CN107236686B

CN107236686B - 一种桔橙指孢囊菌及其在调控微生物代谢物非达霉素中的应用

Info

Publication number: CN107236686B
Application number: CN201710473850.7A
Authority: CN
Inventors: 陈晓霞; 王蓓; 赵万忠; 冯国栋; 谢海军
Original assignee: Hangzhou Huadong Medicine Group Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hangzhou Huadong Medicine Group Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2019-10-15
Anticipated expiration: 2037-06-21
Also published as: CN107236686A

Abstract

本发明公开了一种桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)FID1307及其应用，该菌种由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2017311，保藏日期为：2017年06月07日。本发明还公开了一种由此菌株发酵制备非达霉素的方法。本发明提供的发酵工艺经大生产实践，证明其发酵稳定、副产物少，大大地降低了后提取的难度，适宜工业化大生产，且获得的非达霉素产品质量高。

Description

一种桔橙指孢囊菌及其在调控微生物代谢物非达霉素中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其在制药领域中应用，具体地说是桔橙指孢囊菌通过调控微生物代谢获得非达霉素的应用。

背景技术

非达霉素(fidaxomicin，商品名Dificid，曾用名OPT-80，PAR-101)，是具有18元环结构的大环内酯类抗生素，可由桔橙指孢囊菌hamdenensis亚种(Dactylosporangiumaurantiacumsubspecie hamdenensis)发酵而得，具体可由放线菌指孢囊菌NRRL 18085产生。桔橙指孢囊菌发酵得到的产物是一族与非达霉素结构非常相近的产物，称为台勾霉素(tiacumicins)，按结构不同，分别称为台勾霉素A、B、C、D、E和F。非达霉素为R构型的台勾霉素B，具有新型的作用机制(结构式如下所示)。

非达霉素于2011年5月获美国FDA批准上市，用于治疗艰难梭菌(难辨梭状芽孢杆菌，Clostridium difficile)感染相关性腹泻(CDAD)。这是FDA近30年来批准的首个治疗CDAD的药物，欧盟2011年12月批准上市。

中国专利文献03818016.2(发明名称：台勾霉素的制备)公开了制备台勾霉素B的方法，所制备得到发酵产物中，含有较高的副产物、杂质(见附图1)。

中国专利文献201310208223.2(发明名称：一种游动放线菌菌株及其在制备非达霉素中的应用)公开了其制备得到发酵产物的HPLC分析图(见附图2)，图中显示发酵产物中含有较多的副产物和杂质。

本领域普通技术人员均知道现有技术制备得的非达霉素发酵产物中含有较多的杂物、副产物，这些物质的存在将对后续的提纯带来很大的难度，对于一些在提纯环节中很难去除的杂质，将严重影响最终药品的质量。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种发酵稳定、副产物少的非达霉素产生菌，同时提供该菌株在制备非达霉素中的应用，以及具体的发酵制备方法。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种桔橙指孢囊菌，分类命名为Dactylosporangium aurantiacum FID1307，由中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M 2017311，保藏日期为：2017年6月7日。

所述的保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株的菌落特征：菌落近圆形，表面平整，菌落直径1～2mm，中间***，无分泌物和可溶性色素产生。

所述的保藏号为CCTCC NO：M 2017311菌株可应用于发酵制备非达霉素。该制备方法包括下列步骤：

a.菌株采用保藏编号为CCTCC NO：M 2017311的菌株；

b.将按常规方法制备的30％甘油菌丝冷冻管，按摇瓶种子培养基体积的3～5％的接种量接入摇瓶种子培养基，220～260rpm，培养2～3天，得摇瓶种子液；

将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.1～0.2％的接种量接种于种子罐，120～200rpm，培养3～4天，得罐种子液；

将罐种子液按发酵罐培养基体积5～15％的接种量接种于发酵罐培养基，150～200rpm，发酵培养9～12天，收集发酵液中的树脂；

其中培养温度均为26～30℃。

其中所述的摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源1～4.5g，氮源4～7.7g，无机盐0.1～0.4g，其余为水；

种子罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源1.5～6g，氮源5～9g，无机盐0.2～0.6g，其余为水；

发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源4.5～10g，氮源1.7～5g，无机盐0.8～1.8g，树脂3～6g，其余为水；

