KR100794701B1 - 비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장내 생존성이 우수하면서, 장내에서 다당류를 고효율로 생성하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장내로 유입되는 포도당, 자당 또는 과당등을 체내로 흡수되지 아니하는 고분자 물질로 전환시킴으로써 저당류의 장내흡수를 경쟁적으로 저해하여 비만증 또는 당뇨병을 예방하거나 치료할 수 있게 하는 신규한 미생물, 이들의 약학적 유효량을 함유하는 조성물, 이들을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 대한 것이다.

식이섬유, 유산균, 비만, 당뇨, 예방, 치료

Description

비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 미생물{Microorganisms for Obesity or Diabetes Mellitus}

도 1은 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 래트의 체중 변화를 도시한 도표이다.

도 2는 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 래트의 체중 증가의 변화를 도시한 도표이다.

도 3은 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 래트의 대사 효율 변화를 도시한 도표이다.

도 4는 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 래트의 혈중 콜레스테롤 변화를 도시한 도표이다.

도 5는 본 발명에 따른 미생물을 섭취한 래트의 혈당치 변화를 도시한 도표이다.

본 발명은 장내 생존성이 우수하면서, 장내에서 다당류를 고효율로 생성하는 비만 또는 당뇨 예방 및 치료용 미생물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 장내로 유입되는 포도당, 자당 또는 과당등을 체내로 흡수되지 아니하는 고분자 물질로 전환시킴으로써 저당류의 장내흡수를 경쟁적으로 저해하여 비만증 또는 당뇨병을 예방하거나 치료할 수 있게 하는 신규한 미생물, 이들의 약학적 유효량을 함유하는 조성물, 이들을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물에 대한 것이다.

비만은 아직도 원인이 명확히 밝혀지지 않은 여러 가지 요인들에 의해서 복합적으로 발생하는 만성적인 질환으로 알려져 있다. 비만은 고혈압, 당뇨, 심혈관 질환, 담석, 골관절염, 수면 무호흡증(sleep apnea), 호흡장애, 자궁내막, 전립선, 유방 또는 대장암 등을 유발하는 요인이 되고 있다.

1999년 미합중국 국립보건원(NIH) 보고서(The Evidence Report: Clinical guidelines on the identification, evaluation, and treatment of overweight and obesity in adults, 1999, NIH)에 의하면, 미국인 가운데 약 9,700만명이 비만 상태에 있으며, 비만과 관련된 질환 중의 하나인 제2형 당뇨(type 2 diabetes mellitus) 환자가 약 1,570만명에 이른다. 또한 비만과 관련된 질환에 의하여 매년 전세계적으로 약 20만명이 사망한다고 알려져 있다(Dan Ferber, Science, 283, pp 1423-1424, 1999).

당뇨병은 환자나 그들 가족 뿐만 아니라 사회적으로도 상당한 개인적 및 재정적 비용이 요구되는 전세계적으로 만연한 만성 질환의 하나로서, 별개의 병인 및 발병 기작을 갖는 상이한 당뇨병 유형들이 존재한다. 예를 들면, 진성 당뇨병은 과혈당증 및 당뇨을 특징으로 하며, 인슐린의 부적절한 생성이나 이용으로 야기되는 탄수화물 대사 장애이다.

비인슐린-의존성 진성 당뇨병(NIDDM) 또는 유형 II 당뇨병은 인슐린이 적절하게 생성되어 이용되지만, 말초 조직에서 인슐린이 매개된 글루코오스 대사 및 기타 대사에 결점이 있는 성인에게서 주로 나타나는 당뇨병이다.

NIDDM는 3가지 주요한 대사적 이상, 인슐린이 매개하는 글루코오스 처리에 대한 저항, 영양물로 자극되는 인슐린 분비 능력의 손상 및 간에서 글루코오스의 과생성에 기인한다. NIDDM 치료 즉, 혈당 수준의 조절에 실패하면 심혈관 질환으로 인한 사망 및 망막증, 신장병 및 말초 신경병을 비롯한 다른 당뇨성 합병증이 야기될 수 있다.

NIDDM의 치료법에는 NIDDM 환자의 혈당 수준을 조절하는 방법으로서, 식이요법 및 운동뿐만 아니라 술포닐 요소(Sulfonylurea)계 약물 및 비구아니드계 약물등이 사용될 수 있다. 또한, 메트포민 및 아카르보스 화합물도 최근에 NIDDM 환자를 치료하는데 사용되고 있다. 그러나, 몇몇 환자들은 식이요법과 운동 및/또는 상기한 치료 화합물의 사용에 의해서도 과혈당증을 적절하게 조절할 수 없어서 외인성 인슐린의 투여가 요구되기도 한다.

환자에게 주사로 인슐린을 투여하는 것은 고가이며 고통스러운 점 이외에도, 환자에게 해로운 다양한 상황 또는 합병증을 야기할 수 있다. 예를 들면, 인슐린 반응(저혈당증)은 인슐린 투여량의 착오, 결식, 불규칙한 운동 또는 특별한 원인 없이도 야기될 수 있다. 또한, 국소적 및/또는 전신 알레르기 반응 및 인슐린에 대한 면역학적 저항성이 발생될 수도 있다.

