KR20050010451A

KR20050010451A - 비만증 또는 당뇨병 예방 및/또는 치료용 미생물

Info

Publication number: KR20050010451A
Application number: KR1020030049716A
Authority: KR
Inventors: 송수한; 강선경; 김재호; 박용현; 박한오
Original assignee: (주)바이오니아
Priority date: 2003-07-21
Filing date: 2003-07-21
Publication date: 2005-01-27
Also published as: JP2005040123A; JP4248985B2; KR100794702B1

Abstract

본 발명은 장내 생존성이 우수하면서, 장내에서 다당류를 고효율로 생성하는 비만증 또는 당뇨병 예방 및 치료용 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장내로 유입되는 포도당, 자당 또는 과당 등을 체내로 흡수되지 아니하는 고분자 물질로 전환시킴으로써 저당류의 장내흡수를 경쟁적으로 저해하여 비만증 또는 당뇨병을 예방하거나 치료할 수 있게 하는 신규한 미생물, 이들의 약학적 유효량을 함유하는 조성물 및 이들을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

비만증 또는 당뇨병 예방 및/또는 치료용 미생물{Microorganisms which are taken effects in preventing and/or treating Obesity or Diabetes Mellitus}

본 발명은 장내 생존성이 우수하면서, 장내에서 다당류를 고효율로 생성하는 비만증 또는 당뇨병 예방 및 치료용 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장내로 유입되는 포도당, 자당 또는 과당 등을 체내로 흡수되지 아니하는 고분자 물질로 전환시킴으로써 저당류의 장내흡수를 경쟁적으로 저해하여 비만증 또는 당뇨병을 예방하거나 치료할 수 있게 하는 신규한 미생물, 이들의 약학적 유효량을 함유하는 조성물 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물에 관한 것이다.

비만증은 아직도 원인이 명확히 밝혀지지 않은 여러 가지 요인들에 의해서 복합적으로 발생하는 만성적인 질환으로 알려져 있다. 비만증은 고혈압, 당뇨병, 심혈관 질환, 담석, 골관절염, 수면 무호흡증(sleep apnea), 호흡장애, 자궁내막, 전립선, 유방 또는 대장암 등을 유발하는 요인이 되고 있다.

1999년 미합중국 국립보건원(NIH) 보고서(The Evidence Report: Clinical guidelines on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults, 1999, NIH)에 의하면, 미국인 가운데 약 9,700만 명이 비만 상태에 있으며, 비만과 관련된 질환 중의 하나인 제2형 당뇨(type II diabetes mellitus) 환자가 약 1,570만 명에 이른다. 또한 비만증과 관련된 질환에 의하여매년 전세계적으로 약 20만 명이 사망한다고 알려져 있다(Dan Ferber, Science, 283, p 1423-1424, 1999).

당뇨병은 환자나 가족 뿐만 아니라 사회적으로도 개인적 및 재정적 비용이 상당히 요구되는 전세계적으로 만연한 만성 질환의 하나로서, 별개의 병인 및 발병 기작을 갖는 상이한 당뇨병 유형들이 존재한다. 예를 들면, 진성 당뇨병은 과혈당증 및 당뇨를 특징으로 하며, 인슐린의 부적절한 생성이나 이용으로 야기되는 탄수화물 대사 장애이다.

비인슐린-의존성 진성 당뇨병(이하, ' NIDDM ' 이라 한다) 또는 유형 II 당뇨병은 인슐린이 적절하게 생성되어 이용되지만, 말초 조직에서 인슐린이 매개된 글루코오스 대사 및 기타 대사에 결점이 있는 성인에게서 주로 나타나는 당뇨병이다.

NIDDM은 3가지 주요한 대사적 이상, 인슐린이 매개하는 글루코오스 처리에 대한 저항, 영양물로 자극되는 인슐린 분비 능력의 손상 및 간에서 글루코오스의 과생성에 기인한다. NIDDM 치료 즉, 혈당 수준의 조절에 실패하면 심혈관 질환으로 인한 사망 및 망막증, 신장병 및 말초 신경병을 비롯한 다른 당뇨성 합병증이 야기될 수 있다.

NIDDM의 치료법에는 NIDDM 환자의 혈당 수준을 조절하는 방법으로서, 식이요법 및 운동 뿐만 아니라 경구적 혈당강하제인 술포닐 요소(Sulfonylurea)계 약물 및 비구아니드(biguanide)계 약물 등이 사용될 수 있다. 또한, 메트포민 및 아카르보스 화합물도 최근에 NIDDM 환자를 치료하는데 사용되고 있다. 그러나, 몇몇환자들은 식이요법과 운동 및/또는 상기한 치료 화합물의 사용에 의해서도 과 혈당증을 적절하게 조절할 수 없어, 외인성 인슐린의 투여가 요구되기도 한다.

