들은 비경구적으로, 원칙적으로, 또는 직장으로 제공된다. 물론, 이들 조제품들은 각 투약 경로를 위하여 적절한 형태로 제공된다. 예를 들어, 이들 조제품들은 주사, 흡입, 연고, 좌약 등, 구체적으로는, 주사, 정맥 주사 또는 흡입에 의한 투약; 로숀이나 연고에 의한 국부적 투약; 그리고 좌약들에 의한 직장 투약에 의하여 투여된다.

여기에서 사용된 것처럼, "비경구적 투약" 및 "비경구적으로 투약된"이란 어구들은 장 및 국소 투약 이외의 투약 모드, 즉 주사에 의한 투약 모드들을 일반적으로 의미하고, 제한 없이, 정맥의, 근육 내의, 동맥 내의, 척추강 내의, 낭내, 안와내의, 심장내의, 피내의, 복강내의, 기관천자, 피하의, 각피하의, 관절내의, 피막하의, 지주막하의, 척수내의 그리고 흉골내의 주사 및 주입을 포함한다.

여기에서 사용된 것처럼, "전신 투약", "전신으로 투약된", "주변 투약" 그리고 주변적으로 투약된"이란 어구들은, 그것이 환자의 계로 들어가서 신진 대사 및 다른 유사 과정들, 예를 들어, 피하 투약을 받도록, 중앙 신경계로 직접 투약되는 것 이외의 화합물, 약물 또는 다른 물질의 투약을 의미한다.

추가적인 첨가제들에 대한 일반적 형성 과정들과 정보의 상세한 내용들은 레밍톤(Remington): 약제학의 과학과 실행(The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition)에서 찾을 수 있다.

본 발명은 뒤따르는 실험의 상세한 내용들로부터 더 잘 이해될 것이다. 그러나, 이 기술에서 통상의 지식을 가진 자는 논의되는 특정 방법들과 결과들이, 이후에 뒤따르는 청구항들에서 더 완전히 설명되듯이, 단지 본 발명의 예증이 되는 것들이라는 것을 쉽게 인식할 것이다.

실험적인 상세들

예 1: 화합물 1을 위한 제제 개발

인간 hCDR1 펩티드 (화합물 1)는 2002년 9월 6일에 공개된 PCT 국제 공개번호 WO 02/067848호에서 설명되어 있고, 이 기술에서 공지된 방법들로 준비될 수 있다 (예를 들어, 구테(B. Gutte)가 저자이고, 아카데믹 출판사에서 1995년에 출판된 펩티드: 합성, 구조 및 응용들; 페닝톤과 던(M. Pennington and B. Dunn)이 저자이고, 휴마나 출판사에서 1994년에 출판된 펩티드 합성 프로토콜; 쉬놀저 등(Schnolzer, M et al.)이 저자인, "In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase synthesis. Rapid, High yield assembly of difficult sequences." Int. J. Pept. Protein Res. (1992) 40: 180-193).

화합물 1은 19개의 아미노 산들로 구성되는 합성 폴리펩티드이다. 이 화합물 1은 아세테이트 염으로 제공된다. 펩티드의 수용성 고용도는 0.5 mg/ml 미만인 것으로 결정되었다. 도 1은 아세테이트 염으로서의 화합물 1을 보여준다.

2 mg/ml, 바람직하게는, 10 mg/ml을 초과하는 펩티드 농도를 가진 제제를 ㄱ개발하기 위하여, 여러 고용도 향상제들을 갖는 실험들이 수행되었다. 예비 실험들은 2 mg/ml의 농도가 쉽게 달성될 수 없다는 것을 보여주었다. 피하 주사를 위한 제제를 개발하기 위하여, 산성도(pH)는 4 내지 9의 범위에 있어야 하고 용액은 등장액이어야 하는 것이 또한 바람직하다.

광범위한 문서 조사에 근거하여, 최대의 고용도를 갖는 제제를 제조하기 위하여 몇몇의 주요 접근법들이 채택되었다. 고려된 인자들은 다음과 같다:

*pH 조절 및 완충제들

*용매들

*공동 용매들

*고용화제.

방법

화합물 1은 별도로나 다른 첨가제들과 조합하여 선택된 고용도 향상제 용액에 용해되었고, 용액들은 적어도 한 시간 동안 휘저어졌다. 필요하면 산성도가 조절되었다. 용액들은 시각적으로 조사되어 고용도를 추정하였고 분석 시험 측정을 위하여 보내어졌다. 몇몇의 선택된 제제들에 대하여, 생물학적 활성도가 또한 시험되었다.

결과

표 1은 제제 개발을 위하여 사용된 고용도 향상제들의 유형을 나타낸다. 표 2와 3은 다양한 고용도 향상제들을 갖고서 수행되었던 실험들을 요약한다. 표 2는 5 내지 10 mg/ml 범위의 펩티드 농도로 수행된 초기 스크리닝(screening)을 요약한다. 그 후, 더 고농도의 펩티드로 수행되었던 실험 작업이 더 낮은 투여량으로 반복되었다 (표 3을 보라).

초기 시험들은 화합물 1이 원하는 pH 레벨들의 한계들, 산성과 염기성에서 더 많이 용해될 수 있었지만, 염기성 pH 범위에서 덜 안정하다는 것을 보여주었다. 그리하여, 아세테이트 완충제, 시트레이트 완충제 및 소듐 카보네이트를 포함하는 몇몇 완충제들과 pH 조절 시약들이 시험되었다. 초기에 시험된 완충제들 모두는 원하는 펩티드 고용도 레벨을 얻지 못하였다. 단지 pH 9.2 이상과 pH 3.0 이하의 것들에서 2 mg/ml의 고용도가 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 초기 단계에서, 아세테이트 완충제와 시트레이트 완충제 (긴장제로써 매니톨을 갖는)를 갖는 제제들이 초기 독성 연구들을 위하여 선택되었다. 이들 제제들의 생물학적 활성도가 시험되었고 활성인 것으로 판명되었다.

에탄올, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 크레모포어(Chremophore) 및 그들의 조합들과 같은 비수용성 용매들(표 1을 참조)이 시험되었지만, 화합물 1의 고용도를 증가시키지 못하였다. 30% DMA (디메틸-아세트아미드) 용액은 원하는 범위(5 내지 9 mg/ml)의 고용도를 얻게 하였지만, 그의 독성 프로파일로 인하여 약제학적 제제로서는 적합하지 않았다. 개선된 고용도가 또한 30% (w/w) PEG 400 (5 내지 9 mg/ml)을 이용하여 관찰되었다. 이 후자의 제제는 독성학 연구를 위하여 선택되었지만, 생물학적 시험에서 불활성인 것으로 판명되었고, 생쥐의 독성 연구에서 몇 가지 역효과의 원인일 수 있었다. 그리하여, 이 제제를 더 이상 계속하지 않기로 결정하였다. 예비 실험들의 관점에서, 비-수용성 용매들은 대상 제제들에서 사용되지 않았다.

L-아르기닌, L-글루탐산, L-글리신 및 L-리신을 포함하는 몇몇 아미노 산들(표 1을 참조)이 시험되어 단백질 고용도를 개선하였다. L-아르기닌에서 펩티드의 고용도는 원하는 레벨에 있었지만, 결과적인 pH는 9이상이었다. pH를 감소시키기 위한 시도 또는 아르기닌 HCl 염을 사용하는 시도는 결과적으로 펩티드의 석출을 가져왔다. 인간 혈청 알부민이 또한 시험되어고 낮은 펩티드 농도(1 mg/ml)에서 펩티드의 고용도를 개선하였다 (표 1을 참조).

만니톨, 소비톨 및 덱스트란을 포함하는 부피증가제들(bulking agents)(표 1을 참조)이 단독으로 그리고 다른 첨가제들과 조합하여 시험되었지만, 용액에서 펩티드의 고용도를 개선하지 못하였다.

폴리소베이트 20과 폴리소베이트 80을 포함하는 공동 용매들(표 1을 참조)이 단독으로 그리고 다른 첨가제들과 조합하여 시험되었다. 더 낮은 농도의 폴리소베이트들(6% 이상)은 펩티드의 고용도를 개선하지 못하였고, 더 높은 농도의 폴리소베이트들(10% 이상-표 2를 참조)은 펩티드의 고용도를 2 mg/ml 이상으로 개선하였다. 그러나, 그러한 높은 농도의 폴리소베이트들은 약제학적 제제들을 위해서는 부적합한 것으로 간주되었다.

