TWI762516B

TWI762516B - 針對ｆｚｄ１０之單株抗體及其用途

Info

Publication number: TWI762516B
Application number: TW106134171A
Authority: TW
Inventors: 原田陽介; 横関達己; 中村祐輔
Original assignee: 日商腫瘤療法科學股份有限公司
Priority date: 2016-10-06
Filing date: 2017-10-03
Publication date: 2022-05-01
Also published as: RU2019112825A; KR20190059318A; JP7039039B2; CN110036110A; US20200174002A1; JPWO2018066585A1; CA3038789A1; JP2022068145A; RU2019112825A3; EP3524677B1; BR112019006422A2; EP3524677A1; US11079386B2; WO2018066585A1; CN110036110B; TW201827465A; EP3524677A4; RU2765431C2; KR102531006B1

Abstract

本發明係關於針對FZD10的單株抗體。本發明更提供使用該抗體來診斷FZD10關連病症之方法、檢測FZD10蛋白質之方法、判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之方法、篩選藉由FZD10抑制劑獲致之治療效果高之對象之方法、及含有該抗體之診斷用藥。

Description

針對FZD10之單株抗體及其用途

本發明係關於針對FZD10的單株抗體、使用該抗體來診斷FZD10關連病症之方法、檢測FZD10蛋白質之方法、判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之方法、篩選藉由FZD10抑制劑獲致之治療效果高之對象之方法、及含有該抗體之診斷用藥。

Frizzled蛋白質是具有針對Wnt蛋白質配體之結合部位之G蛋白質結合受體之家族。由基因解析至今已鑑定出18種Wnt基因及10種Frizzled基因(FZD1~FZD10)，且解明它們全部在結構上高度類似。

Frizzled蛋白質是7次跨膜型蛋白質，於N末端具有細胞外富含半胱胺酸之結構域。此富含半胱胺酸之結構域係Wnt配體之結合部位。Wnt配體與Frizzled受體之結合並非一定為一對一，已確認一種Wnt配體會和多種Frizzled受體結合、一種Frizzled受體會有多種Wnt配體結合。

已知藉由Wnt配體與Frizzled受體之結合，會使Wnt訊息傳遞路徑活化。Wnt訊息傳遞路徑存在有使β-鏈蛋白(β-catenin)路徑活化者、及不經由β-鏈蛋白的路徑等數種，據認為利用Wnt配體與Frizzled受體之組合，會活化不同的路徑。

藉由受體結合而活化之Wnt/β-鏈蛋白訊息傳遞路徑，會經過與Frizzled受體直接交互作用的細胞質蛋白質之Dishevelled(Dsh)的中介，而使β-鏈蛋白於細胞質安定化及蓄積。當不存在Wnt訊息時，β-鏈蛋白會局部存在於含有腫瘤抑制蛋白質之大腸腺腫狀息肉(APC)及Axin之細胞質之分解複合體中。該等蛋白質是作為當肝糖合成酵素激酶(GSK)-3β與β-鏈蛋白結合並磷酸化，並將其為藉由泛素(ubiquitin)/蛋白酶體(proteosome)路徑的分解用途的重大結構(scaffold)。(專利文獻1)β-鏈蛋白非依賴路徑顯示和多數作用(process)有關，存在有涉及細胞骨架系之控制之細胞內平面極性(PCP)、涉及細胞之運動及接著之Wnt/Ca²⁺路徑、涉及介由蛋白激酶A而控制肌肉新生之路徑等。Frizzled受體可以二聚體形成，有報告指出此二聚體形成涉及到Wnt訊息路徑之活化(非專利文獻1)。

FZD10(參照序列：Genbank存取編號NM_007197.3(SEQ ID NO：21))mRNA，據報告在包括頸部、消化道及神經膠質母細胞瘤之細胞系統的多數癌細胞系統中，以及約40%之原發性胃癌、原發性結腸癌及大部分的滑膜肉瘤組織中，係受向上調控(專利文獻1~2、非專利文獻2~3)。就FZD10蛋白質之過度表現相關連的疾病而言，可列舉滑膜肉瘤、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)、及急性骨髓性白血病(AML)等(專利文獻3~5)。因此FZD10被認為是抗癌劑之適當標的，有揭示利用對於FZD10為專一的siRNA可以抑制滑膜肉瘤細胞之增殖、針對FZD10之抗體在滑膜肉瘤之小鼠移植片模型有抗腫瘤活性(專利文獻3、4)。又，可預測針對FZD10之單株抗體作為治療中之診斷用藥為有用。除了針對乳癌、惡性淋巴瘤、及結腸癌之曲妥珠單抗(Trastuzumab)之診斷用藥、利妥昔單抗(Rituximab)之診斷用藥、及貝伐單抗(Bevacizumab)之診斷用藥之類的單株抗體之臨床應用之成功例，尚有針對其他分子標靶的一些單株抗體正開發中，該等診斷效果正在評價中。該等診斷用藥，考量選擇對於治療藥有效果的患者之觀點，期待連結到更有效果的治療法。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] WO2007/053577

[專利文獻2] WO2004/020668

[專利文獻3] WO2005/004912

[專利文獻4] WO2006/013733

[專利文獻5] WO2007/148417

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Charles E Dann et al.,Nature (2001),412:86-90

[非專利文獻2] H.Terasaki et al.,Int.J.Mol.Med.(2002)9,107-112

[非專利文獻3] S.Nagayama et al.,Oncogene(2005)24,6201-6212

使用分子標靶治療藥在腫瘤治療時的診斷用藥，重要的是檢測出在大部分目標腫瘤會過度表現且在正常組織不表現、或僅會表現最小程度的細胞蛋白質。但是以專一地高感度檢測在腫瘤表現之蛋白質係有困難，獲得針對如此的蛋白質的抗體亦為困難。例如，針對考量作為抗癌劑之標靶之FZD10已有一些市售抗體。但是本案發明人等利用取得之市售抗體嘗試進行FZD10表現細胞之染色，結果即使在FZD10之表現位準低的細胞仍會出現陽性訊息(偽陽性)。如此地，免疫學上的專一性不充分的抗體，會令人擔心無法清楚地以抗體之反應強度作為指標來檢測FZD10之表現位準之差異。因此本發明之課題在於提供會對於FZD10專一且高感度地結合之抗體。

本案發明人等從對於小鼠以FZD10抗原進行免疫而獲得之單株抗體之中、尋找對於FZD10專一地結合之抗體，結果成功地鑑別出能夠專一地結合於重組的人類FZD10蛋白質的特定抗體、且能夠專一地檢測於細胞、組織內表現之FZD10蛋白質之選殖體。

具體而言，本發明係關於以下：

[1]一種抗體或其抗原結合性片段，能夠與FZD10蛋白質或其部分胜肽結合，包含重鏈可變區及輕鏈可變區中之任一者或兩者，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。

[2]如[1]所述之抗體或其抗原結合性片段，其中，包含含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區中之任一者或兩者。

[3]如[1]或[2]所述之抗體或其抗原結合性片段，專一性地認識由SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列構成之多肽。

[4]一種抗體或其抗原結合性片段，針對對於FZD10之專一性的結合，和如[1]至[3]中任一項所述之抗體競爭。

[5]如[1]至[4]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段，係結合了親和性標記、酵素標記、放射性同位素標記、或螢光標記。

[6]一種多核苷酸，係編碼為如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段。

[7]一種用於診斷FZD10關連病症、判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效、或篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之試藥，含有如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段。

[8]一種診斷在對象中之FZD10關連病症或該病症之發病因素之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣和如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段接觸之步驟； (b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；及(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與對照比較之步驟，於和對照比較，FZD10蛋白質位準較高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險。

[9]如[7]所述之試藥或如[8]所述之方法，該FZD10關連病症係表現FZD10之癌。

[10]如[9]所述之試藥或方法，其中，該癌係選自於由滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)及急性骨髓性白血病(AML)所構成之群組。

[11]一種檢測試樣中之FZD10蛋白質之方法，包括以下之步驟：(a)使從對象單離之試樣和如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段接觸之步驟；及(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟。

[12]一種判定在對象中之利用FZD10抑制劑治療後之藥效之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與藥劑投予前之表現位準進行比較之步驟，於和藥劑投予前相較，FZD10蛋白質位準較低時，代表在該對象中有藥效。

[13]一種篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與對照進行比較之步驟，於和對照相較，FZD10蛋白質位準為同程度或更高位準時，代表在該對象中之利用FZD10抑制劑之治療效果高。

[14]如[8]至[13]中任一項所述之方法，其中，該試樣係從該對象單離之細胞或組織。

[15]一種製造能夠和FZD10蛋白質或其部分胜肽結合之抗體之方法，包括以下步驟：(a)培養含有導入了如[6]所述之多核苷酸之載體之細胞之步驟；及(b)從該細胞之培養物或培養基回收該抗體之步驟。

