JP2010536366A - 肺癌の治療及び診断の標的遺伝子のためのebi3、dlx5、nptx1、及びcdkn3 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2007年8月24日付で出願された米国仮特許出願第60/957,956号、及び2007年10月3日付で出願された同第60/977,360号(これらの内容全体が参照により本明細書中に援用される)の恩典を主張するものである。
ポリアルギニン、
Tat/RKKRRQRRR/配列番号63、
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/配列番号64、
ブホリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/配列番号65、
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/配列番号66、
MAP(モデル両親媒性ペプチド)/KLALKLALKALKAALKLA/配列番号67、
K−FGF/AAVALLPAVLLALLAP/配列番号68、
Ku70/VPMLK/配列番号69、
Ku70/PMLKE/配列番号70、
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/配列番号71、
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/配列番号72、
Pep−1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/配列番号73、
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/配列番号74、
Pep−7/SDLWEMMMVSLACQY/配列番号75、及び
HN−1/TSPLNIHNGQKL/配列番号76から選択され得る。
本発明の実施形態の実施又は試験に際しては、本明細書中に記載されるものと同様又は等価の方法及び材料を使用することができるが、好ましい方法及び材料をここで記載する。しかしながら、本発明は本明細書中に記載される特定の分子、組成物、方法論、又はプロトコルに限定されず、日常実験及び最適化に従って変わり得ることを理解されたい。また、本明細書において使用される専門用語は、単に特定の実施形態(versions or embodiments)の説明を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するよう意図されないことを理解されたい。
単語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」は、本明細書中で使用される場合、特に指定のない限り、「少なくとも1つの」を意味する。
本発明における遺伝子の核酸配列及びポリペプチド配列を以下の番号で示すが、これらに限定されない:
EBI3:配列番号1及び配列番号2、
DLX5:配列番号3及び配列番号4、
CDKN3:配列番号5及び配列番号6、
EF−1δ:配列番号7及び配列番号8、
ValRS:配列番号26又は配列番号28、及び配列番号27又は配列番号29、
EF−1β:配列番号30及び配列番号31、
EF−1γ:配列番号32及び配列番号33、
EF−1α:配列番号57又は配列番号90、及び配列番号58又は配列番号91、
Akt:配列番号59及び60、
NPTX1:配列番号78及び配列番号79、並びに
NPTXR:配列番号86及び配列番号87。
EBI3:NM_005755、
DLX5:BC006226、
CDKN3:L27711、
EF−1δ:BC009907、
ValRS:NM_006295又はBC012808、
EF−1β:NM_001959、
EF−1γ:BC009865、
EF−1α:NM_001402又はNM_001958、
NPTX1:配列番号NM_002522又はNM_002522.2、並びに
NPTXR:配列番号NM_014293。
例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下を含む:50%ホルムアミド、5×SSC、及び1%SDSにおいて42℃でインキュベートする、又は5×SSC、1%SDSにおいて65℃でインキュベートし、0.2×SSC、及び0.1%SDSにおいて50℃で洗浄する。
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4)アルギニン(R)、リシン(K);
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。このように保存的に修飾されたポリペプチドが本発明のタンパク質に含まれる。しかしながら、本発明は、これらに限定されず、タンパク質は、タンパク質の少なくとも1つの生物活性を保持していれば非保存的修飾を含む。さらに、修飾タンパク質には、多型変異体、種間相同体、これらのタンパク質の対立遺伝子でコードされるものは除外されない。
「抗体」という用語は本明細書中で使用される場合、指定のタンパク質又はそのペプチドと特異的に反応する免疫グロブリン及びその断片を含むことが意図される。抗体はヒト抗体、霊長類化(primatized)抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質、又は放射性標識と融合させた抗体、及び抗体断片を含み得る。さらに、本明細書において「抗体」は広義で使用され、具体的には無傷モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)包含し、また所望の生物活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は全てのクラス(例えばIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgM)を示す。
ポリクローナル抗体は、動物において関連抗原及びアジュバントの頻回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射により生じさせるのが好ましい。本発明では、抗原は、配列番号88若しくは配列番号89、又は配列番号61等のEF−1δのCDKN3結合領域を含むポリペプチドであるがこれに限定されない。二官能性物質又は誘導体化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する共役)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基を介する)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOC12、又はR'N=C=NR(式中、R及びRは異なるアルキル基である)を用いて、免疫化される種において免疫原性のあるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子と、関連抗原とを共役させることが有用であり得る。
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体集団、すなわち、集団内に含有される個々の抗体が起こり得る自然発生突然変異(若干存在し得る)以外は同一である集団から得ることができる。したがって、「モノクローナル」という修飾詞は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を意味する。
これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株としては、マウス骨髄腫細胞株、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手可能なMOPC−21及びMPC−11マウス腫瘍及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(Manassas, Virginia, USA)から入手可能なSP−2又はX63−Ag8−653細胞由来のものが挙げられる。ヒト骨髄腫細胞株及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されている(Kozbor D, et al., J Immunol. 1984 Dec;133(6):3001-5、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源に由来する1つ又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「移入(import)」残基と称されることが多く、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、Winter及び共同研究者らの方法((Jones PT, et al., Nature. 1986 May 29-Jun 4;321(6069):522-5; Riechmann L, et al., Nature. 1988 Mar 24;332(6162):323-7; Verhoeyen M, et al., Science. 1988 Mar 25;239(4847):1534-6))に従って、超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行なうことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりかなり小さな部分が、ヒト以外の種の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号明細書)である。実際には、ヒト化抗体は典型的に、幾つかの超可変領域残基、及び場合によっては幾つかのFR残基が、齧歯動物抗体中の類似部位に由来する残基で置換されているヒト抗体である。
ヒト化の代替手段として、ヒト抗体を作り出すことができる。例えば、免疫化の際に内因性免疫グロブリンを産生することなく、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を作製することが可能である。例えば、キメラマウス及び生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合域(JH)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。かかる生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移動は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の産生を引き起こす。例えば、Jakobovits A, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Mar 15;90(6):2551-5、 Nature. 1993 Mar 18;362(6417):255-8、 Br?ggemann M, et al., Year Immunol. 1993;7:33-40;並びに米国特許第5,591,669号明細書、同第5,589,369号明細書、及び同第5,545,807号明細書を参照されたい。
抗体断片の生成について、様々な技法が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷抗体のタンパク分解によって誘導されていた(例えば、Morimoto K & Inouye K.J Biochem Biophys Methods. 1992 Mar; 24(1-2): 107-17、Brennan M et al., Science. 1985 Jul 5; 229(4708) 81-3を参照されたい)。しかしながら、現在では、これらの断片は組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、上述の抗体ファージライブラリから抗体断片を単離することができる。代替的には、Fab'−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的カップリングを行なってF(ab')2断片を形成することもできる(Carter P et al., Biotechnology(NY). 1992 Feb; 10(2): 163-7)。別のアプローチによれば、F(ab')2断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片を生成するための他の技法は、当業者には明らかである。他の実施形態において、好適な抗体は一本鎖Fv断片(scFv)である。国際公開第93/16185号パンフレット、米国特許第5,571,894号明細書、及び米国特許第5,587,458号明細書を参照されたい。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号明細書に記載されるような「線状抗体」であってもよい。かかる線状抗体断片は単一特異的であっても、又は二重特異的であってもよい。
「非抗体結合タンパク質」又は「非抗体リガンド」又は「抗原結合タンパク質」という用語は下記でより詳細に論じられる、アドネクチン、アビマー、一本鎖ポリペプチド結合分子、及び抗体様結合ペプチド模倣薬を含む非免疫グロブリンタンパク質足場を使用する抗体模倣体を互換可能に指す。
本発明の抗NPTX1抗体に関する「中和」という用語、又は「NPTX1活性を中和する抗体」という表現は、NPTX1と結合又は接触することによって、NPTX1による細胞増殖活性の阻害をもたらす抗体を指すように意図される。NPTX1は細胞外へ分泌され、肺癌細胞の増殖に不可欠な因子として機能するため、幾つかの抗NPTX1抗体はこの活性を中和し得る。
上述の方法により調製される抗体又は抗体断片は、癌細胞のようなEF−1δのCDKN3結合領域(72aa〜160aaの位置)を発現する細胞の親和性を検出することにより選択され得る。これらの細胞への非特異的な結合を、3%BSAを含有するPBSで、室温で30分間処理することによりブロッキングする。細胞を候補抗体又は抗体断片と共に室温で60分間インキュベートする。PBSで洗浄した後、細胞をFITC標識二次抗体により60分間室温で染色し、蛍光光度計を用いることにより検出する。代替的には、本発明では、表面プラズモン共鳴現象を用いるバイオセンサーを、抗体又は抗体断片を検出又は定量化する手段として使用してもよい。細胞表面上のEF−1δのCDKN3結合領域(72aa〜160aaの位置)を検出することのできる抗体又は抗体断片が、本発明において選択される。
本発明に従って使用される抗体の治療製剤は、貯蔵のために、所望の純度を有する抗体を任意で薬学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製され得る。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用する用量及び濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコール、若しくはベンジルアルコール;メチルパラベン若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール等);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えばZn−タンパク質錯体);及び/又はTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
本発明の抗体を含む組成物は、適正な医療行為に沿った形で調合、投薬、及び投与され得る。好ましくは、本発明の抗体はヒト、キメラ若しくはヒト化抗体scFv、又は抗体断片である。これに関して検討される因子には、治療される特定の肺癌、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患又は障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、及び医師に既知の他の因子が含まれる。投与される抗体の治療的に有効な量は、かかる検討に左右される。
本明細書で使用されるように、「単離二本鎖分子」という用語は、標的遺伝子(例えば低分子干渉RNA(siRNA、例えば二本鎖リボ核酸(dsRNA)又は低分子ヘアピンRNA(shRNA))及び低分子干渉DNA/RNA(siD/R−NA、例えばDNAとRNAとの二本鎖キメラ(dsD/R−NA)又はDNAとRNAとの低分子ヘアピンキメラ(shD/R−NA))を含む)の発現を阻害する核酸分子を表す。
例えば、
配列番号18(配列番号1の679nt〜697ntの位置)、
配列番号20(配列番号1の280nt〜298ntの位置)のヌクレオチドを含むEBI3標的配列、
例えば、
配列番号49(配列番号5の310nt〜328ntの位置)のヌクレオチドを含むCDKN3標的配列、
例えば、
配列番号51(配列番号7の225nt〜243ntの位置)のヌクレオチドを含むEF−1δ標的配列、
例えば、
配列番号84(配列番号86の1280nt〜1298ntの位置)
配列番号85(配列番号86の1393nt〜1411ntの位置)のヌクレオチドを含むNPTXR標的配列。
[1]細胞に導入した場合にEBI3、CDKN3、EF−1δ、又はNPTXRのin vivo発現、及び細胞増殖を阻害する、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る単離二本鎖分子。
[2]配列番号18(配列番号1の679nt〜697ntの位置)、配列番号20(配列番号1の280nt〜298ntの位置)、配列番号49(配列番号5の310nt〜328ntの位置)、配列番号51(配列番号7の225nt〜243ntの位置)、配列番号84(配列番号86の1280nt〜1298ntの位置)、及び配列番号85(配列番号86の1393nt〜1411ntの位置)の中から選択される標的配列に一致するmRNAに作用する、[1]に記載の二本鎖分子、
[3]センス鎖が配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、[2]に記載の二本鎖分子
[4]約100ヌクレオチド未満の長さを有する、[3]に記載の二本鎖分子。
[5]約75ヌクレオチド未満の長さを有する、[4]に記載の二本鎖分子。
[6]約50ヌクレオチド未満の長さを有する、[5]に記載の二本鎖分子。
[7]約25ヌクレオチド未満の長さを有する、[6]に記載の二本鎖分子。
[8]約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチドの間の長さを有する、[7]に記載の二本鎖分子。
[9]介在一本鎖によって連結したセンス鎖とアンチセンス鎖との両方を有する単一ポリヌクレオチドから成る、[3]に記載の二本鎖分子。
[10]一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]と相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である)を有する、[9]に記載の二本鎖分子、
[11]RNAから成る、[1]に記載の二本鎖分子。
[12]DNAとRNAとの両方から成る、[1]に記載の二本鎖分子。
[13]DNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[12]に記載の二本鎖分子。
[14]センス鎖及びアンチセンス鎖がそれぞれDNA及びRNAから成る、[13]に記載の二本鎖分子。
[15]DNAとRNAとのキメラである、[12]に記載の二本鎖分子。
[16]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の5'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAである、[15]に記載の二本鎖分子、
[17]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[16]に記載の二本鎖分子、
[18]3'オーバーハングを含有する、[2]に記載の二本鎖分子、
[19][2]に記載の二本鎖分子を発現するベクター、
[20]一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である)を有する、[19]に記載のベクター。
1. 転写産物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列について下流を探索する。潜在的なsiRNA標的部位として、それぞれのAAの存在と、その3'側に隣接した19個のヌクレオチドとを記録する。Tuschl et al.は、5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域(UTR)と開始コドン近くの領域(75塩基以内)に対してsiRNAを設計することを避けることを推奨している。これらの領域は調節タンパク質結合部位がより多く存在する可能性があり、UTR結合タンパク質及び/又は翻訳開始複合体が、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合に干渉する可能性があるためである。
2. 潜在的な標的部位と、適当なゲノムデータベース(ヒト、マウス、ラット等)とを比較し、他のコード配列との相同性が大きい任意の標的配列を考慮から外す。基本的に、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/でのNCBIサーバーにあるBLASTを用いる(Altschul SF, et al., Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402)。
3. 合成のために条件を満たす標的配列を選択する。遺伝子の長さに従って評価する標的配列を幾つか選択するのが一般的である。
EBI3遺伝子に対する配列番号18及び配列番号20、
CDKN3遺伝子に対する配列番号49及び配列番号50、
EF−1δ遺伝子に対する配列番号51及び配列番号52、又は
NPTXR遺伝子に対する配列番号84及び配列番号85。
EBI3遺伝子に対する配列番号18(配列番号1の679nt〜697ntの位置)又は配列番号20(配列番号1の280nt〜298ntの位置)、
CDKN3遺伝子に対する配列番号49(配列番号5の310nt〜328ntの位置)、
EF−1δ遺伝子に対する配列番号51(配列番号7の225nt〜243ntの位置)、及び
配列番号84(配列番号86の1280nt〜1298ntの位置)又は配列番号85(配列番号86の1393nt〜1411ntの位置)。
センス鎖:5'−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−[DNA]−5':アンチセンス鎖、及び
センス鎖:5'−(RNA)−[DNA]−3'