환자에게 주사로 인슐린을 투여하는 것은 고가이며 고통스러운 점 이외에도, 환자에게 해로운 다양한 상황 또는 합병증을 야기할 수 있다. 예를 들면, 인슐린 반응(저혈당증)은 인슐린 투여량의 착오, 결식, 불규칙한 운동 또는 특별한 원인 없이도 야기될 수 있다. 또한, 국소적 및/또는 전신 알레르기 반응 및 인슐린에 대한 면역학적 저항성이 발생될 수도 있다.

비만증 및 당뇨병의 예방 또는 치료방법은 크게 식이-운동요법, 수술 요법 및 약물 요법이 있다. 식이-운동 요법은 저칼로리-저지방 섭취와 산소를 소비하는 육체의 활동을 통한 치료 방법인데, 이는 인내심을 가지고 반복적, 지속적으로 수행되어야 하기 때문에 대중적인 효과를 보기는 어려운 것으로 인식되고 있다.

또한, 수술요법은 외과적 수술을 통해 체지방을 물리적으로 제거하는 방법으로서 단기간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만, 시술과정을 거쳐야 하는 점, 효과의 지속성이 없다는 점, 비용이 많이 든다는 점 등으로 활용이 제한되고 있다.

따라서, 혈당의 감소, 혈당 흡수의 저해, 인슐린의 작용 강화 및 식욕의 감소를 유발하는 약제들에 의하여 비만증 또는 비만형 당뇨병을 치료 또는 예방하고자 하는 약물 요법이 활발히 연구되고 있는데, 현재까지 개발된 비만증 및 비만형 당뇨병의 예방 및 치료를 위한 약제는 다양한 생리학적 메커니즘을 이용하는데 중점을 두고 있다.

따라서, 현재 개발된 다양한 약제들 중에서 인체의 대사 균형에 손상을 주지않으면서 천연물질이라는 장점이 있는 식이섬유가 가장 유용한 비만 예방 및 치료 제제로 인정되고 있다.

종래의 미생물 식이섬유를 생성하는 미생물로는 글루코노박터 속(Gluconobacter sp.), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum), 아세토박터 한세니(A. hansenii)., 아세토박터파스테리아누스(A. pasteurianus), 아세토박터 아세티(A. aceti), 라이조븀 속(Rhizobium), 알칼리게네스 속(Alcaligenes), 살리나 속(Sarcina), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 사케(L. sake), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 락토바실러스 델브륙키의 아종(L. delbrueckii subsp.), 락토바실러스 헬베티쿠스글루코스의 변종(L. helveticusglucose var. jugurti), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 불가리쿠스 속(Bulgaricus), 캄페스트리스 속(Campestris), 스핑고모나스 속(Sphingomonas) 등을 이용하고 있다.

상기 이들 미생물이 생성하는 식이섬유는 각종 식품의 안정제, 증점제, 유화제, 흡습제 등과 의약품, 화장품의 재료로 사용되고 있는데, 현재 미생물 셀룰로오스, 크산, 아세탄 등과 해조류에서 정제한 식이섬유인 구아 검(Guar gum), 로커스트 빈 검(Locust bean gum), 카라기난(carrageenan), 알기네이트(alginate) 또는 한천(agar) 등이 이미 상품화되어 있다.

상기한 미생물 중 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집(normal microbial flora)의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로서 오래 전부터 알려져 왔다(Bibel, D. J., ASM News, 54:661-665, 1988: Reid, G. and A. W. Bruce, In H. Lappin-Scott (ed.), Bacterial biofilms. Cambridge University Press, Cambridge, England, p. 274-281, 1995; Reid G., A. W. Bruce, J. A. McGroarty, K. J. Cheng, and J. W. Costerton, Clin. Microbiol. Rev., 3:335-344, 1990). 일반적으로 락토바실러스 균주의 서식처는 동물의 소화기관(L. acidophilus, L. intestinalis, L. johnsonii, L. fermentum, L. reuteri등), 질내 점막(L. vaginalis, L. gasseri), 식품(wine-L. hilgardii), 유산균 음료(L. kefir, L. kefiranofaciens; cheese-L, casei), 식초(L. acetotolerans), 구강(L. oris), 누룩(L. sake, L. homohiochi), 과일 주스(L. kumkeei, L. mali, L. suebicus), 발효된 소시지 또는 어류(L. farciminis, L. alimentarius) 등이다.

실제로 많은 사람들이 건강한 장을 유지하고, 요로 질내 감염(urogenital tract infection)을 막기 위해 락토바실러스 속의 균주를 함유한 건강 보조제를 사용하고 있다. 최근에는 설사 및 변비의 예방 또는 요로 감염의 예방 외에 락토바실러스의 다양한 생리활성 기능(probiotic activity) 즉, 면역력의 조절, 혈중 콜레스테롤 수치 조절, 류마티즘의 치료, 암의 예방, 유당에 대한 민감성 완화, 아토피성 피부염에 대한 효과 등에 대한 중요성과 관심이 증가하고 있다.

