JP4874234B2 - 非小細胞肺癌関連遺伝子ANLN、およびそのRhoAとの相互作用 - Google Patents
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Description
本発明は、癌、特に肺癌の処置および予防に有用な化合物を同定するための方法およびキットに関し、ならびに、それを処置および予防するための方法および組成物に関する。さらに詳しくは、本方法は、非小細胞肺癌でアップレギュレートされている癌特異的遺伝子であるANLN(全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT公報WO2004/031413を参照されたい)が、腫瘍形成に関わる低分子量GTPaseのRasホモロジーファミリーのメンバーであるRhoAと相互作用するという発見に関する。
肺癌は世界中で最も一般的な癌による死因の一つであり、非小細胞肺癌(NSCLC)がこれらのケースの80%近くを占めている(Greenlee, R.T. et al. CA. Cancer J. Clin. 51:15-36 (2001)(非特許文献1))。肺癌の発症および/または進行に関わる多くの遺伝子変化が報告されているが、正確な分子メカニズムは不明のままである(Sozzi, G., Eur. J. Cancer. 37:63-73 (2001)(非特許文献2))。新たに開発された細胞毒性薬剤は進行したNSCLCを有する患者に複数の治療選択肢を与えるが、これらの新たな治療法の各々はシスプラチンをベースに使用する療法と比較して少しの生存利益を提供できるのみである(Schiller, J.H. et al. N. Engl. J. Med. 346(2):92-98 (2002)(非特許文献3); Kelly, K. et al. J. Clin. Oncol. 19(13):3210-3218 (2001)(非特許文献4))。それゆえ、分子標的薬剤および抗体の開発ならびに癌ワクチンのような新規治療戦略が熱望される。
本発明は、ANLNおよびRhoAが非小細胞肺癌細胞中で相互作用すること、さらに、ANLNの核局在が非小細胞肺癌患者における不良な予後に関係しているという知見に基づく。よって、本発明は、ANLN/RhoA相互作用を妨害することによって、またはANLNを介する細胞運動性を阻害することによって、癌、例えば非小細胞肺癌の進行を遅延または停止させる化合物を同定するための新規方法を提供する。本発明はまた、サンプル中のANLNの核局在の有無を決定することによって、癌患者について予後を判断するための方法を提供する。
(a)試験化合物の存在下で、ANLNポリペプチドのRhoA結合ドメインを含むポリペプチドを、RhoAポリペプチドのANLN結合ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程;および
(c)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
(a)活性化RhoAの濃度;
(b)RhoAとRHOエフェクターまたはそのRhoA結合領域との間の相互作用;
(c)活性化RhoAを介する下流遺伝子発現または下流遺伝子産物活性を含む任意のシグナル複合体の活性化;
(d)DNA合成および細胞周期移行の促進;
(e)細胞遊走または任意の他の発癌表現型;
(f)アクチンストレスファイバー形成およびF-アクチン産生;ならびに
(g)細胞接着、遊走、および浸潤に重要な任意の分子との相互作用。
(a)ANLNポリペプチドのRhoA結合ドメインを含む第一のポリペプチド;
(b)RhoAポリペプチドのANLN結合ドメインを含む第二のポリペプチド;および
(c)第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間の相互作用を検出する手段(例えば試薬)。
(a)活性化RhoAの濃度;
(b)RhoAとRHOエフェクターまたはそのRhoA結合領域との間の相互作用;
(c)活性化RhoAを介する下流遺伝子を含む任意のシグナル複合体の活性化;
(d)DNA合成および細胞周期移行の促進;
(e)細胞遊走または任意の他の発癌表現型;
(f)アクチンストレスファイバー形成およびF-アクチン産生;ならびに
(g)細胞接着、遊走、および浸潤に重要な任意の分子との相互作用。
(a)ANLNポリペプチドまたはその機能的同等物を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程;
(b)細胞のANLNを介する運動性を検出する工程;および
(c)試験化合物の非存在下で検出される運動性レベルと比較して細胞の運動性を阻害する試験化合物を選択する工程。
(a)ANLNポリペプチドまたはその機能的同等物を発現する細胞;および
(b)細胞の運動性を検出する手段(例えば試薬)。
(a)NSCLCの予後を予測しようとする対象から収集された試料の核に局在するANLNを検出する工程、および
(b)核内のANLNの局在が検出された場合に予後が不良であると予測する工程。
(a)ANLNタンパク質を認識する抗体を試料と接触させる工程;および
(b)核領域において試料に結合する抗体を検出する工程。
(a)試験化合物の存在下で、ANLNポリペプチドのRhoA結合ドメインを含むポリペプチドを、RhoAポリペプチドのANLN結合ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程;および
(c)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程。
(a)ANLNポリペプチドまたはその機能的同等物を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程;
(b)細胞の運動性を検出する工程;および
(c)試験化合物の非存在下で検出される運動性レベルと比較して細胞の運動性を阻害する試験化合物を選択する工程。
