KR20030096268A

KR20030096268A - 비대칭 아미노케톤 리덕타제 및 이의 핵산

Info

Publication number: KR20030096268A
Application number: KR10-2003-7011541A
Authority: KR
Inventors: 사카모토게이지; 기타신지; 쓰자키가즈야; 모리카와다다노리; 시미즈사카유; 가타오카미치히코
Original assignee: 다이이치 파인 케미칼 가부시키가이샤
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2003-12-24
Also published as: CA2440025C; CA2440025A1; WO2002070714A1; ATE480627T1; EP1371731B1; DE60237584D1; CZ20032343A3; CN100445386C; AU2002234942B2; JPWO2002070714A1; CN1610745A; EP1371731A4; EP1371731A1; KR100629642B1; US20040247583A1; US7166452B2; JP4136663B2

Abstract

본 발명은 1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여 d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 갖고 하기의 이화학적 성질을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제인 단백질 및 당해 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

기질: 1-2-메틸아미노프로피오페논

최적 pH: pH 8.1

최적온도: 55℃

조효소: NADP

분자량: 약 2850ODa 동종사량체

Description

비대칭 아미노케톤 리덕타제 및 이의 핵산{Aminoketone asymmetric reductase and nucleic acid thereof}

에페드린은 옛날부터 발한, 해열, 진해 등의 목적으로 사용되고 있지만 이중에서도 d-슈도에페드린은 항염증작용을 갖는 것으로 공지되어 있다. 또한, 1-에페드린에는 혈관 수축작용, 혈압 상승작용 또는 발한 등의 약리작용이 공지되어 있으며 교감신경 흥분제로서 의료에 사용된다. 또한, 1-에페드린은 기관지 천식 치료에도 사용된다. 즉, 광학활성 에페드린을 포함하는 광학활성 β-아미노알콜을 제조하는 방법은 의약 또는 이의 중간체를 제조하는 과정에서 유용하며 효율적인 제조방법이 요망되고 있다.

종래부터 목적하는 광학활성을 갖는 β-아미노알콜의 제조방법으로서는 라세미체의 β-아미노알콜을 수득한 다음, 광학분할 또는 비대칭 합성 등에 의해 특정한 광학활성체를 제조하는 방법이 사용되고 있다.

그러나 라세미체의 β-아미노알콜은 이의 분자내에 2개의 비대칭 탄소를 갖기 때문에 특정한 광학활성체를 얻기 위해서는 번잡한 공정을 경유하지 않으면 안된다.

예를 들면, 문헌[참조: Ger.(East) 13683, Aug, 27, 1957]에 의하면 β-아미노알콜의 1종류인 광학활성 에페드린의 경우, 벤즈알데히드로부터 효모를 이용한 발효에 의해 수득되는 광학활성 페닐아세틸카비놀에 메틸아민을 환원 축합함으로써 에리트로-1-2-메틸아미노-1-페닐-1-프로판올, 즉 1-에페드린을 제조할 수 있다고 보고되어 있다.

또한, 슈도에페드린을 수득하는 방법으로서는 다시 1-에페드린으로부터 무수 아세트산에 의해 옥사졸린을 생성한 다음, 가수분해하고 트레오체, 즉 d-슈도에페드린으로 반전시킴으로써 제조할 수 있는 것이 보고되어 있다(미국 특허 제4237304호).

상기한 바와 같이 1-페닐-2-메틸아미노-1-프로파논으로부터 목적하는 광학활성을 갖는 슈도에페드린을 제조하기 위해서는 일단, 광학활성 에리트로체의 에페드린을 수득한 다음, 트레오체로 반전시키는 공정이 필요함으로 공정수도 길고 번잡해지며 수율도 저하된다는 문제가 있다.

또한 당해 슈도에페드린의 제조에서는 원료의 케톤체를 환원할 때에 디아스테레오머가 상당량 부생되는 한편, 디아스테레오머의 원료로서의 회수가 곤란하며 경제적으로도 불리하다.

한편, 일본 공개특허공보 제(평) 8-98697호에 기재된 방법에 따르면 분자내에 비대칭 탄소원자 1개를 갖는 2-아미노-1-페닐에탄올 화합물로부터 특정한 미생물을 사용하여 광학활성 2-아미노-1-페닐에탄올 유도체를 제조할 수 있지만 2개의 비대칭 탄소원자를 갖는 β-아미노알콜에 관해서는 또한 효과적인 제조법이 없는 것이 현상황이다.