미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주 기탁기관(ATCC)에 기탁된 262가지의 락토바실러스 균주 모두가 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safety Level) 1'로 분류되어 있다.(Microbiol. Rev., Apr. 23:2 153-77, 1999; FEMS Microbiol. Rev., Sep. 7:1-2, 113-30, 1990. 참조). 최근 락토바실러스가 합성하는 세포 외 식이섬유에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이들 균주가 세포 외 식이섬유를 만드는 기작에는 많은 유전자가 관여하기 때문에 매우 복잡하며, 합성되는 식이섬유의 양 또한 매우 적은 것으로 알려져 있다(Int. J. Food Microbiol., Mar 3 40:1-2, 87-92, 1998; Current Opinion in Biotechnology, 10:498-504, 1999; Current Opinion in Microbiology, 2:598-603, 1999; Appl. Environ. Microbiol., Feb 64:2, 659-664, 1998; FEMS)

상기한 바와 같이, 현재까지 비만증 또는 당뇨병의 치료에 관하여 다양한 연구와 노력이 있어 왔으며 지금까지 여러 가지 화합물들이 비만증 또는 당뇨병 치료제로 개발되었으나, 여전히 부작용이 있고 체내에 축적된 체지방, 단백질 등을 강제적으로 배출하는 기능을 하기 때문에 비만증 또는 당뇨병을 원천적으로 억제하거나 치료하는 획기적인 치료제는 아직까지 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 장내에서 생장하면서 소화 효소에 의해 분해되는 저당류 탄수화물을 흡수하여, 체내로 흡수되지 아니하는 고분자량의 물질로 전환시킴으로써, 장에서 체내 흡수되는 저당류의 양을 크게 줄일 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물의 약학적 유효량을 함유하여, 체내로 흡수되는 저당류의 양을 원천적으로 감소시킴으로써, 비만증 또는 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 미생물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 미생물에 의한 프로바이오틱스(probiotics) 효과를 검증하는 도이다. 여기에서 A 는 락토바실러스 루테리 ATCC23272를, N은 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 미생물을 생균 형태로 섭취한 랫트의 체중 변화를 도시한 도표이다. 여기에서, a는 초기 체중(g)을, b는 40일간 투여한 후의 체중(g)을, c는 40일간 투여한 후의 체중 증가량(g)을 도시한 것이다.

도 3은 본 발명에 따른 미생물을 유산균 발효유 형태로 섭취한 랫트의 체중 증가 변화를 도시한 도표이다. 여기에서, a는 초기 체중(g)을, b는 60일간 투여한 후의 체중(g)을, c는 60일간 투여한 후의 체중 증가량(g)을 도시한 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 랫트의 사료 섭취량의 변화를 도시한 도표이다. 여기에서, a는 본 발명의 미생물의 생균 형태 투여군을, b는 유산균 발효유(요구르트) 형태 투여군에 대한 결과이다.

도 5는 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 랫트의 대사 효율 변화를 도시한 도표이다. 여기에서, a는 본 발명의 미생물의 생균 형태 투여군을, b는 유산균 발효유(요구르트) 형태 투여군에 대한 결과이다.

도 6은 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 랫트의 혈중 콜레스테롤 농도 변화를 도시한 도표이다.

상기 본 발명의 미생물은 장내에서 생장이 가능하고, 인체에 무해하며, 저당류를 장내에서 흡수되지 아니하는 고분자량의 물질인 다당류로 전환시키는 미생물로서, 락토바실러스 퍼멘텀(L.fermentum) NM 316인 것이 바람직하다.

본 발명의 미생물들은 통상적으로, 투여 경로에 따라 선택되는 약학적 담체 및 부형제, 또는 보조 유효 성분 등과의 혼합에 의해서 얻어지는 정제 또는 캡슐과 같은 단위 형태로 투여 된다. 본 발명의 조성물의 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로오스,폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유 등이 포함된다.

본 발명의 미생물 조성물은 윤활제, 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 당업계의 공지된 방법을 이용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복 제제로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 조성물은 통상적인 캡슐화 방법을 사용하여 캡슐 형태의 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 표준 담체를 사용하여 동결 건조시킨 본 발명의 미생물을 함유하는 펠렛을 제조한 후, 이를 경질의 젤라틴 캡슐 내에 충전시키거나 본 발명의 미생물과 임의의 적절한 제약학적 담체, 예를 들어 수성 검, 셀룰로오스, 규산염 또는 오일을 사용하여 현탁액 또는 분산액을 제조한 후, 이러한 분산액 또는 현탁액을 연질의 젤라틴 캡슐 내에 충전시킬 수 있다.

본 발명의 제제는 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장 내에 방출될 수 있도록 하는 제약학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다.

본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl용액과 같은 인공 위즙을 36 내지 38 ℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH6.8의 KH₂PO₄완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.