(a)試験化合物の存在下で、ANLNポリペプチドのRhoA結合ドメインを含むポリペプチドを、RhoAポリペプチドのANLN結合ドメインを含むポリペプチドと接触させる工程;
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程;および
(c)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程;
または、
(a)ANLNポリペプチドまたはその機能的同等物を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程;
(b)細胞の運動性を検出する工程;および
(c)試験化合物の非存在下で検出される運動性レベルと比較して細胞の運動性を阻害する試験化合物を選択する工程。
I. 概説
分子標的薬は、明確な作用メカニズムによって副作用を最小限に抑えつつ、悪性細胞に高度に特異的であることが期待される。このような薬の開発のための適切な分子標的を同定するために見込みある戦略として、本発明者らは、癌細胞で過剰発現している遺伝子を選択できるゲノム全域にわたる発現解析を、RNAi技術による機能喪失効果のハイスループットスクリーニングと組み合わせた。加えて、組織マイクロアレイ方法を応用し、可能性のある標的タンパク質の検証のために何百もの保管臨床サンプルを解析した。この種の体系的なアプローチを用いて、ANLNが臨床NSCLCサンプルならびに細胞株中で高頻度に過剰発現していること、また、この遺伝子産物が肺癌細胞の成長および進行において必要不可欠な役割を担うことを本明細書において示す。
本明細書において用いられる冠詞(a、an、およびthe)は、特に具体的に示されていない限り「少なくとも1つ」を意味する。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リジン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);および
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984) を参照されたい)。
ANLNがRhoAと相互作用し、ANLN発現が癌患者における不良な予後に関連するという本明細書に提供される事項を考慮し、本発明の一局面は、ANLNとRhoAとの間の結合を減少または予防する試験化合物を同定することに関する。さらに、ANLNの発現が細胞運動性の増加と関連するという本明細書において提供される事項を考慮し、本発明は、ANLNを介する運動性を阻害する試験化合物を同定する方法を提供する。
本発明の一部の局面において、試験化合物は抗ANLNまたは抗RhoA抗体である。一部の態様において、これら抗体は、ヒト化抗体を含むがこれに限定されないキメラである。場合によっては、本発明の抗体の態様は、これらタンパク質の片方がもう一方に会合する境界面でANLNまたはRhoAのいずれかに結合する。一部の態様において、これら抗体は、生理的条件下で少なくとも約105 mol-1、106 mol-1以上、107 mol-1以上、108 mol-1以上、または109 mol-1以上のKaでANLNまたはRhoAに結合する。このような抗体は、例えばChemicon, Inc. (Temecula CA) などの商業的供給元から購入することができ、あるいは実質的に精製されたANLNまたはRhoAタンパク質、例えばヒトタンパク質またはその抗原性断片などを、免疫原として用いて作製することができる。提供された免疫原からモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方を調製する方法は、当技術分野において周知である。精製技術、および特定の免疫原に対する抗体を同定するための方法については、例えば、その全体が参照として本明細書に組み入れられるPCT/US02/07144 (WO/03/077838) を参照されたい。例えば親和性カラムを形成するために抗体親和性マトリックスを用いる抗体精製法も当技術分野において周知で、市販されている(AntibodyShop, Copenhagen, Denmark)。ANLN/RhoAの会合を阻害しうる抗体の同定は、試験化合物について全般的に以下に詳述するものと同じ試験アッセイを用いて行われる。
変換酵素は本発明の試験化合物となりうる。本発明の文脈において、変換酵素とは、ANLN、RhoA、または両方に対して共有結合性翻訳後修飾を行う分子触媒である。本発明の変換酵素は、ANLNおよび/またはRhoAの1つまたは複数のアミノ酸残基を、修飾タンパク質の構造中のアロステリック変化を引き起こすように、あるいはANLNとRhoAとの間の結合を妨害するようにANLN/RhoA分子結合部位の化学的性質もしくは修飾タンパク質の構造を変えて、共有結合的に修飾する。本明細書において、これら2分子間の結合の妨害とは、結合のKaにおいて、30℃、イオン強度0.1、界面活性剤の非存在下で測定したこれらタンパク質間の結合のKaと比べて、少なくとも25%、30%、40%、50%、60%、70%またはそれ以上低下させることを指す。本発明の例示的な変換酵素には、キナーゼ、ホスファターゼ、アミダーゼ、アセチラーゼ、グリコシダーゼなどが含まれる。
試験化合物ライブラリーの構築は当技術分野において周知であるが、本セクションでは、試験化合物の同定と、ANLN/RhoA相互作用および/またはANLNを介する細胞運動性の有効な阻害剤のスクリーニングのためのこのような化合物のライブラリーの構築とにおけるさらなるガイダンスを提供する。
試験化合物ライブラリーの構築は、求められる特性を有することが知られている化合物の分子構造、ならびに/または阻害する標的分子、すなわちANLNおよびRhoAの分子構造の知識によって促進される。さらなる評価に適した試験化合物の予備スクリーニングに対する1つのアプローチが、試験化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。本発明において、ANLNおよび/またはRhoAの間の相互作用をモデリングすることにより、相互作用自体の詳細への洞察が提供され、また、可能性のある、相互作用の分子阻害剤を含む、相互作用を阻害するために可能な方法が示唆される。