本發明更關於以下：

[16]一種檢測FZD10關連病症或該病症之發病因素之診斷標記之方法，包括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述記載之抗體或其抗原結合性片段之步驟；及(b)藉由檢測該抗體或抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質作為該標記之步驟。

[17]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段，係使用在診斷FZD10關連病症或該病症之發病因素。

[18]一種如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之用途，係用於製造用以診斷FZD10關連病症或該病症之發病因素之試藥。

[19]一種檢測FZD10抑制劑之藥效標記之方法，包括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；及(b)藉由檢測該抗體或抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質作為該標記之步驟。

[20]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段，係用於判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效。

[21]一種如[1]至[5]項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之用途，係用於製造用以判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之試藥。

[22]一種檢測FZD10抑制劑治療應答性標記之方法，包括以下步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；及(b)檢測該抗體或抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質作為該標記之步驟。

[23]如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段，係用於篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象。

[24]一種如[1]至[5]中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之用途，係用於製造用以篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之試藥。

除了上述以外，本發明之其他目的及特徵可藉由併同附帶的圖表及實施例，閱讀以下之詳細說明而充分明瞭。但是前述發明內容及以下之詳細說明皆是例示的態樣，應理解的是，不是用於限定本發明或本發明之其他替代的態樣。尤其本發明係參照一些特定態樣在本說明書中說明，但此說明係舉例說明本發明，應理解為不限定本發明。該技術領域中有通常知識者可在不脫離附帶之申請專利範圍記載之本發明之精神及範圍而想到各種變化及適用形態。同樣，本發明之其他目的、特徵、利益、及優點可由本概要及以下記載之特定態樣明瞭，該技術領域中有通常知識者可輕易地明白。如此的目的、特徵、利益、及好處，可以合併附帶的實施例、數據、圖表、及從它們得出的妥當的推論，單獨或考慮載入到本說明書之參考文獻而明瞭。

第1圖係揭示在使用各癌種之細胞株之mRNA之表現解析資料庫之Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)中，FZD10 mRNA於各癌種細胞株之表現。

第2圖係揭示在使用了FZD10強制表現系細胞株之免疫組織化學染色中顯示抗FZD10抗體(10A8H4G4)之專一性之顯微鏡照片。利用抗FZD10抗體(10A8H4G4)進行免疫組織化學染色之結果，在由FZD10強制表現細胞株(FZD10/DLD1)製作之石蠟切片觀察到專一性的染色，但是作為陰性對照的導入了空載體的細胞株(Mock/DLD1)未被染色。另一方面，市售抗體(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)進行免疫組織化學染色之結果，於FZD10/DLD1與Mock/DLD1皆觀察到染色。明白了相較於市售抗體，抗FZD10抗體(10A8H4G4)較有專一性。又，照片下之圖顯示由免疫組織化學染色之結果算出FZD10陽性細胞佔強制表現細胞數之比例(%)。

第3圖顯示使用了FZD10之表現量相異之各種細胞株之流式細胞測量術與免疫組織化學染色中的表現的相關性。A：檢測了各細胞株之細胞膜上之FZD10之表現而得的使用10A8H4G4之流式細胞測量術之結果之直方圖。SYO-1、T.T、H727為FZD10表現細胞株，LoVo為FZD10不表現細胞株。B：使用由各細胞株製作之石蠟切片之免疫組織化學染色之結果之顯微鏡照片。又，照片下之圖顯示由免疫組織化學染色之結果算出FZD10陽性細胞佔各細胞株之比例(%)。SYO-1、T.T、H727等FZD10表現細胞株可辨認出有染色，但LoVo(不表現細胞株)未被染色。藉由使用細胞株之解析，明白了抗FZD10抗體(10A8H4G4)於免疫組織化學染色法之專一性。

第4圖顯示使用由SYO-1、COLO201細胞株之小鼠異種移植腫瘤製作之石蠟切片以及肺癌臨床檢體1~6之免疫組織化學染色與在RealTime-PCR之表現之相關性。A：利用本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)之免疫組織化學染色，在SYO-1以及檢體5呈FZD10陽性。另一方面，低表現檢體幾乎未被染色。B：由A之免疫組織化學染色之結果算出FZD10陽性細胞數佔腫瘤細胞之比例並顯示於圖中。C：由同一症例之利用RealTime-PCR的表現解析，獲得與免疫組織化學染色為相關的結果。藉由使用臨床檢體之解析，得知本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)在免疫組織化學染色法之高專一性。

詳細說明

實施或試驗本發明之態樣時可以使用和本說明書記載的方法及材料為類似或同等任意的方法及材料，但理想之方法、裝置、及材料記載於此。但是針對本發明之材料及方法記載前，應理解本說明書記載之特定之大小、形狀、尺寸、材料、方法論、實驗方案等可依慣例的實驗法及最適化而變更，故本發明不限於此等。本記載使用之專門用語係為了說明特定之類型或態樣，應理解並不意欲限定僅依附帶申請專利範圍限定之本發明之範圍。

本發明提供能夠專一性地結合於FZD10蛋白質或其部分胜肽之抗FZD10單株抗體。本發明提供本發明之抗FZD10單株抗體在免疫組織化學染色法中之FZD10蛋白質之檢測有高專一性的證據。

本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)至少在可變區具有下列胺基酸序列。

10A8H4G4、重鏈可變區胺基酸序列(不包括訊息序列)：

(SEQ ID NO：7)

10A8H4G4、輕鏈可變區胺基酸序列(不包括訊息序列)：

(SEQ ID NO：8)

本發明之抗體，也可藉由使用編碼為前述胺基酸序列之DNA之重組技術來製造。

本發明之抗體，係由對於小鼠進行免疫敏化而獲得之複數的抗體產生融合瘤中，以ELISA法篩選對於FZD10有結合性之抗體以取得。針對經ELISA法選擇之抗體，進一步利用免疫染色法進行挑選。選擇在強制表現細胞(陽性對照細胞)顯示陽性、在陰性對照細胞顯示陰性之抗體，並針對選擇出的抗體，進一步挑選在內因性FZD10表現細胞(陽性對照細胞)顯示陽性、在陰性對照細胞顯示陰性的抗體。當與FZD10之相互作用不是那麼強時，帶有弱結合力的抗體會作為背景值而分不清。而藉由使用經預先測定內因性FZD10表現量之細胞株來實施免疫染色並篩選，能夠選擇出目的之與FZD10有強結合性的抗體。

本發明之抗體會專一地結合於FZD10。因此本發明之抗體，作為檢測FZD10或表現FZD10之細胞或組織的工具為有用。又，本發明之抗體，可利用作為和能檢測該抗體之標記結合之標記體，該標記體例如在檢測大腸癌等表現FZD10 之癌細胞或癌組織方面更理想。結合於本發明之抗體之標記只要是可檢測結合於FZD10之抗體之標記即可，可列舉親和性標記(例如：生物素、抗生物素蛋白等)、酵素標記(例如：西洋山葵過氧化酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記(例如：FITC、玫瑰紅(rhodamine)等)等。

本發明之抗體在癌症治療患者之選擇時作為診斷用藥使用時，本發明之抗體可直接使用，但也可製成適合各種使用形態之組成物。

I.定義

本說明書使用之「1個(a)」、「1個(an)」及「該(the)」之用語，若無其他特明指明，係指「至少1個」。

關於物質(例如：胜肽、抗體、多核苷酸等)使用之「經單離」及「經精製」之用語，代表該物質若非經如此步驟則實質上不含天然源中可能含有之至少1種之物質。因此經單離或精製之抗體，係指實質上不含此抗體來源之細胞或組織源的其他細胞材料例如糖質、脂質及其他混入蛋白質的抗體。理想態樣中，本發明之抗體係經單離或精製。

「多胜肽」及「蛋白質」之用語在本說明書可互換的使用，係指胺基酸殘基之聚合物。本用語除了可適用在天然型胺基酸聚合物，也適用在含有1個或多數個非天然型胺基酸殘基之非天然型胺基酸聚合物。非天然型胺基酸包括胺基酸類似體及胺基酸模倣體等。

「多核苷酸」、「寡核苷酸」、及「核酸」之用語，在本說明書係互換地使用，指核苷酸之聚合物。

若無特別記載，「FZD10關連病症」之用語係指表現FZD10之癌。

若無特別記載，「癌」之用語係指表現FZD10之癌，較佳為指過度表現FZD10基因之癌，其例包括滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)及急性骨髓性白血病(AML)等但不限定於此等。例如：可利用使用了各癌種之細胞株之mRNA之表現解析資料庫Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)等，而知道表現FZD10之癌細胞。本申請案中也確認了在肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)，顯著的受向上調控(第1圖)。

本說明書使用之「抗體」之用語，意欲包括針對於指定之蛋白質或其胜肽有專一性的反應性的免疫球蛋白及其片段。抗體可包括和其他蛋白質或標記融合之抗體、及抗體片段。再者，本說明書中，抗體係以最廣的含意使用，具體而言，只要可顯示所望之生物學的活性，則涵蓋完整的單株抗體、多株抗體、由至少二個完整的抗體形成的多專一性抗體(例如：雙專一性抗體)、及抗體片段。「抗體」係指全部類型(例如：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM)。