其中所述的培养基各组分在培养基中比例，摇瓶种子培养基优选比例为：每100mL培养基中，碳源2～3g，氮源5～7g，无机盐0.2～0.3g，其余为水；

种子罐培养基各组分在培养基中的优选比例为：每100mL培养基中，碳源2～4g，氮源6～8g，无机盐0.3～0.5g，其余为水；

发酵罐培养基各组分在培养基中的优选比例为：每100mL培养基中，碳源5～8g，氮源2～4g，无机盐0.8～1.2g，树脂4～5g，其余为水。

其中所述的碳源选自蔗糖、葡萄糖、燕麦粉、D-木糖、D-核糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米糊精、甘油中的一种或几种；氮源选自酸水解酪蛋白、牛肉浸膏、酵母膏、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、酵母粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、麸质粉、棉籽粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、玉米蛋白粉、尿素中的一种或几种；无机盐选自柠檬酸盐、硝酸钾、CaCO₃、K₂HPO₄、MnSO₄.7H₂O、NaCl、MgSO₄.7H₂O、FeSO₄.7H₂O、KH₂PO₄中的一种或几种；树脂选自HZ818、PAD900、HB60中的任一种。

其中所述的培养基优选为：碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或几种；氮源为牛肉浸膏、酵母粉、黄豆饼粉、大豆蛋白胨、玉米蛋白粉、棉籽粉的一种或几种；无机盐为K₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCO₃的一种或几种；树脂为HZ818或PAD900。

本发明所述的保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株是目前可用于大规模生产的菌株。发酵过程是非达霉素生产的重要环节，其发酵水平与工艺优劣直接相关，本发明提供的发酵工艺经过摇瓶发酵和10吨发酵罐试验，其生产能力稳定。经检测，用本发明提供的菌株及发酵培养可获得发酵效价较高的非达霉素，同时发酵副产物较少、产物组分单一、同系物杂峰较少，经HPLC检测，非达霉素归一化含量40～43％。从而为后续的工业化生产提供了良好的基础，降低了后续提取的难度，从而有利于高品质的非达霉素的获得，在工业化生产的应用方面具有很大的优势。

以本发明的菌种制备得到的发酵液与中国专利文献报道的发酵液经HPLC对比，很明显本发明的发酵液杂质少，有效物质浓度较高，有利于大生产。

菌株保藏情况：保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017311。保藏日期为2017年6月7日。

附图说明

图1为中国专利文献03818016.2中的发酵液HPLC图

图2为中国专利文献201310208223.2中的发酵液HPLC图

图3为本发明实施例2发酵液HPLC图

图4为本发明实施例3发酵液HPLC图

图5为本发明实施例4发酵液HPLC图

图6为本发明实施例5发酵液HPLC图

具体实施方式

下面结合具体实施例为本发明进行进一步的描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。

实施例1：保藏号为CCTCC NO：M 2017311菌株的培养及生理生化特征和碳源利用情况

1、保藏号为CCTCC NO：M 2017311菌株培养的形态学特征

将保藏号为CCTCC NO：M 2017311菌株接种于ISP2(酵母膏麦芽浸出粉琼脂)培养基，30℃培养10～14天，观察菌落的形态特征并进行描述。

观察发现该菌落生长丰富，14天直径1～2mm；培养前期菌落近圆形，培养后期边缘不规则突起，中心凹陷；菌丝颜色浅橘色至淡粉红色，无分泌物和可溶性色素产生。

2、保藏号为CCTCC NO：M 2017311菌株生理生化培养特征

菌株在培养基中的培养特征列见下表1所示。

表1 CCTCC NO：M 2017311菌株培养特征

培养基	生长情况	菌苔颜色	可溶性色素
				Isp2酵母膏麦芽浸出粉琼脂培养基	+++	浅橘色	-
Isp3燕麦粉琼脂	++	藕色	-
				Isp4无机盐－淀粉琼脂	++	浅藕色	-
Isp5甘油天门冬素琼脂	+-	浅藕色	-
				ISP6蛋白胨酵母膏浸汁铁琼脂	++	浅黄色	-
ISP7酪氨酸琼脂	+-	浅藕色	-

+：生长一般；++：生长中等；+++：生长丰富；—：缺乏

在ISP2培养基中基丝少，短，不规则分枝，无气丝，在某些琼脂培养基的表面形成指状孢子囊。

此次试验以蛋白胨-磷酸盐为基础培养基，30℃培养，定期进行观察。结果如下表2所示，试验结果显示，该菌株能同化蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、D-木糖、甘油、半乳糖、D-核糖等，不能利用D-***糖、甘露糖、鼠李糖、D-果糖、乳糖、山梨糖等。

表2 CCTCC NO：M 2017311的碳源利用情况

碳源	生长情况
		蔗糖	+
葡萄糖	+
		麦芽糖	+
D-木糖	+
		甘油	+
半乳糖	+
		D-核糖	+
肌醇	±
		棉籽糖	±
D-***糖	-
		鼠李糖	-
甘露糖	-
		D-果糖	-
乳糖	-
		山梨糖	-