3'−(RNA)−5':アンチセンス鎖。
CCC、CCACC、又はCCACACC:Jacque JM et al., Nature 2002 Jul 25, 418(6896): 435- 8, Epub 2002 Jun 26;
UUCG:Lee NS et al., Nat Biotechnol 2002 May, 20(5): 500-5、Fruscoloni P et al., Proc Natl Acad Sci USA 2003 Feb 18, 100(4): 1639-44, Epub 2003 Feb 10;及び
UUCAAGAGA:Dykxhoorn DM et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Jun, 4(6): 457-67。
CAAUGAGCCUGGGCAAGUA−[B]−UACUUGCCCAGGCUCAUUG(標的配列番号18);
UCACGGAUGUCCAGCUGUU−[B]−AACAGCUGGACAUCCGUGA(標的配列番号20);
UAUAGAGUCCCAAACCUUC−[B]−GAAGGUUUGGGACUCUAUA(標的配列番号49);
GUGGAGAACCAGAGUCUGC−[B]−GCAGACUCUGGUUCUCCAC(標的配列番号51);
GACAAUGGCUGGCACCACA−[B]−UGUGGUGCCAGCCAUUGUC(標的配列番号84);及び
CAUCAAGCCUCAUGGGAUC−[B]−GAUCCCAUGAGGCUUGAUG(標的配列番号85)。
本明細書に記載の二本鎖分子を1つ又は複数含有するベクター、及びかかるベクターを含有する細胞も本発明に包含される。本発明のベクターは好ましくは、発現可能な形態で本発明の二本鎖分子をコードする。本明細書中で、「発現可能な形態で」という語句は、細胞に導入される場合、ベクターが分子を発現するであろうことを示す。好ましい一実施形態では、ベクターは、二本鎖分子の発現に必要な調節要素を含む。かかる本発明のベクターは、本発明の二本鎖分子を生成するのに、又は癌を治療する活性成分として直接使用することができる。
或る特定のsiRNAのNSCLCを阻害する能力は、以前に国際公開第2005/89735号パンフレット(参照により本明細書中に援用される)に記載されている。本発明において、EBI3に対する2つの異なるdsRNA、CDKN3に対する2つの異なるdsRNA、及びEF−1δに対する2つの異なるdsRNAを、細胞成長を阻害するそれらの能力について試験した。EBI3に対する2つのdsRNA(図4D)、CDKN3に対する1つのdsRNA(図22A)、EF−1δに対する1つのdsRNA(図22B)、又はNPTXRに対する2つのdsRNA(図13D)は、肺癌細胞株において細胞増殖の抑制と同時に、遺伝子の発現を効果的にノックダウンした。
[1]EBI3、CDKN3、EF−1δ、及び/又はNPTXRを過剰発現する細胞における該遺伝子の発現、並びに細胞増殖を阻害する少なくとも1つの単離二本鎖分子を投与する工程(該分子は、互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る)を含む、癌細胞の成長を阻害し、癌を治療する方法(該癌細胞又は癌はEBI3、CDKN3、EF−1δ又はNPTXR遺伝子の中から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する)、
[2]二本鎖分子が、配列番号18(配列番号1の679nt〜697ntの位置)、配列番号20(配列番号1の280nt〜298ntの位置)、配列番号49(配列番号5の310nt〜328ntの位置)、配列番号51(配列番号7の225nt〜243ntの位置)、配列番号84(配列番号86の1280nt〜1298ntの位置)、及び配列番号85(配列番号86の1393nt〜1411ntの位置)の中から選択される標的配列に一致するmRNAで作用する、[1]に記載の方法、
[3]センス鎖が配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、[2]に記載の二本鎖分子、
[4]治療される癌が肺癌である、[1]に記載の方法、
[5]肺癌がNSCLC又はSCLCである、[1]に記載の方法、
[6]複数種の二本鎖分子を投与する、[1]に記載の方法、
[7]複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[6]に記載の方法。
[8]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[3]に記載の方法。
[9]二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の方法。
[10]二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[9]に記載の方法。
[11]二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[10]に記載の方法。
[12]二本鎖分子が約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド長の間である、[11]に記載の方法。
[13]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一ポリヌクレオチドから成る、[1]に記載の方法。
[14]二本鎖分子が一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である)を有する、[13]に記載の方法、
[15]二本鎖分子がRNAである、[1]に記載の方法。
[16]二本鎖分子がDNAとRNAとの両方を含む、[1]に記載の方法。
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の方法。
[18]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[17]に記載の方法。
[19]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[16]に記載の方法。
[20]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の5'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAから成る、[19]に記載の方法、
[21]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[20]に記載の方法、
[22]二本鎖分子が3'オーバーハングを含有する、[1]に記載の方法、
[23]二本鎖分子がベクターによりコードされる、[1]に記載の方法、
[24]ベクターによりコードされる二本鎖分子が、一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である)を有する、[23]に記載の方法、並びに
[25]二本鎖分子が、分子に加えてトランスフェクション促進剤、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物中に含有される、[1]に記載の方法。
上記の他に、本発明はまた、分子をコードする、本発明の二本鎖分子又はベクターの少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。特に本発明は、以下の組成物[1]〜[25]を提供する:
[1]互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成するセンス鎖及びそれに相補的なアンチセンス鎖から成る、EBI3、CDKN3、EF−1δ、又はNPTXRの発現及び細胞増殖を阻害する少なくとも1つの単離二本鎖分子を含む、癌細胞の成長を阻害し、癌を治療するための組成物(該癌細胞及び癌はEBI3、CDKN3、EF−1δ又はNPTXR遺伝子の中から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する)、
[2]二本鎖分子が配列番号18(配列番号1の679nt〜697ntの位置)、配列番号20(配列番号1の280nt〜298ntの位置)、配列番号49(配列番号5の310nt〜328ntの位置)、配列番号51(配列番号7の225nt〜243ntの位置)、配列番号84(配列番号86の1280nt〜1298ntの位置)、及び配列番号85(配列番号86の1393nt〜1411ntの位置)の中から選択される標的配列と一致するmRNAで作用する、[1]に記載の組成物、
[3]二本鎖分子において、センス鎖が配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有する、[2]に記載の組成物、
[4]治療される癌が肺癌である、[1]に記載の方法、
[5]肺癌がNSCLC又はSCLCである、[4]に記載の方法、
[6]組成物が複数種の二本鎖分子を含有する、[1]に記載の組成物、
[7]複数種の二本鎖分子が同じ遺伝子を標的とする、[6]に記載の組成物。
[8]二本鎖分子が約100ヌクレオチド長未満である、[3]に記載の組成物。
[9]二本鎖分子が約75ヌクレオチド長未満である、[8]に記載の組成物。
[10]二本鎖分子が約50ヌクレオチド長未満である、[9]に記載の組成物。
[11]二本鎖分子が約25ヌクレオチド長未満である、[10]に記載の組成物。
[12]二本鎖分子が約19ヌクレオチド〜約25ヌクレオチド長の間である、[11]に記載の組成物。
[13]二本鎖分子が、介在一本鎖によって連結される、センス鎖とアンチセンス鎖とを含む単一ポリヌクレオチドから成る、[1]に記載の組成物。
[14]二本鎖分子が一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖配列であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である)を有する、[13]に記載の組成物、
[15]二本鎖分子がRNAである、[1]に記載の組成物。
[16]二本鎖分子がDNA及び/又はRNAである、[1]に記載の組成物。
[17]二本鎖分子がDNAポリヌクレオチドとRNAポリヌクレオチドとのハイブリッドである、[16]に記載の組成物。
[18]センス鎖ポリヌクレオチドとアンチセンス鎖ポリヌクレオチドとがそれぞれ、DNAとRNAとから成る、[17]に記載の組成物。
[19]二本鎖分子がDNAとRNAとのキメラである、[16]に記載の組成物。
[20]アンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域、又はセンス鎖の5'末端に隣接する領域及びアンチセンス鎖の3'末端に隣接する領域の両方がRNAから成る、[19]に記載の組成物、
[21]隣接領域が9個〜13個のヌクレオチドから成る、[20]に記載の組成物。
[22]二本鎖分子が3'オーバーハングを含有する、[1]に記載の組成物。
[23]二本鎖分子がベクターによってコードされ、組成物に含有される、[1]に記載の組成物。
[24]二本鎖分子が一般式:5'−[A]−[B]−[A']−3'(式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85の中から選択される標的配列に対応する配列を含有するセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、[A']は[A]に相補的な配列を含有するアンチセンス鎖である)を有する、[23]に記載の組成物、並びに
[25]トランスフェクション増強剤と薬学的に許容可能な担体とを含む、[1]に記載の組成物。
EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δの発現が、肺癌細胞において特異的に上昇することが見出された(図1、図5、図7、図8、及び図16)。したがって、本発明において同定された遺伝子、並びにそれらの転写産物及び翻訳産物には、肺癌に対するマーカーとしての診断的有用性が見られ、細胞試料におけるEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δの発現を測定することにより、肺癌を診断することができる。具体的には、本発明は、被験体におけるEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δの発現レベルを測定することにより肺癌を診断する方法を提供する。本発明の方法によって診断することのできる肺癌には、NSCLC及びSCLCが含まれる。さらに、肺腺癌及び肺扁平上皮癌(SCC)を含むNSCLCも、本発明により診断又は検出される。
[1]
(a)生体試料においてEBI3、CDKN3、又はEF−1δのアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する工程、及び
(b)遺伝子の正常対照レベルと比較して、検出される発現レベルの上昇を疾患の存在と相関させる工程を含む、肺癌を診断する方法。
[2]発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%高い、[1]に記載の方法、
[3]発現レベルが、
(a)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δの配列を含むmRNAを検出すること、
(b)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δのアミノ酸配列を含むタンパク質を検出すること、及び
(c)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、又はEF−1δのアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出することの中から選択される方法により検出される、[1]に記載の方法、
[4]肺癌がNSCLC又はSCLCである、[1]に記載の方法、
[5]発現レベルを、プローブと遺伝子の遺伝子転写産物とのハイブリダイゼーションを検出することにより求める、[3]に記載の方法、
[6]発現レベルを、遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体の結合を遺伝子の発現レベルとして検出することにより求める、[3]に記載の方法、
[7]生体試料が生検材料、痰、又は血液を含む、[1]に記載の方法、
[8]被験体から得られる生体試料が上皮細胞を含む、[1]に記載の方法、
[9]被験体から得られる生体試料が癌細胞を含む、[1]に記載の方法、
[10]被験体から得た生体試料が癌性上皮細胞を含む、[1]に記載の方法。
本発明は、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及びEF−1δの発現は、患者の予後が悪くなることに有意に関連があるという新規の発見に関係している。したがって本発明は、患者の生体試料においてEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子の発現レベルを検出すること、検出された発現レベルを対照レベルと比較すること、及び予後不良(poor prognosis)(低い生存率)の指標として、対照レベルに対する発現レベルの増大を求めることによって、癌、特に肺癌の患者の予後を求める又は判定する方法を提供する。
本発明は、癌を診断する又は癌の予後を判定するキットを提供する。好ましくは、癌は肺癌である。特にキットは、患者から得た生体試料においてEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子の発現を検出する試薬を少なくとも1つ含み、この試薬は、
(a)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子のmRNAを検出する試薬、
(b)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δタンパク質を検出する試薬、及び
(c)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δタンパク質の生物活性を検出する試薬から成る群から選択され得る。
被験体から得た血液試料におけるEBI3のレベルを測定することにより、被験体においてEBI3を発現する癌の発生、又は癌を発症する素因を判定することができる。癌は肺癌、例えばNSCLC及びSCLCであり得る。さらに、SCLCは肺腺癌及び肺扁平上皮癌(SCC)を含む。したがって、本発明は、血液試料におけるEBI3のレベルを求めること(例えば測定すること)を包含する。本発明において、肺癌を診断する方法はまた、肺癌を試験又は検出する方法を含む。代替的には、本発明においては、肺癌の診断とは、被験体における肺癌の疑い、危険性、又は可能性を示すことも指す。
(a)血液試料を診断を受ける被験体から採取する工程、
(b)血液試料におけるEBI3のレベルを求める工程、及び
(c)工程(b)において求められるEBI3レベルを、正常対照のEBI3レベルと比較する工程を含む、被験体において肺癌を診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるEBI3レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。代替的には、本発明は、
(a)診断を受ける被験体から採取した血液試料におけるEBI3のレベルを求める工程、及び
(b)工程(a)において求められるEBI3レベルを、正常対照のEBI3レベルと比較する工程を含む、被験体においてSCCを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるEBI3レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。
(d)血液試料におけるCEAのレベルを求める工程、
(e)工程(d)において求められるCEAレベルを、正常対照のCEAレベルと比較する工程、及び
(f)血液試料において、正常対照と比較して高いEBI3レベル及び高いCEAレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にNSCLCを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
(d)血液試料におけるCYFRAのレベルを求める工程、
(e)工程(d)において求められるCYFRAレベルを、正常対照のCYFRAレベルと比較する工程、及び
(f)血液試料において、正常対照と比較して高いEBI3及び高いCYFRAレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にSCCを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
(d)血液試料においてpro−GRPのレベルを求める工程、
(e)工程(d)において求められるpro−GRPレベルを、正常対照のpro−GRPレベルと比較する工程、及び
(f)血液試料において、正常対照と比較して高いEBI3及び高いpro−GRPレベルのいずれか又は両方が、被験体が肺癌、特にSCLCを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
(a)診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
(b)血液試料におけるNPTX1のレベルを求める工程、及び
(c)工程(b)において求められるNPTX1レベルを、正常対照のNPTX1レベルと比較する工程を含む、被験体においてSCCを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるNPTX1レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。代替的には、本発明は、
(a)診断を受ける被験体から採取した血液試料におけるNPTX1のレベルを求める工程、及び
(b)工程(a)において求められるNPTX1レベルを、正常対照のNPTX1レベルと比較する工程を含む、被験体においてSCCを診断する方法を提供するが、ここで血液試料におけるNPTX1レベルが正常対照と比較して高いことにより、被験体が肺癌を患っていることが示唆される。
(d)血液試料におけるCYFRAのレベルを求める工程、
(e)工程(d)において求められるCYFRAレベルを、正常対照のCYFRAレベルと比較する工程、及び
(f)血液試料において、正常対照と比較して高いNPTX1レベル及び高いCYFRAレベルのいずれか又は両方が、被験体がSCCを患っていることを示唆すると判断する工程をさらに含み得る。
ペルオキシダーゼ、
アルカリフォスファターゼ、
ウレアーゼ、
カタラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、
乳酸脱水素酵素、又は
アミラーゼ等が挙げられる。
フルオレセインイソチオシアネート、
テトラメチルローダミンイソチオシアネート、
置換ローダミンイソチオシアネート、又は
ジクロロトリアジンイソチオシアネート等が挙げられる。
トリチウム、
125I、又は
131I等が挙げられる。
本発明による肺癌の診断を実行するために使用される成分を予め組み合わせて、試験キットとして供給することができる。したがって、本発明は、
(i)血液試料におけるEBI3レベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(ii)EBI3に対する陽性対照試料を含有する、肺癌を検出するためのキットを提供する。
(iii)血液試料におけるCEA又はpro−GRPレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(iv)CEA及び/又はpro−GRPに対する陽性対照試料をさらに含有し得る。
(i)血液試料におけるNPTX1レベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(ii)NPTX1に対する陽性対照試料を含有する、肺癌を検出するためのキットを提供する。
(iii)血液試料におけるCYFRAレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(iv)CYFRAに対する陽性対照試料をさらに含有し得る。
本発明に関して、本スクリーニング法により同定される薬剤は任意の化合物であっても、又は幾つかの化合物を含む組成物であってもよい。さらに、本発明のスクリーニング法によって細胞又はタンパク質に曝露される試験薬剤は、単一の化合物であっても、又は化合物の組み合わせであってもよい。化合物の組み合わせを方法に使用する場合、化合物は順次又は同時に接触させることができる。