본 발명의 장용 피복은 1 개의 코어에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100㎛, 바람직하게는 20 내지 80㎛인 경우가 장용 피복으로서의 만족스러운 결과를 나타내었다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 문헌 [L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3 edit., 1986, p. 365-373, H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359, Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4 edit., vol. 7, pp. 739-742, 및 766-778, (SpringerVerlag, 1971), 및 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 13 edti., pp. 1689-1691(mack Publ., Co., 1970)에 열거되어 있고, 셀룰로오스 에스테르 유도체, 셀룰로오스 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 장용 피복은 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 및 트리멜리테이트 그리고 메타크릴산 공중합체 예를 들면, 메틸아크릴산 40% 이상, 및 특히 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트를 포함하는 메틸아크릴산 및 그의 에스테르로부터 유도된 공중합체로부터 제조된다. 롬 게엠베하사 (Rohm GmbH, 독일)에 의해 시판 중인 엔드라지트 엘(Endragit L 100-55) 제품이 본 발명의 장용 피복의 재료로 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복용 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트는 약 45 내지 90 cP의 점도와, 17 내지 26%의 아세틸 함량 및 30 내지 40%의 프탈레이트 함량을 가지며, 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트는 약 15 내지 20 cP의 점도와, 17 내지 26 %의 아세틸 함량, 25 내지 35%의 트리멜리틸 함량을 갖는다. 이스트맨 코닥 캄파니(Eastman Kodak Company)사가 시판하는 셀룰로오스 아세테이트 트리멜리테이트 제품이 본 발명의 장용 피복 재료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복 재료로서 사용되는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트는 130,000 달톤의 분자량을 갖고, 5 내지 10%의 히드록시프로필 함량, 18 내지 24%의 메톡시 함량 및 21 내지 35%의 프탈릴 함량을 갖는다. 이스트맨 코닥사가 시판하는 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트가 본 발명의 장용 피복의 재료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복에 사용될 수 있는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트는 신-에쯔 케미칼사 (Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., 일본) 가 시판하는 HP50이며, 이는 6 내지 10%의 히드록시프로필 함량, 20 내지 24%의 메톡시 함량, 21 내지 27%의 프탈릴 함량과 84,000 달톤의 분자량을 갖는 제품이다. 또한 신-에쯔 케미칼사가 HP55로 시판중인, 히드록시프로필 함량이 5 내지 9 %, 메톡시 함량이 18 내지 22 %, 프탈릴 함량이 27 내지 35 %이고 분자량이 78,000 달톤인 제품이 본 발명의 장용 피복 재료로 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올 등의 알콜, 아세톤 등의 케톤, CH₂Cl₂와 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3(코팅 재료 대연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 bar의 분무압으로 만족할 만한 결과가 얻어진다.

본 명세서의 " 약학적 유효량 " 은 포유 동물의 장내에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 감소시킬 수 있는 본 발명 미생물의 최소량을 의미하며, 본 발명의 조성물에 의하여 체내에 투여 되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 조정된다.

본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유 동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 제약학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 미생물의 예정된 양을 함유한다.

성인 환자의 경구 투여용 투여 단위는 본 발명의 미생물 0.1g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물 경구 투여량은 일회에 0.1 내지 10g, 바람직하게는 0.5 내지 5g이다. 그리고 본 발명의 미생물의 일일 약학적 유효량은 0.1g이다.

그러나, 투여량은 환자의 체중, 비만 증상의 심각도 및 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러 회로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.

본 명세서의 "조성물"은 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하는 것은 아니고, 발효유, 젤리, 푸딩 등의 통상적인 식품, 기능성 식품 또는 건강 보조 식품까지 포함하는 개념이다.

본 발명의 조성물을 주기적으로 복용하는 경우, 장내에 본 발명의 미생물들이 균총을 이루면서 인체가 당류를 흡수하는 것을 경쟁적으로 방해할 뿐 아니라, 이들 당류를 이용하여 미생물이 생성한 비소화성 다당류가 장내 유용균의 생육조건을 좋게 하고 장 운동을 자극함으로써 결과적으로 본 발명의 조성물이 비만증 또는 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있게 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 비만증 또는 당뇨병의 예방 및 치료용 미생물은 ① 장내에서 증식이 가능하며, ② 저당류를 빠르게 흡수하여 섬유상 물질과 같은 비소화성 또는 난소화성 고분자 물질로 전환시키고, ③ 인체 또는 가축에 해가 없다는 조건을 만족시킨다. 따라서, 상기의 3가지 조건을 만족시키는 공지의 미생물을 각종 기탁기관으로부터 분양 받아 본 발명의 조성물에 사용할 수 있으며, 신규의 미생물을 새로 분리하여 사용할 수도 있다.