試験化合物のコンビナトリアルライブラリーは、ANLN/RhoA相互作用の公知の阻害剤に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として産生しうる。このアプローチは、ライブラリーを妥当なサイズに維持することが可能であり、ハイスループットスクリーニングを促進する。または、単純な、特に短いポリマー分子ライブラリーは、ライブラリーを構成する分子ファミリーの全ての並べ換えを単純に合成することによって構築しうる。この後者のアプローチの一例は、すべてのペプチドが6アミノ酸長のライブラリーであろう。このようなペプチドライブラリーは、全ての6アミノ酸配列の並べ換えを含みうる。このタイプのライブラリーは直線的コンビナトリアルケミカルライブラリーと呼ばれる。
別のアプローチは、組換えバクテリオファージを用いてライブラリーを産生する。この「ファージ法」(Scott and Smith, Science 249:386-390, 1990; Cwirla, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382, 1990; Devlin et al., Science, 249:404-406, 1990)を用いて、非常に大きなライブラリーを構築することができる(例えば106〜108化学単位)。第二のアプローチは主に化学的方法を用いるものであり、Geysen法(Geysen et al., Molecular Immunology 23:709-715, 1986; Geysen et al. J. Immunologic Method 102:259-274, 1987)およびFodorらの方法(Science 251:767-773, 1991)がその例である。Furka et al. (14th International Congress of Biochemistry, Volume #5, Abstract FR:013, 1988; Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493, 1991)、(米国特許第4,631,211号) 、および (米国特許第5,010,175号)が、アゴニストまたはアンタゴニストとして試験されうるペプチドの混合物を産生するための方法を記載している。
本発明のスクリーニング方法は、ANLN/RhoAの会合またはANLNを介する細胞運動性を妨害する確率が高い試験化合物の効率的で迅速な同定を提供する。一般に、ANLN/RhoAの会合またはANLNを介する細胞運動性を妨害する試験化合物の能力を決定する方法はいずれも本発明と共に使用するのに適する。例えば、ELISA形式の競合および非競合阻害アッセイを利用しうる。対照実験を行ってシステムの最大結合能を決定すべきである(例えば、下記の例においては、結合させたANLNをRhoAと接触させ、ANLNに結合するRhoAの量を決定する)。
本発明の試験化合物をスクリーニングするために競合アッセイを用いうる。例として、競合ELISA形式は、固体支持体に結合されたANLN(またはRhoA)を含みうる。この結合されたANLN(またはRhoA)は、RhoA(またはANLN)および試験化合物とインキュベートされる。試験化合物および/またはRhoA(もしくはANLN)をANLN(またはRhoA)に結合させるのに十分な時間の後、基質を洗浄して非結合物質を除く。そしてANLN(またはRhoA)に結合したRhoA(またはANLN)の量を決定する。これは、当技術分野で公知の様々な方法のいずれか、例えば、検出可能な標識でタグ付されたRhoA(またはANLN)種を用いて、あるいは洗浄した基質を標識化抗RhoA(またはANLN)抗体と接触させて、遂行しうる。ANLN(またはRhoA)に結合したRhoA(またはANLN)の量は、RhoA/ANLNの会合を妨害する試験化合物の能力に反比例するであろう。抗体を含むがそれに限定されないタンパク質の標識は、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988) に記載されている。
非競合結合アッセイも、本明細書に記載されるもののような競合アッセイを用いたスクリーニングに容易に適用できない形式で構築された試験化合物ライブラリーの初期スクリーニングとして有用でありうる。このようなライブラリーの一例は、ファージディスプレイライブラリーである(例えば、Barrett, et al. (1992) Anal. Biochem 204, 357-364を参照されたい)。
変換酵素である試験化合物は、アッセイする変換酵素に特異的なコファクターおよび補助基質を用いて非競合形式でアッセイしうる。このようなコファクターおよび補助基質は、調べる変換酵素のタイプが与えられれば、当業者に公知である。
上記のスクリーニングの態様は、さらなる調査に適する試験化合物のハイスループットな決定に適する。本発明のスクリーニング方法は、以下のものの1つまたは複数の検出を含みうる:
(a)活性化RhoAの濃度;
(b)RhoAと、RHOエフェクター(例えばROCK(Maekawa, M. et.al. Science vol 285. 895-898(1999))、Rhophilin-2(Jeremy W. Peck et.al. Journal of Biological Chemistry 277, 43924-32(2002))、またはそのRhoA結合領域との間の相互作用;
(c)活性化RhoAを介する下流遺伝子発現(例えばROCK(Stephan A.K. Harvey et.al. Investigative Ophthalmology & Visual Science 45, 2168-76(2004))、c-JUN(Maria Julia Marinissen et.al. Molecular Cell 14, 29-41(2004))、または下流遺伝子産物活性(例えばERK(Laboureau J, et.al. Experimental Dermatology 13, 70-7(2004))、GATA-4(Yanazume T, et.al. The Journal of Biological Chemistry 277, 8618-25(2002))を含む任意のシグナル複合体の活性化;
