KR20050074468A - 비-소세포성 폐암을 진단하는 방법 - Google Patents

비-소세포성 폐암을 진단하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 차별적으로 발현되는 유전자를 이용하여 비-소세포성 폐암을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 비-암 조직과 비교하여 비-소세포성 폐암에서 발현이 상승되는 새로운 인간 유전자를 제공한다. 또한, 본 발명은 비-소세포성 폐암의 치료 및 예방을 위한 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.

Description

비-소세포성 폐암을 진단하는 방법{METHOD FOR DIAGNOSING NON-SMALL CELL LUNG CANCERS}
본 발명은 생물과학분야, 보다 상세하게는 암 연구 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 비-소세포성 폐암을 진단하는 방법 및 상기 암 세포에서 발현이 상승되거나 감소된 유전자에 관한 것이다.
본 발명은 2002년 9월 30일에 출원된 USSN 60/414, 2002년 9월 30일에 출원된 USSN 60/451, 2003년 4월 28일에 출원된 USSN 60/466,100과 관련되어 있고 이는 참고문헌으로 명세서에 포함된다.
폐암은 인간에게 가장 일반적이고 치명적인 암이다. 폐암의 발병 및 진행과 관련된 많은 유전적 변이(alteration)가 보고되어 왔다. 유전적 변이는 전이의 위험성 또는 치료에 대한 반응을 예측하려는 노력과 진단을 도울 수 있을지라도, 단일 또는 제한된 수의 분자 마커는 일반적으로 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer (NSCLC))의 진단에 대한 만족할만한 결과를 제공하지는 못한다(Mitsudomi et al. , Clin Cancer Res 6: 4055-63 (2000); Niklinski etal., Lung Cancer. 34 Suppl 2:S53-8 (2001) ; Watine, Bmj 320: 379-80 (2000) ). 비-소세포성 폐암(Non-small cell lung cancer, NSCLC)은 지금까지 폐암의 거의 80%에 해당하는 가장 일반적인 형태의 폐암이다(Society, A. C. Cancer Facts and Figures 2001, 2001). 최근 다방면 요법(multi-modality therapy)의 발전에도 불구하고 NSCLC의 대다수가 단계가 진행된 후에야 진단되기 때문에 전체 10-년 생존률은 10% 정도로 낮은 편이다(Fry,W. A. , Phillips, J. L. , and Menck, H. R. Ten-year survey of lung cancer treatment and survival in hospitals in the United States: a national cancer data base report, Cancer.86 : 1867-76., 1999. ). 백금(platinum)에 기초를 둔 화학치료법이 NSCLC 치료를 위한 기준 규격(reference standard)으로 여겨지지만, 그러한 약물은 진행된 NSCLC를 앓고 있는 환자의 생존을 약 6 주 밖에 연장시키지 못한다(Chemotherapy in non-small cell lung cancer: a meta-analysis using updated data on individual patients from 52 randomised clinical trials. Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj.311 : 899-909., 1995). 상기 질병을 위해 티로신 키나아제 억제제를 포함하여 수많은 표적치료가 연구되고 있다. 그러나 백금 및 도세탁셀 기반의 요법으로 실패한 진행된 비-소세포성 폐암(NSCLC) 환자에서((IDEAL 2).,Proc Am Soc Clin Oncol.21 : 292a (A1166), 2002) 그러나 제한된 수의 환자에서만 가능성 있는 결과가 수득되었으며, 어떤 환자는 심한 부작용을 나타냈다(Kris M, N. R. , Herbst RS Aphase II trial ofZD 1839 ('Iressa').
cDNA 마이크로어레이(microarray) 기술을 정상 및 악성 세포에서 유전자 발현의 종합적인 프로파일(profile)을 수득할 수 있게 되었고 악성과 그에 해당하는 정상 세포에서 유전자 발현을 비교할 수 있게 되었다(Okabe et al. , Cancer Res 61: 2129-37 (2001) ; Kitahara et al. , Cancer Res 61: 3544-9 (2001); Lin et al., Oncogene 21: 4120-8(2002) ; Hasegawa etal., Cancer Res 62: 7012-7 (2002) ). 이러한 방법은 암 세포의 복잡한 성질을 밝히는 것이 가능하게 하고 암 발생의 기작을 밝히는데 도움을 준다.
암세포에서 조절되지 않는 유전자를 동정하는 것은 각각의 암에 대한 보다 정확하고 정밀한 진단과 새로운 치료 표적을 개발을 가능하게 한다(Bienz and Clevers, Cell 103: 311-20 (2000)). 유전체의 관점에서 종양의 기작을 밝히고 진단과 새로운 치료제의 개발을 위한 표적 분자를 발견하기 위해서, 본 발명자들은 23040 유전자의 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 종양의 발현 프로파일(profile)을 분석해왔다(Okabe etal., Cancer Res 61: 2129-37(2001) ; Kitahara etal., Cancer Res 61: 3544-9(2001) ; Lin et al. , Oncogene 21: 4120-8 (2002); Hasegawa etal., Cancer Res 62: 7012-7 (2002)).
암 발생의 기작을 밝히려고 계획된 연구는 이미 항암제를 위한 분자 표적의 동정을 용이하게 하였다. 예를 들어, 원래는 활성화가 번역후 파르네실레이션(farnesylation)에 의존적인 Ras와 관련된 성장-신호 경로를 억제하려고 개발된 파르네실전이효소(farnexyltransferase, FTIs) 억제제는 동몰 모델에서 Ras-의존적인 종양을 치료하는데 효과적이었다(He etal., Cell 99: 335-45 (1999) ). 항암제 및 항-HER2 단일클론 항체인 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 조합을 이용하여 인간에 대한 임상 시험이 원-암 유전자(proto-oncogene) 수용체 HER2/neu를 상쇄하기 위해 시행되었다; 그리고 임상 결과와 유방암 환자의 생존율이 향상되었다(Lin etal., Cancer Res 61: 6345-9 (2001)).
선택적으로 bcr-abl 융합 단백질을 비활성화시키는 티로신 키나아제 억제제STI-571는, bcr-abl 티로신 키나아제의 계속적 활성화(constitutive activation)가 백혈구의 형질전환에 있어 중요한 역할을 하는 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemias)을 치료하기 위해 개발되었다. 이러한 종류의 작용제는 특이적인 유전자 산물의 암발생 활성(oncogenic activity)을 억제하도록 디자인 되었다(Fujita etal., Cancer Res 61: 7722-6 (2001) ). 그러므로 일반적으로 암세포에서 상향 조절되는 유전자 산물은 새로운 항암제를 개발하기 위한 잠재적인 표적으로 작용할 것이다.
CD8+ 세포독성 T 림프구는 MHC Class I 분자에 의해 나타나는 종양-관련 항원(tumor-associated antigens, TAAs)으로부터 유도된 에피토프(epitope) 펩티드를 인지하고 암세포를 융해(lysis)시킨다는 것이 입증되었다. TAA의 최초의 예로 MAGE 군이 발견된 이래로, 많은 다른 TAA가 면역학적 방법을 이용하여 발견되었다(Boon, Int J Cancer 54: 177-80(1993) ; Boon and van der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen et al. , Science 254: 1643-7(1991) ; Brichard et al. , J Exp Med 178: 489-95(1993) ; Kawakami et al. , J Exp Med 180: 347-52 (1994) ). 발견된 TAA 중 몇몇은 현재 면역치료의 표적으로 임상 개발 단계에 있다. 지금까지 발견된 TAA는 MAGE(van der Bruggen et al., Science 254: 1643-7 (1991)),gap100 (Kawakami et al. , J Exp Med 180: 347-52(1994)), SART (Shichijo et al. , J Exp Med 187 : 277-88 (1998)), 및 NY-ESO-1 (Chen et al. , Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997) )를 포함한다. 반면에, 암 세포에서 특이적으로 과발현되는 것으로 나타난 유전자 산물은 세포 면역 반응을 포함하여 표적으로 인지되는 것으로 여겨졌다: 그러한 유전자 산물은 p53 (Umano et al. , Brit J Cancer 84: 1052-7 (2001) ), HER2/neu (Tanaka et al., Brit J Cancer 84: 94-9 (2001) ), CEA (Nukaya et al. , Int J Cancer 80: 92-7 (1999) ) 등을 포함한다.
TAA에 관한 기초와 임상 연구의 상당한 진전에도 불구하고(Rosenbeg et al. , Nature Med 4: 321-7 (1998); Mukherji et al., Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995); Hu et al. , Cancer Res 56: 2479-83 (1996) ), 대장암을 포함한 선암종(adenocarcinomas)의 치료를 위해 단지 제한된 수의 TAA 만이 가능하다. 암 세포에서 다량 발현되고 동시에 그러한 발현이 암세포에만 국한되는 TAA가 면역 치료 표적의 유력한 후보가 될 것이다. 더 나아가 잠재적이고 특이적인 항암 면역 반응을 유도하는 새로운 TAA의 동정은 다양한 종류의 암에서 펩티드 백신의 임상적 사용을 가능하게 할 것으로 기대된다(Boon and can der Bruggen, J Exp Med 183: 725-9 (1996); van der Bruggen etal., Science 254: 1643-7(1991) ; Brichard et al. , J Exp Med 178: 489-95(1993) ; Kawakami et al. , J Exp Med 180: 347-52 (1994); Shichijo et al. , J Exp Med 187: 277-88(1998) ; Chen et al. , Proc Natl Acad Sci USA 94: 1914-8 (1997); Harris, J Natl Cancer Inst 88: 1442-5 (1996); Butterfield etal., Cancer Res 59: 3134-42 (1999); Vissers etal., Cancer Res 59: 5554-9 (1999); van der Burg et al. , J Immunol 156: 3308-14 (1996); Tanaka etal., Cancer Res 57: 4465-8 (1997); Fujie et al., Int J Cancer 80: 169-72 (1999); Kikuchi et al. , Int J Cancer 81: 459-66 (1999) ; Oiso et al. , Int J Cancer 81: 387-94 (1999)).
건강한 공여자로부터 수득된 펩티드-자극된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)가 펩티드에 반응하여 상당 수준의 IFN-γ를 생산할 수 있다는 사실은 반복적으로 보고되었지만 51Cr-방출 분석으로 HLA-A24 또는 A0201 제한된 방식에서 암세포에 대해 서는 거의 세포 독성을 나타내지 않았다(Kawano et al. , Cance Res 60: 3550-8 (2000); Nishizaka etal., Cancer Res 60: 4830-7 (2000); Tamura et al. , Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001) ). 그러나, HLA-A24와 HLA-A0201 둘 다 코카시안 뿐만 아니라 일본인에서는 흔한 HLA 대립형질(allele)이다(Date etal., Tissue Antigens 47: 93-101 (1996); Kondo et al. , J Immunol 155: 4307-12 (1995); Kubo et al. , J Immunol 152:3913-24 (1994); Imanishi et al. , Proceeding of the eleventh International HictocompatibilityWorkshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams et al. , Tissue Antigen 49: 129 (1997) ). 그러므로 이러한 HLA에 의하여 나타나는 항원 펩타이는 특히 일본인과 코카시안의 암 치료에 유용할 것이다. 더 나아가 시험관내에서 낮은 친화도 CTL의 유도는 대개 높은 수준의 특이적인 펩티드/MHC 복합체를 생성하는 고농도의 펩티드 사용으로 인한 것임이 알려졌다. 이는 효과적으로 이러한 CTL을 활성화시킬 것이다(Alexander-Miller et al. , Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996)).
도 1은 반-정량적(semi-quantitative) RT-PCR에 의하여 확인된 200개의 유전자가 폐암 세포에서 과발현됨을 나타내는 블럿 사진이다. 폐암 세포는 LCM 방법에 의해 폐암 환자로부터 수득되었다.
도 2는 폐암 세포에서 NSC810, NSC811, NSC 812, NSC 825, NSC 841, NSC 857, NSC 859, NSC 893, NSC 905, NSC 947, NSC 956, NSC 994, NSC 1075, NSC 1107, NSC 1191 및 NSC 1389를 억제하도록 고안된 안티센스 S-올리고뉴클레오티드의 성장-억제 효과를 나타낸다.
도 2는 폐암 세포에서 NSC810-AS, NSC811-AS1, NSC 811-AS2, NSC 811-AS4, NSC 812-AS1, NSC 812-AS2, NSC 825-AS1, NSC 825-AS3, NSC825-AS5, NSC 841-AS4, NSC841-AS5, NSC 857-AS3, NSC 857-AS4, NSC 859-AS2, NSC859-AS3, NSC859-AS5, NSC893-AS1, NSC 893-AS2, NSC 905-AS2, NSC 905-AS3, NSC905-AS5, NSC 947-AS1, NSC 947-AS2, NSC 947-AS3, NSC 947-AS4, NSC956-AS1, NSC 956-AS2, NSC994-AS1, NSC 994-AS3, NSC 994-AS4, NSC 994-AS5, NSC1075-AS5, NSC 1107-AS1, NSC 1107-AS4, NSC1191-AS2, NSC1191-AS4, NSC1191-AS5 및 NSC 1389-AS에 의한 세포 성장 억제를 나타내는 MTT 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 폐암세포주에서 siRNA (NSC 807-sil, NSC810-sil, NSC825-sil, NSC 825-si2, NSC 841-sil, NSC 841-si2, NSC 903-sil, NSC 903-si2, NSC 956-sil, NSC 956-si2, NSC 994-sil, NSC 1107-sil, NSC 1107-si2, NSC 1107-si3, NSC 1107-si4, NSC1107-si5, NSC1191-si2, NSC 1246-si2 and NSC 1389-si2) 의 성장억제효과를 나타낸다.
도 3A는 대조-siRNA 또는 표적-siRNA를 발현하는 벡터로 형질전환된 A549 세포에서 MTT 분석을 실시한 결과를 나타낸다.
도 3B는 대조-siRNA 또는 표적-siRNA를 발현하는 벡터로 형질전환된 LC319 세포에서 MTT 분석을 실시한 결과를 나타낸다.
도 3C는 siRNA로 형질전환된 LC319 세포의 동영상 이미지 마이크로그램(microgram of timelapse imaging)을 나타낸다.
도 3D는 siRNA로 형질전환된 세포의 세포 주기 프로파일을 나타내는 유세포 분류 분석(Flow cytometry analysis) 결과를 나타낸다.
도 3E는 두가지 상이한 모노클론 항체로 검출된 LC319 세포내 순수한(naive) 단백질의 siRNA에 의한 발현과 억제를 나타내는 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 사진이고,
도 3F,G 및 H는 A549 세포에서 시토크롬 c 산화제(cytochrome c oxidase, CCO) 활성과 COX17 RNAi에 의한 활성 억제를 나타낸 그림이고, 도 3F는 CCO 활성의 모식도이다.
도 3G은 인간 미토콘드리아(MAB1273 ; CHEMICON, Temecula, CA)에 대한 마우스 모노클론 항체를 사용하여 세포의 COX17 RNAi로 형질전환된 A549 세포 분할(fractionation), 세포의 세포질 및 미토콘드리아 단편(fraction)을 확인한 그림이고,
도 3H는 형질전환 2 또는 5일 이후에 내재하는 COX17 유전자의 억제로 인해 CCO 활성이 감소했음을 보여주는 그림이고,
도 4는 다양한 인간 조직에서 다중-조직 노던 블럿 분석(multiple-tissue northern blot analysis)으로 NSC 807, NSC 810, NSC 811, NSC 822, NSC825, NSC 841, NSC 849, NSC 855, NSC 859, NSC 885, NSC 895, NSC 903, NSC 904, NSC 905, NSC 915, NSC 948, NSC 956, NSC 994, NSC 1000, NSC 1066, NSC 1075, NSC 1107, NSC 1113, NSC1131, NSC 1141, NSC 1164, NSC 1183, NSC 1201, NSC 1240, NSC 1246, NSC 1254, NSC 1265, NSC 1277, NSC 1295, NSC 1306, NSC 1343, NSC 1362, NSC 1389, NSC 1399, NSC 1406, NSC 1413 및 NSC 1420의 발현을 나타낸 사진이고,
도 5A는 시각화하기 위해서 면역세포화학요법(immunocytochemistry)으로 c-myc-His 표지된 NSC 유전자 발현벡터로 형질전환된 COS-7 세포에서 항-His 단일클론 항체와 로다민(Rhodamine) 결합된 이차 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 관찰된 NSC 849, NSC855, NSC 895, NSC 915, NSC 948, NSC 1000, NSC 1103, NSC 1164, NSC 1201, NSC 1288, NSC 1295, NSC 1389, NSC 1420 및 NSC 1441의 세포내 위치를 나타낸 사진이고, Nuclei는 DAPI로 역염색(counter-stain)되었다.
도 5B는 배지에서 분비된 c-myc 표지된 NSC 895, NSC 1164 및 NSC 1295의 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타낸 사진이고,
도 6은 c-myc-His 표지된 발현 벡터로 형질전환된 COS-7 세포에서 세포성장에 NSC 유전자가 미치는 영향을 나타낸 사진이고,
도 6A는 형질전환된 COS-7세포에서 웨스턴 블럿에 의해 NSC 810, NSC 841 및 NSC 1389의 발현을 나타낸 그림이고,
도 6B는 COS-7 세포의 성장에 NSC 810, NSC 841 및 NSC 1389이 미치는 영향을 나타낸 그림이고, 높은 수준의 NSC810 (COS7-TTK-1 및 2), NSC 841 (NIH3T3-URLC2-3 and 5) 및 NSC 1389 (COS-7-NMU-2,3 and 5)을 발현하는 2 또는 3 가지 독립적인 형질전환체 및 대조군 (mock)을 세 세트(triplicate)로 배양하였다. 세포 생존(Cell viability)은 MTT 분석으로 측정하였다.
도 7은 자가 시스템(autocrine system)에 의해 검사한 세포 성장에 NMU이 미치는 영향을 나타낸 그림이고,
도 7A는 NMU의 자가 분석(autocrine assay) 결과를 나타낸 그림. NMU 의 25 아미노산 폴리펩티드 활성형(NMU-25) 및 BSA (대조군) 단백질은 48시간 마다 각각의 COS-7 세포에 첨가되었다. 첨가 7일 후에 세포수를 MTT 분석으로 세었다.
도 7B는 NMU-25로 처리된 COS-7 세포에서 항-NMU 항체의 성장-억제 효과를 나타낸다.
도 7C는 내재적으로 NMU를 과발현하는 LC319 세포에서 항-NMU 항체의 성장-억제 효과를 나타낸다.
도 8은 NSCLC 세포주, A549, LC319 및 NCI-H522엣 TTK 단백질의 과발현을 확인하는 웨스턴 블럿 분석 결과를 나타내는 그림이고,
도 9는 항-NSC 947 항체, 항-NSC 1164 항체, 항-NSC 1295 항체 및 항-NSC 1389 항체를 가진 선암(adenocarcinoma), 편평 세포암(squamous cell carcinoma) 및 정상 폐의 임상시료에서 NSC 947, NSC 1164, NSC 1295 및 NSC 1389의 면역조직화학적 염색 결과를 나타낸다.
본 발명은 비-소세포성 폐암, 즉 편평 세포암(squamous cell carcinoma), 선암, 즉 선방성(acinar), 유두상(papillary) 및 기관지 폐포(bronchoalveolar)), 대세포암(즉 거대세포와 투명세포), 선편평세포암종(adenosquamous carcinoma) 및 미분화 암종과 관련된 유전자 발현의 패턴 발견에 기초를 두고 있다.
비-소세포성 폐암에서 차별적으로 발현되는 유전자들은 여기서는 집합적으로 "비-소세포성 폐암-관련 유전자(non-small cell lung cancer-associated gene)","NSC 핵산(NSC nucleic acids)" 또는 "NSC 폴리뉴클레오티드(NSC polynucleotides)", 및 상기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 "NSC 폴리펩티드(NSC polypeptides)" 또는 "NSC 단백질(NSC proteins)"로 언급된다. 여기에서, 비-소세포성 폐암에서 상이하게 발현된다는 것은 비-소세포성 폐암에서 유전자 발현이 정상 세포에서의 것과 다르다는 것을 나타낸다. 정상세포는 폐 조직으로부터 수득된다.
그러므로, 본 발명은 환자에게서 수득된 생물학적 시료에서 비-소세포성 폐암 관련 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 대상체의 비-소세포성 폐암에 걸릴 소질을 진단하거나 결정하는 방법에 관한 것이다. 비-소세포성 폐암 관련 유전자는 예를 들어 NSC 1-1448 (표 1-3 참조)를 포함한다. 변이, 예를 들어 유전자의 정상 대조군 수준과 비교할 때 유전자 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체가 비-소세포성 암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다는 것을 나타낸다.
"정상 대조군 수준"은 정상, 건강한 개인 또는 비-소세포성 폐암에 걸리지 않은 것으로 알려진 개인의 집단에서 측정된 유전자의 발현 수준을 나타낸다. 대조군 수준은 단일 참고 집단 또는 다수의 발현 패턴으로부터 유도된 단일 발현 패턴이다. "정상 대조군 수준", "대조군 수준"은 질병배경(즉, 암 또는 비-암)이 알려진 개인 또는 개인의 집단에서 검출된 유전자 발현 수준이다. 그러므로 대조군 수준은 정상적인 건강한 개인, 비-소세포성 폐암에 걸리지 않았다고 알려진 개인의 집단, 비-소세포성 폐암 환자 또는 환자 집단의 유전자의 발현에 기초를 두고 측정될 수 있다. 비-소세포성 폐암 환자나 환자 집단의 유전자 발현 수준에 상응하는 대조군 수준은 "비-소세포성 폐암 대조군 수준"으로 언급된다. 더 나아가 대조군 수준은 이전에 시험한 세포로부터 나온 발현 패턴의 데이터베이스일 수 있다.
정상 대조군 수준과 비교하여 생물학적 시료에서 측정된 어떤 하나 또는 NSC 807-1448 유전자의 패널의 발현 수준 증가는 대상체가(시료가 수득된) 비-소세포성 폐암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있음을 나타낸다. 대조적으로, 정상 대조군 수준과 비교하여 생물학적 시료에서 측정된 어떤 하나 또는 NSC 1-806 유전자의 패널의 발현 수준 감소는 대상체가(시료가 수득된) 비-소세포성 폐암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있음을 나타낸다. 대안적으로, 생물학적 시료에서 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 어떤 하나 또는 패널의 발현 수준은 동일한 유전자 또는 동일한 유전자 패널의 비-소세포성 폐암 대조군 수준과 비교될 수 있다.
유전자 발현은 대조군 수준과 비교하여 10%, 25%, 50% 이상 증가되거나 감소된다. 대안적으로, 유전자 발현은 대조군 수준에 비하여 1.2, 5 배 이상 증가되거나 감소될 수 있다. 발현은 혼성화, 예를 들어 칩상에서 또는 어레이에서 환자에게서 수득한 생물학적 시료의 유전자 전사체에 비-소세포성 폐암-관련 유전자 탐침의 혼성화를 검출하여 측정된다. 환자에게서 수득된 생물학적 시료는 대상체, 예를 들어, 비-소세포성 폐암에 걸렸다고 알려졌거나 의심되는 환자로부터 수득된 시료일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 시료는 객담(sputum), 혈액, 혈청, 혈장 또는 폐 세포를 포함하는 조직일 수 있다.
본 발명은 또한 두 가지 이상의 NSC 1-1448의 유전자 발현 수준 패턴을 포함하는 비-소세포성 폐암 참고 발현 프로파일을 제공한다.
더 나아가 본 발명은 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 발현하는 시험 세포와 시험화합물을 접촉시키는 단계 및 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준이나 활성을 측정하는 단계에 의해 비-소세포성 폐암-관련 유전자(예를 들어 NSC 1-1448)의 발현 또는 활성을 억제하거나 증진시키는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 시험 세포는 폐 상피세포와 같은 폐 세포일 수 있다. 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교한 발현 수준 감소는 시험 화합물이 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 및 작용 억제제임을 나타낸다. 그러므로, 화합물이 정상 대조군 수준과 비교할 때, NSC 807-1448의 비-소세포성 폐암-관련 유전자 발현 수준을 억제하면 그 화합물은 비-소세포성 폐암의 증상을 감소시킬 것으로 기대된다. 또는, 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교할 때 발현 수준이나 활성의 증가는 상기 시험 화합물이 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 또는 기능의 증진제라는 것을 나타낸다. NSC 1-806의 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준을 증가시키는 화합물은 비-소세포성 폐암의 증상을 감소시킬 것으로 기대된다.
대안적으로, 본 발명은 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 방법은 시험 화합물과 NSC 폴리펩티드를 접촉시키는 단계, 및 NSC 폴리펩티드에 결합하거나 NSC 폴리펩티드의 생물학적 활성을 변경시키는 화합물을 선택하는 단계를 포함한다. 더 나아가 본 발명은 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이는 시험 화합물을 NSC 단백질을 발현하거나 리포터 유전자의 NSC 유전자 상류(upstream)의 전사 조절 부위를 포함하는 벡터가 도입된 세포를 접촉시키는 단계, 및 NSC 단백질이나 리포터 유전자에 의하여 암호화된 단백질의 발현 수준을 변경시키는 시험 화합물을 선택하는 단계를 포함한다. 이러한 스크리닝 방법에 따르면, NSC807-1448에 의하여 암호화된 폴리펩티드나 NSC 807-1448에 의하여 암호화된 단백질을 발현하는 세포 또는 NSC 807-1448의 전사 조절 부위가 사용될 때, 정상 대조군 수준과 비교하여 생물학적 활성이나 발현 수준을 억제하는 시험 화합물은 비-소세포성 폐암의 증상을 감소시킬 것으로 기대된다. 대안적으로, NSC 1-806에 의하여 암호화된 폴리펩티드나 NSC 1-806에 의하여 암호화된 단백질을 발현하는 세포 또는 NSC 1-806의 전사 조절 부위를 발현하는 세포가 사용되면, 발현 수준을 증가시키는 화합물은 비-소세포성 폐암의 증상을 감소시킬 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 NSC 핵산에 결합하거나 NSC 핵산의 유전자 산물(예를 들어 mRNA 및 폴리펩티드)에 결합하는 두 가지 이상의 검출 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 또한 하나 이상의 NSC 핵산에 결합하는 폴리뉴클레오티드의 어레이를 제공한다.
비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법 및 그러한 방법에 사용될 조성물 또한 제공된다. 치료 방법은 NSC 807-1448의 유전자 발현을 감소시키는 안티센스, siRNA(short interfering RNA), 또는 라이보자임의 조성물, 또는 상기 유전자에 의하여 암호화된 폴리펩티드에 결합하여 기능을 억제하는 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 대상체에 투여함으로써 대상체에서 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법을 포함한다.
본 발명은 또한 백신 및 백신접종 방법을 포함한다. 예를 들어, 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법은 대상체에 NSC 807-1448의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드나 면역학적으로 활성이 있는 상기 폴리펩티드의 단편을 포함하는 백신을 투여함으로써 수행된다. 면역학적으로 활성이 있는 단편은 자연적으로 존재하는 전체-길이 단백질보다 더 짧은 폴리펩티드이고 이는 체내로 들어가면 면역 반응을 유도한다. 예를 들어 면역학적으로 활성인 단편은 생체에서 T 세포나 B 와 같은 면역 세포를 자극하는 적어도 8개의 잔기를 가진 폴리펩티드를 포함한다. 면역 세포 자극은 세포 증식, 특정 사이토카인의 생산(예를 들어 IL-2) 또는 항체 생산을 검출함으로써 측정될 수 있다.
다른 치료 방법은 NSC 1-806 유전자의 발현 수준이나 NSC 1-806 유전자에 의하여 암호화된 폴리펩티드의 활성을 증가시키는 화합물들을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 비-소세포성 폐암은 NSC 1-806의 폴리뉴클레오티드(예를 들어 벡터에 포함된) 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화된 폴리펩티드를 투여하여 치료되거나 예방될 수 있다. 더 나아가, 본 발명은 본 발명의 스크리닝 방법에 의하여 선택된 화합물을 투여하여 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 제공한다. 폴리펩티드가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유하도록 아미노산 서열을 갖고있는 한, 아미노산 서열은 적어도 1, 2,3, 5,10, 25, 50, 100 또는 200 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가되는 돌연변이가 일어날 수 있다. 돌연변이가 일어난 폴리펨타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 적어도 85%,90%, 95 % 또는 99% 동일하다. 또한 서열번호 1의 핵산에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 또한 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 엄격한, 적당히 엄격한 또는 별로 엄격하지 않은 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 혼성화된다.
명세서에서 "엄격한 (혼성화) 조건"이라는 구문은 탐침, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드가 표적 서열과 혼성화하고 다른 서열과는 혼성화하지 않는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 다른 환경하에서는 다를 것이다. 더 긴 서열의 특이적인 혼성화는 짧은 서열보다 더 높은 온도에서 관찰된다. 일반적으로 엄격한 조건의 온도는 정해진 이온 강도와 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(thermal melting point, Tm)보다 섭씨 5도 정도 낮게 책정된다. Tm은 평형상태에서 표적 서열에 상보적인 탐침의 50%가 표적서열에 혼성화하는 온도이다(정해진 이온 강도, pH 및 핵산 농도에서). 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 탐침의 50%는 평형상태에 놓인다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0 M 소디움 이온 미만이고, 약 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M 소디움 이온(또는 다른 염) 및 온도는 짧은 탐침, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드(예를 들어 10 내지 50 뉴클레오티드)의 경우는 약 30 ℃이고 더 긴 탐침, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드에의 경우는 약 60℃이다. 엄격한 조건은 또한 포름아마이드와 같은 탈안정화 작용제를 넣어 만들어질 수 있다.