시장의 비경구 제품들로서의 사용이 승인된 두 가지 유형의 시클로덱스트린이 또한 시험되었다: 하이드로프록실-β-시클로덱스트린과 술포부틸에테르-β-시클로덱스트린(캅티솔®). 둘 모두는 펩티드의 고용도를 크게 증가시켰다(하이드로프록실-β-시클로덱스트린 10 mg/ml와 캅티솔® 2 mg/ml의 레벨에서의 농도). 두 시클로덱스트린 제제들의 생물학적 활성도가 시험되었고 펩티드 단독의 활성도와 동일한 것으로 발견되었다.

캅티졸®은 부틸 에테르 스페이서 그룹에 의하여, 또는 술포부틸에테르(SBE)에 의하여 소수성 캐비티로부터 분리되는 소듐 술포네이트 염을 가진 상업적으로 이용가능한 다음극성의 β-시클로덱스트린 유도체이다. 캅티솔®은 시덱스사(CyDex Inc.)의 헵타-치환된 술포부틸에테르 β-시클로덱스트린 (SBE7-β-CD) 조제품에 대한 상표명이다 (www.captisol.com). 캅티솔®의 구조는 약물 분자들이 소수성 캐비티에 끼워지도록 하여, 약물 분자를 수용성 용매로부터 고립시킨다. 캅티솔®의 외표면은 친수성이기 때문에, 복합체로 된 약물 분자의 고용도는 그것에 의하여 향상된다. 약물 분자의 고용도를 향상시키기 위한 시클로덱스트린의 사용은 미국 특허 번호 5,134,127과 5,376,645에 개시되어 있는데, 이들 문헌들의 전체 내용들은 이 방법으로 참증으로 결합된다.

시덱스사의 문헌에 따르면, 캅티솔®은 비경구적으로 투약될 때 안전하고 베타-시클로덱스트린과 관련된 신독성을 보이지 않는다. 베타-시클로덱스트린에 상대적으로, 캅티솔®은 상당하거나 더 높은 복합화 특징들과 90 그램/100 ml-50-폴드 개선-를 초과하는 더 우수한 물 고용도를 제공한다.

결론

몇몇 고용도 향상제들은 원하는 고용도 범위에 부합하는 것으로 판명되었다: DMA, PEG-400, 디메틸-아세트아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시레이티드 아주까리 유, N-메틸-2-피롤리디논, 1-에테닐-2-피롤리디논, 폴리소베이트 20, 폴리소베이트m 80, 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 및 술포부틸에테르-β-시클로덱스트린 (캅티솔®). 이들 고용도 향상제들 중, 두 시클로덱스트린들은 고용도에 대하여 우수한 생물학적 활성도와 안정도를 갖는 것으로 판명되었다. 그리하여, 캅티솔®을 예 5 제제들에서 사용하기 위한 고용도 향상제로써 캅티솔®을 선택하여 두 시클로덱스트린 제제들을 더 연구하는 것이 결정되었다. 예 5의 임상 연구들을 위한 최종 제제는 원하는 양의 펩티드(0.5, 1.0 또는 2.5 mg/ml)를 갖는 물에서의 120 mg/ml의 캅티솔®과, pH 조절을 위한 HCl 및 NaOH로 구성된다.

<표 1>

화합물 1 제제 개발을 위하여 사용된 고용도 향상제

고용도 향상 분류	고용도 향상
용매	그리모퍼 EL, CMC, 에탄올, DMA, 글리세린, 프로필렌 글리콜, PEG 400, 모노티오글리세론
합성용제	폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80
가용화제	아르기닌, HSA, 글리신, 크레아티닌, 클루타믹산, 리신 (아세테이트 염 및 자유 염기), 캅티솔®, 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린
부피 팽창제	만니톨, 소비톨, 덱스트로스, 락토오스 덱스트란
pH 조절시약	시트레이트 완충제, 아세테이트 완충제, 소듐 카보네이트

<표 2>

화합물 1 펩티드 제제들에서 평가된 공동 용매들과 안정화제들의 목록

<표 3>

낮은 펩티드 농도들에서 화합물 1 제제들

예 2: 캅티솔 ®에서 화합물 1의 용액을 위한 조제품 프로토콜

건조 화합물 1과 건조 캅티솔®을 물에 혼합하거나 화합물 1을 준비된 캅티솔®의 용액과 물에 첨가하는 것과 같은 표준 용해 방법들은 원하는 농도로 완전 용해에 이르지 못하였다. 화합물 1과 캅티솔® 양자의 몇몇 다른 농도들이 다양한 pH 레벨들에서 시험되었다. 그러나, 캅티솔®에서 화합물 1의 용액을 제조하기 위한 다음의 방법은 원하는 농도로의 완전한 용해로 귀결되었다.

재료: 캅티솔®, 화합물 1 그리고 물

방법:

1. 적절한 양의 캅티솔®을 칭량하여 120 mg/ml의 최종 농도를 제공한다.

2. 80%의 최종량의 물을 첨가하고 10분동안 자기 교반기로 혼합한다.

3. 화합물 1을 칭량하여 2.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 또는 0.1 mg/ml의 최종 농도를 제공한다.

4. 펩티드를 캅티솔® 용액에 첨가한다. 1시간 동안 혼합한다.

5. pH를 올려서 투명한 용액을 얻는다(2.0 mg/ml 제제에서 pH를 9이상으로 약간 올릴 필요가 있을 수도 있다). pH는 HCl 1.0 N과 NaOH 1.0 N을 이용하여 조절된다k. 10분 동안 혼합한다.

6. 필요하면, pH를 7.5 내지 8.5의 범위로 수정한다(HCl이나 NaOH 1.0 N중 하나를 이용하여).

7. 물을 최종 체적에 첨가한다.

8. 용액을 0.2 μ의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 여과한다.

9. 최종 pH를 기록한다.

10. 알리쿼츠(aliquots)를 분배하고 적당한 온도로 저장한다.

예 3: 화합물 1과 캅티솔 ® 용액의 냉동 건조

현재의 냉동 건조 방법은 제제에서 고체들의 백분율이 높은(12%)반면 냉동 건조된 제품들은 보통 5%와 10% 사이의 고체들을 함유한다는 점에서 다른 냉동 건조 방법들과 다르다.

장비

사용된 결빙 건조기는 에드워드 리오필라이저 리오플렉스(Edwards lyophilizer Lyoflex) 0.6이었다. 장비 IQ/OQ가 수행되었고 공정 개발에 앞서 품질 보증에 의하여 순응도를 체크하였다.

0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 2.5 mg/ml의 화합물 농도들에서 화합물 1과 캅티솔®의 용액들이 준비되었다. 충만-체적은 1 ml (1.05 gr)로 조절되었다.

주요 공정 단계들:

1. 결빙

2. 유지(저온에서)

3. 진공에서 두 단계로 건조

3.1 1차 건조-상한 유지 온도까지 선반 워밍, 선반 온도를 상한 유지 온도로 제어.

3.2 2차 건조-상한 유지 선반 온도에서 압력을 최소값으로 감소.

배치(Batches) 1-3

결빙-결빙은 상온에서부터 -40 ℃로 2시간 이내에 수행되었다. 선반들은 -40 ℃에서 3시간 동안 유지되었다.

건조-건조는 110 μ의 압력으로 수행되었다. 선반 온도는 20 ℃로 13시간 이상 증가되었고, 그 온도에서 추가적인 13시간 동안 유지되었다.

결과:

물 함량 결과들은 다음과 같다:

배치 번호 1: 3.8%

배치 번호 2: 4.0% 그리고

배치 번호 3: 4.9%

배치 4와 5

배치들 1, 2, 3으로 인도되는 공정들의 물 함량 결과들은 원하는 값보다 더 높기 때문에, 같은 온도와 낮은 압력에서 2차 건조 단계를 추가하는 것이 결정되었다.