(d)DNA合成および細胞周期移行の促進;
(e)細胞遊走または任意の他の発癌表現型細胞接着、細胞浸潤(Shibata, T et.al. American Journal of Pathology 164, 2269-78(2004), Selma Cetin et.al. The Journal of Biological Chemistry 279, 24592-600(2004));
(f)アクチンストレスファイバー形成およびF-アクチン産生;ならびに
(g)細胞接着、遊走、および浸潤に重要な任意の分子との相互作用(Spred(Miyoshi, K. et.al. Oncogene 23, 5567-5576(2004))、Smurf1(Hong-Rui Wang et.al. Science 302, 1775-9(2003)))。
よって、本発明は、癌、特に非小細胞肺癌などの肺癌、ならびにANLNおよび/もしくはRhoAの発現レベルおよび活性の上昇を示す細胞、ならびに/またはANLNの核局在によって特徴付けられる他の癌の予防または処置に有用な薬剤および方法を含む。これら薬剤および方法は、ANLN/RhoA相互作用を阻害するとして同定された本発明の少なくとも1つの試験化合物を、異常な細胞増殖の減衰または停止を達成するのに有効な量で含む。より具体的には、治療的に有効な量とは、処置対象の発症を防ぐのに、あるいはその既存の症状を緩和するのに、有効な量を意味する。
本発明の薬剤のための有効な用量範囲の決定は、特に本明細書に提供される詳述された開示を鑑みれば、十分に当業者の能力の範囲内である。試験化合物の治療的に有効な用量は、まず細胞培養アッセイおよび/または動物モデルから推定できる。例えば、動物モデルにおいて用量を定め、細胞培養で決定されるIC50(50%の細胞が所望の効果を示す用量)を含む循環濃度範囲を達成することができる。また、試験化合物の毒性および治療有効性は、例えば、LD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%に治療有効量)を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が、治療指数(すなわちLD50とED50の比)である。高い治療指数を示す化合物を用いることができる。これら細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトに用いる用量範囲を定める際に用いうる。このような化合物の用量は、毒性がほとんどないかまたは全くないED50を含む循環濃度の範囲内に収まるであろう。用量は、使用される用量形態および利用される投与経路に従い、この範囲内で変わりうる。厳密な処方、投与経路、および用量は、患者の状態を考慮して個別の医師によって選択されうる。例えばFingl et al., (1975), in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p1を参照されたい。用量および間隔は、所望の効果を維持するのに十分な活性試験化合物の血漿レベルを提供するように個別に調整しうる。
哺乳類(例えばヒト)に投与する薬剤は、薬学的に許容される添加物、または担体を含みうる。適した添加物およびそれらの製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., (1980), Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.に記載されている。水溶性の調製物には、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤中に典型的に用いられる。薬学的に許容される等張添加物の例としては、生理的食塩水、リンゲル液、ハンクス液、およびデキストロース溶液などの液体が含まれる。等張添加物は、注射用製剤に特に重要である。
ANLN/RhoAの会合の阻害物質(disruptor)として同定されたタンパク質およびペプチド試験化合物は、癌、例えば非小細胞肺癌に苦しむ患者に遺伝子療法を用いて治療的に送達しうる。遺伝子療法技術に適用できる例示的試験化合物としては、変換酵素や、立体またはアロステリック阻害によってANLN/RhoAの会合を直接変化させるペプチドが含まれるが、これらに限定されない。一部の局面において、遺伝子療法の態様は、本発明の適した同定された試験化合物をコードする核酸配列を含む。一部の態様において、核酸配列は、標的細胞における試験化合物の発現に必要なそれらの調節エレメントを含む。核酸は、標的細胞のゲノムに安定に挿入されるように準備されうる(例えば、相同組換えカセットベクターの記載について、Thomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503を参照されたい)。
本発明はまた、癌、特に非小細胞肺癌(NSCLC)などの肺癌の処置または予防に有用な化合物をスクリーニングするための材料を含む製品またはキットも提供する。このような製品は、本明細書に記載される材料の、1つまたは複数のラベルされた容器を、使用説明と共に含みうる。適した容器には、例えば、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。
(1)活性化RhoAの濃度;
(2)RhoAとRHOエフェクターまたはそのRhoA結合領域との間の相互作用;
(3)活性化RhoAを介する下流遺伝子を含む任意のシグナル複合体の活性化;
(4)DNA合成および細胞周期移行の促進;
(5)細胞遊走または任意の他の発癌表現型;
(6)アクチンストレスファイバー形成およびF-アクチン産生;ならびに