試験薬剤ライブラリの構築は、求められる特性を有することが知られる化合物の分子構造、及び/又は阻害される標的分子、すなわちEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及びEF−1δの分子構造の情報により容易になる。さらなる評価に適切な試験薬剤を予備スクリーニングする一アプローチは、試験薬剤とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。
試験薬剤のコンビナトリアルライブラリは、既知の阻害剤中に存在するコア構造の情報を含む、合理的薬物設計プログラムの一部として作製され得る。このアプローチにより、ハイスループットスクリーニングを促す適度なサイズにライブラリを維持することが可能になる。代替的には、ライブラリを構成する分子ファミリーの全順列を単に合成することにより、単純な、特に短い重合体分子ライブラリが構築され得る。この後者のアプローチの一例は、6アミノ酸長の全ペプチドのライブラリである。かかるペプチドライブラリは6アミノ酸おきの配列順列を含み得る。このタイプのライブラリは、線形コンビナトリアル化学ライブラリと称される。
別のアプローチは、ライブラリを作成するために組み換えバクテリオファージを使用する。この「ファージ法」(Scott & Smith, Science 1990, 249: 386-90、Cwirla et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87: 6378-82、Devlin et al., Science 1990, 249: 404-6)を用いて、非常に大きいライブラリを構築することができる(例えば106個〜108個の化学物質)。第2のアプローチは、主として化学的な方法を使用するが、Geysenの方法(Geysen et al., Molecular Immunology 1986, 23: 709-15、Geysen et al., J Immunologic Method 1987, 102: 259-74)、及びFodor et al.の方法(Science 1991, 251: 767-73)がその例である。Furka et al.(14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume #5, Abstract FR: 013; Furka, Int J Peptide Protein Res 1991, 37: 487-93)、Houghten(米国特許第4,631,211号明細書)、及びRutter et al.(米国特許第5,010,175号明細書)は、アゴニスト又はアンタゴニストとして試験することのできるペプチドの混合物を生成する方法を記載している。
本発明では、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及びEF−1δの過剰発現が、正常器官における発現はなかったにもかかわらず、肺癌において検出された(図1、図5、図7、図16、及び図19)。したがって、EBI3、DLX5、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子、該遺伝子によりコードされるタンパク質を用いて、本発明はEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δに結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。肺癌におけるEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及びEF−1δの発現により、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δに結合する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌の治療又は予防に有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δポリペプチドを用いて、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、並びに肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。特に、このスクリーニング法の一実施形態は、
(a)試験化合物を、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
(b)ポリペプチドと試験化合物との間の結合活性を検出する工程、及び
(c)ポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程、
を含む。
本発明において、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及びEF−1δタンパク質は、肺癌細胞の細胞増殖(図4D、図6D、図10A、図10B、図22A、及び図22B)、細胞浸潤活性(図23A)、細胞外分泌(図1C及び図7D)、ホスファターゼ活性(図21A)、及びAktリン酸化(図23D)を促進する活性を有する。これらの生物活性を用いて、本発明は、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。したがって、本発明は、
(a)試験化合物をEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程
(b)工程(a)のポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
(c)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの生物活性を、試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程を含む、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子によりコードされるポリペプチドを用いて、肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
(a)候補化合物を、CDKN3を過剰発現する細胞と接触させる工程、
(b)EF−1δのリン酸化レベルを測定する工程、及び
(c)対照と比較して脱リン酸化を低減する候補化合物を選択する工程を含む。
(a)候補化合物を、CDKN3を過剰発現する細胞と接触させる工程、
(b)Akt Ser473のリン酸化を測定する工程、及び
(c)対照と比較してリン酸化を低減する候補化合物を選択する工程を含む。
(1)アラニン(A)、グリシン(G);
(2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
(3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
(4)アルギニン(R)、リシン(K);
(5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
(6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
(7)セリン(S)、スレオニン(T);及び
(8)システイン(C)、メチオニン(M)
(例えば、Creighton, Proteins 1984を参照されたい)。
本発明において、siRNAによるEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの発現の減少は、癌細胞増殖の阻害を引き起こす(図4D、図6D、図10A、図10B、図22A、及び図22B)。したがって、本発明はEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの発現を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの発現を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明に関しては、かかるスクリーニングは例えば、
(a)候補化合物をEBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δを発現する細胞と接触させる工程、並びに
(b)EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの発現レベルを対照と比較して低下させる候補化合物を選択する工程を含み得る。
(a)候補化合物を、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの転写調節領域及び転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子から成るベクターを導入した細胞と接触させる工程、
(b)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(c)上記レポーター遺伝子の発現又は活性を低下させる候補化合物を選択する工程が含まれ得る。
本発明において、CDKN3(配列番号5;GenBankアクセッション番号:L27711)と、バリル−tRNA合成酵素(VRS)(配列番号26若しくは配列番号28;GenBankアクセッション番号:NM_006295若しくはBC012808)又はEF−1β(配列番号30;GenBankアクセッション番号:NM_001959)又はEF−1γ(配列番号7;GenBankアクセッション番号:BC009907)又はEF−1δ(配列番号32;GenBankアクセッション番号:BC009865)との間の相互作用を免疫沈降(図18A)により示すか、又はNPTX1とNPTXRとの間の相互作用を図15Bに示す。さらに、CDKN3は、EF−1γの72〜160アミノ酸(配列番号48)に対応する領域に結合する(図21B及び図21C)。さらに、CDKN3はEF−1δを脱リン酸化する(図20D及び図21A)。したがって、本発明は、CDKN3と、VRS、EF−1α、EF−1β、EF−1γ、及びEF−1δの中から選択される相互作用パートナーとの間の結合、又はNPTX1とNPTXRとの間の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。CDKN3とこれらの相互作用パートナーとの間、又はNPTX1とNPTXRとの間の結合を阻害する化合物は、肺癌細胞の増殖を抑制し、したがって肺癌を治療又は予防するのに有用であることが期待される。したがって、本発明はまた、肺癌細胞の増殖を抑制する化合物をスクリーニングする方法、及び肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法を提供する。
(a)CDKN3ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験化合物の存在下で、VRSポリペプチド、EF−1αポリペプチド、EF−1βポリペプチド、EF−1γポリペプチド、EF−1δポリペプチド、及びその機能的等価物の中から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程、並びに
(c)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程、又は
(a)NPTX1ポリペプチド又はその機能的等価物を、試験化合物の存在下で、相互作用NPTXRポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
(b)ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
(c)ポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程を含む。
本発明においては、以下の事象の1つ又は複数を抑制することにより、NSCLC及びSCLCを含む肺癌の細胞増殖が低減することが明らかになる:
EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの発現、
EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3、及び/又はEF−1δの生物活性、並びに
CDKN3と、EF−1α、EF−1β、EF−1γ、及び/又はEF−1δとの間の相互作用。
本明細書中で開示されるタンパク質のドミナントネガティブ(dominant negative)突然変異体を、肺癌を治療又は予防するために使用することができる。例えば、本発明は、優性阻害効果を有するEF−1δ突然変異体、又はかかる突然変異体をコードするポリヌクレオチドを投与することにより、被験体において肺癌を治療又は予防する方法を提供する。EF−1δ突然変異体は、CDKN3結合領域を含むアミノ酸配列、例えばEF−1δのロイシンジッパーの一部を含むEF−1δタンパク質の一部を含み得る(図20Aを参照)。EF−1δ突然変異体は、配列番号8の90aa〜108aaの位置に対応する配列番号61のアミノ酸配列を有し得る。
[R]−[D]
(式中、[R]は膜形質導入物質であり、[D]は配列番号61のアミノ酸配列を有するポリペプチドである)を有し得る。該一般式において、[R]は[D]と直接連結しても、又はリンカーを介して[D]と間接的に連結してもよい。複数の官能基を有するペプチド又は化合物をリンカーとして使用することができる。具体的には、アミノ酸配列:−GGG−がリンカーとして使用され得る。代替的には、膜形質導入物質及び配列番号61のアミノ酸配列を有するポリペプチドを微粒子の表面に結合させることができる。本発明においては、[R]は[D]の任意の(arbitral)領域に連結し得る。例えば、[R]を[D]のN末端又はC末端に連結しても、又は[D]を構成するアミノ酸残基の側鎖に連結してもよい。さらに、[R]の複数の分子を[D]の1つの分子に連結することもできる。幾つかの実施形態では、[R]の複数の分子を[D]の異なる部位に連結してもよい。別の実施形態では、[D]は共に連結した幾つかの[R]で修飾され得る。
[ポリアルギニン];Matsushita, M. et al, J Neurosci. 21, 6000-7 (2003)、
[Tat/RKKRRQRRR](配列番号63);Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988)、Green, M. & Loewenstein, P. M. Cell 55, 1179-88 (1988)、
[ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK](配列番号64);Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)、
[ブホリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK](配列番号65);Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)、
[トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL](配列番号66);Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998)、
[MAP(モデル両親媒性ペプチド)/KLALKLALKALKAALKLA](配列番号67);Oehlke, J. et al. Biochem. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)、
[K−FGF/AAVALLPAVLLALLAP](配列番号68);Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)、
[Ku70/VPMLK](配列番号69);Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)、
[Ku70/PMLKE](配列番号70);Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)、
[プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP](配列番号71);Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002)、
[pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK](配列番号72);Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001)、
[Pep−1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV](配列番号73);Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001)、
[SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR](配列番号74);Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000)、
[Pep−7/SDLWEMMMVSLACQY](配列番号75);Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002)、
[HN−1/TSPLNIHNGQKL](配列番号76);Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000)。
実施例1 一般的方法
1.細胞株及び組織試料
この試験で使用される23種のヒト肺癌細胞株としては、9種の腺癌(ADC;A427、A549、LC319、PC−3、PC−9、PC−14、NCI−H1373、NCI−H1666及びNCI−H1781)と、2種の腺扁平上皮癌(ASC;NCI−H266及びNCI−H647)と、7種のSCC(EBC−1、LU61、NCI−H520、NCI−H1703、NCI−H2170、RERF−LC−AI、及びSK−MES−1)と、1種の大細胞癌(LX1)と、4種の小細胞肺癌(SCLC;DMS114、DMS273、SBC−3及びSBC−5)とが挙げられる。全ての細胞を、10%FCSを添加した適当な培地中で単層で成長させ、5%CO2で加湿空気雰囲気下で37℃に維持した。対照として用いたヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)をCambrex Bioscience, Inc.(East Rutherford, NJ)からの最適化培地(末梢気道成長培地)中で成長させた。初代の肺癌試料は、インフォームドコンセントにより早期に取得した(Yamabuki T, et al., Int J Oncol 28: 1375-84(2006)、Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205(2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75(2006))。国際対癌連合のTNM分類に従って臨床病期を求めた(Sobin L et al., 6th ed. New York: Wiley-Liss; (2002))。271種のADC、110種のSCC、28種のLCC、14種のASC、及び隣接正常肺組織を含む、合計で423種の原発性NSCLC(I期〜IIIA期)のホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター(埼玉県、日本)において外科手術を受ける患者から臨床病理的データと共に早期に得た。この研究及び言及した全ての臨床材料の使用は、個々の倫理審査委員会によって認可されたものであった。
血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、120人の健常な対照個人(96人の男性及び24人の女性、27歳〜60歳の範囲で年齢の中央値が51.6歳)、及び63人の慢性閉塞性肺疾患(COPD)である非腫瘍性肺疾患患者(53人の男性及び10人の女性、54歳〜73歳の範囲で年齢の中央値が67.0歳)から得た。これらのCOPD患者は全て、現在及び/又は以前に喫煙者であった(生涯喫煙量(pack-year index)(PYI)の平均[±1SD]が70.0±42.7であった。PYIは、1日で消費したタバコ箱数[1パック20本]に喫煙年数を乗算した数として規定された)。血清試料は、インフォームドコンセントに署名して、95人の肺癌患者(49人の男性及び46人の女性、38歳〜83歳の範囲で年齢の中央値が64.4歳)、並びに194人の肺癌患者(142人の男性及び52人の女性、38歳〜89歳の範囲で年齢の中央値が68.0歳)からも得た。これらの289肺癌症例には、170のADC、37のSCC及び82のSCLCが含まれていた。合計で289人の肺癌患者から得たこれらの血清試料を、以下の基準に基づいて研究のために選択した:(a)患者は新たに診断され、未治療であった、及び(b)患者の腫瘍が病理学的に肺癌であると診断された(I期〜IV期)。診断時に血清を得て、−150℃で保管した。
各々の試料から得た合計で3μgアリコートのmRNAを、ランダムプライマー(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)及びSuperScript II(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて一本鎖cDNAに逆転写させた。以下のEBI3に特異的な合成プライマーセット、又は内部対照としてβアクチン(ACTB)に特異的なプライマーを用いて半定量的逆転写−PCR(RT−PCR)実験を行なった:
EBI3、5'−TGTTCTCCATGGCTCCCTAC−3'(配列番号9)及び
5'−AGCTCCCTGACGCTTGTAAC−3'(配列番号10)、
ACTB、5'−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3'(配列番号11)及び
5'−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3'(配列番号12)。
16種の組織を対象とするヒト多組織ブロット(BD Biosciences,Palo Alto,CA)を、以下のプライマーを用いてプローブとして調製した、[α−32P]−dCTPで標識したEBI3のPCR産物(404bp)とハイブリダイズさせた:
5'−TGTTCTCCATGGCTCCCTAC−3'(配列番号13)、及び
5'−CTACTTGCCCAGGCTCATTG−3'(配列番号14)。
