KR20050053598A

KR20050053598A - 티아쿠미신 제조법

Info

Publication number: KR20050053598A
Application number: KR1020057001613A
Authority: KR
Inventors: 유이-공 슈에; 치-젠 프랑크 듀; 밍-히즈 치오우; 메이-치아오 위; 유안-팅 천; 프랭클린 더블유. 오크무; 조나단 제임스 듀필드
Original assignee: 옵티머 파마슈티칼즈, 인코포레이티드
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2003-07-15
Publication date: 2005-06-08
Also published as: JP2005534332A; WO2004014295A2; US20060257981A1; EP2860241A1; EP1539977A4; AU2003251902A1; CA2494742C; EP1539977A2; HUS1500016I1; US8728796B2; EP1539977B1; JP5729919B2; AU2003251902B2; KR100972542B1; FR15C0028I2; NL300727I2; CN1688707A; WO2004014295A3; SI1539977T1; LU92684I2

Abstract

하나 이상의 티아쿠미신을 탄소원, 질소원, 무기염과 같은 미량원소, 및 흡착제를 포함하는 영양배지에서 생산 및 축적하는 능력을 가진 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 종에 속하는 미생물을 배양함으로서 생산되는 티아쿠미신을 생산 및 회수하는 방법, 공정 및 물질, 여기서 질소원은 피쉬 파우더를 포함하고, 여기서 상기 티아쿠미신은 50 mg/L 브로스보다 큰 수율로 생산된다.

Description

티아쿠미신 제조법{TIACUMICIN PRODUCTION}

티아쿠미신은 하기와 같이 18-멤버 마크로리드 고리를 함유한 구조적으로 관련된 화합물 군이다.

현재, 몇몇 구별된 티아쿠미신이 확인되었으며, 이들 중 여섯개(티아쿠미신 A-F)가 이들의 치환체 R¹, R², 및 R³ 의 특정 패턴에 의해서 정의되었다(미국 특허 제 4, 918, 174 호; J. Antibiotics, 1987, 575-588).

리피아미신은 티아쿠미신에 밀접하게 관련된 자연 생성물의 군이다. 리피아미신 군의 두 멤버(A3 및 B3)는 티아쿠미신 B 및 C 와 각각 동일하다(J. Antibiotics, 1988, 308-315; J. Chem. Soc. Perkin Trans I, 1987, 1353 - 1359).

티아쿠미신 및 리피아미신은 수많은 물리적 방법에 의해서 특징지어져 왔다. 이들 화합물의 보고된 화학적 구조는 분광기(UV-vis, IR 및 ¹H 및 ¹³C NMR), 질량분광기, 및 원소 분석에 기초한 것이다(예를 들어, J. Antibiotics, 1987, 575-588: J. Antibiotics, 1983, 1312-1322).

티아쿠미신은 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 를 포함하는 박테이라에 의해서 생산되며, 이것은 ARS Patent Collection of the Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL61604, accession number NRRL 18085 로부터 얻어진다. 스트레인 AB 718C-41 의 특성이 J. Antibiotics, 1987, 567-574 및 US 특허 제 4,918,174 에서 주어진다.

리피아미신은 Actinoplanes deccanensis(미국 특허 제 3,978,211)을 포함하는 박테리아에 의해서 생산된다. ATCC 에 21983 호로 기탁된, 타입 스트레인 A/10655 의 탁소노미컬(taxonomical) 연구는 J.Antibiotics, 1975, 247-25 에서 논의되었다.

티아쿠미신, 상세하게는 티아쿠미신 B 는 다양한 박테리아 병원균에 대해서 활성을 보여주며, 특히 Clostridium difficile, 그람 양성 박테리아(Antimicrob. Agents Chemother. 1991, 1108-1111)에 대해서 보여준다. Clostridium difficile 는 창자 감염을 야기하는 혐기성 포자 형성 박테리아이다. 설사가 가장 통상적인 증상이지만, 복부통증 및 열이 날 수도 있다. Clostridium difficile 는 항생제 섭취 후 발생할 수 있는 대장염(콜론 염증) 및 설사의 주요 유발제이다. 이 박테리아는 주로 병원과 요양원에서 얻어진다. C. difficile 에 대해서 뛰어난 활성을 보여주는 티아쿠미신 B 는, 이 때문에 박테리아 감염, 특히 포유류에서 위장관 계통의 것들에 대해서 유용할 것으로 기대된다. 그러한 치료의 예로는 제한적이지는 않지만, 대장염의 치료 및 과민성 대장 증후군의 치료를 포함한다. 티아쿠미신은 또한 대장암의 치료 용도를 발견할 수 있다.

발효 공정은 티아쿠미신을 포함하는 항생제를 얻기 위해서 사용된다. 항생제는 서브머지(submerged)된 호기성 발효 조건하에서, 항생제의 활성이 인-공정 분석에서 유추할 때 실질적인 양의 항생제 활성이 생성될 때까지, 쉽게 동화되는 탄소, 질소원 및 무기 염을 함유하는 배지에서 미생물을 배양함으로서 얻어질 수 있다. 항생제에 대한 요구가 전세계적으로 증가하기 때문에, 항생제를 생산하는 향상된 방법에 대한 계속적인 요구가 있다.