(7)細胞接着、遊走、および浸潤に重要な任意の分子との相互作用。
本方法は、数々のタイプの癌の診断、予後、分類、および処置に用いることができる。原発性、転移性、および再発癌などの任意の進行段階の癌を検出することができる。診断、予後、分類のための例示的な癌には、例えば、非小細胞肺癌(NSCLC)などの肺癌が含まれる。
上記に提供した開示から理解できるように、本発明は広範な応用を有する。よって、以下の実施例は例示目的のために提供するものであって、いずれにしても本発明を限定するものと見なす意図はない。当業者は、本質的に類似の結果を得るために変化または修飾しうる様々な重要でないパラメータを容易に認識するであろう。
(a)細胞株および臨床サンプル
本明細書の実施例において用いられた23個のヒト肺癌細胞株は以下の通りである:肺腺癌(ADC);A549、LC319、PC-3、PC-9、PC-14、A427、NCI-H1373、細気管支肺胞癌(BAC);NCI-H1666、NCI-H1781、肺扁平上皮細胞癌(SCC);RERF-LC-AI、SK-MES-1、EBC-1、LU61、NCI-H520、NCI-H1703、NCI-H2170、肺腺扁平上皮癌(ASC);NCI-H226、NCI-H647、肺大細胞癌(LCC);LX1、小細胞肺癌(SCLC);DMS114、DMS273、SBC-3、SBC-5。細胞は全て、10%ウシ胎児血清(FCS)を加えた適切な培地中で、単層で生育させ、37℃、5%CO2の加湿空気雰囲気下で維持した。ヒト小気道上皮細胞(SAEC)を正常対照として用い、Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した最適培地(SAGM)で生育させた。37人の患者からのインフォームドコンセントが得られた原発性NSCLCサンプル(このうち22個がADC、14個がSCC、1個がASCに分類された)を前もって得た(Kikuchi, T., et al., Oncogene. 22:2192-205 (2003))。
遺伝子発現プロファイル解析に基づき、50%を超える腫瘍中で正常肺の5倍以上の発現レベルを示す遺伝子を検査するために選択した。ANLN転写物がそれら遺伝子のリストに含まれ、続いて半定量的RT-PCRによって過剰発現していることが確認された。βアクチン(ACTB)の発現レベルを定量対照として用いて、臨床肺癌細胞のmRNAから調製された各一本鎖cDNAの適切な希釈物を調製した。増幅用のプライマーセットは以下の通りである:
ACTBには、ACTB-F (5’-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3’(SEQ ID No.5))および
ACTB-R (5’-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3’(SEQ ID No.6))、ならびに
ANLNには、ANLN-F1 (5’-GCTGCGTAGCTTACAGACTTAGC-3’(SEQ ID No.7))および
ANLN-R1 (5’-AAGGCGTTTAAAGGTG ATAGGTG-3’(SEQ ID No.8))。
ヒト複数組織ブロット(Human multiple-tissue blot)(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)をANLNの32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。ANLNの全長cDNAを以下のプライマーを用いてRT-PCRで調製した:
ANLN-F2 (5’- CCCAAGCTTGGGGCCACCATGGATCCGTTTACGGAGAAAC -3’(SEQ ID No.9))および
ANLN-R2 (5’- TGCTCTAGAGCAAGGCTTTCCAATAGGTTTGTAG -3’(SEQ ID No.10))。
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は供給業者の推奨に従って行った。増感スクリーンを用いて室温で96時間、ブロットをオートラジオグラフィーにかけた。
コドン位置428〜718のGST融合ヒトANLNタンパク質でウサギを免疫化して、ヒトANLNタンパク質に特異的なウサギ抗体を作成した。抗体は標準的な手順で精製した。ECL Western Blotting System(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)を用いた。細胞は、プラスミドトランスフェクション後24時間、無血清培地中で維持し、適切な量の溶解バッファー(150mM NaCl、50mM Tris-HCl, pH8.0、1%Nonidet P-40、0.1%SDS、0.5%デオキシコール酸Na、に加えてプロテアーゼ阻害剤)に溶解させた。SDS-PAGEを行い、PAGEで分離されたタンパク質をニトロセルロース膜(Amersham Biosciences)上にエレクトロブロットし、抗体と共にインキュベートした。ヒツジ抗マウスIgG-HRP抗体(Amersham Biosciences)およびヤギ抗ウサギIgG-HRP抗体(Amersham Biosciences)をこれら実験の二次抗体として供した。
培養細胞をPBS(-)で2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド溶液中、60分間室温で固定し、0.1%Triton X-100を含むPBS(-)で1.5分間透過化した。一次抗体反応の前に、細胞をブロッキング溶液(PBS(-)中3%BSA)で60分間覆って非特異的な抗体結合をブロックした。そして、細胞をヒトANLNに対する抗体と共にインキュベートした。内因性ANLNを明らかにするために、FITC(Cappel, Durham, NC, USA)またはローダミン(Cappel)に結合したヤギ抗ウサギ二次抗体で染色し、レーザー共焦点顕微鏡(TSC SP2 AOBS: Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)で観察した。アクチンフィラメントを可視化するため、Alexa59結合ファロイジン(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)も、二次抗体とのインキュベーション後に加えた。