더 나아가 본 발명은 본 발명의 상기된 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 명세서에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 어떠한 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드의 구조 또는 3개를 초과하는 개별 유전자에 걸쳐 자연적으로 존재하는 게놈 폴리뉴클레오티드의 단편 구조와 동일하지 않은 폴리뉴클레오티드이다. 그러므로 상기 용어는 예를 들어, (a) 자연적으로 존재하는 개체의 게놈에서 자연적으로 존재하는 게놈 DNA 분자의 일부 서열을 가진 DNA ; (b) 벡터 또는 진핵세포나 원핵세포의 게놈 DNA로 삽입되어 그 결과 생성되는 분자가 어떠한 자연적으로 존재하는 벡터나 게놈 DNA와 동일하지 않은 폴리뉴클레오티드; (c) cDNA, 게놈 단편, 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 생성된 단편 또는 제한 효소 단편과 같은 개별 분자 (d) 하이브리드 유전자(예를 들어 융합 폴리펩티드를 암호화하는 유전자)의 일부분인 재조합 뉴클레오티드 서열. 바람직하게는, 분리된 핵산 분자가 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 이를 초과하여 동일하다. 예를 들어 서열번호 1의 서열과 같은 참고 서열과 길이가 같거나 그 보다 더 긴 분리된 폴리뉴클레오티드의 경우에 참고 서열의 전체 길이와 비교된다. 분리된 폴리뉴클레오티드가 예를 들어, 서열번호 1의 서열과 같은 참고 서열보다 더 짧은 경우에 같은 길이의 참고 서열의 단편과 비교하게 된다(상동성( 계산이 필요한 루프(loop)는 제외)
또한 명세서에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하는 벡터 및 본 발명의 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포가 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 하기의 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 세포를 배양하여 명세서에 기재된 폴리펩티드를 생산하는 방법을 설명한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 서열번호 2의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 단편을 제공한다. 항체는 모노클론 또는 폴리클론일 수 있다. 부분적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 안티센스 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 DNA), 라이보자임 및 siRNA에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 그러한 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하는데, 즉 비-소세포성 폐암을 진단하거나 상기 질병을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 더 나아가 서열번호 423, 425, 427,429, 431,433, 435,437, 439,441, 443, 445,447, 449,451, 453,455, 457,459, 461,463, 465,467, 469,471, 473,475, 477,479, 481,483, 485,487, 489,491, 493,495, 497,499, 501,503, 505,507, 509,511, 513,515, 517,519, 521,523, 525,527, 529, 또는 531의 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 뉴클레오티드 서열을 가지고 있는 폴리뉴클레오티드는 NSCLC 세포주의 병터(focus) 형성을 억제하는데 효과적임이 입증되었다.
더 나아가, 본 발명은 서열번호 533,534, 535,536, 537, 538, 539,540, 541,542, 543,544, 545, 546,547, 548,549, 550,551, 또는 552의 뉴클레오티드 서열을 갖는 siRNA를 제공한다. 이러한 뉴클레오티드 서열 중 어떤 것을 갖는 siRNA 모두는 NSCLC 세포주의 세포 생존을 억제하는데 효과적인 것으로 입증되었다.
본 발명은 또한 조성물을 사용하여 비-소세포성 폐암을 치료하거나 억제하는 방법 뿐 아니라 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA 중 어떤 것을 사용하여 비-소세포성 폐암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 더 나아가 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩티드, 이의 기능적 등가물, 또는 이 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-소세포성 폐암 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다. 조성물에 포함된 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 발현되기 위하여 벡터에 삽입될 것이다.
본 발명의 약학적 조성물의 작용 과정은 바람직하게는 암 세포의 성장을 억제하는 것이다. 약학적 조성물은 인간 및 사육 포유류를 포함한 포유류에 적용될 수 있다.
추가로, 본 발명은 상향조절된 NSC 폴리펩티드(예를 들어 NSC807-1448) 또는 면역학적 활성이 있는 이의 단편 또는 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써 항암 면역을 유도하는 방법을 제공한다.
만약 다르게 정의되지 않는다면, 명세서에 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 해당분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 똑같은 의미로 사용된다. 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 재료는 하기와 같다. 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 출원서, 특허 및 다른 참고문헌은 전문이 본 발명에 참고문헌으로 삽입된다. 분쟁시는, 정의를 포함한 본 명세서가 기준이 될 것이다. 이에 덧붙여서, 재료, 방법 및 실시예는 설명하기 위한 것일 뿐 제한하기 위한 것은 아니다.
본 발명의 상기한 요약 및 다음의 상세한 설명은 바람직한 실시예이고 본 발명이나 본 발명의 다른 실시예를 제한하지는 않는 것으로 이해된다.
"a", "an", 및 "the"는 특별한 언급이 없으면 "하나 이상"을 의미한다.
본 발명은 부분적으로 폐암에 걸린 환자의 원 폐암 조직으로부터 폐 세포의 여라가지 유전자 발현 패턴 변화를 발견하는데 기초를 두고 있다. 유전자 발현 수준의 차이는 종합적인 DNA 마이크로어레이(microarray) 분석에 의해 확인되었다.
cDNA 마이크로어레이 분석은 일반적으로 비-소세포성 폐암 환자에게서 과다발현되거나 발현이 감소하는 유전자를 선택하기 위하여 23040 유전자에 대하여 수행되었다. 그들 중 642 개 유전자는 상향 조절되었고 806 개 유전자는 하향 조절되었다.
마이크로어레이 분석에 의하여 동정된 유전자는 더 나아가 치료제 개발 또는 면역 치료를 위한 표적이 되는 후보 유전자를 동정하기 위하여 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 및/또는 siRNA 기술에 의하여 스크리닝 되었다. 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 및 siRNA는 표적 유전자에 상응하는 특이적인 mRNA 가닥에 혼성화하는 짧은 합성된 DNA/RNA 가닥이다(Jansen and Zangemeister-Wittke, Lancet Oncol 3: 672-83 (2002); Brummenlkamp etal., Science 296: 550-3 (2002) ). mRNA에 결합함으로써 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유전자의 활동을 블로킹한(blocking) 결과 표적 유전자가 단백질로 번역되는 것을 막는다(Jansen and Zangemeister-Wittke, Lancet Oncol 3: 672-83 (2002) ). 반대로, siRNA는 세포에 도입되어, 유전되지 않는, 유전자적 현상으로 유전자 기능을 녹아웃시키는 서열-특이적인 이중 가닥 RNA로 표적 유전자의 결손 돌연변이(null mutation)을 재현한다(Brummenlkamp etal., Science 296: 550-3 (2002)). 통합된 비소세포성 폐암의 유전자 발현 데이터베이스 및 상향조절된 유전자의 유전자외적 현상에 의한 녹아웃을 조합한 이러한 접근법은 개인별 맞춤 치료법을 위한 표적 분자의 빠른 규명 및 평가에 있어 강력한 전략을 제공한다. 상기 유전자들은 NSCLC 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 유전자들은 자가분비, 세포 주기/성장 및 신호 전달에 작용하는 단백질 또는 알려지지 않은 기능을 가진 산물을 암호화한다.
명세서에서 동정된 차별적으로 발현되는 유전자는 진단 목적으로 사용될 수 있고 비-소세포성 폐암을 억제하기 위한 유전자 표적 치료제를 개발하는데 이용될 수 있다.
비-소세포성 폐암 환자에서 발현 수준이 변화되는 유전자(즉, 증가하거나 감소하는)는 표 1-3에 요약되었고 명세서에서는 집합적으로 "비-소세포성 폐암-관련 유전자", "NSC 유전자", "NSC 폴리뉴클레오티드" 및 그들에 의하여 암호화된 폴리펩타이는 "NSC 폴리펩티드" 또는 "NSC 단백질"로 언급된다. 다르게 표시되지 않으면, "NSC"는 명세서에 기재된 서열 중 어느 하나를 나타낸다(예를 들어 NSC 1-1448). 상기 유전자들은 이미 알려져있고 데이터베이스 접근 번호(accession number)와 함께 나타낸다.
비-소세포성 폐암의 진단
다양한 NSC 유전자의 발현 수준을 측정함으로써, 대상체에서 비-소세포성 폐암의 발병 또는 비-소세포성 폐암이 발생할 소인을 대상체 유래의 생물학적 시료를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명은 시료에서 하나 이상의 그리고 표 1내지 3에 기재된 모든 NSC 서열의 발현 수준을 측정하는 것에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 전사체는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 검출된다. 알려진 서열의 GenBnk 데이터베이스 엔트리(GenBank database entries)에 의해 제공되는 서열정보에 기초하여, 비-소세포성 폐암-관련 유전자는 당업계 숙련자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 검출하고 측정될 수 있다. 상기 방법에 의해 검출되는 유전자 전사체는 mRNA와 단백질 같은 전사와 번역 산물 모두를 포함한다. 예를 들어, NSC 폴리뉴클레오티드에 해당하는 서열 데이터베이스 엔트리 내의 서열은 예를 들면, 노던 블럿 혼성화 분석과 같이 NSC mRNA를 검출하기 위한 탐침을 제작하는데 사용될 수 있다. 탐침이 대상체의 생물학적 시료에 혼성화는 DNA 어레이로 실시될 수 있다. 어레이의 사용은 NSC 유전자 다수의 발현 수준을 검출하는데 바람직하다. 다른 예로 서열은 특이적으로 NSC 폴리뉴클레오티드를 증폭시키기 위한(예를 들어, 역-전사 기반 중합효소 연쇄 반응(reverse-transcription based polymerase chain reaction, RT-PCR)과 같은 증폭-기반 검출 방법) 프라이머를 제작하는데도 사용될 수 있다. 더 나아가, NSC 유전자의 발현 수준은 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 활성 또는 양으로 분석될 수 있다. 단백질의 양을 측정하는 방법은 면역분석(immunoassay)법을 포함한다.
어떠한 생물학적 물질도 NSC 유전자가 시료에서 검출될 수 있고 시험 세포 집단(즉 대상체로부터 수득된 조직 시료)을 포함하는 한, 발현 수준을 측정하기 위한 생물학적 시료로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 생물학적 시료는 폐 세포(폐로부터 수득된 세포)를 포함한다. 유전자 발현 또한 혈액, 혈청 또는 객담 같은 다른 체액에서 측정될 수 있다. 더 나아가 시험 시료는 조직에서 순수분리된 세포일 수 있다.
상기 방법에 따라 비-소세포성 폐암으로 진단된 대상체는 바람직하게는 포유류이고 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 및 소를 포함한다.
생물학적 시료에서 하나 이상의 NSC 유전자의 발현 수준은 참고 시료의 동일한 유전자 발현 수준과 비교될 수 있다. 참고 시료는 공지의 변수, 즉 암 또는 비-암으로 알려진 하나 이상의 세포를 포함한다. 참고 시료는 시험 시료와 유사한 조직 타입으로부터 수득되어야 한다.
대안적으로, 대조군 발현 수준은 분석된 변수 또는 조건이 알려진 세포로부터 유도된 분자 정보 데이터베이스에 따라 측정될 수 있다.
생물학적 시료에서 유전자 발현 패턴이 NSCLC의 존재를 나타내는지 여부는 참고 세포 집단의 조성에 달려있다. 예를 들어, 참고 세포 집단이 비-암 세포로 구성되어 있을 때, 참고와 유사한 유전자 발현은 시험 생물학적 시료가 비-암이라는 것을 나타낸다. 반면에, 참고 세포 집단이 암세포로 구성되어 있을 때, 생물학적 시료가 참고와 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다는 것은 시험 생물학적 시료가 암세포를 포함하고 있다는 것을 나타낸다.
시험 생물학적 시료는 다수의 참고 시료와 비교될 수 있다. 다수의 참고 시료 각각은 알려진 변수가 다르다. 그러므로, 시험 시료는 예를 들어, 비-소세소성 폐암 세포를 포함한다고 알려진 참고 시료 및 동시에 비-비-소세포성 폐암 세포(non-non-small cell lung cancer cell, 예를 들어, 정상 세포)를 포함한다고 알려진 제 2의 참고시료와 비교될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 비-소세포성 폐암-관련 유전자(예를 들어, NSC1-1448)의 발현은 시료에서 측정되고 동일한 유전자의 정상 대조군 수준과 비교된다. "정상 대조군 수준"이라는 구문은 비-소세포성 폐암에 걸리지 않은 집단의 생물학적 시료에서 전형적으로 발견되는 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 프로파일을 말한다. 대조군과 시험 대상체의 생물학적 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준은 동시에 측정되거나, 정상 대조군 수준은 대조군으로부터 이전에 수집된 시료의 유전자 발현 수준을 분석하여 수득된 결과에 따른 통계적 방법에 의하여 측정될 수 있을 것이다. 환자의 조직시료로부터 유도된 생물학적 시료의 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준의 증가 또는 감소는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸리거나 걸릴 위험이 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 정상 대조군 수준과 비교할 때, 시험 생물학적 시료에서 NSC 807-1448의 발현 수준의 증가는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다는 것을 나타낸다. 반면에, 정상 대조군 수준과 비교할 때, NSC 1-806의 발현 수준의 감소는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있다는 것을 나타낸다.
시험 생물학적 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준은 발현 수준이 참고의 것과 비교하여 1.0, 1.5, 2.0, 5.0 배 이상 상이할 때, 변경된 것으로 볼 수 있다. 대안적으로, 시험 생물학적 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준은 발현 수준이 참고의 것과 적어도 50%, 60%, 80%, 90% 또는 그 이상 증가하거나 감소하였을 때, 변경된 것으로 볼 수 있다.
시험 시료와 참고 시료 간의 유전자 발현의 상이함은 대조군 예를 들어, 발현량이 크게 변화하지 않는 유전자(housekeeping gene)의 시료는 표준화될 수 있다. 예를 들어, 대조 폴리뉴클레오티드는 발현 수준이 암과 암이 아닌 세포간이 상이하지 않은 것으로 알려진 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 시험 및 참고 시료에서 대조군 폴리뉴클레오티드의 발현 수준은 NSC 유전자로 검출된 발현 수준을 표준화하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용될 대조 유전자는 β-액틴(β-actin), 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 및 리보솜 단백질 PI 를 포함한다.
명세서에서 동정된 차별적으로 발현되는 NSC 유전자는 또한 비-소세포성 폐암의 치료 과정을 모니터하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법에서, 시험 생물학적 시료는 비-소세포성 폐암 치료를 실시한 대상체로부터 제공된다. 만약 원한다면 다수의 시험 생물학적 시료가 치료전, 동안, 후 등 다양한 시간에 대상체로부터 수득될 수 있다. 시료에서 하나 이상의 NSC 유전자의 발현은 치료받지 않은 비-소세포성 폐암의 참고 시료와 측정되고 비교된다.
참고 시료가 비-소세포성 폐암 세포를 포함하고 있지 않다면, 시험 생물학적 시료와 참고 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준의 유사성은 치료의 효능을 나타낸다. 그러나, 시험과 참고 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준의 차이는 그다지 좋지않은 임상 결과나 예후를 나타낸다.
"효과있는(efficaciouss)"라는 단어는 치료가 대상체에서 병리학적으로 상향-조절되는 유전자 (NSC 807-1448)의 발현을 감소시시키거나, 병리학적으로 하향-조절되는 유전자(NSC 1-806)의 발현을 증가시키거나 비-소세포성 폐암의 크기, 퍼짐(prevalence) 또는 전이 가능성을 감소시키는 것을 의미한다. 치료가 예방적으로 적용될 때, "효과있는"은 치료가 비-소세포성 폐암의 진행을 늦추거나 예방하거나 또는 비-소세포성 폐암의 임상 증상을 경감시키는 것을 의미한다. 비-소세포성 폐암의 평가는 표준 임상 프로토콜을 이용하여 이루어질 수 있다. 더 나아가 치료의 효능은 비-소세포성 폐암을 진단하거나 치료하는 알려진 방법과 결합하여 측정된다. 예를 들어 비-소세포성 폐암은 조직병리학적으로 진단되거나 만성 기침, 목이 쉬는것, 기침으로 피가나오는 것, 체중감소, 식욕감소. 짧은 호흡, 천명(wheezing), 기관지염(ronchitis) 또는 폐렴의 반복적 발생 및 흉통과 같은 이상 증상을을 알아냄으로써 진단된다.
더욱이, 비-소세포성 폐암을 진단하는 본 발명의 방법은 또한 환자에게서 수득된 생물학적 시료에서 NSC 유전자의 발현 수준을 비교함으로써, 암 환자의 예후를 진단하는데 이용될 수 있다. 대안적으로, 생물학적 시료에서 유전자의 발현 수준은 환자의 예후를 평가하기 위하여 질병 단계의 스펙트럼에 걸쳐 측정될 수 있다.
정상 대조군 수준과 비교하여 NSC807-1448의 발현 수준의 증가 또는 NSC 1-806의 발현 수준의 감소는 좋지 않은 예후임을 나타낸다. 정상 대조군 수준과 비교하여 NSC807-1448 또는 NSC 1-806의 발현 수준의 동일성은 환자의 보다 좋은 예후를 나타낸다. 바람직하게, 대상체의 예후는 NSC 807-1448 또는 NSC 1-806의 발현 프로파일을 비교함으로써 평가될 수 있다.
발현 프로파일
본 발명은 또한 두 가지 이상의 NSC 1-1448 유전자 발현 패턴을 포함하는 비-소세포성 폐암 참고 발현 프로파일을 제공한다. 프로파일 발현은 비-소세포성 폐암 진단 또는 상기 질병이 발병할 소질 진단, 치료경과 모니터링 및 질병에 걸린 환자의 예후를 평가를 위한 대조군으로 사용된다.
비-소세포성 폐암 관련 유전자 발현을 억제하거나 증진시키는 화합물 동정
바-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현이나 활성을 억제하는 화합물은 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 발현하는 세포를 시험 화합물과 접촉하고 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준 또는 활성을 측정함으로써 동정된다. 정상 대조군 수준과 비교할 때, 발현 감소는 화합물이 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 억제제임을 나타낸다. 시험 세포에서 발현되는 비-소세포성 폐암-관련 유전자가 상향-조절되는 유전자일 때, 상기 방법에 따라 동정된 화합물은 비-소세포성 폐암을 억제하는데 유용하다.
대안적으로, 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현이나 활성을 증진시키는 화합물은 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 발현하는 시험 세포 집단을 시험 화합물과 접촉시키고 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준 또는 활성을 측정함으로써 유전자의 증진제로 확인될 수 있다. 시험 세포에서 발현되는 비-소세포성 폐암 세포-관련 유전자는 하향-조절되는 유전자일 때, 본 방법에 따라 확인된 화합물은 비-소세포성 폐암을 억제하는데 유용하다고 여겨진다.
시험 세포는 세포의 집단일 수 있고 세포가 표적 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 발현하는 한 어떠한 세포도 포함한다. 예를 들어, 시험 세포는 폐 조직으로부터 유래한 세포, 혈액, 혈청 또는 객담과 같은 상피 세포을 포함한다. 시험 세포는 비-소세포성 폐암 세포로부터 유도된 불멸화된 세포일 수 있다. 대안적으로, 시험 세포는 NSC 유전자로 트랜스펙션된 세포이거나 리포터 유전자와 작동되도록 연결되어 있는 NSC 유전자의 조절 서열(예를 들어 프로모터)로 트랜스펙션된 세포일 수 있다.
화합물 스크리닝
NSC 유전자를 사용하여, 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 유전자의 전사 조절 부위, 유전자의 발현이나 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 활성을 바꾸는 화합물이 스크리닝될 수 있다. 그러한 화합물은 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는 약제로 사용될 것으로 기대된다.
그러므로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 스크리닝 방법의 실시예는 다음의 단계를 포함한다: (a) 시험 화합물을 본 발명의 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) 본 발명의 폴리펩티드와 시험 화합물 사이의 결합 활성을 검출하는 단계; 및 (c) 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 선택하는 단계.
스크리닝에 사용되는 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드거나 자연에서 유래한 단백질 또는 이의 펩티드의 일부분일 수 있다. 시험 화합물과 접촉될 폴리펩티드는 예를 들어 순수분리된 폴리펩티드, 용해성 단백질, 담체와 결합된 형태 또는 다른 폴리펩티드와 융합된 융합 단백질에 결합된 형태일 수 있다.
NSC 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로 당업계 숙련자에게잘 알려져 있는 많은 방법들이 사용될 수 있다. 그러한 스크리닝은 예를 들어 면역침강 방법, 구체적으로 다음의 방법으로 수행될 수 있다. 유전자를 외부 유전자로서 pSV2neo, pcDNAI, pcDNA3.1,pCAGGS 및 pCD8와 같은 발현벡터에 삽입함으로써 동물세포 등에서 NSC 폴리펩티드의 어떤 것을 암호화하는 유전자가 발현된다. 발현에 사용될 프로모터는 일반적으로 사용되는 어떠한 프로모터도 가능하고 예를 들어 SV40 초기 프로모터(Rigby in Williamson(ed.), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141 (1982) ), EF-a 프로모터(Kim etal., Gene 91: 217-23 (1990) ), CAG 프로모터(Niwa etal., Gene108 : 193-200 (1991)), RSV LTR 프로모터(Cullen, Methods in Enzymology 152: 684-704 (1987) ), SRa 프로모터(Takebe et al. , Mol Cell Biol 8: 466(1988)), CMV 즉시 초기(immediate early) 프로모터(Seed and Aruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987) ), SV40 후기 프로모터(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 : 385-94 (1982) ), 아데노바이러스 후기 프로모터(Kaufman et al. , Mol Cell Biol 9: 946 (1989) ), HSV TK 프로모터 등을 포함할 수 있다. 유전자를 동물세포로 삽입하여 외부 우전자를 발현시키는 것은 어떠한 방법으로도 수행될 수 있다. 예를 들어 일렉트로포레이션 방법(electroporation method, Chu etal., Nucleic Acids Res 15: 1311-26 (1987)), 칼슘 포스페이트 방법(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987) ), DEAE 덱스트란 방법(Lopata etal., Nucleic Acids Res 12: 5707-17 (1984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-3 (1985) ), 리포펙틴 방법(Derijard, B Cell 7: 1025-37 (1994); Lamb et al. , Nature Genetics 5: 22-30 (1993): Rabindran etal., Science 259: 230-4 (1993) ) 등이다. 특이성이 알려진 모노클론 항체의 에피토프를 폴리펩티드의 N-또는 C-말단에 도입하여 모노클론항체의 인식부위(에피토프)를 포함하는 융합단백질로서 또한 발현될 수 있다. 상업적으로 가능한 에피톱-항체 시스템이 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995) ). 융합 단백질을 발현하는 벡터 예를 들어, 갈락토시다제, 말토오즈 결합 단백질, 글루타치온 S-전이효소, 녹색 형광 단백질(florescence protein, GFP) 등은 다수의 클로닝 사이트 사용에 의해 상업적으로 가능하다.
NSC 폴리펩티드의 특성을 바꾸지 않기 위해 단지 몇개에서 다수의 아미노산으로 이루어진 작은 에피톱을 도입함으로써 준비되는 융합 단백질이 보고되었다. 폴리히스티딘(His-tag), 인플루엔자 집합체 HA, 인간 c-myc, FLAG, 소수포 구내염 바이러스 당단백질(Vesicular stomatitis virus glycoprotein, VSV-GP), T7 유전자 10 단백질(T7-표지), 인간 단순 헤르페스 바이러스 당당백질(simple herpes virus glycoprotein, HSV-tag), E-tag(단일클론 파지의 에피톱) 등의 에피톱과 그들을 인식하는 단일 항체가 NSC 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 에피톱-항체 시스템으로 사용될 수 있다(Experimental Medicine 13: 85-90 (1995)).
면역침강법(immunoprecipitation)에서, 면역 복합체는 이러한 항체들을 적합한 계면 활성제(detergent)를 사용하여 준비한 세포 파쇄액에 첨가함으로써 형성된다. 면역 복합체는 NSC 폴리펩티드, 폴리펩티드와 결합하는 능력을 갖는 폴리펩티드 및 항체로 이루어져 있다. 면역침강법은 또한 상기 에피톱에 대한 항체를 사용하는 것 이외에 NSC 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 수행될 수 있고 항체는 상기와 같이 준비될 수 있다.
항체가 마우스 IgG 항체이면 면역 복합체는 예를 들어 단백질 A 세파로즈(sepharose) 또는 단백질 G 세파로즈(sepharose)와 침강될 수 있다. 만약 NSC 폴리펩티드가 GST와 같은 에피톱과 융합 단백질로 준비된다면 면역 복합체는 글루타치온-세파로즈 4B와 같이 이러한 에피톱에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 NSC 폴리펩티드에 대한 항체 사용에서와 같은 방법으로 형성될 수 있다.
면역침강법은 다음의 또한 예를 들어 문헌의 방법대로 수행될 수 있다(Harlow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)).
SDS-PAGE 는 일반적으로 면역침강된 단백질 분석을 위해 사용되고 결합된 단백질은 적합한 농도의 젤을 사용하여 분자량에 의해 분석할 수 있다. NSC 폴리펩티드에 결합된 단백질이 쿠마시(Coomassie) 염색 또는 은(silver) 염색과 같은 일반적인 염색 방법으로 검출되기 위해 단백질에 대한 검출 민감성이 방사성 동위원소인 35S-메치오닌(methionine) 또는 35S-시스테인(cystein)을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 향상될 수 있다. 표적 단백질은 단백질의 분자량이 밝혀지면 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 직접 순수분리될수 있고 그 서열이 결정될 수 있다.
폴리펩티드를 사용하여 NSC 폴리펩티드의 어떤 것에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 방법으로 예를 들어 웨스트-웨스턴 블랏 분석(Skolnik etal., Cell 65: 83-90 (1991) )이 사용될 수 있다. 구체적으로 NSC 폴리펩티드에 결합하는 단백질은 세포, 조직, 기관(예를 들어, 고환 및 전립선과 같은 조직) 또는 파지 벡터(예를 들어 ZAP)를 사용하여 NSC 폴리펩티드에 결합하는 단백질을 발현할 것으로 기대되는 배양세포(예를 들어 LNCaP, PC3, DU145)로부터 cDNA 라이브러리를 준비하고 LB-아가로즈에서 단백질을 발현시키고 , 필터에서 발현된 단백질을 고정하고, 순수분리되고 표지된 NSC 폴리펩티드를 상기 필터와 반응시키고 표지에 따라 NSC 폴리펩티드에 결합된 단백질을 발현하는 플라크를 검출함으로써 수득될 수 있다. NSC 폴리펩티드는 바이오틴 및 아비딘간의 결합을 이용하거나 NSC 폴리펩티드, 펩티드 또는 NSC 폴리펩티드에 융합된 폴리펩티드(예를 들어 GST)에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 표지된 수 있다. 방사성 동위원소나 형광을 사용하는 방법 또한 이용될 수 있다.
또는, 본 발명의 스크리닝 방법의 다른 실시예에서 세포를 사용하는 투-하이브리드 시스템(two-hybrid system, "MATCHMAKER Two-Hybridsystem","Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybrid system" (Clontech);"HybriZAP Two-Hybrid Vector System" (Stratagene); the references"Dalton and Treisman, Cell 68: 597-612 (1992)", "Fields and Sternglanz, Trends Genet 10: 286-92 (1994)")이 사용될 수 있다.
투-하이브리드 시스템에서 , NSC 폴리펩티드는 SRF-결합 부위 또는 GAL4-결합 부위에 융합되어 효모세포에서 발현된다.
cDNA 라이브러리는 상기 NSC 폴리펩티드에 결합할 단백질을 발현할 것으로 기대되는 세포에서 제조하여, 상기 라이브러리가 발현시 VP16 또는 GAL4 전사활성 부위에 융합되도록 한다. 그리고나서 cDNA 라이브러리는 상기 이스트세포에 도입되고 라이브러리로부터 유도된 cDNA는 양성 클론으로 검출된 클론으로부터 분리된다(본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 단백질이 효모 세포에서 발현될 때, 둘의 결합이 리포터 유전자를 활성화시키면 양성 클론이 검출된다). cDNA에 의해 암호화된 단백질은 상기 E. coli에서 분리된 cDNA를 도입하고 단백질을 발현시킴으로써 준비될 수 있다.
리포터 유전자로는 예를 들어, Ade2 유전자, lacZ 유전자, CAT 유전자, 루시퍼라제(luciferase) 유전자 등이 HIS3 유전자와 더불어 사용될 수 있다.
NSC 폴리펩티드에 결합하는 화합물은 또한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, NSC 폴리펩티드는 친화도 컬럼의 캐리어(carrier)에 고정될 수 있고 NSC 폴리펩티드에 결합할 수 있는 단백질을 포함하는 시험 화합물이 컬럼에 로딩할 수 있다. 명세서에서 시험 화합물은 예를 들어, 세포 추출물, 세포 파쇄액 등 시험 화합물을 로딩한 후에, 컬럼은 세척되고 NSC 폴리펩티드에 결합된 화합물이 준비될 수 있다.
시험 화합물이 단백질이면, 수득된 단백질의 아미노산 서열을 분석하고 올리고 DNA를 서열에 따라 합성하고 cDNA 라이브러리를 상기 올리고 DNA를 단백질을 암호화하는 DNA를 수득하기 위한 탐침으로 사용하여 스크리닝한다.
표면 플라즈몬 공명 현상(surface plasmon resonance phenomenon)을 사용한 바이오센서는 본 발명에서 결합된 화합물을 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 그러한 바이오센서가 사용될 때, NSC 폴리펩티드와 시험 화합물 간의 상호작용은 소량의 폴리펩티드만을 사용하여 표지 없이 표면 플라즈몬 공명 신호로 실시간(real-time)으로 관찰될 수 있다(예를 들어, BIAcore, Pharmacia).
그러므로 NSC 폴리펩티드와 시험 화합물 간의 결합을 BIAcore와 같은 바이오센서를 이용하여 측정하는 것이 가능하다.
고정된 NSC 폴리펩티드가 합성 화학 화합물, 천연물 뱅크(natural substance bank) 또는 랜덤 파지 펩티드 디스플레이 라이브러리(random phage peptide display library)에 노출될 때 분자들을 스크리닝하는 방법과 단백질이 아닌 NSC 단백질에 결합하는 화학적 화합물(작용제와 길항제를 포함하여)을 분리하기 위해 조합 화학 기술(combinatorial chemistry technique)을 기초로 한 고수율(high-throughput)을 사용하여 스크리닝하는 방법(Wrighton et al. , Science 273: 458-64 (1996); Verdine, Nature 384: 11-13(1996) ; Hogan, Nature 384: 17-9 (1996))은 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다.
또는, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 NSC 폴리펩티드를 사용하여 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다: (a) 시험 화합물을 NSC 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; (b) 단계 (a)의 NSC 폴리펩티드의 생물학적 활성을 검출하는 단계; 및 (c) 시험 화합물의 부재하에 검출된 생물학적 활성과 비교하여 NSC 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하거나 증진시키는 화합물을 선택하는 단계.
NSC 1-1448의 유전자 중 어느 것에 의해 암호화되는 단백질이 비-소세포성 폐암 세포의 증식을 증진시키는 활성이 있기 때문에 이러한 단백질 중 하나의 활성을 증진시키거나 억제하는 화합물은 index로 이러한 활성을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
어떠한 폴리펩티드든 그들이 NSC 단백질의 생물학적 활성을 포함하는 한 스크리닝에 사용될 수 있다. 그러한 생물학적 활성은 NSC 807-1448에 의해 암호화되는 단백질의 세포-증식 활성을 포함한다. 예를 들어, NSC 807-1448에 의해 암호화되는 인간 단백질이 사용될 수 있고 이러한 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드 또한 사용될 수 있다. 그러한 폴리펩티드는 세포에 의해 내생적(endogenously)으로 또는 외생적으로(exogenously) 발현될 수 있다.
