KR100280366B1 - 리팜피신과 각종 항생제에 내성을 갖는 신규 변이주인 엔테로코 - Google Patents
리팜피신과 각종 항생제에 내성을 갖는 신규 변이주인 엔테로코 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 리팜피신 및 각종 항생제에 내성을 갖는 신규한 변이주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2 (기탁번호 제 KFCC-11075 호)에 관한 것으로, 엔테로코커스 패칼리스 BR2의 모균주와는 달리 리팜피신 및 각종 항생제에 동시에 내성을 가지며 그 모균주의 정장균주로서의 특성을 그대로 지님으로써 항결핵제나 항생제 투여 환자에게 있어서 장질환의 치료, 균교대증의 억제 및 예방에 효과를 지니며 항생제가 첨가된 동물 사료에 첨가시 질병예방 효과 및 육질 개선의 효과를 갖는다.
Description
본 발명은 리팜피신과 각종 항생제에 내성을 갖는 신규한 변이주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2 유산균에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 엔테로코커스 패칼리스 BIO 의 균주를 변이처리하여 내성을 유도하여, 한국종균협회에 1998년 12월 17일자로 기탁된 기탁번호 제 KFCC-11075 호의 엔테로코커스 패칼리스 BR2 에 관한 것이다.
오랫동안 유산균제제는 장질환에 대한 치료와 예방의 정장 효과를 목적으로 사용되어 왔으며, 이에 대한 보고도 여러편이 나와 있다. 그 예로서, 유아기 설사 증상에 유산균을 투여하여 치료 효과를 보았다는 보고(R.O. Clock, J.A.M.A. Vol. 61, P.164, 1913)가 있은 이래, 설사증세로 고통받는 환자의 70%를 치료하였다는 보고(L.M. Gornpertz, et al., J.A.M.A. Vol. 80, P.90, 1923), 유산균으로 설사증상을 치료하고 대장의 유산균 농도와 그 임상적인 치료결과는 밀접한 관계가 있다
는 보고(L.F. Rettger, et al., Lactobacillus acidophilus and its therapeutic applications, New Haven, Yale University Press, 1935) 등, 유산균이 장내에서 직접, 간접으로 영양 공급효과 및 장 점막의 재생 촉진 효과가 있으며, 장암의 예방효과가 있다고 알려지고 있다.
한편, 항결핵제나 항생제를 장기복용하는 환자의 경우, 각종 항생제나 리팜피신과 같은 항결핵제로 인해서 장내 정상 세균총의 균형이 파괴되어 흡수부진과 소화불량 그리고 균교대증 등으로 인한 설사와 같은 장질환을 일으키는 등 여러 가지 부작용이 생길 수 있다. 따라서, 항결핵제나 항생제 등을 복용할 경우 이러한 부작용을 예방하기 위해 정장용 생균제제를 병용하도록 권장되고 있다.
그러므로, 이러한 목적으로 사용되는 정장용 생균제제의 조건은 항결핵제나 항생제, 즉 리팜피신 및 각종 항생제에 의해 쉽게 파되되지 않아야 한다.
이러한 내성 정장균주의 개발에 관해서는 대한민국 특허공보 제98-5232호에 기재되어 있으며, 상기 공보에서는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)의 변이주로서 리팜피신과 플로로퀴놀론계 항생제에 내성을 갖는 신규한 변이주인 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) OFR9 (KCTC 8640P)에 대하여 개시되어 있다.
상기 특허공보에 따르면, 비피도박테리움 비피덤 (B. bifidum) OFR9 의 배양액과 BL-액체 배지를 혼합하여 pH를 4.92로 조절한 배지에서 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae, ATCC 9752)의 성장이 억제되는 것으로 나타났다.
또 다른 내성 정장균주 개발에 관해서는 마이크로바이올로지칼 이뮤놀로지(Microbiol. Immunol. Vol. 21(2), 85-97, 1997)에서 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) 균주의 내성을 유도하여 하기 표와 같이 내성이 유도되었다는 데이터가 보고된 바 있다.
상기 논문에 따르는 변이주는 리팜피신에 대한 내성은 본건 발명자가 자체 분석한 결과 11μg/ml 이하인 것으로 나타났다.
따라서, 상기와 같은 기술을 이용한 증량 계대법(successive transfer culture)을 이용한 내성 유도에 의해서는 리팜피신에 있어서는 내성이 유도되지 않는 것으로 나타났다.