건조-건조는 110 μ의 압력으로 수행되었다. 선반 온도는 20 ℃로 13시간 이상 증가되었고, 그 온도에서 추가적인 13시간 동안 유지되었거나 (배치 3) 혹은 추가 8시간 동안 유지되었다 (배치 5). 추가 5시간 동안 압력이 10 μbar로 감소되었다. 전체 공정 시간은 36시간이었다.

결과:

물 함량 결과들은 다음과 같다:

배치 번호 4: 플라시보 : 3.0%

1 mg/ml:3.9%

배치 번호 5: 플라시보 : 4.1%

결론

도시된 것처럼, 캅티솔®을 갖는 화합물 1을 위한 냉동 건조 공정이 개발되었다. 고체들의 높은 백분율과 그로 인한 응축된 케이크로 인하여, 개발된 공정은 펩티드에 대하여 현재 이용가능한 냉동 건조 사이클들보다 더 길고, 추가적인 2차 건조 단계를 보여준다. 표 4는 개발된 공정을 요약한다.

<표 4>

Step	Compound 1(Peptide) with Captisol®
Loading	5℃
Freezing	2 hours to -40℃
Hold at low temp	3 hours to -40℃
Primary Drying:Warm to 20℃Hold at 20℃	13 hours pressure 110μbar13 hours pressure 110μbar
Secondary drying:Hold at 20℃	5 hours pressure 10μbar
Storage at	-20℃
Process time	36 hours

예 4. 냉동 건조 화합물 용액의 생체 내에서의 생물학적 활동도의 조사 (DP, 1 mg/vial, 12% 캅티솔 ®)

냉동 건조된 화합물 용액, 즉, 약물 제품(DP)을 갖는 피하(s.c.) 처리를 뒤따르게 하는 화합물 1 기준 규격 (RS) 특정 T-세포들로부터 IL-2 분비의 억제에 의하여 생물학적 활성도가 두 가지 농도에서 탐지되었다. 처리 결과들은 포스페이트 버퍼드 살린(phosphate buffered saline: PBS)에서 화합물 1 (RS)로 생쥐를 치료한 결과들과 비교된다. 결과들은 아래의 표들과 도 2에 도시되어 있다.

실험 설계:

1. 면역화 일수 0

(네개의 모든 풋패드들(footpads)에서 CFA로

에멀션처리된 화합물 1 RS

2. 치료

(200 ㎕ 용액에서 넥의 후방에서의 s.c.) 일수 0

3. 다음을 가진 생체내 활성화: 일수 10

a. 0; 0.5; 1; 2.5; 5; 10; 25; 50 그리고

100 μg/ml의 농도에서 화합물 1 RS

b. 화합물 1의 아미노 산들의 역순을 갖는

펩티드(네거티브 컨트롤).

c. 콘 A (포지티브 컨트롤).

4. 축축하게 된 5% CO₂ 인규베이터에서 37℃ 로 20시간 동안 배양물의 배양

5. ELISA에 의한 IL-2 측정

실험 그룹들의 표

Group	Immunization with	Treatment
A	50μg Compound 1RS	50μg Compd. 1RS in PBS
B		200μg Compd. 1RS in PBS
C		50μg DP (batch 2)
D		200μg DP (batch 2)
F		Placebo (12% captisol®)

화합물 1 RS (pg/ml)로 체외 활성화를 뒤따르게 하는 화합물 1 (DP) 치료된 생쥐로부터 IL-2 분비

예 5: 치료를 위한 최적 투여량의 평가

다음의 약어들은 다음의 설명에서 사용된다:

CFA 완전한 프로인드의(Complete Freund's) 보조제

Con A Concanavalin A

DP 약물 제품

DS 약물 물질

EM-1 농축된 DCCM-1 medium

EM-3 농축된 RPMI-1640 + 우태혈청 medium

FCS 우태혈청

IFN-γ 인터페론-감마

LN 림프 노드

PBS 포스페이트 버퍼트 사린

RS 기준 규격

s.c. 피하의

TB 트리판 블루(Trypan Blue)

TGF-β 변형 성장 인자-베타

WFI 주입용 물

소개

20마리의 생쥐 그룹들이 50 ㎍/생쥐의 화합물 1 RS로 면역처리되었다. 면역처리된 생쥐들은 다음과 같은 다섯 개의 치료 그룹으로 배치되었다: 플라시보, 25, 50, 100 그리고 200 ㎍/생쥐의 화합물 1 DP (피하 투약). 면역과 치료가 있은 지 10일이 지나서, LN이 추출되었고 단일 세포 현탁액이 준비되었다. 화합물 1 RS의 몇몇 농도들을 갖는 활성화에 반응하여 배양 세포들에 의한 IFN-γ와 TFG-β의 생체내 분비가 측정되었다.

실험 설계

1. 면역화 -일수 0

2. 화합물 1 DP로 치료 -일수 0

3. 치료된 생쥐들로부터 LN 세포들의 생체내 활성화 -일수 10

4. (IFN-γ 판단을 위한) 배양 매개체의 채집 -일수 12

5. (TFG-β 판단을 위한) 배양 매개체의 채집 -일수 13

6. IFN-γ에 대한 엘리사

7. TFG-β에 대한 엘리사

<표 7>

Exp.Group	Treatment		In-vitro activation
	Article	Mice/group	Cells/well	Compound 1 RS concentration
A1	Control12%Captisol®	4	2.5 ×10⁶	Compound 1 RS0-100μg/ml
			5×10⁶
A2	25 μg/mouse	4	2.5 ×10⁶
			5×10⁶
A3	50 μg/mouse	4	2.5 ×10⁶
			5×10⁶
A4	100 μg/mouse	4	2.5 ×10⁶
			5×10⁶
A5	200 μg/mouse	4	2.5 ×10⁶
			5×10⁶

재료 및 시약

동물

생쥐: 하란(Harlan) 동물 양육센서의 레호봇(Rehovot)이 공급한 20 마리의 BALB/c 암컷 생쥐,

면역화 나이 (주+일수): 10

실험에 포함된 생쥐의 평균 무게: 19.01 그램

재료

일반적 시약

70%의 에탄올이 96%의 에탄올을 순수한 H₂O로 희석하여 준비되었다.

면역화를 위한 화합물 1 용액들의 준비

CFA-화합물 1 RS 에멀션 (500 ㎍/ml, 50 ㎍/생쥐)이 다음과 같이 준비되었다:

1. 1.874 mg의 화합물 1이 1.87 ml의 WFT에 용해되어 1 mg/ml의 용액을 얻었다.

2. 이 용액은 pH 지시기 스트립으로 시험되었고 5의 pH를 갖는다는 것이 밝혀졌다.

3. 1.5 ml의 용액이 1.5 ml CFA로 에멀션화되어 500 ㎍/ml의 최종 농도를 얻었다.

치료를 위한 용액의 준비

200 ㎕ 용액의 s.c. 주사로 치료가 수행되었다.

12% 캅티솔® 용액의 준비

1.2 그램의 캅티솔®이 10 ml의 WFI에 용해되어 12% 캅티솔® 용액을 얻었다.

실험 절차

생쥐 무게 측정

면역화에 앞서 생쥐들의 무게가 측정되었다. 평균 생쥐 무게: 19.01 ± 0.97 그램.

면역화

면역화는 100 마이크로리터의 에멀션(각 후방 발패드로 50 마이크로리터)을 주사하여 수행되었다.

치료

면역화 단계 다음에, 생쥐들은 지정된 화합물 1 DP 또는 12% 캅티솔® 치료 용액들로부터 200 ㎕의 그들의 목 뒤 지점에서의 s.c. 주사에 의하여 치료되었다.

생체내 배양

생쥐들은 경추탈골에 의하여 희생되었다. LN은 뒤쪽 다리들로부터 추출되었고 약 5 mL의 RPMI를 함유하는 멸균 사례로 옮겨졌다. 세포들은 200 마이크로미터 메쉬 스테인레스 강망에 대한 섬유의 미세한 스퀴징에 의하여 추출되었다. 세포들은 수집되었고 상온에서 300G로 10분 동안 원심분리되었다.

단일 세포 현탁액들이 각 실험 그룹의 웅덩이 형태로 된 LN으로부터 준비되었다.

2,500,000개와 5,000,000개의 cells/ml/well 현탁액들이 EM-1에서 화합물 1 RS (0-100 ㎍/ml)로 배양되었다.