6ウェルディッシュにプレーティングした2 X 105個のNSCLC細胞株A549を、リポフェクタミン試薬(40nM)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いて、ANLN遺伝子に対応する合成S-オリゴヌクレオチド(0.2μM)でトランスフェクトし、10%FCSを含む培地中で2日間維持した。細胞生存率を、それぞれ三回MTTアッセイによって評価した。S-オリゴヌクレオチドの配列は以下の通り:
アンチセンス1(AS1)5’-CTCCGTAAACGGATCCAT-3’(SEQ ID No.11);
リバース1(R1)5’-TACCTAGGCAAATGCCTC-3’(SEQ ID No.12)、
アンチセンス2(AS2)5’-CGGATCCATCGCCCCAGG-3’(SEQ ID No.13);
リバース2(R2)5’-GGACCCCGCTACCTAGGC-3’(SEQ ID No.14)。
MTTアッセイは、別に記載されているように(Suzuki, C., et al., Cancer Res. 63:7038-41 (2003))行った。
別に報告されているように(Shimokawa T, et al., Cancer Res. 2003;63:6116-20.)、ベクターベースのRNA干渉(RNAi)システムpsiH1BX3.0は哺乳動物細胞におけるsiRNAの合成を誘導するために確立された。30μlのリポフェクタミン 2000(Invitrogen)を用いて、10μgのsiRNA発現ベクターをNSCLC細胞株LC319およびA549にトランスフェクトした。このアッセイでは、90%を超えるトランスフェクト細胞がこの合成siRNAを発現し、内因性のANLN発現が有効に抑制された。トランスフェクト細胞を、適切な濃度のジェネテシン(G418)存在下で5日間培養した。細胞数および生存率を三回Giemsa染色およびMTTアッセイによって測定した。RNAiの合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通り:
対照(LUC(ルシフェラーゼ:フォチナス ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子)5’-CGTACGCGGAATACTTCGA-3’(SEQ ID No.15);
SCR(スクランブル:5Sおよび16S rRNAをコードするミドリムシ葉緑体遺伝子)5’-GCGCGCTTTGTAGGATTCG-3’(SEQ ID No.16));
siRNA-ANLN-1(si-1)5’-CCAGTTGAGTCGACATCTG-3’(SEQ ID No.17);
siRNA-ANLN-2(si-2)5’-GCAGCAGATACCATCAGTG-3’(SEQ ID No.18)。
本発明者らのRNAiシステムを実証するため、個々の対照siRNAを半定量的RT-PCRによって試験し、COS-7細胞に一過的にトランスフェクトした対応標的遺伝子の発現の低下を確認した。また、このアッセイに用いた細胞株において、対照ではなく機能的siRNAによるANLN発現のダウンレギュレーションが確認された。
細胞を5 X 105細胞/100mmディッシュの密度でプレーティングし、siRNA発現ベクターでトランスフェクトして、適切な濃度のジェネテシンの存在下で培養した。トランスフェクション5日後、細胞をトリプシン処理し、PBS中に収集して、70%冷エタノール中で30分間固定した。100μg/ml RNase(Sigma-Aldrich Co.)で処置した後、細胞をPBS中50μg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma-Aldrich Co.)で染色した。フローサイトメトリーをBecton Dickinson FACScanで行い、ModFitソフトウェア(Verity Software House, Inc., Topsham, ME, USA)によって解析した。少なくとも20,000個の非ゲート化(ungated)細胞から決定した細胞をDNA含量について解析した。
ANLNおよびモック(mock)プラスミドを発現するように設計されたプラスミドでトランスフェクトした肺癌細胞(LC319およびA549細胞)を、無血清培地中で4時間培養した。次に培地を10%FCSと10μM BrdUを含むRPMI1640と交換した。これらの細胞を20時間インキュベートし、さらに固定して、取り込まれたBrdUを市販のキット(Cell Proliferation ELISA, BrdU; Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を用いて測定するために用いた。
ANLNまたはモックプラスミドを発現するように設計されたプラスミドでトランスフェクトしたNIH3T3およびCOS-7細胞を、10%FCSを含むDMEM中で融合性の段階まで生育させた。細胞をトリプシン処理によって回収し、続いて血清またはプロテイナーゼ阻害剤を加えないDMEM中で洗浄した。細胞をDMEM中で1 x 105/mlで懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質(Becton Dickinson Labware, Bedford, MA, USA)の乾燥層をDMEMで2時間、室温で再水和した。10%FCSを含むDMEM(0.75ml)を24ウェルマトリゲル浸潤チャンバーの各下部チャンバーに加え、0.5ml(5 x 104細胞)の細胞懸濁液を上部チャンバーの各インサートに加えた。インサートのプレートを22時間、37℃でインキュベートした。インキュベーション後チャンバーを処理し、供給業者(Becton Dickinson Labware)の指示通りに、マトリゲルで被覆されたインサートを通って浸潤している細胞を固定してGiemsaによって染色した。