도 1 은 실시예 1 에 따라서 생성된 원발효 물질의 HPLC 크로마토그램을 보여준다; 티아쿠미신 B 는 대략 12.6 분의 체류 시간을 가진다.

도 2 는 실시예 2 에 따라서 생성된 원발효 물질의 HPLC 크로마토그램을 보여준다; 티아쿠미신 B 는 대략 11.8 분의 체류 시간을 가진다.

도 3 은 실시예 2 에 따른 발효에 의해서 생산된 정제된(HPLC 로) 티아쿠미신 B의 HPLC 크로마토그램을 보여준다; 티아쿠미신 B 의 체류시간은 대략 12.0 분이다.

도 4 는 실시예 3 에 따라, 발효에 의해서 생산되고, 역상 매개 압력 액상 크로마토그래피에 이은 분쇄에 의해서 정제된 티아쿠미신 B 의 HPLC 크로마토그램을 보여준다; 티아쿠미신 B는 약 10.1 분의 체류시간을 가진다.

발명의 요약

본 발명은 티아쿠미신을 생산하는 방법, 공정 및 물질들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 여기서 기술된 발효법, 공정 및 물질을 이용하여 생산된 티아쿠미신에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명은 적어도 하나의 티아쿠미신 수율이 약 50 mg/L 브로스보다 크고, 영양배지에서 티아쿠미신을 생산할 수 있는 능력을 가지는 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 종에 속하는 미생물을 배양하는 것과 영양배지에서 적어도 하나의 티아쿠미신을 축적하는 것을 포함하는 티아쿠미신을 생산하는 공정을 포함한다.

일 실시예에서, 향상된 티아쿠미신 B 의 발효적 생산의 향상된 매개와 조건이 개시되어 있다. 그래서, 본 발명의 일 실시예는 탄소원, 질소원, 무기염과 같은 미량원소, 및 흡착제를 포함하는 티아쿠미신의 생산용 영양배지이며, 여기서 상기 질소원은 피쉬 파우더이며, 그리고 여기서 상기 영양배지는 적어도 하나의 티아쿠미신 수율이 약 50 mg/L 브로스보다 크도록 사용된다.

다른 실시예에서, 향상된 회수 방법, 티아쿠미신 B 의 수지 흡착이 기술된다.

다른 실시예에서, 본 발명은 티아쿠미신을 생산하는 유기체로서, Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 에 관련된 박테리아 스트레인을 이용한다. 그래서, 본 발명은 탄소원, 질소원, 무기염과 같은 미량원소, 및 흡착제를 포함하는 영양배지에서 하나이상의 티아쿠미신을 생산하고 축적하는 능력을 가지는 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 종에 속하는 미생물을 배양함으로서 생산되는 티아쿠미신을 포함하며, 여기서 상기 질소원은 피쉬파우더이며, 상기 티아쿠미신은 약 50 mg/L 브로스보다 큰 수율로 생산된다.

본 발명의 다른 실시예는 원 발효 물질로부터 티아쿠미신의 정제를 위한 역상 매개 압력 액체 크로마토그래피 및 액체/액체 분배 및/또는 분쇄의 용도를 포함한다.

이들 개선들은 단독으로 또는 함께 보다 향상된 수율(> 50 mg/L 브로스)로 티아쿠미신 B 의 생산 및 회수를 가능하게 한다.

발명의 상세한 설명

여기서 언급되는 모든 특허, 공보 및 특허출원은 그 전체가 참고문헌으로 도입되는 것이다. 달리 정의되지 않는다면, 여기서 사용되는 모든 기술적 또는 과학적 용어들은 발명이 속하는 분야에서 평균적 기술자에 의해서 통상적으로 이해되는

것과 같은 의미를 가진다. 예시적인 물질과 방법들이 하기에 기술된다. 그러나, 여기서 기술된 것들과 유사하거나 또는 등가의 물질과 방법들은 본 발명의 변형을 얻기 위해서 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예들은 단지 예시적인 것이며, 범위를 한정하는 것으로 의도되어서는 않된다.

본 발명의 티아쿠미신을 함유한 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치용으로 투여될 수 있다. 치료적인 분야에서, 조성물은 이미 감염된 환자에게, 상기 기술한 바와 같이, 치료에 충분하거나 또는 적어도 부분적으로 감염증상을 완하시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 성취하기 위한 적절한 양은 "치료적으로 효과적인 양 또는 복용량"으로 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 감염의 코스, 및 심각성, 이전 치료, 환자의 건강 상태, 및 약물에 대한 반응성과 치료하는 의사의 판단에 달려 있다. 예방적인 부분에서, 본 발명의 티아쿠미신을 함유한 조성물은 특별한 감염의 위험에 민감하거나 또는 그렇지 않으면 노출된 환자에게 투여된다. 그러한 양은 "예방적으로 효과적인 양"으로 정의된다. 그 사용에서, 정확한 양은 또 다시 환자의 건강상태, 체중, 등등에 따라 다르게 된다.

일단 환자의 건강이 나아지게 되면, 필요시 유지 약량이 투여된다. 결과적으로, 복용 또는 잦은 투여 또는 둘다가 향상된 조건이 유지되는 수준까지 증상의 기능에 따라서 감소될 수 있다. 증상이 소정의 수준까지 경감되면, 치료는 중지될 수 있다. 그러나 환자가 질병증상의 어떤 재발에 대해서 장기간 기준으로 간헐적인 치료를 요할 수도 있다.