細胞をカバーガラス(Becton Dickinson Labware,Franklin Lakes,NJ)上に置き、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1%Triton X−100を用いて室温で3分間透過処理した。非特異的な結合を、室温で10分間、Casblock(ZYMED,San Francisco,CA)でブロッキングした。次に細胞を、室温で60分間、3%BSAを含有するPBS中で希釈した一次抗体とインキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を室温で60分間、Alexa 488結合二次抗体(Invitrogen)で染色した。PBSによるさらなる洗浄の後、各々の検体を、4'、6−ジアミジノ−2−フェニルインドールを含有するVectashield(Vector Laboratories, Inc,Burlingame,CA)に載せ、Spectral Confocal Scanning Systems(TSC SP2 AOBS:Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)で可視化した。
パラフィンブロック中に埋包された臨床試料におけるEBI3タンパク質の存在を研究するために、切片を以下の様に染色した。要約すると、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、3.3mg/mLのヤギポリクローナル抗ヒトEBI3抗体(Santa Cruz Biotechnnology,Santa Cruz,CA)を各スライドに添加し、切片を、二次抗体としてHRP標識抗ヤギIgG[Histofine Simple Stain MAX PO (G),Nichirei,Tokyo,Japan]とインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍組織マイクロアレイは、他で記載したように(Chin SF, et al., Mol Pathol 56: 275-9 (2003)、Callagy G, et al., Diagn Mol Pathol 12: 27-34 (2003)、Callagy G, et al., J Pathol 205: 388-96 (2005))、423のホルマリン固定原発性肺癌を用いて構築した。サンプリングのための組織領域を、スライド上の対応するH&E染色切片との視覚化アラインメントに基づき選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取された3つ、4つ又は5つの組織芯(直径0.6mm、深さ3mm〜4mm)を、組織マイクロアレイ(Beecher Instruments,Sun Prairie,WI)を用いてレシピエントのパラフィンブロックに入れた。それぞれの症例由来の正常な組織芯に穴を開けて、得られたマイクロアレイブロックの5μm切片を免疫組織化学分析に使用した。3人の別々の研究者が、臨床病理学的データの予備知識なく、以前レポートしたように(Suzuki C, et al., Cancer Res 65: 11314-25 (2005)、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004)、Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)、Hayama S, et al., Cancer Res 67: 4113-22 (2007)、EBI3陽性度を半定量的に判定した。EBI3染色の強度は、以下の基準を用いて評価した:強陽性(2+とスコア付け)、50%を超える腫瘍細胞が暗褐色に染色され、完全に細胞質を見えなくする;弱陽性(1+)、腫瘍細胞の細胞質で検知できるより程度の低い任意の褐色染色;欠損(0とスコア付け)、腫瘍細胞において検出できる染色なし。評価人(reviewers)が別々に症例を強陽性と規定する場合のみ、症例は強陽性であると認められた。
StatView統計プログラム(SAS,Cary,NC)を用いて統計的分析を行なった。外科手術の日からNSCLCに関連する死亡の時点、又は最後の追跡観察までの腫瘍特異的な生存曲線を算出した。カプラン・マイヤー曲線を各関係変数及びEBI3発現について算出した。患者サブグループ間の生存期間における差異を、ログランク検定を用いて分析した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量分析及び多変量分析を行なって、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との間の関連性を判定した。第1に、年齢、性別、病理学的腫瘍分類、及び病理学的結節分類を含む考え得る予後因子(一度に1つの因子を考慮に入れる)と死との間の関連性を分析した。第2に、多変量Cox分析を、P値<0.05の取り込み(entry)レベルを満たした任意及び全ての変数と共に、強いEBI3発現を常にモデルに入れる変数減少(backward)(ステップワイズ)手順に適用した。モデルに因子を加え続けたが、独立因子はP<0.05の追い出し(exit)レベルを超えなかった。
独自に構築したELISAシステムでEBI3の血清レベルを測定した。まず初めに、EBI3に特異的なヤギポリクローナル抗体を捕捉抗体として96ウェルマイクロプレート(Nunc Roskilde,Denmark)に加え、室温で2時間インキュベートした。いかなる非結合抗体も洗い流した後、5% BSAをウェルに加え、ブロッキングのために4℃で16時間インキュベートした。1回の洗浄後、3倍希釈血清をウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。いかなる非結合物質も洗い流した後、Biotin Labeling Kit−NH2(同仁化学研究所、熊本県、日本)を使用してEBI3に特異的なビオチニル化したポリクローナル抗体を検出抗体としてウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。1回洗浄して、いかなる非結合抗体−酵素試薬も取り除いた後、HRP−ストレプトアビジンをウェルに加え、20分間インキュベートした。1回洗浄後、基質溶液(R&D Systems, Inc.,Minneapolis,MN)をウェルに加え、30分間反応させた。2Nの硫酸100μLを添加することによって反応を停止させた。着色強度を、450nmの波長、570nmの参照波長で光度計によって求めた。血清中のCEAのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット(Hope Laboratories,Belmont,CA)を使用してELISAによって測定した。血清中のProGRPのレベルは、供給業者のプロトコルに従って、市販の酵素試験キット(株式会社テイエフビー、東京都、日本)を使用してELISAによって測定した。腫瘍群と健常な対照群との間のEBI3、CEA、及びProGRPレベルの差異はマンホイットニーU検定によって分析した。最適な診断精度及び尤度比を有するカットオフレベルを求めるために、EBI3、CEA、及びProGRPのレベルを受信者動作特性(ROC)曲線分析によって評価した。EBI3とCEA/ProGRPとの間の相関係数をスピアマンの順位相関係数を用いて算出した。有意差は、P<0.05として規定した。
低分子干渉RNA(siRNA)二本鎖(Dharmacon, Inc.,Lafayette,CO)(600pM)を、30μlのLipofectamine 2000(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて、製造業者のプロトコルに従って、NSCLC細胞株A549及びLC319にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を7日間培養し、細胞の生存率を3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイ(セルカウンティングキット−8溶液;同仁化学研究所、熊本県、日本)により評価した。EBI3発現の抑制を確認するために、半定量的RT−PCRを上記のEBI3に特異的な合成プライマーを用いて行なった。RNAiに関する合成オリゴヌクレオチドの配列は、以下のようであった:
対照1(On−Target plus;Dharmacon, Inc.;
5'−UGGUUUACAUGUCGACUAA−3'(配列番号53に対応するRNA)、
5'−UGGUUUACAUGUUUUCUGA−3'(配列番号54に対応するRNA)、
5'−UGGUUUACAUGUUUUCCUA−3'(配列番号55に対応するRNA)、
5'−UGGUUUACAUGUUGUGUGA−3'(配列番号56に対応するRNA)のプール)、
対照2(ルシフェラーゼ/LUC:フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子);
5'−NNCGUACGCGGAAUACUUCGA−3'(配列番号16に対応するRNA)、
EBI3−1に対するsiRNA(si−EBI3−#1);
5'−UACUUGCCCAGGCUCAUUGUU−3'(配列番号17)、
si−EBI3−#1の標的配列;
5'−CAATGAGCCTGGGCAAGTA−3'(配列番号18)、
si−EBI3−#2;
5'−AACAGCUGGACAUCCGUGAUU−3'(配列番号19)、
si−EBI3−#1の標的配列;
5'−TCACGGATGTCCAGCTGTT−3'(標的配列20)。
EBI3を安定発現する形質転換体を標準プロトコルに従って樹立した。EBI3の全コード領域を、プライマーセット(5'−CCGCTCGAGGGAATTCCAGCCATGACCCCGCAGCTT−3'及び5'−TGCTCTAGAGCACTTGCCCAGGCTCATTGTGGC−3')を用いたRT−PCRにより増幅した。産物をEcoRI及びXbaIを用いて消化し、EBI3タンパク質のCOOH末端のc−myc−Hisエピトープ配列(LDEESILKQEHHHHHH)を含有するpcDNA3.1−myc/HisA(+)ベクター(Invitrogen)の適当な部位にクローニングした。FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics,Basel,Switherland)を製造業者のプロトコルに従って用いて、内因性EBI3を発現しないCOS−7細胞に、EBI3を発現するプラスミド(pcDNA3.1−EBI3−myc/His)、又はモックプラスミド(pcDNA3.1−myc/His)のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、10%FBS及びジェネテシン(0.4mg/mL)を含有するDMEM中で14日間培養した。次に、50個の別個のコロニーをトリプシン処理し、限界希釈アッセイにより安定な形質転換体についてスクリーニングした。各々のクローンにおいてEBI3の発現を、ウエスタンブロット法及び免疫染色により求めた。
EBI3を安定発現することのできるCOS−7形質転換体を、6ウェルプレートに播種し(1×104細胞/ウェル)、10%FCS及び0.4mg/mlのジェネテシンを含有する培地において維持した。120時間後、細胞増殖をセルカウンティングキット(和光純薬工業株式会社、大阪府、日本)を用いたMTTアッセイにより評価した。コロニーを染色し、同時に計数した。全ての実験は三連で行なった。
初期段階での癌の存在の検出に適用可能であり得る新規の分子を同定するため、且つ癌細胞の生物学的特性に基づく新規の治療を発展させるために、101種の肺癌の全ゲノム発現プロファイル分析を、cDNAマイクロアレイ(Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205 (2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75 (2006)、Kikuchi T, et al., Int J Oncol 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1: 485-99 (2003)、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 13: 3029-43 (2004))を用いて実行した。スクリーニングした32256種の遺伝子のうち、EBI3転写産物の発現の上昇(3倍以上)が、検査した肺癌試料の大半の癌細胞において同定された。15種の肺癌組織のうち11種、23種の肺癌細胞株のうち12種において、過剰発現が半定量的RT−PCR実験により確認された(図1A)。肺癌細胞における内因性EBI3の細胞内局在化を検査するために、免疫蛍光分析を実行した。EBI3転写産物を半定量的RT−PCR実験により検出したところ、LC319細胞及びNCI−H1373細胞において、高レベルのEBI3が粒状外観を呈した腫瘍細胞の細胞質で検出されたが(図1A)、NCI−H2170細胞及び気管支上皮由来のBEAS−2B細胞は共に、EBI3の発現を示さなかった。結果は、抗体がEBI3に特異的に結合することを示唆するものでもあった(図1B)。また、EBI3は分泌タンパク質をコードするため、EBI3の培養上清レベルをELISAによって評価し、EBI3はLC319及びPC14により分泌されるが、一方でNCI−H2170又はBEAS−2Bによる分泌EBI3は検出されないことを確認した(図1C)。
肺癌形成におけるEBI3の生物学的意義及び臨床病理的意義を調査するために、根治的切除を受けた423件のNSCLC症例からの組織切片を含有する組織マイクロアレイ上で、免疫組織化学的染色を行なった。EBI3に特異的なポリクローナル抗体を用いて検出されるEBI3染色は、腫瘍細胞の細胞質で主に観察されるが、正常肺細胞においては観察されなかった(図2A)。EBI3発現のパターンを、組織アレイ上で、なし(0としてスコア付け)から弱い/強い陽性(1+〜2+としてスコア付け)までの範囲で分類した。EBI3は、423種のNSCLCのうち、210件(49.6%)の症例で強く染色され(スコア:2+)、159件(37.6%)の症例で弱く染色され(スコア1+)、54件(12.8%)の症例で染色されなかった(スコア0)(表2A)。次に、EBI3発現(強い陽性対弱い陽性/なし)と、性別(男性でより高い;フィッシャーの直接確率検定によるP<0.0001)、組織型(非ADCでより高い;フィッシャーの直接確率検定によるP=0.0004)、腫瘍サイズ(pT2−4でより高い;フィッシャーの直接確率検定によるP=0.0009)、及びリンパ節転移(pN1−2でより高い;フィッシャーの直接確率検定によるP=0.0039)との有意な相関が見出された(表2A)。NSCLC患者の生存期間中央値は、EBI3の発現レベルが高くなるに従って有意に短くなる(P=0.0011、ログランク検定;図2B)。また、患者の予後と、年齢、性別、病理学的腫瘍段階(腫瘍サイズ;T1対T2−4)、病理学的結節段階(結節状態;N0対N1、N2)、組織構造(ADC対他の組織型(histology types))、及びEBI3状態(スコア0、1+対スコア2+)を含む幾つかの因子との間の関連性を評価するために、単変量分析を適用した。これらの変数は全て、予後不良と有意に関連する。Cox比例ハザードモデルを用いた多変量分析により、EBI3(P=0.0435)並びに他の3つの因子(年齢、病理学的腫瘍段階、及び病理学的結節段階)が、外科的治療を行ったNSCLC患者に関して独立した予後因子であることが決定された(表2B)。
EBI3は分泌タンパク質をコードするため、EBI3タンパク質が肺癌患者の血清中に分泌されるか否かを調査した。ELISA実験により、301人の肺癌患者から得た血清試料の大半においてEBI3タンパク質が検出された。肺癌患者におけるEBI3の血清レベルの平均(±1SD)は、18.0±16.4単位/mLであった。対照的に、134人の健常個体の平均(±1SD)EBI3血清レベルは、4.4±4.7単位/mLであり、喫煙者及び/又は喫煙経験者である63人のCOPD患者における平均(±1SD)EBI3血清レベルは、5.8±8.0単位/mLであった。血清EBI3タンパク質のレベルは、健常ドナー又はCOPD患者におけるより肺癌患者において有意に高かったが(P<0.0001、マンホイットニーU検定)、健常個体とCOPD患者との間の差は有意ではなかった(P=0.160)。肺癌の組織型によれば、EBI3の血清レベルは、178人の腺癌患者では17.8±15.4単位/mLであり、41人のSCC患者では19.9±16.9単位/mLであり、82人のSCLC患者では17.6±18.1単位/mLであったが(図3A)、この3つの組織型間の差は有意ではなかった。本発明者らは次に、EBI3のレベルと、情報が利用可能な肺癌患者の臨床段階との間の関係を評価した。初期段階の腫瘍を有する患者においても、高レベルの血清EBI3が検出された(図3B)。これら301人の癌患者及び134人の健常対照のデータを用いて作成したROC曲線を使用して(図4A、左パネル)、EBI3に対する最適な診断精度及び尤度比(最小の偽陰性及び偽陽性結果)を提供するために、このアッセイにおけるカットオフレベルを設定した(すなわち、45.2%(301人中136人)の感度且つ97.8%(134人中131人)の特異度で15.4単位/mL)。腫瘍組織構造によれば、血清EBI3の陽性症例の割合は、NSCLCに関しては47.9%(219人中105人)、SCLCに関しては37.8%(82人中31人)であった。COPDに関しては、血清EBI3の陽性症例の割合は3.2%(63人中2人)であった。同じ患者における血清EBI3のレベルをモニタリングするために、NSCLC患者から得た手術前及び手術後(外科手術の2ヶ月後)の血清試料のセット(paired)を用いて、ELISA実験を実行した。血清EBI3の濃度は、原発性腫瘍の外科的切除の後、劇的に低下した(図4A、右パネル)。本発明者らはさらに、血清を外科手術の前に採取した、同じセットの6件のNSCLC症例(EBI3陽性腫瘍を有する3人の患者及びEBI3陰性腫瘍を有する3人の患者)において、血清EBI3値を原発性腫瘍におけるEBI3の発現レベルと比較した。血清EBI3のレベルは、原発性腫瘍におけるEBI3の発現レベルと良い相関を示した(図4B)。結果は、初期段階での癌の検出及び疾患の再発のモニタリングのためのバイオマーカーとしての、血清EBI3の高い特異性及び大きな可能性を独立して支持するものである。
腫瘍検出バイオマーカーとしての血清EBI3レベルの臨床有用性を評価するために、2つの従来の腫瘍マーカー(ADC患者に対するCEA、SCC患者に対するCYFRA、及びSCLC患者に対するProGRP)の血清レベルを、癌患者及び対照個体から得た同じ血清試料セットにおいて、ELISAにより測定した。ROC分析によって、NSCLC検出に関するCEAのカットオフ値が、2.2ng/mLであると求められた(36.0%(178人中64人)の感度且つ97.5%(118人中115人)の特異度;図4C、左上パネル)。血清EBI3とCEA値との間の相関係数は有意ではなく(スピアマンの順位相関係数:ρ(rho)=0.063;P=0.4016)、血清中の両方のマーカーを測定することで、ADCの検出に対する総合感度が65.7%(178人中117人)に改善され得ることが示唆された(ADCの診断に関して、CEA単独の感度は36.0%(178人中64人)であり、EBI3単独の感度は46.1%(205人中82人)であった)。正常ボランティア(対照群)でのこの2つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性率は5.1%(118人中6人)であったが、同じ対照群におけるCEA及びEBI3各々の偽陽性率は、それぞれ2.5%(118人中3人)及び2.5%(118人中3人)であった(図4C、左下パネル)。SCC患者に対するROC分析により、CYFRAのカットオフ値は、48.6%(37人中18人)の感度且つ2.3%(130人中3人)の特異度で(図4C、中央上パネル)、2.0ng/mlであると求められた。血清EBI3とCYFRAとの間の相関係数は有意ではなく(スピアマンの順位相関係数:ρ(rho)=−0.117;P=0.4817)、血清中の両方のマーカーを測定することで、SCCの検出に対する総合感度が78.5%に改善され得ることが示唆された(SCCの診断に関して、CYFRA単独の感度は48.6%(37人中18人)であり、EBI3単独の感度は54.1%(37人中20人)であった)。正常ボランティア(対照群)でのこの2つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性率は4.6%(130人中6人)であったが、同じ対照群におけるCYFRA及びEBI3各々の偽陽性率は、それぞれ2.3%(130人中3人)及び2.3%(130人中3人)であった(図4C、中央下パネル)。SCLC患者に対するROC分析により、ProGRPのカットオフ値は、64.6%(82人中53人)の感度且つ97.4%(116人中3人)の特異度で(図4C、右上パネル)、39.5pg/mLであると求められた。血清EBI3とProGRP値との間の相関係数は有意ではなく(スピアマンの順位相関係数:ρ(rho)=0.074;P=0.5075)、同様に両方のマーカーの血清レベルを測定することで、SCLCの検出に対する総合感度が74.4%(82人中61人)に改善され得ることが示唆された(SCLCの診断に関して、ProGRP単独の感度は64.6%(82人中53人)であり、EBI3単独の感度は37.8%(82人中31人)であった)。正常ボランティア(対照群)でのこの2つの腫瘍マーカーのいずれかに関する偽陽性症例は5.2%(116人中6人)であったが、同じ対照群におけるProGRP及びEBI3各々の偽陽性率は、それぞれ2.6%(116人中3人)及び2.6%(116人中3人)であった(図4C、右下パネル)。
EBI3の上方制御が肺癌細胞の成長又は生存において役割を果たすか否かを判定するために、2つの異なる対照siRNA(ON−Target及びLUCに関するsiRNA)と共に、siRNAによる内因性EBI3発現の阻害を評価した。有効なsiRNAによる2つの異なるNSCLC細胞A549又はLC319の処理は、EBI3の発現を低下させ(図4D)、MTTアッセイ及びコロニー形成アッセイにより測定される細胞生存率及びコロニー数の有意な阻害をもたらした(図4D)。結果はEBI3の上方制御が癌細胞の成長又は生存と関連することを示唆する。