이러한 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 NSC 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제 후보이다. "작용제(agonist)"라는 용어는 거기에 결합함으로써 NSC 폴리펩티드의 기능을 활성화시키는 분자를 말한다. "길항제(antagonist)"라는 용어는 거기에 결합함으로써 NSC 폴리펩티드의 작용을 억제하는 분자를 말한다. 더욱이, 이러한 스크리닝에 의해 분리된 화합물은 생체내에서 분자들(DNA와 단백질을 포함하여)과 NSC 폴리펩티드의 상호작용을 억제하는 화합물 후보이다.
본 발명의 방법에서 검출되는 생물학적 활성이 세포증식일 때, 예를 들어 NSC 폴리펩티드(예를 들어 NSC 807-1448)를 발현하는 세포를 준비하고 시험 화합물의 존재하에 세포를 배양하고 세포 증식의 속도, 세포 주기 및 콜로니 형성능 등을 측정함으로써 검출될 수 있다.
상기 언급한대로, NSC 유전자의 발현 수준을 조절하여 비-소세포성 폐암의 시작과 진행을 조절할 수 있다. 그러므로 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 화합물은 하나 이상의 NSC 유전자의 발현 수준을 인덱스로 사용하는 스크리닝을 통해서 확인될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 스크리닝은 예를 들어 다음의 단계를 포함할 수 있다: a) 시험 화합물을 하나 이상의 NSC 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계; 및 b) 시험 화합물의 부재하에 발현 수준과 비교하여, NSC 807-1448의 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 화합물 또는 NSC 1-806의 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시키는 화합물을 선택하는 단계.
NSC 유전자 중 하나 이상을 발현하는 세포는 예를 들어 비-소세포성 폐암 세포로부터 제작된 세포주; 본 발명의 상기 스크리닝에 사용될 수 있는 세포(예를 들어, A549, NCI-H226, NCI-H522, LC319). 발현 수준은 당업계 숙련자에게 잘 알려진 방법으로 측정될 수 있다. 스크리닝 방법에서, NSC 유전자 중 하나 이상의 발현 수준을 감소시키는 화합물은 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 후보 물질로 선택될 수 있다.
또는, 본 발명의 스크리닝 방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다: a) 시험 화합물을 나 이상의 마커 유전자(하나 이상의 마커 유전자는 NSC 1-1448인)의 전사 조절 부위 및 전사 조절 부위의 조절하에 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계, b) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및 c) 상기 마커가 상향 조절되는 유전자(예를 들어 NSC 807-1448)일 때 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 감소시키는 화합물을 선택하거나 상기 마커 유전자가 하향 조절되는 유전자(예를 들어 NSC 1-806)일 때 발현 수준을 증가시키는 화합물을 선택하는 단계.
적합한 리포터 유전자 및 숙주 세포는 당업계에 잘 알려져 있다. 스크리닝에 필요한 리포터 컨스트럭트는 마커 유전자의 전사 조절 부위를 사용하여 준비될 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 부위가 당업계의 숙련자에게 잘 알려져 있을때, 리포터 컨스트럭트는 상기 서열 정보를 이용하여 준비될 수 있다. 마커 유전자의 전사 조절 부위가 확인되지 않았을 때, 전사 조절 부위를 포함하고 잇는 뉴클레오티드 단편은 마커 유전자의 뉴클레오티드 서열 정보에 기초한 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다.
어떠한 시험 화합물이라도 예를 들어 세포 추출물, 세포 배양 상등액, 미생물 발효 산물, 해양 생물의 추출물, 식물 추출물, 순수분리되거나 분리되지 않은 단백질, 펩티드, 비-펩티드 화합물, 합성 마이크로분자 화합물 및 천연 화합물이 본 발명의 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 시험 화합물은 또한 당업계에 알려진 조합 라이브러리에서 다양한 접근 방법 다음을 포함하는 중 어떤 것을 이용해서도 수득될 수 있다 (1) 생물학적 라이브러리, (2) 공간적으로 불러낼 수 있는 평행(spatially addressable parallel) 고형상 또는 용액상 라이브러리 (3) 디컨볼루션(deconvolution)을 필요로하는 합성 라이브러리 방법, (4) "하나의 비드(bead) 하나의 화합물" 라이브러리 방법 및 (5) 친화도 크로마토그래피 선택을 이용한 합성 라이브러리 방법
다른 네가지 방법이 펩티드, 비-펩티드 올리고머 또는 화합물의 소분자 라이브러리에 가능하지만 친화도 크로마토그래피 선택을 이용한 생물학적 라이브러리 방법은 펩티드 라이브러리에 한정되어 있다(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145). 분자 라이브러리 합성 방법의 예는 당업계에서 발견될 수 있다(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37:2678 ; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233). 화합물의 라이브러리는 용액(see Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412) 또는 비드(Lam (1991) Nature354 : 82), 칩(Fodor (1993) Nature 364: 555), 박테리아(US Pat. No. 5,223, 409), 포자(US Pat. No. 5,571,698 ; 5,403, 484, and 5,223, 409), plasmids (Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865) 또는 파지(Scott and Smith (1990) Science 249: 386; Delvin (1990) Science 249: 404; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301; US Pat. Application 2002103360)로 제시될 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 세포 또는 단백질에 노출된 시험 화합물은 단일 화합물 또는 화합물의 혼합물일 수 잇다. 화합물의 조합이 본 발명의 스크리닝에 사용될 때, 화합물은 순차적으로 또는 동시에 접촉될 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분리된 화합물은 예를 들어 비-소세포성 폐암 같은 세포 증식 질환을 치료하거나 예방하기 위한 NSC 폴리펩티드의 활성을 증진시키거나 억제하는 약물의 후보이다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득된 화합물의 구조의 일부분이 추가, 결실 및/또는 교환(replacement)에 의해 전환된 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득환 화합물에 포함된다. 과소 발현되는 유전자(under-expressed genes예를 들어 NSC1-806)를 자극하는데 또는 과다 발현되는 유전자(under-expressed genes, 예를 들어 NSC1-806)를 억제하는데 효과가 있는 화합물은 임상적 잇점이 있고 더 나아가 동물 모델이나 시험 대상체의 암 세포 성장을 예방하는 능력을 시험할 수 있다고 생각된다.
특정 개인에 적합한 비-소세포성 폐암 치료를 위한 치료제를 선택하기
개인의 유전적 구성의 차이는 다양한 약물을 대사하는 상대적인 능력의 차이를 일으킨다. 대상체에서 항-비-소세포성 폐암 작용제로 대사되는 화합물은 암 대상체의 세포에서 암인 상태의 특징으로부터 암이 아닌 상태의 유전자 발현 특징으로 유전자 발현 패턴의 변화를 유도함으로써 스스로 입증될 수 있다.
따라서, 명세서에 기재된 차별적으로 발현되는 NSC 유전자는 선택된 대상체로부터 유도된 시험세포(또는 시험세포 집단)에서 후보 화합물을 시험함으로써 대상체에 특이적이로 적합한 비-소세포성 폐암의 치료제 또는 예방 억제제로 추정되는 물질의 선택을 가능하게 한다.
항-비-소세포성 폐암 작용제를 알아내기 위해서 특이적인 대상체에 대해 대상체 유래의 시험 세포 또는 시험 집단이 치료제에 노출되거나 하나 이상의 NSC 1-1448 유전자의 발현이 측정되는 것이 적합하다.
시험 세포 또는 시험세포 집단은 비-소세포성 폐암 관련 유전자를 발현하는 비-소세포성 폐암 세포를 포함한다. 바람직하게는 시험 세포 또는 시험 세포 집단은 epithelial cell을 포함한다. 예를 들어, 시험 세포 또는 시험 세포 집단은 후보 작용제의 존재하에 정온배치되고 시험 세포나 시험 세포 집단의 유전자 발현 패턴은 측정되고 하나 이상의 참고 프로파일, 예를 들어 비-소세포성 폐암 참고 발현 프로파일이나 비-비-소세포성 폐암 참고 프로파일과 비교된다.
시험세포 또는 시험 세포 집단에서 비-소세포성 폐암을 포함한 세포 집단과 비교하여 하나 이상의 NSC807-1448의 발현 감소나 하나 이상의 NSC 1-806의 발현 증가는 작용제가 치료효과가 있다는 것을 나타낸다.
시험 작용제는 어떠한 화합물이나 조성물일 수 있다. 예를 들어, 시험 작용제는 면역 조절(immunomodulatory) 작용제일 수 있다.
키트
본 발명은 또한 NSC-검출 시약, 예를 들어 하나 이상의 NSC 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하거나 식별하는 핵산을 포함하는 키트를 제공한다.
하나 이상의 NSC 폴리뉴클레오티드에 결합하거나 식별하는 핵산은 NSC 폴리뉴클레오티드의 일부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 항체에 의하여 예시된다. 시약은 키트의 형태로 함께 포장된다. 핵산 또는 항체(고형 매트릭스에 결합하거나 매트릭스에 그들을 결합시키기 위한 시약을 개별적으로 포장한)와 같은 시약, 대조 시약(양성 및/또는 음성) 및/또는 핵산 또는 항체를 검출하기 위한 수단은 바람직하게는 개별 용기에 포장된다. 분석을 수행하기 위한 지침(예를 들어 글로 씌여지거나, 테이프e, VCR, CD-ROM, 등등)이 키트에 포함될 수 있다. 키트의 분석 형태는 당업계에 알려진 노던 혼성화 또는 샌드위치 ELISA일 수 있다.
예를 들어, NSC 검출 시약은 하나 이상의 NSC 검출 부위를 만들기 위해 다공성 스트립(porous strip)과 같은 고형 매트릭스에 고정화되었다. 다공성 스트립의 측정 또는 검출 시약은 각각의 검출부위가 NSC 검출 시약을 포함하는 다수의 검출 부위를 포함할 수 있다. 시험 스트립은 또한 음성 및/또한 양성 대조군을 위한 부위를 포함할 수 있다. 또는, 대조 부위는 시험 스트립과 별개의 스트립에 위치한다. 선택적으로, 서로 다른 검출 부위는 서로 다른 양의 고형 시약, 즉 첫번째 검출 부위에 더 많은 양 그리고 수반하는 부위에 부위에 더 적은 양의 고형 시약을 포함할 수 있다. 시험 생물학적 시료의 첨가, 검출가능한 신호를 나타내는 부위의 수는 시료에 있는 NSC 양의 정량적인 표시를 제공한다. 검출 부위는 어떠한 알맞게 검출가능한 모양으로 배열될 수 있고 전형적으로 시험 스트립의 폭에 해당하는 막대 또는 점 모양이다.
또는, 키트는 하나 이상의 NSC 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 기판 어레이를 포함한다. 어레이의 핵산은 NSC 1-1448에 의해 나타난 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 특이적으로 식별한다. NSC 1-1448에 의해 제시된 유전자의 2,3, 4, 5,6, 7,8, 9,10, 15,20, 25,40 또는 50 또는 그 이상은 어레이 시험 스트립이나 칩에 결합하는 수준에 의해 식별된다. 기판(substrate) 어레이는 예를 들어 고형 substrate, 예를 들어 미국 발명 5,744, 305에 기재된 "칩"일 수 있다.
어레이와 다원성(plurality)
본 발명은 또한 하나 이상의 NSC 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 기판(substrate) 어레이를 포함한다. 어레이 상의 핵산은 NSC 1-1448에 의해 제시된 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 대응한다. NSC 1-1448에 의해 제시되는 2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 15,20, 25,40 또는 50 또는 그 이상의 유전자의 발현 수준은 어레이에 결합하는 핵산을 검출함으로써 식별된다.
본 발명은 또한 핵산의 분리된 다수(즉, 두 가지 이상의 핵산 혼합물)를 포함한다. 핵산은 액상 또는 고형상, 예를 들어 니트로셀룰로스 막과 같은 고형 지지대에 고정된 고형상이다. plurality는 NSC 1-1448에 의해 제시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 추가적인 실시예에 따르면 plurality는 NSC 1-1448에 의해 제시된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 40 또는 50 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
칩
DNA 칩은 다수의 유전자의 발현 수준을 동시에 비교하는 편리한 장치이다. DNA 칩-기반의 발현 프로파일은 예를 들어 "마이크로어레이 바이오칩 기술(Microarray Biochip Technology)" (Mark Schena, Eaton Publishing, 2000)등에 기재된 방법으로 수행될 수 있다. DNA 칩은 다수의 유전자를 검출하기 위한 고정된 고-밀도 탐침을 포함한다. 그러므로, 많은 유전자의 발현 수준은 한 회의 분석으로 동시에 측정될 수 있다. 즉, 표본(specimen)의 발현 프로파일은 DNA 칩으로 측정될 수 있다. 본 발명의 DNA 칩-기반의 방법은 다음의 단계를 포함한다: (1) 마커 유전자에 해당하는 aRNA 또는 cDNA를 합성하는 단계; (2) aRNA 또는 cDNA를 마커 유전자와 혼성화시키는 단계; 및 (3) 탐침에 혼성화하는 RNA 또는 cDNA를 측정하고 이의 mRNA 양을 정량하는 단계.
aRNA는 주형 cDNA로부터 RNA 중합효소로 전사된 RNA를 일컫는다. DNA 칩-기반 발현 프로파일링을 위하 aRNA 전사 키트 상업적으로 구입 가능하다. 그러한 키트로 aRNA는 T7 프로모터가 붙은 cDNA를 주형으로부터 T7 RNA 중합효소를 이용하여 합성될 수 있다. 반면에, 랜덤 프라이머를 사용한 PCR에 의해 cDNA는 mRNA로부터 합성된 cDNA를 주형으로 증폭될 수 있다.
또는, DNA 칩은 탐칩을 포함하는데 이는 칩 상에 스팟팅되어있어 본 발명의 마커 유전자를 검출할 수 있다. DNA 칩에 스팟팅하는 마커 유전자의 수에는 제한이 없다. 예를 들어, 5% 또는 그 이상, 바람직하게는 20% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 70% 또는 그 이상의 본 발명의 마커 유전자를 선택할 수 있다. 마커 유전자 뿐만 아니라 어떤 다른 유전자라도 DNA 칩에 스팟팅될 수 있다. 예를 들어, 발현 수준이 거의 변경되지 않은 유전자에 대한 탐침도 DNA 칩에 스팟팅될 수 있다. 그러한 유전자는 분석결과가 다수의 칩간 비교 또는 서로다른 분석간 비교를 위해 사용될 때, 분석 결과를 표준화하는데 사용될 수 있다.
탐침은 선택된 각각의 마커 유전자에 대해 디자인되고 DNA 칩 상에 스팟팅된다.
그러한 탐침은 예를 들어 5-50 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
DNA 칩상에 그러한 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 더 긴 DNA는 PCR을 이용하거나 화학적으로 합성될 수 있다. PCR 등에 의해 합성된 긴 DNA를 유리 슬라이드에 스팟팅하는 방법 또한 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 상기 방법에 의해 수득된 DNA 칩은 본 발명에 따라 비-소세포성 폐암을 진단하는데 사용될 수 있다.
준비된 DNA 칩은 aRNA와 접촉되고 탐침과 aRNA 간에 혼성화를 검출한다. aRNA는 이전에 형광 염료로 표지될 수 잇다. Cy3 (red) 및 Cy5 (green)과 같은 형광 염료는 aRNA를 표지하는데 사용될 수 있다. 대상체 및 대조군 유래의 aRNA는 서로 다른 형광 염료로 각각 표지된다. 둘 사이의 발현 수준의 차이는 신호 강도의 차이에 따라 측정될 수 있다. DNA 칩 상의 형광염료의 신호는 스캐너에 의해 검출될 수 있고 특별한 프로그램을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, Affymetrix사의 Suite는 DNA 칩 분석을 위한 소프트웨어 패키지이다.
비-소세포성 폐암을 치료하거나 진단하기 위한 방법
본 발명은 대상체의 비-소세포성 폐암을 치료하거나 경감시키거나 예방하는 방법을 제공한다. 치료 화합물은 비-소세포성 폐암에 걸렸고나 걸릴 위험이 있는(걸리기 쉬운) 대상체에 예방 또는 치료를 위해 투여된다. 그러한 대상체는 표준 임상 방법을 사용하여 또는 NSC 1-1448의 발현이나 활성의 정도를 벗어난 수준을 검출하여 확인된다.
예방적 투여는 질병의 임상적 증상이 나타나기 전에 질병이나 이상의 진행이 예방되거나 지연되도록 실시된다.
치료 방법은 비-소세포성 폐암에서 비-소세포성 폐암 세포가 유도된 것과 같은 조직 형태의 정상 세포와 비교할 때, 비-소세포성 폐암에서 발현이 감소하는("과소-발현되는 유전자") 하나 이상의 유전자 산물의 발현이나 기능을 증가시키는 것을 포함한다. 이러한 방법에서, 대상체는 대상체에서 하나 이상의 과소-발현되는 유전자(NSC 1-806)의 양을 증가시키는 화합물의 유효량으로 치료된다. 투여는 전신 또는 국소 투여일 수 있다. 치료 화합물은 과소-발현되는 유전자의 폴리펩티드 산물 또는 이의 생물학적으로 활성이 있는 단편, 비-소세포성 폐암 세포에서 유전자의 발현을 가능하게 발현 조절 인자의 하류에서 과소-발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 및 비-소세포성 폐암 세포에 내생적으로 존재하는 그러한 유전자의 발현 수준을 증가시키는 화합물(즉, 과소-발현되는 유전자의 발현을 상향-조절하는 화합물)을 포함한다.
그러한 치료 화합물의 치료는 대상체의 폐 세포에서 이상 수준으로-하향-발현되는 유전자의 효과를 억제하고 대상체의 임상 상태를 향상시킨다. 그러한 화합물은 상기된 본 발명의 방법을 스크리닝함으로써 수득될 수 있다.
또한 방법은 비-소세포성 폐암 세포에서 비-소세포성 폐암 세포가 수득된 동일한 조직 타입의 정상 세포에 비해 이상 수준으로 증가되는("과다-발현되는 유전자") 유전자의 하나 이상의 유전자 산물의 발현이나 기능 또는 둘다를 감소시키는 것을 포함한다. 발현은 당업계에 알려진 어떠한 방법으로든 억제될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 대상체에서 하나 이상의 과다-발현 유전자(NSC807-1448)의 양을 감소시키는 화합물의 유효량으로 치료될 수 있다. 화합물의 투여는 전신 또는 국소일 수 있다. 그러한 치료 화합물은 비-소세포성 폐암 세포에 내생적으로 존재하는 유전자의 발현 수준을 감소시키는 화합물을 포함한다(즉 과다-발현 유전자의 발현을 하향-조절하는(down-regulate) 화합물). 그러한 치료 화합물의 투여는 대상체에서 이상 수준으로 과다-발현되는 유전자의 효과를 억제하고 대상체의 임상 상태를 개선할 것으로 기대된다. 그러한 화합물은 상기 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 비-세포성 폐암을 치료하거나 예방하는데 사용되는 단백질(NSC 1-1448)의 활성을 조절하는 화합물은 단백질 외에 자연적으로 존재하는 이러한 단백질의 동족의 리간드(cognate ligand), 펩티드, 펩티드 모방물(peptidomimetic) 및 다른 작은 분자를 포함한다.
또는, 과다 발현 유전자(NSC807-1448)의 발현은 대상체에 과다발현 유전자의 발현을 억제하거나 길항작용을 하는 핵산을 투여함으로써 억제될 수 있다. 과다발현 유전자의 발현을 방해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 라이보자임은 과다발현 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
상기대로, NSC 807-1448의 뉴클레오티드 서열 중 어떤 것에 상응하는 안티센스-올리고뉴클레오타이는 NSC 807-1448의 발현을 감소시키는데 사용될 수 있다. 비-소세포성 폐암에서 상향-조절되는 NSC 807-1448에 상응하는 안티센스-올리고뉴클레오티드는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방에 유용하다. 구체적으로, 본 발명의 안티센스-올리고뉴클레오티드는 NSC807-1448에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 어떤 것에 결합하거나 이의 상응하는 mRNA에 결합하여 유전자의 전사 또는 번역을 억제하고 mRNA의 분해를 촉진하고/거나 NSC 뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질의 작용을 억제함으로써 작용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "안티센스-올리고뉴클레오티드"라는 용어는 표적 서열이 전부 상보적인 뉴클레오티드와 안티센스-올리고뉴클레오티드가 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있는한 하나 이상의 뉴클레오티드가 미스매치되는 뉴클레오티드 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 안티센스-올리고뉴클레오티드는 서열번호 423,425, 427,429, 431,433, 435,437, 439,441, 443,445, 447,449, 451,453, 455,457, 459,461, 463,465, 467,469, 471,473, 475,477, 479,481, 483,485, 487,489, 491,493, 495,497, 499,501, 503,505, 507,509, 511,513, 515,517, 519,521, 523,525, 527,529, 및 531의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이는 모두 NSCLC 세포주에서 포커스 형성을 억제하는데 효과적인 것으로 입증되었다. 추가적으로 본 발명의 안티센스-올리고뉴클레오티드는 NSC 807-1448의 뉴클레오티드 서열과 15개의 연속된 뉴클레오티드 이상의 SPAN에 걸쳐 적어도 70% 또는 그 이상, 바람직하게는 80% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 90% 또는 그 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 상동성(homology)를 갖고 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 당업계에 알려진 알고리즘은 상동성을 측정하는데 이용될 수 있다. 더 나아가 안티센스-올리고뉴클레오티드의 유도체 또는 변형된 산물은 또한 본 발명의 안티센스-올리고 뉴클레오티드로 사용될 수 있다. 그러한 변형된 산물의 예는 메틸-포스포네이트-타입(methyl-phosphonate-type) 또는 에틸-포스포네이트-타입(ethyl-phosphonate-type), 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형 및 포스포로아미데이트(phosphoroamidate) 변형과 같은 더 낮은 알킬 포스포네이트(phosphonate) 변형을 포함한다.
안티센스-올리고뉴클레오티드 및 이의 유도체는 단백질을 암호화하는 DNA 또는 mRNA에 결합하고 그들의 전사 또는 번역을 억제하고 mRNA의 분해를 촉진하고 단백질의 발현을 억제하여 단백질 기능을 억제함으로써 NSC 807-1448에 의해 암호화되는 단백질을 생산하는 세포에 작용한다.
안티센스-올리고뉴클레오티드 및 이의 유도체는 유도체에 대해 비활성인 적당한 베이스(base) 물질과 혼합함으로써 찰제(liniment)이나 습포제(poultice)와 같은 외용제(external preparation)로 만들 수 있다.
본 발명의 안티센스-올리고뉴클레오티드는 NSC 807-1448의 어떤 하나에 의해 암호화되는 하나 이상의 NSC의 발현을 억제하여 단백질의 생물학적 활성을 억제하는데 이용된다. 과다 발현 유전자의 하나 이상의 유전자 산물을 억제하는 폴리뉴클레오티드는 또한 NSC 807-1448와 같이 과다-발현되는(over-expressed) NSC 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 센스 가닥 핵산과 안티센스 가닥 핵산의 결합을 포함하는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 포함한다. "siRNA"란 용어는 표적 mRNA의 번역을 억제하는 이중가닥 RNA 분자를 일컫는다. siRNA를 세포로 도입하는 표준 기술은 RNA가 전사된 주형 DNA를 포함하여 본 발명의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
siRNA는 표적 유전자, 예를 들어 헤어핀과 같은 표적 유전자로부터 센스와 상보적인 안티센스 서열 둘 다를 가진 단일 전사체가 만들어진다. 상기 방법은 NSC 유전자가 상향-조절되는 세포의 유전자 발현을 억제하는데 사용된다. 표적 세포에서 siRNA가 NSC 유전자 전사체로 결합하는 것은 세포에 의한 NSC 단백질의 감소를 가져온다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 적어도 10개의 뉴클레오티드이고 자연적으로 존재하는 전사체일 수 있다. 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 19-25 뉴클레오티드이다. 보다 바람직하게는 올리고뉴클레오티드는 길이가 75,50 또는 25 뉴클레오티드 이하이다. 본 발명의 바람직한 siRNA는 서열번호 533,534, 535,536, 537,538, 539,540, 541,542, 543,544, 545,546, 547, 548,549, 550,551, and 552의 뉴클레오티드 서열을 표적 서열로 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 모두는 NSCLC 세포주의 세포 생존을 억제하는데 효과가 있음이 입증되었다.
더 나아가, siRNA의 뉴클레오티드 서열은 Ambion website (http://www. ambion.com/techlib/misc/siRNA-finder. html)에서 가능한 siRNA 디자인 컴퓨터 프로그램을 사용하여 디자인될 수 있다. siRNA의 뉴클레오티드 서열은 다음의 프로토콜에 기반을 둔 컴퓨터 프로그램에 의해 선택된다:
siRNA 표적 부위의 선택:
1. 전사체의 AUG 시작 코돈으로 시작, AA 다이뉴클레오티드(dinucleotide) 서열 에 대해 하류를 스캔. 각각의 AA 와 3'인접한 19 뉴클레오티드의 발생을 기록. Tuschl, et al. 은 siRNA를 5'과 3' 비번역 부위(untranslated region, UTR)에 대해 디자인 하지 말고 짧은 코돈(75 염기 이내) 가까이에 있는 부위가 조절 단백질 결합 부위에 이런 부위가 많을 것이라고 권장하였다.이러한 부위에 대해 디자인된 엔도뉴클리아제와 siRNA의 복합체는 UTR-결합 부위 및/또는 번역 시작 복합체를 방해할 수 있다.
2. 잠재적인 표적 부위를 인간 게놈 데이터베이스와 비교하고 다른 암호화 서열과 상당한 상동성을 갖는 어떠한 표적 서열을 고려대상에서 제외. 상동성 조사는 NCBI 서버 www.ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 3에 있는 BLAST를 사용하여 수행될 수 있다.
3.합성을 위해 합당한 표적 서열을 선택. Ambion 웹사이트에서 몇가지 바람직한 표적 서열이 평가를 위한 유전자 길이와 함께 선택될 수 있다.
siRNA는 과다발현 NSC 단백질의 발현을 억제하여 단백질의 생물학적 활성을 억제하는데 유용하다. 그러므로 siRNA를 포함하는 조성물은 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는데 유용하다.
과다 발현 유전자의 하나이상의 유전자 산물을 억제하는 핵산은 또한 과다발현 유전자(NSC 807-1448)에 대한 라이보자임을 포함한다.
라이보자임은 과다발현 NSC 단백질의 발현을 억제하여 단백질의 활성을 억제하는데 유용하다. 그러므로 라이보자임을 포함하는 조성물은 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는데 유용하다.
일반적으로, 라이보자임은 크기가 큰 라이보자임과 작은 라이보자임으로 분류된다. 큰 라이보자임은 핵산의 인산 에스테르 결합을 잘라내는 효소로 알려져 있다. 큰 라이보자임으로 반응시킨 후에, 반응 부위는 5'-포스페이트와 3'-수산기 군으로 이루어진다. 큰 라이보자인은 더 나아가 (1) 구아노신에 의해 5'-스플라이스 부위(splice site)에 에스테르 교환반응(transesterification)의 촉매인 그룹 I 인트론 RNA ; (2) 래리엇(lariat) 구조를 통해 두 단계의 반응을 통한 자체-스플라이싱의 촉매인 group II 인트론 RNA ; 및 (3) 가수분해를 통해 5' 부위에 tRNA 전구체를 잘라내는 리보뉴클리아제 P의 RNA 성분으로 분류된다. 반면에, 작은 라이보자임은 큰 라이보자임과 비교할 때 더작은 크기(약 40bp)이고 RNA를 잘라 5' 수산 군과 2'-3' 환상 포스페이트(cyclic phosphate)를 만든다. 해머 헤드 (Hammer head) 타입 라이보자임t(Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225) 및 헤어핀(hairpin) 타임 라이보자임(Buzayan (1986) Nature 323: 349; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751)은 작은 라이보자임에 포함된다. 라이보자임을 디자인하고 제작하는 방법은 당업계에 잘알려져 있고(see Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225; Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059; Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res. 19:6751) 과다 발현 NSC 단백질의 발현을 억제하는 라이보자임은 라이보자임을 생산하는 기존의 방법에 따라 NSC 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 서열 정보에 기초하여 제작될 수 있다.
라이보자임은 과다 발현 NSC 단백질의 발현을 억제하여 단백질의 생물학적 할성을 억제하는데 유용하다. 그러므로, 라이보자임을 포함하는 조성물은 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는데 유용하다.
또는, 과다발현 유전자의 하나 이상의 유전자 산물의 기능은 유전자 산물에 결합하거나 otherwise 유전자 산물의 기능을 억제하는 화합물을 투여함으로써 억제된다. 예를 들어, 화합물은 과다발현 유전자 산물 또는 유전자 산물에 결합하는 항체이다.
본 발명은 항체, 특히 상향-조절 유전자에 의하여 암호화되는 단백질에 대한 항체 또는 항체의 단편의 사용에 관한 것이다. 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 항체(즉, 상향-조절되는 유전자 산물)를 합성하는데 사용되는 항원을 포함하는 분자 또는 그것과 밀접하게 관련된 항원에 특이적으로 상호작용(결합)하는 특이적인 구조를 가진 면역글로불린 분자를 일컫는다.
과다발현 NSC 뉴클레오티드에 결합하는 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체와 같이 어떤 형태든 가능하고 래빗과 같은 동물을 폴리펩티드로 면역화하여 수득되는 항혈청, 모든 클래스의 폴리클론 및 단일클론 항체, 인간 항체 및 유전자 재조합에 의해 생산된 인간화된 항체를 포함한다
더 나아가 본 발명의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법에 사용된 항체는 그것이 마커 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질에 결합하기만 하면 항체의 단편 또는 변형된 항체일 수 있다.
예를 들어, 항체 단편은 Fab, F (ab') 2, Fv 또는 단일 사슬(scFv)일 수 있고 Fv 단편은 H와 L 사슬이 적당한 링커에 의해 접합된 것이다(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83). 보다 구체적으로 항체 단편은 파페인(papain) 또는 펩신(pepsin) 같은 유전자로 항체를 처리하여 생성될 수 있다. 또는, 항체 단편을 암호화하는 유전자는 제작될 수 있고 발편 벡터에 삽입되어 적당한 숙주세포에서 발현될 수 있다(예를 들어 Co et al. (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better M. and Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi(1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) Methods Enzymol. 121: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7).
항체는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG)과 같은 다양한 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 변형된 항체는 화학적으로 항체를 변형하여 수득할 수 있다. 이러한 변형 방법은 당업계에서 통상적으로 사용된다.
또는, 항체는 비인간 항체로부터 유래한 변형 부위(variable region)와 인간 항체로부터 유래한 불변 부위(constant region)가 결합된 키메릭 항체(chimeric antibody)로 또는 인간이 아닌 항체로부터 유도된 상보성 결정 부위를 포함하여, 인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR)와 불변부위가 결합된 인간화된 항체로 수득될 수 있다. 그러한 항체는 알려진 기술을 이용하여 준비될 수 있다.