비만 및 당뇨의 예방 또는 치료방법은 크게 식이-운동요법, 수술 요법 및 약 물 요법이 있다. 식이-운동 요법은 저칼로리-저지방 섭취와 산소를 소비하는 육체의 활동을 통한 치료 방법인데, 이는 인내심을 가지고 반복적, 지속적으로 수행되어야 하기 때문에 대중적인 효과를 보기는 어려운 것으로 인식되고 있다.

수술요법은 외과적 수술을 통해 체지방을 물리적으로 제거하는 방법으로서 단기간에 효과를 볼 수 있는 장점이 있지만, 수술을 해야 하는 점, 효과의 지속성이 없다는 점, 비용이 많이 든다는 점등 때문에 활용이 제한되고 있다.

따라서, 혈당의 감소, 혈당 흡수의 저해, 인슐린의 작용 강화 및 식욕의 감소를 유발하는 약제들에 의하여 비만 또는 비만형 당뇨를 치료 또는 예방하고자 하는 약물 요법이 활발히 연구되고 있는데, 현재까지 개발된 비만 및 비만형 당뇨의 예방 및 치료를 위한 약제는 다양한 생리학적 메카니즘을 이용하고 있다.

그러나, 종래에 개발된 다양한 약제들 중에서 인체의 대사 균형에 손상을 주지 않으며, 천연물질이라는 점 때문에 식이섬유가 가장 유용한 비만 예방 및 치료제제로 인정되고 있다.

종래의 미생물 식이섬유는 글루코노박터 속(Gluconobacter sp.), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 아세토박터 자일리눔(Acetobacter xylinum), 아세토박터 한세니(A. hansenii)., 아세토박터 파스테리아누스(A. pasteurianus), 아세토박터 아세티(A. aceti), 라이조븀 속(Rhizobium), 알칼리게네스 속(Alcaligenes), 살리나 속(Sarcina), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 락토코커스 크레모리스(Lactococcus cremoris), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus), 락토바실러스 사케(L. sake), 락토바실러스 루테리(L. reuteri), 락토바실러스 락티스(L. lactis), 락토바실러스 델브륙키의 아종(L. delbrueckii subsp.), 락토바실러스 헬베티쿠스글루코스의 변종(L. helveticusglucose var. jugurti), 류코노스톡 덱스트라니쿰(Leuconostoc dextranicum), 불가리쿠스 속(Bulgaricus), 캄페스트리스 속(Campestris), 스핑고모나스 속(Sphingomonas) 등의 미생물을 이용하고 있다.

이들 미생물이 생성하는 식이섬유는 각종 식품의 안정제, 증점제, 유화제, 흡습제 등과 의약품, 화장품의 재료로 사용되고 있는데, 현재 미생물 셀룰로오스, 크산, 아세탄등과 해조류에서 정제한 식이섬유인 구아 검(Guar gum), 로커스트 빈 검(Locust bean gum), 카라게난(carrageenan), 알기내이트(alginate), 아가(agar) 등이 이미 상품화되어 있다.

상기한 미생물 중 락토바실러스 속 균주는 인체의 장내에 서식하는 정상 미생물 군집(normal microbial flora)의 주요 구성원으로서, 건강한 소화기관과 질내 환경을 유지하는 데 있어서 중요한 것으로서 오래 전부터 알려져 왔다(Bibel, D. J., ASM News, 54:661-665, 1988: Reid, G. and A. W. Bruce, In H. Lappin-Scott (ed.), Bacterial biofilms. Cambridge University Press, Cambridge, England, p. 274-281, 1995; Reid G., A. W. Bruce, J. A. McGroarty, K. J. Cheng, and J. W. Costerton, Clin. Microbiol. Rev., 3:335-344, 1990). 일반적으로 락토바실러스 균주의 서식처는 동물의 소화기관(L. acidophilus, L. intestinalis, L. johnsonii, L. reuteri 등), 질내 점막(L. vaginalis, L. gasseri), 식품(wine- L. hilgardii), 유산균 음료(L. kefir, L. kefiranofaciens; cheese- L, casei), 식초(L. acetotolerans), 구강(L. oris), 누룩(L. sake, L. homohiochi), 과일 주스(L. kumkeei, L. mali, L. suebicus), 발효된 소시지 또는 어류(L. farciminis, L. alimentarius) 등이다.

실제로 많은 사람들이 건강한 장을 유지하고, 요로 질내 감염(urogenital tract infection)을 막기 위해 락토바실러스 속의 균주를 함유한 건강 보조제를 사용하고 있다. 최근에는 설사 및 변비의 예방 또는 요로 감염의 예방 외에 락토바실러스의 다양한 생리활성 기능(probiotic activity) 즉, 면역력의 조절, 혈중 콜레스테롤 수치 조절, 류마티즘의 치료, 암의 예방, 유당에 대한 민감성 완화, 아토피성 피부염에 대한 효과 등에 대한 중요성과 관심이 증가하고 있다.

미국의 공중건강 가이드라인(U.S. Public Health Service guidelines)에 의하면, 현재 미국 균주기탁기관(ATCC)에 기탁된 262가지의 락토바실러스 균주 모두가 인체나 동물에 질병을 유발할 잠재적 위험에 대해서는 알려진 것이 없다고 인정되는 '안정수준(Bio-safty Level) 1'로 분류되어 있다.