「抗體片段」，係完整的抗體的一部分，一般包括完整的抗體的一或多數抗原結合區或可變區。故本發明中，抗體片段可包括完整的抗體的一或多數抗原結合部分。本說明書使用之抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合性片段」的用語，係指保持能夠專一地結合於抗原(例如：FZD10)之能力之抗體之一或多數免疫學上有活性的片段。顯示抗體之抗原結合機能可由全長抗體之片段實施。抗體片段，例如包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、及Fv片段、直鏈狀抗體，及單鏈抗體分子。不拘結構，抗體片段會和由完整的抗體所辨認之抗原為相同之抗原結合。「抗體片段」之用語，也包括會專一地和抗原結合之合成多胜肽或基因操作多胜肽，例如由輕鏈可變區構成之多胜肽、由重鏈及輕鏈之可變區構成之「Fv」片段、輕鏈及重鏈之可變區利用胜肽連結基連結之重組單鏈多胜肽分子(「scFv蛋白質」)，及由模倣了超可變區之胺基酸殘基構成之最小辨認單元。

若無特別記載，本說明書使用之技術用語及科學用語皆有和本發明所屬技術領域之人士共通理解之用語相同之含意。

本發明中，FZD10蛋白質與抗體的專一性的結合，例如可利用抗體間之競爭予以評價。具體而言，本發明之抗體，例如可將包括由SEQ ID NO：7之胺基酸序列構成之重鏈可變區、及由SEQ ID NO：8之胺基酸序列構成之輕鏈可變區之抗體作為參照抗體，來評價候選抗體之專一性。代表的參照抗體，為10A8H4G4。候選抗體對於參照抗體與人FZD10蛋白質間之抗原抗體反應進行競爭的情形，可以確認候選抗體帶有和參照抗體為同等之專一性。例如，候選抗體不存在時結合於FZD10蛋白質之抗體之量，於候選抗體共存下使參照抗體與FZD10蛋白質反應時，有10%、20%、30%、或40%，更佳為50%、或以上之參照抗體之結合受到抑制的情形，可判定抗體間發生競爭。抗體間之競爭之評價，不只可使用FZD10蛋白質，只要參照抗體會結合，也可使用其部分胜肽。理想的部分胜肽為FZD10蛋白質之N末端細胞外結構域胜肽，例如包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之部分胜肽。

II.抗體之產生

本發明使用抗FZD10單株抗體。該抗體可依該技術領域周知之方法提供。

本發明使用之例示的抗體產生技術，記載如下。

(i)單株抗體

單株抗體係由實質上為均勻的抗體的集團獲得。亦即，構成集團之各個抗體，除了有可能以些微量存在之天然的變異以外為相同。如此，「單株」之修飾語，係指並非和別個抗體之混合物的抗體的特徵。

例如單株抗體，可使用Kohler et al.,Nature,256：495(1975)首次記載之融合瘤法產生，或也可依重組DNA法(US4,816,567號)產生。

融合瘤法中，係將小鼠或其他適當的寄主動物，例如倉鼠等以FZD10多胜肽(FZD10蛋白質或其部分多胜肽)免疫，來誘發產生或能產生會和FZD10多胜肽專一地結合之抗體的淋巴球。或將淋巴球於試管內以FZD10多胜肽免疫亦可。之後，使用聚乙二醇等適當的融合劑使淋巴球與骨髓瘤細胞融合，形成融合瘤細胞(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。

將所製備之融合瘤細胞接種在含有會妨礙未融合之親代骨髓瘤細胞之增殖或生存的一或多數物質之理想的適當培養基中，使其在培養基中增殖。例如：親代骨髓瘤細胞有欠缺酵素次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸基核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)時，融合瘤用之培養基一般可含有次黃嘌呤、胺喋呤、及胸苷(HAT培養基)，藉由該等物質，會妨礙HGPRT缺損細胞之增殖。

理想的骨髓瘤細胞，係指會有效率的融合，且輔助經選擇之抗體產生細胞產生安定的高位準的抗體且對於HAT培養基等培養基有感受性。理想的骨髓瘤細胞株為小鼠骨髓瘤株，例如包括來自可由Salk Institute Cell Distribution Center,San Diego,California USA取得之MOPC-21及MPC-11小鼠腫瘤者，及可由American Type Culture Collection,Manassas,Virginia,USA取得之SP-2細胞或X63-Ag8-653細胞。關於人單株抗體之產生，也有人記載人骨髓瘤細胞株及小鼠-人異質骨髓瘤細胞株(Kozbor,J.Immunol.,133：300 1(1984)；Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。

將融合瘤細胞已增殖之培養基進行關於對於抗原之單株抗體之產生的分析。較佳為由融合瘤細胞產生之單株抗體之結合專一性，利用免疫沈降法、或放射免疫測定法(RIA)或酵素結合免疫吸附測定(ELISA)等，以試管內結合測定來決定。

單株抗體之結合親和性例如可依照Munson et al.,Anal Biochem.,107：220(1980)之30Scatchard分析判定。

鑑別了產生所期望的專一性、親和性、及/或活性之抗體之融合瘤細胞後，將此選殖體以極限稀釋法進行次選殖，並可依標準的方法使其增殖(Goding,Monoclonal Antibodies：Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。適合此目的之培養基，包括例如D-MEM培養基或RPMI-1640培養基。再者，融合瘤細胞也可利用動物之腹水腫瘤之類的活體內方式增殖。

由次選殖體分泌之單株抗體可精製至成為均勻。例如可依照對於一般的蛋白質使用的分離法及精製法進行抗體之分離及精製。例如：不限於此等，可適當地選用並組合親和性層析等管柱層析、過濾、超過濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳、及等電點電泳，以從培養基、腹水、或血清中適當地將抗體予以分離及單離(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))。蛋白質A管柱及蛋白質G管柱可作為親和性管柱使用。應使用之例示的蛋白質A管柱，包括例如：Hyper D、POROS、及Sepharose F.F.(Pharmacia)。

例示的層析，除了親和性層析以外，例如尚包括離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。層析程序可依照HPLC及FPLC等液相層析進行。

編碼為單株抗體之DNA，可使用習知程序(例如藉由使用會專一地結合在編碼為小鼠抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)輕易地單離並定序。融合瘤細胞，可作為如此的DNA的理想供給源。若將DNA單離，並配置在表現載體中，然後將其轉染到其他方法不產生免疫球蛋白蛋白質之大腸菌(E.coli)細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞等寄主細胞中，可達成單株抗體在重組寄主細胞中之合成。關於編碼為抗體之DNA在細菌中之重組表現之總說，包括Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5：256-262(1993)及Pluckthun,Immunol.Revs.,130：151-188(1992)。

用以產生針對FZD10顯示反應性之專一性的抗體或抗體片段之其他方法，係指使用FZD10蛋白質或其部分胜肽來篩選於細菌中表現之編碼為免疫球蛋白基因或其一部分之表現庫。例如能使用表現完全的Fab片段、VH區、及Fv區的噬菌體表現庫使其在細菌中表現。可參照例如：Ward et al.,Nature 341：544-546(1989)；Huse et al.,Science 246：1275-1281(1989)；及McCafferty et al.,Nature 348：552-554(1990)。例如藉由使用FZD10胜肽對於如此的庫進行篩選，可鑑別對於FZD10有反應性之免疫球蛋白片段。或也可為了產生抗體或其片段，使用SCID-hu小鼠(可從Genpharm取得)。

在進一步態樣中，抗體或抗體片段可以從使用McCafferty et al.,Nature,348：552-554(1990)記載之技術所製作之抗體噬菌體庫單離。Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991)及Marks et al.,J MoL BioL,222：581-597(1991)中，分別記載使用噬菌體庫之小鼠抗體及人抗體之單離。之後的刊物中，記載利用鏈曳步產生高親和性(nM範圍)人抗體(Marks et al.,BioTechnology,10：779-783(1992))，及作為建構非常大之噬菌體庫之策略的組合感染及活體內重組(Waterhouse et al.,Nuc.Acids.Res.,21：2265-2266(1993))。如上所述，該等技術係可替代用以將單株抗體單離之習知單株抗體融合瘤技術的方法。

本發明提供FZD10關連病症之診斷、利用FZD10抑制劑治療後之藥效之判定、及適合篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之抗體。本發明成功地建立了能於免疫組織化學染色及流式細胞測量術以高專一性檢測FZD10蛋白質之小鼠單株抗體選殖體(10A8H4G4)。已實際驗證此抗體選殖體若使用於肺癌臨床檢體之免疫組織化學染色，則利用RealTime-PCR確認了FZD10之表現位準高之肺癌檢體會有陽性結果，但確認了FZD10之表現位準低之肺癌檢體則幾乎不染色。再者，若使用市售之抗FZD10抗體，由FZD10強制表現細胞株、不表現細胞株任一者製作之試樣皆有染色，反觀使用本發明之抗FZD10抗體時，由FZD10強制表現細胞株製作之試樣會專一地染色。如此，有高抗原專一性之本發明之抗體，在選擇FZD10表現位準高的患者，甚至選擇利用FZD10抑制劑所為之治療有效可能性高之患者方面為有利。