본 발명에서는 다당류를 생성하는 유산균을 분변으로부터 분리하여, 그들의 다당류 생성능력, 당 소비속도, 위산 및 담즙산에 대한 내성실험을 통해 돌연변이 모균주를 선택한 후, 이들을 화학물질을 이용하여 돌연변이 시켜 다당류를 다량 생성하는 NM316 균주를 선별하였다. 선별된 NM316 균주는 확인 결과 락토바실러스 퍼멘텀 임을 확인하였고, ' 락토바실러스 퍼멘텀 NM316' (이하, ' 락토바실러스 NM316 ' 이라 한다)이라 명명하여 이를 기탁하였다(KCTC 10458BP).

이렇게 선별된 본 발명의 락토바실러스 NM316 균주에 의하여 생성되는 다당류가 장내 소화효소에 의해 분해되는지 여부를 확인한 결과, 락토바실러스 NM316 균주에 의하여 생성된 다당류는 장내 소화효소에 의해 분해되지 않으며 최종적으로는 체내로 흡수되지 않고 배출 됨을 알 수 있었다.

본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 균주를 생균 형태와 유산균 발효유 형태로 랫트에게 투여한 결과, 소량의 다당류를 생성하는 대조군과 비교하여 볼 때, 체중의 변화에 있어서, 생균 형태 투여군에서는 대략 16.1% 의 체중 증가가 억제되었고, 유산균 발효유 형태 투여군에서는 6.3%의 체중 증가가 억제되는 것으로 나타났다. 그리고, 사료 섭취량에 있어서는 생균 형태 투여군에서는 대략 10.7% 적게 섭취하였고, 유산균 발효유 형태 투여군에서는 대략 4.6% 더 많이 섭취하는 것으로 확인되었다.

상기 결과들을 근거로 하여 사료 섭취량을 체중 증가량으로 나눈 값으로 표현한 대사 효율의 측면에서 계산한 결과, 대조구와 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 균주에서, 생균 형태 투여군의 경우는 격일 주기로 측정했을 때 대략 6.4%, 유산균 발효유 형태 투여군에서는 12일을 주기로 측정했을 때에는 대략 28.5% 더 높은 대사 효율을 보였다. 따라서, 본 발명의 미생물을 섭취할 경우 사료 섭취량이 많아지면 체중 증가는 대조군에 비해 억제되는 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 미생물을 섭취하는 경우에 혈중 콜레스테롤의 변화를 확인한 결과, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 균주는 생리식염수 투여군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 따라서, 본 발명의 미생물 및 이 미생물이 유효성분으로 함유된 식품 조성물이 비만증, 당뇨병 및 순환기성 질환(동맥경화, 심근경색 등)에 효과가 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리 범위를 본 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예1. 다당류를 다량 생성하는 균주 획득

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 신규 미생물을 하기와 같은 방법으로 분리 및 개선하였다. 먼저 점질물을 다량 생산하는 유산균을 찾기 위해 분변 시료는 대한민국, 청주 태생의 6 개월간 모유 만을 수유한 건강한 유아로부터 채취하였다. 분변을 생리 식염수로 10 배 수준으로 희석하여, pH 1.5의 MRS 액체 배지에 2 %를 접종하고, 37 ℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 이를 MRS 배지와 유산균 선택배지(LBS agar)에 도말하고 37 ℃에서 48시간 배양하여, 각 평판으로부터 5 - 30 개의 콜로니를 획득하였다. 각각의 콜로니는 이쑤시게를 이용하여 각각의 점성을 확인하고, 끈적임이 있는 균락을 점성물질 생성 균주로 선발하였다. 선발된 균주는 MRS 아가 배지에 2회 이상 도말하여 순수 분리하였다. 각각의 군락은 선택적으로 락토바실러스 만을 선택적으로 선별할 수 있는 프라이머를 사용한 PCR 방법에 의해 락토바실러스 만을 선별 분리하였다.

모유를 수유한 영아로부터 분리된 각각의 균들을 MRS 배지에 37℃, 6시간 배양한 후 원심분리하여 생리식염수(PBS. pH 7.0) 완충액으로 2회 세척한 후, 동량의 생리 식염수에 현탁하고 NTG(N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine)를 최종농도 200 ㎍/㎖이 되도록 첨가하여 37℃에서 30 내지 120분 간 배양하였다. 원심분리 하여 얻어진 균체는 생리 식염수로 2 회 세척하여 다시 MRS 액체 배지에 3 차례 반복 배양하고, 고농도의 과당이 함유된 MRS배지 (5 % 과당, 1 % 쇠고기 추출물, 1% peptone, 0.5% 효모 추출물, 0.1% 트윈-80(Tween-80), 0.2% 시트르산 암모늄, 0.5% 아세트산 나트륨, 0.01% MgSO4, 0.01% MnSO4, 0.05% L-cysteine-HCl)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다.