+：阳或利用；-：阴或不利用；±：弱阳性或不确定

实施例2：发酵培养制备非达霉素

采用保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株。

1、菌种培养及保存

固体培养基：葡萄糖1g，可溶性淀粉2g，酵母浸出粉1g，酸水解酪蛋白0.5g，琼脂2g，加水到100mL，pH调7.0。

固体培养方法：菌株接种于固体培养基斜面上，30℃培养8～10天。

固体培养结束后，斜面放置4～10℃冷藏备用。

2、摇瓶种子培养

培养基：葡萄糖1g，玉米淀粉0.5g，马铃薯淀粉0.5g，酵母粉1g，大豆蛋白胨1.5g，牛肉浸膏2g，黄豆饼粉0.5g，CaCO₃0.4g，加水到100mL，pH7.0。

装液量：500mL三角瓶里装100mL培养基，121℃灭菌30min。

接种量：5％(V/V)的30％甘油菌丝冷冻管

培养温度：30℃

培养时间：3天

摇床转速：260rpm

摇瓶种子培养方法：将30％甘油菌丝冷冻管解冻后按照接种量5％(V/V)接摇瓶种子培养基中，待菌丝长起，有明显挂壁现象且菌浓为12％以上，将1L摇瓶种子培养液，接入1000L种子罐中。

30％甘油菌丝冷冻管的制作：在无菌状态下，将灭菌后的甘油约30mL加入生长好的种瓶里，摇匀制成约30％甘油菌丝悬浮液，然后分装至小试管中(5mL/支)，放置-20℃低温冰箱冷藏备用。

3、种子罐种子培养基

种子罐种子培养基比例与摇瓶种子培养基比例一致，加水至500L，pH调7.0。

装量：1000L种子罐内装培养基500L，121℃灭菌30min。

种子罐培养方法：培养好的1L摇瓶种子液接入种子罐中，30℃，4天。培养过程中控制罐压：0.04MPa，搅拌速度120rpm，通气量1：1(V/V)。

培养后，镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌，菌浓≥12％。

4、发酵罐培养

发酵培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中含葡萄糖1g，麦芽糖5g，玉米淀粉4g，黄豆饼粉1.5g，酵母膏2g，大豆蛋白胨1.5g，硝酸钾0.5g，NaCl 0.1g，CaCO₃0.2g，HZ818 6g，泡敌0.15％，其余为水，pH7.0。

装量：10吨发酵罐内装培养基6吨

发酵罐培养方法：培养好的500L罐上种子液接入发酵罐中，30℃，12天。培养过程中控制罐压：0.04MPa，搅拌速度160rpm，通气量1：1.3(V/V)。

发酵终点判断：菌丝染色深，空泡较多，菌丝有断裂、自溶现象。

放罐过滤，得到HZ818，经常规方法浸泡，检测，非达霉素HPLC归一化含量为40％(见附图3)。

实施例3：发酵培养制备非达霉素

(1)发酵培养非达霉素

采用保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株。

摇瓶种子培养：每100mL培养基中含葡萄糖0.5g，玉米淀粉0.5g，大豆蛋白胨5g，酵母粉0.2g，牛肉浸膏1.5g，黄豆饼粉1g，CaCO₃ 0.1g，其余为水，pH自然。接入5％(V/V)的30％甘油菌丝冷冻管，220rpm，28℃培养2天得种子液。

种子罐培养：每100mL培养基中含葡萄糖0.5g，酵母粉0.5g，玉米淀粉1g，大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏1.5％，棉籽粉1g，玉米浆粉1g，KH₂PO₄ 0.5g，CaCO₃ 0.1g，其余为水，pH自然。种子接种量0.1％(V/V)，150rpm，30℃培养4天。

发酵罐培养：每100mL培养基中含葡萄糖1g，麦芽糊精3g，酵母粉1g，麸质粉1g，可溶性淀粉4g，KH₂PO₄ 0.3g，FeSO₄.7H₂O 0.2g，硝酸钾0.5g，HZ818 3g，泡敌0.1％，CaCO₃0.1g，其余为水，pH自然。种子接种量5％(V/V)，180rpm，30℃培养9天。

放罐过滤，得到HZ818，经常规方法浸泡，检测，非达霉素HPLC归一化含量为42％(见附图4)。

实施例4：发酵培养制备非达霉素

(1)发酵培养非达霉素

采用保藏编号为CCTCC NO：M 2017311的菌株

摇瓶种子培养：每100mL培养基中含蔗糖1g，可溶性淀粉2g，大豆蛋白胨0.5g，牛肉浸膏0.5g，麦芽浸出粉2g，黄豆饼粉1g，CaCO₃0.2g，其余为水，pH6.8。接入3％(V/V)的30％甘油菌丝冷冻管，250rpm，28℃，培养3天得种子液。