세포의 반응표시로서의 IFN-γ와 TGF-β의 분비는 배양 매개체의 ELISA로 판단되었다 (IFN-γ의 경우 48시간, 그리고 TGF-β의 경우 72시간).

<표 8>

생체내 실험 그룹들

ExperimentalGroup	Treatment	In-vitro activation
ExperimentalGroup	Article	Cells/well	Activation substanceconcentration
A1-2.5	Control12%Captisol®	2.5 ×10⁶	Compound 1 RS0; 3.125; 6.25; 12.5; 50 and 100 μg/mlCon A 2.5 μg/ml
A1-5	Control12%Captisol®	5×10⁶
A2-2.5	DP25μg/mouse	2.5 ×10⁶
A2-5	DP25μg/mouse	5×10⁶
A3-2.5	DP50μg/mouse	2.5 ×10⁶
A3-5	DP50μg/mouse	5×10⁶
A4-2.5	DP100μg/mouse	2.5 ×10⁶
A4-5	DP100μg/mouse	5×10⁶
A5-2.5A5-5	DP200μg/mouse	2.5 ×10⁶5×10⁶

세포 현탁액의 준비

<표 9>

세포 계수 결과와 세포 현탁액들의 준비 (10 ×10⁶/ml)

Grp	Vol.(ml)	Dilutn. factor	Viable cells	Dead cells	%Viable cells	%Dead cells	Average viable cells	Total viable cells(×10⁶)	EM-1 to add (ml) for suspension of 10 ×10⁶cells/ml
A1	10	16	115	--	100	--	112	179.2	17.9
			109	--	100	--
A2	10	16	50	4	92.6	7.4	47.5	76	7.6
			45	2	95.7	4.3
A3	10	16	80	4	95.2	4.8	80.5	128.8	12.8
			81	5	94.2	5.8
A4	10	16	87	--	100	--	89	142	14.2
			91	--	100	--
A5	10	16	120	2	98.4	1.6	112.5	180	18
			105	2	98.1	1.9

세포 현탁액들의 준비 (5×10 ⁶ /ml)

10×10⁶세포/ml 현탁액들이 5 ml EM-1을 5 ml 세포 현탁액들에 첨가하여 1:2 로 희석되었다.

48 웰 플레이트들에서 LN 세포 배양체들의 배양

3개의 조직 배양 플레이트들이 준비되었다. 다음의 물질이 각 판에 첨가되었다.

배경 제어 (배양체로 배양된 세포들)

0.5 ml의 세포 현탁액

0.5 ml의 배양체 (EM-1)

시스템 포지티브 컨트롤 (콘 A로 자극된 세포들)

0.5 ml의 세포 현탁액

EM-1에서 0.5ml의 콘 A 5 ㎍/ml (최종 농도 2.5 ㎍/well)

화합물 1 활성화 용액들로 배양된 세포들(샘플들)

0.5 ml의 세포 현탁액

0.5 ml의 화합물 1 RS 6.25 - 200 ㎍/ml (최종 농도 3.125 - 100 ㎍/ml/well)

96개의 웰 플레이트들에서 LN 세포 배양체들의 배양

48개의 웰 플레이트들이 준비된 후, 96개의 웰 플레이트들이 셀 현탁액으로부터 100 ㎕와 활성화 용액들로부터 100 ㎕를 인가하여 준비되었다.

배양체 플레이트들은 37 ℃에서 축축하게 된 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간이나 72시간 중 하나로 배양되었다.

표면 부유물 수집

배양된 플레이트들은 상온에서 300 g로 10분 동안 원심분리되었다. 표면 부유물들 (각 웰로부터 850 ㎕)은 미러 플레이트들이나 튜브들로 이송되었다. 그 후, 샘플들의 반복된 결빙/해동을 피하기 위하여, 표면 부유물은 워킹 알리쿼츠(working aliquots) (200 ㎕의 두 개의 알리쿼츠와 450 ㎕의 한 개의 알리쿼츠). 각 튜브는 다음의 상세한 내용으로 라벨이 붙여졌다.

1. 배양후 실험 코드 및 시간

2. 그룹 및 샘플 번호

3. 활성제와 농도

4. 표면 부유물 수집일

표면 부유물들은 엘리사를 위하여 사용될 때까지 -20 ℃에서 저장되었다.

결과

<표 10>

그룹들의 요약

실험그룹들:
면역화		치료		체외활성화
실험 그룹들	면역화 투여량	서브 그룹	Article
A	50μg/mouse	A1	12% Captisol®Placebo control	화합물 1RS 3.125-100μg/ml
		A2	화합물 125μg/M
		A3	화합물 150μg/M
		A4	화합물 1100μg/M
		A5	화합물 1200μg/M

<표 11-A>

최종 사이토카인 농도

최종 사이토카인 (pg/ml)(2,500,000 세포들/well)

화합물 1농도	플라시보	50μg/M	100μg/M	200μg/M
3.125μg/ml	321.3	54.1	64.5	103.9
6.25μg/ml	238.6	81.8	116.1	126.1
12.5μg/ml	397.1	123.1	180.9	129.0
25μg/ml	655.5	215.1	262.8	240.3
50μg/ml	573.9	292.5	518.3	378.1
100μg/ml	926.0	531.8	582.7	524.1
Con A	322.6	356.2	337.4	BQL

<표 11-B>

최종 사이토카인 농도

최종 사이토카인 (pg/ml)(5,000,000 세포들/well)

화합물 1농도	플라시보	25μg/M	50μg/M	100μg/M	200μg/M
3.125μg/ml	522.3	BQL	76.2	90.8	204.4
6.25μg/ml	634.8	BQL	109.2	157.8	244.1
12.5μg/ml	962.8	41.9	179.2	257.1	466.1
25μg/ml	967.4	70.0	277.9	421.7	660.5
50μg/ml	1338.8	104.2	373.4	739.7	922.5
100μg/ml	2010.2	185.2	547.0	995.5	1006.2
Con A	6839.8	2995.3	4837.0	10126.8	7722.8

결과들은 또한 도 3-4에 도시된다.

관찰

IFN -γ 분비

1. 플라시보 그룹에서, 화합물 1 체외 활성화에 대한 선형 투여량 반응이 보여진다. 이 그래프는 동일한 면역화 투여량 (50 ㎍/mouse)과 배양 매개체(EM-1)를 갖는 탈체 모델에 대하여 얻어진 그래프와 닮았다.

2. 모든 시험된 그룹들 내에서 화합물 1 체외 활성화에 대한 투여량 반응이 있었다.

3. 치료를 위하여 사용된 모든 투여량들의 경우들에서 IFN-γ 분비의 중요한 억제가 보인다(25 ㎍/mouse의 치료된 투여량으로 평균 95%의 억제). 주로 5×10⁶ 세포들/well이 사용될 때, 치료를 위하여 제공된 투여량과 % 억제 사이의 역 상관관계가 발견될 수 있다. 2.5×10⁶ 세포들/well이 사용될 때, 50 ㎍/mouse로 한 동물들의 치료는 100 또는 200 ㎍의 경우보다 더 좋은 억제를 제공하였다. 25 ㎍의 양은 생략되었다 (세포들의 부족).

4. 2.5×10⁶ 세포들/well대신 5×10⁶ 세포들/well이 사용될 때 더 나은 억제가 보인다.

5. 그래프들의 선형 범위에서, % 억제의 SD는 낮았다.

6. 2.5×10⁶ 세포들/well이 사용될 때, 콘 A를 갖는 기술적인 문제가 분명해졌다.

TGF -β 분비

1. 플라시보 그룹에서, 화합물 1을 갖는 체외 활성화에 대한 투여량 반응이 보이지 않았다. TGF-β 분비 레벨은 모든 다른 치료 그룹들에서 엘리사의 탐지 한계를 벗어났다.

예 6: 주사를 위한 화합물 1과 캅티솔®(0, 0.5, 1.0 및 2.5 mg/vial)을 갖는 냉동 건조 사이클의 최적화

목적

이 연구의 목적은 냉동 건조 케이크의 형상을 개선하고 붕괴 및 균열을 회피하기 위한 주사를 위한 캅티솔®을 갖는 화합물 1에 대한 냉동 건조 사이클을 최적화하기 위한 것이다. 그러므로, 냉동 건조 사이클을 개선하고 최적화하는 것이 결정되었다. 이 사이클은 페이스 I 배치들의 제조를 위한 생산 냉동건조기들로 전달된다.