腫瘍形成におけるEBI3の潜在的な役割を明らかにするために、EBI3を発現するように設計したプラスミドを調製した(pcDNA3.1−EBI3−myc/His)。このプラスミド又はモックプラスミドをCOS−7細胞にトランスフェクトし、EBI3を発現する安定なクローンを樹立した。抗EBI3抗体を用いた免疫細胞化学的染色により、細胞質においてEBI3タンパク質の発現が確認された(データは示さない)。哺乳類細胞の成長に対するEBI3の影響を求めるために、本発明者らは、EBI3を安定発現するCOS−7由来形質転換体のコロニー形成アッセイを行なった。本発明者らは、外因性EBI3を発現する2つの独立したCOS−7細胞株(COS−7−EBI3−#1及びCOS−7−EBI3−#2;図4E、上パネル)を樹立し、それらの成長をモックベクターをトランスフェクトした対照細胞(COS−7−MOCK−M1及びCOS−7−MOCK−M2)の成長と比較した。2つのCOS−7−EBI3細胞のどちらの成長も、EBI3の発現レベルに応じて有意に促進された(図4E、下パネル)。また、COS7−EBI3細胞においては、対照細胞より大きなコロニーを形成する顕著な傾向が見られた(図4E、下パネル)。siRNAアッセイの結果によると、これらのデータによりEBI3は腫瘍成長及び/又は生存において重要な役割を果たすことが強く示唆される。
腫瘍の画像診断、併用化学療法、及び放射線療法における最近の進歩に関わらず、肺癌患者に関する予後及び生活の質という観点では、過去10年間にわずかな改善しか達成されていない。したがって、癌の早期検出のための、及び個々の患者に対する補助治療法のより良い選択のための新規の診断バイオマーカーを開発することが現在緊急に必要とされている。101種の肺癌の全ゲノム発現プロファイル分析を、レーザーマイクロダイセクションによる癌細胞の濃縮の後、32256個を超える遺伝子を含有するcDNAマイクロアレイを用いて実行した(Kikuchi T, et al., Oncogene 22: 2192-205 (2003)、Taniwaki M, et al., Int J Oncol 29: 567-75 (2006)、Kikuchi T, et al., Int J Oncol 28: 799-805 (2006)、Kakiuchi S, et al., Mol Cancer Res 1: 485-99 (2003)、Kakiuchi S, et al., Hum Mol Genet 13: 3029-43 (2004))。この分析により、幾つかの遺伝子が新規の診断マーカー、治療薬、及び/又は免疫療法の開発のための候補としての可能性を有することが明らかにとなった(Suzuki C, et al., Cancer Res 65: 11314-25 (2005)、Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004)、Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005)、Hayama S, et al., Cancer Res 67: 4113-22 (2007))。
実施例7 一般的方法
1.肺癌細胞株及び組織試料
この研究において使用されるヒト肺癌細胞株は以下のようであった:肺腺癌(ADC)、A427、A549、LC319、PC3、PC9、及びNCI−H1373;細気管支肺胞上皮癌(BAC)、NCI−H1781;肺扁平上皮癌(SCC)、RERF−LC−AI、SK−MES−1、EBC−I、LU61、NCI−H520、NCI−H1703、及びNCI−H2170;肺腺扁平上皮癌(ASC)、NCI−H226及びNCI−H647;肺大細胞癌(LCC)、LX1;並びに小細胞肺癌(SCLC)、DMS114、DMS273、SBC−3、及びSBC−5。全ての細胞を10%ウシ胎仔血清(FCS)を補充した適当な培地において単層で成長させ、5%CO2の加湿空気の雰囲気で37℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)は、Cambrex Bio Science Inc.(Walkersville,MD)から購入した最適化培地(SAGM)において成長させた。14種の原発性NSCLC(7種のADC及び7種のSCC)を、以前に記載されているように(Kato T, et al., Cancer Res 65: 5638-46 (2005))、書面によるインフォームドコンセントを行なった上で患者から得た。合計で369種のNSCLC及び隣接正常肺組織の組織マイクロアレイ上での免疫染色用の試料は、埼玉県立がんセンター(埼玉県、日本)において根治的外科手術を受ける患者から得た。この研究及び全ての臨床材料の使用は、企業研究倫理委員会によって認可されたものであった
総RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies, Inc.,Gaithersburg,MD)を用い、製造業者のプロトコルに従って培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出したRNA及び正常ヒト組織ポリ(A)RNAをDNaseI(株式会社ニッポンジーン、東京都、日本)で処理し、オリゴ(dT)プライマー及びSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen,Carlsbad,CA)を用いて逆転写した。以下のDLX5特異的プライマー又は内部対照としてACTB特異的プライマーを用いて、半定量的RT−PCR実験を行なった:
DLX5:5'−CTCGCTCAGCCACCACCCTCAT−3'(配列番号21)、及び
5'−AGTTGAGGTCATAGATTTCAAGGCAC−3'(配列番号22);
ACTB:5'−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3'(配列番号11)及び
5'−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3'(配列番号12)。
ヒト多組織ブロット(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)を、32Pで標識したDLX5のPCR産物とハイブリダイズさせた。DLX5のcDNAプローブを、上記のプライマーを用いたRT−PCRにより調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び洗浄を供給業者の勧告に従って実行した。ブロットを室温で30時間、増感BASスクリーン(BIO−RAD,Hercules,CA)でのオートラジオグラフィーに供した。
NH2末端にHisタグ付きエピトープを含有する、DLX5の完全長断片を発現するプラスミドを、pET28ベクター(Novagen,Madison,WI)を用いて調製した。この組み換えペプチドを、大腸菌BL21コドンプラス株(Stratagene,LaJolla,CA)において発現させ、TALON樹脂(BD Bioscience)を用いて、供給業者のプロトコルに従って精製した。SDS−PAGEゲル上で抽出したタンパク質をウサギに接種し、免疫血清を標準方法に従ってアフィニティカラム上で精製した。アフィニティ精製した抗DLX5抗体を、免疫組織化学的研究に使用した。DLX5発現ベクターをトランスフェクトした細胞株から得た可溶化物を用いたウエスタンブロット上で、及び細胞株の免疫細胞化学的染色によって(細胞株は各々DLX5を内因的に発現するか又は発現しない)、抗体がDLX5に特異的であることが確認された。
SBC−5細胞をカバースリップ上に播種し、細胞を4%ホルムアミド中で固定し、冷メタノール/アセトン(50:50)を用いて室温で5分間透過処理した。PBSで一回洗浄した後、細胞を抗DLX5抗体と室温で1時間インキュベートした後、Alexa488結合ヤギ抗ウサギ抗体(Molecular Probe)(1:1000希釈)と暗所で1時間インキュベートした。共焦点顕微鏡(TCS SP2−AOBS、Leica Microsystems)上で画像を捉えた。
臨床材料におけるDLX5タンパク質の存在を調査するために、組織切片をENVISION+キット/HRP(DakoCytomation,Glostrup,Denmark)によって染色した。内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、アフィニティ精製した抗DLX5抗体を添加し、各々の切片を二次抗体であるHRP標識抗ウサギIgGとインキュベートした。基質色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍組織マイクロアレイを、他に掲載されているように、ホルマリン固定NSCLCを用いて構築した(Ishikawa N, et al., Clin Cancer Res 10: 8363-70 (2004))。サンプリングのための組織領域は、スライド上での対応するHE染色切片とのビジュアルアラインメント(visual alignment)に基づいて選択した。ドナー腫瘍ブロックから採取した3つ、4つ、又は5つの組織芯(直径0.6mm;高さ3mm〜4mm)を、組織マイクロアレイヤー(Beecher Instruments,Sun Prairie,WI)を用いてレシピエントパラフィンブロックに入れた。各々のケースから正常組織の芯を抜いた。得られたマイクロアレイブロックの5μmの切片を免疫組織化学的分析に使用した。DLX5に関する陽性は、臨床追跡データの予備知識を持たない3人の別の調査員により半定量的に判定され、調査員は各々、染色強度をなし(0としてスコア付け)、弱い陽性(1+)、又は強い陽性(2+)として記録した。肺癌は、全ての調査員(reviewers)が強い陽性(2+)であると判断した場合にのみ、そのようにスコア付けした。
全ての分析は、統計的分析ソフトウェア(StatView、バージョン5.0;SAS Institute, Inc.,Cary,NC,USA)を用いて実行した。その発現レベルと年齢、性別、病理学的TNM段階、及び組織型等の臨床病理的変数との間の相関を次に検査した。強いDLX5免疫反応性を、フィッシャーの直接確率検定を用いて臨床病理学的変数との関連性について判定した。Cox比例ハザード回帰モデルを用いて単変量分析及び多変量分析を行なって、臨床病理学的変数と癌関連死亡率との間の関連性を判定した。第1に、年齢、性別、組織型、pT分類、及びpN分類を含む考え得る予後因子(一度に1つの因子を考慮に入れる)と死との間の関連性を分析した。第2に、多変量Cox分析を、0.05未満のP値の取り込み(entry)レベルを満たした任意及び全ての変数と共に、DLX5発現を常にモデルに入れる変数減少(ステップワイズ)手順に適用した。モデルに因子を加え続けたが、独立因子はP<0.05の追い出し(exit)レベルを超えなかった。
哺乳類細胞においてsiRNAを生成するように設計されたベクターベースのRNA干渉(RNAi)システム、psiH1BX3.0がこれまでに確立されている(Suzuki C, et al., Cancer Res 63: 7038-41(2003))。DLX5特異的siRNA発現ベクター10μgを、30μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、DLX5を内因性過剰発現した、SBC−5及びNCI−H1781細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を適当な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で7日間培養し、コロニー数及び生細胞をギムザ染色及び三連MTTアッセイによって計数した。RNAiに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった:
対照1(EGFP:高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子、オワンクラゲ(Aequorea victoria)GFPの突然変異体)、5'−GAAGCAGCACGACTTCTTC−3'(配列番号23);
対照2(スクランブル:5S及び16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ(Euglena gracilis)遺伝子)、5'−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3'(配列番号16);
siRNA−DLX5−♯1、5'−CCAGCCAGAGAAAGAAGTG−3';
siRNA−DLX5−♯2、5'−GTGCAGCCAGCTCAATCAA−3'。
肺癌に対する新規の治療剤及び/又はバイオマーカーの開発のための標的分子を同定するために、初めに、分析した86種のNSCLC又は15種のSCLCの50%より多くにおいて、5倍以上の発現を示す遺伝子についてcDNAマイクロアレイによるスクリーニングを実行した(Kikuchi T, et al. Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14): 2192-205、Taniwaki M, et al, Int J Oncol. 2006 Sep; 29(3): 567-75、Kakiuchi S, et al. Mol Cancer Res. 2003 May; 1(7): 485-99)。スクリーニングした27648種の遺伝子のうち、DLX5遺伝子が肺癌の大部分において過剰発現されることが同定され、半定量的RT−PCR実験によって14種のさらなるNSCLC症例のうち9種(7種のADCのうち2種及び7種のSCCの全て)(図5A)並びに23種の肺癌細胞株のうち10種においてその過剰発現が確認されたが、一方で正常気管支上皮に由来するSAEC細胞においては、その発現はほとんど検出不可能であった(図5B)。肺癌細胞における内因性DLX5の細胞内局在化を求めるために、続いてヒトDLX5に特異的なウサギポリクローナル抗体を作出し、SBC−5細胞の核において強く染色され、細胞質において弱く染色されることを見出した(図5C)。DLX5のcDNAをプローブとして用いたノーザンブロット分析により、検査した23種の組織のうち胎盤においてのみ1.8kbの転写産物に対応する強いシグナルを同定した(図5D)。さらに、5種の正常組織(心臓、肝臓、腎臓、肺、及び胎盤)におけるDLX5タンパク質の発現を、抗DLX5ポリクローナル抗体を用いて免疫組織化学的分析により肺癌における発現と比較した。ノーザン分析の結果と一致して、胎盤及び肺癌においてはDLX5の発現が観察されたが、他の4種の正常組織においてはほとんど検出不可能であった(図6A)。
DLX5の臨床病理的意義を確認するために、DLX5タンパク質の発現を、根治性の外科的切除を受けた369人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによりさらに検査した。DLX5発現パターンを欠損/弱(0〜1+にスコア付け)〜強(2+)の範囲で組織アレイ上で分類した(図6B)。ポジティブ染色が、234種中191種(81.6%)のADC腫瘍、95種中80種(84.2%)のSCC腫瘍、27種中24種(88.9%)のLCC腫瘍、及び13種中10種(76.9%)のASC腫瘍で見出された。次にDLX5発現(強陽性対弱陽性/欠損)と様々な臨床病理的パラメータとの相関関係を検査し、pT分類との有意な相関関係が見出された(大きい腫瘍でより高い、P=0.0053、フィッシャーの直接確率検定)(表3A)。
DLX5が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、DLX5に対するsiRNA(si−DLX5−#1及びsi−DLX5−#2)を発現するプラスミド及び2つの対照プラスミド(EGFP及びスクランブルに対するsiRNA)を構築し、肺癌細胞株、SBC−5及びNCI−H1781にトランスフェクトした。si−DLX5−#2をトランスフェクトした細胞におけるmRNAレベルは、これらの2つの対照siRNA又はsi−DLX5−#1のいずれかをトランスフェクトしたものに比べて有意に低下した。コロニー数及びMTTアッセイによって測定された生細胞の数で有意な低下が観察され、このことによりDLX5の上方制御が、癌細胞の成長又は生存に関連することが示唆された(SBC−5の代表的なデータを図6Dに示す)。
癌治療のための分子標的薬物の開発は進歩したが、利用可能な治療に対して良好な応答を示す患者の割合は依然として非常に限定されている(Imai K, et al., Nat Rev Cancer 6:714-27(2006))。このため、有害反応が最小であるか又は全くなく、悪性細胞に対する特異性が高い新規の抗癌剤を開発することが急務である。このために、本発明者らは、以下のように薬物開発に良好な分子標的を同定する戦略を推進している;1)cDNAマイクロアレイ分析に基づく癌細胞における上方制御遺伝子のスクリーニング;2)RNAiシステムを用いた機能喪失表現型の研究及びタンパク質の生物学的機能の規定;並びに3)組織マイクロアレイ上の数百もの臨床試料間のタンパク質発現の系統的分析。このアプローチをとると、遠位欠失ホメオボックスタンパク質ファミリーの成員であるDLX5が臨床肺癌試料及び細胞株の大部分で頻繁に過剰発現されること、及びこの遺伝子産物が肺癌細胞の生存/成長に必要であることが本明細書で実証される。
実施例11 一般的方法
1.細胞株及び組織試料
この試験で使用される23種のヒト肺癌細胞株としては、9種の腺癌(ADC;A427、A549、LC319、PC−3、PC−9、PC−14、NCI−H1373、NCI−H1666及びNCI−H1781)と、9種の扁平上皮癌(SCC;EBC−1、LU61、NCI−H226、NCI−H520、NCI−H647、NCI−H1703、NCI−H2170、RERF−LC−AI、及びSK−MES−1)と、1種の大細胞癌(LCC;LX1)と、4種の小細胞肺癌(SCLC;DMS114、DMS273、SBC−3及びSBC−5)とが挙げられる。全ての細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)を添加した適当な培地中で単層で成長させ、5%CO2で加湿空気雰囲気下で37℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)をCambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した最適化培地(SAGM)中で成長させた。初代の肺癌組織試料は、以前に記載されたように(Kikuchi 2003、Taniwaki 2006)、書面によるインフォームドコンセントにより取得した。238種のADC、95種のSCC、28種のLCC、及び13種のASC、及び隣接正常肺組織を含む、合計で374種の原発性NSCLCのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター(埼玉県、日本)において外科手術を受けた患者から臨床病理的データと共に早期に得た。13種のSCLCを、広島大学(広島県、日本)で剖検を受けた個体から得た。腫瘍検体の組織学的分類は、WHO基準に基づいていた(Travis WD)。NSCLC検体及び死後材料(ADCを有する2個体)由来の5種の組織(心臓、肝臓、肺、腎臓、及び副腎)も広島大学から入手した。この研究及び言及した全ての臨床材料の使用は、個々の倫理審査委員会によって認可されたものであった。
血清試料は、インフォームドコンセントに署名した、対照として102人の健常な個人(84人の男性及び18人の女性、31歳〜60歳の範囲で年齢の中央値が49.0±7.46SD)、及び日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト(BioBank Japan)の一部として登録された又は広島大学病院に入院した、80人の慢性閉塞性肺疾患(COPD)である非腫瘍性肺疾患患者(68人の男性及び12人の女性、54歳〜73歳の範囲で年齢の中央値が66.4±5.92SD)から得た。これらの患者は全て、現在及び/又は以前に喫煙者であった(生涯喫煙量(pack-year index)(PYI)の平均[±1SD]が64.2±41.6であった。PYIは、1日で消費したタバコ箱数[1パック20本]に喫煙年数を乗算した数として規定された)。健常個体は、全血球計算値、C反応性タンパク質(CRP)、赤血球沈降速度、肝機能検査、腎機能検査、尿検査、便検査、胸部X線検査、又は心電図では異常を示さなかった。血清試料は、インフォームドコンセントに署名した、広島大学病院及び神奈川県立がんセンター病院に入院した223人の肺癌患者、並びに日本のオーダーメイド医療実現化プロジェクト(BioBank Japan)の一部として登録された106人の肺癌患者(227人の男性及び102人の女性、30歳〜86歳の範囲で年齢の中央値が66.6±11.2SD)からも得た。以下の基準に基づき、試験のために試料を選択した:(1)患者は、新たに診断され、これまでに治療しておらず、(2)患者の腫瘍を肺癌として病理的に診断した(I期〜IV期)。これらの329症例には、185のADC、51のSCC、及び93のSCLCが含まれていた。臨床病理的記録を完全に文書で行った。診断時に血清を得て、−80℃で保存した。
総RNAを、製造業者のプロトコルに従って、Trizol試薬(Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD)を使用して培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出RNA及び正常なヒト組織のポリA RNAをDNaseI(Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)で処理した後、オリゴ(dT)12−18プライマーとSuperScript II逆転写酵素(Life Technologies, Inc.)とを用いて逆転写した。半定量的RT−PCR実験を、合成NPTX1遺伝子特異的プライマー(5'−GTTGGGGACCGGAGGTAAA−3'及び5'−AAACCACGACTTCGTCAAGC−3')、合成NPTXR遺伝子特異的プライマー(5'−TCTGCCAGATCTTCCCATCT−3'及び5'−GGCTTCAGCTTCCTCATCTG−3')、又は内部対照としてβアクチン(ACTB)特異的プライマー(5'−ATCAAGATCATTGCTCCTCCT−3'及び5'−CTGCGCAAGTTAGGTTTTGT−3')を用いて行った。全てのPCR反応は、GeneAmp PCRシステム9700(Applied Biosystems, Foster City, CA)で、94℃、2分間の初期変性、その後の22サイクル(ACTBでは)又は35サイクル(NPTX1では)の94℃、30秒、54℃又は60℃、30秒、及び72℃、60秒を包含した。
ヒト多重組織ブロット(BD Biosciences, Palo Alto, CA)を、32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。NPTX1のPCR産物を、上記と同じプライマーを用いてRT−PCRによってプローブとして調製した。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実行した。−80℃で1週間、増感スクリーンを用いて、ブロットをオートラジオグラフィーに供した。