일반적으로, 본 발명의 티아쿠미신의 효과적인 적절한 약량은 매일 수납자당 0.1 에서 1000 밀리그램(mg), 바람직하게는 매일 1 에서 500 mg 이다. 소정의 약량은 바람직하게는 하루종일 적정한 간격으로 일회, 이회, 삼회, 사회, 또는 추가적인 회수로 투여될 수 있다. 이들 분할 약량은 , 예를 들면 단위 복용형당 활성 성분을 5 에서 1000mg, 바람직하게는 10 에서 200 mg 함유하는 단위복용형으로 투여

될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 화합물은 환자 체중당 약 1.0 mg/kg 에서 250 mg/kg 사이의 양으로, 하루에 일에서 4회 정도로 투여될 것이다.

"약물학적 조성물"은 여기서 기술되는 하나 이상의 티아쿠미신의 혼합물, 또는 약물학적으로 수용가능한 이들의 염과 다른 화학적 성분, 일예로 생리학적으로 수용가능한 캐리어 및/또는 부형제와의 혼합물을 언급한다. 약물학적 조성물의 목적은 기관에 화합물의 투여를 용이하게 하는 것이다.

본 발명의 화합물의 "약리학적으로 수용가능한 염"은 약리학적으로 수용가능한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 적절한 산의 예로는 하이드로클로닉, 하이드로보믹, 설폰, 나이트릭, 과염소, 퓨마릭, 말레, 포스포닉, 글리코닉, 글루코닉, 락틱, 살리실, 숙신, 톨루엔-p-설폰, 탈틱, 아세틱, 시트릭, 메탄설폰, 포믹, 벤조익, 말로닉, 나프탈렌-p-설폰, 벤젠설폰, 1,2-에탄설폰 산(에디실레이트), 갈락토실-D-글루콘산, 등등을 포함한다. 다른산, 일예로 옥살산은 그 자체로는 약리학적으로 수용가능하지 않더라도, 본 발명의 화합물 또는 이들의 약리학적으로 수용가능한 산 투입염을 얻기 위한 중간체로서 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다. 적절한 염기로부터 유도되는 염은 알카리 금속(예를 들어, 쏘듐), 알카리 토금속(예를 들어, 마그네슘), 암모늄, 및 N(C₁-C₄알킬)₄ ⁺염 등이다. 일부의 이들의 예시적인 예는 쏘듐 하이드록사이드, 포타슘하이드록사이드, 클로린 하이드록사이드, 쏘듐 카보네이트, 등이다.

"생리적으로 수용가능한 캐리어"는 기관에 유의한 염증을 야기하지 않고, 그리고 투여되는 화합물의 생물학적 특성과 활성을 폐기시키지 않는 캐리어 또는 희석제를 언급한다.

"부형제"는 화합물에 투여를 보다 용이하게 하기 위해서 약물학적 조성물에 적절하게 투여되는 불활성 물질이다. 부형제의 예로는 제한적이지는 않지만 칼슘카보네이트, 칼슘포스페이트, 다양한 당, 및 스타치, 셀루로스 유도체, 젤라틴, 야채유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.

여기서 사용되는 용어"영양배지"는 천연 또는 합성적으로 발생한 성분의 혼합물을 가르킨다. 일반적으로, 영양배지는 탄소원, 질소원, 무기염과 같은 트레이스 성분, 및 임의적인 비타민 또는 다른 성장 인자 및 흡착제를 포함한다.

여기서 사용되는 용어"브로스"는 배양 후 또는 중에 얻어지는 유체 배양 배지를 언급한다. 브로스는 물, 소정의 항생제, 비사용된 영양체, 생존 또는 사망 기관, 대사 물질, 및 소정의 생성물을 가지거나 또는 가지지 않는 흡착체의 혼합물을 포함한다.

여기서 사용되는 용어"티아쿠미신"은 하기 보여지는 18-멤버 마크로리드 고리를 포함하는 모든 화합물의 군을 언급한다.

용어 "티아쿠미신 B"는 하기 구조를 가지는 분자를 언급한다.

여기서 사용되는 용어"수율"은 원 배양 브로스와 동일한 부피까지 메탄올에서 재구성된 원 티아쿠미신의 양을 언급하는 것이다. 수율은 표준 HPLC 기법을 이용하여 결정된다. 수율은 mg/L 단위로 보고된다.

발명의 일 실시예는 미생물의 서브머지된 호기성 발효에 의해서 항생제, 예를 들어, 티아쿠미신을 생산하는데 적절한 공정을 포함한다. 그러한 유기물의 한 실시예는 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenesis 이다. 발명의 일 실시예에 따르면, 티아쿠미신, 일예로 티아쿠미신 B 는 예외적인 수율(>100 mg/L 브로스)로 수지 흡착에 의해서 발효 브로스로부터 회수되고, 수지와 균사로부터 다양한 극성을 가지는 용매로 세척함으로 용리된다. 정제는 용매 추출 및/또는 Sephadex, 실리카겔, HPLC 또는 역상 매개 압력 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피적 분리, 및/또는 하나 이상의 용매로 재결정 및/또는 하나 이상의 용매로 분쇄에 의해서 더 진행될 수 있다.