본 발명은 비대칭 아미노케톤 리덕타제, 상기 효소를 암호화하는 핵산, 상기 효소를 생성하는 미생물 및 이들을 사용하는 광학활성 아미노알콜의 제조방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 SDS-PAGE에 의한 전기영동 사진이다.

도 2는 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 pH 의존성을 도시한 것이다.

도 3은 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 온도 의존성을 도시한 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명이 적절한 실시 형태에 관해서 상세하게 설명한다.

또한, 본 명세서 및 도면에서 염기 및 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우에는 IUPAC-IUB[Commission on Biochemical Nomenclature]에 따르거나 당해 분야에서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 근거하는 것이다. 또한, 아미노산에 광학 이성체가 존재하는 경우에는 특별히 단정하지 않는 한, L-체를 나타낸다.

우선, 본 발명의 단백질에 관해서 설명한다.

본 발명의 단백질은 1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여 d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 가지며 또한, 하기의 이화학적 성질을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제인 것을 특징으로 하는 단백질이다.

기질: 1-2-메틸아미노프로피오페논

최적 pH: pH 8.1

최적온도: 55℃

조효소: NADP

분자량: 약 28500Da 동종사량체.

상기한 단백질은 1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여 d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 가질 뿐만 아니라 1-2-디메틸아미노프로피오페논, 아미노아세톤, 1-아미노-2-부타논에 대하여 환원활성을 나타낸다. 또한, 1-아미노-2-프로판올에작용하여 아미노아세톤를 생성한다.

상기한 이화학적 성질 이외의 성질로서 각종 금속이온 또는 억제제에 의한 영향에 관해서 검토가 이루어지고 있으며 α,α'-디피리딜, o-페난트롤린, EDTA에 의해 억제되는 것이 확인되고 있다.

상기한 단백질은 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 미생물을 배양하여 수득된 균체로부터 정제함으로써 수득된다.

상기 배양방법으로서는 사용되는 미생물이 생육될 수 있는 조건이면 특별한 제한이 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있으며 통상적으로 탄소원, 질소원, 기타 양분을 함유하는 액체 배지가 사용된다. 배지의 탄소원으로서는 미생물이 이용할 수 있으면 어느 것도 사용할 수 있다. 구체적으로는 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 덱스트린, 전분, 소르비톨 등의 당류, 메탄올, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이의 염류, 파라핀 등의 탄화수소류 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 질소원으로서는 미생물이 이용할 수 있으면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로는 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산의 암모늄염; 푸마르산암모늄, 시트르산암모늄 등의 유기산의 암모늄염; 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염; 고기 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 펩톤 등의 무기 또는 유기 질소 함유 화합물 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다. 또한, 배지에는 무기염, 미량 금속염, 비타민류 등의 통상적인 배양에 사용되는 영양원을 적절하게 첨가할 수 있다. 또한 필요에 따라 배지에는 미생물의 증식을 촉진하는 물질, 배지의 pH 유지에 효과적인 완충 물질 등을 첨가할 수 있다.

미생물의 배양은 생육에 적합한 조건하에 실시할 수 있다. 구체적으로는 배지의 pH 3 내지 10, 바람직하게는 4 내지 9, 온도 0 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 40℃에서 실시할 수 있다. 미생물의 배양은 호기적 또는 혐기적 조건하에 실시할 수 있다. 배양시간은 10 내지 150시간이 바람직하지만 각각의 미생물에 따라 적절하게 결정하여야 한다.

이와 같이 배양된 미생물은 이의 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균체를 수득하며 이러한 균체를 물 또는 완충액으로 잘 세정한다. 세정한 균체는 적당량의 완충액에 현탁하여 균체를 파쇄한다. 파쇄 방법으로서는 특별한 제한은 없지만 예를 들면, 유발, 다이노 밀, 프렌치 프레스, 초음파 파쇄기 등의 기계적 파쇄법을 들 수 있다. 수득된 균체의 파쇄액 중에서 고형물을 여과 또는 원심분리에 의해 제거하여 수득된 무세포 추출액 중의 비대칭 아미노케톤 리덕타제는 효소 분리의 통상적인 방법에 따라 채취된다.