ANLNまたはモックプラスミドを発現するように設計されたプラスミドでトランスフェクトされたNIH3T3細胞を無血清DMEM中に懸濁し、10μg/mlのフィブロネクチンで被覆された2ウェルチャンバー(Becton Dickinson Labware)の個々のウェルにプレーティングした。4時間インキュベーション後、各チャンバーの底からP200ピペットチップで接着細胞を線状に掻き取って傷をつけ、培地を10%FCSを含むDMEMで交換した。細胞を増殖させ、傷害区域に48時間遊走させた。そして、傷害区域内の細胞数を顕微鏡(DP50, OLYMPUS, Tokyo, Japan)を用いて数えた。
ANLNによるRHOの活性化を、EZ-Detect(商標)Rho Activation Kit(PIERCE, Rockford, IL, USA)を用いて検出した。簡単に述べると、ANLN発現プラスミドまたはモックプラスミドでトランスフェクトしたLC319細胞を24時間培養した。次に細胞を洗浄し、溶解バッファーで溶解した。16,000xgで遠心分離した後、溶解物を、活性化RHOをアフィニティー沈降させるためにGST-rhotekin(RTKN)-RBDおよび「SwellGel Immobilized Glutathione Disc」と混合した。活性化RHOを含むGSTプルダウン沈殿剤を洗浄し、サンプルバッファーで煮沸して、抗RHO(-A、-B、および-C)および抗ANLN抗体を用いるウェスタンブロット解析に供した。
ホルマリンで固定した肺癌を用いた腫瘍組織マイクロアレイを、以前に公開されているように(Kononen, J., et al., Nat. Med. 4: 844-847 (1998); Chin, S. F., et al., Mol. Pathol., 56:275-79 (2003); Callagy, G., et al., Diagn. Mol. Pathol., 12:27-34 (2003))構築した。サンプリング用の組織区域は、スライド上の対応するHE染色されたセクションとの視覚的配列に基づいて選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された3、4、または5個の組織コア(直径0.6mm;高さ3〜4mm)を、組織マイクロアレイヤー(Beecher Instruments, Hummingbird Court Sun Prairie, WI, USA)を用いてレシピエントパラフィンブロック中に配置した。また、各ケースから正常組織のコアも切り抜いた。得られたマイクロアレイブロックの5μmセクションを免疫組織化学解析に用いた。ANLNの染色パターンを、なし(absent)または陽性として半定量的に評価し、また、臨床経過観察データの予備知識のない3人の独立した研究者が、核または細胞質ANLN(n-ANLN、c-ANLN)に応じて定性的に評価した。n-またはc-ANLN染色腫瘍細胞が10%未満のケースはそれぞれのタイプのANLN陰性と判定した。評価者が独立して陽性と規定したケースのみを陽性として認めた。
組織マイクロアレイ解析によって決定されるANLNタンパク質の発現レベルとの相関について、年齢、性別、および病理学的TNM段階などの臨床病理学的変数を調べた。手術日からNSCLCに関連した死亡時または最終経過観察時までの腫瘍特異的生存曲線を計算した。各関連変数およびANLN発現についてそれぞれKaplan-Meier曲線を計算した。Log-rank検定を用いて患者サブグループ間の生存期間の差を解析した。Cox比例ハザード回帰モデルで一変量および多変量解析を行い、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との関連を決定した。まず、年齢、性別、pT分類、およびpN分類を含む可能な予後因子と死との関連を、1回につき1つの因子を考慮して解析した。次に、多変量Cox解析を、P値<0.05のエントリーレベルを満たす任意のおよび全ての変数と協調して、常にANLN発現をモデルに強制する逆方向(段階的)手順で行った。モデルが因子を加え続けていくと、独立因子はP値<0.05のエグジット(exit)レベルを超えなかった。
cDNAマイクロアレイによる解析で37個のNSCLCのうちの50%以上において5倍以上の発現を示す遺伝子は、以前にスクリーニングされている(Kikuchi, T. et al. Oncogene 22(14):2192-2205 (2003))。スクリーニングされた23,040個の遺伝子のうち、ANLN転写物は、NSCLCにおいて頻繁に過剰発現しているとして同定され、半定量的RT-PCR実験によって12個の代表的なNSCLC症例において過剰発現が確認された(図1a)。加えて、高レベルのANLN(Genbankアクセッション番号NM_018685)発現が23個の肺癌細胞株全てにおいて観察された一方、正常小気道上皮由来細胞(SAEC)においてはPCR産物は検出されなかった(図1b)。ANLN cDNAをブローブとして用いたノーザンブロッティング解析によって、約4.0kbの転写物が、調べた24個の正常ヒト組織のうち精巣および脊髄においてのみ弱いバンドとして同定された(図1c)。NSCLC細胞株A549、LC319、およびNCI-H522におけるANLNタンパク質の発現は、抗ANLN抗体を用いたウェスタンブロッティング解析によって内因性ANLNタンパク質の発現を調べることにより確認された。