본 발명은 과다발현 NSC 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법을 제공한다. 상기 방법에 따르면, NSC 폴리펩티드에 대한 약학적 유효량이 투여된다. 과다발현 NSC 폴리펩티드에 대한 항체는 NSC 안백질의 활성을 줄일 수 있을만큼 충분한 양으로 투여된다.
또는, 종양 세포에 특이적인 세포 표면 마커에 결합하는 항체는 약물 전달을 위한 도구로 사용될 수 있다. 그러므로 예를 들어, 세포 독성 작용제와 결합한 과다발현 NSC 폴리펩티드에 대한 항체는 종양 세포를 손상시키는데 충분한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에 NSC 807-1448로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 면역학적으로 활성이 있는 단편 또는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편을 포함하는 백신을 투여하는 것을 포함하여 대상체에서 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법에 관한 것이다.
폴리펩티드 투여는 대상체에서 항암 면역을 유도한다. 그러므로, 본 발명은 더 나아가 항암 면역을 유도하는 방법을 제공한다. 폴리펩티드 또는 이의 면역학적으로 활성인 단편은 비-소세포성 폐암에 대한 백신으로 유용하다. 몇몇 경우에 단백질 또는 이의 단편은 T 세포 수용체에 결합된 형태로 또는 대식세포, 수지상 세포(dendritic cell, DC) 또는 B-세포와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)에 의해 제시된 형태로 투여될 수 있다. DC의 강력한 항원 제시 능력 때문에 APC 중에 DC의 사용이 가장 바람직하다.
본 발명에서 "비-소세포성 폐암에 대한 백신"이라는 구문은 항암 면역 또는 동물에 접종되면 비-소세포성 폐암을 억제하는 면역을 유도하는 기능을 갖고 있는 물질을 일컫는 것이다. 일반적으로, 항암면역은 다음과 같은 면역 반응을 유도한다: 세포독성 림프구의 유도. 종양을 인식하는 항체 유도 및 항암 사이토카인 생성 유도. 그러므로 특정 단백질이 동물에 접종되자마자 이러한 면역 반응 중 어느 하나를 유도하면 그 단백질은 효과를 유도하는 항암면역을 갖게된다. 단백질에 의한 항암 면역의 유도는 생체내에서 또는 시험관내에서 단백질에 대한 숙주에서의 면역 시스템의 반응을 관찰하여 검출될 수 있다.
예를 들어, 세포독성 T-림프구 유도를 검출하는 방법은 잘 알려져 있다. 생체로 들어간 외부 물질은 항원 제시 세포(APC)의 작용에 의해 T 세포와 B 세포로 제시된다. 항원의 자극에 의해 항원 특이적인 방법으로 APC에 의해 제시된 항원에 반응하는 T 세포는 항원에 의한 자극으로 세포독성 T 세포(또는 세포독성 T 림프구)로 분화하고 증식한다(이는 T 세포의 활성화라고 일컬어진다). 그러므로 특정 펩티드에 의한 CTL 유도는 APC에 의해 T 세포로 펩티드를 제시하고 CTL의 유도를 검출함으로써 평가될 수 있다. 더 나아가, APC는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 대식세포, 호산구(eosinophil) 및 NK 세포를 활성화시키는 효과를 가지고 있다. CD4+ T 세포는 또한 항암면역에서 중요하기 때문에 펩티드의 작용을 유도하는 항암면역은 표지자(indicator)로서 이러한 세포들의 활성화 효과를 이용하여 평가될 수 있다.
APC로 수지상 세포(DC)를 사용하여 CTL의 작용 유도를 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. DC는 APC 가운데 작용을 유도하는 가장 강한 CTL을 갖는 대표적인 APC이다. 이러한 방법으로, 시험 폴리펩티드는 최초로 DC와 접촉하게 되고 이 DC는 T 세포와 접촉하게 된다. DC와 접촉한 이후에 관심을 갖고 있는 세포에 대해 세포 독성 효과를 갖는 T 세포의 검출는 시험 폴리펩티드가 세포 독성 T 세포를 유도하는 활성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.
종양에 대한 CTL의 활성이 검출될 수 있다. 예를 들어 표지자로 51Cr 표지된 종양세포의 용해를 사용하여 검출될 수 있다.
또는, 3H-싸이미딘 흡수 활성 또는 LDH(lactose dehydrogenase)-배출을 표지자로 종양 세포 손상 정도를 평가하는 방법 또한 잘 알려져 있다.
DC와 별도로, 말초 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 또한 APC로 사용될 것이다. CTL의 유도는 GM-CSF와 IL-4의 존재하에 PBMC를 배양함으로써 증진된다고 보고되어 있다. 유사하게, CTL은 키홀 림페테모시아닌(keyhole limpethemocyanin, KLH)과 IL-7의 존재하에 PBMC를 배양함으로써 유도되는 것으로 보인다.
이러한 방법에 의해 CTL 유도 활성을 갖는다고 확인된 시험 폴리펩티드는 DC 활성화 효과와 이어서 CTL 유도 효과를 갖는 폴리펩티드이다.
그러므로, 종양 세포에 대해 CTL을 유도하는 폴리펩티드는 비-소세포성 폐암에 대한 백신으로 유용하다. 더 나아가 비-소세포성 폐암에 대해 CTL을 유도하는 능력을 획득한 APC는 비-소세포성 폐암 백신으로 유용하다. 더 나아가 APC에 의해 폴리펩티드 항원의 제시로 세포 독성을 획득한 CTL 또한 비-소세포성 폐암에 대한 백신으로 사용될 수 있다. APC 와 CTL 항암면역을 사용하여 비-소세포성 폐암에 대한 치료법은 세포면역치료로 일컬어진다.
일반적으로 세포 면역치료를 위해 폴리펩티드를 사용할 때, CTL-유도의 효과는 상이한 구조를 갖는 다수의 폴리펩티드를 combining 하여 이를 DC와 접촉시킴으로써 증가한다고 알려져 있다. 그러므로 DC를 단백질 단편으로 자극할 때, 여러가지 타입의 단편의 혼합물을 사용하는 것이 유리하다.
또는, 폴리펩티드에 의한 항암 면역의 유도는 종양에 대한 항체 생산의 유도를 관찰함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 대한 항체가 폴리펩티드로 면역화된 실험동물에서 유도될 때, 그리고 성장, 증식 또는 종양 세포의 전이가 이러한 항체에 의해 억제될 때, 폴리펩티드는 하암 면역을 유도하는 능력이 있다고 확인될 수 있다.
항암 면역은 본 발명의 백신을 투여함으로써 유도되고 항암 면역의 유도는 비-소세포성 폐암의 치료와 예방를 가능하게 한다. 비-소세포성 폐암 치료 또는 발병 예방는 NSCLC 세포의 성장억제, NSCLC 세포의 퇴화 및 NSCLC 세포의 발생 억제와 같은 단계를 포함한다. 비-소세포성 폐암에 걸린 환자의 사망 감소, 혈액에서 NSC 마커의 감소, 비-소세포성 폐암에 동반되는 검출가능한 증상의 경감 등 또한 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방에 포함된다.
그러한 치료 및 예방효과는 바람직하게는 통계적으로 중요하다. 예를 들어 관찰시, 비-소세포성 폐암에 대한 백신의 치료 또는 예방 효과는 백신 접종하지 않은 대조군과 비교하여 5% 또는 그 이하의 상당한 수준이다. 예를 들어, 스튜던트 t-테스트(Student's t-test), 만-휘트니 U 테스트(Mann-Whitney U-test) 또는 ANOVA는 통계 분석에 사용될 것이다.
면역 활성을 갖는 상기 단백질 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 벡터는 보조물질(adjuvant)과 결합될 수 있다. 보조물질은 면역학적 활성을 갖는 단백질과 함께 투여되었을 때(또는 연속적으로) 단백질에 대한 면역 반응을 증진시키는 화합물을 일컫는다. 보조물질의 예는 콜레라 독(cholera toxin), 살모넬라 독(salmonella toxin), 명반(alum) 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 더 나아가 본 발명의 백신은 약학적으로 허용가능한 담체와 적절히 결합될 수 있을 것이다. 그러한 담체의 예는 멸균된 물, 생리학적 식염수, 인산염 완충용액, 배양 용액 등이다. 더 나아가 백신은 필요하다면 안정제(stabilizer), 현탁물질(suspension), 방부제(preservative), 계면활성제(surfactant) 등을 포함할 수 있다.
백신은 전신적으로 또는 국소적으로 투여된다. 백신 투여는 한번 투여되거나 여러번 투여로 부양될 수 있다.
본 발명의 백신으로 APC 또는 CTL을 사용할 때, 비-소세포성 폐암은 예를 들어 생체 외(ex vivo) 방법으로 치료되거나 예방될 수 있다. 보다 특이적으로 치료나 얘방을 받은 대상체의 PBMC가 모아지고, 세포들은 생체 외로 폴리펩티드와 접촉되고 APC 또는 CTL를 유도한 후, 세포들은 대상체에 투여될 수 있을 것이다. APC 또한 폴리펩티드를 암호화하는 벡터를 생체 외에서 PBMC로 도입함으로써 유도될 수 있다. 시험관내에서 유도된 APC 또는 CTL은 투여 전에 클로닝될 수 있다. 표적세포에 손상을 주는 높은 활성을 가진 세포를 클로닝하고 성장시킴으로써 세포 면역치료는 보다 효과적으로 수행될 수 있다.
더 나아가, 이러한 방법으로 분리된 APC 와 CTL은 세포가 수득된 개인의 세포 면역치료 뿐 아니라 다른 개인의 유사한 타입의 질병에도 사용될 수 있다.
비-소세포성 폐암 치료 또는 예방를 위한 약학적 조성물
본 발명은 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현이나 활성을 변경시키는 호합물을 스크리닝하는 본 발명의 방법에 의하여 선택된 화합물을 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는 조성물을 제공한다.
인간과 마우스, 래트, 기니아 피그, 래빗, 고양이, 개, 양, 돼지, 가축, 원숭이, 비비(baboon) 또는 침팬지의 증식성 질병(예를 들어, 비-소세포성 폐암)을 치료하기 위한 약제로서 본 발명의 방법에 의하여 스크리닝되어 분리된 화합물을 투여할 때, 분리된 화합물을 직접적으로 투여되거나 통상적인 약제 제조 방법을 이용하여 투여형(dosage form)으로 제형화될 수 있다. 본 조성물의 그러한 약학적 제제는 구강, 직장, 비강, 국소(구강 및 설하), 질 또는 비경구(근육내, 피하 및 정맥내) 투여 또는, 흡입이나 취분(insufflation) 등 투여에 알맞은 것을 포함한다. 제형은 선택적으로 분리된 제형 단위로 포장된다.
경구 투여에 적합한 약학적 조성물은 각각 활성 성분의 선결량(predetermined amount)을 함유하는 캡슐, 사세(cachet) 또는 정제를 포함한다
제형은 또한 가루, 입자, 용액, 현탁액 또는 이멀전(emulsion)을 포함한다. 활성 성분은 전량 지제(bolus electuary) 또는 페이스트(paste)로 선택적으로 투여된다. 경구 투여를 위한 정제와 캡슐은 결합제, 충진제, 윤활제, 붕괴제 또는 습윤제와 같은 통상적인 부형제를 포함할 수 있다. 정제는 선택적으로 하나 이상의 제형 성분으로 압착 및 몰딩(molding)에 의해 만들어질 수 있다. 압착 정제는 알맞은 기계로 활성 성분을 선택적으로 binder, 윤활제, 비활성 희석제, 계면 활성제(surface active) 또는 분산제(dispersing agent)와 혼합하여 가루나 입자와 같은 자유유동(free-flowing) 형태로 압착함으로써 제제화될 수 있다. 몰딩된 정제(Molded tablet)는 알맞은 기계로 젖게한 가루화된 화합물의 혼합물을 몰딩하여 만들어질 수 있다. tablet은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다. 경구 액제는 예를 들어 수성의 또는 기름의 현탁액, 이멀전, 시럽 또는 액제(elixir)의 형태일 수 있고 또는 사용 전에 물이나 다른 적합한 수송과 재수화(reconstitution)를 위해 건조한 산물로 제시될 수 있다. 그러한 액제는 분산제, 유화제, 비-수성 수송체(식용 기름을 포함하는) 또는 방부제와 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다. 정제는 생체내에서 활성 성분의 느린 또는 조절된 배출을 위해서 선택적으로 제형화될 수 있다. 정제의 포장은 한 입에 먹을 수 있는 하나의 정제를 포함할 수 있다. 이러한 제제에서 제형 또는 복용량은 허용가능한 범위에서 알맞은 양으로 만들어질 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 수용자의 혈액과 등장인(isotonic) 제형을 만들기 위한 항산화제, 완충용액, 제균제(bacteriostat) 및 용질을 포함할 수 있는 수성과 비-수성 멸균 주사 용액; 및 분산제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성과 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 제형은 일회 용량 또는 수회 용량 용기, 예를 들어 밀폐된 앰플(ampoule) 및 바이알(vial)로 제시될 수 있고 예를 들어 식염수, 주사용수(water-for-injection)와 같이 사용 바로 전에 멸균 액체 담체의 첨가만을 필요로하는 동결건조(lyophilized) 상태로 저장될 수 있다.
또는, 제형은 연속 주입(continuous infusion)으로 제시될 수 있다. 임시(Extemporaneous) 주사 용액과 현탁액은 멸균 가루, 입자 및 이전에 기재된 유사한 정제로부터 제제화될 수 있다.
직장 투여를 위한 제형은 코코아 버터나 폴리에틸렌 글리콜과 같은 표준 담체와 좌약을 포함한다. 입에서 국소 투여를 위한, 예를 들어 구강 또는 설하 제형은 수크로스 또는 아카시아와 같은 향기 베이스(flavored base)에 활성 성분을 함유하는 로젠지(lozenge) 또는 트라가간스(tragacanth) 및 젤라틴, 글리세린, 수크로스 또는 아카시아와 같은 베이스에 활성 성분을 포함하는 페스틸(pastilles)을 포함한다. 활성 성분의 비강내 투여를 위해, 액체 스프레이 또는 분산 가루(dispersible powder) 또는 점적제(form of drop)로 사용될 수 있다. 점적제는 하나 이상의 분산제(dispersing agent), 용해제 또는 분산제(suspending agent)를 포함하는 수성 또는 비-수성의 베이스로 제형화될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해 조성물은 기복기(insufflator), 분무기(nebulizer), 압축된 팩 또는 다른 에어로졸 스프레이를 수송하는 수단으로 편리하게 전달될 수 있다. 압축된 팩(Pressurized pack)은 디클로로디플로로메탄(dichlorodifluoromethane), 트리클로로플로로메탄(trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플로로에탄(dichlorotetrafluoroethane), 이산화탄소(carbon dioxide) 또는 다른 적당한 가스와 같은 적합한 압축 불활성 가스(propellant)를 포함할 수 있다. 압축된 에어로졸의 경우에 일회 용량은 개량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 측정될 수 있다.
또는, 흡입 또는 취분에 의한 투여를 위하여, 조성물은 건조 분말 조성물, 예를 들어 활성 성분과 락토오즈나 녹말과 같은 적당한 가루의 혼합물의 형태로 섭취될 수 있다. 분말 조성물은 분말이 흡입기(inhalator)나 기복기(insufflator)의 도움으로 투여될 수 있는 예를 들어 캡슐, 카트리지, 젤라틴 또는 투명한 포장과 같은 단위 제제(unit dosage form)로 제시될 수 있다.
다른 제형은 이식할 수 있는 장치와 접착 패치를 포함한다 ; 이는 치료 작용를 배출한다.
상기 제형은 활성 성분이 필요하다면 활성 성분을 지속적으로 배출하는 서방형(sustained release)일 수 있다. 약학적 조성물은 또한 항미생물제제(antimicrobial agent), 면역억제제(immunosuppressant) 또는 방부제와 같은 다른 활성성분을 포함할 수 있다.
구체적으로 상기된 성분에 추가하여 본 발명의 제형은 당업계에서 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있다. 본 발명은 제형의 형태와 관련된 당업계에서 통상적인 다른 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어 경구 투여를 위하여 적합한 물질로는 방향제가 포함될 수 있다.
바람직한 일회 용량(unit dosage) 제형은 하기와 같이 활성 성분 또는 이의 적절한 단편의 유효량을 함유하는 것이다.
앞서 언급된 각각의 조건을 위하여, 조성물 예를 들어 폴리펩티드와 유기 화합물은 경구로 또는 주사로 하루에 약 0.1에서 약 250 mg/kg의 양으로 투여될 수 있다. 성인을 위한 용량 범위는 일반적으로 하루에 약 5 mg 에서 17.5g이고 바람직하게는 하루에 약 5 mg 에서 약 10 g이고 가장 바람직하게는 하루에 약 100 mg 에서 약 3g 이다. 개별 단위(discrete units)로 제공되는 정제 또는 다른 단위 용량 제형은 그러한 용량 또는 다수의 용량으로 유효한 양으로 예를 들어 약 5 mg 에서 약 500 mg, 일반적으로 약 100 mg 에서 약 500 mg을 함유하는 단위로 유효량을 편리하게 함유할 수 있다.
용량은 대상체의 나이와 성별, 처리되는 정확한 순서 및 중한 정도(severity)을 포함하는 인자의 수에 의존할 것이다. 또한 투여 경로는 상태와 정도에 따라 다양할 것이다.
더 나아가 본 발명은 NSC 807-1448군으로부터 선택된 어떠한 한 유전자의 발현을 억제하는 활성 성분을 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는 조성물을 제공한다. 그러한 활성 성분은 유전자 또는 발현벡터와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유도체에 대한 라이보자임, siRNA 또는 라이보자임일 수 있다. 활성 성분은 유도체에 대해 비활성인 적당한 베이스와 혼합하여 찰제나 습포제와 같은 외용제로 만들어질 수 있다.
또한, 필요하다면 활성 성분은 부형제, 등장제, 용해제, 방부제, 진통제 등을 첨가하여 정제, 가루, 입자, 캡슐, 리포좀 캡슐, 주사, 용액, 코-점적제 및 동결건조작용제로 제형화될 수 있다. 이들은 약제를 함유하는 핵산을 제제화하는 전통적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
바람직하게는, 안티센스-올리고뉴클레오티드 유도체, siRNA 유도체 또는 라이보자임 유도체는 환자에게 환부에 직접 도포(application)하거나 혈관으로 주사하여 환부에 도달하도록 투여될 수 있다. 봉입제(mounting medium)은 또한 내구성과 막 투과성을 증가시키는 조성물로 사용될 수 있다. 배지의 예는 리포좀, 폴리-L-리신, 지질, 콜레스테롤, 리포펙틴 및 이의 유도체를 포함한다.
그러한 조성물의 복용량은 활자의 상태에 따라 적당하게 맞출 수 있고 원하는 양만큼 사용될 수 있다. 예를 들어 0.1 에서 100 mg/kg, 바람직하게는 0.1 에서 50 mg/kg 복용 범위가 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 NSC 807-1448의 군으로부터 선택된 유전자의 어떠한 하나에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 대한 항체 또는 폴리펩티드에 결합하는 항체의 단편을 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는 조성물이다.
증상에 따라 약간의 차이는 있을지라도 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하기 위한 항체 또는 이의 단편의 복용량은 정상 성인에게 경구로 투여될 때(몸무게 60 kg) 하루에 약 0.1 mg 에서 약 100 mg, 바람직하게는 하루에 약 1.0 mg 에서 약 50 mg 보다 바람직하게는 하루에 약 1.0 mg에서 약 20 mg이다.
정상 성인(60 kg)에게 주사 형태로 비경구로 투여할 때, 환자의 상태, 질병의 증상 및 투여 방법에 따라 약간의 차이는 있을지라도 하루에 약 0.01 mg에서 30 mg의 용량, 바람직하게는 하루에 약 0.1 에서 20 mg, 보다 바람직하게는 하루에 약 0.1에서 약 10 mg 의 용량을 정맥내 주사하는 것이 간편하다. 또한, 동물의 경우에도 마찬가지로 60 kg의 무게로 환산된 양을 투여하는 것이 가능하다.
폴리펩티드
본 발명에 따르면, 암이 아닌 조직에 비하여 비-소세포성 폐암에서 발현이 상당히 상승된 새로운 인간 유전자 URLC 1 (NSC 905)가 제공된다.
URLC I (NSC 905)은TUDOR 도메인을 암호화한다. TUDOR 도메인은 RNA 결합 및 핵산 결합 능력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 상기 유전자의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 기재되고 상기 유전자에 의하여 암호화되는 아미노산 서열은 서열번호 2로 기재된다.
이러한 유전자는 암세포에 암형성(oncogenic) 활성을 부여하는 것으로 알려져 있고 이러한 단백질의 활성은 암치료, 특히 비-소세포성 폐암에 있어 가망성 있는 전략이다.
본 발명은 서열번호 1로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 새로운 인간 유전자 뿐 아니라 그들이 NSC 단백질을 암호화하는 정도까지 이의 축퇴(degenerate)와 돌연변이 서열번호 2로 기재된 아미노산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 이제부터 이러한 유전자에 의해 암호화된 폴리펩티드는 집합적으로 NSC 단백질로 언급된다.
NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드의 예는 예를 들어, 인간 NSC 단백질에 해당하는 다른 개체의 상동 단백질 뿐 아니라인간 NSC 단백질의 돌연변이를 포함한다.
본 발명에서 "기능적으로 등가"라는 용어는 대상체 폴리펩티드가 여느 NSC 단백질처럼 세포 증식을 증진시키는 활성 및 암세포에 암발생 활성을 부여하는 활성을 가지고 있다는 것을 의미한다.
대상체 폴리펩티드가 세포 증식 활성을 가지는지 아닌지는 대상체 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 각각의 폴리펩티드를 발현하는 세포로 도입하고 세포 증식 증진이나 콜로니 형성능 증가를 관찰함으로써 판단될 수 있다.
주어진 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 준비하는 방법은 당업계 숙련자에게 잘 알려져 있고 단백질로 돌연변이를 도입하는 알려진 방법을 포함한다. 예를 들어, 당업계 숙련자는 인간 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 위치-지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 이러한 단백질 중 어떤 것의 아미노산 서열에 적당한 돌연변이를 도입함으로써 준비할 수 있다(Hashimoto-Gotoh etal., Gene 152: 271-5 (1995); Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); Kramer etal., Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987); Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1985); Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 (1988) ). 아미노산 돌연변이는 자연에서도 일어난다. 본 발명의 폴리펩티드는 인간 NSC 단백질의 아미노산 서열을 가지고 있는 단백질을 포함하는데 여기서 하나 이상의 아미노산이 돌연변이가 되어 인간 NSC 단백질과 기능적으로는 등가인 돌연변이 폴리펩티드가 제공된다. 그러한 돌연변이에서 돌연변이될 아미노산의 수는 일반적으로 10개의 아미노산 또는 그 이하이고, 바람직하게는 6개의 아미노산 또는 그 이하이고 보다 바람직하게는 3개의 아미노산 또는 그 이하이다.
돌연변이된 또는 변형된 단백질, 치환, 결실, 삽입 및/또는 특정 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기를 첨가함으로써 변형된 아미노산 서열을 갖는 단백질은 원래의 생물학적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10: 6487-500 (1982); Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982)).
돌연변이가 일어날 아미노산 잔기는 바람직하게는 아미노산 곁 가지의 특성이 보존되는 다른 아미노산으로 돌연변이 된다(보존성 아미노산 서열로 알려진 과정) 아미노산 곁가지 특성의 예는 소수성 아미노산(A,I, L, M, F, P, W,Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 및 일반적으로 다음의 기능기 또는 특징을 갖는 곁가지이다: 지방족 곁가지(G, A,V, L,I, P); 곁가지를 포함하는 수산기(S, T, Y) ; 곁가지를 포함하는 황 원자(C, M); 곁가지를 포함하는 카르복실산과 아마이드(amide)(D, N, E, Q); 곁가지를 포함하는 염기(R, K, H); 및 곁가지를 포함하는 aromatic(H, F, Y, W). 삽입된 글자는 아미노산의 한 글자(one-letter) 코드를 나타낸다.
하나 이상의 잔기가 인간 NSC 단백질의 아미노산 서열에 첨가된 폴리펩티드의 예는 인간 NSC 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 융합 단백질은 인간 NSC 단백질과 다른 펩티드 또는 단백질의 융합이 본 발명에 포함된다. 융합 단백질은 본 발명의 인간 NSC 단백질을 암호화하는 DNA를 다른 펩티드나 단백질을 암호화하는 DNA와 결합시킴으로써 프레임이 맞도록 융합 단백질을 발현 벡터에 삽입하여 숙주에서 발현되도록 하는 당업계 숙련자에게 잘 알려진 기술이다. 본 발명의 단백질에 융합된 펩티드나 단백질에 대한 제약은 없다.
본 발명의 NSC 단백질에 융합되는 펩티드로 사용될 알려진 펩티드에는 예를 들어 FLAG(Hopp etal., Biotechnology 6: 1204-10 (1988)), 6개의 His 잔기(히스티딘)를 포함하는 6xHis, lOxHis, 인플루엔자 응집체(HA), 인간 c-myc 단편, VSP-GP 단편, pl8HIV 단편, T7-표지, HSV-표지, E-표지, SV40T 항원 단편,Ick 표지, a-튜불린 단편, B-tag, 단백질 C 단편 등이 포함된다. 본 발명의 단백질에 융합될 수 있는 단백질의 예는 GST (glutathione-S-transferase), 인플루엔자 응집체(HA), 이뮤노글로불린 불변 부위, β-갈락토시다제, MBP(maltose-binding protein) 등을 포함한다.
융합 단백질은 융합 펩티드나 상기 단백질을 암호화하는 상업적으로 구입가능한 DNA를 융합하여 준비될 수 있고, 본 발명의 NSC 폴리펩티드를 암호화하는 DNA와 융합된 DNA를 발현하여 준비될 수 있다. 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 분리하는 당업계에 알려진 다른 방법은 예를 들어 혼성화 기술을 사용하는 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9. 58, Cold Spring Harbor Lab. Press(1989))이다. 당업계 숙련자는 NSC 단백질과 높은 상동성을 갖는 DNA를 쉽게 분리할 수 있고(즉 서열번호 1) 분리한 DNA로부터 인간 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 본 발명의 NSC 단백질은 NSC 인간 NSC 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 전체 또는 일부분과 혼성화하는 DNA에 의해서 암호화된 것과 인간 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 것을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 인간으로부터 유래한 단백질에 해당하는 포유류 상동체(homologue)(예를 들어 원숭이, 래트, 래빗 및 소의 유전자에 의하여 암호화된 폴리펩티드를 포함한다. 동물에서 인간 NSC 단백질을 암호화하는 DNA에 매우 높은 상동성을 갖는 cDNA를 분리할 때, 폐암 조직을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
인간 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 분리하기 위한 혼성화 조건은 당업계 숙련자에게 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 혼성화는 68℃ 에서 30분 동안 또는 더 오래 "Rapid-hyb buffer" (Amersham LIFE SCIENCE)를 사용하여 전혼성화(prehybridization)되고 표지된 탐칩을 첨가하여 68℃에서 1시간 또는 더 오래 데움으로써 수행된다. 그 다음 세척 단계는 예를 들어 좀 더 엄격하지 않은 조건에서 수행될 수 있다. 좀 더 엄격하지 않은 조건은 예를 들어 42℃, 2X SSC, 0.1% SDS, 또는 바람직하게는 50℃, 2X SSC,0.1% SDS 보다 바람직하게는 매우 엄격한 조건이 사용된다. 매우 엄격한 조건은 예를 들어, 상온에서 20분간 2X SSC, 0.01% SDS에서 세번 세척하고나서 37 ℃에서 20분간 lx SSC, 0.1% SDS에서 세번 세척하고 50℃에서 20분간 lx SSC, 0.1%SDS에서 2번 세척하는 것이다. 그러나 온도 및 염 농도와 같은 여러가지 요인이 혼성화의 엄격성에 영향을 미칠 수 있고 당업계 숙련자는 필요한 엄격성를 달성하는 요인을 선택할 수 있다.
혼성화의 경우, 유전자 증폭, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(PCR) 방법이 DNA(서열번호 1)를 암호화하는 단백질의 서열정보에 기초하여 합성된 프라이므를 사용하여 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 분리하는데 사용될 수 있다.
상기 혼성화 기술 또는 유전자 증폭 기술을 통해 분리된 DNA에 의해 인간의 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드는 일반적으로 인간 NSC 단백질의 아미노산 서열에 높은 상동성을 가지고 있다. "높은 상동성(High homology)"은 전형적으로 40% 또는 그 이상, 바람직하게는 60% 또는 그 이상, 보다 바람직하게는 80% 또는 그 이상, 보다 더 바람직하게는 95% 또는 그 이상의 상동성을 말한다. 폴리펩티드의 상동성은 다음의 "Wilbur and Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30 (1983)"의 알고리즘에 의하여 측정될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 그것을 생산하기 위해 사용되는 세포나 숙주 또는 사용되는 정제방법에 따라 아미노산 서열, 분자량, 등전점, 당 사슬의 존재 또는 부재 또는 형태에 변화를 갖는다.
그럼에도 불구하고 본 발명의 인간 NSC 단백질의 것과 기능적으로 등가인한 본 발명의 범주내에 들어있다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업계 숙련자들에게 잘 알려진 방법에 의하여 재조합 단백질이나 천연 단백질로 준비될 수 있다. 재조합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 적당한 박현 벡터에 삽입하여 적당한 숙주세포내로 벡터를 도입하고 추출물을 크로마토그래피, 예를 들어 본 발명의 단백질에 대한 항체가 고정된 컬럼을 사용하여 또는 이전에 언급된 컬럼 중 하나 이상을 결합하여 이온교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 젤 여과 또는 친화도 크로마토그래피에 로딩하여 폴리펩티드를 순수분리으로써 준비될 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드가 숙주세포 내에서 글루타치온-S-전이효소를 갖는 융합 단백질이나 여러개의 히스티딘이 보충된 재조합 단백질로 발현되면(예를 들어, 동물세포와 대장균) 발현된 재조합 단백질은 글루타치온 컬럼이나 니켈 컬럼을 사용히여 순수분리될 수 있다.
또는, 본 발명의 폴리펩티드가 c-myc, 여러개의 히스티니, 또는 FLAG이 표지된 단백질로 발현되면, 폴리펩티드는 각각 c-myc, His, 또는 FLAG에 대한 항체를 사용하여 검출되고 순수분리될 수 있다.