최근 락토바실러스가 합성하는 세포외 식이섬유에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 이들 균주가 세포외 식이섬유를 만드는 기작에는 많은 유전자가 관여하기 때문에 매우 복잡하며, 합성되는 식이섬유의 양 또한 매우 적은 것으로 알려져 있다(Int. J. Food Microbiol., Mar 3 40:1-2, 87-92, 1998; Current Opinion in Biotechnology, 10:498-504, 1999; Current Opinion in Microbiology, 2:598-603, 1999; Appl. Environ. Microbiol., Feb 64:2, 659-664, 1998; FEMS Microbiol. Rev., Apr. 23:2 153-77, 1999; FEMS Microbiol. Rev., Sep. 7:1-2, 113-30, 1990. 참조).

상기한 바와 같이, 현재까지 비만 또는 당뇨의 치료에 관하여 다양한 연구와 노력이 있어 왔으며 지금까지 여러 가지 화합물들이 비만 또는 당뇨병 치료제로 개발되었지만 여전히 부작용이 있고 체내에 축적된 체지방, 단백질 등을 강제적으로 배출하는 기능을 하기 때문에 비만 또는 당뇨를 원천적으로 억제하거나 치료하는 획기적인 치료제는 아직까지 없는 실정이다.

본 발명의 목적은 장내에서 생장하면서 소화 효소에 의해 분해된 저당류 탄수화물을 흡수하여 체내로 흡수되지 아니하는 고분자량의 물질로 전환시킴으로써, 장에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 크게 줄일 수 있는 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물의 약학적 유효량을 함유하여, 체내로 흡수되는 저당류의 양을 원천적으로 감소시킴으로써, 비만 또는 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 유효성분으로서 함유하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 장내에서 생장하면서 소화 효소에 의해 분해된 저당류 탄수화물을 흡수하여 체내로 흡수되지 아니하는 고분자량의 물질로 전환시킴으로써, 장 에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 크게 줄일 수 있는 미생물을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 미생물은 장내에서 생장이 가능하고, 인체에 무해하며, 저당류를 장내에서 흡수되지 아니하는 고분자량의 물질로 전환시키는 미생물로서, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) PRD202 인 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물의 약학적 유효량을 함유하여, 체내로 흡수되는 저당류의 양을 원천적으로 감소시킴으로써, 비만 또는 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위한 의약 조성물을 제공함으로써 달성된다.

본 발명의 미생물들은 통상적으로, 투여 경로에 따라 선택되는 약학적 담체 및 부형제, 또는 보조 유효 성분등과의 혼합에 의해서 얻어지는 정제 또는 캡슐과 같은 단위 형태로 투여된다. 본 발명의 조성물에 적합한 담체, 부형제 및 희석제에는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알긴산염, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 규산캄슘, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸 및 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광유등이 포함된다.

본 발명의 미생물 조성물은 윤활제, 습윤제, 유화제, 및 현탁화제, 방부제, 감미제 또는 향미제를 추가로 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 방법을 사용하여, 위장을 통과한 뒤 소장에 도달하여 활성 성분인 미생물이 신속하게 장내에 방출되도록 장용 피복 제제로 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 조성물은 통상적인 캡슐화 방법을 사용하여 캡슐 형 태의 조성물로 제조될 수 있다. 예를 들어, 표준 담체를 사용하여 동결 건조시킨 본 발명의 미생물을 함유하는 펠렛을 제조한 후, 이를 경질의 젤라틴 캡슐내에 충전시키거나 본 발명의 미생물과 임의의 적절한 제약학적 담체, 예를 들어 수성 검, 셀룰로스, 규산염 또는 오일을 사용하여 현탁액, 분산액을 제조한 후, 이러한 분산액 또는 현탁액을 연질의 젤라틴 캡슐 내에 충전시킬수 있다.

본 발명의 제제는 특히, 경구용 단위 제형으로서 장용 피복된 장용성 제제로서 제공될 수 있다. 본 명세서에서의 "장용 피복"은 위산에 의해서는 분해되지 아니하여 피복이 유지되나, 소장에서는 충분히 분해되어 활성 성분이 소장 내에 방출될 수 있도록 하는 제약학상 허용 가능한 모든 종류의 공지의 피복을 포함한다.

본 발명의 "장용 피복"은 pH 1의 HCl용액과 같은 인공 위즙을 36 내지 38 ℃에서 접촉시킬 때, 2시간 이상 동안 그대로 유지되며, 바람직하게는 이후에 pH6.8의 KH₂PO₄ 완충 용액과 같은 인공 장즙에서 30분 이내에 분해되는 피복을 지칭한다.

본 발명의 장용 피복은 1 개의 코어에 약 16 내지 30, 바람직하게는 16 내지 20 또는 25mg 이하의 양으로 피복된다. 본 발명의 장용 피복의 두께가 5 내지 100㎛, 바람직하게는 20 내지 80㎛인 경우가 장용 피복으로서의 만족스러운 결과를 나타내었다. 장용 피복의 재료는 공지의 고분자 물질들 중에서 적당히 선택된다. 적당한 고분자 물질은 문헌 [L. Lachman 외, The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3판, 1986, pp. 365-373, H. Sucker 외, Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359, Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis, 4판, vol. 7, pp. 739-742, 및 766-778, (SpringerVerlag, 1971), 및 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 13판, pp. 1689-1691(mack Publ., Co., 1970)에 열거되어 있고, 셀룰로오즈 에스테르 유도체, 셀룰로오즈 에테르, 아크릴 수지의 메틸아크릴레이트 공중합체 및 말레산 및 프탈산 유도체의 공중합체가 이들에 포함될 수 있다.