공정 최적화

0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 2.5 mg/ml의 농도들에서 펩티드의 배치들과 플라시보가 준비되었고 몇몇 냉동 건조 사이클들이 수행되었다. 사용된 냉동 건조기는 에드워드 리오필라이저 리오플렉스 0.6이었다.

고용도, 물 함량 및 케이크 외관이 시험되었다.

얻어진 결과들에 따르면, 화합물 1을 위한 새로운 냉동 건조 사이클이 선택되었다. 고체들의 높은 함량(12%)과 그로 인한 응축된 케이크로 인하여, 새로운 공정은 예 3에서의 냉동 건조 사이클보다 더 길고, 추가적인 1차 건조 단계를 보여준다. 표 12는 공정들 사이의 차이들을 요약한다.

<표 12>

단계	화합물 1과 예 3의 캅티졸®에 대한 냉동건조 사이클	화합물 1과 캅티졸®에 대한 새로운 냉동건조 사이클
로딩	5℃	5℃
결빙	-40℃로 2시간	-45℃로 6시간
저온에서 유지	-40℃로 3시간	-45℃로 3시간
1차 건조:단계 Ⅰ단계 Ⅱ20℃(25℃)로 유지	20℃로 13 시간 압력 110μbar13 시간 압력 110μbar	-20℃로19시간 압력 150μbar 25℃로13시간 압력 150μbar8 시간 압력 150μbar
2차 건조: 20℃로 유지	5시간 압력 10μbar	-
저장	5℃	5℃
공정시간	36 시간	49 시간

예 7: SLE-경향의 (NZBxNZW)F1 암컷 생쥐에서 루퍼스 징후들에 대한 (캅티솔®에 투약된) 화합물 1의 효과

임상 시험에 참가하는 환자들은 첨가제로써 캅티솔®(술포부틸 에테르 베타-시클로덱스트린 소듐)을 이용한 화합물 1로 치료된다. 이 때문에, 생쥐의 변형이 PBS내의 화합물 1로 치료되었을 때 관찰된 것처럼, 캅티솔®에 제공된 화합물 1의 제제로 (NZBxNZW)F1 생쥐의 치료가 동일한 이익적 효과들을 가질 것인가를 판단하는 것이 중요하였다.

이 때문에, (NZBxNZW)F1 암컷 생쥐들(약 생후 8개월)이 일주일에 한번씩 10주 동안 캅티솔® 단독(n=8)으로나 캅티솔® 내(n=9와 10)의 25 또는 50 ㎍/mouse 화합물 1로 피하적으로 치료된 3개의 그룹으로 분리되었다. 이전 연구들은 이 범위의 투여량들이 SLE 징후들을 개선하는데 있어서 시험된 더 높은 투여량들 (100과 200 ㎍/mouse)보다 더 효과적이었다는 것을 나타내었기 때문에, 이들 투여량들이 선택되었다. 약물의 동일한 배치가 이 연구에서 사용되었고 제1 상 I 임상 실험에서 화합물 1이 사용되었다.

생쥐들은 anti-dsDNA 항체들과 단백뇨를 위하여 뒤따랐다. 생쥐들이 희생되었을 때, ICD의 세기는 신장으로 판단되었다.

도 5에서 알 수 있듯이, 10분 치료 주입들 후에, 그룹들 사이의 상당한 차이들은 dsDNA-특정 항체들의 레벨에서 관측될 수 없었다.

표 13은 화합물 1로 한 치료의 이익적인 효과들이 5차 주사로부터 시작하여 관측될 수 있었고 10차 주사까지 유지되었다는 것을 보여준다. 캅티솔® 컨트롤 그룹에서 단백뇨의 평균 레벨들은 화합물 1-처리된 그룹들보다 일관되게 더 높았다. 또한, 표 13은 ICD의 세기 감소가 두 화합물 1 투여량 그룹들의 신장들에서 관측되었다는 것을 보여준다. 이들 생쥐들에게서 SLE의 징후들을 감소시키는데 있어서 더 낮은 투여량(25 ㎍/mouse)이 더 높은 투여량(50 ㎍/mouse)보다 더 효과적이었다는 것을 보여주는 전체 경향이 있다.

<표 13> 25 또는 50 μg/생쥐 화합물 1(캅티솔®)로 치료한 (NZBxNZW) F1 생쥐에서 SLE의 징후

연구 그룹	평균 단백뇨± SEM (g/L)치료시작 후 지나간 주의 수				ICD^a (평균±SEM)
연구 그룹	5	7	8	10	ICD^a (평균±SEM)
Captisol^®	1.81±1.22(n=8)	5.74±3.13(n=8)	4.5±2.92(n=7)^b	4.46±2.93(n=7)^b	2.29±0.28(n=7)
화합물 1(50 μg/생쥐)	0.75±0.3(n=10)	0.81±0.3(n=10)	1.09±0.4(n=10)	1.29±0.3(n=10)	1.90±0.23(n=10)
화합물 2(25 μg/생쥐)	0.16±0.05(n=9)	1.26±1.09(n=9)	0.5±0.31(n=9)	0.56±0.3(n=9)	1.22^c±0.32(n=9)

^a ICD=Immune Complex Deposits. ICD 세기 척도: 0=없음; 1=중간; 2=강함; 3=강함/매우 강함.

^b 높은 레벨의 단백뇨를 지닌 동물의 죽음은 그룹 평균을 더 낮추었다.

^c (Captisol^®로 치료한 제어 생쥐와 비교하여; Mann-Whitney) p<0.05.

도 6은 각 치료 그룹 중의 하나의 신장의 대표적인 단면 사진을 보여준다. 상측 행은 캅티솔®-처치된 생쥐의 단면 사진이며, 중앙행은 50μg/생쥐 화합물 1로 치료된 생쥐의 단면 사진이며, 하측 행은 25μg/생쥐 화합물 1로 치료된 생쥐의 단면 사진이다. 각 투여량에서 (캅티솔®에 용해된) 화합물 1로 치료된 생쥐들의 신장 단면 사진에서 관찰되는 면역 복합 침전물들의 세기는 제어 그룹에서 관찰되는 것보다 훨씬 낮다는 것을 알 수 있다.

예 8: 상 I의 임상 연구

SLE 피실험자에서 캅티솔 ®의 피하주사에서 내성과 안전성에 접근하기 위한 상 I, 다중심적 , 임의의, 이중 맹검의 , 플라시보 제어된, 일회 투약의, 포-암(four-arm) 연구

이것은 프랑스에서 실시되었으며 인체에서 캅티솔®의 화합물 1에 대한 첫 번째 임상 연구이었다. 이 연구의 주요 목적은 SLE 피실험자에게 일회의 sc 주입으로써 투여된 캅티솔®의 화합물 1의 내성과 안전성을 평가하는 것이었다. 이 연구의 두 번째 목적은 이러한 피실험자에게 캅티솔®의 화합물 1의 일회의 sc 양 이후 면역학상 반응을 평가하는 것이었다.

36명의 피실험자가 이 연구에 참여하였다. 이 연구에 적합하도록 하기 위하여, SLE 환자들은 ACR(American College of Rheumatology)에서 루퍼스의 진단을 위해 사용되는 적어도 네 개의 기준을 만족시켜야만 하였다. 또한, 환자들은 안정적이고, 가볍고/보통의 질병과 SLE 질병 활동도 지수(SLEDAI)에 대해 10 이하의 점수를 가지고 있어야만 하였다.

각 환자는 아래와 같은 그룹 지정에 따라 주입 또는 그것의 매칭 플라시보(캅티솔®)를 위하여 재구성된 화합물 1의 일회 sc 주입을 받았다.

□ 그룹 A: 플라시보 (캅티솔®)

□ 그룹 B: 캅티솔®의 0.5 mg 화합물 1

□ 그룹 C: 캅티솔®의 1 mg 화합물 1

□ 그룹 D: 캅티솔®의 2.5 mg 화합물 1

실험실 테스트를 위한 혈액과 소변을 포함하여 일련의 표준적인 안전성 시험을 선발시, 투약한 날 동안, 투약후 24 시간, 투약 후 2주, 4주 및 8주째에 검사를 수행하였다. 투약전에, 예정된 재차 방문을 통해, SLE 관련 면역학상 테스트, 항-화합물 1 항체들과 PBL 약물 분석을 위해 혈액 샘플들을 채취하였다. 아래의 면역학상 테스트를 수행하였다.