本發明之抗FZD10小鼠單株抗體選殖體(10A8H4G4)之重鏈可變區(H鏈V區)及輕鏈可變區(L鏈V區)之胺基酸序列，分別示於SEQ ID NO：7及8。

重鏈可變區及輕鏈可變區中含有的CDR(互補決定區)可依該技術領域中周知之方法決定。例如：Kabat等人(Kabat E.A.et al.,(1991)Sequence of Proteins of Immunological Interest.5th Edition)或Chothia等(Chothia et al.,J.Mol.Biol.(1987)196；901-917)記載之方法一般使用在CDR決定。依Kabat之定義決定之本發明之抗FZD10小鼠單株抗體選殖體(10A8H4G4)之重鏈可變區之CDR1、2、3，分別示於SEQ ID NO：1、2、3，此選殖體之輕鏈可變區之CDR1、2、3，分別示於SEQ ID NO：4、5、6。

故本發明提供一種抗體或其抗原結合性片段，係包括重鏈可變區及輕鏈可變區中任一者或兩者且可結合於FZD10蛋白質或其部分胜肽的抗體或其抗原結合性片段，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。

本發明中，本發明之抗體所結合之FZD10蛋白質之部分胜肽，較佳為FZD10蛋白質之N末端細胞外結構域胜肽，例如含有相當於FZD10蛋白質(SEQ ID NO：22)之21-161位之胺基酸序列(SEQ ID NO：9)且由從SEQ ID NO：22選擇之胺基酸序列構成。更佳為本發明中，FZD10蛋白質之部分胜肽可由SEQ ID NO：9之胺基酸序列構成。

上述包括「含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3」之重鏈可變區之一例，係含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區。上述包括「含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3」之輕鏈可變區之一例，係含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區。

因此一態樣中，本發明提供一種抗體或其抗原結合性片段，包括含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區中之任一者或兩者。

本發明之抗體可依習知的方法製備。例如可依習知之基因重組技術將編碼為抗體多胜肽之多核苷酸***到適當的載體，將該載體載入到寄主，並使該寄主產生抗體，以製備抗體(例如參照Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-75)。

編碼為本發明之抗體之可變區(V區)之多核苷酸之核酸序列，可由本發明之抗體之V區之胺基酸序列推測。編碼為本發明之抗體選殖體之重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之核酸序列分別可以使用例如：SEQ ID NO：10及11所示之核酸序列。編碼為本發明之抗體之V區之多核苷酸，可藉由如固相技術(Beaucage SL & Iyer RP,Tetrahedron(1992)48, 2223-311；Matthes et al.,EMBO J(1984)3,801-5)及寡核苷酸合成技術(Jones et al.,Nature(1986)321,522-5)之習知方法，依據序列資訊合成。

編碼為抗體V區之多核苷酸係***到含有編碼為抗體恆定(C)區之多核苷酸之表現載體。

為了產生本發明所使用之抗體，將編碼為該抗體(抗體基因)之多核苷酸***到表現載體，以使抗體基因能在表現控制要素(例如：強化子、啟動子)之控制下表現。使用表現載體對於寄主細胞進行形質轉換，使抗體表現。

於抗體基因之表現，可將編碼為抗體之H鏈之多核苷酸與編碼為L鏈之多核苷酸***個別表現載體，之後將獲得之重組表現載體對於寄主細胞進行同時形質轉換。或也可將編碼為抗體之H鏈之多核苷酸與編碼為L鏈之多核苷酸之兩者一起***到單一的表現載體，之後將獲得之重組表現載體對於寄主細胞進行形質轉換(例如：國際公開公報第94/11523號)。

可依公知之方法使抗體基因表現。在哺乳類細胞表現時，可將習知的有用的啟動子、欲表現之抗體基因、及聚(A)訊息(位在相對於抗體基因之3'末端為下游)予以功能性地連結。例如：可使用人類巨細胞病毒早期基因啟動子/強化子系作為有用的啟動子/強化子系。

其他啟動子/強化子系，例如可使用來自病毒(例如：反轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒及猴病毒40(SV40))者，及來自哺乳類細胞者(例如：人類伸長因子1α(HEF1α))於本發明之抗體之表現。

使用SV40啟動子/強化子系時，基因表現可依Mulligan等人(Nature(1979)277,108-14.)的方法輕易地進行。使用HEF1α啟動子/強化子系時，基因表現可依Mizushima等人(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322.)的方法輕易地進行。

在大腸菌表現時，可將習知之有用的啟動子、用以使關注對象之抗體分泌之訊息序列、及抗體基因予以功能性地連結。啟動子可以使用lacZ啟動子或araB啟動子。使用lacZ啟動子時，基因表現可依Ward等人(Nature(1098)341,544-6.；FASBE J.(1992)6,2422-7.)的方法進行，另一方面，使用araB啟動子時，基因表現可依Better等人(Science(1988)240,1041-3.)的方法進行。

針對用於抗體分泌之訊息序列，當意欲使關注對象之抗體分泌到大腸菌之細胞周邊空間時，可使用pelB訊息序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-83.)。將分泌到細胞周邊空間中的抗體予以單離，之後使抗體再度折疊以成為適當的立體結構。

可使用來自病毒(例如：SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV))等之複製起點。為了使寄主細胞系之基因副本數增加，表現載體也可更含有胺基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸菌黄嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸基核糖基轉移酶(Ecogpt)基因及二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等選擇標記基因。針對本發明使用之抗體之產生，使用包括真核生物及原核生物之細胞系的任意表現系。真核生物細胞包括動物 (例如：哺乳類、昆蟲、黴菌及真菌、酵母)之樹立細胞株。原核生物細胞包括大腸菌細胞等細菌細胞。本發明使用之抗體宜在CHO細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、Vero細胞、及HeLa細胞等哺乳類細胞中表現較佳。

然後將經形質轉換之寄主細胞於試管內或活體內培養，使關注對象之抗體產生。寄主細胞之培養可依任意公知之方法實施。本說明書能使用之培養基，也可為DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM培養基。培養基也可含有胎牛血清(FCS)等血清補充物。

重組抗體產生時，除了使用上述寄主細胞，也可使用基因轉殖動物作為寄主。例如將抗體基因***編碼為動物之母乳中原本會產生之蛋白質(例如：β酪蛋白)之基因之預定部位，並製備融合基因。將含有已導入抗體基因之融合基因之DNA片段注射到非人動物之胚胎，然後將此胚胎對於雌性動物導入。體內有該胚胎之該雌性動物會產下基因轉殖非人動物。關注對象之抗體會從該基因轉殖非人動物或其子孫分泌到母乳中。為了增加含有該抗體之母乳之量，也可對該基因轉殖動物投予適當的激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702.)。

可將如上述表現產生之抗體從細胞或寄主動物體單離並精製。本發明使用之抗體之單離及精製，也可對於親和性管柱進行。抗體之單離及精製可使用以往使用之其他方法；因此方法無特殊限制。例如可將各式各樣的層析、過濾、超過濾、鹽析及透析單獨使用或組合使用，將關注對象之抗體予以單離及精製(Antibodies A Laboratory Manual.Ed.Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。

(ii)抗體片段

為了產生抗體片段已開發了各式各樣的技術。以往係藉由完整的抗體之蛋白質分解消化而獲得該等片段(例如參照Morimoto et al.,Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及Brennan et al.,Science,229：81(1985))。但是該等片段現在可藉由重組寄主細胞直接產生。例如可以從抗體噬菌體庫將抗體片段予以單離。或可以從大腸菌直接回收Fab'-SH片段，進行化學的偶聯，並形成F(ab')₂片段(Carter et al.,Bio/Technology 10：163-167(1992))。依其他方式，可以從重組寄主細胞培養物將F(ab')₂片段直接單離。為了產生抗體片段之其他技術，對於該技術領域中有通常知識者係明顯。其他態樣中，最適抗體係單鏈Fv片段(scFv)。參照WO93/16185號；US5,571,894號；及US5,587,458號。又，抗體片段可如例如US5,641,870號記載，係「直鏈狀抗體」。如此的直鏈狀抗體片段可有單一的專一性或雙專一性。

(iii)標記化抗體

使本發明之抗體任意地與親和性標記、酵素標記、放射性同位素標記、螢光標記、或化學發光標記結合。例如藉由在表現FZD10之癌組織存在且可檢測之標記之存在，能夠判定診斷對象中是否有癌或腫瘤。又，可藉由癌組織之標記之局部性，判定病症之擴大。