NPTX1(BB017)に特異的なウサギポリクローナル抗体(pAb)を、ウサギにGST融合ヒトNPTX1タンパク質(コドン20〜145及び297〜430)で免疫付与することにより産生し、標準プロトコルを用いて精製した。またヒトNPTX1(mAb−75−1)に特異的なマウスモノクローナル抗体(mAb)を、遺伝子銃を用いてヒトNPTX1タンパク質をコードするプラスミドDNAをBALB/cマウス(Chowdhury)の皮内に免疫付与することにより産生した。NPTX1のmAbをアフィニティクロマトグラフィによって細胞培養上清から精製した。NPTX1のmAbが、内因的にNPTX1を発現した又は発現しなかった肺癌細胞株の可溶化物を用いたウエスタンブロット分析によってヒトNPTX1に特異的であることが証明された。
細胞を、Protease Inhibitor Cocktail Set III(Calbiochem, Darmstadt, Germany)を含有するラジオイムノ沈降アッセイバッファー[50mmol/LのTris−HCl(pH8.0)、150mmol/LのNaCl、1%NP40、0.5%デオキシコール酸Na、0.1%SDS]で溶解した。タンパク質試料を、SDS−ポリアクリルアミドゲルによって分離し、Hybond−ECLニトロセルロース膜(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ)上に電気ブロットした。ブロットを、マウスモノクローナル抗NPTX1抗体(mAb−75−1)とインキュベートした。抗原−抗体複合体を西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare Bio-sciences)と結合した二次抗体を用いて検出した。タンパク質バンドを増強化学発光ウエスタンブロット法検出試薬(GE Healthcare Bio-Sciences)によって可視化した。
細胞をカバーガラス(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)上に置き、4%パラホルムアルデヒドで固定し、PBS中の0.1%Triton X−100を用いて室温で3分間透過処理した。非特異的な結合を、室温で10分間、CASBLOCK(ZYMED, South San Francisco, California)でブロッキングした。次に細胞を、室温で60分間、3%BSAを含有するPBS中で希釈したヒトNPTX1抗体(mAb−75−1)に対する一次抗体とインキュベートした。PBSで洗浄した後、細胞を室温で60分間、Alexa Fluor488結合二次抗体(Molecular Probes)で染色した。PBSによるさらなる洗浄の後、各々の検体を、4',6'−ジアミジン−2'−フェニルインドレンジヒドロクロライド(DAPI)を含有するVectashield(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA)に載せ、Spectral Confocal Scanning Systems(TSC SP2 AOBS:Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)で可視化した。
パラフィンブロック中に埋包された臨床試料におけるNPTX1タンパク質の存在を研究するために、切片を以下の様に染色した。要約すると、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後、100mg/mlのマウスモノクローナル抗ヒトNPTX1抗体(mAb−75−1)を添加した。切片を、二次抗体としてHRP標識抗マウスIgGとインキュベートした。基質−色原体を添加し、生検試料をヘマトキシリンで対比染色した。
統計分析をStat View統計プログラム(SaS, Cary, NC)を用いて実行した。臨床病理的変数とNPTX1に対する陽性度との関連性を、フィッシャーの直接確率検定によって比較した。腫瘍特異的な生存率をカプラン・マイヤー法によって評価し、2つの群間の差異をログランク検定で評価した。変数減少法によるCox比例ハザード回帰モデルを用いて予後に関連する危険因子を評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。このモデルから変数を取り除くための基準は尤度比統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた(除去のためのデフォルトP値 0.05)。
独自に構築したELISAシステムでNPTX1の血清レベルを測定した。まず初めに、NPTX1に特異的なマウスモノクローナル抗体(mAb−75−1;4mg/ml)を1ウェル当たり100ml、捕捉抗体として96ウェルマイクロプレート(Nunc Maxisorp Bioscience, Inc., Naperville, IL)に加え、室温で2時間インキュベートした。室温で、PBST(1%ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.05%Tweenを含有するPBS)を用いて、いかなる非結合抗体も洗い流した後、5% BSAを1ウェル当たり200mlウェルに加え、ブロッキングのために室温で2時間インキュベートした。3回の洗浄後、1%BSAを有するPBS中の3倍希釈血清を1ウェル当たり100mlウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。いかなる非結合物質も洗い流した後、Biotin Labeling Kit−NH2(株式会社同仁化学研究所、熊本県、日本)を使用してビオチニル化した、NPTX1に特異的なウサギポリクローナル抗体(BB017;0.01mg/ml)を、検出抗体として1ウェル当たり100mlウェルに加え、室温で2時間インキュベートした。3回洗浄して、いかなる非結合抗体−酵素試薬も取り除いた後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ(SAv−HRP)をウェルに加え、20分間インキュベートした。3回の洗浄後、基質溶液(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN)を1ウェル当たり100mlウェルに加え、30分間反応させた。2Nの硫酸50mlを添加することによって反応を停止させた。着色強度を、450nmの波長、570nmの参照波長で光度計によって求めた。血清中のCEAのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット(HOPE Laboratories, Belmont, CA)を使用してELISAによって測定した。血清中のCYFRAのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット(DRG International Inc USA, Mountainside, NJ)を使用してELISAによって測定した。血清中のProGRPのレベルは、供給業者の推奨に従って、市販の酵素試験キット(株式会社テイエフビー、東京都、日本)を使用してELISAによって測定した。腫瘍群と健常な対照群との間のNPTX1、CEA、CYFRA及びProGRPレベルの差異はマンホイットニーU検定によって分析した。最適な診断精度及び尤度比を有するカットオフレベルを求めるために、NPTX1、CEA、CYFRA及びProGRPのレベルを受信者動作特性(ROC)曲線分析によって評価した。NPTX1とCEAとの間の相関係数をスピアマンの順位相関係数を用いて算出した。有意差は、P<0.05として規定した。
上述のように、哺乳類細胞におけるsiRNAの合成に関するベクターベースのRNA干渉(RNAi)システム、psiH1BX3.0がこれまでに確立されている(Suzuki, 2003)。本明細書中では、siRNA発現ベクター10μgを、30μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いて、NPTX1を過剰発現した、NSCLC細胞株、A549及びSCLC細胞株、SBC−5にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を適当な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で5日間培養し、その後細胞数及び生存率をギムザ染色及び三連MTTアッセイによって測定した。要するに、細胞計測キット8溶液(株式会社同仁化学研究所)を1/10量の濃度で各々のディッシュに添加し、プレートを37℃でさらに2時間インキュベートした。次に吸光度をMicroplate Reader 550(BIO−RAD, Hercules, CA)を用いて450nmで測定した。NPTX1のmRNA発現の抑制を確認するために、半定量的RT−PCR実験を、合成NPTX1特異的なプライマーを用いて行なった。RNAiに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった:対照1(ルシフェラーゼ、LUC:フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子)、5'−CGTACGCGGAATACTTCGA−3';対照2(スクランブル、SCR:5S及び16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ(Euglena gracilis)遺伝子)、5'−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3';NPTX1 siRNA−1(si−NPTX1−1)、5'−CTCGGGCAAACTTTGCAAT−3';NPTX1 siRNA−2(si−NPTX1−2)、5'−GGTGAAGAAGAGCCTGCCA−3'。
NPTX1の全コード配列を、pcDNA3.1myc−Hisプラスミドベクター(Invitrogen, Carlsbad, California)の適当な部位にクローニングした。myc−Hisタグ付きNPTX1を発現するプラスミド又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたCOS−7細胞を、適当な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で10%FCSを含有するDMEM中で8日間成長させた。細胞の生存率をMTTアッセイにより評価した。要するに、細胞計測キット8溶液(株式会社同仁化学研究所)を1/10量の濃度で各々のディッシュに添加し、プレートを37℃でさらに2時間インキュベートした。次に吸光度をMicroplate Reader 550(BIO−RAD, Hercules, CA)を用いて参照として450nmで測定した。
ヒトNPTX1を発現するpcDNA3.1−myc/Hisプラスミド、又はモックプラスミドのいずれかをトランスフェクトしたNIH−3T3細胞を、10%FCSを含有するDMEM中でコンフルエント近くまで成長させた。細胞をトリプシン処理により採取し、血清又はプロテイナーゼ阻害剤を添加せずにDMEM中で洗浄し、1×105細胞/mlの濃度でDMEM中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲルマトリクス(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)の乾燥層を室温で2時間、DMEMを用いて再水和した。10%FCSを含有するDMEM(0.75ml)を、24ウェルマトリゲル浸潤チャンバにおける各々の下部チャンバ(lower chamber)に添加し、0.5ml(5×104細胞)の細胞懸濁液を上部チャンバの各々のインサートに添加した。インサートのプレートを37℃で22時間インキュベートした。インキュベート後、チャンバを処理した;供給業者(Becton Dickinson Labware)の指示通りに、マトリゲルを介して浸潤した細胞を固定し、ギムザ染色した。
治療剤の開発のための新規の標的分子及び/又は肺癌に対する診断上のバイオマーカーを求めるために、初めにcDNAマイクロアレイ(Kikuchi, 2003, 2006, Kakiuchi, 2004, Taniwaki)によって分析された101種の肺癌試料の半分以上において、正常な細胞よりも癌細胞で3倍を超える高い発現レベルを示した遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした27648個の遺伝子の中で、NPTX1の過剰発現が、検査した肺癌の大部分で同定され、15種の内10種のさらなる肺癌組織及び23種の内17種の肺癌細胞株において半定量的RT−PCR実験によってその転写活性化を確認した(図7A、上パネル及び下パネル)。その後ヒトNPTX1に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成し、4つの肺癌細胞株(3つのNPTX1陽性細胞株:NCI−H226、NCI−H520、及びSBC−5対1つのNPTX1陰性細胞株、NCI−H2170)及び末梢気道上皮由来細胞(SAEC)における内因性NPTX1タンパク質の発現として、ウエスタンブロット分析により確認した(図7B)。
NPTX1の生物学的及び臨床病理的な意義を確認するために、NPTX1タンパク質の発現を、374人のNSCLC患者由来の原発性NSCLC組織と、13人の患者由来のSCLC組織とを含有する組織マイクロアレイにより検査した。NPTX1に関する陽性細胞質染色が、手術で切除したNSCLCの56.1%(210/374)及びSCLCの69.2%(9/13)で観察され、検査した正常肺組織のいずれにおいても染色は観察されなかった(図8C)。次にそのポジティブ染色と、374人のNSCLC患者における様々な臨床病理的パラメータとの相関を検査した。組織アレイ上で、NPTX1発現パターンを、欠損(0でスコア付け)から弱/強陽性(1+〜2+とスコア付け)の範囲で分類した(図8D、上パネル、方法を参照されたい)。
NPTX1が分泌タンパク質をコードするので、NPTX1タンパク質が肺癌患者の血清に分泌されたか否かを研究した。ELISA実験によって、329人の肺癌患者由来の血清学的試料の大部分でNPTX1が検出され、肺癌患者におけるNPTX1の血清レベルは、1.36±1.60ng/ml(平均±1SD)であり、健常個体におけるNPTX1の血清レベルは0.59±0.44ng/mlであった(差異は、マンホイットニーU検定ではP値が0.001未満で有意であった;図9A)。肺癌の組織型に従って、NPTX1の血清レベルは、ADC患者で1.41±1.27ng/mlであり、SCC患者で1.09±0.95ng/mlであり、SCLC患者で1.42±2.33ng/mlであり、3つの組織型間の差異は有意なものではなかった。NPTX1の血清レベルは、良性肺疾患のCOPD患者で0.67±0.48ng/mlであった。肺癌患者でのNPTX1の血清レベルは、正常ボランティア及びCOPD患者のものより有意に高かった(P<0.0001)。初期段階の腫瘍を有する患者であっても高レベルの血清NPTX1が検出された。有意には、初期段階疾患(I期〜IIIA期又はLD期)の患者由来の血清よりも局所進行性肺癌(IIIB期)又は遠隔器官転移(IV期又はED期)の患者由来の血清で、さらなるレベルのNPTX1がより一般的であった(図9B)。これらの329人の癌患者及び102人の健常な対照のデータによって作成した受信者動作特性(ROC)曲線を用いて、このアッセイにおけるカットオフレベルは、NPTX1に最適な診断精度と尤度比とを与えるように、即ちNPTX1で1.28ng/ml(NSCLCで41.5%、ADCで44.3%、SCCで29.4%、及びSCLCで31.2%の感度で)及びNSCLCで96.1%の特異度で)に設定された。80人のCOPD患者の中で、7人(8.8%)が陽性NPTX1レベルを有していた。次に同じ患者で血清NPTX1レベルをモニタリングするために、対となる術前及び術後の(手術後2ヶ月の)4人のNSCLC患者由来の血清試料を使用してELISA実験を実施した。原発腫瘍の外科的切除後、血清NPTX1濃度が劇的に低減した(図9C)。本発明者らはさらに、手術前に血清を採取した12人のNSCLC症例(6人のNPTX1陽性の腫瘍を有する患者及び6人のNPTX1陰性の腫瘍を有する患者)の同じ組において、原発性腫瘍で血清NPTX1値をNPTX1の発現レベルと比較した。血清NPTX1のレベルは、原発性腫瘍でNPTX1の発現レベルと良好な相関関係を示した(図9D)。その結果により独立して、初期段階での癌の検出、並びに腫瘍の切除及び疾患の再発のモニタリングのためのバイオマーカーとしての血清NPTX1の高い特異性及び大きな可能性が支持される。
また、診療所において腫瘍検出バイオマーカーとして血清NPTX1レベルの臨床的有用性を評価するために、癌患者及び対照個体由来の同じ組の血清試料において2つの従来の腫瘍マーカー(ADC患者ではCEA、SCC患者ではCYFRA、及びSCLC患者ではproGRP)の血清レベルもELISAによって測定した。ROC分析によって求められるこのアッセイにおけるカットオフレベルは、最適な診断精度及び尤度比をもたらすように、CEAではすなわち2.5ng/ml(ADCでは38.4%の感度で及び98.0%の特異度で)、CYFRAではすなわち2.0ng/ml(SCCでは29.4%の感度で及び98.0%の特異度で)及びproGRPではすなわち、46.0pg/ml(SCLCでは62.4%の感度で及び99.0%の特異度で)に設定された。血清NPTX1とCEA値との間の相関係数は有意ではなかった(スピアマンの順位相関係数:p=0.109、P=0.1474)。
NPTX1の上方制御が肺癌細胞の成長又は生存に関与するか否かを判定するために、2つの異なる対照プラスミド(ルシフェラーゼ(LUC)、及びスクランブル(SCR)に対するsiRNA)と共に、NPTX1に対するsiRNA(si−NPTX1−1、si−NPTX1−2)を発現するようにプラスミドを設計及び構築し、それらをA549細胞及びSBC−5細胞にトランスフェクトし、内因性NPTX1の発現を抑制した。si−NPTX1−2をトランスフェクトした細胞におけるNPTX1の量は、2つの対照siRNAのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて有意に低減した(図10A、上パネル)。si−NPTX1−1は、NPTX1発現に対する抑制効果をほとんど示さなかった。遺伝子発現レベルに対する抑制効果と一致して、トランスフェクトしたsi−NPTX1−2は、コロニー形成アッセイ及びMTTアッセイによって測定されたコロニー数及び細胞生存率の有意な低減をもたらすが、かかる効果は、2つの対照siRNA又はsi−NPTX1−1では観察されなかった(図10A、中央及び下パネル)。
組織マイクロアレイ上での免疫組織化学的分析によって、NPTX1強陽性腫瘍を有するNSCLC患者が、NPTX1弱陽性又はNPTX1陰性腫瘍を有するNSCLC患者よりも短い癌特異的な生存期間を示すことが示唆されたので、NIH−3T3細胞を使用してマトリゲルアッセイを用いて、細胞浸潤におけるNPTX1の考え得る役割を検査した。NPTX1のcDNAのNIH−3T3細胞へのトランスフェクションは、モックベクターをトランスフェクトした細胞に比べて、マトリゲルによるその浸潤活性を有意に高めた(図11)。
本発明はさらに、マウスモデルにおける治療的薬剤としての抗NPTX1抗体のin vivo腫瘍抑制効果を研究した。本発明者らは、A549細胞を7週齢の雌BALB/cヌードマウス(nu/nu)の皮下に移植し、30日間、1週間に2回、300μg/体の親和性精製した抗NPTX1モノクローナル抗体(mAb−75−1)、又は正常マウスIgG(対照)を腫瘍に投与した。抗NPTX1モノクローナル抗体(mAb−75−1)により、A549肺癌の成長が有意に抑制されたが、同じ用量の正常マウスIgGは腫瘍成長に影響を与えなかった(P=0.016、それぞれ両側t検定;図12、上パネル)。切除腫瘍の凍結切片を用いたHE染色により、抗NPTX1抗体で処理した腫瘍組織において生癌細胞の有意な繊維腫変化及び減少が検出された(図12、下パネル)。まとめると、これらの結果により、抗NPTX1モノクローナル抗体(mAb−75−1)がin vitro及びin vivoでの癌細胞に対する成長抑制効果を有することが明らかになった。
既知のNPTX1受容体、NPTXRは、シナプス前ヘビ毒毒素タイポキシンのシナプスへの輸送に関与することが示唆され、これはシナプス残屑の除去に関与する新規のニューロンへの取り込み経路を表し得る(Kirkpatrick LL, et al., J Biol Chem 278:17786-92(2000), Dodds DC, et al., J Biol Chem 272(34):21488-94(1997))。NPTXR遺伝子が、肺癌で発現されたか否か、及び成長促進効果に関与していたか否かを研究するために、本発明者らは、半定量的RT−PCR実験によって肺癌細胞株及び臨床組織におけるNPTXRの発現を分析した。NPTXRは、肺癌試料で比較的高いレベルで発現されたが、正常肺では発現されなかった(図7E)。NPTXRの発現パターンは、これらの腫瘍におけるNPTX1発現との良好な一致を示した。上記のように、NPTX1のオートクリン成長促進効果に関して検査したCOS−7細胞は、半定量的RT−PCR分析及び免疫組織化学分析により、内因的にNPTXRを発現することを確認した(データ図示せず)。このデータによって、NPTX1が肺癌細胞におけるNPTXRとの相互作用によって、その成長促進効果を媒介すると考えられることが示唆された。
NPTX1/NPTXRシグナル伝達の調節に関与する機構を求めるために、本発明者らは、NPTX1及びNPTXRの細胞内分布の共焦点顕微鏡観察によって、NPTX1/NPTXRは、細胞が分泌NPTX1に曝されると内在化し得るか否かを検査した。レシピエントCOS−7細胞又はSBC−5細胞は、培地においてカバースリップ上で37℃で一晩成長させた。また、NPTX1ベクターをトランスフェクトしたドナーCOS−7細胞又はSBC−5細胞の上清を採取した。それから、レシピエントCOS−7細胞又はSBC−5細胞を、ドナー細胞の上清と3時間インキュベートした。本発明者らは、免疫組織化学法によってNPTX1とこれらの細胞の表面との結合を検出した(図14A及び図14B)。また、これらの2つの細胞株の表面上で外因性NPTX1と内因性NPTXRとの共局在化が観察された(データ図示されず)。それから、膜透過条件下で免疫組織化学法を行ない、本発明者らは内在化した外因性NPTX1を検出した(図14A及び図14B)。レシピエントCOS−7細胞のドナーNPTX1トランスフェクト(+)COS−7細胞由来の馴化培地による処理の1時間又は3時間後、内在化したNPTX1が、抗myc抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出された。レシピエントCOS−7細胞は、ドナーNPTX1トランスフェクト(+)COS−7細胞由来の馴化培地において時間に依存的に分泌NPTX1を取り込むと考えられた(図14C)。全ての分析は、実験者の処理条件の知識なしの盲検で実行した。