본 발명에 사용되는 한 미생물은 Actinoplanaceae, genus Dactylosporangium (Journal of Antibiotics, 1987, p. 567-574 and US patent 4,918, 174) 군에 속하는 것으로 확인되었다. 이것은 Dactylasporangium aurantiacum subspecies hanzdenensis 718C-41로 명명되었다. 서브컬쳐는 ARS Patent Collection of the Northern Regional Research Center, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, U. S. A.로부터 얻어졌으며, 여기에서 accession number NRRL 18085이 부여되었다. 스트레인 AB 718C-41 의 특성은 Journal of Antibiotics, 1987, p. 567-574 와 US patent 4,918, 174에 기술되었다.

티아쿠미신을 생산할 수 있는 추가적인 미생물은 변종을 포함하며, 이것은 종래 알려진 종과 비교시 더 좋은 잇점들을 보여준다. 그러한 박테리아 스트레인은 양친 스트레인의 돌연변이 유발에 의해서 생산될 수 있다. 돌연변이 유발 방법 및 전략, 변이된 박테이아 스트레인의 스크리닝과 분리 절차, 발명의 변형 스트레인의 생산할 때 사용되는 배지 조성은 공지되어 있다. 스트레인의 지정된 미생물은 소정의 마이크로리드의 증가된 생산, 보다 효율적인 영양배지의 이용, 또는 감소된 호기성 성장에 필요한 산소 요구와 같은 잇점들을 구체화시킬 수 있다.

바람직한 실시예에서, Dactylosporangium aurantiacum subspecies hamdenesis AB 718C-41 NRRL 18085 의 티아쿠미신의 생산을 위한 배양은 하나 이상의 흡착제를 가지는 용이하게 동화할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염, 및 다른 유기성분과 적절한 호기성 조건 및 무균환경에서의 혼합에서 수행된다. 본 발명의 항생제를 생산하는데 사용되는 영양 배지 조성물은 실시예에서 상세하게 기술된다.

미생물 성장을 지지할 수 있는 탄소원은 제한적이지는 않지만, 글루코스, 수크로스, 갈락토즈, 프럭토즈, 스타치, 몰라시즈, 말트 추출물, 덱스트린, 훼이, 글리세롤, 리피드, 콘 밀, 등등과 이들의 조합을 포함한다. 발명의 한 실시예에 있어서, 탄소원은 0.2 - 10 중량 %의 범위로 존재한다. 발명의 한 실시예에 따른 탄소원의 양은 표 2 에 주어진다.

미생물 성장을 지지할 수 있는 질소원은 제한적이지는 않지만, 쇠고기 추출물, 콩밀, 목화씨밀, 홀 이스트(whole yeast), 이스트 추출물, 콩밀 가루, 펩톤, 카사미노산, 피쉬 파우더, 옥수수 담금액, 암모늄 염, 카세인, 아미노산, 등등과 이들의 혼합물을 포함한다. 한 실시예에 있어서, 영양배지는 피쉬 파우더(999 Prime quality fishmeal, TripelNine Fish Protein, a.m.b.a. Fiskerihavnsgade 35, 6700 Eshjerg,Dermark)를 질소원으로 포함한다. 발명의 일 실시예에 있어서, 질소원은 0.1 - 5.0 중량%의 범위로 존재한다. 발명의 일 실시예에 따른 질소원의 양은 표 2 에 주어진다.

유기물의 성장과 발육에 필요한 필수 미량 원소는 유기물의 생합성 요건과 성장을 충족시키기에 충분한 양으로 다른 구성의 배지에서 불순물로 발견될 수 있다. 그러나, 미생물의 성장을 도울 수 있는 추가적인 용융성 영양 무기염을 배양배지에 도입하는 것이 유익하다. 미생물의 성장을 지지할 수 있는 무기염은 제한적이지는 않지만, K₂HPO₄, MgSO₄.7H₂O, KCl, CaCO₃, 등등을 포함한다. 필수 미량 원소는 바람직하게 0.02 에서 2.0 중량 % 의 범위로 존재한다. 본 발명의 실시예에 따른 개개 필수 원소의 양은 표 2 에 주어진다.

상업적으로 이용가능한 흡착제 수지는 배양중 티아쿠미신의 수율과 회수의 효율을 증가시키는 것이 발견되었다. 그러한 흡착제는 제한적이지는 않지만, Amberlite^R XAD16, XAD16HP, XAD2, XAD7HP, XAD1180, XAD1600, 및 IRC50(전부 Rohm & Hass 제품), Duolite^R XAD761(Rohm & Hass, 미국) 등등이다. 흡착제는 바람직하게 0.5 에서 15 중량 % 의 범위로 존재한다. 발명의 한 실시예에 따른 흡착제의 양은 표 2 에 주어진다.

통상적인 호기성 서브머지된 배양 공정에서처럼, 무균 공기가 배양 배지를 통해서 분산된다. 산소 함량은 3 % 이상으로 유지되었다(InPro 6000 Series O₂ 센서, Mettler Toledo). 이러한 조건하에서, 세포의 성장은 혐기성이 되는 생장 조건을 방지하는 수준으로 유지된다. 몇몇 실시예에서, 제한 성분은 탄소원, 질소원, 또는 세포에 의해서 요구되는 다른 성분으로부터 선택된다(예를 들어, 공급 배지에서).