□ (직접 및 간접적) Coomb's

□ C3, C4 및 CH50

□ 전체 IgG, IgM 및 IgA

□ ANA, 항dsDNA (Farr assay), 항ssDNA

□ (항La, 항Ro, 항RNP, 항Sm을 포함하는) 항ENA

□ 항카디오리핀 항체

□ VDRL

□ FTA 항체

□ 류마티스성 인자

피실험자 개체군에서 캅티솔®의 화합물 1의 안전성과 내성은 아래와 같은 기준에 근거하여 평가되었다.

□ SLE 플레어를 포함하여 AE들의 발생

□ 생명 징후들

□ 12-lead ECG

□ 건강 진단에서 변화들

□ 일상적인 임상 실험 테스트

□ SLEDAI 스코어

□ 면역학상 테스트 결과

상 Ia 의 임상 연구 상세한 내용

주요 연구원 및 각 연구 장소는 다음과 같다. 프랑스에서 6개의 연구 센터, 즉, Jean Charles Piette 교수 (La Pitie Salpetriere 병원, 파리), Oliver Meyer 교수 (Bichat 병원, 파리), Jean Revuz 교수 (Henri Mondor 병원, 크레테이), Loic Guillevin 교수 (Avicenne 병원, 보비그니), Eric Hachulla 교수 (Claude Huriez 병원, 닐 세덱스), Xavier Mariette 교수 (Bicetre 병원, 크렘린 비세터)

주사 앰플, 투약량 및 투약방법을 위한 ( 캅티솔 ®에서) 화합물 1, 플라시보 , 물

캅티솔®(120 mg/병)에서 화합물 1을 아래와 같은 투약량으로 피실험자당 일회 피하주사하였다.

캅티솔®의 0.5 mg 화합물 1/병, 캅티솔®의 1 mg 화합물 1/병, 및 캅티솔®의 2.5 mg 화합물 1/병.

화합물 1에 대한 플라시보: 120 mg 캅티솔®/병 (겉보기에 캅티솔®의 화합물 1의 병들에 동일)

방법론

이것은 화합물 1 또는 플라시보의 일회 피하주사를 이용한 임의 추출되고, 멀티-센터의, 이중 맹검의, 플라시보 제어된, 포-암 연구이었다. SLE 환자들은 기초 처치 전에 21일까지 검사를 받았다. 각 적합한 피실험자를 네 개의 치료 그룹 중 하나를 무작위로 뽑았다. 즉, 1.5, 1 또는 2.5 mg 화합물 1 또는 그의 매칭 플라시보 중 어느 하나의 피하 주사하였다. 모든 피실험자들은 약물 투여 전날에 허락을 하였다. 각 피실험자는 상술한 처치들 중 하나의 일회 투약을 받았다. 피실험자들은 투약 후 24 동안 퇴원하였다. 피실험자는 투약 후 2주, 4주 및 8주에 심층적으로 검사를 받았다. 안전성 실험 테스트를 위한 혈액 샘플(혈청 및 완전 혈액)을 선발시, 투약한 날(투약전), 둘째날(투약후), 투약후 2주, 4주 및 8주 (최종 방문)시 채취하였다. 면역학적 테스트를 위한 혈액 샘플은 선발시, 투약한 날(투약전), 4주 및 8주째에 채취하였다. PBL(peripheral blood lymphocytes) 확산은 투약하는 날(투약전), 2주, 4주 및 8주째에 평가하였다.

(전체 및 각 치료에 있어서) 피실험자의 수

이 연구에서 36명의 피실험자는 다음과 같은 방법으로 무작위로 뽑았다. 즉, 0.5 mg 처치 그룹에 9명, 1 mg 처치 그룹에 9명, 2.5 mg 처치 그룹에 10명, 플라시보 처리 그룹에 8명을 뽑았다.

포함을 위한 진단 및 주요 기준

이 연구에 적합한 피실험자들은 ACR의 적어도 네 가지 진단 기준을 만족시키는 SLE 환자들이다. 그들의 질병 상태는 2000년에 개정된 (SLEDAI 2k) SLE 질병 활동도 지수에서 10 이하의 점수를 가지는 안정적이고, 가볍고/보통의 질병 상태에 있어야만 했다.

연구를 위한 검사 이전 6개월 동안 불안정하거나 심한 천식, 뇌졸증, 급성 심근경색, 불안정한 협심증, 뇌출혈, 폐색전을 보인 SLE 환자들은 참여에서 제외시켰다. 임상적으로 유의하거나 불안정한 의학적 또는 외과적 상태, 당뇨병, 간질환(간경변, 활동성 간염, 간문맥 고혈압, 및/또는 복수증), 임상적으로 유의한 고혈압, 악성종양, 투석 또는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 병력을 가진 SLE 환자들도 본 연구참여로부터 제외되었다.

또한, 혈장사혈을 경험하였거나 검사 전 3개월 동안 아래와 같은 약물 중 하나로 치료받았았던 SLE 환자들은 본 연구 참여로부터 제외되었다. 이 약물로는, 하루에 30 mg 이상의 프레드니손 (또는 동일한 양의 다른 코르티코스테로이드), 정맥 코르티코스테로이드, 정맥 면역 글로블린 G(IgG), 경구용 항응고제 및 세포독성 약물 (예를 들면, 아자티오프린, 클로람부실, 시클로포스파미드, 미코페놀레이트 모페틸, 메토트렉세이트, 타크로리무스 등이 있다.

또한, 검사전 마지막 3개월동안 코르티코스테로이드(±10 mg/일 이상의 프레드니손, 또는 동일한 양의 다른 코르티코스테로이드) 및/또는 말라리아예방약으로 치료를 시작한 SLE 환자들은 본 연구로부터 제외되었다.

연구가 진행되는 동안 내내 기초 SLE 치료를 유지하기 위해 노력하면서도, 조사자들은 환자의 복지를 유지하고 최적화하기 위해 연구하는 동안에도 언제라도 참여자의 치료를 변경할 수 있었다.

평가에 대한 기준

안전성

아래의 안전성 파라메타들을 검사시, 입원하는 동안, 그리고 최종 방문을 포함하여 재차 방문시 부가하였다. 상기 파라메타들은, 생명 징후(심장수축으로 인한 혈압, 심장이완으로 인한 혈압, 맥박, 산소 포화, 체온 및 체중), 12-lead ECG, 건강 진단 및 임상학적 일상 실험실 안전성 테스트에서 변화 등을 포함한다. 투여한 날과 그 이후의 각 방문시 부작용들이 보고되었다.

면역학

SLE 관련 면역학적 테스트를 입원하는 동안 검사시 그리고 최종 방문을 포함하는 재차 방문시에 수행하였다.

투여한 날과 최종 방문을 포함하는 재차 방문시에 PBL 증식 측정과 항-화합물 1 항체 측정을 이용하여 약품 관련 면역학적 응답을 조사하였다.

질병 활동도

2000년에 개정된 (SLEDAI 2k) SLE 질병 활동도 지수 점수를 이용한 질병 활동도 평가를 검사시, 입원하는 동안, 그리고 최종 방문을 포함하는 재차 방문시 행하였다.

통계학적 방법들

이 연구가 진행되는 동안 수집된 데이터를 분석하고 제공하는 데 SAS® 버전 9.0 소프트웨어가 사용되었다. 상 Ia 연구를 위하여 어떠한 파워 계산도 수행되지 않았으며 어떠한 공식적인 가정 테스트도 실행하지 않았다.

부작용 경험

부작용 경험의 발생과 빈도는, MedDRA 사전 버전 5.0에 따른 System Organ Class와 선순위 용어에 의해 제공되었다. 이 데이터는 치료 그룹에 의해 표로 만들었다.