適合使用的標記包括，例如：螢光素(fluorescein)及玫瑰紅等螢光標記；及冷光素酶等酵素標記。使用之可檢測之/檢測用之標記，可依使用之影像化樣式來選擇。如此的標記與抗體之結合體，可使用該技術領域公知之實驗步驟及技術製作。本發明中，本發明之抗體可於即將使用時與所望之標記結合，也可以已和標記結合之抗體之形式提供。

抗體與標記之結合體，可以使用N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀醯亞胺基-4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸酯、亞胺基硫烷(iminothiolane,IT)、醯亞胺酯之二官能性衍生物(例如二亞胺代己二酸二甲酯鹽酸鹽(adipimidic acid dimethyl HCl))、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))、醛(例如戊二醛)、雙疊氮化合物(例如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮鹽衍生物(例如雙-(對重氮鹽基苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)、及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)等各種二官能性蛋白質偶聯劑進行製作。或可利用例如重組技術或胜肽合成製作含有抗體及標記之融合蛋白質。如此的融合蛋白質之理想例可列舉ECFP、EYFP、或EGFP等標記蛋白質與抗體之融合蛋白質。

III. FZD10關連病症之診斷、利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之篩選(治療前診斷)、或利用FZD10抑制劑治療後之藥效之判定(治療後診斷)

FZD10，作為FZD10關連病症之診斷標記，及用以評價罹患該疾患之對象對於FZD10抑制劑之應答性及該抑制劑之藥效之標記為有用。因此本發明之抗體，可以作為用以診斷癌等 FZD10關連病症、用以篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象、或用以判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之標記之檢測試藥。

更具體而言，可以利用本發明之抗體而檢測從對象單離之試樣中之FZD10蛋白質，並實施FZD10關連病症之診斷、利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用FZD10抑制劑治療後之藥效之判定。因此本發明，提供在從對象單離之試樣中使用本發明之抗體檢測FZD10蛋白質以診斷對象中之FZD10關連病症或該病症之發病因素之方法、篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之方法、及判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之方法。該等方法包括以下步驟：(a)使從對象單離之試樣與本發明之抗體或其抗原結合性片段接觸之步驟；(b)藉由對於該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合進行檢測，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟：及(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與對照進行比較之步驟。

典型的態樣中，前述試樣係從前述對象單離之細胞或組織，較佳為從前述對象單離之組織。因此通常本發明之各方法皆針對從對象單離之試樣以試管內(in vitro)的方式實施。利用活組織檢查法(生檢)、採血等方法從對象將組織、細胞予以單離之方法係為公知。或也可利用經由為了治療之醫療性處置(外科手術等)而從對象取出的生物體試樣。從對象單離之細胞、組織在與抗體接觸前也可進行適當處理。例如一般而言，從對象獲得之組織試樣可於冷凍後切片，再以醇、福馬林等進行固定而作為免疫組織學解析用的試樣。或利用福馬林等將組織試樣、培養細胞等固定後，進行石臘包埋而獲得用以進行免疫組織學解析的切片。

本發明之抗體或其抗原結合性片段之與試樣之結合，亦即，與試樣中之抗原蛋白質之結合，可依照該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行檢測。更具體而言，可藉由本發明之抗體與前述試樣接觸後、利用洗淨以去除未結合於試樣中之FZD10者，之後檢測殘留在試樣中之抗體，以檢測本發明之抗體與試樣中之FZD10蛋白質之結合。此時抗體有直接標記時，可藉由檢測標記以檢測和FZD10蛋白質結合之本發明之抗體之存在。標記若為酵素、螢光物質、發光物質、或粒子等可檢測者，則可直接檢測該等標記。此外，本發明之抗體經生物素等親和性物質(結合性物質)標記時(親和性標記)，可以利用標記抗生物素蛋白等結合伙伴來捕捉抗體之存在。或本發明之抗體未經直接標記時，可利用針對抗體之結合試藥來檢測本發明之抗體。例如，可將作為抗體結合試藥之針對蛋白質A、抗體等之抗體進行標記而利用在抗體之檢測。

FZD10關連病症之診斷的情形，前述步驟(c)中，當相較於對照位準(正常對照位準，較佳為從未罹患FZD10關連病症之健常對象單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準)，FZD10蛋白質位準較高時，代表對象罹患有FZD10關連病症或有其發病風險。

又，當篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象時，前述步驟(c)中，當相較於對照位準(較佳為診斷為FZD10關連病症之對象之組織中之FZD10蛋白質之表現位準)，FZD10蛋白質位準為同程度或較高時，代表對象中之利用FZD10抑制劑之治療效果高。

另一方面，判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效的情形，前述步驟(c)中，相較於對照位準(較佳為從藥劑投予前之對象單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準)，FZD10蛋白質位準較低時，代表在對象中有藥效。

依本發明之診斷方法顯示有FZD10關連病症之患者，成為利用FZD10抑制劑治療之對象可能性高。因此可接續本發明之診斷方法，對於顯示有FZD10關連病症之患者投予FZD10抑制劑。也可進一步對於顯示FZD10抑制劑之治療效果高之患者篩選後投予FZD10抑制劑。又，接受FZD10抑制劑之投予之患者中，顯示該抑制劑有治療效果時，可繼續對於相同患者投予FZD10抑制劑。

亦即本發明係關於一種FZD10關連病症之治療方法，包括以下步驟：利用本發明之方法鑑定選自以下之群中之任意患者，並對於該患者投予FZD10抑制劑：依本發明之診斷方法顯示有FZD10關連病症之患者；顯示FZD10抑制劑之治療效果有高可能性之患者；及已接受FZD10抑制劑之投予之患者中，該抑制劑有治療效果之患者。

本發明中，對於患者投予之FZD10抑制劑能夠使用公知之化合物。本說明書中，對於FZD10表現細胞呈現細胞傷害活性之抗體、抑制FZD10之表現雙股RNA分子等，也包括在FZD10抑制劑。如此的抗體、雙股RNA分子等，例如可列舉WO2005/004912或WO2007/148417揭示之針對FZD10之抗體、及WO2006/013733揭示之對於FZD10為專一的siRNA。

關連於本發明，從知道未罹患FZD10關連病症(例如：非癌性)之生物體試樣測定之對照位準，稱為「正常對照位準」。從對象單離之試樣中的FZD10蛋白質位準相較於正常對照位準為較高時，可診斷對象有應接受治療之FZD10關連病症。

另一方面，從知道罹患FZD10關連病症(例如：癌性)之生物體試樣測定之對照位準，稱為「病症對照位準(例如：癌性對照位準)」。從利用FZD10抑制劑治療前之對象單離之試樣中的FZD10蛋白質位準與病症對照位準為同程度或更高時，可診斷對象利用FZD10抑制劑之治療效果高。

又，當從利用FZD10抑制劑治療後之對象單離之試樣中的FZD10蛋白質位準相較於藥劑投予前之同對象之病症對照位準為低時，可診斷治療有藥效，亦即，對象利用FZD10抑制劑之治療效果高。

特定態樣中，也可將從應接受治療之FZD10關連病症(例如癌)之器官之非罹患區域(例如：非癌性區域)獲得之正常細胞(或組織)作為正常對照使用。於其他態樣中，對照位準也可基於對於從知道病症狀態(例如：癌性或非癌性)之對象而來的試樣中之預先測定之FZD10蛋白質位準進行解析而獲得之結果，利用統計方法決定。再者，對照位準，可從來自以前試驗之試樣(細胞或組織)之表現模式之資料庫獲得。評價對象之試樣為組織試樣時，宜將來自相同組織之試樣作為對照試樣較佳。

再者，可依本發明之一態樣，將生物體試樣中之FZD10蛋白質位準和從多數參照試樣所測定之多數對照位準進行比較。宜使用來自與來自對象之生物體試樣之組織型為類似之組織型之參照試樣測得之對照位準較佳。再者，宜使用病症狀態已判明之集團中的FZD10蛋白質位準的基準值較佳。基準值可依該技術領域中公知之任意方法獲得。例如可將平均值+/-2 S.D.或平均值+/-3 S.D.之範圍作為基準值。

試樣中之FZD10蛋白質位準，其位準為對照位準之例如高出10%、25%、或50%、或高超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍、或更高時，可視為高。試樣中之FZD10蛋白質位準，其位準為對照位準之例如低10%、25%、或50%、或低超過1.1倍、超過1.5倍、超過2.0倍、超過5.0倍、超過10.0倍、或更低時，可視為低。

典型的態樣中，FZD10關連病症係表現FZD10之癌。表現FZD10之癌，例如：滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)及急性骨髓性白血病(AML)，但不限定於此等。