박테리아는 적절한 성장 조건에서 성장한다. 그러한 적절한 성장 조건은 성장 배지 및/또는 공급배지의 성분의 이용성을 제한함으로서 특징되며, 그러한 방법으로 상기 박테리아의 성장을 위한 호기성 조건이 유지된다. 그러한 조건들은 또한 예를 들어 약 2 %에서 30%의 농도로 용해된 산소의 수준을 유지함으로서 특징될 수 있다. 그러한 수준의 용해된 산소는 용해된 산소 농도를 측정하고 박테리아 성장시키기 위해서 사용되는 특정 기술적 장비에 의존해서 변할 수 있다.

티아쿠미신 생산 박테리아는 쉐이크 플라스크에서부터 큰 회분식 발효기에서까지 종래 기법에 의해서 증식될 수 있다. 티아쿠미신의 실질적인 양을 생산하기 위해서, 탱크에서 서브머지된 호기성 발효가 이용된다. 그러나, 적은 양은 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 얻어질 수 있다. 탱크 발효에서는, 식물성 이노쿨럼(inoculum)을 사용하는 바람직하다. 식물성 이노쿨럼은 스펀지폼, 미세리알(mycelial) 조각, 또는 동결건조된 유기체의 펠렛의 적은 부피의 배양 배지를 신선하고, 활동적으로 자라는 유기체 배지를 얻도록 인큐베이트시키는 것이다. 식물성 이노쿨럼은 다음 보다 큰 탱크로 옮겨지고, 거기서 적절한 인큐베이트 시간 후, 티아쿠미신 항생제가 훨씬 향상된 수율로 생산된다.

만일 거품이 문제가 되면, 대용량 발효 배지에 소포제를 소량 투여하는 것이 필요하다.

생산은 조절 배지안에서 다른 첨가제/성분과 함께 생산을 향상시키기 위해서 진행된다. 액체-서브머지, 교반-배지 공정이 티아쿠미신의 생산을 위해서 사용된다. 발효는 25 °C 에서 37 °C 온도 범위에서 진행되었다. 탄소원의 소모는 조심스럽게 관찰되고, 그리고 추가적인 양의 탄소원이 필요시 투입되었다. 발효 pH는 바람직하게는 약 6.0에서 8.0 사이에서 유지되었다. 티아쿠미신 B 는 발효의 인큐베이팅 후 3에서 15 일간 생산되고 축적되었다. 표준 제어 배지는 하기 성분과 하기 양으로 구성된다:

피쉬 파우더 0.1% 에서 5%

글루코스 0.2% 에서 10%

K₂HPO₄ 0.02% 에서 0.5%

MgS0_4·7H₂0 0.02% 에서 0.5%

KCI 0.01 % 에서 0.3%

CaCO₃ 0.1% 에서 2%

다른 첨가제/성분은 다음과 같이 구성된다:

카사미노산 0.05% 에서 2%,

이스트 추출물 0.05% 에서 2%

XAD-16 수지 0.5% 에서 15%

발효 종료시, 고형분(흡착제 수지)는 체질에 의해서 브로스로부터 분리된다. 티아쿠미신은 수지로부터 유기 용매, 일예로 에틸아세테이트, 메탄올, 아세토니트릴 EH는 이 이상의 유기 용매의 혼합물에 의해서 용리된다. 추출물은 다시 감압하에서 농축된다. 이 잔류물은 핵산, 헵탄, 메틸사이클로핵산과 같은 비극성 용매로 분쇄되거나, 또는 일예로 다양한 비율과 조합으로 에틸아세테이트/물; 에틸아세테이트/쏘듐 클로라이드 수용액; 메탄올/헥산, 아세토니트릴/헥산과 또는 다른 2 이상의 용매의 혼합물에서 분배되거나 또는 적절한 유기 용매계로 용출되는 Sephadex 컬럼크로마토그래피에 의해서 더 정제된다. 필요하다면, 티아쿠미신은 결정화 및/또는 크롬마토그래피분리 및/또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및/또는 액체/액체 분배 및/또는 다른 분쇄에 의해서 더 정제될 수 있다.

상기로부터 인식될 수 있는 것과 같이, 본 발명은 다양한 적용 분야를 가진다. 따라서, 하기 실시예들은 예시적으로 제시되는 것이며, 제한적인 것으로 제공되는 것이 아니다.

실시예 1

Dactylasporangium aurantiacum subspecies hanzdenensis AB 718C-41 NRRL 18085 (-20 ℃ 저장)이 1 mL 의 Medium No. 104 (Table 1)에서 유지되었다. 표준 멸균 조건 후(30 분, 121 ℃, 1.05 kg/cm²)후, Medium No. 104 (50 mL)를 함유하는 씨드 플라스크(250 mL) 가 AB 718C-41 NRRL 18085 와 함께 쉐이커(set @ 250 rpm)에서 30 ℃ 로 72 시간동안 이노쿨레이트 되었다. 제 1 패시지 씨드 플라스크로부터 5 % 식물성 이노쿨럼이 표 1 에서와 동일한 성분을 함유한 발효 플라스크로부터 어셉틱컬하게(aseptically) 옮겨졌다.