种子罐培养：每100mL培养基中含蔗糖1g，可溶性淀粉2g，大豆蛋白胨1g，牛肉浸膏1g，麦芽浸出粉2g，黄豆饼粉2g，CaCO₃0.2g，加水至500L，pH6.8。种子接种量0.2％(V/V),180rpm，26℃，培养4天。

发酵罐培养：每100mL培养基含葡萄糖2g，麦芽糊精1g，酵母粉1g，棉籽粉0.5g，玉米淀粉2g，K₂HPO₄ 0.3g，FeSO₄.7H₂O 0.2g，尿素0.2g，硝酸钠0.5g,CaCO₃0.4g，HB60 4g，泡敌0.15％，其余为水，pH6.8。种子接种量8％(V/V)，150rpm，26℃培养10天。

放罐过滤，得到HB60，经常规方法浸泡，检测，非达霉素HPLC归一化含量为43％(见附图5)。

实施例5：发酵培养制备非达霉素

(1)发酵培养非达霉素

采用保藏编号为CCTCC NO：M 2017311的菌株

摇瓶种子培养：每100mL培养基中含葡萄糖1.5g，玉米糊精3g，大豆蛋白胨3g，黄豆饼粉2g，酵母膏2g，CaCO₃0.3g，其余为水，pH自然。接入5％(V/V)的30％甘油菌丝冷冻管，240rpm，30℃培养2天得种子液。

种子罐培养：每100mL培养基中含葡萄糖2.0g，玉米淀粉4g，酵母粉2g，玉米蛋白粉3g，黄豆饼粉2g，酵母膏1g，CaCO₃0.3g，其余为水，pH自然。种子接种量0.1％(V/V)，200rpm,28℃培养3天。

发酵罐培养：每100mL培养基中含甘油0.5g，麦芽糊精4g，酵母粉1g，玉米蛋白粉3g，KH₂PO₄ 0.5g，硝酸钠1g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，MnSO₄.7H₂O 0.1g，PAD900 5g，泡敌0.2％，CaCO₃ 0.3g，其余为水，pH7.0。种子接种量15％(V/V)，200rpm，30℃培养9天。

放罐过滤，得到PAD900，经常规方法浸泡，检测，非达霉素HPLC归一化含量为41％(见附图6)。

Claims

1.一种桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)FID1307，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2017311，保藏日期为：2017年6月7日。

2.如权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株在发酵制备非达霉素中的应用。

3.如应用权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2017311的菌株发酵制备非达霉素中的方法，其特征在于包括下列步骤：

a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCC NO：M 2017311的菌株；

其中培养温度均为26～30℃。

4.如权利要求3所述的发酵制备方法，其特征是：

摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源1～4.5g，氮源4～7.7g，无机盐0.1～0.4g，其余为水；

发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源4.5～10g，氮源1.7～5g，无机盐0.8～1.8g，树脂3～6g，其余为水。

5.如权利要求4所述的发酵制备方法，培养基各组分在培养基中的优选比例为：

摇瓶种子培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源2～3g，氮源5～7g，无机盐0.2～0.3g，其余为水；

种子罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源2～4g，氮源6～8g，无机盐0.3～0.5g，其余为水；

发酵罐培养基各组分在培养基中的比例为：每100mL培养基中，碳源5～8g，氮源2～4g，无机盐0.8～1.2g，树脂4～5g，其余为水。

6.如权利要求4或5所述的制备方法，其中所述的培养基各组分为：碳源选自蔗糖、葡萄糖、燕麦粉、D-木糖、D-核糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉、玉米糊精、甘油中的一种或几种；氮源选自酸水解酪蛋白、牛肉浸膏、酵母膏、酵母浸出粉、麦芽浸出粉、酵母粉、大豆蛋白胨、蛋白胨、麸质粉、棉籽粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、玉米蛋白粉、尿素中的一种或几种；无机盐选自柠檬酸盐、硝酸钾、CaCO₃、K₂HPO₄、MnSO₄.7H₂O、NaCl、MgSO₄.7H₂O、FeSO₄.7H₂O、KH₂PO₄中的一种或几种；树脂选自HZ818、PAD900、HB60中的一种。

7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述的培养基优选为：碳源为葡萄糖、玉米淀粉中的一种或几种；氮源为牛肉浸膏、酵母粉、黄豆饼粉、大豆蛋白胨、玉米蛋白粉、棉籽粉的一种或几种；无机盐为K₂HPO₄、KH₂PO₄、CaCO₃的一种或几种；树脂为HZ818或PAD900。