본 발명의 바람직한 장용 피복은 셀룰로오즈 아세테이트 프탈레이트 및 트리멜리테이트 그리고 메타크릴산 공중합체 (예를 들면, 메틸아크릴산 40% 이상, 및 특히 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트를 포함하는 메틸아크릴산 및 그의 에스테르로부터 유도된 공중합체)로부터 제조된다. 롬 게엠베하사 (Rohm GmbH, 독일)에 의해 시판 중인 엔드라지트 엘(Endragit L 100-55) 제품이 본 발명의 장용 피복의 재료로 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복용 셀룰로오즈 아세테이트 프탈레이트는 약 45 내지 90 cP의 점도와, 17 내지 26%의 아세틸 함량 및 30 내지 40%의 프탈레이트 함량을 가지며, 셀룰로오즈 아세테이트 트리멜리테이트는 약 15 내지 20 cS의 점도와, 17 내지 26 %의 아세틸 함량, 25 내지 35%의 트리멜리틸 함량을 갖는다. 이스트맨 코닥 캄파니(Eastman Kodak Company)사가 시판하는 셀룰로오즈 아세테이트 트리멜리테이트 제품이 본 발명의 장용 피복 재료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복 재료로서 사용되는 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트는 130,000 달톤의 분자량을 갖고, 5 내지 10%의 히드록시프로필 함량, 18 내지 24%의 메톡시 함량 및 21 내지 35%의 프탈릴 함량을 갖는다. 이스트맨 코닥사 가 시판하는 셀룰로오즈 아세테이트 프탈레이트가 본 발명의 장용 피복의 재료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복에 사용될 수 있는 히드록시프로필 메틸셀룰로오즈 프탈레이트는 신-에쯔 케미칼사 (Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., 일본)가 시판하는 HP50이며, 이는 6 내지 10%의 히드록시프로필 함량, 20 내지 24%의 메톡시 함량, 21 내지 27%의 프탈릴 함량과 84,000 달톤의 분자량을 갖는 제품이다. 또한 신-에쯔 케미칼사가 HP55로 시판중인, 히드록시프로필 함량이 5 내지 9 %, 메톡시 함량이 18 내지 22 %, 프탈릴 함량이 27 내지 35 %이고 분자량이 78,000 달톤인 제품이 본 발명의 장용 피복 재료로 사용될 수 있다.

본 발명의 장용 피복은 장용 피복 용액을 코어에 분무하는 통상적인 장용 피복법을 사용하여 제조될 수 있다. 장용 피복 공정에 사용되는 적당한 용매로는 에탄올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤, CH₂Cl₂와 같은 할로겐화 탄화수소 용매이며 이들 용매들의 혼합 용매가 사용될 수도 있다. 디-n-부틸프탈레이트 또는 트리아세틴과 같은 연화제를 1 대 약 0.05 내지 약 0.3(코팅 재료 대연화제)의 비율로 피복 용액에 첨가한다. 분무 과정을 연속적으로 수행하는 것이 적절하며 피복의 조건을 고려하여 분무량을 조절하는 것이 가능하다. 분무압은 다양하게 조절할 수 있고, 일반적으로 약 1 내지 약 1.5 bar의 분무압으로 만족할 만한 결과가 얻어진다.

본 명세서의 “약학적 유효량”은 포유 동물의 장내에서 체내로 흡수되는 저당류의 양을 감소시킬 수 있는 본 발명 미생물의 최소량을 의미하며, 본 발명의 조 성물에 의하여 체내에 투여되는 미생물의 양은 투여 경로, 투여 대상을 고려하여 조정된다.

본 발명의 조성물은 대상 개체에 매일 일회 이상 투여될 수 있다. 단위 투여량은 사람 피험자 및 다른 포유 동물을 위한 단위 투여에 적합하게 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 적절한 제약학적 담체를 포함하며 치료 효과를 나타내는 본 발명의 미생물의 예정된 양을 함유한다.

성인 환자의 경구 투여용 투여 단위는 본발명의 미생물 0.1g 이상을 함유하는 것이 바람직하며, 본 발명의 조성물 경구 투여량은 일회에 0.1내지 10g, 바람직하게는 0.5내지 5g이다. 본 발명의 미생물의 약학적 유효량은 0.1g/1일이다.

그러나, 투여량은 환자의 체중, 비만 증상의 심각도 및 사용되는 미생물과 보조 유효 성분에 따라 가변적이다. 또한, 일일 총 투여량을 여러회로 분할하여 필요에 따라 연속적으로 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량 범위는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 아니한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 유효성분으로서 함유하는 식품 조성물을 제공함으로써 달성된다.

본 명세서의 "조성물"은 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하는 것은 아니고, 통상적인 식품, 기능성 식품 또는 건강 보조 식품까지 포함하는 개념이다.