표 1: Medium No. 104 의 성분

피쉬파우더	글루코스	K₂HPO₄	MgSO₄·7H₂O	KCI	CaCO₃	카사미노산	이스트추출물	XAD-16
10 g/L	20 g/L	0.5g/L	0.5g/L	0.3g/L	3g/L	2.5g/L	2.5g/L	20 g/L

발효 플라스크는 로터리 쉐이커에서 30 °C로 3 에서 12 일간 인큐베이트되었다. 전 배양 발효 브로스의 시료가 여과되었다. 필터 케이크는 MeOH 로 세척되고, 용매는 감압하에서 제거되었다. 잔류물은 원 발효 브로스의 동일한 부피까지 메탄올에서 재구성되었다. 분석은 Waters 2487 2-channel UV/Vis 감지기가 장착된 Waters BREEZE HPLC system으로 이루어졌다. 티아쿠미신, 1.5 mL/분의 유속에서 0.1 % 인산을 함유한 물에서 45 % 아세토니트릴을 구성하는 유동상으로, 50 x 4.6 JUM I. D., 5, UM YMC ODS-A column (YMC catalog # CCA AS05- 0546WT)에서 분석되었다. 티아쿠미신은 266nm에서 검출되었다. 원생성물의 HPLC 크로마토그램 (Tiacumicin B retention time @ 12.6 minutes) 이 도 1 에 보여진다. 이 실시예에서, 티아쿠미신 B 의 원 수율은 약 250 mg/L 7 일 후이었으며, HPLC 에 의한 정제 후, 티아쿠미신 B 의 수율은 약 100 mg/L 이었다.

실시예 2

표준 멸균 조건(30 min, 121 ℃, 1.05 kg/cm²) 후, Medium No. 104 (50 mL)을 함유하는 씨드 플라스크 (250 mL)가 AB 718C- 41 NRRL 18085으로 인큐베이트되었고, 그리고 쉐이커에서(set @ 250 rpm) 30° C로 72 hr동안 인큐베이트 되었다. 제 1 패시지 씨드 플라스크로부터 5 % 식물성 이노쿨럼이 표 1 에서와 동일한 성분을 함유한 발효 플라스크로부터 어셉틱컬하게(aseptically) 옮겨졌고, 그리고 로타리 쉐이커에서 30 ℃ 로 72 hr 동안 인큐베이트되었다. 제 2 패시지 씨드 플라스크로부터 5 % 식물성 이노쿨럼이 Medium No. 104 (2.5 L)를 함유한 5 리터 발효기에서 AB 718C-41 NRRL 18085 로 인큐베이트 하기 위해서 사용되었다. 과량의 거품 생성은 소포제(Sigma A-6426)의 투입에 의해서 제어되었다. 이 제품은 폴리올 분산에서 비-실리콘 유기 소포제의 혼합물이다.

글루코스 소비가 성장 인자로서 관측되었으며, 그 수준은 공급 배지의 투입에 의해서 제어되었다. 공급 배지 및 조건은 하기 실시예 2에서와 같다.

공급 배지

이스트추출물	카사미노산	글루코스	K₂HPO₄	MgSO_4·7H₂O	KCI
1.5%	1.5%	30 %	0.5%	0.5%	0.3%

발효기 배지:No. 104

발효기 부피: 5 리터

멸균 : 40 minutes, 121 ℃, 1.05 kg/cm²

인큐베이션 온도: 30 ℃

폭기 속도: 배지 부피 및 분당 공기 0.5 - 1.5 부피

발효기 교반: 300 - 500 rpm

발효는 8 일간 수행되었으며, XAD-16 수지가 체질에 의해서 배양 브로스로부터 분리되었다. 물로 세척 후, XAD-16 수지는 메탄올로 용출되었다(5-10 x XAD-16 부피). 메탄올은 증발되고, 그리고 지성 잔류물은 에틸 아세테이트로 3 회 추출되었다. 추출물은 혼합되고, 그리고 감압하에서 지성 잔류물에 농축되었다. 지성 잔류물은 건조되고, 그리고 헥산으로 세척되어, 엷은 브라운 파우더로서 원 생성물을 제공하며, 그리고 그 HPLC 크로마토그램((Tiacumincin B retention time @ 11. 8 minutes) 는 도 2에서 보여진다. 이것은 실리카겔 컬럼(용출물로서 에틸아세테이트와 헥산의 혼합물)에 의해서 정제되고, 잔류물은 RP-HPLC(역상 HPLC)에 의해서 더 정제되어, 백색 고체로서 티아쿠미신 B를 제공하였다. 순도는 HPLC 크로마토그래피에 의해서 > 95 % 인 것으로 결정되었으며, 크로마토그램(티아쿠미신 B 잔류시간@ 12.0 minutes) 은 도 3에서 보여진다. 분리된 티아쿠미신 B 의 분석은 J. Antibiotics, 1987,575-588에서 보고된 것과 동일한 1H 및 13C를 제공하였으며, 하기 요약되었다.