이에 본 발명자들은 리팜피신 및 각종 항생제들의 내성을 유도하기 위하여 증량계대법으로 계속 계대배양을 실시하여 약제내성을 유도하고, 순수 분리된 균을 NTG을 함유한 완충액에서 30분간 부유시킨 후, 원심분리하여 균을 변이처리한 다
음, 리팜피신을 함유한 배지에서 변이처리된 유효균을 분리하여 리팜피신 및 각종 항생제에 내성이 있는 정장균을 만들 수 있다는 흥미로운 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 리팜피신과 각종 항생제에 내성을 갖는 신규한 정장균주를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 포함하는 것을 특징으로 하는 유산균제제를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물용 사료를 제공하는 데에 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 리팜피신과 각종 항생제에 내성을 갖는 신규 변이주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2 (KFCC-11075)를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 따르는 신규 변이주인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2의 분리 동정 및 내성 유도는 다음과 같이 하였다.
본 발명에서 사용한 모균주는 본건 출원인인 보령제약 주식회사가 유산균 균말 제조용으로 개발한 유산균인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BIO를 순수분리하여 2% 락토스 한천배지에 보존하였다.
액체 배지가 든 삼각 플라스크에 각각의 항생제 농도를 단계적으로 높여서 함유하도록 만든 후, 위에서 분리된 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis)를 접종하여 적당한 온도에서 배양하여 균의 발육이 안정한 최고 농도의 시험관에서 유산균을 채취하여 순수 분리하였다. 이렇게 순수 분리된 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis)를 증량계대법으로 계속 계대 배양하여 내성을 유도하였다.
이때에 스트렙토마이신-구배 플레이트에서는 10~20회, 클로람페니콜-구배 플레이트에서는 20~30회, 테트라사이클린-구배 플레이트에서는 20~30회, 에리스로마이신-구배 플레이트에서는 10~20회, 아미노벤질 페니실린-구배 플레이트에서는 10~20회 계대배양하여 각종 항생제 내성을 유도하였다.
상기에서 항생제 내성이 유도된 균을 순수분리하여 NTG를 함유한 완충액에 부유시킨 후 원심분리하여 균체를 모으고 같은 완충액에 세척한 후 재부유시킨다. 2~4시간 방치후 리팜피신을 50~400μg 함유한 한천배지에서 순수 분리하고, 분리한 균을 증량계대법으로 리팜피신-구배 플레이트에서 10~30회 계대배양한 후 분리하여 보존하였다.
이상과 같이 변이처리된 본 발명에 따르는 신규 변이 유산균을 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2로 명명하고 1998년 12월 17일로 대한민국 특허균주기탁기관인 한국종균협회 미생물 보존 센터에 기탁하여 기탁번호 KFCC 11075호를 부여 받았다.
본 발명에 따르는 신규한 변이주인 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2 와 공지 균주인 그 모균주 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BIO
의 특성을 비교, 요약하면 하기 표2와 같다.
본 발명에 따르는 신규한 변이주는 증량계대법 및 NTG 처리되어 실험결과 리팜피신에 대한 강력한 내성(360μg/ml)을 갖고 있으며, 스트렙토마이신에 700μg/ml, 클로람페니콜에 100μg/ml, 테트라사이클린에 5μg/ml, 에리스로마이신에 1,000μg/ml, 아미노벤질 페니실린에 100μg/ml, 리팜피신에 360μg/ml, 페니실린 G에 150μg/ml, 세팔렉신에 150μg/ml, 겐타마이신에 30μg/ml, 린코마이신에 50μg/ml, 카나마이신에 2,500μg/ml의 내성이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명은 신규한 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2(KFCC-11075)를 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 제제를 제공하는 것을 특
징으로 한다.
본 발명에 따르는 신규한 유산균주인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 함유하는 유산균제제는 본 발명에 따르는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 순수분리하여 건조시켜 제조한 균말을 각종 부형제, 향료 및 각종 첨가제와 함께 액제 또는 정제 등 통상의 제형으로 제조할 수 있다.