肺癌細胞におけるANLNの細胞内局在を確認するため、免疫細胞化学解析を行った。肺癌細胞株LC319およびA549で内因的に発現されたANLNは、様々な細胞内局在パターンを示した(図2a)。ANLNタンパク質は、核および/または細胞質(n-ANLNおよびc-ANLN)、ならびに核膜崩壊後の皮層、細胞質***中の***溝、および***終期の後期の中央体において観察された。細胞質における線維様染色もかなりの数の細胞において観察された。これら細胞におけるストレスファイバー上の内因性ANLNおよびF-アクチンの共存が、抗ANLN抗体およびファロイジンを用いた免疫染色によって確認された(図2b)。アクチン細胞骨格は哺乳動物細胞の細胞質***および形態に重要な役割を担うことが知られていることから、次に、アクチンストレスファイバー形成に対するANLNの効果を、ANLN発現プラスミドをLC319およびNIH3T3細胞にトランスフェクションすることによって調べた。ファロイジンで検出された線維様染色はANLNのトランスフェクション後に有意に増加し、外因性ANLNの過剰発現がこれら細胞において多くのストレスファイバーを誘導することが示唆された(図2c)。
ANLNが肺癌細胞の成長または生存に不可欠であるかどうかを評価するため、ANLN配列(Genbankアクセッション番号NM_018685、SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:2をコードする)に対応する2対のリバース(対照)およびアンチセンスS-オリゴヌクレオチドを合成して、高レベルのANLN発現を示したA549細胞にそれぞれトランスフェクトした。2つの異なるアンチセンスS-オリゴヌクレオチド(AS1およびAS2)のそれぞれの導入は、対応対照ヌクレオチド(R1およびR2)と比較して細胞生存度を低下させ、ANLNが癌細胞の成長および/または生存に不可欠であることが示唆された(データ示さず)。アンチセンスS-オリゴヌクレオチドによる成長抑制効果がANLN特異的であることをさらに確認するため、ANLNに対するsiRNA(siRNA-ANLN-1および-2)および2個の対照プラスミド(ルシフェラーゼ(LUC)またはスクランブル(SCR)に対するsiRNA)を発現するようにプラスミドを設計、構築し、それぞれをLC319およびA549細胞にトランスフェクトした。siRNA-ANLN-1または-2でトランスフェクトした細胞におけるANLN転写物の量は、2個の対照siRNAのいずれかでトランスフェクトしたものと比べて有意に低下した(図3a);siRNA-ANLN-1または-2のトランスフェクションによってもまた、コロニー形成およびMTTアッセイによって測定したところコロニー数および細胞生存度が有意に低下した(図3b、c)。さらに、siRNA-ANLN-1で処置した細胞は、複数の核を有する、より大きな細胞形態を示した(図3d)。この表現型の分子メカニズムをさらに明らかにするため、siRNA-ANLN-1でトランスフェクトしたLC319細胞を用いてフローサイトメトリーを行い、siRNA-ANLN-1でトランスフェクトした細胞において4N〜16NのDNA含量を有する細胞の比率が、対照siRNA(LUC)でトランスフェクトした細胞におけるものよりも有意に高いことを見出した(図3e)。
ストレスファイバー上のANLNタンパク質およびF-アクチンが共存し、外因性ANLN発現の誘導が哺乳動物細胞においてアクチンストレスファイバーの形成を促進することが免疫細胞化学解析により示されたので、続いてマトリゲル浸潤アッセイを行い、ANLNが細胞運動性に役割を担っている可能性があるかどうかを判定した。ANLN発現ベクターでトランスフェクトしたNIH3T3およびCOS-7細胞のマトリゲルを通じた浸潤は、対照細胞と比較して有意に促進された(図4b、4c)。ANLNまたはモックプラスミドを発現するように設計されたプラスミドでトランスフェクトしたNIH3T3細胞を用いた傷害遊走アッセイもまた、ANLN発現細胞の遊走が有意に活性化されたことを示した。
外科的に切除された285個のNSCLC組織からなる組織マイクロアレイを用い、抗ANLNポリクローナル抗体で免疫組織化学解析を行った。この研究により、285ケースのうち267(93.6%)個がc-ANLN(細胞質性)のみで陽性に染色され、128(44.9%)個がc-ANLNおよびn-ANLN(核性)の両方で陽性であり、n-ANLNのみで陽性であるケースはなかったことが示された(図6a)。そうすると問題は、ANLN発現がNSCLCの臨床結果と関連するのかどうかであった。統計解析では、c-またはn-ANLN発現のpT-またはpN-因子との有意な相関は認められなかった。しかし、Kaplan-Meier法を用い、n-ANLN発現と腫瘍特異的5年生存率との間に顕著な関連が見出された(Log-rank検定でP<0.0001)(図6b)。一変量解析を用いると、pT、pN、性別、およびn-ANLN発現が、NSCLC患者の不良な腫瘍特異的生存と有意に関連していた。さらに、Cox比例ハザードモデルを用いた多変量解析によって、n-ANLN染色は独立した予後因子であることが決定された(P=0.001)。
本明細書で示したように、ANLNのRhoAとの相互作用、およびこの相互作用の阻害により癌細胞の細胞増殖が阻害された。このように、ANLNとRhoAの結合を阻害し、その活性を妨げる薬剤は、抗癌剤、特にNSCLCのような肺癌の治療のための抗癌剤として、治療的に有用であると考えられる。
Claims (4)
- 以下の工程を含む、対象における非小細胞肺癌(NSCLC)の予後を予測するための試験方法:
(a)NSCLC予後を予測しようとする対象から収集された非小細胞肺癌(NSCLC)組織試料の核に局在するANLNタンパク質を検出する工程;および
(b)核内のANLNタンパク質の局在が検出された場合に予後が不良であると予測する工程。 - 以下の工程によって試料の核内のANLNの局在が検出される、請求項1記載の方法:
(a)ANLNタンパク質を認識する抗体を試料と接触させる工程;および
(b)核領域において試料に結合する抗体を検出する工程。 - ANLNタンパク質を認識する抗体と、核の検出用の薬剤とを含む、請求項1に記載の方法に用いるための非小細胞肺癌(NSCLC)に罹患した対象の予後試験キット。
- 核の検出用の薬剤がヘマトキシリン-エオシン染色染料である、請求項3記載のキット。
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