Tiacumicin B :

mp 129-140 ℃ (RP-HPLC로부터 백색파우더);

mp 166-169 ℃(이소프로판올로부터 백색파우더);

실시예 3

원시료 티아쿠미신 B(15 g)이 실시예 2에서 기술된 것과 같은 수지로부터 분리 후, 지성 잔류물로서 발효에 의해서 얻어졌다. 이것은 에틸 아세테이트(300 mL)에서 35 ℃로 용해되었으며, 그리고 용액은 물(300 ml)로 분별 깔대기에서 흔들어진 후, 1 분간 정치되었다. 포화된 쏘듐 클로라이드 수용액(100 ml)가 투입되고, 혼합물은 1 분간 더 정치되었다. 하부상과 계면의 어떤 고체들은 버려지고, 그리고 상부상은 갈색 고체로 감압하에서 35 ℃로 농축되었다. 결과적인 형태는 하기 변수를 가지는 Isco UA-6 UV/VIS 검출기를 갖춘 Biotage 75L 장치를 이용하여 역상 매개압 액체 크로마토그래피을 거쳤다:

컬럼 : 1.2 kg, Biotage KP-C18-HS silica.

평형: 50: 50: 1, MECN/H2O/ACOH (6 L).

충진: 메탄올에서 (20 mL), 25 g 의 Biotage KP-C18-HS silica를 함유한 샘플 인젝션 모듈을 통해.

용리액: 50: 50: 1, MeCN/H2O/AcOH.

흐름: 230 mL/min

압력: 용매-90 psi

라디알-100 psi

검출기 : 파장 -254 mu

Path length-0.1 cm

감도-2

챠트 스피드-60 cm/hr

노이즈 필터-5 sec.

프렉션 모집: 수동-메인 피크와 예비 피크사이에서 인젝션 직후에 모집을 시작해서, 20 % 의 메인 피크 높이에서 모집을 종료.

컬럼 조건 : 100 % MeCN (4L)

포화된 쏘듐 클로라이드 수용액 (25% 의 프렉션 부피 가 모집된 부분에 투입되었다. 혼합물은 흔들어지고, 그리고 2 상으로 분리되도록 하였다. 상부상은 제거되고, 감압하에서 30 ℃에서 건조되도록 농축되었다. 결과적인 고체는 에틸아세테아트(75 ml)에 용해되고, 물로 세척되어(2 x 75 ml), 쏘듐 클로라이드를 제거하였다. 유기 상은 감압하에서 30 ℃로 농축되어 노란색 폼을 제공하였다(회수: 4.56g, 30 %; 순도 - 93 %).

물질은 몇몇 다른 배치와 혼화되었고(총 156.0 g, 90.8 % 순도), 여기에 이소프로판올(1000 ml)가 투입되었다. 혼합물은 교반하면서 실온으로 20 분동안 초음파처리되어, 오프-화이트 서스펜션을 생산하였다. 이 시점에서, 물질은 여과되고, 필터케이크는 이소프로판올로 세척되었다(300 ml). 고체는 고진공하에서 건조되어 오프-화이트 파우더를 제공하였다.(회수 146.2 g, 94 % 순도 91.1 %)(도4)

Mp 156-160 ℃; [α]D²⁰-8.4 (c 2.0 MeOH); MS m/z(ESI)1079.7(M+Na)⁺; Calce for C₅₂H₇₄Cl₂O₁₈; C, 59.03; H, 7.05; Cl, 6.70. Found: C, 58.75; H, 7.04; Cl, 6.91.

여기서 예시적으로 기술된 발명은 여기서 상세하게 기술되지 않은 어떤 요소 또는 요소들, 범위 또는 범위들의 부재하에서 적절하게 실행될 수 있다. 그래서, 예를 들어, 용어“포함하는”, “함유하는”, “갖는” 등은 범위없이 확장적으로 이해될 것이다. 추가적으로, 여기서 이용되는 용어와 표현들은 예시적인 용어로서 사용되었으며, 제한적인 것이 아니며, 그리고 그러한 용어들이나 표현들의 사용이 더 보여지고, 기술되는 어떤 등가물을 배제하기 위한 의도는 없으며, 청구된 발명의 범위내에서, 다양한 변형들이 가능하다는 것이 인식되어야 한다. 그래서, 본 발명이 발람직한 실시예에 관련하여 그리고 선택적인 특징으로 기술되었다 할지라도, 여기서 공개된 본 발명의 다양한 변형이 또는 개선이 평균적 기술자에게 제공될 수 있고, 그러한 변형과 개선은 여기서 공개된 발명의 범위에 속하는 것으로 고려된다. 여기서 발명은 넓게 일반적으로 기술되었다. 각각의 더 좁은 종과 아종은 이들 발명의 일반적 공개 형태의 영역 내에 들게 된다. 이것은, 제거된 물질이 특정적으로 거기 잔류하는지를 무론하고, 속으로부터 어떤 내용을 제거하는 조건 또는 네거티브 제한을 가지는 각 발명의 포괄적인 기술을 포함한다. 추가로, 발명의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 형태로 기술될 때, 당업자는 발명이 또한 마쿠쉬 그룹의 어떤 개별적 멤버 또는 멤버의 서브그룹에 의해서 기술된다는 것을 이해할 것이다.