본 발명의 조성물을 주기적으로 복용하는 경우, 장내에 본 발명의 미생물들이 균총을 이루면서 인체가 당류를 흡수하는 것을 경쟁적으로 방해할 뿐 아니라, 이들 당류를 이용하여 미생물이 생산한 비소화성 다당류가 장내 유용균의 생육조건을 좋 게 하고 장 운동을 자극함으로써 결과적으로 본 발명의 조성물이 비만 또는 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있게 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 비만 또는 당뇨의 예방 및 치료용 미생물은 ① 장내에서 증식이 가능하며, ② 저당류를 빠르게 흡수하여 섬유상 물질과 같은 비소화성 또는 난소화성 고분자 물질로 전환시키고, ③ 인체 또는 가축에 해가 없다는 조건을 만족시킨다. 따라서, 상기의 3가지 조건을 만족시키는 공지의 미생물을 각종 기탁기관으로부터 분양받아 본 발명의 조성물에 사용할 수 있으며, 신규의 미생물을 새로이 분리하여 사용할 수도 있다.

본 발명자들은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 신규의 미생물을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

다당류를 생성하는 것으로 공지된 각종 미생물을 기탁 기관으로부터 분양 받아, 그들의 다당류 생성능력, 당 소비속도, 위산 및 담즙산에 대한 내성실험을 통하여 돌연변이 모균주를 선택한 후, 이를 화학물질을 이용하여 돌연변이시켜 다당류를 다량 생산하는 PRD202를 선별하였다. 선별된 PRD202는 확인 결과 락토바실러스 루테리임을 확인하였고, 락토바실러스 루테리 PRD202라 명명하여 KCTC에 기탁하였다(기탁번호 KCTC10301BP).

이렇게 선별된 본 발명의 락토바실러스 루테리 PRD202 균주에 의하여 생성되는 다당류가 장내 소화효소에 의해 분해되는지 확인한 결과 분해되지 않아서, 락토바실러스 루테리 PRD202에 의하여 생성된 다당류는 장내 소화효소에 의해 분해되어 체내로 흡수되지 않고 배출됨을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 미생물의 베타-글루쿠로니데이즈의 역가를 측정한 결과 본 발명의 미생물은 베타-글루쿠로니데이즈를 전혀 생성하지 않아, 베타-글루쿠로니데이즈로 인한 유해성은 없는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 락토바실러스 루테리 PRD202를 래트에게 투여한 결과 대조구에 비하여 체중이 약 6.5% 감소되었고,사료 섭취량이 9.3% 정도 적게 섭취하는 것으로 나타났으며, 대사효율을 계산한 결과 대조구와 본 발명의 락토바실러스 루테리 PRD202가 약 5.6% 정도 차이를 보였다. 따라서 본 발명의 미생물은 체중조절에 효과가 있음을 알 수 있다.

본 발명의 미생물을 섭취하는 경우에 혈중 콜레스테롤의 변화를 확인한 결과, 본 발명의 락토바실러스 루테리 PRD202는 생리식염수 투여군에 비하여 유의성 있게 감소하였다. 따라서, 본 발명의 미생물 및 미생물 조성물이 비만, 당뇨 및 순환기성 질병(동맥경화, 심근경색 등)에 효과가 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 미생물 투여로 인해 정상 혈당치 보다 낮아 지는 저혈당 증세가 나타나지 아니함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명은 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리 범위를 본 실시예로 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 락토바실러스 루테리 ATCC 23272의 저당류 소비 속도 및 다당류 생성 능 력 측정

락토바실러스 루테리 ATCC 23272 균주의 당 소비 속도를 측정하기 위하여 80 ℃ 초저온 냉동고에 보관 중인 락토바실러스 균를 10 ml의 캡 튜브에 접종하여 24시간 동안 37℃ 배양기에서 활성화시킨 후 활성화 된 균주를 100 ml의 MRS 배지(2% 포도당, 1% 쇠고기 추출물, 1% peptone, 0.5% 효모 추출물, 0.1% 트윈-80(Tween-80), 0.2% 시트르산 암모늄, 0.5% 아세트산 나트륨, 0.01% MgSO4, 0.005% MnSO4, 0.05% L-cysteine-HCl)에 접종하고, 3시간 간격으로 시료를 채취하여 성장속도, 수율 및 당 소비 속도를 측정한 결과 락토바실러스 ATCC 23272 균주는 성장속도 0.071 O.D/hr, 수율 0.082 Ys/x 및 글루코스 소비속도 1.21 g/L/hr를 나타내었다.

락토바실러스 루테리 ATCC 23272의 다당류 생성 능력을 알아보기 위하여 MRS배지에서 24시간 동안 배양한 상기 균주를 튜브에 0.5 ml 담고 13,000 g에서 20분간 원심분리하여, 상등액을 취하고 동량의 40% 트리클로로아세테이트를 가하여 강하게 교반시킨 후 재차 13,000(g) 에서 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액에 2배의 차가운(4℃) 에탄올을 넣고 혼합하여 이를 다시 6,000(g)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고 난 후 처음 부피와 동량의 증류수를 넣어 다당류를 현탁시켜 페놀-황산 법으로 다당류량을 측정하여 다당류 생성량을 측정하였다.

락토바실러스 루테리 ATCC 23272균의 위와 십이지장 통과 능력을 시험하기 위해서 pH 1.5의 염산 인공위액을 제조하여 균을 10⁶ 농도로 접종하여 2 시간 후 생존률(초기접종 균수(cfu/ml)/배양 후 생존 균수(cfu/ml))을 측정한 결과, 유사위액(pH 1.5)에서 2시간 배양 후 생존률은 25.5%, 담즙에서 9시간 배양 후 생존률은 667%, EPS 생성량은 670mg/L로 나타났다.