융합 단백질을 순수분리한 후에, 필요하다면 트롬빈(thrombin)이나 factor-Xa로 잘라 원하는 폴리펩티드 이외의 부위를 제외하는 것이 또한 가능하다.
천연 단백질은 당업계 숙련자에게 잘 알려진 방법으로 분리될 수 있다. 예를 들어 천연 단백질은 예를 들어 친화도 컬럼에 결합되어 있는 하기 NSC 단백질에 결합하는 항체를 본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 조직이나 세포의 추출물과 접촉시키는 당업계 숙련자에게 잘 알려진 방법으로 분리될 수 있다. 항체는 폴리클론이나 모노클론 항체일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 NSC 단백질의 펩티드 일부를 포함한다. 부분 펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 아미노산 서열을 가지고 있고 7개 아미노산 이상, 바람직하게는 8개의 아미노산 또는 그 이상 그리고 보다 바람직하게는 9개의 아미노산 또는 그 이상으로 이루어져 있다. 부분 펩티드는 예를 들어 본 발명의 NSC 단백질에 대한 항체를 준비하고 본 발명의 NSC 단백질에 결합한 화합물을 스크리닝하고 본 발명의 NSC 단백질의 촉진제(accelerator) 또는 억제제(inhibitor)를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 부분 펩티드는 유전공학, 폴리펩티드 합성의 잘 알려진 방법 또는 본 발명의 폴리펩티드를 적당한 펩티다제로 소화함으로써 생산될 수 있다. 펩티드 합성에 있어서, 예를 들어 고형상 합성이나 액체상 합성이 사용될 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 NSC 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 NSC 단백질은 상기와 같이 본 발명의 NSC 단백질의 생체내 또는 시험관내 생산에 사용될 수 있거나 본 발명의 단백질을 암호화하는 유전자의 이상으로 인한 질병의 유전자 치료에 적용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 어떠한 형태든 그것이 본 발명의 NSC 단백질 또는 mRNA, RNA, cDNA, 게놈 DNA, 화학적으로 합성된 폴리펩티드를 포함하여 이의 등가물을 암호화하는 한 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩뉴클레오티드는 결과로 나타난 DNA가 본 발명의 NSC 단백질 또는 이의 등가물을 암호화하는 한 축퇴(degenerate) 서열 뿐 아니라 주어진 뉴클레오티드를 포함하는 DNA를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 당업계 숙련자에게 알려진 방법으로 준비될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 NSC 단백질을 발현하는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 준비하여 본 발명의 DNA의 부분적인 서열(예를 들어 서열번호 1)을 탐침으로 사용하여 혼성화를 실시하여 준비될 수 있다.
cDNA 라이브러리는 예를 들어 Sambrook etal., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)에 기재된 방법으로 준비될 수 있다; 또는, 상업적으로 가능한 cDNA 라이브러리 또한 사용될 수 있다. cDNA 라이브러리는 또한 본 발명의 NSC 단백질을 발현하는 세포로부터 RNA를 추출하고 본 발명의 DNA 서열에 기초하여 올리고 DNA를 합성하고(예를 들어 서열번호 1), 프라이머로 올리고 DNA를 사용하여 PCR을 실시하고 본 발명의 NSC 단백질을 암호화하는 cDNA를 증폭하여 준비될 수 있다.
덧붙여서, 수득된 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 시퀀싱하여 cDNA에 의해 암호화된 부분의 번역이 쉽게 측정되고 본 발명의 NSC 단백질의 아미노산 서열이 쉽게 수득될 수 있다. 더욱이 수득된 cDNA나 이의 일부분을 탐침으로 사용하여 게놈 DNA를 스크리닝함으로써 게놈 DNA가 분리될 수 있다.
보다 구체적으로, mRNA는 먼저 본 발명의 NSC 단백질이 발현된 세포, 조직 또는 기관으로부터 준비될 수 있다. mRNA를 분리하는데 알려진 방법이 사용될 수 있다; 예를 들어, 전체 RNA는 구아니딘 초원심분리(guanidine ultracentrifugation, Chirgwin etal., Biochemistry 18: 5294-9 (1979) ) 또는 AGPC 방법(Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162: 156-9 (1987) )에 의해 준비될 수 있다. 덧붙여, mRNA는 mRNA 분리 키트(Pharmacia) 등을 사용하여 전제 RNA로부터 순수분리될 수 있거나 또는 QuickPrep mRNA 분리 키트(Pharmacia)에 의하여 직접 순수분리될 수 있다.
수득된 mRNA는 역전사 효소를 사용하여 cDNA를 합성하는데 사용된다. cDNA는 AMV 역전사 1차 가닥 cDNA 합성 키트(Seikagaku Kogyo)같이 상업적으로 구입가능한 키트를 사용하여 합성될 수 있다. 또는,cDNA는 5'-RACE 방법(Frohman et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)에 따라 합성되고 증폭될 수 있다; Belyavsky etal., Nucleic Acids Res 17: 2919-32 (1989) ), 이는 명세서에 기재된대로 프라이머와 5'-Ampli FINDER RACE 키트(Clontech), 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용한다.
원하는 DNA 단편이 PCR 산물로부터 준비되고 벡터 DNA와 접합된다. 재조합 벡터는 E. coli 등을 형질전환하는데 사용되고 원하는 재조합 벡터는 선택된 콜로니로부터 준비된다. 원하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 디데옥시뉴클레오티드 체인 종결과 같은 통상적인 방법에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 보다 효과적으로 발현되도록 발현을 위해 사용되는 숙주에서 코돈 사용 횟수를 고려하여 디자인될 것이다(Grantham et al. , Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1981) ). 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열은 상업적으로 구입가능한 키트에 의해 또는 통상적인 방법에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 서열은 제한효소의 절단, 합성 올리고뉴클레오티드 또는 적당한 폴리뉴클레오티드 단편의 삽입, 링커의 첨가 또는 개시코돈(ATG) 및/또는 종결 코돈(TAA, TGA, or TAG)의 삽입으로 변경될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 엄격한 조건에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고 상기된 본 발명의 NSC 단백질과 기능적으로 등가인 폴리펩티드를 암호화한다. 당업계 숙련자는 적절한 엄격한 조건을 선택할 수 있다.
예를 들어, 낮은 엄격한 조건이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 높은 엄격한 조건이 사용될 수 있다. 이러한 조건은 상기와 같다. 상기 혼성화 DNA는 바람직하게는 cDNA 또는 염색체 DNA이다.
벡터와 숙주세포
본 발명은 또한 본 발명의 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입되는 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 숙주세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 특히 DNA가 본 발명의 NSC 단백질을 발현하도록 하는데 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 유전자 치료를 위해 투여하하는데 유용하다.
대장균이 숙주세포이고 벡터가 증폭되어 대장균내에서 많은 양이 생산되었을 때(예를 들어 JM109,DHSa,HB101, 또는 XLlBlue) 상기 벡터는 대장균에서 증폭되기 위해 "ori"를 가지고 있고 형질전환 대장균을 선별하기 위해 마커 유전자를 가지고 있어야 한다(예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 카나마이신, 클로람페니콜 등의 약물에 의해 선별되는 약물-저항성 유전자). 예를 들어 M13-시리즈 벡터, pUC-시리즈 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script, 등이 사용될 수 있다. 덧붙여서 pGEM-T, DIRECT, 및 pT7 도 상기 벡터 뿐 아니라 cDNA를 서브클로닝하고 추출하는데 사용될 수 있다. 벡터가 본 발명의 NSC 단백질을 생산하는데 사용되면 대장균에서 발현될 발현벡터는 대장균에서 증폭되기 위한 상기 특징을 가지고 있어야 한다. JM109,DHSa,HB101, 또는 XL1 Blue과 같은 대장균이 숙주세포로 사용되면 벡터는 대장균에서 효율적으로 원하는 유전자를 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들어 lacZ 프로모터(Ward etal., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), araB promoter (Better et al. , Science 240: 1041-3 (1988) ), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있어야 한다. 그런 점에서 pGEX-SX-1 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen),pEGFP 및 pET (이 경우에 숙주는 바람직하게는 T7 RNA 중합효소를 발현하는 BL21이다)는 예를 들어 상기 벡터 대신에 사용될 수 있다. 추가적으로 벡터는 또한 반백질 분비를 위한 단일 서열을 포함할 수 있다. NSC 단백질이 대장균의 주변 세포질로 분비되도록 하는 대표적인 신호 서열은 pelB 신호 서열이다(Lei etal., J Bacteriol 169: 4379 (1987) ). 벡터를 표적 숙주세포에 도입하는 방법은 예를 들어 칼슘 클로라이드 방법 및 일렉터로포레이션 방법을 포함한다.
대장균과 더불어, 예를 들어 포유류에서 유래한 발현벡터(예를 들어 pcDNA3 (Invitrogen) 및 pEGF-BOS (Nucleic Acids Res 18 (17): 5322 (1990)), pEF, pCDM8), 곤충 세포로부터 유래한 발현벡터(예를 들어,"Bac-to-BAC 배큘로바이러스 발현 시스템"(GIBCO BRL), pBacPAK8), 식물로부터 유래한 발현벡터(예를 들어pMHl,pee), 동물 바이러스로부터 유래한 발현벡터(예를 들어 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스로부터 유래한 발현벡터(예를 들어 pZIpneo), 효모로부터 유래한 발현벡터(예를 들어,"Pichia 발현 키트" (Invitrogen),pNVl l,SP-Q01), 및 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로부터 유래한 박현벡터는 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는데 사용될 수 있다.
CHO, COS 또는 NIH3T3 세포와 같은 동물 세포에서 벡터를 발현하기 위해서 벡터는 그러한 세포에서의 발현에 필요한 프로모터 예를 들어 SV40 프로모터(Mulligan etal., Nature 277:108 (1979) ), MMLV-LTR 프로모터, theEFla 프로모터(Mizushima etal., Nucleic Acids Res18 : 5322 (1990) ), CMV 프로모터 등을 가져야 하고 바람직하게는 형질전환체를 선별하기위한 마커 유전자(예를 들어 약물(예를 들어, 네오마이신, G418)에 의해 선별되는 약물 저항성 유전자). 이러한 특헝을 가진 알려진 벡터의 예는 에를 들어 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV 및 pOP13를 포함한다.
NSC 단백질 생산
덧붙여서 본 발명은 본 발명의 NSC 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. NSC 단백질은 NSC 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 갖는 숙주세포를 배양하여 준비될 수 있다. 필요에 따라, 방법은 유전자를 안정하게 발현하는데, 동시에 세포내에 유전자의 카피 수를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, DHFR 유전자(예를 들어 pCHO I)에 상보적인 벡터는 핵산 합성 경로가 제거되고 메소트렉세이트(methotrexate, MTX)에 의해 증폭되는 CHO 세포로 도입될 수 있다.
더 나아가, 유전자의 일시적인 발현의 경우 SV40(pcD, 등)의 복제 오리진(origin)을 포함하는 벡터가 염색체에 SV40 T 항원 제시 유전자를 포함하는 COS 세포로 형질도입되는 방법이 사용될 수 있다.
상기에서 수득된 본 발명의 NSC 단백질은 숙주 세포의 안 또는 밖(예를 들어 배지)으로부터 분리될 수 있고 실질적으로 순수한 균질의(homogeneous) 폴리펩타이로 순수분리될 수 있다. 명세서에서 사용되는 "실제적으로 순수하다"는 용어는 주어진 폴리펩티드에서 폴리펩티드가 실질적으로 다른 생물학적 거대분자로가 없다는 것을 의미한다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 건중량으로 75% 이상(예를 들어 80,85, 95, 또는 99% 이상) 순수하다. 순수한 정도(Purity)는 어떠한 적당한 표준 방법, 예를 들어 컬럼 크로마토그래피, 폴리아크릴아마이드 젤전기영동 또는 HPLC 분석과 같은 적합한 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 폴리펩티드 분리 및 정제 방법은 특정 방법에 제한되지 않는다; 사실 어떠한 표준 방법도 사용될 수 있다.
예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 필터, 한외여과(ultrafiltration), 염 침전, 용질 침전(solvent precipitation), 용매 추출, 증류(distillation), 면역침강, SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, 등전점 전기영동, 투석 및 재결정화가 적당하게 선택되어 NSC 단백질을 분리하고 정제하기 위해 결합될 수 있다.
크로마토그래피의 예는 예를 들어, 친화도 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤 여과, 역상 크로마토그래피, 픕착 크로마토그래피 등을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak etal., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ). 이러한 크로마토그래피는 HPLC 및 FPLC와 같은 액체 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 상기 방법에 의해 준비된 매우 정제된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 NSC 폴리펩티드는 정제 전 또는 후에 적당한 변형 효소로 선택적으로 변형되거나 부분적으로 결실될 수 있다. 유용한 단백질 변형 효소는 트립신, 키모트립신, 리실렌도펩티다제(lysylendopeptidase), 단백질 키나아제, 글루코시다제 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
항체
본 발명은 본 발명의 NSC 단백질에 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 모노클론 또는 폴리클론 항체와 같은 어떤 형태로든 사용될 수 있고 래빗과같은 동물을 본 발명의 NSC 단백질로 면역화시켜 수득되는 항혈청을 포함하고 폴리클론 및 모노클론 항체의 모든 클래스, 인간 항체 및 유전적 재조합에 의하여 생산된 인간화된 항체를 포함한다.
항체를 수득하기위한 항원으로 사용되는 본 발명의 NSC 단백질 어떤 동물 종으로부터나 수득될 수 있으나 바람직하게는 인간, 마우스 또는 래트와 같은 포유류, 보다 바람직하게는 인간으로부터 수득된다. 인간-유도 NSC 단백질은 명세서에 기재된 뉴클레오티드나 아미노산 서열로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따르면, 면역화 항원으로 사용되는 폴리펩티드는 NSC 단백질의 온전한 단백질 또는 일부 펩티드일 수 있다. 일부 펩티드는 예를 들어 본 발명의 NSC 단백질의 아미노(N) -말단 또는 카르복시(C) -말단 단편을 포함할 수 있다.
명세서에서 항체는 본 발명의 NSC 단백질의 전체 길이 또는 단편과 반응하는 단백질로 정의된다.
본 발명의 NSC 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 유전자는 명세서에 기재된 숙주세포를 형질전환시키는데 사용되는 알려진 발현벡터로 삽입될 수 있다. 바람직한 단백질 또는 그의 단편은 어떤 표준 방법에 의해서도 숙주 세포 밖이나 안으로부터 회복될 수 있고 이어서 항원으로 사용될 수 있다.
또는, NSC 단백질을 발현하는 전체 세포 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드는 항원으로 사용될 수 있다.
어떤 포유류 동물이든 항원으로 면역화될 수는 있지만 바람직하게는 세포 융합에 사용되는 모세포와 적합성이 고려된다. 일반적으로 쥐목(Rodentia), 토끼목(Lagomorpha) 또는 영장류(Primate)가 사용된다. 쥐목 동물은 예를 들어 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 토끼목 동물은 예를 들어 래빗을 포함한다. 영장류 동물은 예를 들어 짧은 꼬리 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 망토 개코 원숭이(sacred baboon) 및 침팬지(chimpanzee)와 같은 협비류(Catarrhini , old world monkey) 원숭이를 포함한다.
동물을 항원으로 면역화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
항원의 복강내 투여 또는 피하 투여는 포유류의 면역화를 위한 표준 방법이다. 보다 구체적으로 항체는 적당한 양의 인산염 완충 식염수(PBS), 생리적 식염수 등에 희석되고 현탁될 수 있다. 원한다면 항원 현탁액은 적당한 양의 프로인드 완전 면역반응 항진제(Freund's complete adjuvant)와 같은 표준 보조물질과 혼합되어 포유류 동물에 투여될 수 있다. 바람직하게는, 이어서 적당한 양의 프로인드 완전 면역반응 항진제와 혼합된 항체를 몇 번 4내지 21일 마다 수회 투여한다.
또한 적당한 담체가 면역화에 사용될 수 있다. 상기와 같은 면역화 후 혈청은 원하는 항체의 양에 증가가 있는지 표준 방법으로 검사된다.
본 발명의 NSC 단백질에 대한 폴리클론 항체는 혈청에서 원하는 항체의 증가가 확인된 면역화된 동물로부터 혈액을 수득하고 어떠한 기존의 방법으로든 혈액에서 혈청을 분리함으로써 준비될 수 있다. 폴리클론 항체는 폴리클론 항체를 함유하는 혈청 뿐 아니라 혈청에서 분리될 수 있는 폴리클론 항체를 포함하는 분획을 포함한다.
면역글로불린 G 또는 M은 예를 들어 본 발명의 NSC 단백질과 결합된 친화도 컬럼을 사용하여 본 발명의 NSC 단백질만을 인식하는 분획으로부터 준비될 수 있고 더 나아가 이 분획을 단백질 A나 G 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.
모노클론 항체를 준비하기 위해서, 면역 세포는 항원으로 면역화된 포유류로부터 수득되고 상기와 같이 혈청에서 원하는 항체의 수준이 증가되는지 체크되어 세포 융합하게 된다. 세포 융합에 사용되는 면역 세포는 바람직하게는 spleen으로부터 수득된다. 상기 면역세포와 융합되는 다른 바람직한 모세포는 예를 들어 포유류의 골수종 세포, 보다 바람직하게는 약물에 의해 융합된 세포의 선택을 위한 후천적 특성을 가지고 있는 골수종 세포를 포함한다.
상기 면역세포와 골수종 세포는 알려진 방법, 예를 들어 Milstein et al.의 방법에 따라 융합될 수 있다(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981)).
세포 융합에 의하여 수득된 하이브리도마는 HAT 배지, 하이포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 사이미딘(thymidine) 포함 배지와 같은 표준 선택 배지에 배양함으로써 선별될 수 있다. 세포 배양은 typically 원하는 하이브리도마를 제외한(비-융합 세포) 모든 다른 세포가 죽는데 충분한 시간인 며칠에서 몇 주 동안 HAT 배지에서 계속되된다. 그리고나서 표준 제한 희석이 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 스크리닝하고 클로닝하기 위해 수행된다.
상기 방법에 덧붙여, 인간이 아닌 동물이 하이브리도마를 준비하기 위해 항원으로 면역화되는 상기 방법에 덧붙여 EB 바이러스에 의해 감염된 것과 같은 인간 림프구가 NSC 단백질, NSC 단백질 발현 세포 또는 그들의 시험관내 세포파쇄액으로 면역화될 수 있다. 그리고나서 면역화된 림프구는 U266와 같이 계속 분열하여 NSC 단백질에 결합할 수 있는 원하는 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 생산하는 인간으로부터 유도된 골수종 세포와 융합된다(Unexamined Published Japanese Patent Application No. (JP-A) Sho 63-17688).
수득된 하이브리도마는 이어서 마우스의 복강으로 이식되고 복수는 추출된다. 수득된 단일클론 항체는 예를 들어 암모늄 설페이트 침전, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼, DEAE 이온 교환 크로마토그래피, 또는 본 발명의 NSC 단백질이 결합된 친화도 컬럼에 의하여 정제될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 발명의 NSC 단백질의 정제와 검출 뿐 아니라 본 발명의 NSC 단백질의 작용제와 길항제 후보로 사용될 수 있다.
덧붙여, 이 항체는 비-소세포성 페암을 포함하는 본 발명의 NSC 단백질과 관련된 질병의 항체 치료에 이용될 수 있다. 수득된 항체가 인체에 투여되면(항체 처리), 인간 항체 또는 인간와된 항체는 면역원성을 줄이는데 바람직하다.
예를 들어, 인간 항체 유전자의 repertory를 가진 형질전환 동물은 NSC 단백질, NSC 단백질을 발현하는 세포 또는 그의 세포 파쇄액과 같은 항체로 면역화될 수 있다. 항체 생산 세포는 그리고나서 동물로부터 수득되어 하이브리도마를 수득하기 위하여 골수종 세포와 융합된다. 이로부터 폴리펩티드에 대한 인간 항체가 준비될 수 있다(W092-03918, W093-2227, W094-02602, W094-25585, W096-33735, 및W096-34096 참조).
또는, 면역화된 림프구와 같은 항체를 생산하는 면역 세포는 암유전자에 의해 죽지않게 되고 모노클론 항체를 준비하는데 사용될 수 있다.
그러므로 모노클론 항체는 또한 유전공학적 방법을 사용하여 재조합적으로 준비될 수 있다(예를 들어, Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD (1990) ). 예를 들어, 항체를 암호화하는 DNA는 하이브리도마나 항체를 생산하는 면역화된 림프구와 같은 면역세포로부터 클로닝되어 적당한 벡터로 삽입되어 재조합 항체를 준비하는 숙주 세포로 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기와 같이 준비된 재조합 항체를 제공한다.
더 나아가, 본 발명의 항체는 항체나 본 발명의 하나 이상의 NSC에 결합하는한 변형된 항체의 단편일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab, F (ab') 2, Fv, 또는 H 와 L 사슬로부터 Fv 단편이 적당한 링커에 의해 접합되는 단일 사슬 Fv (scFv)일 수 있다. 보다 구체적으로 항체 단편은 파페인(papain)이나 펩신(pepsin)과 같은 항체를 처리하여 제작될 수 있다. 또는, 항체 단편을 암호화하는 유전자가 제작되어 발현벡터에 삽입되고 적당한 숙주세포에서 발현될 수 있다(예를 들어, Co et al. , J Immunol 152: 2968-76 (1994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96(1989) ; Pluckthun andSkerra, Methods Enzymol 178: 497-515(1989) ; Lamoyi, Methods Enzymol 121: 652-63(1986) ; Rousseaux etal., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986) ; Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991) 참조).
항체는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다양항 분자와 결합하여 변형될 수 있다. 본 발명은 그러한 변형된 항체를 제공한다.
변형된 항체는 항체를 화학적으로 변형하여 수득될 수 있다. 이러한 변형 방법은 당분에야서 통상적이다.
또는, 본 발명의 항체는 비인간 항체로부터 유도된 가변 부위와 인간 항체로부터 유도된 불변 부위 간의 키메릭 항체(chimeric antibody) 또는 비-인간 항체로부터 유도된 구조 부위(frame work region, FR) 및 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR), 인간 항체로부터 유도된 불변 부위를 포함하는 인간화된 항체로 수득될 수 있다. 그러한 항체는 알려진 기술을 이용하여 준비될 수 있다.
상기와 같이 수득된 항체는 균질하게 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체의 분리 및 정제는 일반적인 단백질에 사용되는 분리 및 정제방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어 항체는 친화도 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석(salting-out), 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동, 등전 포커싱(isoelectric focusing) 등의 컬럼 크로마토그래피를 적당하게 선택하고 결합하여 분리, 정제될 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ), 그러나 이에 국한되지는 않는다. 단백질 A 컬럼과 단백질 G 컬럼은 친화도 컬럼으로 이용될 수 있다. 사용되는 Exemplary 단백질 A 컬럼은 예를 들어 Hyper D, POROS, 및 Sepharose F. F. (Pharmacia)를 포함한다.
친화도는 제외하고 전형적인 크로마토그래피는 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 젤 여과, 역-상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 포함한다(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak etal., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ). 크로마토그래피 과정은 HPLC 및 FPLC와 같은 액체-상 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 흡광도 측정, 효소 표식 면역 정량법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 효소 면역법(enzyme immunoassay, EIA), 방사성 면역법(radioimmunoassay, RIA), 및/또는 면역형광(immunofluorescence)은 본 발명의 항체의 항원 결합 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. ELISA에서, 본 발명의 항체는 플레이트에 고정되고 본 발명의 NSC 단백질은 플레이트에 적용되고 그리고나서 항체 생산 세포의 상등액 또는 정제된 항체와 같이 원하는 항체를 포함하는 시료가 로딩된다. 그리고나서 일차 항체를 인식하고 알칼라인 포스파타제와 같은 효소로 표지된 이차 항체가 로딩되고 효소로 플레이트에 정온배치된다. 다음으로, 세척 후에 ρ-니트로페닐 포스페이트 phosphate와 같은 효소 기질이 플레이트에 추가되고 시료의 항원 결합 활성을 평가하기 위해 흡광도가 측정된다. C-말단이나 N-말단과 같은 NSC 단백질의 단편이 항체의 결합 활성을 평가하기 위한 항원으로서 사용될 수 있다.
BIAcore (Pharmacia)는 본 발명에 따른 항체의 활성을 평가하는데 사용될 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 항체를 본 발명의 NSC 단백질을 포함하고 있다고 여겨지는 시료에 노출시켜 항체와 단백질에 의해 형성된 면역 복합체를 검출하고 측정함으로써 본 발명의 NSC 단백질의 검출 또는 측정이 가능하게 한다.
본 발명에 따른 NSC 단백질의 검출 또는 측정방법이 특이적으로 단백질을 검출하거나 측정하기 때문에 상기 방법은 단백질이 사용되는 다양한 실험에 유용할 것이다.
다음의 실시예는 본 발명을 실시하고 사용하는 당업자에게 도움을 주기위한 것이고 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
다르게 정의되지 않으면, 명세서에서 사용되는 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속한 당업계의 일반적인 기술에 의해 이해되는대로 같은 의미를 갖는다. 명세서에 기술된 것과 비슷하거나 등가인(equivalent) 방법과 재료가 본 발명의 시험 또는 테스트에서 사용될 수 있을지라도, 적당한 방법과 재료는 아래에 기재되어 있다. 명세서에 인용된 어떠한 특허, 어떠한 특허 명세서 및 출판물이라도 참고문헌으로 삽입된다.
본 발명은 다음의 실시예에 상세하게 기재되어 있지만 이 실시예에 한정되지는 않는다.
환자로부터 수득된 조직(예를 들어 비-소세포성 폐암으로부터 상피세포)과 정상 조직은 병증 상태에서 차별적으로 발현되는 유전자를 확인하기 위해 평가되었다. 분석은 다음과 같이 수행되었다.
[실시예 1] 일반적인 방법
(1) 환자와 조직 시료
프라이머리(Primary) 폐암 조직은 엽절제술에 걸린 경험이 있는 37명의 환자로부터 설명에 근거한 동의(informed consent)를 구해 얻었다(46에서 79세의 15명 여성과 22명 남성; 평균 연령 66.0)
임상적 정보는 의학적 기록으로부터 입수했고 각각의 종양은 조직병리학적 아형에 따라 진단되었다; 37 종양 중 22가 선암으로 분류되었고, 14는 SCC 및 하나는 선편평세포암종(adenosquamous carcinoma)으로 분류되었다. 각각의 종양의 임상상태는 UICC TNM 분류에 의해 판단되었다. 모든 시료는 즉시 얼려 TissueTek OCT 배지(Sakura, Tokyo, Japan)에 담가 -80 ℃에 저장하였다.
(2) 레이저-캡처 미세절제, RNA 추출 및 T7-기반 RNA 증폭
암 세포는 보존된 시료로부터 레이저-캡처 미세절제를 사용하여 선택적으로 수득되었다(Kitahara et al. , Cancer Res 61: 3544-9 (2001) ). 전체 RNA의 추출과 T7-기반의 증폭이 이전에 기술된대로 수행되었다(Okabe etal., Cancer Res 61: 2129-37 (2001) ). 대조군 탐침으로, 정상적인 인간 폐 폴리 (A) RNA (CLONTECH)는 똑같은 방법으로 증폭되었다. 각각의 암 조직과 대조군으로부터 증폭된 RNA(aRNA)의 2.5 ug 분배량(aliquot)이 Cy5-dCTP과 Cy3-dCTP의 존재하에 각각 역으로 전사되었다.
(3) cDNA 마이크로 어레이 준비
유리 슬라이드에 스팟팅하기 위한 cDNA를 수득하기 위하여, RT-PCR이 상기의 각각의 유전자에 대해 수행되었다(Kitahara et al. , Cancer Res 61: 3544-9 (2001)). PCR 산물은 type VII 유리 슬라이드(Amersham Biosciences)에 Microarray Spotter Generation III (Amersham Biosciences)로 스팟팅되었다. 4,608 유전자들은 단일 슬라이드에 두 번 스팟팅되었다. 동일한 52개의 발현량이 일정한 유전자(housekeeping gene)와 2개의 음성대조군 유전자로 스팟팅된 슬라이드의 5개의 다른 세트가 준비되었다(전체 23,040 유전자).
(4) 혼성화와 데이터의 습득
혼성화, 세척 및 신호 검출는 이전에 기재된대로 수행되었다(Yanagawa et al. , Neoplasia 3: 395-401 (2001) ). 각각의 표적 스팟에 대한 Cy5 (종양)과 Cy3 (대조군)의 형광강도는 발현량이 거의 변화하지 않는(housekeeping) 52 유전자의 평균 Cy3/Cy5 비가 하나로 같도록 맞췄다. 낮은 신호 강도로부터 도출된 데이터는 믿을만 하지 않다. 그러므로 각 슬라이드의 신호 강도의 컷-오프(cut-off) 값이 측정되었다. 유전자는 Cy3과 Cy5 염료 둘다 컷 오프보다 더 낮은 신호 강도를 나타낼 때 그 이후의 분석으로부터 제외되었다.
(5) 유전자-발현 프로파일에 따른 37 NSCLC의 클러스터(cluster) 분석
유전자와 종양 둘 다에 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)방법이 적용된다. 37 시료의 분류에 있어 재현가능한 클러스터를 얻기 위해, 95%의 실험에서 유효한 데이터를 수득하고 발현 비율이 1.0 이상의 표준편차를 갖는 899가지 유전자가 선택되었다. 분석은 M. Eisen (http ://genome-www5. stanford. edu/ MicroArray/SMD/restech. html)에 의해 작성된 웹에서 사용가능한 소프트웨어("Cluster"과"TreeView")를 사용하여 수행하였다. 클러스터링 알고리즘을 적용하기 전에, 형광비는 각각의 스팟에 대해 로그로 변형되었고 되었고 데이터는 실험적 편향을 제거하기 위하여 각각의 시료에 대해 중간값 중심이었다(median-centered)
[실시예 2] 비-소세포성 폐암에서 임상적으로 관련있는 발현패턴을 갖는 유전자의 동정
모든 37 NSCLC 시료의 발현 프로파일로부터 수득된 데이터를 이용하여 2 차원적 계층적 클러스터링 알고리즘이 시료와 유전자 간의 유사성을 분석하기 위해 이용되었다.
Cy3-또는 Cy5 형광 강도가 컷 오프 값 이하이면 이전에 기재된대로 유전자는 이후의 분석으로부터 제외되었고(Yanagawa et al. , Neoplasia 3: 395-401 (2001) ) 험된 cases의 95% 이상에서 유효한 값을 얻을 수 있었던 유전자는 선택되었다. 1. 0 미만의 표준편차가 관찰된 유전자 또한 제외되었다. 이러한 컷오프를 통과한 899 유전자는 더 분석되었다.