이 때, 그 복용량은 항생제 복용량에 따라 가감될 수 있으나 통상 유산균말을 기준으로 약 1회 30 ~ 150 mg을 1일 2~3회 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르는 신규한 유산균주인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2는 동물실험을 통해 확인한 결과 종래의 유산균제제에 비하여 항생제 내성이 우수하여 장내 생존율이 크게 증가되는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한 신규한 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 함유하는 것을 특징으로 하는 동물용 사료를 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르는 신규한 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 함유하는 동물용 사료는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2 유산균말을 통상의 항생제를 함유하는 사료에 대하여 0.01~1 중량%를 혼합하여 제조할 수 있다.
본 발명에 따르는 신규한 유산균주인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2를 함유하는 동물용 사료는 실험을 통해 확인한 결과 통상의 항생제를 함유하는 사료만을 투여한 돼지에 비하여 체중증가 및 육질 개선효과가 있는 것으로 나타났다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예
는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제공되는 것으로 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1 : 균주 분리]
보령제약 주식회사가 유산균 균말 제조용으로 개발한 유산균인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BIO를 순수분리하여 1% 고기추출물, 1% 펩톤, 0.05% NaCl, 0.22% 효모엑스, 0.1% 탄산칼슘이 함유된 2% 락토스 한천 평판 배지에 도말하여 37℃ 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양결과 생긴균의 집락으로부터 단일 균주별로 분리하여 보존하였다.
[실시예 2 : 항생제 내성유도]
미리 조제된 2% 락토스 액체 배지 425ml가 든 삼각 플라스크에 각각의 항생제 농도를 단계적으로 높여서 함유하도록 만든 후, 상기 실시예 1에서 분리한 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BIO를 접종하여 37℃에서 3일간 배양하여 균의 발육이 안정한 최고 농도의 시험관에서 유산균을 채취하였다.
이 균주를 아미노벤질 페니실린을 30μg 함유한 2% 락토스 한천 배지에서 내성 균주를 분리한 후 보관하였다. 순수 분리된 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis)를 증량계대법으로 계속 계대 배양하여 내성을 유도하였다.
스트렙토마이신-구배 플레이트에서는 20회, 클로람페니콜-구배 플레이트에서는 25회, 테트라사이클린-구배 플레이트에서는 30회, 에리스로마이신-구배 플레이
트에서는 16회, 아미노벤질 페니실린-구배 플레이트에서는 10회 계대배양하여 각종 항생제 내성을 유도하였다.
[실시예 3 : 최소발육저지농도(MIC)의 측정]
상기 실시예 2에서 순수 분리된 유산균을 2% 락토스 배지에 현탁시켜 흡광도가 0.3이 되도록 조제하여 MIC(최소 발육 저지 농도) 측정용 균액으로 하였다. 먼저, 항생제 농도를 단계적으로 희석하여 첫 번째 시험관에는 예상되는 MIC 농도의 최고가 되게 하고, 그 이하는 2배씩 희석되게 하였다. 단계별로 희석된 항생제를 미리 준비된 2% 락토스 한천 배지(45℃ 유지)에 넣고 페트리디쉬에 부어서 굳힌다. 준비된 균액을 각각의 항생물질을 함유한 2% 락토스 한천 플레이트 위에 0.1ml 씩 도말하고 대조군으로 내성이 유도되지 않는 유산균도 도말하여 비교하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후 균의 성장이 없는 마지막 플레이트에 든 항생제의 농도를 최소발육저지농도(MIC)로 하였다. 그 결과를 하기 표 3 에 나타내었다.
하기 표 3 에 나타난 바와 같이 상기 실시예 2에서 유도된 내성균주는 모균주보다 각종 항생제에 대한 내성이 상당히 증가하였지만, 리팜피신은 오히려 내성이 감소된 것으로 나타났다.
[실시예 4 : 리팜피신 내성 변이주 분리]
상기 실시예 2에서 순수분리된 균을 150μg/ml의 NTG를 함유한 0.1M 시트르산 나트륨(trisodium citrate) 완충액(pH 5.6)에 30분간 부유시킨 후 원심분리하여 균체를 모으고 같은 완충액에 3회 세척한 후 재부유시킨다. 2시간 방치후 75μg의 리팜피신을 함유한 2% 락토스 한천배지로 순수 분리하고, 분리한 균을 증량계대법을 이용하여 리팜피신-구배 플레이트에서 20회 계대배양한 후 분리하여, 리팜피신 75μg, 아미노벤질 페니실린 30μg을 함유한 배지에 보존하였다.