상기 개시된 바는 예시적이지, 제한적이 아니라는 것이 이해되어야 할 것이다. 많은 실시예들이 상기 내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 청구항에 권리가 주어지는 동등의 전체 영역과 함께, 발명의 범위는 상기 기술을 근거로 결정되 것이 아닌 첨부된 청구항에 근거하여 결정되어야 할 것이다. 특허공보를 포함한 모든 문헌, 참고문헌은 여기서 참고로 도입되었다.

Claims

영양배지에서 티아쿠미신을 생산하는 능력을 가지는 미생물을 배양하는 것과 영양배지에서 적어도 하나의 티아쿠미신을 축적하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 티아쿠미신의 수율이 약 50 mg/L의 전 발효 브로스보다 큰, 티아쿠미신 생산 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 수율이 약 100 mg/L 브로스 보다 큰 공정.
제 2 항에 있어서, 상기 수율은 약 200 mg/L 브로스 보다 큰 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 수율은 약 50 mg/L 브로스에서 약 500 mg/L 브로스인 공정.
제 4 항에 있어서, 상기 수율이 약 100 mg/L 브로스에서 약 500 mg/L 브로스인 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물이 Dactylosporangium aurantiacum NRRL 18085 인 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 티아쿠미신은 티아쿠미신 B 인 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 티아쿠미신은 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물로 용리시킴으로서 원하지 않는 물질을 체질하고 제거하는 기법; 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물로 추출하는 기법; 결정화; 크로마토그래피 분리; HPLC; MPLC; 분쇄; 및 포화된 염수와 함께 적어도 하나의 용매 또는 용매 혼합물로 추출하는 기법으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 기법을 이용하여 상기 영양배지로부터 분리되는 공정.
제 1 항에 있어서, 상기 미생물은 약 25 ℃ 에서 약 35 ℃사이의 온도에서, 약 6.0 에서 약 8.0 사이의 pH 로 배양되는 공정.
제 1 항에 있어서, 영양 배지는 글루코스, 수크로스, 스타치, 몰라세스, 덱스트린, 훼이, 글리세롤, 리피드 및 콘밀로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 탄소원을 포함하는 공정.
제 1 항에 있어서, 영양배지는 필요한 추가적인 탄소원으로 공급되는 공정.
제 1 항에 있어서, 영양 배지는 쇠고기 추출물, 콩밀, 홀 이스트(whole yeast), 이스트 추출물, 콩밀 가루, 펩톤, 카사미노산, 피쉬 파우더, 옥수수 담금액, 암모늄 염, 카세인, 아미노산으로 이루어진 그룹에서 선택되는 미생물 성장을 지지할 수 있는 하나 이상의 질소/유기원을 포함하는 공정.
제 12 항에 있어서, 영양배지가 피쉬 파우더를 포함하는 공정.
제 1 항에 있어서, 영양배지가 K₂HPO₄, MgSO₄·7H₂O 및 CaCO ₃ 로 이루어진 그룹에서 선택되는 미생물 성장을 지지할 수 있는 하나 이상의 무기염을 포함하는 공정.
제 1 항에 있어서, 영양배지는 상지 배양 중 하나 이상의 티아쿠미신을 흡수할 수 있는 적어도 하나의 흡착제를 포함하고, 상기 흡착제는 Amberlite^R XAD16, XAD16HP, XAD2, XAD7HP, XAD1180, XAD1600, 및 IRC50, Duolite^RXAD761 및 역상 실리카겔로 이루어진 그룹에서 선택되는 공정.
제 15 항에 있어서, 상기 역상 실리카겔은 KP-C18, KP-C18-WP, 및 KP-C18HS 로 이루어진 그룹에서 선택되는 공정.
탄소원, 질소원, 미량원소, 및 흡착제를 포함하며, 50 mg/L 브로스보다 큰 수율로 하나 이상의 티아쿠미신을 생산하도록 사용되는, 미생물로부터 티아쿠미신을 생산하기 위한 영양 배지.
제 17 항에 있어서, 상기 티아쿠미신 수율이 약 100 mg/L 브로스 보다 큰 영양배지.
제 18 항에 있어서, 상기 티아쿠미신 수율은 약 200 mg/L 브로스 보다 큰 영양배지.
제 17 항에 있어서, 상기 티아쿠미신 수율은 약 50 mg/L 브로스에서 약 500 mg/L 브로스인 영양배지.
제 20 항에 있어서, 상기 티아쿠미신 수율이 약 100 mg/L 브로스에서 약 500 mg/L 브로스인 영양배지.
제 17 항에 있어서, 상기 질소원이 피쉬 파우더인 영양배지.
제 17 항에 있어서, 상기 미생물이 Dactylosporangium aurantiacum NRRL 18085 인 영양배지.
제 17 항에 있어서, 상기 티아쿠미신은 티아쿠미신 B 인 영양배지.
제 17 항에 있어서, 영양배지가 상기 배양 중 적어도 하나의 티아쿠미신을 흡착할 수 있는 적어도 하나의 흡착제를 포함하는 영양배지.
하나 이상의 티아쿠미신을 탄소원, 질소원, 무기염과 같은 미량원소, 및 흡착제를 포함하는 영양배지에서 생산 및 축적하는 능력을 가진 Dactylosporangium aurantiacum 아종 hamdenensis 종에 속하는 미생물을 배양함으로서 생산되고, 여기서 상기 티아쿠미신은 50 mg/L 브로스보다 큰 수율로 생산되는 티아쿠미신.