임상 실험 데이터

관찰 수, 평균, 표준 편차, 최소 및 최대값을 포함하는 실험 값의 기술적 통계는 검신, 첫째날 (투약 전), 둘째날, 2주, 4주 및 8주에 결정되었으며 치료 그룹에 의해 제공되었다. 기준시점으로부터 각 시점/방문까지 변화는 또한 치료 지정에 의해 각 방문에 대해 제공되었다. (적용시, 낮고 높은) 비정상적인 결과들의 퍼센트는 치료 그룹 및 방문/시점에 의해 파라메타에 근거로 제시된다. 기준시점으로부터 24시간 이후 투여량까지 그리고 기준시점으로부터 최종 방문까지의 변화 분석을 수행하였다.

생명 징후들

관찰 수, 평균, 표준 편차, 중간값, 최소값 및 최대값을 포함하는 생명 징후에 대한 기술적 통계는 검사시, 첫째날(투약 전후, 그리고 각 시간대), 둘째날, 2주, 4주 및 8주에 결정되었으며, 지정된 치료에 의해 표로 만들었다. 기준시점으로부터 각 시점/방문까지 변화는 방문 및 치료 지정에 의해 제공된다.

체중

지준시점, 종료 및 기준시점으로부터 변화시 체중(kg)의 기술적 통계는 치료 그룹에 의해 제공된다.

ECG

기준시점, 최종 및 기준시점으로부터 변화시 ECG 파라메터의 기술적인 통계가 제공된다. 변화 분석은, 정상/비정상 또는 존재/부존재 ECG 파라메터들 사이에서 기준시점으로부터 종료까지의 변화를 표로 제공한다. PCS(potentially clinically significant) QTc (Bazett) 측정은 미리 정해진 기준에 따라 확인되었다. PCS와 non-PCS Absolute QTc (Bazett) 사이의 변화 분석표와 기준시점으로부터 모든 방문까지의 QTc (Bazett)에서 PCS 변화의 발생표가 제공된다.

건강 진단

건강 진단 결과는 기준시점과 최종 방문시 각 신체 계통에 대한 비정상 또는 정상 조사결과를 가지는 비실험자의 발생에 의해 분석된다. 정상과 비정상간의 변화 분석과 그 반대의 경우도 또한 적용되었다. 기준시점으로부터 변화가 발생하지 않았을 경우, "기타"로 정의하였다.

화합물 1 관련 면역학적 실험

면역학적 지표로서, 다수의 진찰자료, 평균값, 표준편차, 중앙값, 최소값, 최대값 등과 같은 기술적 통계자료들이 치료 그룹과 방문에 의해 산출되고 제공되었다. 베이스라인(baseline)으로부터 각 재차 방문으로의 변화도 치료 그룹에 의해 제공된다. 응용 가능한 경우, 양성/음성 결과를 지니는 피실험자들(subjects)의 수와 비율이 치료 그룹과 방문에 의해 제공된다.

SLEDAI 2K

SLEDAI 2K의 평균값, 표준편차, 중앙값, 최소값, 최대값 등과 같은 기술적 통계자료가 제공된다.

상 Ia 임상연구 결과

피실험자 경향(disposition) 및 SLE 특성

36명의 피실험자들이 참가하여 실험 계획안에 따라 연구를 완료하였다. 모든 치료 그룹에서 대다수 피실험자들은 여성(34명; 94.4%)이고 백인(30명; 83.3%)이었다. 모든 치료 그룹의 평균 연령은 35.6세(32 내지 39의 범위)였다. 대부분의 피실험자들(91.7%)은 4 내지 6 사이의 ACR(American College of Rheumatology) 진단 기준을 지니고 있었으며, 평균 그룹 SLEDAI 2K 점수는 2.1로부터 4.1까지의 범위에서 변동되었다.

안정성 결과

연구 약물 치료 그룹들과 위약(placebo: 플라시보) 그룹 간에는 부작용(AE: Adverse Event)의 발생수 측면에서 현저한 차이점이 없었다. 모든 그룹들에서 가장 공통적으로 관찰되었던 AE는 가볍거나 중간 정도의 증상의 두통과 가벼운 증상의 주사 부위 반응이었다. 투약 반응(dose response)은 관찰되지 않았다. 심각한 부작용(SAE: Serious Adverse Event) 즉, 중증의(severe) 부작용은 연구중에 전혀 발생되지 않았다.

혈액학, 생화학 또는 소변검사 수치 측면에서도, 연구 약물에 기인하는 임상학적 중증 효과는 전혀 발견되지 않았다.

치명적 징후 지표(심장수축기 혈압, 심장확장기 혈압, 맥박, 산소 포화도) 측면에서, 연구 약물에 기인하는 임상학적 중증 효과는 전혀 발견되지 않았다.

체온 및 체중 측면에서도, 연구 약물에 기인하는 임상학적 중증 효과는 전혀 발견되지 않았다.

분류적 ECG 측정치 및 디지털 ECG 지표 측면에서, 화합물 1-피치료 그룹과 위약-피치료 그룹(placebo-treatment group) 간의 (Compound 1-treated group) 중대한 임상학적 차이점(difference of clinical significance)은 전혀 발견되지 않았다. PCS QTc 절대치와 베이스라인(> 60 msec)로부터의 QTc 변화는 전혀 기록되지 않았다. 화합물 1-피치료 그룹 및 위약-피치료 그룹들 내의 유사한 수의 피실험자들은 베이스라인으로부터 30 msec에서 60 msec 사이에서 변하는 QTcB 값을 가졌다.

화합물 1의 건강 진단(physical exam)에 대한 임상학적 증증 효과는 전혀 발견되지 않았다.

면역학적 결과

모든 피실험자들로부터 채취한 혈청 샘플을 측정한 결과에 따르면, 0.5, 1 및 2.5 mg/환자만큼의 화합물 1의 일 회 피하 투여는 anti-Compound 1 특이 항체의 발생을 초래하지 않았다는 것을 알 수 있었다. 7명의 피실험자들이 화합물 1에 대해 결정점(cut-off)이상으로 반응하였다. 이러한 항체들의 증가 레벨은 약물 투여를 하기 전에도 이미 나타나고 있었다. 항체들의 레벨의 증가는 이후의 기간(2개월)에도 전혀 관찰되지 않았다. 이 피실험자들의 혈청들은 반응 항체들의 동형(isotype)에 대해서 분석되었다. 피실험자들 중 두 명에서 나타난 반응이 IgM 동형과 관련되었으며, 다른 두 명에서 나타난 반응이 IgG 동형과 관련되었다. 7명 중 어느 누구도 특정 IgE 항체들을 가지지 않았다.

PBL(peripheral blood lymphocytes: 말초 혈압 림프구) 분석에 따르면, 피실험자들의 50% (18명)가 반응자로 분류되었으며 모든 치료 그룹들에서도 유사한 분포가 나타났다는 것을 알 수 있었다. 연구 약물의 일 회 SC 투여량 만이 투여되었다는 점을 고려해 보았을 때, 세포 반응은 상대적으로 낮았으며, 분석에 사용된 화합물 1 치료 투여량 또는 투여농도와 반응자/무반응자의 상태 사이에는 연관성이 전혀 없었다. 반응자의 발생 명수가 증가하는 징조는 전형 발견되지 않았다. 안정성을 제어하기 위한 TX (tetanus toxoid: 파상풍 변성독소) 분석 결과에 따르면, TTX에 대한 반응이 모든 치료 그룹들에 있어서 연구 기간 내내 지속 되었음을 알 수 있으며, 이는 captisol_®의 화합물 1이 TTX 회복(recall) 항원에 대한 면역학적 반을을 전혀 변경시키지 않는다는 것을 나타낸다.

면역학적 소견은 연구 약물 화합물 1의 일회 투여량 만큼만의 투여의 결과이다.

병 활동도 결과

소변 검사에서의 혈농도로 보아 2 내지 10 포인트의 SLEDAI 스코아 변화를 보이는 0.5 mg 치료 그룹에서의 한 명의 피실험자를 제외하고는, SLEDAI 스코아 (change of ≥3, ≤12)에 대한 화합물의 임상학적 중대 효과는 연구 기간동안에 전혀 발견되지 않았다. 이러한 소변 검사 소견은 연구 계획안에 따라 조사자들에 의해 루푸스 발작으로 확인되지 않았으며, 치료 변경없이 해결되었다.

결론

상술한 바와 같은 상 Ia 연구 결과에 따르면, 120 mg captisol_®의0.5, 1 또는 2.5 mg의 화합물의 일회 피하 투여는 안전하며 잘 견뎌지고 상 Ib의 여러번의 투여에 대한 연구를 지속할 수 있게 한다.