상기에서 얻어진 변이주와 NTG 처리를 하지 않고 항생제만을 증량계대배양한 변이주에 대하여 각각 상기 실시예 3과 같은 방법으로 최소발육저지온도를 측정하였다. 본 결과, 하기 표 4에서와 같이 NTG 처리를 한 변이주는 NTG 처리를 하지 않은 변이주보다 리팜피신 내성이 33배 이상 증가하였으며, 다른 항생제에 대한 내성도 현저히 증가된 것으로 나타났다.
[실시예 5 : 유산균말 제조]
상기 실시예 4와 같은 방법에 의해 생성되어 순수분리된 균주를 사면 배양한 시험관에 생리식염수를 가하여 균체를 모은 후, 180g 의 탈지분유, 820ml 의 정제수 및 염산 L-시스테인 0.66g (pH 7.0)의 조성을 갖는 배지가 들어있는 250ml 삼각 플라스크에 넣고, 37℃에서 72시간 배양한다.
이 배양액을 배지 250l가 들어 있는 혐기성 배양조에 가하여 잘 혼합한 후 37℃에서 48시간동안 배양한 다음, 살포건조(spray drying) 시킨다. 이때 균주는 1x109/g 이상이었다.
[실시예 6 : 유산균 제제 제조]
상기 실시예 5에서 제조된 유산균말 6g (생균수 1x109/g)당 사카린나트륨 0.1g과 하이드록시프로필셀룰로오스 2.5g을 넣고, 적당량의 옥수수 전분, 향료 (레몬밀크)를 넣어 100g이 되도록 하여 잘 혼합하여 본 발명에 따르는 유산균 제제를
제조하였다.
마우스를 이용한 동물 실험을 통하여 상기 실시예 6에서 제조된 유산균 제제 1g을 각종 항생제와 1일 3회 병용 투여한 결과 총 내성균주의 수가 정상 마우스군의 균주수와 유사하였고, 투여기간동안 약간 증가하는 양상도 나타났다. 또한, 시판되고 있는 유산균 제제를 대조 시험한 결과, 장내 유산균주의 수가 보다 증가되는 것으로 나타났다.
[실시예 7 : 동물용 사료의 제조]
상기 실시예 5에서 제조된 유산균말을 기존의 항생제가 첨가된 사료에 첨가하여 약 3개월간 실험하였다. 항생제로는 테트라사이클린 2.0 mg/유산균말 1g/사료 kg, 리팜피신 0.36mg/유산균말 1g/사료 kg, 카나마이신 2.5mg/유산균말 1g/사료 kg 의 양을 사용하였다. 실험 대상으로는 74두의 돼지를 대조군과 시험군으로 나누어 3개월간의 평균 체중증가, 매일매일의 체중증가량, 사료의 효율(총 체중/사료소비량), 지방두께 감소 등을 측정하여 그 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
이상의 결과로부터 본 발명에 따르는 신규한 유산균인 엔테로코커스 패칼리
스(E. faecalis) BR2를 사료에 첨가하여 투여할 경우 기존의 항생제가 첨가된 사료만을 투여한 경우에 발생할 수 있는 장질환을 예방하여 이로인해 동물의 체중증가 및 육질 개선효과를 나타내는 것으로 보인다.
이상과 같이 본 발명에 따르는 신규 변이 유산균주인 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis) BR2는 리팜피신 및 각종 항생제에 강력한 내성을 가진 유산균주로서, 이러한 신규 변이 유산균주를 제제화하여 항결핵제나 항생제를 복용하는 환자에게 병용투여함으로써 항결핵제나 항생제의 약효를 그대로 유지하면서 유산균에 의한 장내 유해 세균 억제 및 균교대증으로 인한 설사 등의 부작용을 방지할 수 있다. 뿐만 아니라, 유산균 제제의 효과로서 기대되는 면역증강효과를 얻을 수 있다.
또한 본 발명에 따르는 신규 변이 유산균주를 사료에 첨가할 경우, 종래 사료에서 첨가된 항생제로 인해 살이 찌지 않고 육질이 나빠지는 현상을 방지하여, 균교대증 방지, 살이 찌고, 육질이 좋아지는 간접적인 효과도 기대된다.
Claims (3)
- 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2(KFCC-11075).
- 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2(KFCC-11075)를 함유하는 것을 특징으로 하는 유산균 제제.
- 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) BR2(KFCC-11075)를 함유하는 것을 특징으로 하는 동물용 사료.
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