시료 축(수직)에서, 37 중에 39 시료(2 cases는 실험 과정의 재현성과 신뢰성을 입증하기 위해 2회 실험하였다)는 발현 프로파일에 따라 두개의 주요 군으로 클러스터링되었다. 나무모양그림(dendrogram)은 개인 사이의 발현 패턴의 유사성을 나타낸다. 가지가 짧을수록 유사성은 더 커진다. 독립적인 실험에서 표지되고 혼성화된 두 개의 경우(Nos. 6과 12)는 같은 군안에서 가장 가깝게 클러스터링 되었다. 분석에 따르면, 유전자는 슬라이드 글라스의 다른 위치에 스팟팅된 동일한 유전자의 근접한 줄로 클러스터링 되었다(데이터 제시 안됨). 37 중에, 22 선종은 하나의 주요 군으로 클러스터링되었고 14 SCC는 다른 군으로 클러스터링되었다. 단일한 선편평세포암(No. 25)은 SCC군으로 포함되었다. 분명히, 선암과 SCC는 병인학적(etiological) 차이의 분자적 성격을 밝혀줄 특이적이고 상이한 유전자 발현 프로파일을 가지고 있는 것으로 나타났다.
NSCLC에서 하향-조절되는 유전자를 찾기 위하여 발현이 NSCLC의 70% 이상에서 0.2 배 미만 또는 그 이하로 감소되는 유전자가 스크리닝되었다, NSCLC에서 806 하향-조절 유전자가 확인되었는데 이는 종양 억제 작용을 가질 수 있고 잠재적으로 미래의 유전자 치료를 위해 사용될 수 있다(표 참조). 전체, NSCLC의 50% 이상에서 5.0보다 더 큰 Cy5/Cy3 비를 갖는 582 개의 상향-조절되는 유전자(표 2)가 확인되었다. 표에서 NSCLC의 70% 이상에서 5 배의 발현을 나타내는 유전자는 잠재적인 진단마커이고 케이스(case)의 50% 이상에서 5배 과발현된 것들은 약물의 잠재적인 표적이다. 약물의 표적으로, 케이스의 33%-50% 사이에 데이터가 존재하는 유전자 또한 선택되었고 NSCLC의 90% 이상에서 5배 더 높은 발현을 나타내는 60개의 유전자가 추가적으로 결정되었다(표 3). 이후의 선별을 위한 기준은 다음과 같다: (1) 혈청에서 검출가능한 종양 마커: 인간 고환, 난소 및 태아 조직에서만 발현을 나타내는 유전자; (2) 객담에서 검출가능한 종양 마커: airway의 조직에서 발현을 나타내지 않는 유전자 (즉 폐, 기관 및 침샘) ; 및 (3) 치료 표적: 간이나 신장 같은 인간의 생체 기관에서 발현을 나타내지 않는 유전자. 이러한 유전자의 정상 조직의 분포의 데이타가 23040 인간 유전자를 포함하는 cDNA 마이크로어레이에 의해서 25명의 성인과 4명의 태아 인간 조직에의 발현 프로파일로부터 수득되었다.
[실시예 3] 비-소세포성 폐암 세포 성장을 억제하는 분자 표적의 동정과 특성화
암 세포의 성장, 증식 및 생존을 조절하는 새로운 분자 표적을 동정하고 특성화하기 위해서 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 기술이 다음과 같이 표적 유전자를 선별하는데 적용되었다.
(1) 전체-길이 서열의 동정
마이크로어레이에서 Cy5/Cy3의 높은 신호 강도비를 나타내는 유전자의 전체-길이 서열은 데이터 베이스를 스크리닝하고 공급자 추천에 따라 마라톤 cDNA 증폭 키트(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 cDNA 말단의 5'빠른 증폭(rapid amplification)으로 측정되었다.
cDNA 주형은 유전자 측이적인 역방향 프라이머와 키트에서 제공된 AP1 프라이머로 인간 고환 mRNA (BD Biosciences Clontech)로부터 합성되었다. 뉴클레오티드 서열은 제조자 지시사항에 따라 ABI PRISM 3700 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 측정하였다.
(2) 노던 블럿 분석(Northern blot analysis)
마이크로어레이에서 검사를 위해 선택된 유전자 각각에 해당하는 32P-표지된 PCR 산물은 인간 다중-조직 블럿(multiple-tissue blots, BD Biosciences Clontech)과 혼성화되었다. 전혼성화(Prehybridization), 혼성화 및 세척이 공급자 추천사항에 따라 수행되었다. 블럿은 -80℃에서 24-168 시간동안 강화 스크린에서 방사선 자동사진(utoradiograph)이 마련되었다.
조직 분포와 유전자 각각의 크기를 측정하기 위하여 인간 다중 조직 노던 블럿 분석이 인간 cDNA를 탐침으로 사용하여 측정되었고(도 4), 각 유전자에 대해 다음의 결과를 얻었다:
NSC 807: 태반과 고환에서 단일한 4.4 kb mRNA가 발견되었다; NSC810 : 고환에서 단일한 3.lkb mRNA가 발견되었다;
NSC 811: 태반과 혀에서 2.4와 2.7kb mRNA가 발견되었고 약한 발현이 신장, 간, 부신, 방광, 뇌(전체), 임파절, 전립선, 위, 갑상선 및 기관지에서 검출되었다;
NSC 822: 심장, 간 및 고환에서 단일한 3kb mRNA가 발견되었다;
NSC825 : 고환와 척수에서 단일한 4.3kb mRNA가 발견되었다;
NSC 849: 태반, 전립선 및 기관에서 단일한 1.4kb mRNA가 발견되었다;
NSC 855: 태반, 전립선 및 기관에서 3.6kb mRNA가 발견되었다;
NSC 859: 골격근과 림프절a에서 2.lkb 전사체의 약한 발현이 검출되었다.
NSC 885: 고환에서 단일한 5.Okb mRNA가 발견되었다;
NSC 895: 태반, 위 및 기관에서 단일한 1.5 kb mRNA가 발견되었다;
NSC 903: 고환에서 단일한 2.7 kb mRNA가 발견되었고 흉선, 소장, 대장 및 골수에서 약한 발현이 검출되었다;
NSC 904: 고환와 골격근에서 단일한 4.4 kb mRNA가 발견되었다;
NSC 905: 심장, 골격근, 간, 위 및 혀에서 단일한 2.5 kb mRNA가 발견되었고 태반와 갑상선에서 약한 발현이 검출되었다;
NSC 915: 고환에서 단일한 1.5 kb mRNA가 발견되었다 ;
NSC 948: 신장, 간, 태반, 위, 갑상선, 혀 및 기관에서 단일한 3.8 kb mRNA가 발견되었다;
NSC 956: 심장, 골격근, 고환, 위, 갑상선 및 부신에서 단일한 2.1 kb mRNA가 발견되었고 약한 발현이 간, 췌장, 흉선, 전립선 및 척수에서 검출되었다;
NSC 994: 골격근과 고환에서 단일한 3.3 kb mRNA가 발견되었고 심장, 간 및 췌장에서 약한 발현이 검출되었다;
NSC 1000: 단일한 3.5kb mRNA가 뇌, 췌장, 전립선 및 고환에서 발견되었고 , 위, 척수 및 부신에서 약한 발현이 검출되었다;
NSC 1066: 단일한 3.6kbmRNA가 골격근 및 고환에서 발견되었다;
NSC 1075: 단일한 1. 9kbmRNA가 고환에서 발견되었다;
NSC 1107: 단일한 2.2kbmRNA가 고환에서 발견되었다;
NSC1131 : 1.6 및 1.4kb 전사체가 고환에서 발견되었다;
NSC 1141: 단일한 2.9kbmRNA가 태반에서 발견되었고, 전사체의 약한 발현이 골격근 및 고환에서 검출되었다;
NSC 1164: 단일한 5.2kbmRNA가 뇌 및 부신에서 발견되었다;
NSC 1183: 단일한 2.OkbmRNA가 골격근 및 심장에서 발견되었다;
NSC 1201: 7.8kb 전사체의 약한 발현이 심장, 골격근, 척수, 전립선, 고환, 갑상선, 비장, 림프절, 기관, 부신에서 발견되었다;
NSC 1240: 5.7kb의 약한 전사체가 위, 척수 및 림프절에서 발견되었다;
NSC 1246: 단일한1. 4kbmRNA가 고환에서 발견되었다;
NSC 1254: 단일한 3.0kbmRNA가 고환에서 발견되었다;
NSC 1265: 3.Okb 전사체의 약한 발현이 위에서 발견되었다;
NSC 1277: 단일한1. 8kbmRNA가 고환에서 발견되었다;
NSC 1295: 단일한 3.5kbmRNA가 백혈구, 림프절 및 골수에서 발견되었다;
NSC 1306: 단일한 7.4kbmRNA 가 심장 및 골격근에서 발견되었다;
NSC 1343: 단일한 4.7kbmRNA가 태반 및 골격근에서 발견되었다;
NSC 1362: 단일한 3.6kbmRNA 가 뇌 및 전뇌에서 발견되었다;
NSC 1389: 단일한 0.9kbmRNA가 혀에서 발견되었다;
NSC 1399: 단일한 0.9kbmRNA 가 태반에서 발견되었다;
NSC 1406: 단일한 2.4kbmRNA 가 심장, 골격근 및 전립선에서 발견되었다;
NSC 1413: 단일한 4.OkbmRNA 가 간 및 전립선에서 발견되었다;
NSC 1420: 단일한 2.8kbmRNA 가 고환에서 발견되었다.
반 정량적인 RT-PCR 분석
NSCLC의 50% 이상에서 5배 또는 그 이상의 mRNA 발현수준의 증가는 이전에 기재된대로 반 정량적인 RT-PCR에 의하여 확인되었다(Akashi et al. Int J Cancer 88: 873-80 (2000) ). 전체 RNA는 제조자의 프로토콜에 따라 Trizol 시약(Life Technologies, Inc. , Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 배양세포와 임상 조직으로부터 추출되었다. 추출된 RNA는 DNase I (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)으로 처리되었고 Superscript II 역전사 효소(Life Technologies, Inc. )로 올리고(dT)l2 l8 프라이머를 사용하여 단일-가닥 cDNA로 역전사되었다. PCR 증폭을 위해 각각의 단일-가닥 cDNA의 적정 희석이 정량적인 대조군으로, 베타-액틴(ACTB) 또는 베타-2-마이크로글로불린을 모니터링함으로써 준비되었다. 모든 반응은 94 ℃에서 2분 동안 변성, 이어서 2분 동안 18 (ACTB 또는 B2 or 25-30 주기(본 발명의 각각의 유전자에 대해) of 94 C for 30, 58-62 C for 30s and 72 C for 45s on GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems). 프라이머 서열은 표 4에 나열되어 있다.
폐암 환자로부터 수득된 암 조직에서 각각의 유전자의 발현(도 2)은 반-정량적 RT-PCR에 의하여 확인되었다. 결과는 다음과 같다:
NSC 807 : NSC 807 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 810 : NSC 810 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 6명에서);
NSC 811 : NSC 811 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서 );
NSC 812 : NSC 812 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 15명 모두에서 );
NSC 816 : NSC 816 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 820 : NSC 820 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서 );
NSC 822 : NSC 822 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 3명에서 );
NSC 824 : NSC 824 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서 );
NSC 825 : NSC 825 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 12명 모두에서 ) ;
NSC 830 : NSC 830 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 7명에서);
NSC 837 : NSC 837 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 7명에서 );
NSC 840 : NSC 840 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서 );
NSC 841 : NSC 841 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 9명에서 );
NSC 842 : NSC 842 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 7명에서);
NSC 846 : NSC 846 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 849 : NSC 849 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 7명에서 );
NSC 850 : NSC 850 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서 );
NSC 853 : NSC 853 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 854 : NSC 854 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서 );
NSC 855 : NSC 855 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11 중 10명에서 );
NSC 857 : NSC 857 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서 );
NSC 859 : NSC 859 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서 );
NSC 861 : NSC 861 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 5명에서);
NSC 864 : NSC 864 발현은 상향조절되었고 반-정량적 RT-PCR에 의해 확인되었다(NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 870 NSC 870 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 10명에서);
NSC 871 NSC 871 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 13명 중 12명에서);
NSC 872 NSC 872 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 12명 중 9명에서)
NSC 881 NSC 881 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 882 NSC 882 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 7명에서);
NSC 884 NSC 884 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 885 NSC 885 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 889 NSC 889 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 893 NSC 893 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 7명에서);
NSC 895 NSC 895 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 898 NSC 898 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 901 NSC 901 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 14명 모두에서);
NSC 902 NSC 902 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 903 NSC 903 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 904 NSC 904 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 7명에서);
NSC 905 NSC 905 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 13명 모두에서);
NSC 909 NSC 909 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 13명 중 9명에서);
NSC 912 NSC 912 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 915 NSC 915 발현이 상향조절되었다(NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 917 NSC 917 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 920 NSC 920 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 921 NSC 921 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 924 NSC 924 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 929 NSC 929 발현은 상향조절되었다(NSCLC 환자 12명 중 10명에서);
NSC 930 NSC 930 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 933 NSC 933 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 934 : CIT. NSC 934 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 936 NSC 936 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 938 NSC 938 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
SC 940 NSC 940 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 2명에서);
NSC 944 NSC 944 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 947 NSC 947 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 948 NSC 948 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 956 NSC 956 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 957 NSC 957 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 958 NSC 958 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 963 NSC 963 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 964 NSC 964 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 965 NSC 965 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 10명에서);
NSC 966 NSC 966 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 3명에서);
NSC 970 NSC 970 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 12명 중 7명에서);
NSC 972 NSC 972 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 973 NSC 973 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 3명에서);
NSC 974 NSC 974 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 975 NSC 975 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 12명에서);
NSC 980 NSC 980 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 984 NSC 984 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 989 NSC 989 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9 모두에서);
NSC 990 NSC 990 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 4명에서);
NSC 991 NSC 991 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 3명에서);
NSC 994 NSC 994 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1000 NSC1000 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 13명 중 12명에서).
NSC 1002 NSC 1002 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1003 NSC 1003 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1012 NSC 1012 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1015 NSC 1015 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명에서);
NSC 1016 NSC 1016 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1018 :NSC1018 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 3명에서);
NSC 1023 NSC 1023 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 12명 중 7명에서);
NSC 1026 NSC 1026 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 7명에서);
NSC 1027 NSC 1027 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 5명에서);
NSC 1030 NSC 1030 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1034 NSC 1034 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 5명에서);
NSC 1037 NSC 1037 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 1038 NSC 1038 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 6명에서);
NSC 1047 NSC 1047 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 4명에서);
NSC 1049 : 상향조절된 NSC 1049가 검출되었다(NSCLC 환자 6 모두에서);
NSC 1052 NSC 1052 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1057 : NSC 1057 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1058 NSC 1058 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 1059 NSC 1059 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1064 NSC 1064 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 13명 모두에서);
NSC 1066 NSC 1066 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 1067 : NSC 1067 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1071 NSC 1071 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1072 NSC1072 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 7명에서);
NSC 1075 NSC 1075 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 1077 NSC 1077 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 8명에서);
NSC 1078 NSC 1078 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1086 NSC1086 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 10명에서);
NSC 1089 NSC 1089 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 1090 NSC 1090 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 3명에서)
NSC 1103 NSC 1103 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 1107 NSC 1107 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1109 NSC 1109 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1113 NSC 1113 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 10명에서);
NSC 1116 NSC 1116 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1125 NSC 1125 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명에서);
NSC 1131 : 상향조절된 NSC 1131의 발현이 검출되었다(NSCLC 환자 6명 중 2명에서);
NSC 1133 NSC 1133 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1136 NSC 1136 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1141 NSC 1141 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 6명에서);
NSC 1142 : 상향조절된 NSC 1142 발현이 검출되었다(NSCLC 환자 11명 중 9명에서);
NSC 1157 NSC 1157 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 1명에서);
NSC1162 NSC1162 발현이 상향조절되었다(NSCLC 환자 10명 중 9명에서)
NSC 1164 NSC 1164 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1167 NSC 1167 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1169 NSC 1169 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 3명에서)
NSC 1173 NSC 1173 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 5명에서);
NSC 1176 NSC 1176 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1183 : up-regulationof NSC 1183 was detected (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1184 NSC 1184 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1185 : up-regulationof NSC 1185 was detected (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1191 NSC 1191 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 1195 :
NSC 1195 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 5명에서);
NSC 1196 : NSC 1196 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6 모두에서);
NSC 1201 : NSC 1201 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 1205 : NSC 1205 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 7명에서);
NSC 1207 : NSC 1207 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 1210 : NSC 1210 was and up-regulated (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 1214 : NSC 1214 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 7명에서);
NSC 1234 : NSC 1234 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 1236 NSC 1236 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 6명에서)
NSC 1237 NSC 1237 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1238 NSC 1238 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 6명에서);
NSC 1240 NSC 1240 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1242 NSC 1242 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 4명에서);
NSC 1246 NSC 1246 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 6명에서);
NSC 1247 NSC 1247 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 5명에서);
NSC 1250 NSC 1250 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명에서);
NSC 1254 NSC 1254 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명에서);
NSC 1265 : 상향조절된 NSC 1265가 검출되었다 (NSCLC 환자 5명 중 4명에서);
NSC 1273 : 상향조절된 NSC 1273가 검출되었다(NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1277 NSC 1277 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1279 NSC 1279 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1288 NSC 1288 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 1289 NSC 1289 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 1290 NSC 1290 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1292 NSC 1292 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1293 : 상향조절된 NSC 1293 의 발현이 검출되었다(NSCLC 환자 6명 중 4명에서);
NSC 1294 : NSC 1294 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 1295 : NSC 1295 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 5명에서);
NSC 1299 : 상향조절된 NSC 1299 발현이 검출되었다(NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1302 : NSC 1302 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1306 : 상향조절된 NSC 1306 발현이 검출되었다(NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1309 NSC 1309 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 9명에서);
NSC 1310 NSC 1310 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 9명에서);
NSC 1315 NSC 1315 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 1320 NSC 1320 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 5명에서);
NSC 1323 NSC 1323 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1325 NSC 1325 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 2명에서);
NSC 1328 NSC 1328 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 1337 NSC 1337 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 모두에서);
NSC 1345 NSC 1345 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 3명에서);
NSC 1350 NSC 1350 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 6명에서);
NSC 1353 NSC 1353 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 3명에서);
NSC 1362 NSC 1362 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 6명에서);
NSC 1371 NSC 1371 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1375 NSC 1375 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1377 NSC 1377 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 5명에서);
NSC 1378 NSC 1378 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1384 NSC 1384 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 11명 중 8명에서);
NSC 1389 NSC 1389 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1390 NSC 1390 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 8명에서);
NSC 1391 NSC 1391 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 모두에서);
NSC 1394 NSC 1394 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 6명에서);
NSC 1395 NSC 1395 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 4명에서);
NSC1398 NSC 1398 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC 1399 NSC 1399 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 4명에서);
NSC 1403 NSC 1403 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 8명 중 6명에서);
NSC 1406 NSC 1406 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1407 NSC 1407 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 모두에서);
NSC 1410 NSC 1410 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 10명 중 5명에서);
NSC 1412 NSC 1412 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 9명 중 6명에서);
NSC 1417 NSC 1417 발현은 상향조절되었다 (NSCLC 환자 7명 중 3명에서)
NSC 1420: 상향조절된 NSC 1420 가 검출되었다(NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1422 NSC 1422 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 10명 중 4명에서);
NSC 1424 NSC 1424 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 6명 중 5명에서);
NSC 1435 NSC 1435 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 8명 중 4명에서);
NSC 1436 NSC 1436 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 7명 모두에서);
NSC 1439 NSC 1439 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 8명 중 모두에서);
NSC 1440 NSC 1440 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 9명 중 8명에서);
NSC1441 NSC 1441 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 11명 중 9명에서);
NSC 1444 NSCSC 1444 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 6명 중 4명에서);
NSC 1445 NSCSC 1445 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 7명 중 6명에서);
NSC 1447 NSCSC 1447 발현은 상향조절된다 (NSCLC 환자 7명 모두에서).
(3) 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 분석
3 내지 5 쌍의 역 뉴클레오티드(대조군)와 유전자 각각에 해당하는 안티센스 S-올리고뉴클레오티드가 준비되었다. 6-웰 또는 1Ocm 배양접시에 플레이팅된 네 개의 NSCLC 세포주 A549, NCI-H226, NCI-H522 및/또는 LC319가 리포펙틴 시약(Life Technologies, Inc. )를 사용하여 각 유전자에 해당하는 합성 S-올리고뉴클레오티드로 형질전환되었고 2일 동안 10%의 10% 우태야 혈청을 포함하는 배지에서 유지되었다. 그리고나서 세포들은 100% 메탄올로 고정되고 김자(Giemsa) 용액으로 염색되었다. 대조군에 비해 26 유전자에 대한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성을 억제하였다. 그러므로 이러한 유전자의 억제는 형질전환된 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것이 입증되었다. 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 서열과 대조군 역(reverse) 올리고뉴클레오티드는 표 5에 나타나 있다. MTT 분석은 당업계에 알려진 방법으로 3 회 수행되었다(Akashi et al. (2000) Int. J. Cancer 88: 873-80). 방법과 각각의 유전자에 대한 결과는 다음과 같다.
NSC 810: TTK ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO : 423) 및 TTK에 대한 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(SEQ ID NO : 424)가 합성되었다.
S-올리고뉴클레오티드 각각은 NSCLC 세포주 A549 과 LC319로 형질전환되었고 이는 TTK에 대해 가장 높은 발현 수준을 나타내었다. 형질전환 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 MTT 분석에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 억제하는 것이 분명히 확인되었다(도 2). 그러므로, TTK의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다. 상기 결과는 또한 초점 형성 (김자 염색)에 의하여 확인되었다(데이터 제시 안함).
NSC 811 : SDCI ; 세 개의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드(AS1 (SEQ ID NO : 425), AS2 (SEQ ID NO : 427) 및 AS4 (SEQ ID NO : 429) ) 및 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(Rl (SEQ ID NO : 426), R2 (SEQ ID N: 428) 및 SDC1에 해당하는 R4 (SEQ ID NO : 430))는 합성되어 각각 NSCLC 세포주로 형질전환되었다. 이는 SICl에 가장 높은 발현을 나타내었다. 형질전환 2일 후, 이러한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 MTT 분석에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 확실하게 억제하는 것으로 나타났다(도. 2). 그러므로, SDC1 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 나타났다. 상기 결과는 또한 초점 형성 (김자 염색)으로 확인되었다(데이터 제시 안함).
NSC 812: NMB ; 두 개의 효과적인 안티센스 S-oligonucleotides(AS1 (SEQ ID NO :431)와 AS2 (SEQ ID NO : 433) )및 NMB에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(Rl (SEQ ID NO : 432) 과 R2 (SEQ ID NO : 434) )가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 NSCLC 세포주 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었고 이는 NMB에 대해 가장 높은 발현을 나타내었다. 형질전환 2일 뒤에, 이러한 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 MTT 분석에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명하게 억제하는 것으로 입증되었다(도. 2). 그러므로, NMB의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 또한 초점 형성 (김자 염색)에 의하여 확인되었다(데이터 제시 안함).
NSC816 :PIR51 ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO :435) 과 PIR51에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R1 (SEQ ID NO :436) 가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 NMB에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(김자 염색) (자료 제시 안함). 그러므로 PIR51 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 825: ANLN ; 세 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 (AS1 (SEQ ID NO : 437), AS3 (SEQ ID NO : 439) 및 AS5 (SEQ ID NO : 441) )과 ANLN에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(Rl (SEQ ID NO : 438), R3 (SEQID NO : 440) 및R5 (SEQ ID NO : 442)) 가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 NMB에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(김자 염색) (자료 제시 안함). 그러므로 ANLN억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 841 : URLC2 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS4 (SEQ ID NO : 443) 및 AS5 (SEQ ID NO : 445)과 URLC2 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R4 (SEQ ID NO : 444) 및 R5 (SEQ ID NO : 446)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC2에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다 (자료 제시 안함). 그러므로 URLC2 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 857: TIGD5 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS3 (SEQ ID NO : 447) 및 AS4 (SEQ ID NO : 449)과 TIGD5에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R3 (SEQ ID NO : 448) 및 R4 (SEQ ID NO : 450)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 TIGD5에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 TIGD5 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 859: URLC3 ; 세 쌍의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS2 (SEQ ID NO :451), AS3 (SEQ ID NO : 453) 및 AS5 (SEQ ID NO :455)과 URLC3에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R2 (SEQ ID NO : 452), R3 (SEQ ID NO : 454) 및 R5 (SEQ ID NO : 456)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC3에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLC3 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 885 : BAG5 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 457) 및 AS2 (SEQ ID NO : 459)과 BAG5 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)Rl (SEQ ID NO: 458) 및 R2 (SEQ ID NO: 460)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 BAG5에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 BAG5 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 893:MPHOSPH1 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQID NO :461) 및 AS2 (SEQ ID NO : 463)과 MPHOSPH1에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R1 (SEQ ID NO : 462) 및 R2 (SEQ ID NO : 464)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 MPHOSPH1에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 MPHOSPH1 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 905:URLCl ; 세 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS2 (SEQ ID NO : 465), AS3 (SEQ ID NO : 467) 및 AS5 (SEQ ID NO : 469)과 URLCl에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R2 (SEQ ID NO : 466), R3 (SEQ ID NO : 468) 및 R5 (SEQ ID NO : 470)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLCI에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLCI 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 909:FLJ10468 ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 471)과 FLJ10468에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)Rl (SEQ ID NO : 472)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 FLJ10468에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전화 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 FLJ10468 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 920: CHAFIA ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 473) 및 AS4 (SEQ ID NO : 475)과 CHAFIA에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)Rl (SEQ ID NO : 474) 및 R4 (SEQ ID NO : 476)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 CHAFIA에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 CHAFIA 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 947: PKP3 ; 네 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 (AS1 (SEQ ID NO : 477), AS2 (SEQ ID NO : 479), AS3 (SEQ ID NO :481) 및 AS4 (SEQ ID NO : 483) )과 PKP3 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(Rl (SEQ ID NO : 478), R2 (SEQ ID NO : 480), R3 (SEQ ID NO: 482) 및 R4 (SEQ ID NO : 484)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 PKP3 에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 LC319로 형질전환되었다. 형질전환 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 PKP3 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 956:SIAHBPI ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 485) 및 AS2 (SEQ ID NO : 487)과 PKP3 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R1 (SEQ ID NO : 486) 및 R2 (SEQ ID NO : 488)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 SIAHBPI에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 SIAHBPI 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 994: DKFZP434E2318 ; 네 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 (AS1 (SEQ ID NO : 489), AS3 (SEQ ID NO :491), AS4 (SEQ ID NO : 493) 및 AS5 (SEQ ID NO : 495))과 DKFZP434E2318에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)(R1 (SEQ ID NO : 490), R3 (SEQ ID NO : 492), R4 (SEQ ID NO : 494) 및 R5 (SEQ ID NO : 496))가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 DKFZP434E2318에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 DKFZP434E2318 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1075: URLC4 ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS5 (SEQ ID NO : 497)과 URLC4에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R5 (SEQ ID NO : 498)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC4에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLC4 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1107: URLC8 ; 두 가지 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS 1 (SEQ ID NO : 499) 및 AS4 (SEQ ID NO : 501)과 URLC8 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군)R1 (SEQ ID NO : 500) 및 R4 (SEQ ID NO : 502)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC8에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLC8 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1113: URLC5 ; 두 가지 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO: 503) 및 AS2 (SEQ ID NO : 505)과 URLC8 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) Rl (SEQ ID NO: 504) 및 R2 (SEQ ID NO : 506)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC5에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLC5 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC1131 : SYNJ2BP ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 507)과 SYNJ2BP에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) R1 (SEQ ID NO : 508)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 SYNJ2BP에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 NCI-H226로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 SYNJ2BP 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1142: NAPG ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 509)과 NAPG에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) Rl (SEQ ID NO :510)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 NAPG에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 NAPG 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1183: BYSL; 세 개의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1(SEQ ID NO : 511), AS2(SEQ ID NO : 513), AS3(SEQ ID NO : 515) 과 BYSL에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) R1(SEQ ID NO : 512), R2(SEQ ID NO : 514), R3(SEQ ID NO : 516)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 BYSL에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549,NCI-H226 및 NCI-H522 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 BYSL 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1185:URLC6 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS4 (SEQ ID NO : 517) 및 AS6 (SEQ ID NO : 519)과 URLC6에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) R4 (SEQ ID NO : 518) 및 R6 (SEQ ID NO : 520)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 URLC6에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 NCI-H226 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 URLC6 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC1191 :COX17 ; 세 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS2 (SEQ ID NO :521), AS4 (SEQ ID NO : 523) 및 AS5 (SEQ ID NO : 525)과 COX17에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) R2 (SEQ ID NO : 522), R4 (SEQ ID NO : 524) 및R5 (SEQ ID NO : 526)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 COX17에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 COX17 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC 1273:FLJ32549 ; 두 가지의 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS1 (SEQ ID NO : 527) 및 AS2 (SEQ ID NO: 529)과 FLJ32549 에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) RI (SEQ ID NO : 528) 및 R2 (SEQ ID NO: 530)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 FLJ32549에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549, NCI-H226 및 NCI-H522 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 FLJ32549 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
NSC1389 : NMU ; 효과적인 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 AS (SEQ ID NO :531)과 NMU에 해당하는 역 S-올리고뉴클레오티드(대조군) R (SEQ ID NO : 532)가 합성되었다. 각각의 S-올리고뉴클레오티드는 NMU에 대해 가장 높은 발현을 나타내는 NSCLC 세포주인 A549 및 LC319로 형질전환되었다. 형질전환 2 일 후에, 안티센스 S-올리고뉴클레오티드는 초점 형성 (김자 염색)에 의해 대조군과 비교하여 세포 증식을 분명히 억제하는 것이 입증되었다(자료 제시 안함). 그러므로 NMU억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시키는 것으로 여겨진다.
(4) RNA 간섭 분석
포유류 세포에서 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNAs)의 합성을 일으키는 벡터-기반의 RNAi 시스템인 psiHlBX3.0이 NSCLC 세포에서 각각의 내생의 유전자 발현을 억제시키기 위해 사용되었다. 다섯가지 벡터는 유전자 각각의 표적 서열에 대해 다섯 가지의 상이한 19-염기 쌍 이중가닥 뉴클레오티드를 합성하기 위해 디자인되었다. 벡터들은 60-90% 이상의 형질전환 효율을 나타내는 리포펙타민 2000 시약(Invitrogene, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 NSCLC 세포주로 형질전환되었다. 세포들은 적당한 농도의 geneticin (G418)의 농도하에 5-9일 동안 배양되었다. 세포 수나 세포 생존(viability)은 3 회 김자 염색 및/또는 MTT 분석으로 측정되었다.