過去10年で、腫瘍の診断画像化、併用化学療法、最新の手術法及び放射線療法における多くの進歩にもかかわらず、ほとんどの肺癌患者の予後及び生活の質(quality of life)に関して改善はほとんど達成されていない。実際、患者の3分の2が、根治性の外科治療が不可能である進行性段階と診断される。進行性NSCLCに対する新たな化学治療計画の有効性は向上したが、従来の化学療法による進行性NSCLCに対する生存率の中央値は依然として約7ヶ月〜8ヶ月である(Breathnach 2001, Hanna 2004)。
実施例18 一般的方法
1.細胞株及び臨床組織試料
この試験で使用される15種のヒト肺癌細胞株は以下のようであった:15種のNSCLC;LC176、LC319、A549、NCI−H23、NCI−H226、NCI−H552、PC3、PC9、PC14、SK−LU−1、EBC−1、RERF−LC−AI、SK−MES−1、SW900、及びSW1573。全ての細胞を、10%ウシ胎仔血清(FCS)を添加した適当な培地中で単層で成長させ、5%CO2で加湿空気雰囲気下で37℃に維持した。ヒト末梢気道上皮細胞(SAEC)をCambrex Bio Science Inc.(Walkersville, MD)から購入した最適化培地(SAGM)中で成長させた。7種のADC及び7種のSCCを含む原発性NSCLCは、他で記載したように(Kikuchi et al., 2003)取得した。243種のADC、102種のSCC、28種のLCC、及び12種の腺扁平上皮癌(ASC)、及び隣接正常肺組織を含む、合計で385種の原発性NSCLCのホルマリン固定試料は、埼玉県立がんセンター(埼玉県、日本)において根治的外科手術を受ける患者から臨床病理的データと共に早期に得た。NSCLC検体及び死後材料(SCCを有する2個体)由来の5種の組織(心臓、肝臓、肺、腎臓、及び胃)も広島大学から入手した。この研究及び全ての臨床材料の使用は、個々の研究倫理審査委員会によって認可されたものであった。
製造業者のプロトコルに従ってTRIzol試薬(Life Technologies, Inc.)を使用して、総RNAを培養細胞及び臨床組織から抽出した。抽出したRNA及び正常ヒト組織ポリ(A)RNAをDNaseI(株式会社ニッポンジーン)で処理し、オリゴ(dT)20プライマーとSuperScript II逆転写酵素(Invitrogen)とを用いて逆転写した。半定量的RT−PCR実験は、以下の合成した遺伝子特異的なプライマー又は内部対照としてβアクチン(ACTB)特異的プライマーを用いて行なった:
CDKN3、5'−GTGAATTGTTCTCAGTTTCTCGG−3'(配列番号34)及び
5'−TCTCTTGATGATAGATGTGCAGC−3'(配列番号35);
EF−1δ、5'−TGGCTACAAACTTCCTAGCACAT−3'(配列番号36)及び
5'−CTCCACCACACACTGAATCTGTA−3'(配列番号37);
ValRS、5'−TAAGCATCACGCGAGCCGTG−3'(配列番号38)及び
5'−GGATGGAGCAGCAGCGATCAGAA−3'(配列番号39);
EF−1α1、5'−AGACTGGTTAATGATAACAATGC−3'(配列番号40)及び
5'−GGTCTCAAAATTCTGTGACAAAT−3'(配列番号41);
EF−1β、5'−CAGAAGCATTCAAGCAGACG−3'(配列番号42)及び
5'−ATGCCATGATCCAGGATGGA−3'(配列番号43);
EF−1γ、5'−GGTGGACTACGAGTCATACACAT−3'(配列番号44)及び
5'−CAGTTTCCTTTAATGACCCCC−3'(配列番号45);
CDK1、5'−AGCCTAGCATCCCATGTCAA−3'(配列番号46)及び
5'−GAAGACGAAGTACAGCTGAAG−3'(配列番号47);
ACTB、5'−GAGGTGATAGCATTGCTTTCG−3'(配列番号11)及び
5'−CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC−3'(配列番号12)。
ヒト多重組織ブロット(BD Biosciences Clontech)を、CDKN3の32P標識PCR産物とハイブリダイズさせた。供給業者の推奨に従って、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄を実行した。−80℃で7日間、増感スクリーンを用いて、ブロットをオートラジオグラフィーに供した。
細胞を、プロテアーゼ阻害剤(Protease Inhibitor Cocktail Set III;CALBIOCHEM)を含有するRIPAバッファー[50mMのTris−HCl(pH8.0)、150mMのNaCl、1%NP−40、0.5%デオキシコール酸Na、0.1%SDS]で溶解した。タンパク質試料を、SDS−ポリアクリルアミドゲルによって分離し、Hybond−ECLニトロセルロース膜(GE Healthcare Biosciences)上に電気ブロットした。ブロットを、マウスモノクローナル抗CDKN3(KAP)抗体(BD Bioscience Pharmingen)、ウサギポリクローナル抗EF−1δ抗体(NOVUS Biologicals)、マウスモノクローナル抗EF−1α抗体(Upstate)、ウサギポリクローナル抗Akt抗体(Cell Signaling Technology, Inc.)、ウサギポリクローナル抗ホスホAkt(Ser473)抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、マウスモノクローナル抗βアクチン抗体(SIGMA)、マウスモノクローナル抗Flag抗体(SIGMA)、ウサギポリクローナル抗c−Myc抗体(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)又はラットモノクローナル抗HA抗体(Roche Diagnostics Corporation)とインキュベートした。抗原−抗体複合体を西洋ワサビペルオキシダーゼ(GE Healthcare Bio-sciences)と結合した二次抗体を用いて検出した。以前に記載されたように(Kato et al., 2005;Suzuki et al., 2005)、タンパク質バンドをECLウエスタンブロット法検出試薬(GE Healthcare Bio-sciences)によって可視化した。マウスモノクローナル抗CDKN3(KAP)抗体(BD Bioscience Pharmingen)及びウサギポリクローナル抗EF−1δ抗体(NOVUS Biologicals)は、内因性タンパク質のいずれかを発現した又は発現しないNSCLC細胞可溶化物を用いて、ウエスタンブロット分析によって個々にヒトCDKN3及びEF−1δに特異的であることが証明された(図19Aを参照されたい)。
臨床試料におけるCDKN3又はEF−1δタンパク質の存在を研究するために、切片をENVISION+キット/西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(DakoCytomation)を用いて染色した。要するに、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後に、抗CDKN3抗体(BD Bioscience Pharmingen)又は抗EF−1δ抗体(NOVUS Biologicals)を添加し、切片を二次抗体としてHRPで標識した抗マウスIgG又はウサギIgGとインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。
分割表を用いて、年齢、性別、腫瘍サイズ(pT)及びリンパ節転移(pN)等の臨床病理的変数と、CDKN3及び/又はEF−1δの陽性度との関連を組織マイクロアレイ分析によって求めた。腫瘍特異的な生存曲線を、手術日からNSCLCに関連する死の時点又は最後の追跡調査観察まで算出した。カプラン・マイヤー曲線をそれぞれの関連変数及びCDKN3及び/又はEF−1δの発現に関して算出し、患者亜群間の生存時間の違いを、ログランク検定を用いて分析した。予後に関連する危険因子を、変数減少法によるCox比例ハザード回帰モデルを用いて評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。変数を除去する基準は尤度統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた(モデルからの除去のためのデフォルトP値 0.05)。
上述のように、哺乳類細胞におけるsiRNAの合成に関するベクターベースのRNA干渉(RNAi)システム、psiH1BX3.0がこれまでに確立されている(Suzuki, C., Cancer Res. 63:7038-7041(2003))。10μgのsiRNA発現ベクターを、30μLのLipofectamine 2000(Invitrogen)を用いてNSCLC細胞株にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を適当な濃度のジェネテシン(G418)の存在下で5日間培養し、その後細胞数及び生存率をギムザ染色及び三連MTTアッセイによって測定した。RNAiに対する合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りであった:
対照1(EGFP:遺伝子、オワンクラゲGFPの突然変異体)、
5'−GAAGCAGCACGACTTCTTC−3'(配列番号23);
対照2(ルシフェラーゼ:フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子)、
5'−CGTACGCGGAATACTTCGA−3'(配列番号15);
対照3(スクランブル:5S及び16S rRNAをコードする葉緑体ミドリムシ遺伝子)、
5'−GCGCGCTTTGTAGGATTCG−3'(配列番号16);
siRNA−CDKN3−A(si−A)、5'−TATAGAGTCCCAAACCTTC−3'(配列番号49);
siRNA−CDKN3−B(si−B)、5'−TACACTGCTATGGAGGACT−3'(配列番号50);
siRNA−EF−1δ−1(si−1)、5'−GTGGAGAACCAGAGTCTGC−3'(配列番号51);
siRNA−EF−1δ−2(si−2)、5'−CATCCAGAAATCCCTGGCT−3'(配列番号52)。
臨床試料におけるCDKN3又はEF−1δタンパク質の存在を研究するために、切片をENVISION+キット/西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)(DakoCytomation)を用いて染色した。要するに、内因性ペルオキシダーゼ及びタンパク質をブロッキングした後に、抗CDKN3抗体(BD Bioscience Pharmingen)又は抗EF−1δ抗体(NOVUS Biologicals)を添加し、切片を二次抗体としてHRPで標識した抗マウスIgG又はウサギIgGとインキュベートした。基質−色原体を添加し、検体をヘマトキシリンで対比染色した。
分割表を用いて、年齢、性別、腫瘍サイズ(pT)及びリンパ節転移(pN)等の臨床病理的変数と、組織マイクロアレイ分析によって求められるCDKN3及び/又はEF−1δの陽性度とを関連付ける試みがなされた。腫瘍特異的な生存曲線を、手術日からNSCLCに関連する死の時点又は最後の追跡調査観察まで算出した。カプラン・マイヤー曲線をそれぞれの関連変数及びCDKN3及び/又はEF−1δの発現に関して算出し、患者亜群間の生存時間の違いを、ログランク検定を用いて分析した。予後に関連する危険因子を、変数減少法によるCox比例ハザード回帰モデルを用いて評価した。比例ハザード仮定を確認し、これを満たし、単変量分析において統計的に有意な結果を有する変数のみを多変量分析に含めた。変数を除去する基準は尤度統計値であり、これは最尤部分推定値に基づいていた(モデルからの除去のためのデフォルトP値 0.05)。
製造業者の取扱説明書に従ってFuGENE6トランスフェクション試薬(Roche Diagnostics)を用いて、NIH−3T3細胞にCDKN3を発現するプラスミド又はモックプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を採取し、FCSなしでDMEM中に懸濁した。細胞懸濁液を調製する前に、マトリゲル基質(Becton Dickinson Labware)の乾燥層を室温で2時間DMEMによって再水和した。それから、10% FCSを含有するDMEMを24ウェルマトリゲル浸潤チャンバのそれぞれの下部チャンバに加え、細胞懸濁液を上部チャンバのそれぞれの挿入部(inserts)に加えた。挿入部のプレートを37℃で22時間インキュベートした。インキュベート後、マトリゲルでコーティングした挿入部を通って侵入する細胞を固定し、ギムザで染色した。
CDKN3の考え得る結合部位を含有したEF−1δタンパク質の一部に対応する19アミノ酸ペプチド配列は、そのNH2末端で膜伝達11ポリアルギニン配列と共有結合した(11R;Futaki et al., Hayama et al., 2006, 2007を参照されたい)。5種の細胞透過性ペプチドが合成された:11R−EF−1δ73−91、RRRRRRRRRRR−GGG−TSGDHGELVVRIASLEVEN;11R−EF−1δ90−108、RRRRRRRRRRR−GGG−ENQSLRGVVQELQQAISKL;11R−EF−1δ108−126、RRRRRRRRRRR−GGG−LEARLNVLEKSSPGHRATA;11R−EF−1δ125−143、RRRRRRRRRRR−GGG−TAPQTQHVSPMRQVEPPAK;11R−EF−1δ142−160、RRRRRRRRRRR−GGG−AKKPATPAEDDEDDDIDLF。ペプチドを調製逆相高圧液体クロマトグラフィで精製した。LC319細胞を、5日間、2.5μM、5.0μM及び7.5μMの濃度で11Rペプチドとインキュベートした。培地を適当な濃度の各々のペプチドで48時間毎に交換し、処理後5日目に、細胞の生存率をMTTアッセイにより評価した。
肺癌細胞株LC319由来の細胞抽出物を、プロテアーゼ阻害剤の存在下で最終容量2mlの免疫沈降バッファー[0.5% NP−40、50mMのTris−HCl、150mMのNaCl]中で4℃で1時間、100μLのプロテインG−アガロースビーズとのインキュベーションによって予め精製した。1000rpmで4℃で5分間の遠心分離の後、上清を4℃で2時間、抗CDKN3モノクローナル抗体又は正常マウスIgGとインキュベートした。それから5000rpmで2分間の遠心分離によって、ビーズを回収し、それぞれ1mLの免疫沈降バッファーで6回洗浄した。洗浄したビーズを50μLのLaemmli試料バッファー中で再懸濁し、5分間煮沸して、タンパク質を5%〜10%のSDS PAGEゲル(BIO RAD)で分離した。電気泳動後、ゲルを銀で染色した。抗CDKN3モノクローナル抗体で免疫沈降した抽出物で特異的に見出されたタンパク質バンドを切り出し、かつマトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量スペクトル(MALDI−TOF−MS)分析法(AXIMA−CFRプラス、株式会社島津製作所)に利用した。
ホスファターゼ処理のために、細胞抽出物をホスファターゼバッファー中のλ−ホスファターゼ(New England Biolabs)又はバッファー単独と37℃で1時間インキュベートした後、免疫ブロット法に使用した。
治療剤及び/又は診断上のバイオマーカーの開発のための新規の標的分子を検索するために、初めにcDNAマイクロアレイにより分析した101種の肺癌の50%より多くで3倍を超える発現を示す遺伝子をスクリーニングした。スクリーニングした27648個の遺伝子の中で、サイクリン依存性キナーゼ抑制因子3(CDKN3)をコードする遺伝子が、肺癌で頻繁に過剰発現され、CDKN3発現の増大が14件中12件のさらなるNSCLC症例(7件中6件の腺癌(ADC)及び7件中6件の扁平上皮癌(SCC))で確認されたことが同定された(図16A)。興味深いことに、初期段階の原発性肺腫瘍のものと比べて、CDKN3のより高い発現パターンが、脳転移及び進行性原発性肺腫瘍(腺癌、ADC)で観察された(図16B)。プローブとしてのCDKN3のcDNAによるノーザンブロット法により、23種の検査した正常ヒト組織の中において睾丸で0.9kb転写産物に対応する強い強いシグナルが同定され、胸腺、結腸、胃及び骨髄で非常に弱いシグナルが同定された(図16C)。また、CDKN3タンパク質の発現を6つの正常組織(心臓、肝臓、腎臓、肺、結腸及び睾丸)で抗CDKN3抗体によって検査し、CDKN3が睾丸(主に一次***細胞の細胞質)及び肺癌で豊富に発現されたが、その発現は、残りの5つの正常組織ではほとんど検出することができなかったことを見出した(図17A)。
CDKN3の生物学的及び臨床病理的意義を確認するために、臨床NSCLCにおけるCDKN3タンパク質発現を、385人の患者由来のNSCLC組織及び15人の患者由来のSCLC組織を含有する組織マイクロアレイにより検査した。CDKN3に対するポジティブ染色(細胞質及び核)が、手術で切除したNSCLCの65.7%(253/385)及びSCLCの80.0%(12/15)で観察されたが、検査した正常肺組織のいずれでも染色は観察されなかった(図17B)。それから、ポジティブ染色と様々な臨床病理的パラメータとの間の相関関係を385人のNSCLC患者で検査した。SCLCの試料サイズはさらに評価するには小さすぎた。性別(男性でより高い、P=0.0054、フィッシャーの直接確率検定)、組織学的分類(非ADCでより高い、P<0.0001、フィッシャーの直接確率検定)、及びpN段階(N1、N2でより高い、P=0.0057、フィッシャーの直接確率検定)が有意にCDKN3陽性度に関連していた(表4A)。腫瘍がCDKN3のポジティブ染色を示したNSCLC患者は、CDKN3発現が欠損したものと比べて腫瘍特異的な生存期間が短いことを明らかにした(P<0.0001、ログランク検定)(図17C)。単変量分析によって、高齢(65歳以上)、男性、非ADC組織学的分類、進行性pT段階、進行性pN段階及びCDKN3陽性度は全て、NSCLC患者では腫瘍特異的な生存率が低いことと有意に関連していた(表4B)。予後因子の多変量分析では、高齢、進行性pT段階、進行性pN段階及びCDKN3陽性度が独立した予後因子であることを示していた(表4B)。
発癌におけるCDKN3の機能を解明するために、肺癌細胞においてCDKN3と相互作用するタンパク質を求めた。LC319細胞由来の細胞抽出物を抗CDKN3モノクローナル抗体又はマウスIgG(陰性対照)で免疫沈降させた。SDS−PAGEによる分離の後に、タンパク質複合体を銀染色した。抗CDKN3抗体による免疫沈降体で見られたが、マウスIgGによる免疫沈降体では見られなかった、140kDa、50kDa、31kDa及び25kDaのタンパク質バンドを、切り出し、トリプシン消化して、質量分析にかけた。140kDa、50kDa、31kDa及び25kDaバンド由来のペプチドがそれぞれ、バリル−tRNAシンテターゼ(バリル−tRNAシンテターゼ、ValRS;140kDa)、真核性翻訳延長因子1γ(EF−1γ;50kDa)、真核性翻訳延長因子1δ(EF−1δ;31kDa)、真核性翻訳延長因子1β(EF−1β;25kDa)の配列に一致した(図18A)。
EF−1δの臨床病理的意義を明らかにするために、385人の患者由来の肺癌組織を含有する組織マイクロアレイによって、臨床NSCLCにおいてEF−1δタンパク質発現を検査した。EF−1δに対するポジティブ染色(細胞質及び核)が手術で切除したNSCLCの67.5%で観察された(260/385)(図19B)。EF−1δに対する染色は、検査した正常肺組織のいずれでもほとんど観察されなかった。CDKN3タンパク質の発現は、これらの腫瘍においてEF−1δ発現と有意に一致していた(P<0.0001、フィッシャーの直接確率検定)。NSCLCにおけるEF−1δのポジティブ染色は、性別(男性でより高い;P=0.0004、フィッシャーの直接確率検定)、組織型(非ADCでより高い;P<0.0001、フィッシャーの直接確率検定)、及び進行性pN段階(N1、N2でより高い;P=0.0141、フィッシャーの直接確率検定)及び5年生存率(P=0.0006、ログランク検定)に有意に関連していた(図19C;表5A)。予後因子の多変量分析では、年齢、pT段階、pN段階及びEF−1δ陽性度が独立した予後因子であることを示していた(表5B)。
ウエスタンブロット分析により、肺癌細胞で2つの異なるサイズのEF−1δタンパク質が検出された一方で(図20A)、報告によるとEF−1δはin vitroでそのセリン残基及びスレオニン残基でリン酸化された(Minella O, et al., Biosci Rep. 3:119-27(1998))。in vivoでEF−1δリン酸化反応の可能性を検査するために、本発明者らは、タンパク質ホスファターゼの存在又は非存在下でFlag−HAタグ付きEF−1δを過剰発現したCOS−7細胞由来の抽出物をインキュベートし、ウエスタンブロット分析によってEF−1δタンパク質の分子量を分析した。ホスファターゼで処理した抽出物中の大部分のEF−1δタンパク質の測定量は、非処理細胞のものより少なかった(図20C、左パネル)。一方、Flag−HAタグ付きEF−1βタンパク質及びFlag−HAタグ付きEF−1γタンパク質の分子量は、ホスファターゼで処理後も変化しなかった(図20C、中央の右パネル)。
その後、これら2つのタンパク質と、肺癌に対する治療標的としてのその潜在性との関連性の生物学的重要性を研究した。CDKN3との相互作用に必要とされるEF−1δにおけるドメインを求めるために、そのN末端及びC末端にFLAG−HA配列を有するEF−1δの各々の構築物をLC319細胞にトランスフェクトした(EF−1δ72〜160、EF−1δ161〜281、EF−1δ1〜160、EF−1δ72〜281、及び全長EF−1δ1〜281;図21B)。モノクローナル抗Flag抗体による免疫沈降により、EF−1δ72〜160、EF−1δ1〜160、EF−1δ72〜281及びEF−1δ1〜281がCDKN3と相互作用することが可能であったが、EF−1δ161〜281は可能ではなかったことが示された(図21B)。これらの実験により、EF−1δにロイシンジッパーモチーフを含有する89アミノ酸ポリペプチド(コドン72〜160;配列番号48)がCDKN3との相互作用に重要な役割を果たすことが示唆された。