예 9: 상 Ib 의 임상 연구

SLE 피실험자에서 캅티솔 ®의 피하주사에서 화합물 1의 내성과 안전성에 접근하기 위한 상 I, 다중심적 , 바이 - 내서널 , 임의의, 이중 맹검의 , 포-암, 플라시보 제어된, 다수 투약 연구

이 연구는 SLE 피실험자들에 대한 반복적인 화합물 1 sc 투약의 안전성과 내성을 평가하기 위하여 수행되고 있다. 이 연구의 두 번째 목적은 SLE 피실험자들에서 캅티솔®의 화합물 1의 반복적인 sc 투약 이후 면역학적 반응을 평가하는 것이다.

화합물 1은 캅티솔®에서 0.5, 1.0 또는 2.5 mg의 투여량으로 주어진다. 이 조사용 제품은 총 12 sc 주사, 즉 4주 동안 주당 3회를 격일로(주말은 제외) 투약한다. 피실험자들을 투약을 시작한 후 2주, 4주, 8주 및 12주로 계획된 일정으로 감시한다. 안전성과 내성은 상 Ia의 임상 연구에서 설명한 것과 유산한 테스트를 이용하여 평가한다.

결과

상기 상 Ib 연구는 120 mg 캅티솔®에서 0.5, 1 또는 2.5 mg의 화합물 1을 여러번 피하주사하여도 안전하며 잘 견딜수 있다.

Claims

수용성 캐리어;

NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지는, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 약제학적으로 타당한 염의 조성물; 및

상기 수용성 캐리어에 상기 펩티드를 용해시키기 위한 효과적인 양을 가진 치환된 β-시클로덱스트린을 포함하고,

상기 조성물은 4와 9 사이의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩티드의 염의 농도는 적어도 0.5 mg/ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 펩티드의 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 펩티드의 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.5 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 7.5와 8.5 사이의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적으로 타당한 염은 아세테이트 염인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 하이드록시프로필, 술포부틸 에테르, 또는 술포프로필 에테르 치환된 β-시클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 술포부틸 에테르 치환된 β-시클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 치환된 β-시클로덱스트린은 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물의 pH를 4-9의 범위로 만들기에 적합한 양과 유형의 약제학적으로 타당한 완충제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
수용성 캐리어;

NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지는, 0.1 mg/ml 내지 20 mg/ml의 펩티드의 아세테이트 염의 조성물; 및

70 mg/ml 내지 170 mg/ml의 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린의 조성물을 포함하고,

상기 펩티드와 상기 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린은 상기 수용성 캐리어 내에 용해되고,

상기 조성물은 6.5와 8.5 사이의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 적어도 0.5 mg/ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.5 mg/ml 범위인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제13항에 있어서, 상기 헵타-(술포부틸 에테르)-β-시클로덱스트린의 농도는 120 mg/ml이고, 상기 조성물의 pH는 7.5와 8.5 사이인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 펩테드의 아세테이트 염의 농도는 1.0 mg/ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 펩티드의 아세테이트 염의 농도는 2.5 mg/ml인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
대상인 사람에게서 전신성 홍반성 낭창(SLE)의 징후를 완화하는데 효과적인 양으로 청구항 1 내지 18 중 어느 한 항에 의한 약제학적 조성물을 상기 사람에게 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 SLE의 징후를 완화하기 위한 방법.
대상인 사람에게서 SLE를 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의한 약제학적 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 의한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 방법으로서,

a) 치환된 β-시클로덱스트린 용액을 소정 농도로 수용성 캐리어 내에 준비하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 용액에 NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 갖는 펩티드의 약학적으로 타당한 염을 소정량 첨가하는 단계;

c) 상기 펩티드가 상기 용액에 용해될 때까지 상기 단계 b)의 용액의 pH를 조절하는 단계; 및

d) 필요하다면, 단계 c)의 용액의 pH를 4-9로 조절하여 상기 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린 용액은 상기 약제학적 조성물에서 70 mg/ml 내지 170 mg/ml의 치환된 β-시클로덱스트린의 최종 농도로 하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제22항에 있어서, 상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 치환된 β-시클로덱스트린의 최종 농도를 120 mg/ml로 하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 펩티드의 최종 농도를 적어도 0.1 mg/ml로 하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 펩티드의 최종 농도를 적어도 0.5 mg/ml로 하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 펩티드의 최종 농도를 적어도 2.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 또는 0.1 mg/ml이 되도록 하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 단계 b)는 상기 용액을 1시간 동안 혼합하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 상기 단계 c)에서 pH는 HCl 또는 NaOH 1.ON을 이용하여 조절되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서, 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 상기 단계 d)의 용액을 여과하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항에 있어서,

상기 소정 농도의 치환된 β-시클로덱스트린은 상기 약제학적 조성물에서 치환된 β-시클로덱스트린의 최종 농도를 120 mg/ml로 하고;

상기 소정량의 펩티드는 상기 약제학적 조성물에서 펩티드의 최종 농도를 적어도 2.5 mg/ml, 2.0 mg/ml, 1.0 mg/ml, 0.5 mg/ml 또는 0.1 mg/ml 이 되도록 하며;

상기 단계 b)는 상기 용액을 1시간 동안 혼합하는 것을 더 포함하고; 그리고

상기 단계 c)에서 pH는 HCl 또는 NaOH 1.ON을 이용하여 조절되고,

셀룰로오스 아세테이트 필터를 통하여 상기 단계 d)의 용액을 여과하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 제조방법.
제21항 내지 제30항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 준비된 약제학적 조성물.
제2항의 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 방법으로서,

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -40℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -40℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 20℃로 올리는 단계;

d) 상기 온도를 20℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계; 및

e) 압력을 감소시키고 상기 온도를 20℃로 소정 시간동안 유지하여 상기 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 a)는 2시간 이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 c)는 13시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 c)는 110μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 d)는 13시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 d)는 110μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 e)에서 압력이 10μbar로 감소하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서, 상기 단계 e)는 5시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항에 있어서,

상기 단계 a)는 2시간 이내에 수행되고;

상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되고;

상기 단계 c)는 13시간 이상 110 μbar의 압력으로 수행되고;

상기 단계 d)는 13시간 이상 110 μbar의 압력으로 수행되고; 그리고

상기 단계 e)는 5시간 이상으로 수행되고 상기 압력은 10 μbar로 감소되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제32항 내지 제41항 중 어느 한 항에 의한 방법으로 준비되는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
제2항의 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 방법으로서,

a) 상기 약제학적 조성물의 온도를 -45℃까지 낮추는 단계;

b) 상기 온도를 -45℃에서 소정 시간동안 유지하는 단계;

c) 상기 용액의 온도를 -20℃로 올리는 단계;

d) 상기 용액의 온도를 25℃까지 올리는 단계; 및

e) 상기 온도를 25℃로 소정 시간동안 유지하여 상기 약제학적 조성물을 냉동 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 a)는 6시간 이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 c)는 19시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 c)는 150μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 d)는 13시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 d)는 150μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 e)는 8시간 이상 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서, 상기 단계 e)는 150μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항에 있어서,

상기 단계 a)는 6시간 이내에 수행되고;

상기 단계 b)는 3시간 이내에 수행되고;

상기 단계 c)는 19시간 이상 150 μbar의 압력으로 수행되고;

상기 단계 d)는 13시간 이상 150 μbar의 압력으로 수행되고; 그리고

상기 단계 e)는 8시간 이상 150μbar의 압력으로 수행되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물의 냉동 건조 방법.
제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따르는 방법으로 준비되는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
제53항에 있어서, 상기 조성물의 수분 함량은 5%미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
제54항에 있어서, 상기 조성물의 수분 함량은 4.0%미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
제55항에 있어서, 상기 조성물의 수분 함량은 3.5%미만인 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
NH₂-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO:1)의 구조식을 가지는 펩티드의 약제학적으로 타당한 염; 및

치환된 β-시클로덱스트린을 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동 건조된 약제학적 조성물.
패키징 재료; 및

제 57항의 냉동건조된 약제학적 조성물을 소정량 포함하는 구성된 패키지 형태로 된 약제학적 조성물.