(5) 유세포 분석(Flow cytometry)
세포들은 I00-mm 배양 접시당 5 X 10 세포수의 밀도로 플레이팅되고 상기와 같이 siRNA-발현벡터로 형질전환되었다. 감염 24-48 시간 후에, 세포들은 트립신 처리되어 PBS에 회수된 후 70% 의 차가운 에탄올에서 30분 동안 고정되었다. 100 μg/ml RNase(Sigma Chemical Co. -Aldrich, St. Louis, MO)로 처리된 후에 세포들은 PBS내의 50 ug/ml 요오드화 프로피디움(propidium iodide, Sigma-Aldrich)로 염색되었다. 유세포 분석은 Becton Dickinson FACScan에서 수행되어 ModFit software(Verity Software House, Inc. , Topsham, ME)으로 분석되었다. 세포 주기의 GO/G1, S 및 G2/M 기에서 핵의 퍼센트와 sub-G1 군집은 20,000 언게이티드 세포(ungated cell) 이상에서 측정되었다. 세포사멸(Apoptosis) 또한 annexinV의 결합을 기초로 유세포 분석에 의해 측정되었다.
(6) RNAi
암 세포의 성장, 증식 및 생존을 조절하는 새로운 분자 표적을 확인하고 특성화하기 위해서, RNA 간섭 기술이 상기 과정을 통하여 선택된 각각의 후보 유전자의 내생 발현을 억제하기 위해 psiHlBX3.0 벡터로 수행되었다. 후보 유전자 각각에 대한 특이적인 방법과 결과는 다음과 같다: NSC 807: KOC1: 세 가지 효과적인 벡터 유전자를 표적으로 하는 19-염기쌍의 이중 가잗 서열의 합성을 일으키는 효과적인 벡터가 디자인되어 NSCLC 세포주인 A549 및 LC319로 형질도입되었다. 형질도입 5일 후에, 이러한 유전자에 대한 RNAi 벡터(No. 1)의 도입은 대조군과 비교하여 분명히 콜로니의 수를 억제하였고(도 3A 및 3B), 이는 KOC1 억제가 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 줄인다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 또한 초점 형성 분석 (김자 염색)으로 확인되었다(데이터 제시 안함).
NSC 810: TTK: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중 가닥 서열의 합성을 지시하는 세 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염하였다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 RNAi 벡터 (TTK-1)의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식을 명확히 억제하고 있음을 보이므로 (도 3A 및3A), 이는 TTK는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 의미한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음). 효과적인 TTKRNAi로 형질감염된 세포를 현미경에서 더 조사하여 상을 24 또는 48일마다 잡았다. TTKRNAi가 형질감염된 LC319 세포는 다핵 세포 형질로 보였고 완전한 세포 사멸이 일어났지만, EGFPRNAi로 형질감염된 세포는 단핵세포 형질을 보였다 (도 3C). 항-TTK 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의하여 LC319 세포에서 TTKRNAi에 의해 음성 TTK 단백질의 발현 및 그의 억제를 검출하였다 (도 3E).
NSC 825: ANLN: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 ANLN의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음). 두가지 효과적인 ANLNRNAi 중 임의의 것으로 형질감염된 LC319 세포는 다-핵세포 형질을 가지지만, EGFPRNAi로 형질감염된 세포는 단-핵세포 형질을 보어였다 (도 3C). 유세포분석기(flow cytometry)에 의해 결정된 ANLNRNAi로 형질감염된 세포의 세포주기 양상은 비정상적인 세포주기 및 배수성 (polyploidy)(> 4N DNA)을 보였다 (도 3 D).
NSC : URLC2: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 URLC2의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음). siRNA 형질감염 24 시간 후 유세포분석을 수행하였다. 결과, LC319 세포의 sub-Gl 집단이 28% 증가함을 검출하였다. URLC2-siRNA는 아넥신 V의 결합의 유세포 분석에 의해 측정되는 아포토시스(apoptosis)를 현저하게 유도하였다 (도 3D).
NSC 903: URLC9: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터의 도입은 콜로니의 수를 명확히 억제하므로 (도 3A 및 3B) 이는 URLC9의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC956 : SIAHBP1 : 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 SIAHBP1의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC 994: DKFZP434E2318: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 1)의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 DKFZP434E2318의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC 1107: URLC8 : 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 다섯 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 1)의 도입은 대조군에 비해 콜로니 수를 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 URLC8의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC1191 : COX17: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 2)의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 COX17D의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC 1246: SUPT3H: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 세 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 2)의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 SUPT3H의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음).
NSC 1389: NMU : 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 두 가지 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 2)의 도입은 MTT 분석에 의해 대조군에 비해 세포 증식이 명확히 억제되는 것으로 보이므로 (도 3A 및 3B) 이는 NMU의 억제는 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 감소시킨다는 것을 제시한다. 상기 결과는 또한 포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 확인되었다(결과 보이지 않음). 다음, siRNA 형질감염 24 시간 후 유세포분석을 수행하였다. 결과, LC319 세포의 sub-G1 populations이 34.5% 증가함을 검출하였다 (도 3D).
NSC 1395: FBN2: 상기 유전자를 표적으로 하는 19-염기 쌍 이중-가닥 서열의 합성을 지시하는 효과적인 벡터를 고안하고 NSCLC 세포주 A549 및 LC319로 형질감염시켰다. 형질감염 5일 후, 상기 유전자에 대한 상기 RNAi 벡터(No. 2)의 도입은 e포커스 형성 분석 (focus formation assay (김사 염색:Giemsa staining))에 의해 대조군에 비해 세포 증식을 명확히 억제하는 것으로 확인되었다(결과 보이지 않음).
(7) 사이토크롬 C 산화효소 (Cytochrome c oxidase) 활성
A549 세포에서 사이토크롬 C 산화효소 (CCO) 활성 및 COX17RNAi에 의한 그의 억제를 조사하였다. CCO 활성을 측정하는 방법을 설명하는 도식적인 도해는 도 3F에서 보인다. 구체적으로, 세포를 디기토닌 (digitonin) (Wako, Osaka, Japan)를 이용하여 미토콘드리아 및 다른 분획으로 분리하였다. 완충액 (lOmM Tris, 0.2mM EDTA, 0.05% n-dodecyl-b-D-maltoside, pH7.6)에서 사이토크롬 c (63 mM)을 제이철 사이토크롬 c을 제일철 사이토크롬 c로 전환하기 위하여 실내온도 (18℃)에서 30분간 12.5mM L (+) - 아스코르브산 (ascorbic acid)과 배양하였다. lmg/ml 미토콘드리아 단백질 용액 20 ㎕을 37℃에서 2 ml의 혼합액에 첨가하였다. CCO 활성을 위한 반응을 550nm에서 측정하였다.
순수 COX17 단백질이 인간 NSCLC 세포에서 사이토크롬 C 산화효소 (CCO) 활성을 가지고 있는지 명확히 하기 위하여, CCO 활성을 검출하기 위하여 효과적인 COX17 RNAi 벡터를 A549 세포주로 형질감염시켰다. 형질감염 2 또는 5 일후, COX 활성은 내인성 COX 17 유전자의 억제에 의해 감소하였다. 상기 결과는 인간 NSCLC에서 COX17에 의한 CCO 활성의 중요성을 확인한다 (도 3 F, G 및 H).
siRNA로 효과적인 합성 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 6에서 보이고 있다. 안티센스 S-올리고뉴클레오티드 및/또는 RNAi의 형질감염에 의한 억제가 암 세포의 성장, 증식 및 생존이 억제된 30 개의 유전자를 동정하였다.
(8) 면역세포화학적 분석 (Immunocytochemical analysis)
c-myc-His가 태그된 단백질을 준비하기 위하여 각 단백질의 C-말단에서 c-myc-His 에피토프 서열 (LDEESILKQE-HHHHHH)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제조하고 COS-7 세포로 형질감염하였다. 챔버 슬라이드에 접종된 일시적으로 형질감염된 COS-7 세포를 4% 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS로 고정하고, 4℃에서 3분 동안 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 투과되게 하였다. 비-특이적인 항체-결합 부위를 막기 위하여 실온에서 30 분 동안 세포를 블로킹 용액 (PBS에서 2% BSA)으로 덮었다. 그런 다음, 세포를 마우스 항-c-myc 항체 (블로킹 용액에서 1: 800으로 희석된)와 배양하였다. ECLIPSE E800 현미경(Nikon)에서 관찰하기 위하여 항체를 FITC가 접합된 고트 항-마우스 이차 항체로 염색하였다. 형질전환된 세포에서 c-myc이 태그된 단백질의 단백을 확인하기 위하여, 종래에 서술된 대로 웨스턴-블롯팅을 수행하였다 (Shiratsuchi et al. , Biochem Biophys Res Commun 247: 597-604 (1998)).
(9) 포유동물 세포에서 잠재적인 표적 유전자의 생성의 위치
포유동물 세포에서 상기 후보 유전자에 의해 코딩된 단백질의 세포내 위치를 조사하기 위하여, 각 단백질의 C-말단에 c-myc-His 에피토프 서열 (LDEESILKQE-HHHHHH)을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드, pcDNA3.1 (+) /c-myc-His로 COS-7세포로 형질감염시켰다. 항-c-myc 항체를 이용하여 형질감염도된 세포에서 단백질의 발현을 이뮤노블롯팅으로 확인하였다 (도 5A).
(10) 항-암 치료 및 진단을 위한 표적으로서 막횡단/분비 단백질의 선택
종양 세포의 표면에 과발현되어 있는 14 막횡단/분비 단백질을 스크리닝하였다. 상기 단백질은 암에 대한 수용체-표적으로/항체를 기본으로 하는 치료 및 진단을 위한 좋은 표적이 될 것으로 기대된다. 형질감염된 COS-7 세포에서 단백질의 발현 및 세포내 위치를 면역세포화학적 분석으로 확인하였다.
각 유전자에 의해 코딩된 단백질의 세포내 위치를 결정하기 위하여, c-myc-His 또는 Flag로 태그된 단백질을 발현하는 플라스미드로 COS-7 세포를 형질감염시켰다. 각 유전자에 대한 면역세포화학적 분석의 결과는 하기에 주어진다:
NSC 807:KOC1 : KOCl/c-myc-His 단백질은 주로 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 825 : ANLN : ANLN/c-myc-His 단백질은 주로 핵 및 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 841: URLC2 : URLC2/c-myc-His 단백질은 주로 핵 및 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 849: GJB5:GJB5/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A).
NSC 855: LNIR:LNIRYc-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A).
NSC 895: FAM3D:FAM3D/c-myc-His 단백질은 주로 세포질 과립, 골지 및 세포질막에서 검출된다 (도 5A). 웨스턴 블롯팅에 의해 배양액에서 FAM3D 의 분비를 검출하였다 (도 5B). 따라서, FAM3D 은 분비단백질로 여겨진다.
NSC 903: URLC9 : URLC9/c-myc-His 단백질은 주로 핵에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 915 : URLC10 : URLC 10/c-myc-His 단백질은 주로 세포질 과립 및 골지에서 검출되고 세포질막의 표면에서 점으로 검출된다 (도 5A).
NSC 948: TASK-2:TASK-2/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A).
NSC 956 :SIAHBP1: SIAHBP1/c-myc-His 단백질은 주로 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 994: DKFZp434E2318: DKFZp434E2318/c-myc-His 단백질은 주로 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 1000: PSK-1: PSK-1/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A).
NSC 1103: KCNK1:KCNKI/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A).
NSC 1107: URLC8: URLC8/c-myc-His 단백질은 주로 핵에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 1164: NPTX1: NPTX1/c-myc-His 단백질은 주로 세포질 과립에서 검출된다 (도 5A). 웨스턴 블롯팅에 의해 배양액에서 NPTXI의 분비를 검출하였다 (도 5B). 따라서, NPTXI은 분비단백질로 여겨진다.
NSC1191: COX17:COX17/c-myc-His 단백질은 주로 미토콘드리아에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC 1201: SLC7A1: SLC7Al/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막 및 골지에서 검출된다 (도 5A).
NSC 1246: SUPT3H: SUPT3H/c-myc-His 단백질은 주로 핵 및 세포질에서 검출된다 (결과 보이지 않음).
NSC1288: PTGFRN: PTGFRN/c-myc-His 단백질은 주로 세포질 막 및 골지에서 검출된다 (도 5A).
NSC 1295: ADAM8: ADAM8/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막에서 검출된다 (도 5A). 웨스턴 블롯팅에 의해 배양액에서 ADAM8의 3 가지 잘린 형태의 분비물을 검출하였다 (도 5B). 따라서, ADAM8은 분비 단백질로 여겨진다.
NSC 1389: NMU:NMU/c-myc-His 단백질은 주로 골지체에서 및 분비 단백질로 검출된다 (도 5A).
NSC 1420: CHDOL: CHDOL/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막 및 골지에서 검출된다 (도 5A).
NSC 1441: HSCOV: HSNOV/c-myc-His 단백질은 주로 세포질막 및 골지에서 검출된다 (도 5A).
(12) 세포 성장 분석 및 콜로니 형성 분석 (대장y formation assay)
표준 프로토콜에 따라 안정화된 형질감염체를 확립하였다.
구체적으로 타겟 유전자 (pcDNA3.1/myc-His) 또는 유전자의 상보가닥 (pcDNA3.1-안티센스)를 발현하는 플라스미드, 또는 mock 플라스미드(pcDNA3.1)를 COS-7 세포로 형질감염 후, 14일 동안 제네티신(G418)을 세포에 배양하였다. 그런 다음, 콜로니를 선택하고 웨스턴 블롯팅에 의해 유전자의 발현을 검출하였다. 확립된 안정화된 형질감염체는 항-c-myc 항체로 면역염색법에 의해 단클론임을 확인하였다 (결과 보이지 않음). COS-7 세포의 안정화된 형질전환체를 6-웰 마이크로타이터플레이터 (5X 104 cells/well)에 접종하고, 24, 48, 72, 96, 120 및 144 시간동안 항생제가 보충된 10% FBS를 포함하는 배지에서 유지하였다. 각 시점에서 세포증식활성을 Cell Counting 키트 (WAKO) 또는 MTT 분석을 이용하여 측정하였다.
(13) 안정화 형질전환체의 세포증식분석 및 자가분비분석(autocrine assay)
NSC 810: TTK ; 포유동물 세포 증식에 있어서 TTK의 효과를 결정하기 위하여외인성 TTK(COS-7-TTK1 및 2)을 발현하는 COS-7 세포를 확립하고 그의 성장을 mock 벡터 (TTK-mock)로 형질감염된 대조군 세포의 증식을 비교하였다. 도 6에서 보듯이, COS-7-TTK의 성장을 pcDNA3.1-TTK-c-myc-His 단백질의 발현수준과 일치하게 대조군 세포에 비교하여 현저히 촉진하였다. 세번의 독립적인 실험에 의해 결과를 확인하였다. COS-7-TTK 세포는 또한 대조군 세포와 비교하여 더 큰 콜로니를 형성하는 두드러진 경향을 보였다 (결과 보이지 않음).
NSC 841: URLC2 ; 포유동물 세포 증식에서 URLC2의 효과를 결정하기 위하여, 외인성 URLC2 (NIH3T3-URLC2-3 및 5)을 발현하는 NIH3T3 세포를 확립하고, 그의 성장을 mock 벡터로 형질감염 대조군 세포 (NIH3T3-mock)의 성장을 비교하였다. 도 6에서 보듯이, NIH3T3-URLC2 세포의 성장은 pcDNA3.1-URLC2-myc-His 단백질의 발현 수준과 일치하게 대조군 세포의 성장과 비교하여 현저히 촉진되었다. 세번의 독립적인 실험에 의해 결과는 확인되었다. NIH3T3-URLC2 세포는 또한 대조군 세포와 비교하여 더 큰 콜로니를 형성하는 두드러진 경향을 보였다 (결과 보이지 않음).
NSC 1389: NMU; 포유동물 세포 증식에서 NMU의 효과를 결정하기 위하여, 외인성 NMU (COS-7-NMU-2, 3 및 5)을 발현하는 COS-7 세포를 확립하고, 그의 성장을 mock 벡터로 형질감염 대조군 세포 (COS-7-AS-1 및 2; COS-7-mock)의 성장을 비교하였다. 도 6에서 보듯이, COS-7-NMU 세포의 성장은 pcDNA3.1-NMU-c-myc/His 단백질의 발현 수준과 일치하게 대조군 세포의 성장과 비교하여 현저히 촉진되었다. 네번의 독립적인 실험에 의해 결과는 확인되었다. COS-7-NMU 세포는 또한 대조군 세포와 비교하여 더 큰 콜로니를 형성하는 두드러진 경향을 보였다. 상기 결과는 과발현된 NMU는 포유동물 세포에서 형질전환 효과를 가진다는 것을 제시한다.
(14) 자가 분비 분석 (Autocrine assay)
세포 증식에서 NMU의 자가분비 기능을 확인하기 위하여, COS-7 세포를 최종 농도 1 ug - 50 ug (3 uM - 15 uM/ml)로 NMU의 25 아미노산 폴리펩티드 (Alpha diagnostic international: ADI)의 활성 형태를 포함하는 배양액에서 배양하였다. 같은 농도의 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 배지를 대조군으로 사용하였다. 7일 동안 48 시간 마다 폴리펩티드 또는 BSA를 첨가하였다. 24, 48, 72, 96, 120 및 144 시간의 시점에서 세포의 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다. COS-7 세포에서 NMU 단백질의 성장 촉진 효과를 확인하기 위하여, 항-NMU 항체를 3 uM/ml NMU-25를 포함한는 배양액으로 최종 농도 0.5 uM-7.5 uM/ml로 첨가하였다.
결과, NMU-25와 배양된 COS-7 세포는 농도 의존적인 방법으로 BSA의 것과 비교하여 더 크고 더 빠른 세포 증식을 보였다 (도 7A).
다음, 항-NMU 항체를 3 uM/ml NMU-25를 포함하는 COS-7의 배양액으로 0.5 uM-7.5 uM/ml의 농도로 첨가하였다. MTT 분석에 따라, NMU-25 및 항-NMU 항체를 배양한 COS-7 세포에서 농도 의존적인 방법으로 대조군과 비교하여 더 늦은 세포 증식을 나타냄을 보였다 (도 7B).
더욱이, 항-NMU 항체를 외인성 NMU를 과발현하고 있는 LC319 세포의 배양액에 같은 농도로 첨가하였다. MTT 분석에 의해, 항-NMU 항체를 배양한 LC319 세포는 농도 의존적인 방법으로 대조군과 비교하여 더 늦은 세포 성장을 보이는 것으로 증명된다 (도 7B).
(15) 면역조직화학적 분석(Immunohistochemical analysis)
정상 폐 및 NSCLC를 포함하는 임상 조직 샘플에서 단백질의 발현을 조사하기 위하여, ENVISION+ Kit/HRP (DAKO)를 이용하여 절편을 염색하였다.
구체적으로, 내인성 퍼옥시다제 및 단백질 블로킹 반응 후, 항-인간 항체를 일차 항체로 첨가하고 그런 다음 이차 항체로 HRP가 라벨된 항-래빗 IgG 로 조직 샘플을 처리하였다. 그런 다음, 헤마톡실린이 처리된 조직 표본을 대조염색하기 위하여 기질로서 색소원 (chromogen)을 첨가하였다.
NSCLC에서 TTK 단백질의 과발현을 확인하기 위하여, 먼저 NSCLC 세포주, A549, LC319 및 NCI-H522에서 단백질을 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 동정하였다 (도 8). 그런 다음, 면역조직화학적 염색을 하기 대로 각 유전자에 대해 수행하였다.
NSC 947: PKP3; 면역조직화학적 염색을 동결되고 OCT 배지에 묻힌 (embedded) 외과적으로 얻은 NSCLC (편평세포암, squamous cell carcinoma)에 항-PKP3 항체로 수행하였다. 모든 종양 조직 샘플의 세포질은 항-PKP3 항체로 주로 염색되었지만, 정상 폐 조직은 염색되지 않았다 (도 9).
NSC 1164: NPTX1; 면역조직화학적 염색을 동결되고 OCT 배지에 묻힌 (embedded) 외과적으로 얻은 NSCLC (편평세포암, squamous cell carcinoma)에 항-NPTXI 항체로 수행하였다. 모든 종양 조직 샘플의 세포질은 항-NPTXI 항체로 주로 염색되었지만, 정상 폐 조직은 염색되지 않았다 (도 9).
NSC 1295: ADAM8; 면역조직화학적 염색을 동결되고 OCT 배지에 묻힌 (embedded) 외과적으로 얻은 NSCLC (편평세포암, squamous cell carcinoma)에 항-ADAM8 항체로 수행하였다. 모든 종양 조직 샘플은 항-ADAM8 항체로 강하게 염색되었지만, 정상 폐 조직은 약하게 염색되었다 (도 9).
NSC 1389: NMU: 면역조직화학적 염색을 동결되고 OCT 배지에 묻힌 (embedded) 외과적으로 얻은 NSCLC (편평세포암, squamous cell carcinoma)에 항-NMU 항체로 수행하였다. 모든 종양 조직 샘플의 세포질은 항-NMU 항체로 주로 염색되었지만, 정상 폐 조직은 염색되지 않았다. 선암 (adenocarcinoma) 샘플에서, 관 세포(duct cell) 및 비늘모양 세포 악성종양 (squamous cell carcinomas)에서 NMU는 핵주위 특히, 세포질 과립에서 검출되었다 (도 9).
(16) 표적 유전자의 전-장 서열분석, 노던 블롯팅 및 반-정량적 RT-PCR 분석
34개의 정상 조직과 비교하여 NSCLC의 50% 이상에서 그들의 발현이 5-배 증가의 증가를 보인 과-발현된 유전자의 목록을 조합하여, 생존에 중요하지 않거나 대체되어 질 수 있는 생식 조직 또는 태아 기관을 제외하고 정상조직에서는 발현되지 않고 NSCLCs에서는 특이적으로 발현된 종양 마커 또는 치료 표적으로 642개의 후보 유전자를 선택하였다. 표적 유전자의 전장 서열은 EST 스크리닝으로 결정되고 그의 유전자 발현 양상을 반정량적 RT-PCR을 이용하여 종양 및 정상 조직에서 확인하였다.
새로운 유전자 URLC 1을 찾았다. 그의 뉴클레오티드 및 그에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 목록에서 하기 서열 번호로 보여진다:
뉴클레익 서열 아미노산 서열
URLC1 SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 2
상기에서 얻은 결과는 본 발명의 각각의 유전자에 대해 하기에 요약된다:
NSC 807:KOC1 ; 상기 유전자는 hnRNA K-상동(homology) (KH) 도메인 및 RNA 인식 모티브 (RNA recognition motif, RRM)를 코딩한다. IGF-II (IGF2) leader 3' mRNA의 5'UTR에 결합하는 KH 도메인의 기능은 후기 발달 (late development) 동안 IGF-II의 번역을 억제한다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자의 유용성을 제시한다.
NSC810 : TTK ; 상기 유전자는 S TKc 도메인을 코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 세린, 트레오닌 및 티로신에서 단백질을 인산화기키고 상기 인산화는 아마도 세포 증식과 관련되어 있을 것이다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다. 본 발명에 따라, 안정화된 형질감염체에서 발현된 TTK 단백질은 농도 의존적으로 COS-7 세포의 증식을 촉진한다. 상기 결과는 TTK의 과발현은 포유동물 세포에서 형질전환 효과를 나타냄을 제시한다. 상기 결과는 NSCLC에 대한 새로운 종양유전자임을 밝히고 TTK를 표적으로 하여 폐암을 치료하기 위한 유망한 치료 전략이 확립될 수 있음을 제시한다.
NSC811: Suc 1; 상기 유전자는 추정적인 band 4.1 homologues' 결합 모티브 (4.1m) 도메인을 코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면 프로테오글린칸, 신데칸 (syndecan)이고 이것은 세포외부기질 (extracellular matrix)에 대한 수용체로 작용하는 내재성막단백질이다. 이것은 막횡단 헤파란 설페이트프로테오글리칸 (transmembrane heparan sulfateproteoglycans)의 군에 속한다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 812: NMB ; 상기 유전자는 신호 펩티드 및 막횡단 도메인을 코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 봄베신(bombesin)과의 구성원인 뉴로메딘 B(neuromedin B)로 작용하고 이것은 폐암에 대한 자가분비 성장 인자이다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 816: PIR51; 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 핵에 위치하고 단백질에서 찾을 수 있는 도메인이 없다. 상기 단백질은 DNA- 및 RNA- 결합 단백질로 작용한다; DNA 재조합 및 수선에 관련된 RAD51 재조합효소 단백질과 상호작용한다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 825: ANLN ; 상기 유전자는 PH 도메인을 코딩하고 상기 단백질의 몇가지 추정적인 기능이 제시된다: (1) 이질성삼단위체 (heterotrimeric) G 단백질의 베타/감마 아단위와 결합; (2) 지질에 결합, 예, 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate); (3) 인산화된 Ser/Thr 잔기에 결합; 및 (4) 알려지지 않은 기작에 의해 막에 부착. 상기 유전자는 셉틴(septin)과 같은 절단 고랑 단백질(cleavage furrow proteins)과 상호작용하는 액틴 결합 단백질로 세포질분열에서 역할을 한다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 841: URLC2; 상기 유전자는 Jmjc 단백질 (큐핀(cupin) 금속성효소( metalloenzyme)의 부분인 도메인 과)코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 염색질(chromatin) 재편성 과정을 조절하는 알려지지 않은 기능을 가진 효소이다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다. 본 연구에 의해 URLC2의 억제는 LC319 세포의 아포토시스(apoptosis)를 유도하였다. 더욱이. 안정화된 형질감염체에서 발현된 URLC2 단백질은 농도 의존적으로 NIH3T3 세포의 성장을 촉진하였다. 상기 결과는 과발현된 URLC2는 포유동물 세포에서 형질전환 효과를 가지고 있음을 제시한다. 상기 결과는 URLC2는 URLC2의 새로운 종양유전자임을 밝히고 폐암을 치료하기위한 유망한 치료 전략으로 URLC2에 초점을 두어 확립될 수 있다.
NSC 849: GJB5; 상기 유전자는 간극 연접(gap junction) 단백질, 베타 5 (beta 5 (connexin31. 1))를 코딩한다. GJB5는 코넥신(connexin)과 (beta-type (group i) 아과)의 구성원이다. 하나의 간극 연접은 막횡단 채널, 코넥신의 빽빽하게 꽉찬 무리로 구성되고 이것을 통하여 낮은 분자량의 물질은 하나의 세포에서 이웃 세포로 확산된다고 보고되고 있다. 코넥손(connexon)은 코넥신의 육분자체(hexamer)로 구성된다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 면역세포화학적 분석에 의해 세포질막에서 주로 검출되었다. 정상 조직에서의 낮은 발현 및 NSCLC에서의 높은 발현은 상기 유전자는 NSCLC을 위한 진단 마커(즉, 혈청 또는 타액을 이용하는 진단) 및 치료 표적으로 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 855: LNIR; 상기 유전자는 신호 펩티드, 면역글로빈, 면역글로빈 C2 도메인 및 하나의 막횡단 도메인을 코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 막횡단 단백질은 종양세포의 표면에 과발현되지만 정상 세포에는 발현되지 않는 것으로 여겨진다. 따라서 상기 유전자는 수용체-표적 치료 또는 진단을 위한 좋은 타겟이 될 것이다.
NSC 857: TIGD5; 상기 유전자는 중심립 단백질 B (Centromere Protein B, CENP-B)을 코딩한다. CENP-B는 중심립에 위치하는 DNA-결합 단백질이다. 단백질의 N-말단 125 잔기안에, DNA-결합 도메인이 있고 이것은 17bp CENP-B 박스 서열에 해당하는 것에 결합한다. C-말단 59 잔기에서, CENP-B는 이합체(dimerization) 도메인을 가지고 있다. CENP-B 다이머 (dimer)는 루프 구조를 형성하는 DNA의 중간 신장(intervening stretch)으로 두개의 분리된 DNA 분자 또는 하나의 DNA 분자에 있는 두개의 CENP-B 박스에 결합한다. 상기 아과에 속하는 단백질은 곰팡이 및 선충류에서 발견되는 DNA 트랜스포손(transposons)과 관련이 있고, 더욱 멀게는 Tcl 및 marinertransposases와 관련있다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 또한 주요 포유동물 중심립 단백질 B와 매우 유사하다. 상기 유전자의 정확한 기능은 알려져있지 않다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 859: URLC3 ; 상기 유전자는 임의의 알려진 도메인을 코딩하지 않고, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 진핵생물의 번역 개시 인자 3 아단위(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit) (Homo sapiens)에 56 아미노산 이상 70% 유사성을 가진다. 상기 아단위는 40s 리보좀에 결합하고 메티오닐-tRNAi 및 RNA의 결합을 촉진한다(유사성에 의해). 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 885: BAG5; 상기 유전자는 BAG 도메인을 코딩한다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 BAG1-관련 단백질 과(BAG1-related protein family)의 구성원이다. 상기 유전자의 정상 조직에서의 낮은 발현, NSCLC에서의 높은 발현 및 상기 유전자의 억제에 의한 형질감염된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 새로운 약제 및 면역치료를 위한 새로운 진단 마커 및 표적으로 상기 유전자는 유용하다는 것을 제시한다.
NSC 893: MPHOSP1; 상기 유전자는 aKISc 도메인을 코딩하고 세포소기관의 세포내 수송 및 세포 분열에서 중요한 역할을 하는 미세소관-의존적인 분자 모터이다. 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질은 키네신-유사 단백질 과에 속하고 rab6a 및 rab6b의 구아노신-3 인산 (gtp)-결합된 형태와 상호작용한다. 상기 단백질은 골지 막 및 미세소관에 따른 관련된 소포의 수송을 조절하는 퇴행하는 rab6을 필요로하는 모터로 작용할 수 있다. 상기 단백질은 미세소관 양극-지시 운동성 (microtubule plus end-directed motility)을 가지고 있고 세포주기의 M-기 동안 인산화된다.