실시예 2: 다당류를 다량 생산하는 본 발명의 변이 균주 획득

식이섬유를 다량으로 생산하는 변이 균주를 얻기 위하여 먼저 균을 변형 MRS 배지에서 37℃, 6시간 배양한 후 원심분리하여 침전시켜 얻은 락토바실러스 루테리 ATCC 23272 균을 생리식염수(PBS. pH 7.0) 완충액으로 세척한 후 NTG(N-methyl-N-mitro-N-nitrogoguanidine)를 최종농도 200 ㎍/ml가 되도록 첨가하여, 37℃에서 30 분간 배양해서 균주 99.9 %를 사멸시켰다.

이렇게 해서 얻은 돌연변이 군을 고농도의 과당이 함유된 MRS(5 % 과당, 1 % 쇠고기 추출물, 1% peptone, 0.5% 효모 추출물, 0.1% 트윈-80(Tween-80), 0.2% 시트르산 암모늄, 0.5% 아세트산 나트륨, 0.01% MgSO4, 0.01% MnSO4, 0.05% L-cysteine-HCl) 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 배양하였다.

배양액을 각각의 튜브에 0.5 ml 담고 13,000 g에서 20분간 원심분리하여, 상등액을 취하고 동량의 40% 트리클로로아세테이트를 가하여 교반시킨 후 재차 13,000(g) 에서 20분간 원심분리하여 얻어진 상등액에 2배의 차가운(4℃) 에탄올을 넣고 혼합하여 이를 다시 6,000(g)에서 10분간 원심분리하여 상등액을 조심히 버리고 난 후 처음 부피와 동량의 증류수를 넣어 다당류를 현탁시켜 페놀-황산 법으로 다당류 량을 측정하고 다당류 효율(EPS(mg/L)/O.D(650nm))을 측정하였다.

이렇게 해서 얻어진 다당류 효율이 높은 균주를 동일한 방법으로 재차 돌연변 이 시켜 다당류 생산 효율이 높은 균주를 획득하였다.

제1세대 변이 균주에서 원균주보다 다당류의 생산량이 증가한 균주를 획득하고, 동일한 방법으로 다시 돌연변이시켜서 제2세대 변이 균주를 획득하였다. 이 결과, 높은 EPS(exopolysccharide) 생산 효율을 보이는 락토바실러스 루테리 PRD202(이하, PRD202라 함)를 획득하였고, PRD202는 표 1에 나타낸 바와 같이 락토바실러스 루테리 ATCC23272에 비해 7배 정도의 다당류 생성 능력을 보였다.

락토바실러스 루테리 ATCC 23272와 락토바실러스 루테리 PRD202의 다당류 생성량

균주명	O.D(650nm)?①	EPS(mg/L)?②	EPS수율(②÷①)
락토바실러스?루테리?ATCC23272	5.15	673.5	130.8
락토바실러스 루테리 PRD202	2.10	1266.5	602.8

실시예 3: PRD202 균주의 특성 및 동정

다당류 생성량이 많은 PRD202 미생물과 모균주간의 유전적 차이점을 파악하기 위하여 균주를 각각 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 12 시간 동안 정치 배양하였다. 배양액을 4℃, 6,000(g)에서 원심분리하여 미생물을 수득하고, 이로부터 CTAB/NaCl 방법을 사용하여 핵산을 추출하였다. 핵산 추출물을 16S rRNA 교감 프라이머(16S rRNA consensus primer)를 이용하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 결정한 결과 본 발명의 미생물은 락토바실러스 루테리 ATCC23272 변이 균주임을 확인하였다.

본 발명의 미생물은 모(母)균주에 비하여 성장속도가 저조하였고, 정치 배양 시 균주가 침전되는 양상이 적었으며, API 50 CH Kit(BioMerieux 사)를 이용한 당 이용성 비교 결과 모 균주는 αmethyl-D-glucoside를 탄소원으로 하여 미약한 성장을 보인 반면 본 발명의 락토바실러스 루테리 PRD202는 이를 전혀 이용하지 못하였다.

이상과 같이, 표현형과 16S rRNA 유전자의 염기서열 분석을 통하여, 본 발명의 미생물을 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) PRD202로 명명하여, 2002년 7월 12일 국제 기탁기관인 유전자 은행 부설 KCTC에 기탁번호 KCTC 10301BP로 기탁하였다.

실시예 4 : 다당류의 장내 소화 효소에 의한 분해성

상기 본 발명의 미생물 PRD202에 의해서 장내에서 생성되는 다당류가 장내 소화효소에 의해 분해되는지 여부를 확인하기 위하여 정제된 다당류를 포스페이트 완충액에 녹인 후, 래트(rat)의 소장에서 분리한 소화 효소를 농도별로 첨가하여 120 분간 반응시키고 이를 효소 비색법을 이용한 trinder kit (cat. 315-500 Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다.

측정 결과 표 2에 나타낸 바와 같이 PRD202에 의해 생성된 다당류는 장내 소화 효소에 의해서 분해되지 않았다. 따라서 본 발명의 PRD202에 의해서 생성된 다당류는 장내 소화 효소에 의해서 분해되어 체내로 흡수되지 않고 체외로 배출됨을 알 수 있었다.