進一步態樣中，本發明提供一種檢測FZD10關連病症或該病症之發病因素之診斷標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性片段檢測試樣中之FZD10蛋白質以作為該診斷標記之步驟。已明白FZD10在某種癌細胞中會比起正常組織，表現更增強。因此若能夠專一地檢測FZD10之表現位準，則作為和其關連之病症之診斷標記有用。在與本發明之關連中，FZD10關連病症或該病症之發病因素之診斷標記，特徵為：係藉由和本發明之抗體或其抗原結合性片段之結合而檢測之從對象單離之試樣中之FZD10蛋白質，其表現位準相較於對照位準為高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險。在此，前述對照位準，係正常對照位準，較佳為從未罹患FZD10關連病症之健常對象單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準。一般而言，對照位準宜為和在欲檢測診斷標記之癌細胞所由來之組織為相同之組織中之表現位準較佳。

本發明也提供用以在FZD10關連病症或該病症之發病因素之診斷使用之本發明之抗體或其抗原結合性片段。或本發明提供用以診斷FZD10關連病症或該病症之發病因素之試藥之製造時使用本發明之抗體或其抗原結合性片段之用途。

此外，本發明提供檢測FZD10抑制劑治療應答性標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性片段檢測作為該應答性標記之試樣中之FZD10蛋白質之步驟。已知FZD10在某種癌細胞中專一地表現增強，如此的癌細胞的增殖會受FZD10抑制劑而抑制(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。亦即，可將FZD10之表現作為指標，預測針對FZD10抑制劑之應答性。原因在於FZD10若以高位準表現，則可以期待利用FZD10抑制劑所獲致之細胞增殖抑制作用。因此若能夠專一地檢測FZD10之表現位準，則作為FZD10 抑制劑治療應答性標記為有用。在與本發明之關連中，FZD10抑制劑治療應答性標記，係指利用與本發明之抗體或其抗原結合性片段之結合而檢測之從對象單離之試樣中之FZD10蛋白質，其特徵為：其表現位準相較於對照位準為同程度或更高時，代表對象中之利用FZD10抑制劑之治療效果高。在此，前述對照位準較佳為病症對照位準，亦即從知道罹患FZD10關連病症之對象之病症部位單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準，尤佳為從利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象在治療前單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準。

本發明也提供用以篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之用途的本發明之抗體或其抗原結合性片段。或本發明提供在用以篩選利用FZD10抑制劑治療效果高之對象之試藥之製造時之本發明之抗體或其抗原結合性片段之用途。

本發明也提供檢測FZD10抑制劑之藥效標記之方法，包括使用本發明之抗體或其抗原結合性片段來檢測試樣中之FZD10蛋白質作為該藥效標記之步驟。已知FZD10在某種癌細胞中會專一地表現增強，如此的癌細胞之增殖會因FZD10抑制劑而受抑制(WO2005/004912、WO2006/013733、WO2007/148417)。所以，有如此的癌細胞之癌組織會因FZD10抑制劑而縮小或死滅。亦即可將FZD10之表現位準作為指標，評價在有如此的癌細胞之對象中之FZD10抑制劑之藥效。原因是若從有FZD10陽性之癌細胞之組織單離之試樣中的FZD10的表現位準相較於利用FZD10抑制劑治療前所單離之試樣為減少，則可視為因FZD10抑制劑導致FZD10陽性之癌細胞減少。因此若能夠專一地檢測FZD10之表現位準，則作為FZD10抑制劑之藥效標記為有用。在與本發明之關連中，FZD10抑制劑之藥效標記係利用與本發明之抗體或其抗原結合性片段之結合檢測從已經投予FZD10抑制劑之對象單離之試樣中之FZD10蛋白質，其特徵為：其表現位準相較於對照位準為較低時，代表該對象有FZD10抑制劑之藥效。在此，前述對照位準較佳為從藥劑投予前之該對象之病症部位單離之試樣中之FZD10蛋白質之表現位準。

本發明也提供用以判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效時使用之本發明之抗體或其抗原結合性片段。或本發明提供為了判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效之試藥之製造時之本發明之抗體或其抗原結合性片段之用途。

IV. FZD10關連病症之診斷、利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用FZD10抑制劑之治療後之藥效之判定用之試藥或套組

本發明提供FZD10關連病症之診斷、利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之篩選、或利用FZD10抑制劑之治療後之藥效之判定用之試藥或套組。具體而言，該等套組包括作為FZD10蛋白質之檢測試藥的本發明之抗體或其抗原結合性片段。於一態樣，可以將本發明之診斷用藥或套組用之抗體利用螢光物質、發光物質、或放射性同位素予以標記。用以將抗體進行標記之的方法及用以對於標記抗體進行檢測的方法，係該技術領域中周知，可以將任意之標記及方法利用在本發明。

本套組可包括本發明之抗體或其抗原結合性片段與其他標記檢測試藥之組合。本套組可更包括針對FZD10之陽性及陰性之對照試藥，及用以對於本發明之抗體進行檢測之二次抗體。例如已知會高表現FZD10之細胞株之培養切片或組織試樣，可用於在作為有用的陽性對照試藥方面。又，例如：從健常對象或非癌性組織獲得之組織試樣，可用於作為有用的陰性對照試藥。用以檢測本發明之抗體之二次抗體，宜利用螢光物質、發光物質、放射性同位素、或酵素予以標記較佳。本發明之套組也可包括緩衝液、稀釋液、濾器、針、針筒、及記載了使用說明之附帶文書(例如書面、磁帶、CD-ROM等)從商業方面或使用者的立場方面希望使用的其他材料。該等試藥等可以保存在附標籤的容器中。適當的容器包括瓶、小玻璃瓶、及試管。容器可以由玻璃或塑膠等各種材料形成。

本發明已針對其特定之態樣在本說明書中詳細說明，但前述說明事實上係例示性地說明，應理解為係說明本發明及其理想態樣。該技術領域中有通常知識者可通過例行的實驗，由其中輕易地理解在不脫離本發明精神及範圍內進行各種變更及修正。故本發明可由上述說明規定，而意欲由附帶的申請專利範圍及它們的均等範圍所規定。

以下參照實施例對於本發明更詳細地記載。但是以下之材料、方法及實施例係為了協助該技術領域中有通常知識者製作及使用本發明之某形態，但另一方面，僅是用於說明本發明之態樣，故絕對不意欲限定本發明之範圍。該技術領域中有通常知識者可以在本發明之實施或試驗中使用和本說明書記載者為類似或同等方法及材料。

又，本說明書引用之全部先前技術文獻納入本發明說明書中作為參考。

【實施例】

以下舉實施例對於本發明詳細說明，但是本發明不限於此等實施例。

[材料及方法]

細胞培養

製作對於從ATCC購買的人類大腸癌細胞株DLD1導入了FZD10表現載體而得的FZD10強制表現細胞株(FZD10/DLD1)，並製作作為陰性對照的導入了空載體的細胞株(Mock/DLD1)。於5%CO₂之加濕環境中，於37℃，維持在補充了10%胎牛血清(FBS)、1%盤尼西林/鏈黴素及0.8mg/mL GENETICIN之RPMI-1640中。將從日本國立癌研究中心稀少癌中心分讓的人類滑膜肉瘤細胞株SYO-1，於5%CO₂之加濕環境中37℃，維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM中。將從JCRB購買的人類食道癌細胞株T.T，在5%CO₂之加濕環境中37℃，維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素的DMEM/F12(1：1)中。將從ATCC購買的人類肺癌細胞株H727，於5%CO₂之加濕環境中37℃，維持在補充了10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之RPMI-1640中。將從ATCC購買的人類大腸癌細胞株COLO201，於5%CO₂之加濕環境中37℃，維持在補充了10%胎牛血清(FBS)、1%盤尼西林/鏈黴素、10mM HEPES、1mM Sodium pyruvate及4.5g/L葡萄糖之RPMI-1640中。將從ATCC 購買的人類大腸癌細胞株LoVo，於CO₂之加濕環境中，於37℃維持在補充了20%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之F12中。

臨床檢體

來自外科切除之肺癌的組織試樣(福馬林固定石臘切片、冷凍組織)，及此等的對應臨床資訊，以取得書面的知情同意後，由神奈川癌症中心取得。

免疫組織化學染色(IHC)

將經福馬林固定石蠟切片化的FZD10/DLD1、Mock/DLD1、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201及臨床檢體，於二甲苯中浸3分鐘3次而脫石蠟後，於100%乙醇各浸1分鐘2次、於90%、70%、及50%乙醇浸1分鐘，使其再水合。為了進行抗原賦活處理，將已浸於抗原賦活化液pH9(Nichirei Bioscience)之切片，以FZD10/DLD1、Mock/DLD1於125℃溫育30秒、SYO1、T.T、H727、LoVo、COLO201及臨床檢體於95℃溫育40分鐘。溫育後於室溫放置20分鐘，以流水水洗5分鐘。以3.0%過氧化氫水浸10分鐘，進行內因性過氧化酶之阻斷，以Wash Buffer(TBS-T(Takara Bio))清洗5分鐘3次。再者，為了阻斷非專一性反應，在切片上滴加適量的Protein Block液(Dako)，並靜置10分鐘。以濕潤箱分別滴加適量的1次抗體(FZD10Ab(10A8H4G4)、FZD10(L164)pAb、FZD10 PolyclonalAb)，靜置60分鐘，以Wash Buffer清洗5分鐘3次。於濕潤箱中，適量滴加作為2次抗體之Histofine Simple Stain MAX-PO(Nichirei Bioscience)，並靜置30分鐘。以Wash Buffer清洗5分鐘3次。利用DAB基質溶液(Nichirei Bioscience)實施呈色反應。將切片浸於蘇木素(Dako)20秒，以流水洗淨。以50%、70%、及90%乙醇分別浸1分鐘、及以100%乙醇浸1分鐘2次，實施脫水。最後將切片於二甲苯浸3分鐘2次進行透徹，以Mount-Quick(DAIDO SANGYO)進行封入。