이러한 효소 분리방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있지만 예를 들면, 황산암모늄 침전법 등의 염석; 세파덱스 등에 의한 겔 여과법; 디에틸아미노에틸기 또는 카복시메틸기 등을 가지는 담체 등을 사용하는 이온교환 크로마토그래피법; 부틸기, 옥틸기, 페닐기 등의 소수성기를 가지는 담체 등을 사용하는 소수성 크로마토그래피법; 색소 겔 크로마토그래피법; 전기영동법; 투석; 한외여과법; 친화성·크로마토그래피법; 고속 액체 크로마토그래피법 등에 의해 정제할 수 있다.

또한, 상기 효소를 고정화 효소로서 사용할 수 있다. 이러한 방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있지만 효소 또는 효소 생성 세포를 고정화시킨 것을 들 수 있으며 공유결합법이나 흡착법이라는 담체 결합법, 가교법, 포괄법 등에 의해 고정화할 수 있다. 또한 글루타르알데히드, 헥사메틸렌디이소시아네이트, 헥사메틸렌디이소티오시아네트 등의 축합제를 필요에 따라 사용할 수 있다. 또한, 다른 고정화법으로서는 예를 들면, 단량체를 중합반응으로 겔화시켜 실시하는 단량체법; 통상적인 단량체보다 큰 분자를 중합시키는 초기 중합체법; 중합체를 겔화시켜 실시하는 중합체법; 폴리아크릴아미드를 사용하는 고정화; 알긴산, 콜라겐, 젤라틴, 한천, κ-카라기난 등의 천연 고분자를 사용하는 고정화; 광경화성 수지, 우레탄 중합체 등의 합성 고분자를 사용하는 고정화를 들 수 있다.

이와 같이 정제된 효소는 전기영동(SDS-PAGE 등)에 의해서 단일 밴드가 확인되면 정제가 충분하게 실시된 것으로 판단한다.

또한, 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 미생물로서는 모르가넬라(Morganella)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 스핑고박테리움(Sphingobacterium)속, 노카르디오이데스(Nocardioides)속, 무코르(Mucor)속, 아브시디아(Absidia)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 그리폴라(Grifola)속, 유로티움(Eurotium)속, 가노데르마(Ganoderma)속, 하이포크레아(Hypocrea)속, 헬리코스틸룸(Helicostylum)속, 베르티실리움(Verticillium)속, 푸사리움(Fusarium)속, 트리티라치움(Tritirachium)속, 모르티에렐라(Mortierella)속,아르밀라리엘라(Armillariella)속, 실린드로카르폰(Cylindrocarpon)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 아우레오박테리움(Aureobacterium)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus)속, 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물 그룹에서 선택되는 하나 이상의 미생물인 것이 바람직하며 보다 구체적으로는 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii), 마이크로박테리움 아르보레센스(Microbacterium arborescens), 스핑고박테리움 멀티보룸(Sphingobacterium multivorum), 노카르디오이데스 심플렉스(Nocardioides simplex), 무코르 암비구스(Mucor ambiguus), 무코르 쟈바니쿠스(Mucor javanicus), 무코르 프라길리스(Mucor fragilis), 아브시디아 리히테이미(Absidia lichtheimi), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 캔디두스(Aspergillus candidus), 아스퍼질러스 오리재 변종 오리재(Aspergillus oryzae var. oryzae), 아스퍼질러스 포에티두스 변종 아시두스(Aspergillus foetidus var. acidus), 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum), 그리폴라 프론도사(Grifola frondosa), 유로티움 레펜스(Eurotium repens), 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum), 하이포크레아 젤라티노사(Hypocrea gelatinosa), 헬리코스틸룸 니그리칸스(Helicostylum nigric ans), 베르티실리움 펀지콜라 변종 펀지콜라 (Verticillium fungicola var. fungicola), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 트리티라치움오리재(Tritirachium oryzae), 모르티에렐라 이사벨리나(Mortierella isabellina), 아르밀라리엘라 멜레아(Armillariella mellea), 실린드로카르폰 스클레로티게눔(Cylindrocarpon sclerotigenum), 클레브시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 아우레오박테리움 에스테라로마티쿰(Aureobacterium esteraromaticum), 크산토모나스(Xanthomonas sp.), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis), 마이코박테리움 디에른호페리 (Mycobacterium diernhoferi), 마이코박테리움 바카에 (Mycobacterium vaccae), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei), 마이코박테리움 포르투이툼(Mycobacterium fortuitum), 마이코박테리움 클로로페놀리쿰(Mycobacterium chlorophenolicum), 스포로볼로마이세스 살모니칼라(Sporobolomyces salmonicolor), 스포로볼로마이세스 코랄리포르미스(Sporobolomyces coralliformis), 스포리디오볼루스 존소니이(Sporidiobolus johnsonii), 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococus erythropolis), 로도코쿠스 로도크로우스(Rhodococcus rhodochrous)를 들 수 있다.