장내 소화효소에 의한 다당류의 분해

기질의?종류	기질농도 (mg/ml)	효소?농도(ug/ml)
		1250	625	312.5	156.25	78.13	39.06
과?당	6.85	172.52*	144.39	196.71	125.32	78.92	45.00
다당류	5	0.51	0.48	0.80	0.38	0.29	0.19

실시예 5 : 락토바실러스 루테리 PRD 202로부터 베타-글루쿠로니데이즈의 발현 여부

장내 미생물에 의해 생산되는 베타-글루쿠로니데이즈는 벤조피렌과 같은 발암성 방향화합물등의 분해를 지연시키고, 인체 내에서 생성되는 독소가 간에서 분해 되는 것을 방해 하여 해독 작용을 지연 시키는 등의 악영향을 끼친다.

따라서, 장내에서 본 발명의 미생물에 의한 베타-글루쿠로니데이즈의 생성 여부를 확인 하기 위하여, PNPG(para-nitrophenyl-beta-D-glucuronide)(Cat. N-1627, Sigma. USA)의 가수분해에 의한 흡광도 측정법을 이용하였다.

먼저 PRD202를 300 ml 의 MRS 배지에 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 균을 회수하고 이를 생리 식염수(PBS)를 이용하여 세척한 후, GUS 완충액(100 mM sodium phosphate-2.5 mM EDTA[pH 6.0]) 10 ml에 재현탁하여, 분쇄하고 세포벽 등의 찌꺼기를 제거하여 얻어진 세포 추출물 50 - 400 ㎕을 12.5 mM의 PNPG가 함유된 GUS완충액 500 ㎕에 첨가하여 5, 15, 30 분간 37 ℃ 수욕조에서 반응시킨 후, 1M Na₂CO₃를 이용하여 반응을 중지시키고 405nm(OD405)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 베타-글루쿠로니데이즈의 역가(1 unit)는 표준시료(Cat. No. G-8162, Sigma. USA)를 이용하여 측정 하였으며, 그 비교치는 표 3과 같다.

락토바실러스 루테리 PRD202의 베타-글루쿠로니데이즈의 역가를 측정한 결과, 본 발명의 미생물은 베타-글루쿠로니데이즈를 전혀 생성하지 않으며, 이러한 결과로 베타-글루쿠로니데이즈로 인한 유해성의 문제는 없는 것을 알 수 있었다.

베타-글루쿠로니데이즈의 역가 측정

	첨가량	반응시간(O.D. = 405nm)
		5 분	15 분	30 분
표준물질 농도 (베타-글루쿠로니데이즈)	1 unit	0.235	0.397	0.527
	4.3 unit	0.540	1.054	1.715
	8.7 unit	0.854	1.765	2.451
	17.5 unit	1.516	2.436	2.533
세포 추출물 농도	50 ㎕	0.011	0.016	0.013
	100 ㎕	0.001	0.018	0.003
	200 ㎕	0.050	0.048	0.050
	400 ㎕	0.114	0.125	0.120

실시예 6 : 락토바실러스 루테리 PRD202 섭취시 체중과 식이량의 변화 및 그에 따른 대사 효율의 변화

측정에 사용한 동물은 SD 래트(Sprague Dawley rat)로 5주령의 수컷을 사용하였으며 군당 9마리씩 생리식염수(PBS)투여군, 락토바실러스 루테리 ATCC23272 투여군, PRD202 투여군으로 분류하여 실험하였다. 군에 따라 락토바실러스 루테리 ATCC23272와 PRD202를 1일 2회 투여하였으며, 1회 투여시 균체량은 3×10¹¹ cfu 농도로 경구 투여하였다. 래트의 체중과 사료 섭취량은 이틀 간격으로 측정하여 9마리의 평균값을 나타내었다.

30일간 투여한 결과 표 4 및 도 1에 나타낸 바와 같이 SD 래트의 체중 변화가 12일 이후부터 서서히 나타났으며, 최종 30일째 측정치는 대조구인 PBS 투여군에 비해 체중이 약 6.5% 가량 억제됨을 보였다.

장기 투여시 SD 래트의 체중변화

?	0day	10day	20day	30day
대조구?(PBS?투여군)	147.1±6.3	207.3±4.2	273.1±4.8	328.4±6.9
락토바실러스 루테리 ATCC23272?투여군	151.3±3.2	207.6±9.2	270.4±7.2	320.4±7.1
PRD202?투여군	150.5±6.0	200.4±11.3	260.0±7.5	307.3±10.9
(단위:g)

또한, 사료 섭취량의 변화를 비교하여 볼 경우 표 5와 도 2에 나타낸 바와 같이 PBS 투여군보다 약 9.3%정도 적게 섭취하는 것으로 나타났다. 이 결과로 사료의 대사 효율을 계산한 결과 PBS 투여군과 PRD202 투여군과의 차이가 약 5.6%정도 발생하고 PRD202의 대사효율이 높게 나타났다(도 3).

장기 투여시 SD래트의 사료 섭취량의 변화

?	10day	20day	30day
대조구?(PBS?투여군)	188.8±5.8	213.2±10.8	231.6±9.3
락토바실러스?루테리 ATCC23272?투여군	177.3±10.5	202.7±11.4	216.0±9.9
PRD202?투여군	176.7±10.9	195.1±16.8	210.0±9.2
(단위:g)

이와 같은 결과로 본 발명의 미생물은 저당류를 흡수하여 다당류로 전환시킴으로써 비만 치료 및 예방에 큰 효과가 있으며, 체내에 형성되는 다당류에 의한 포만감으로 인하여 음식물의 섭취량을 줄이는 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 7 : 락토바실러스 루테리 PRD202 섭취시 혈중 콜레스테롤의 변화

본 발명에 의한 PRD202를 섭취할 경우, 당뇨와 비만 등의 질병 뿐 아니라 순환기성 질병(동맥경화, 심근경색 등)의 감소에 대한 효과가 나타나는지 여부를 확인하고자 혈중 콜레스테롤의 변화를 분석하였다.