即時(RT)PCR

使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)從癌細胞株(SYO-1、COLO201)萃取總RNA。針對臨床冷凍組織(肺扁平上皮癌)，將冷凍組織片浸於TRIzol Reagent(Invitrogen)並磨碎，進行氯仿萃取。於獲得之萃取液中加入約等量的70%乙醇，使用RNeasy Mini kit(QIAGEN)萃取總RNA。使用SuperScript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)之反轉錄酵素，從總RNA合成cDNA。將cDNA作為模板，使用KAPA SYBR FAST ABI Prism qPCR kit(KAPA Biosystems)實施PCR反應。FZD10作為表現解析目的基因、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)作為家管基因。FZD10，係使用FZD10-11F：5'-GTGTGCAGCCGTAGGTTAAAG-3'(SEQ ID NO：12)、FZD10 R5：5'-GACTGGGCAGGGATCTCATA-3'(SEQ ID NO：13)之引子組，GAPDH，係使用GAPDH RT-PCR Fw：5'-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3'(SEQ ID NO：14)、GAPDH RT-PCR Re：5'-GGTCCACCACTGACACGTTG-3'(SEQ ID NO：15)之引子組，實施即時PCR反應。經時的監測PCR放大產物量，在PCR放大產物成指數函數地放大的區域中設定閾值並算出Ct值。將Ct值代入到檢量線，求算出未知樣本的濃度。藉由將FZD10基因之定量值除以GAPDH基因之定量值，實施樣本間之模板量的標準化，並比較FZD10基因之表現量。

流式細胞測量術(FCM)

將SYO1、T.T、H727、及LoVo分別在建議的培養基中維持直到成為早期融合(early-confluent)為止。為了避免細胞表面抗原的變性，接著使細胞以細胞剝離用溶液(Cell Dissociation Solution；SIGMA,MO)分離，以0.5% BSA/PBS懸浮。將懸浮細胞通過細胞濾網(cell strainer)，除掉塊狀物，計數細胞數。將細胞分注在96Well分析盤(2×10⁵個/50μL)。添加稀釋好的試驗抗體或培養上清50μL，於4℃靜置1小時。將盤於4℃以1500rpm離心5分鐘，去除上清後，以0.5% BSA/PBS 150μL清洗2次。和Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Invitrogen,CA)20mg/mL混合，於暗處中於4℃靜置1小時。將盤於4℃以1500rpm離心5分鐘，去除上清後，以0.5% BSA/PBS 150μL清洗2次，以120μL之0.5% BSA/PBS將細胞懸浮。依照FACS Calibur(Becton Dickinson,NJ)的製造商的使用說明書，評價試驗抗體之結合模式及專一性。

[實施例1]抗FZD10單株抗體之製作

(1)以可溶型FZD10蛋白質作為免疫原之抗FZD10抗體產生融合瘤之取得

FZD10為膜蛋白質，所以製作對固定之膜蛋白質反應之抗體時，細胞外區域能成為免疫原。FZD10之N末端以外之細胞外區域非常短，據認為不易作為抗原，所以選擇N末端之細胞外區域(1-161胺基酸)作為免疫原，將訊息胜肽以外的可溶型FZD10蛋白質(21-161胺基酸區域)(SEQ ID NO：9)作為免疫原，製作單株抗體。於佛洛伊德佐劑(Freund Adjuvant)加入抗原胜肽50μg後，將其乳劑化，對於Balb/c小鼠(日本SLC(股)公司)進行皮下注射以實施初次免疫。第2次以後的免疫，係藉由將同樣方式製備的相當於25μg抗原胜肽量進行皮下注射以實施。最終免疫起3日後，從小鼠無菌地製備脾臟細胞，依常法以聚乙二醇法實施與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的細胞融合。

(2)抗FZD10抗體產生融合瘤之挑選

抗FZD10抗體之挑選，首先，利用使用可溶性FZD10蛋白質的ELISA法篩選與FZD10有結合性之抗體。針對以ELISA法所選擇之抗體，進一步利用免疫染色法實施挑選。利用免疫染色法所為之挑選，利用使用了表現全長FZD10蛋白質(SEQ ID NO：22)之FZD10強制表現細胞株FZD10/DLD1的免疫組織化學染色以進行。亦即，將使全長FZD10蛋白質強制表現之FZD10強制表現細胞株FZD10/DLD1進行福馬林固定石蠟切片化後，實施免疫染色，並挑選出認為有強反應的融合瘤。

針對試驗的融合瘤當中已確認以高位準產生FZD10專一性抗體的融合瘤選殖體10A8H4G4的免疫組織化學染色之結果，示於第2圖。如第2圖的照片及圖所示，使用10A8H4G4染色時，由FZD10強制表現細胞株FZD10/DLD1製作的石蠟切片有染色，亦即顯示FZD10陽性細胞之比例高。另一方面，由作為陰性對照之導入了空載體的細胞株(Mock/DLD1)的石蠟切片，幾乎未被染色，顯示FZD10陽性細胞之比例低。由該等結果可知融合瘤選殖體10A8H4G4可用於作為產生在免疫組織化學染色中專一地檢測FZD10之抗體的融合瘤。

另一方面，使用市售抗體(FZD10(L164)Ab、FZD10PolyclonalAb)染色時，FZD10/DLD1與Mock/DLD1皆觀察到染色(在高比例的細胞檢測到訊息)。所以，懷疑該等市售之抗體獲得的檢測結果可能包括了偽陽性訊息。

由以上之結果，可知本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)在免疫組織化學染色法中，具有相較於市售抗FZD10抗體，能以較高專一性檢測FZD10之有利性質。

將此融合瘤選殖體10A8H4G4選擇為以使其產生進一步實驗用之抗體。將融合瘤選殖體10A8H4G4大量培養，2~3週後收集培養液。使用蛋白質A管柱(GE Healthcare,NJ)，從培養液精製抗體。本說明書中，本發明之抗體也稱為選殖體10A8H4G4。

[實施例2]抗FZD10單株抗體之專一性之評價

然後，使用FZD10之表現量相異的各種細胞株，評價10A8H4G4之專一性。亦即，比較使用10A8H4G4之免疫組織化學染色及流式細胞測量術之結果，並研究是否有因應FZD10蛋白質之表現量的染色。在此，在使用各癌種之細胞株之mRNA之表現解析資料庫Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)中，肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)顯示有顯著的向上調控(第1圖)。故，將由該等癌種而來的細胞株用在以下之解析。

首先，依照使用10A8H4G4之流式細胞測量術，確認各種人類癌組織來源的細胞株的細胞膜上有內因性之FZD10蛋白質表現。如第3圖，除了已知有內因性之FZD10蛋白質表現之來自人類滑膜肉瘤的SYO-1以外，來自人類食道癌之細胞株T.T及來自人類肺癌之細胞株H727，也利用使用10A8H4G4之流式細胞測量術檢測到陽性訊息。另一方面，已知為FZD10不表現細胞株之來自人類大腸癌之細胞株LoVo，在使用10A8H4G4之流式細胞測量術並未檢測到陽性訊息。

然後，針對由該等細胞株製作之石蠟切片，使用10A8H4G4實施免疫組織化學染色。如第3B圖所示，使用10A8H4G4染色的結果，由確認有FZD10表現的細胞株SYO-1、T.T、H727製作的石蠟切片，觀察到有染色。該等石蠟切片檢測到與流式細胞測量術之結果為相關的高比例之細胞有陽性的信號。另一方面，由FZD10不表現細胞株LoVo製作的石蠟切片幾乎未被染色，幾乎未檢測到陽性的信號。

由以上之結果顯示本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)，在流式細胞測量術、免疫組織化學染色法皆是能以高專一性檢測試樣中之FZD10蛋白質的有用工具。

[實施例3]腫瘤移植模型及臨床檢體中之FZD10蛋白質之檢測

本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)在免疫組織化學染色中之專一性，是使用由癌細胞株之小鼠異種移植腫瘤製作之石蠟切片以及肺癌臨床檢體進行評價。由SYO-1、COLO201細胞株之小鼠異種移植腫瘤製作之石蠟切片以及肺癌臨床檢體1~6之腫瘤區及非腫瘤區中的FZD10的蛋白質及RNA的表現，分別以免疫組織化學染色及RealTime-PCR檢測，結果示於第4圖。