평판에 형성된 콜로니를 이쑤시게로 각각의 점성을 확인하여 점성이 증가한 콜로니를 선별한 후, 이를 다시 MRS 액체 배지에 접종하여 배양하였다. 24 시간 동안 배양이 완료된 균주 배양액의 다당류 생성 수율을 계산하기 위하여 각각의 튜브에 0.5 ㎖씩 담고 13,000(g)에서 20분 간 원심분리하여 상등액을 취하고, 동량의 40% 트리클로로-아세테이트(Trichloro-acetate)를 가하여 교반시킨 후, 재차 13,000(g)에서 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액에 2배의 차가운(4℃) 에탄올을 넣고 혼합하였다. 이를 다시 6,000(g)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 조심히 버리고 초기 부피와 동량의 증류수를 넣어 다당류를 현탁시키고 페놀-황산 법으로 다당류 량을 측정하고 다당류 효율(EPS(mg/L)/O.D(650nm))을 측정하여 한 균주를 획득하였다.

락토바실러스 퍼멘텀 NM316 균주는 표 1에 나타난 바와 같이, 대조 미생물인 락토바실러스 루테리 ATCC23272 에 비해 5배 이상의 다당류 생성 능력을 보임을 알수 있었다.

락토바실러스 루테리 ATCC23272와 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 균주의 다당류 생성량

균주명	생균수 (cfu/ml)	O.D(650nm) ①	EPS(mg/L) ②	EPS수율 (②÷①)
락토바실러스 루테리 ATCC 23272	6.05 X 10⁸	4.38	427	97.4
락토바실러스 퍼멘텀 NM316	7.3 X 10⁶	1.41	714	506.4

실시예 2. 락토바실러스 NM316균주(KCTC 10458BP)의 특성 및 동정

다당류 생성량이 증대된 락토바실러스 NM316 의 계통을 파악하기 위해 균주를 각각 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 12 시간 동안 정치 배양하였다. 배양액을 4℃, 6,000(g)에서 원심분리하여 미생물을 수득하고, 이로부터 CTAB/NaCl 방법을 사용하여 핵산을 추출하였다. 핵산 추출물을 16S rRNA 교감 프라이머(16S rRNA consensus primer)를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 결과, 락토바실러스 퍼멘텀 임을 확인하였다.

그리고, API 50 CH Kit(BioMerieux ㏇)를 이용한 당 이용성을 비교한 결과, L-아라비노스, 리보오스, 갈락토스, 글루코스, 말토스, 락토스, 멜리비오스, 과당에 대한 당 이용성은 높았고, 이 외에 D-라피노스, 글루코네이트에서는 낮은 성장율을 보였다.

상기한 바와 같이, 표현형과 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통하여, 본 발명의 미생물을 ' 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 ' 균주로 명명하고, 이를 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 의거, KCTC(Korean Collection forType Culture)에 기탁하였다(KCTC 10458BP).

실시예 3. 다당류의 장내 소화 효소에 의한 분해성

본 발명의 락토바실러스 NM316 균주에 의하여 장내 생성되는 다당류의 장내 소화 효소에 의한 분해 여부를 확인하기 위하여 정제된 다당류를 인산 완충액에 녹인 후, 랫트(rat)의 소장에서 분리한 소화효소를 농도 별로 첨가하여 120 분간 반응시키고 이를 효소 비색법을 이용한 trinder kit (cat. 315-500 Sigma, USA)를 이용하여 결과를 측정하였다.

표 2에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 NM316 균주에 의해 생성된 다당류는 장내 소화효소에 의하여 분해되지 않음을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 락토바실러스 NM316 균주에 의해 생성된 다당류는 체내 흡수되지 않고 체외로 배출됨을 알 수 있었다.

장내 소화효소에 의한 다당류의 분해

기질의종류	기질농도(㎍/㎖)	효소 농도(㎍/㎖)
		1250	625	312.5	156.25	78.13	39.06
과 당	6.85	172.52*	144.39	196.71	125.32	78.92	45.00
다당류	5	0.51	0.48	0.80	0.38	0.29	0.19

실시예 4. 락토바실러스 NM316 균주의 프로바이오틱스 효과 확인

락토바실러스 NM316 균주의 프로바이오틱스 효과를 확인하기 위하여 먼저 대장균(E,coli)을 16 시간 LB 액체 배지에서 배양하여 1 X10⁵- 1 X 10⁶농도로 희석하였다. 이를 멸균된 면봉에 적셔 균일하게 도말한 후, 락토바실러스 NM316 배양 상등액을 20배 농축하여 멸균된 8mm 디스크페이퍼(어드벤텍, 일본)에 40㎕의 발효액을 흡수시켜 도말한 한천 평판 배지 위에 올려 놓았다.