지방질의 분석을 위하여 실험중인 래트의 혈액을 1주 간격으로 꼬리 채혈법을 이용하여 혈액을 채취하여 사용하였다. 지방질의 분석은 효소 비색법을 사용하였으며 Cholestezyme-V(신양화학)등을 이용하여 505-570nm에서 표준용액과 함께 흡광도를 측정함으로써, 혈청에 존재하는 콜레스테롤 양을 계산하였다.

표 6 및 도 4에서 나타낸 것과 같이 혈중 총 콜레스테롤 수치는 PRD202의 경우 투여 28일째 생리식염수 투여군에 비하여 유의성 있게 감소(P<0.005)할 뿐만 아니라 투여하기 전보다도 유의성 있게 감소(P<0.005)하였다. 따라서 본 발명의 미생물은 순환기성 질병(동맥경화, 심근경색 등)의 감소에도 효과를 나타낼 수 있음을 예측할 수 있었다.

장기투여시?SD?래트의?혈중?콜레스테롤?양의?변화

	0day	7day	14day	21day	28day
대조구(식염수?투여군)	87.99±2.11	109.13±7.38	84.98±6.73	87.66±5.30	82.46±3.94
락토바실러스?루테리 ATCC23272?투여군	82.81±3.50	107.87±4.65	85.3±9.17	83.11±9.96	74.38±7.36
PRD202 투여군	82.98±2.64	105.85±9.26	82.95±3.71	80.66±8.04	68.01±4.47*
*:?28일째?대조구와?PRD202 투여군과의 비교시?P<0.005, (단위:mg/dl)

실시예 8 : 락토바실러스 루테리 PRD202 섭취시 혈당치의 변화

본 발명의 미생물 섭취시 미생물의 당 흡수로 인한 저혈당 등의 문제점을 파악하기 위하여 래트의 혈당치를 측정하였다.

혈당 측정을 위해 1 주 간격으로 래트로부터 혈액을 채취한 후, 혈청을 분리하였다. 혈당치는 효소 비색법을 이용한 트린더 키트 (Cat. 325-500, Sigma, USA)를 이용하여 505 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준용액을 기준으로 각각의 혈청에 대한 혈당치를 계산하였다. 이렇게 나온 실험결과는 실험군 당 평균 ±표준편차로 표시하였다. 혈당치 측정 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, 정상 래트의 혈당 수치와 비슷한 수준의 혈당치를 보였다. 따라서, 본 발명의 미생물 투여로 인해 정상 혈당치 보다 낮아지는 저혈당을 나타낼 우려는 없음을 알 수 있었다(표 7).

장기투여시?SD?래트의?혈당치의?변화

	0day	7day	14day	21day	28day
대조구(식염수?투여군)	129.8±5.5	98.2±8.8	127.1±8.4	114.9±7.9	107.8±10.7
락토바실러스?루테리 ATCC23272?투여군	126.6±5.2	106.9±8.8	129.2±8.4	105.8±4.1	101.7±2.5
PRD202 투여군	125.3±11.5	111.8±12.7	121.0±9.5	121.6±9.6	106.9±10.1

이상과 같이 본 발명의 구성 및 바람직한 실시예를 본 명세서에 기재하였으 나, 본 발명의 권리 범위는 기재된 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 아니되며, 당업자라면 본 발명의 권리범위내에서 본 명세서에 기재된 내용의 변형을 실시할 수 있을 것이다.

본 발명의 미생물은 우수한 장내 생존성과, 고효율의 다당류 생성능력을 가지고 있어서 장내에서 생존하면서, 저당류의 탄소화합물을 고분자량의 다당류로 전환시켜 체내로 흡수되는 탄소화합물의 양을 줄여줌으로써, 비만 및 당뇨의 치료 및 예방 효과를 갖는다. 또한, 베타-글루쿠로니데이즈에 의한 유해성이 없으며, 체중조절, 정장작용, 콜레스테롤 흡수 억제의 효과를 나타낸다.

Claims (7)

1. 다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 루테리(KCTC-10301BP).
2. 다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 루테리(KCTC-10301BP)의 약학적 유효량과 담체로 이루어진 비만증 예방치료용 제제.
3. 제2항에 있어서, 상기 비만증 예방치료용 제제를 장용 피복 물질로 피복시킨 것을 특징으로 하는 비만증 예방치료용 제제.
4. 다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 루테리(KCTC-10301BP)를 유효성분으로 함유하는 식품 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 식품 조성물이 체중감소 효과를 갖는 것임을 특징으로 하는 식품 조성물.
6. 다당류 물질을 생성시키는 락토바실러스 루테리(KCTC-10301BP)의 약학적 유효량과 담체로 이루어진 당뇨병 예방치료용 제제.
7. 제6항에 있어서, 상기 당뇨병 예방치료용 제제를 장용 피복 물질로 피복시킨 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방치료용 제제.

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