如第4圖，於由已確認FZD10之RNA有高表現之細胞株SYO-1之小鼠異種移植腫瘤製作之石蠟切片，檢測到被10A8H4G4染色之細胞，亦即FZD10陽性細胞，但是於由FZD10之RNA之表現量少之細胞株COLO201之小鼠異種移植腫瘤製作之石蠟切片，被10A8H4G4染色之細胞，亦即FZD10陽性細胞少。此結果顯示本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)是用於在免疫組織化學染色法中、獲得與試樣中之FZD10蛋白質之表現量相關之檢測結果之有用工具。

又，於已確認腫瘤區專一性的FZD10的RNA有表現的肺癌臨床檢體5，檢測到被10A8H4G4染色之細胞，亦即FZD10陽性細胞，但是未確認腫瘤區域專一性的FZD10的RNA的表現的其他肺癌臨床檢體，則幾乎未染色，幾乎未檢測到FZD10陽性細胞。此結果顯示10A8H4G4在臨床檢體亦能專一性地檢測FZD10蛋白質。

[實施例4]抗FZD10單株抗體之可變區之胺基酸序列分析

分析本發明之抗FZD10抗體(10A8H4G4)之可變區之胺基酸序列。

使用RNeasy mini kit(QIAGEN)從融合瘤10A8H4G4萃取總RNA。使用Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen)，從總RNA合成cDNA。cDNA合成用之引子如下。

重鏈3'引子之mIGCUniRv：5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3'(SEQ ID NO：16)

輕鏈3'引子之mIGKRv2：5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3'(SEQ ID NO：17)

使用5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends(Invitrogen)在cDNA末端附加dC之聚合物，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen)，將編碼為單株抗體之可變區之多核苷酸放大。放大用之引子如下。引子序列中之鹼「I」代表肌苷。

重鏈5'及輕鏈5'引子之5' RACE Abridged Anchor Primer：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3'(SEQ ID NO：18)、重鏈3'引子之mIGCUniRv2：5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3'(SEQ ID NO：19)，及輕鏈3'引子之mIGKNesRv2：5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3'(SEQ ID NO：20)。

將PCR產物選殖到pGEM-T Easy Vector(Promega)。將***片段區域定序，並決定10A8H4G4之可變區(不含訊息序列)之核酸序列。

小鼠單株抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區之胺基酸序列及核酸序列，依以下之方式決定。

10A8H4G4、重鏈可變區胺基酸序列(不含訊息序列)：

(SEQ ID NO：7)(由SEQ ID NO：10所示之核酸序列編碼)

10A8H4G4、重鏈可變區核酸序列：

(SEQ ID NO：10)

10A8H4G4、輕鏈可變區胺基酸序列(不包括訊息序列)：

(SEQ ID NO：8)(由SEQ ID NO：11所示之核酸序列編碼)

10A8H4G4、輕鏈可變區核酸序列：

(SEQ ID NO：11)

依Kabat之定義決定之本發明之抗體(10A8H4G4)之CDR序列如下。

重鏈CDR1(CDR-H1)：TSGLGVS(SEQ ID NO：1)；重鏈CDR2(CDR-H2)：HIYWDDDKRYNPSLKS(SEQ ID NO：2)；重鏈CDR3(CDR-H3)：RAYYGNYYALDY(SEQ ID NO：3)；輕鏈CDR1(CDR-L1)：KSSQSLLNSGNQKNYLT(SEQ ID NO：4)；輕鏈CDR2(CDR-L2)：WASTRKS(SEQ ID NO：5)；及輕鏈CDR3(CDR-L3)：QNDYSYPVT(SEQ ID NO：6)

[產業利用性]

本發明成功地製作能以高專一性檢測從臨床檢體等對象單離之試樣中的FZD10蛋白質的抗FZD10抗體。藉由使用本發明之抗FZD10抗體，能以高感度且低背景檢測試樣中之FZD10蛋白質。因此本發明之抗體對於診斷表現FZD10之癌等FZD10關連病症有用。又，本發明之抗體可檢測因應試樣中之FZD10之表現量之FZD10，故對於利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之篩選(治療前診斷)、對象中之利用FZD10抑制劑治療後之藥效之判定(治療後診斷)也有用。

<110> 腫瘤療法科學股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE,INC.)

<120> 針對FZD10之單株抗體及其用途

<130> ONC-A1605-TW

<140> 106134171

<141> 2017-10-03

<150> JP 2016-197881

<151> 2016-10-06

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VH CDR1

<400> 1

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VH CDR2

<400> 2

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VH CDR3

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VL CDR1

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VL CDR2

<400> 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> VL CDR

<400> 6

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 重鏈可變區

<400> 7

<210> 8

<211> 116

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 輕鏈可變區

<400> 8

<210> 9

<211> 141

<212> PRT

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對免疫原之FZD10片段

<400> 9

<210> 10

<211> 366

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 重鏈可變區核酸序列

<400> 10

<210> 11

<211> 348

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 輕鏈可變區核酸序列

<400> 11

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對FZD10之人為合成之正向引子序列

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對FZD10之人為合成之反向引子序列

<400> 13

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對GAPDH之人為合成的正向引子序列

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對GAPDH之人為合成的反向引子序列

<400> 15

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對VH之人為合成的3’引子序列

<400> 16

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對VL之人為合成的3’引子序列

<400> 17

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對VH及VL之人為合成之5’引子序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(25)

<223> n為肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(30)

<223> n為肌苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(35)

<223> n為肌苷

<400> 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對VH之人為合成的3’引子序列

<400> 19

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人造序列

<220>

<223> 針對VL之人為合成的3’引子序列

<400> 20

<210> 21

<211> 3288

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (485)..(2230)

<300>

<308> Genbank acc no.NM_007197.3

<309> 2015-12-31

<313> (1)..(3288)

<400> 21

<210> 22

<211> 581

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 22

Claims

一種抗體或其抗原結合性片段，能夠與FZD10蛋白質或其部分胜肽結合，包含重鏈可變區及輕鏈可變區之兩者，該重鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之CDR3，該輕鏈可變區包括：含有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之CDR1；含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之CDR2；及含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之CDR3。
如申請專利範圍第1項所述之抗體或其抗原結合性片段，其中，包含含有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之輕鏈可變區之兩者。
如申請專利範圍第1或2項所述之抗體或其抗原結合性片段，專一性地認識由SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列構成之多肽。
如申請專利範圍第1或2項所述之抗體或其抗原結合性片段，係結合了親和性標記、酵素標記、放射性同位素標記、或螢光標記。
一種多核苷酸，係編碼為如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段。
一種用於診斷FZD10關連病症、判定利用FZD10抑制劑治療後之藥效、或篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之試藥，含有如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段。
如申請專利範圍第6項所述之試藥，其中該FZD10關連病症為表現FZD10之癌。
如申請專利範圍第7項所述之試藥，其中，該癌係選自於由滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)及急性骨髓性白血病(AML)構成之群組。
一種診斷在對象中之FZD10關連病症或該病症之發病因素之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣和如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段接觸之步驟；(b)藉由檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；及(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與對照比較之步驟，於和對照比較，FZD10蛋白質位準較高時，代表該對象罹患該病症或有其發病風險。
如申請專利範圍第9項所述之方法，該FZD10關連病症係表現FZD10之癌。
如申請專利範圍第10項所述之方法，其中，該癌係選自於由滑膜肉瘤、肺癌、食道癌、結腸直腸癌(大腸癌)、胃癌、慢性骨髓性白血病(CML)及急性骨髓性白血病(AML)構成之群組。
一種檢測試樣中之FZD10蛋白質之方法，包括以下之步驟：(a)使從對象單離之試樣和如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段接觸之步驟；及(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟。
一種判定在對象中之利用FZD10抑制劑治療後之藥效之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；及(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與藥劑投予前之表現位準進行比較之步驟，於和藥劑投予前相較，FZD10蛋白質位準較低時，代表在該對象中有藥效。
一種篩選利用FZD10抑制劑之治療效果高之對象之方法，包括以下之步驟：(a)使從該對象單離之試樣接觸如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之抗體或其抗原結合性片段之步驟；(b)檢測該抗體或其抗原結合性片段與該試樣之結合，以檢測該試樣中之FZD10蛋白質之步驟；及(c)將該試樣中之FZD10蛋白質位準與對照進行比較之步驟，於和對照相較，FZD10蛋白質位準為同程度或更高位準時，代表在該對象中之利用FZD10抑制劑之治療效果高。
如申請專利範圍第9至14項中任一項所述之方法，其中，該試樣係從該對象單離之細胞或組織。
一種製造能夠和FZD10蛋白質或其部分胜肽結合之抗體或其抗原結合性片段之方法，包括以下步驟：(a)培養含有導入了如申請專利範圍第5項所述之多核苷酸之載體之細胞之步驟；及(b)從該細胞之培養物或培養基回收該抗體之步驟。