CDKN3が肺癌細胞の成長又は生存に不可欠であるか否かを判定するために、CDKN3に対するsiRNA(si−A及びsi−B)を発現するプラスミド、及び3つの異なる対照プラスミド(EGFP、ルシフェラーゼ(LUC)又はスクランブル(SCR)に対するsiRNA)を設計及び構築し、それらをLC319細胞(図22A)及びA549細胞(データ図示せず)にトランスフェクトした。si−Aをトランスフェクトした細胞でのCDKN3転写産物の量は、3つの対照siRNAのいずれかをトランスフェクトした細胞に比べて最も有意に低下し、si−BはCDKN3発現に対して抑制効果をほとんど示さなかった(図22A:上部左パネル)。遺伝子発現に対するその抑制効果と一致して、トランスフェクトしたsi−Aにより、MTT及びコロニー形成アッセイによって測定された細胞生存率及びコロニー数の減少が起こったが、かかる効果は3つの対照又はsi−Bでは観察されなかった(図22A:上部右及び下パネル)。
組織マイクロアレイ上の免疫組織化学的分析により、CDKN3強陽性腫瘍を有する肺癌患者が、腫瘍がCDKN3に対して陰性であった患者よりも短い癌特異的な生存期間を示したことが示されたので(図19B及び図19C)、CDKN3が細胞浸潤能に関与し得るか否かを求めるのに、マトリゲル浸潤アッセイを実行した。マトリゲルによるCDKN3発現ベクターをトランスフェクトしたNIH−3T3細胞の浸潤は、モックベクターをトランスフェクトした対照細胞に比べて有意に高まり(図19C)、これによりCDKN3がまた、悪性の高い表現型の肺癌細胞に寄与し得ることが示唆された。一方、EF−1β、γ、δ、及びValRSと関連することが知られたEF−1αは、複数の機能に関与するとされる。
それから、肺癌細胞の成長又は生存に対するCDKN3とEF−1δとの間の相互作用の機能的意義を研究するために、これらの2つのタンパク質の結合を阻害することが期待される生体活性細胞透過性ペプチドが、開発された。次に、EF−1δのコドン73〜160に含まれた19アミノ酸配列の5つの異なるペプチドを合成した(図24A)。これらのペプチドをNH2末端で11個のアルギニン残基(11R)を伝達する膜に共有結合させた。5つの11R−EF−1δペプチドの、LC319細胞の培養培地への添加による成長に対する効果を評価し、ここで11R−EF−1δ90−108ペプチドによる処理が、MTTアッセイによって測定されるように細胞生存率を有意に低下させた(図24B、上パネル)。11R−EF−1δ90−108の、LC319細胞の培養培地への添加が、免疫沈降実験による内因性CDKN3とEF−1δとの間の複合体形成を低減した(図24B、下パネル)。これらのデータにより、11R−EF−1δ90−108がCDKN3とEF−1δとの間の相互作用を特異的に阻害することができることが示された。
癌治療に対する新規の分子標的の同定及び特性化における最近の加速によって、かなりの関心と共に新たな種類の抗癌剤の開発に焦点が当てられている(Kelly, K., et al., J. Clin. Oncol. 19 :3210-3218(2001))。今までのところ、多くの標的化療法が肺癌で研究中であるが、応答性のある腫瘍型の範囲及び治療の有効性は依然として非常に限定される。分子標的化薬物は、作用機構が明確であるため、最小の有害作用で悪性細胞に対する特異性が高いことが期待される。この目的へのアプローチとして有望な戦略は、癌細胞で過剰発現する遺伝子を効果的に同定するために全ゲノム発現分析の力を利用することである。また、組織マイクロアレイを、RNAi技法による機能喪失効果のハイスループットスクリーニングと組み合わせて、潜在的な標的タンパク質のバリデーションのために数百ものアーカイブ臨床試料を分析するのに使用した。このアプローチを用いて、本明細書でCDKN3が臨床肺癌試料及び肺癌細胞株で頻繁に過剰発現され、遺伝子産物が肺癌細胞の成長及び進行において欠かすことのできない役割を果たすことが示される。
本明細書中で実証されるように、細胞成長は、EBI3、CDKN3及び/又はEF−1δ遺伝子を特異的に標的とする二本鎖分子によって抑制される。したがって、これらの新規の二本鎖分子は、抗癌薬の開発に有用な候補物質である。例えば、EBI3、DLX5、NPTX1、CDKN3及び/又はEF−1δタンパク質の発現を阻止する及び/又はその活性を抑える薬剤は、抗癌剤、特に肺癌の治療、より具体的にはNSCLC及びSCLCの治療用の抗癌剤としての治療上の有用性を見出し得る。
Claims (69)
- 細胞に導入した場合にEBI3、CDKN3、EF−1δ、又はNPTXRのin vivo発現、及び細胞増殖を阻害する単離二本鎖分子であって、互いにハイブリダイズすることで該二本鎖分子を形成するセンス鎖とそれに相補的なアンチセンス鎖とを含む、二本鎖分子。
- 前記センス鎖が配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含む、請求項1に記載の二本鎖分子。
- 前記二本鎖分子が、約19ヌクレオチド長〜約25ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである、請求項2に記載の二本鎖分子。
- 介在一本鎖によって連結したセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドから成る、請求項1に記載の二本鎖分子。
- 一般式:
5'−[A]−[B]−[A']−3'
を有する二本鎖分子であって、式中、[A]は配列番号18、配列番号20、配列番号49、配列番号51、配列番号84、及び配列番号85から成る群から選択される標的配列に対応する配列を含むセンス鎖であり、[B]は3個〜23個のヌクレオチドから成る介在一本鎖であり、かつ[A']は[A]に相補的な配列を含むアンチセンス鎖である、請求項4に記載の二本鎖分子。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の二本鎖分子を発現するベクター。
- EBI3、CDKN3、EF−1δ又はNPTXR遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する癌を治療する方法であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離二本鎖分子、又は請求項6に記載のベクターの少なくとも1つを投与する工程を含む方法。
- 治療される前記癌が肺癌である、請求項7に記載の方法。
- EBI3、CDKN3、EF−1δ又はNPTXR遺伝子から成る群から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する癌を治療するための組成物であって、請求項1〜4のいずれか1項に記載の単離二本鎖分子又は請求項6に記載のベクターの少なくとも1つを含む、組成物。
- 治療される前記癌が肺癌である、請求項9に記載の組成物。
- 肺癌を診断する方法であって、
(a)被験体から得た生体試料において、
(i)EBI3、DLX5、及びCDKN3の群から選択されるmRNAを検出すること、
(ii)EBI3、DLX5、及びCDKN3の群から選択されるタンパク質を検出すること、及び
(iii)EBI3、DLX5、及びCDKN3の群から選択されるタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか1つによって、遺伝子の発現レベルを求める工程、並びに
(b)前記遺伝子の正常対照レベルと比較した場合の、工程(a)において求められる前記発現レベルの上昇を、肺癌の存在と関連付ける工程
を含む、方法。 - 工程(a)において求められる前記発現レベルが、前記正常対照レベルより少なくとも10%高い、請求項11に記載の方法。
- 工程(a)において求められる前記発現レベルをEBI3、DLX5、及びCDKN3の群から選択されるタンパク質に対する抗体の結合を検出することにより求める、請求項11に記載の方法。
- 前記被験体から得た生体試料が生検材料、痰、血液、胸水、又は尿を含む、請求項11に記載の方法。
- 肺癌患者の予後を判定又は決定する方法であって、
(a)患者から得た生体試料において遺伝子の発現レベルを検出する工程、
(b)検出される前記発現レベルを対照レベルと比較する工程、及び
(c)工程(b)の比較に基づいて前記患者の予後を決定する工程
を含み、前記遺伝子がEBI3、DLX5、CDKN3、又はEF−1δから成る群から選択される、方法。 - 前記対照レベルが予後良好な対照レベルであり、該対照レベルと比較した場合の前記発現レベルの上昇が、予後不良であると決定される、請求項15に記載の方法。
- 前記上昇が前記対照レベルより少なくとも10%高い、請求項15に記載の方法。
- 前記発現レベルが、
(a)EBI3、DLX5、CDKN3、又はEF−1δのmRNAを検出すること、
(b)EBI3、DLX5、CDKN3又はEF−1δタンパク質を検出すること、及び
(c)EBI3、DLX5、CDKN3又はEF−1δタンパク質の生物活性を検出すること
から成る群から選択される方法のいずれか1つによって求められる、請求項15に記載の方法。 - 前記患者から得た生体試料が生検材料、痰、又は血液、胸水、又は尿を含む、請求項15に記載の方法。
- 肺癌を診断するか、又は肺癌患者の予後を判定若しくは決定するためのキットであって、
(a)遺伝子のmRNAを検出するための試薬、
(b)前記遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するための試薬、及び
(c)前記タンパク質の生物活性を検出するための試薬
から成る群から選択される試薬を含み、前記遺伝子がEBI3、DLX5、CDKN3、又はEF−1δから成る群から選択される、キット。 - 前記試薬が前記遺伝子の遺伝子転写産物に対するプローブである、請求項20に記載のキット。
- 前記試薬が前記遺伝子によりコードされる前記タンパク質に対する抗体である、請求項20に記載のキット。
- 被験体において肺癌を診断する方法であって、
(a)診断される被験体に由来する血液試料を準備する工程、
(b)前記血液試料におけるEBI3タンパク質のレベルを求める工程、及び
(c)工程(b)において求められる前記EBI3レベルを正常対照のEBI3レベルと比較する工程
を含み、前記血液試料におけるEBI3レベルが前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、方法。 - 前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記EBI3タンパク質をイムノアッセイにより検出する、請求項23に記載の方法。
- 前記イムノアッセイがELISAである、請求項25に記載の方法。
- (d)前記血液試料におけるCEAのレベルを求める工程、及び
(e)工程(d)において求められる前記CEAレベルを正常対照のCEAレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるEBI3レベル及びCEAレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項23に記載の方法。 - 前記肺癌がNSCLCである、請求項27に記載の方法。
- (d)前記血液試料におけるCYFRAのレベルを求める工程、
(e)工程(e)において求められる前記CYFRAレベルを正常対照のCYFRAレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるEBI3レベル及びCYFRAレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項23に記載の方法。 - 前記肺癌がSCCである、請求項29に記載の方法。
- (d)前記血液試料におけるpro−GRPのレベルを求める工程、
(e)工程(e)において求められる前記pro−GRPレベルを正常対照のpro−GRPレベルと比較する工程
をさらに含み、前記血液試料におけるEBI3レベル及びpro−GRPレベルのいずれか又は両方が前記正常対照と比較して高いことにより、前記被験体が肺癌を患っていることが示唆される、請求項23に記載の方法。 - 前記肺癌がSCLCである、請求項31に記載の方法。
- EBI3を発現する癌を検出するためのキットであって、
(i)血液試料におけるEBI3のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(ii)EBI3に対する陽性対照試料
を含む、キット。 - (iii)血液試料におけるCEA、CYFRA、及び/又はpro−GRPのレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(iv)CEA、CYFRA、及び/又はpro−GRPに対する陽性対照試料をさらに含む、請求項33に記載のキット。 - 前記陽性対照試料がEBI3、CEA、CYFRA、及び/又はpro−GRPに対して陽性である、請求項34に記載のキット。
- 被験体における肺癌を診断する方法であって、
(a)診断を受ける被験体から血液試料を採取する工程、
(b)前記血液試料におけるNPTX1及びCYFRAのレベルを求める工程、
(c)工程(b)において求められる前記NPTX1レベル及び前記CYFRAレベルを、正常対照のNPTX1レベル及びCYFRAレベルと比較する工程、及び
(d)前記血液試料において、前記正常対照と比較して高いNPTX1レベル及び高いCYFRAレベルのいずれか又は両方が、前記被験体が肺癌を患っていることを示唆すると判断する工程
を含む、方法。 - 前記肺癌が扁平上皮癌(SCC)である、請求項36に記載の方法。
- 前記血液試料が全血、血清、及び血漿から成る群から選択される、請求項36に記載の方法。
- NPTX1及びCYFRAタンパク質を発現する癌を検出するためのキットであって、
(i)血液試料におけるNPTX1及びCYFRAタンパク質のレベルを求めるためのイムノアッセイ試薬、及び
(ii)NPTX1及びCYFRAタンパク質に対する陽性対照試料
を含む、キット。 - 肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験化合物をEBI3、DLX5、又はCDKN3のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
(b)前記ポリペプチドと前記試験化合物との結合活性を検出する工程、及び
(c)前記ポリペプチドに結合する化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験化合物をEBI3、DLX5、又はCDKN3のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと接触させる工程、
(b)工程(a)の前記ポリペプチドの生物活性を検出する工程、及び
(c)EBI3、DLX5、又はCDKN3の前記ポリヌクレオチドによりコードされる前記ポリペプチドの生物活性を、前記試験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して抑制する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 前記生物活性が細胞増殖、細胞浸潤、細胞外分泌、ホスファターゼ活性、及びAktリン酸化の促進の群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記ホスファターゼ活性がEF−1δを用いて検出されたものである、請求項42に記載の方法。
- 肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)候補化合物をEBI3、DLX5、又はCDKN3を発現する細胞と接触させる工程、及び
(b)前記試験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、EBI3、DLX5、又はCDKN3の発現レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)候補化合物をEBI3、DLX5、又はCDKN3の転写調節領域、及び該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる工程、
(b)前記レポーター遺伝子の発現又は活性を測定する工程、及び
(c)対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現又は活性レベルを低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 肺癌を治療若しくは予防するか、又は肺癌細胞の成長を阻害するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験化合物の存在下で、CDKN3ポリペプチド又はその機能的等価物を、VRSポリペプチド、EF−1αポリペプチド、EF−1βポリペプチド、EF−1γポリペプチド、EF−1δポリペプチド、及びそれらの機能的等価物から成る群から選択される相互作用パートナーと接触させる工程、
(b)前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
(c)これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 前記EF−1δポリペプチドの機能的等価物が、配列番号48から成るポリペプチドを含む、請求項46に記載の方法。
- 前記CDKN3ポリペプチドの機能的等価物がVRSポリペプチド、EF−1αポリペプチド、EF−1βポリペプチド、EF−1γポリペプチド、又はEF−1δ結合ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項46に記載の方法。
- 肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)候補化合物をCDKN3を過剰発現する細胞と接触させる工程、
(b)Akt Ser473のリン酸化を測定する工程、及び
(c)対照と比較して、前記リン酸化を低下させる候補化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 肺癌を治療又は予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験化合物の存在下で、NPTX1ポリペプチド又はその機能的等価物を、NPTXRポリペプチド又はその機能的等価物と接触させる工程、
(b)前記ポリペプチド間の結合を検出する工程、及び
(c)これらのポリペプチド間の結合を阻害する試験化合物を選択する工程
を含む、方法。 - 前記NPTX1ポリペプチドの機能的等価物がNPTXR結合ドメインを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記NPTXRポリペプチドの機能的等価物がNPTX1結合ドメインを含む、請求項50に記載の方法。
- 配列番号88又は配列番号89を含むポリペプチドに結合する抗体。
- NPTX1中和活性を有する、請求項53に記載の抗体。
- 肺癌を治療又は予防するための組成物であって、薬学的に有効な量の抗NPTX1抗体又はその断片を含む、組成物。
- 前記NPTX1抗体が請求項53及び54に記載の抗体である、請求項55に記載の組成物。
- 被験体において肺癌を治療又は予防する方法であって、該被験体に抗NPTX1抗体又はその断片を投与することを含む、方法。
- 前記NPTX1抗体が請求項53及び54に記載の抗体である、請求項57に記載の方法。
- ENQSLRGVVQELQQAISKL(配列番号61)を含むポリペプチド又は該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列であって、配列番号8から成るペプチドの生物学的機能を欠く、ポリペプチド。
- 前記生物学的機能が細胞増殖活性である、請求項59に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが8個〜30個の残基から成る、請求項59に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが細胞膜透過性物質で修飾される、請求項59に記載のポリペプチド。
- 一般式:
[R]−[D]
を有し、配列番号8から成るペプチドの生物学的機能を欠くポリペプチドであって、式中、[R]及び[D]はリンカーGGGを介して直接的又は間接的に連結してもよく、[R]は細胞膜透過性物質を表し、[D]はENQSLRGVVQELQQAISKL(配列番号61)を含む断片配列のアミノ酸配列、又は該断片配列を含む該ポリペプチドに機能的に等価なポリペプチドのアミノ酸配列を表す、請求項59に記載のポリペプチド。 - 前記細胞膜透過性物質が:
ポリアルギニン、
Tat/RKKRRQRRR/配列番号63、
ペネトラチン/RQIKIWFQNRRMKWKK/配列番号64、
ブホリンII/TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK/配列番号65、
トランスポータン/GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL/配列番号66、
MAP(モデル両親媒性ペプチド)/KLALKLALKALKAALKLA/配列番号67、
K−FGF/AAVALLPAVLLALLAP/配列番号68、
Ku70/VPMLK/配列番号69、
Ku70/PMLKE/配列番号70、
プリオン/MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP/配列番号71、
pVEC/LLIILRRRIRKQAHAHSK/配列番号72、
Pep−1/KETWWETWWTEWSQPKKKRKV/配列番号73、
SynB1/RGGRLSYSRRRFSTSTGR/配列番号74、
Pep−7/SDLWEMMMVSLACQY/配列番号75、及び
HN−1/TSPLNIHNGQKL/配列番号76
から成る群から選択されるいずれか1つである、請求項63に記載のポリペプチド。 - 前記ポリアルギニンが11個のArg(RRRRRRRRRRR/配列番号77)である、請求項64に記載のポリペプチド。
- 活性成分として請求項59〜65のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、癌の治療及び予防のいずれか又は両方のための薬剤。
- 前記癌が肺癌である、請求項66に記載の薬剤。
- 請求項59〜65のいずれか一項に記載のポリペプチドを投与する工程を含む、癌を治療又は予防する方法。
- 前記癌が肺癌である、請求項68に記載の方法。
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