정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC895 : FAM3D ; 본 유전자는 그 기능이 밝혀진 상태일지라도, 분비 단백질로 생각되는 N-말단 부위에서 신호 펩티드 도메인을 가지는 단백질을 암호화한다. 본 단백질은 면역세포화학적 분석에서 본 단백질이 분비되었을 때, 주로 세포질성 미소체 및 골지체에서 검출되었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성 및 NSCLCs에서의 높은 발현은 본 유전자가 NSCLCs를 위한 진단 마커(즉, 혈청 또는 타액을 사용한 진단에서)로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 898: URLC7 ; 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 핵내에 위치하며 또한 상기 단백질내에 알려지지 않은 도메인이 존재하였다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 903: URLC9 ; 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 핵내에 위치하며 또한 상기 단백질내에 알려지지 않은 도메인이 존재하였다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 905:URLC1 ; 본 유전자는 여러 추정되는 기능들이 암시되는 TUDOR 도메인을 암호화한다: (1) RNA-결합 및 (2) 핵산 결합. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 909: FLJ10468 ; 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 핵내에 위치하며 또한 상기 단백질내에 알려지지 않은 도메인이 존재하였다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 915: URLC10 ; 본 유전자는 2 트랜스멤브레인 도메인을 암호화한다. 상기 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 GML에 낮은 유사성이 있는 부위를 가진다. 본 단백질은 주로 세포질성 미소체 및 골지체에서, 또한 면역세포화학적 분석에 의하여 세포막의 표면에 점으로서 검출되었다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 920:CHAF1A ; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다.
본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 DNA 복제상에서 히스톤 H3의 축적이 H4를 아세틸화시키는 것을 돕는 크로마틴 조립 인자 1(chromatin assembly factor 1)의 150 kDa 서브유닛을 가진다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 947: PKP3 ; 본 유전자는 ARM(armadillo/β-catenin-like repeats domain)을 암호화한다.
본 알마딜로 반복은 드로스피아 부분 극성 유전자 알마딜로(Drosphia segment polarity gene armadillo)에서 처음으로 확인된 대략 40 아미노산 길이의 일렬로 반복된 서열 모티프이다. 유사한 반복들이 포유류 알마딜로 유사체 β-카테닌, 연결 플라크 단백질인 플라코글로빈, APC(adenomatous polyposis coli) 종양 억제 단백질 및 수많은 다른 단백질에서 이후에 발견되었다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 단백질-단백질 상호작용을 매개하며, 알마딜로단백질 패밀리의 구성원인 플라코필린 3으로 기능한다.
정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다. 면역조직화학적 염색은 편평세포암 세포의 세포질에서 PKP3가 강하게 염색된다는 것을 입증하였다. 이들 데이터는 PKP3가 폐암을 치료하기 위한 가능성 있는 치료 및 진단 표적임을 암시한다.
NSC 948: TASK-2 ; 본 유전자는 이온 트랜스포터 도메인인 신호 펩티드(SOSUI)를 암호화한다.
본 유전자는 2 구멍-형성 P 도메인을 포함하는 포타슘 채널의 수퍼패밀리에 속하는 단백질을 암호화한다. 본 유전자의 mRNA는 주로 피질원세관 및 신장의 수집관에서 발현된다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 외부 pH에 대하여 고도로 민감하며, 이는 그 발현 패턴과 조합하여, 신장 포타슘 수송에 중요한 역할을 할수도 있음을 암시한다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 956 : SIAHBP1 ; 본 유전자는 핵산 결합 도메인으로서 알려진 RNA 인식 모티프(RRM) 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 Ro RNS-결합 단백질이다. 상기는 Ro RNPs의 기능을 활성화시키기 위하여 Ro RNPs와 상호작용한다.
본 단백질은 또한 FUSE(far upstream element) 및 FUSE-결합 단백질을 가지는 3중 복합체를 형성한다. 그것은 FUSE와의 결합을 거쳐 c-myc 리포터를 억제할 수 있다. 전사 인자 ⅡH는 또한 본 단백질의 표적으로 알려져 있으며, 또한 상기 단백질은 활성화된 전사를 억제한다. 본 유전자는 피부건조증 색소 질환과 연관되어 있다.
2개의 선택적으로 스플라이싱된 전사체 배리언트들이 다른 아이소폼을 암호화하는 본 유전자에 존재한다. 다중 폴리아데닐레이션 위치가 본 유전자에 존재하는 것으로 보인다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 991 : DOLPP1 ; 본 유전자는 트랜스멤브레인 도메인 및 산 포스파타제 호몰로그 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 994: DKFZP434E2318 ; 본 유전자는 BTB/POZ 도메인 및 Kelch 도메인을 암호화한다.
본 BTB/POZ 도메인은 단백질-단백질 상호작용 모티프인 것으로 알려져 있다. 본 BTB/POZ 도메인은 동일중합체성 이합체화(homomeric dimerization) 및 또한, 몇가지 경우, 이성중합체성 이합체화(heteromeric dimerization)를 매개한다. 여러 징크 핑거(zinc finger) 단백질의 POZ 도메인은 전사 억제를 매개하고, N-CoR 및 SMART을 포함하는 히스톤 디아세틸라제 코-리프레서 복합체의 성분들과 상호작용하는 것으로 보인다. 본 Kelch 도메인은 단백질-단백질 상호작용과 연관된 β프로펠러 도메인이며, 지콜레이트 옥시다제(gycolate oxidase)같은 약간의 효소 활성을 가진다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 1000: PSK-1 ; 본 유전자는 신호 펩티드(CUB 도메인, 스시 도메인(SCR repeat) 및 하나의 트랜스멤브레인 도메인)을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 5 스시(SCR) 도메인 및 세포외 CUB 도메인을 포함하는 부착 단백질인 쥐 Sez6와 매우 유사하다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1066: MCM8 ; 본 유전자는 다양한 세포 활성(AAA) 도메인 및 MCM(minichromosome maintenance protein) 도메인과 연관된 ATPase를 암호화한다.
정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1075: URLC4 ; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1103:KCNK1 ; 본 유전자는 2 구멍-형성 P 도메인을 포함하는 포타슘 채널 단백질의 수퍼패밀리에 속하는 단백질을 암호화한다. 본 유전자의 산물은 기능적 채널임을 나타내지는 않는다. 다른 비-구멍-형성 단백질은 기능적 채널로서 활성에 필요할 수 있다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1107: URLC8 ; 본 유전자는 이중 가닥 RNA 결합 모티프(DSRM) 도메인을 암호화한다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1113: URLC5 ; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1131: SYNJ2BP ; 본 유전자는 PDZ 트랜스멤브레인 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 PDZ 도메인을 포함하는 막-표적화 시그널링 단백질일 수 있다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1141:URLC11 ; 본 유전자는 9 트랜스멤브레인 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 트랜스멤브레인은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1142: NAPG; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다. NAPG에 의하여 암호화된, 예견된 312-아미노산 인간 단백질의 서열은 소의 γ-SNAP과 95% 동일하다. 본 NAPG 단백질은 혈소판 세포외 유출을 매개하고, 본 과정의 막 융합 경우를 조종한다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1164: NPTX1 ; 본 유전자는 펜탁신/C-반응성 단백질을 암호화한다. NPTZ1은 신경세포성 펜탁신 유전자 패밀리의 구성원이다. 신경세포성 펜탁신 1은 뱀 독인 타이폭신을 위한 결합 단백질을 암호화하는 쥐(rat) NP1과 유사하다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 면역세포화학적 분석에 의하여 주로 세포질성 미소체 및 골지체에서 검출되었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현은 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성 및 NSCLCs에서의 높은 발현은 본 유전자가 NSCLCs를 위한 진단 마커(즉, 혈청 또는 타액을 사용한 진단에서) 및 치료 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다. 면역조직화학적 염색은 선암 세포의 세포질에서 NPTX1이 강하게 염색된다는 것을 입증하였다. 이들 데이터는 NPTX1이 폐암을 치료하기 위한 가능성있는 치료 및 진단 표적임을 나타내었다.
NSC 1183: BYSL ; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 배아 이식에 중요한 트로피닌(TRO, trophinin) 및 타스틴(TASTIN)을 가진 세포 부착 분자 복합체를 형성하는 비스틴(bystin)의 기능을 가진다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1185: URLC6 ; 본 유전자는 징크 핑거(zinc finger) RNA 인식 모티프 도메인을 암호화한다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC1191 :COX17 ; 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 미토콘드리아 막사이 공간(유사성에 의하여)에 위치하며 또한 미토콘드리아에 구리를 수송하는 기능을 한다. 더욱이, 본 단백질은 사이토크롬 산화효소의발현에 요구된다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 1201:SLC7A1 ; 본 유전자는 14 트랜스멤브레인 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 아르기닌, 라이신 및 원형질막을 가로지르는 오르니틴을 수송하는 양이온성 아미노산 트랜스포터(ecotropic retroviral receptor)로서 기능하는 쥐의 Rec-1(Atrc 1)과 강한 유사성을 가진다. 본 단백질은 면역세포화학적 방법에 의하여 세포막 및 골지에서 주로 검출되었다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1240: FLJ00159 ; 본 유전자는 4 트랜스멤브레인 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1246: SUPT3H ; 본 유전자는 전사 촉발 인자 aD, a18kD 서브유닛을 암호화한다.
본 유전자에 의하여 암호화된 단백질을 포함하는 패밀리는 Spt3 효모 전사 인자 및 18kD 서브유닛의 인간 전사 촉발 인자 aD(TFaD-18)를 포함한다.
크리스탈 구조의 결정은 비정형적 히스톤 폴드를 나타내었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역 치료를 위한 표적으로 유용할 수 있음을 암시한다.
NSC 1254:FLJ10815 ; 본 유전자는 트랜스멤브레인 아미노산 트랜스포터 단백질을 암호화한다. 상기 트랜스멤브레인 부위는 UNC-47 및 MTR을 포함하는 많은 아미노산 트랜스포터에서 밝혀져 있다. UNC-47은 소포성 GABA(amino butyric acid) 트랜스포터(VGAT)를 암호화한다.
본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 AAAP(amino acid/auxin permease) 패밀리의 막 트랜스포터들과 약간 유사한 기능을 가진다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1265: SLC28A2 ; 본 유전자는 Na+ 의존 뉴클레오시드 트랜스포터를 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 퓨린 뉴클레오시드 및 유리딘을 수송하는 소듐 -연결 뉴클레오시드 트랜스포터 2로서 기능한다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1273: FLJ32549 ; 알려지지 않은 도메인이 본 유전자에 의하여 암호화되어 검출되었다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할수 있음을 나타낸다.
NSC 1288: PTGFRN ; 본 유전자는 신호 펩티드(6 면역글로불린 도메인 및 1개의 트랜스멤브레인 도메인)을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 친화도 상수보다 다소 리셉터 수를 감소시킴으로써, 그것의 특이적 fp 리셉터와 프로스타글란딘 2-α(pgf2-α)의 결합을 억제한다. 본 단백질은 프로스타글란딘 f2-α리셉터와 기능적으로 연결되어 있는 것 같다. 따라서, 본 단백질은 면역세포화학적 분석에 의하여 주로 세포막 및 골지체에서 검출되었다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것같다.
따라서, 본 단백질은 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1292:C17Orf26 ; 본 유전자는 3 트랜스멤브레인 도메인( 징크 트랜스포터(Zinc transporter) 도메인 및 신호 펩티드(SOSUI))을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1295: ADAM8 ; 본 유전자는 뱀 디스인테그린(disintegrins), 리프롤리신 패밀리 프로펩티드(Reprolysin family propeptide) 및 리프롤리신(M12B) 패밀리 징크 메탈로프로테아제(metalloprotease)에 상동적인 단백질을 암호화한다. ADAM 패밀리의 구성원들은 잠재적 부착 및 프로테아제 도메인 모두를 갖춘 독특한 구조를 가진 세포 표면 단백질이다. ADAM8의 세포외 부위는 메탈로프로테아제 및 디스인테그린 도메인들을 포함하는 출혈 뱀독 단백질에 현저한 아미노산 서열 상동성을 보인다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현은 본 유전자가 NSCLCs를 위한 진단 마커(즉, 혈청 또는 타액을 사용한 진단을 위하여) 및 치료 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다. 면역조직화학적 염색은 ADAM8이 선암 세포에서 강하게 염색된다는 것을 입증하였다. 이들 데이터는 ADAM8이 폐암을 치료하기 위한 가능성있는 치료 및 진단 표적임을 나타내었다.
NSC 1306: ABCA4 ; 본 유전자는 시그널 펩티드 및 AAA 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 막-관련 단백질은 ABC(ATP-binding cassette) 트랜스포터 수퍼패밀리의 구성원이다. 본 ABC 단백질은 세포외 및 세포내 막을 통하여 다양한 분자들을 수송한다. 본 ABC 유전자는 7개의 서브패밀리들로 나누어진다(ABC1, MDR/TAP, MRP, ALD, OABP, GCN20 및 White). 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 ABC 1 서브패밀리의 구성원이다. ABC1 서브패밀리의 구성원들은 다세포 진핵생물에서만이 발견된 주요한 ABC 수퍼패밀리를 포함한다. 본 단백질은 기질로서 N-레티닐리딘-PE(N-retinylidene-PE)를 사용하는 레티나 특이적(retina-specific) ABC 트랜스포터이다. 본 유전자 산물이 포토리셉터 세포 막을 통하여 필수적인 분자의 수송을 매개함을 나타냄으로써, 본 단백질은 오로지 레티나 포토리셉터 세포(retina photoreceptor cell)에서 발현된다. 본 유전자의 돌연변이는 스타가르트 병(Stargardt disease)을 가지는 것으로 진단된 환자들에서 발견되며, 또한 망막색소변성증(retinitis pigmentosa)-19 및 황반변성기-관련 2와 연관되어 있다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적 치료 또는 진단을 위한 좋은 표적으로 작용할 수도 있다.
NSC 1343: GPR49 ; 본 유전자는 류신이 풍부한 반복 N-말단 도메인 및 7 트랜스멤브레인 리셉터(로돕신 패밀리)인 신호 펩티드를 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 G 단백질-결합 리셉터 패밀리에 속하며, 그 구성원들은 류신-풍부 리셉터를 포함하는 큰 세포외 부위를 가진다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1362: SCAMP5 ; 본 유전자는 4 트랜스멤브레인 도메인들을 암호화한다.
본 유전자에 의하여 암호화된 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1389: NMU ; 본 유전자는 NMU 도메인을 암호화한다. 대부분의 활성 펩티드들 처럼, 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 더 큰 전구체 단백질로부터 단백질분해적으로 진행된다.
본 단백질의 성숙 펩티드는 8 내지 25 잔기 길이이며, 그것의 C-말단은 아미드화(amidated)되어 있다.
본 단백질은 근육 수축, 특히 위장관의 근육 수축을 자극하며, 식이를 억제한다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다. 본 연구에 따라, 본 NMU 단백질은 안정한 트랜스펙턴드(transfectant)에 의하여 배양 배지에 분비되었거나, 또는 상기 배지에 첨가된 활성형의 NMU 펩티드들은 투여량 의존 방식으로 COS-7 세포의 성장을 촉진하였다. 면역조직화학적 염색에 따라, 본 NMU 단백질은 선암 및 편평세포암 세포의 세포질에서 강하게 염색되었다. 이들 데이터는 NMU가 NSCLC를 위한 중요한 자가분비 성장 인자가 될 수 있음을 나타내었고, 또한 폐암을 치료하기 위한 가능성있는 치료 및 진단 전략은 NMU 리간드-리셉터 시스템에 촛점을 맞춤으로써 개발될 수 있음을 암시하였다.
나아가, NMU의 억제는 LC319 세포에서 세포사멸(apoptosis)를 유도하였다. 더욱이, 항-NMU 항체에 의한 NMU 단백질의 억제는 LC319 세포에서 대조군들과 비교하였을때 성장 억제를 유도하였다. 이들 결과는 폐암이 NMU를 표적화하는 항체 또는 siRNA를 사용하여 치료될 수 있음을 암시한다.
SC 1395: FBN2 ; 본 유전자는 칼슘-결합 EGF-유사(EGF CA) 도메인 및 EGF 유사 (분류되지않은 서브패밀리) 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 세포외 미세섬유(extracellular microfibrils)의 유지 및 형성을 조절할 수 있는 세포외 기질 단백질인 피브릴린(fibrillin) 2로서 기능한다. FBN2에서 돌연변이는 선천성 구축거미가락증(congenital contractual arachnodactyly)을 야기할 수 있다. 정상 조직내 본 유전자의 더 낮은 활성, NSCLCs에서의 높은 발현, 및 본 유전자의 억제에 의하여 트랜스펙션된 세포의 감소된 성장, 증식 및/또는 생존은 본 유전자가 새로운 진단 마커 및 새로운 약물 및 면역치료를 위한 표적으로서 유용할 수 있음을 나타낸다.
NSC 1420: CHDOL ; 본 유전자는 세포외 부분에서 C-타입 렉틴(lectins)의 특징을 나타내는 탄수화물 인식 도메인을 가진 타입 I 막 단백질을 암호화한다. 다른 단백질에서 본 도메인은 당단백질(glycoprotein)의 세포내이입 및 외인성 당-부하(bearing) 병원균과 연관되어있다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 핵 주변 부위에 우세하게 위치한다. 본 단백질은 면역세포화학적 분석에 의하여 세포막 및 골지체에서 주로 검출되었다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
NSC 1441:HSNOV1 ; 본 유전자는 내재성 막 단백질 DFU6 도메인을 암호화한다. 본 유전자에 의하여 암호화된 단백질은 면역세포화학적 분석에 의하여 주로 세포막 및 골지체에서 검출되었다. 본 트랜스멤브레인 단백질은 정상 세포에서가 아닌 종양 세포 표면에서 과발현된 것 같다. 따라서, 본 단백질은 리셉터-표적화 치료 또는 진단에 좋은 표적으로서 이용할 수 있다.
레이저-캡쳐 절단 및 게놈-전체의 cDNA 마이크로어레이의 조합을 통하여 얻어진 본 명세서에 기술된 비-소세포성 폐암상의 유전자 발현 분석은 비-소세포성 폐암의 예방 및 치료를 위한 표적들로서 특이적인 유전자들을 확인하였다. 이들 구별되게 발현된 유전자들의 발현에 근거하여, 본 발명은 비-소세포성 폐암을 확인 또는 검출하기 위한 분자 진단 마커들을 제공한다.
본 명세서에 기술된 방법들은 또한 비-소세포성 폐암의 예방, 진단 및 치료를 위한 부가적인 분자 표적의 확인에 유용하다.
본 명세서에 보고된 데이터는 비-소세포성 폐암의 포괄적인 이해를 더하고, 새로운 진단 전략의 개발을 용이하게 하며, 또한 치료제 및 예방 작용제를 위하여 분자 표적의 확인을 위한 실마리를 제공한다. 이러한 정보는 암형성의 더욱 해박한 이해에 기여하며, 또한 진단, 치료 및 궁극적으로 비-소세포성 폐암의 예방을 위하여 새로운 전략을 개발하기 위한 지표를 제공한다.
본 발명이 자세히, 그리고 특정 구현예를 참조로 기술되었으나, 본 발명의 의도 및 범위를 벗어남이 없이, 본 발명에 다양한 변화 및 변형이 수행될 수 있는 것이 당해 기술분야의 당업자에게 분명할 것이다.
<110> ONCOTHERAPY SCIENCE, INC. JAPAN AS REPRESENTED BY THE PRESIDENT OF THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> METHOD FOR DIAGNOSING NON-SMALL CELL LUNG CANCERS <130> ONC-A0212Y2P <150> US 60/414,673 <151> 2002-09-30 <150> US 60/451,374 <151> 2003-02-28 <150> US 60/466,100 <151> 2003-04-28 <160> 552 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2235 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggcacgaggc ggcggaggcg gcggcggcgg cggcgatggc agcggaccct gagcgagctt 60 gagggctcgg acccagctcc ctcccgcgaa accttgggcg gatccggcgc tgcggcccca 120 gctcgctccg ctcctgctcc ctccccggcc gctgcctggg cggaggcaga ggcagaggcc 180 cgggctggcc gccctgctcg tgccccagct cggccccgga cggcccggct gctgtgcaga 240 gaggaggccg agtcggtagt gaaaagagaa tactgaagaa taggatctca agatgagtaa 300 aaagccccca aatcgccctg gaatcacttt tgagattggt gctcgtttgg aggcactgga 360 ctacttacaa aaatggtatc catcacgaat tgaaaaaatt gactatgagg agggcaagat 420 gttggtccat tttgagcgct ggagtcatcg ttatgatgag tggatttact gggatagcaa 480 tagattgcga ccccttgaga gaccagcact aagaaaagaa gggctaaaag atgaggaaga 540 tttctttgat tttaaagctg 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<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Lys Lys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Ile Thr Phe Glu Ile Gly 1 5 10 15 Ala Arg Leu Glu Ala Leu Asp Tyr Leu Gln Lys Trp Tyr Pro Ser Arg 20 25 30 Ile Glu Lys Ile Asp Tyr Glu Glu Gly Lys Met Leu Val His Phe Glu 35 40 45 Arg Trp Ser His Arg Tyr Asp Glu Trp Ile Tyr Trp Asp Ser Asn Arg 50 55 60 Leu Arg Pro Leu Glu Arg Pro Ala Leu Arg Lys Glu Gly Leu Lys Asp 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Phe Asp Phe Lys Ala Gly Glu Glu Val Leu Ala Arg 85 90 95 Trp Thr Asp Cys Arg Tyr Tyr Pro Ala Lys Ile Glu Ala Ile Asn Lys 100 105 110 Glu Gly Thr Phe Thr Val Gln Phe Tyr Asp Gly Val Ile Arg Cys Leu 115 120 125 Lys Arg Met His Ile Lys Ala Met Pro Glu Asp Ala Lys Gly Gln Val 130 135 140 Lys Ser Gln His Pro Leu Ser Trp Cys Cys Pro Ile Asp Pro Ala Gly 145 150 155 160 Ser Cys Asn Gln Ser Met Gly Ser Glu Asp Trp Ile Ala Leu Val Lys 165 170 175 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Asn Lys Thr Gly Ser Lys Pro Arg 180 185 190 Thr Ser Ala Asn Ser Asn Lys Asp Lys Asp Lys Asp Glu Arg Lys 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synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 4 ggttttaaat gcagctccta tgtg 24 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 5 atggaatccg aggatttaag tggcagagaa ttga 34 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 6 tttttttccc cttttttttt caaaagtctt ggaggat 37 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 7 gcttcctcct ggaaattgac 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 8 tctactgtac agggaaaaac cca 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 9 agtcgtggtt cagaagttac agc 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized primer sequence for RT-PCR <400> 10 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<223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 545 cggaggatct catgaccac 19 <210> 546 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 546 gattcgcatc ctgccatcg 19 <210> 547 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 547 cagtattcgg acatagagg 19 <210> 548 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 548 caccaagtac tgcttgtgc 19 <210> 549 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 549 ggagaagaac actgtggac 19 <210> 550 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 550 gacaaattga gtggcagca 19 <210> 551 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 551 gagattcaga gtggacgaa 19 <210> 552 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized oligonucleotide sequence for RNAi <400> 552 gagagcaatg aggatgact 19

Claims (52)

  1. 정상 대조군 수준과 비교하여 비-소세포성 폐암-관련 유전자 수준의 증가 또는 감소는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸리거나 비-소세포성 폐암에 걸릴 위험이 있다는 것을 나타내는, 대상체 유래의 생물학적 시료에서 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 대상체에서 비-소세포성 폐암 또는 비-소세포성 폐암에 걸릴 소질을 진단하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 비-소세포성 폐암 관련 유전자는 NSC 807-1448로 이루어진 군에서 선택되고, 정상 대조군 수준과 비교하여 수준 증가는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸리거나 걸릴 위험성이 있음을 나타내는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 증가는 정상 수준보다 적어도 10% 더 큰 것을 의미하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 비-소세포성 폐암 관련 유전자는 NSC 1-806로 이루어진 군으로부터 선택되고, 정상 대조군 수준과 비교하여, 감소는 대상체가 비-소세포성 폐암에 걸리거나 걸릴 위험성이 있음을 나타내는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 감소는 정상 대조군 수준보다 적어도 10% 더 낮은 방법
  6. 제 1항에 있어서, 방법은 다수의 비-소세포성 폐암-관련 유전자 수준을 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 수준은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법에 의해 측정되는 방법:
    (1) 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 mRNA를 검출하는 단계;
    (2) 비-소세포성 폐암-관련 유전자에 의해 단백질을 검출하는 단계; 및 (3) 비-소세포성 폐암-관련 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 생물학적 활성을 검출하는 단계.
  8. 제 1항에 있어서, 수준은 비-세포성 폐암-관련 유전자 탐침과 환자 유래의 생물학적 시료 유전자 전사체의 혼성화를 검출함으로써 측정되는 방법
  9. 제 8항에 있어서, 혼성화 단계는 DNA 어레이(array)로 수행되는 방법.
  10. 제 1항에 있어서, 생물학적 시료는 객담 또는 혈액을 포함하는 방법.
  11. NSC 1-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 유전자의 유전자 발현 패턴을 포함하는, 비-소세포성 폐암 참조 발현 프로필(reference expression profile).
  12. 하기의 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 또는 활성을 억제하는 화합물을 동정하는 방법:
    (1) 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 발현하는 시험 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 상기 발현 수준을 억제하는 화합물을 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 억제제로 결정하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 시험 세포는 NSCLC 세포인 방법.
  14. 하기 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 또는 활성을 증진시키는 화합물을 동정하는 방법:
    (1) 비-소세포성 폐암-관련 유전자를 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (2) 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (3) 상기 유전자의 정상 대조군 수준과 비교하여 발현 수준을 증가시키는 화합물을 비-소세포성 폐암-관련 유전자의 증진제로 결정하는 단계.
  15. 제 14항에 있어서, 시험 세포는 NSCLC 세포인 방법.
  16. 하기 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법:
    (1) 시험 화합물을 NSC 1-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (2) 폴리펩티드와 시험 화합물 사이의 결합 활성을 측정하는 단계; 및
    (3) 폴리펩티드에 결합하는 화합물을 선택하는 단계.
  17. 하기 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법:
    (a) 시험 화합물을 NSC 1-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계;
    (b) (a) 단계의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 시험 화합물의 부재시 측정된 생물학적 활성과 비교하여 NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하는 또는 시험 화합물의 부재시 측정된 생물학적 활성과 비교하여 NSC 1-806로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 증진시키는 화합물을 선택하는 단계.
  18. 제 17항에 있어서, 생물학적 활성은 세포 증식 활성인 방법.
  19. 하기 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법:
    (1) 시험 화합물을 NSC 1-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계: 및
    (2) NSC 807-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 마커의 발현 수준을 감소시키는 화합물 또는 NSC 1-806으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자의 발현 수준을 상승시키는 화합물을 선택하는 단계.
  20. 제 19항에 있어서, 세포는 NSCLC 세포인 방법.
  21. 하기 단계를 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방하는 화합물의 스크리닝 방법:
    (1) 시험 화합물을, NSC-1-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커 유전자의 전사 조절 부위 및 상기 전사 조절 부위하에서 발현되는 리포터 유전자를 포함하는 벡터가 도입된 세포와 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 단계; 및
    (3) 마커 유전자가 NSC 807-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 상향-조절되는 마커 유전자일 경우 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 감소시키거나 또는 유전자가 NSC 1-806으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하향-조절되는 마커 유전자일 경우 대조군과 비교하여 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 증진시키는 화합물을 선택하는 단계.
  22. NSC 1-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자 또는 이에 의해 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는 두 가지 이상의 탐지(detection) 시약을 포함하는 키트.
  23. NSC 1-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 결합하는 두 개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 어레이(array).
  24. NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 코딩 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법.
  25. NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현을 감소시키는 siRNA 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법.
  26. NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는, 약학적으로 유효한 양의 항체 또는 이의 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법.
  27. NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 면역학적으로 활성이 있는 단편, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법.
  28. NSC 1-806으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 발현 또는 활성을 증가시키는 화합물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암을 치료하거나 예방하는 방법.
  29. 제 12항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득되는 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법.
  30. NSC 1-806로 구성되는 군으로부터 선택되는 약학적으로 유효한 양의 폴리뉴클레오티드 또는 암호화된 폴리펩티드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암 치료 또는 예방방법
  31. NSC 807-1448로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 대한 약학적으로 유효한 양의 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA를 포함하는 비-소세포성 폐암을 치료 또는 예방용 조성물.
  32. NSC 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드에 결합하는, 약학적으로 유효한 양의 항체 또는 이의 단편을 포함하는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방용 조성물.
  33. 활성 성분으로서 제 12 내지 21항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 선택되는 약학적으로 유효한 양의 화합물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방용 조성물.
  34. 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 실질적으로 순수한 폴리펩티드:
    (a) 서열번호 2의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) 아미노산의 5% 이하가 치환, 결실, 삽입된 및/또는 추가된 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 등가인 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드: 및
    (c) 서열번호 2의 아미노산으로 이루어진 단백질과 생물학적 활성이 등가인, 엄격한 조건하에서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 이루어진 유전자에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화되는 폴리펩티드.
  35. 제 34항의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  36. 제 35항에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  37. 제 35항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  38. 제 35항의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 갖는 숙주세포.
  39. 하기 단계를 포함하는 제 34항의 폴리펩티드를 생산하는 방법:
    (1) 제 34항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 갖는 숙주세포를 배양하는 단계;
    (2) 상기 숙주세포가 상기 폴리펩티드를 발현하도록 하는 단계; 및
    (3) 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계
  40. 제 34항의 폴리펩티드에 결합하는 항체.
  41. 제 35항의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 가닥에 상보적이고, 15 뉴클레오티드 이상을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  42. 제 35항의 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 siRNA.
  43. 서열번호 423,425, 427,429, 431,433, 435, 437,439, 441,443, 445,447, 449,451, 453,455, 457,459, 461,463, 465,467, 469, 471,473, 475,477, 479,481, 483,485, 487,489, 491,493, 495,497, 499,501, 503, 505,507, 509,511, 513,515, 517,519, 521,523, 525,527, 529, 또는 531을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 안티센스 폴리뉴클레오티드.
  44. 서열번호 533,534, 535,536, 537,538, 539,540, 541,542, 543,544, 545,546, 547, 548, 549,550,551, 및 552의 뉴클레오티드 서열을 표적 서열로 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 siRNA
  45. 약학적으로 유효한 양의 제 43항의 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방용 조성물
  46. 약학적으로 유효한 양의 제 44항의 siRNA를 포함하는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방용 조성물.
  47. 제 45항의 안티센스 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방방법.
  48. 제 46항의 siRNA 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는 대상체의 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방방법.
  49. 약학적으로 유효한 양의 제 34항의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-소세포성 폐암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  50. 제 49항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 발현벡터에 삽입되는 약학적 조성물
  51. NSC 807-1448로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자에 의하여 암호화되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 면역학적으로 활성이 있는 단편 또는 상기 폴리펩티드나 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 항종양 면역 유도 방법(anti tumor immunity)
  52. 제 51항에 있어서, 대상체에 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 항종양 면역 유도 방법.
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