37℃에서 48시간 배양한 후, 생육 억제 능력을 비교하기 위해 디스크 주변에 형성되는 투명지역의 크기를 확인하였다. 발효액에 의한 대장균 성장 억제환의 확인 결과 락토바실러스 루테리 ATCC23272, 락토바실러스 NM316 두 균주 모두에서 투명환 형성을 확인할 수 있었다. 따라서 락토바실러스 NM316은 유해균의 성장을 억제하는 유산균 고유의 프로바이오틱스 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 5. 락토바실러스 NM316 섭취 시 체중, 식이량의 변화 및 그에 따른 대사 효율의 변화

본 발명에서 사용된 동물은 SD 랫트(Sprague Dawley rat)로 5주령의 수컷으로 하였으며 생리식염수(PBS) 투여군, 락토바실러스 루테리 ATCC23272 투여군 및 락토바실러스 NM316균주 투여군으로 구성된 그룹으로 대별하여 각 군 당 11 마리씩을 실험하였다. 상기 실험군에 따라 락토바실러스 루테리 ATCC23272와 락토바실러스 NM316 균주는 1일 2회 투여하였으며, 1회 투여 시 총 균체량은 3 X 10¹¹cfu 농도로 하여 경구 투여하는 방식을 취하였다. 도 4의 a는 본 발명에 따른 미생물을 생균 형태로 섭취한 랫트의 사료 섭취량의 변화를 도시한 것이다. 여기에서, 랫트의 체중과 사료 섭취량은 격일 주기로 측정하여 9마리의 평균값을 나타낸 것이다.

도 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 본 실험에서 40일 간 투여한 결과, SD 랫트의 체중 변화가 투여 개시일로부터 12일 경과 이후에 서서히 나타나기 시작하였으며, 최종 40일 경과 시의 측정치는 대조구인 PBS 투여군에 비해 약 10.3% 가량 억제되는 결과를 얻었다.

장기 투여 시 SD 랫트의 체중변화

	0 day	40 days	체중 증가량
대조구(PBS 투여군)	154.09 ±4.25	390.27 ±19.63	236.19 ±19.19
락토바실러스 루테리ATCC23272 투여군	153.41 ±4.22	365.50 ±17.09	212.09 ±6.31
락토바실러스 퍼멘텀NM316 투여군	151.93 ±4.60	350.03 ±11.86	198.1 ±2.46

또한, 장기 투여 시 SD 랫트의 사료 섭취량에 따른 사료 효율의 변화를 확인하였는데, 도 5의 a에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 미생물을 생균 형태로 섭취한 랫트의 대사 효율 변화는 결과적으로 락토바실러스 NM316 투여군의 총 사료 섭취량이 타 군들에 비해 대략 10.7% 정도 낮음을 확인할 수 있었으며, 투여 기간 동안의 총 체중 변화량 역시 약 16.1% 정도 낮은 것으로 확인되었다. 그러나, 사료 효율면에서는 생리식염수(PBS) 투여군 보다 약 6.4% 높게 나타났다. 결과적으로 락토바실러스 NM316 투여군이 생리식염수 투여군에 비해 많은 양의 사료를 섭취한다 하더라도 체중 증가 억제 효과가 더 뛰어난 것으로 나타났다.

실시예 6. 락토바실러스 NM316 균주의 유산균 발효유 섭취 시 체중, 식이량의 변화 및 그에 따른 대사 효율의 변화

본 발명에서 사용한 동물은 SD 랫트(Sprague Dawley rat)로 5주령의 수컷으로 하였으며 각 군 당 11마리씩을 생리식염수(PBS)투여군, 일반 스타터 균주 만을이용한 유산균 발효유(S), 락토바실러스 루테리 ATCC23272균주를 첨가하여 제조한 유산균 발효유 및 락토바실러스 NM316균주를 첨가하여 제조한 유산균 발효유 투여군으로 분류하여 실험하였다. 생리식염수(PBS)투여군을 제외한 나머지 유산균 발효유 투여군에 대해서는 스타터 균주인 스트렙토코커스 써모필러스 : 락토바실러스 불가리쿠스를 5:2의 비율로 혼합한 균체를 7 X 10⁶접종하여 기본 스타터 발효유를 제조하여 이를 기본 스타터 유산균 발효유로 하였으며 이 발효유의 생균수는 전체 1 X 10⁸정도가 되게 하였다. 이렇게 제조된 유산균 발효유에 락토바실러스 루테리 ATCC23272와 락토바실러스 NM316 균주에 대해서는 별도 배양하여 유산균 발효유에 첨가하여 투여하였으며 이때 락토바실러스 루테리 ATCC23272 와 락토바실러스 NM316 균주의 투여된 총 균체량은 4 X10¹⁰cfu 이며 이렇게 제조한 유산균 발효유는 1일 2회 경구 투여하는 방식을 취하였다. 도 4 의 b에 나타난 바와 같이, 랫트의 체중과 사료 섭취량은 4일 간격으로 측정하여 10마리의 평균값을 나타내었다.

상기 제조한 발효유를 60일간 투여한 결과, 도 3 및 표 4 에 나타난 바와 같이, SD 랫트의 체중 변화가 44일 경과 후 서서히 나타나기 시작했으며, 최종 60일 경과 시의 측정치는 대조구인 요구르트 투여군에 비해 체중이 약 2.6% 가량 낮게 나타났다. 장기 투여 시 SD랫트의 사료 섭취량의 변화에 있어서는 스타터 요구르트 투여군에 비하여 락토바실러스 NM316 투여군이 약 4.6% 정도 더 많은 양의 사료를 섭취하는 것으로 나타났으며 투여기간 중의 체중 변화량 역시 4.3% 정도 억제하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 근거로 하여 도 5 의 b에 나타난 바와 같이, 사료효율을 계산하였을 때 요구르트 투여군에 비해 약 5.2% 정도 더 높게 나타났다.

이러한 결과도 생균을 투여했을 경우와 동일하게 더 많은 양의 사료를 섭취하더라도 체중 증가 억제효과가 뛰어난 것으로 나타났다.

유산균 발효유 장기 투여시 SD 랫트의 체중변화

	0 day	60 days	체중 증가량
대조구 (PBS 투여군)	153.65 ±6.11	413.47 ±14.02	259.83 ±16.44
S^*	154.19 ±6.61	420.3 ±19.33	266.11 ±17.15
S + 락토바실러스NM316균주 투여군	154.7 ±7.27	409.17 ±19.48	254.47 ±15.22

S^*: 스타터 미생물을 이용하여 만든 발효유

실시예 7. 락토바실러스 NM316 균주 섭취 시 혈중 콜레스테롤의 변화

본 발명에 의한 락토바실러스 NM316 균주를 섭취할 경우, 당뇨병과 비만증 등의 질환 뿐만 아니라 순환기성 질환(동맥경화, 심근경색 등)의 발병율에 대한 감소 효과 여부를 확인하고자 혈중 콜레스테롤의 변화를 분석하였다.

지방질 분석을 위해 실험 중인 랫트의 혈액을 실험 종료 시 꼬리 채혈법을 이용하여 혈액을 채취하는 방식으로 실험을 수행하였다. 지방질의 분석은 효소 비색법을 사용하였으며 Cholestezyme-V(신양화학, 한국)등을 이용하여 505-570nm에서 표준용액과 함께 흡광도를 측정함으로써, 혈청 내 콜레스테롤 함량을 계산하였다.

도 6 및 표 5 에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 NM316 균주의 혈중 총 콜레스테롤 수치는 생리식염수 투여군과 비교해 보면, 투여 개시일로부터 40일 경과 시점부터 감소하기 시작하여 오히려 투여하기 전보다 더 감소하는 것으로나타났다. 따라서, 본 발명의 미생물은 순환기성 질환(동맥경화, 심근경색 등)의 발병율 감소에도 효과가 있음을 예측할 수 있었다.

생균제제로 장기투여 시 SD 랫트의 혈중 콜레스테롤 양의 변화

	0 day	40 days
대조구(식염수 투여군)	87.86 ±4.25	75.18 ±5.67
락토바실러스 루테리ATCC23272 투여군	87.58 ±8.75	69.23 ±4.36
락토바실러스 퍼멘텀NM316균주 투여군	95.37 ±9.87	70.94 ±5.11

상기한 바와 같이, 본 발명의 구성 및 바람직한 실시예를 본 명세서에 기재하였으나, 본 발명의 권리 범위는 상기 기재된 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 아니되며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 변형을 실시할 수 있을 것이다.

본 발명의 미생물은 우수한 장내 생존성과, 고효율의 다당류 생성능력을 가지고 있어 장내에서 생존하면서, 포도당, 자당 또는 과당 등의 저당류 화합물을 고분자량의 다당류로 전환시켜 체내로 흡수되는 탄수화물의 양을 줄여줌으로써, 비만증 및 당뇨병의 치료 및 예방 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 미생물은 체중조절, 정장작용 및 콜레스테롤 흡수 억제 효과가 있다.

Claims

다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 퍼멘텀 NM316 (KCTC-10458BP).
다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 퍼멘텀 NM316(KCTC-10458BP)의 약학적 유효량과 담체로 이루어진 비만증 예방 치료용 제제.
제 2 항에 있어서, 상기 비만증 예방 치료용 제제를 장용 피복 물질로 피복시킨 것을 특징으로 하는 비만증 예방 치료용 제제.
다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 퍼멘텀 NM316(KCTC-10458BP)을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 식품 조성물이 젤리, 푸딩, 분말, 캡슐, 또는 발효유인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 퍼멘텀 NM316(KCTC-10458BP)의 약학적 유효량과 담체로 이루어진 당뇨병 예방 치료용 제제.
제5항에 있어서, 상기 당뇨병 예방치료용 제제를 장용 피복 물질로 피복시킨 것을 특징으로 하는 비만증 예방 치료용 제제.