상기 미생물은 야생주, 변종주 또는 세포 융합 또는 유전자 조작법 등의 수법에 따라 유도되는 재조합체 등의 어떤 주라도 양호하며 하나 이상을 사용하면 양호하다.

또한, 본 발명에 따른 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 미생물의 1종류이며 특히 효과적인 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 신규 미생물로서 로도코쿠스에리트로폴리스 MAK-34주를 들 수 있다. 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주는 본 발명자 등이 자연계에서 분리한 신규인 미생물이며 수탁번호: FERM BP-7451로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1가 1반지 1 쥬오 제6)에 평성 13년 2월15일에 수탁되어 있다.

로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주의 균학적 성질은 하기와 같다.

분류학적 성질

(1)형태적 성질

세포의 형상: 간균

세포의 크기: 1.0×1.5 내지 2.0μm

특징: V형 형성

운동성: -

포자: -.

(2)배양적 성질

배양온도: 30℃

콜로니 형태: 원형, 주변 침식형, 볼록형, 약간 광택이 있으며 크림색

젤라틴의 액화: -.

(3)생리학적 성질

그램 염색: +

질산염 환원: -

시트르산염의 이용: +

우레아제: +

옥시다제: -

카타라제: +

산소에 대한 반응: 호기성

0/F 테스트: -

피라지미다제: -

피롤리도닐알릴아미다제: -

알칼리포스포타제: +

β-글루쿠로니다제: -

β-갈락토시다제: -

α-글루코시다제: +

N-아세틸-β-글루코사미니다제: -

에스쿨린(글루코시다제): +

탄수화물의 이용성

락트당: -

맥아당: +

만노스: +

벤조산염: +

부탄-2,3-디올: +

시트라콘산: -

D-만델산: -

DL-노르로이신: +

피멜산: -

스페르민: -.

(4) 16S rRNA의 전체 염기서열을 해석하여 Micro Seq의 데이터 베이스와 대조한다.

당해 주와 근연(近緣)으로 되는 균주와 이의 상이성

로도코쿠스 에리트로폴리스 0.56%

로도코쿠스 글로베룰루스(Rhodococcus globerulus) 0.76%

쓰카무렐라 라티스라비엔시스(Tsukamurella wratislaviensis) 2.54%

로도코쿠스 파스시안스(Rhodococcus fascians) 2.94%

이상의 결과에서 로도코쿠스 에리트로폴리스가 상동률 99.44%로서 가장 근연인 균군이라는 발견이 얻어진다.

또한, 본 발명의 단백질은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한, 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질이다.

이러한 결실, 삽입, 치환, 부가를 실시하는 방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 일본생화학회편, 「속생화학실험강좌l, 유전자 연구법II」, p105(히로세 스스무), 도쿄가가쿠도진(1986); 일본생화학회편, 「신생화학실험강좌2, 핵산 111(재조합 DNA 기술)」, p233(히로세 스스무), 도쿄가가쿠도진(1992); 문헌[참조: R, Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. l54, p.350 & p.367, Academic Press, New York(1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p.457 & p.468, Academic Press, New York(1983); J.A. Wells et al., "Gene", Vol. 34, p.315(1985); T. Grundstroem et al., "Nucleic Acids Res", Vol. 13, p.3305(1985); J. Taylor et al., "Nucleic Acids Res.", Vol.13, p.8765(1985); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol.155, p.568, Academic Press, New York(1987); A.R. Oliphant et al., "Gene", Vol. 44, p.177(1986)]에 기재된 방법을 들 수 있다. 구체적으로는 예를 들면, 합성 올리고뉴클레오타이드 등을 이용하는 위치 지정 변이 도입법(부위 특이적 변이도입법), Kunkel법, dNTP[αS]법(Eckstein)법, 아황산이나 아질산 등을 사용하는 영역 지정 변이도입법 등의 방법을 들 수 있다.

또한, 다수의 단백질에는 당쇄가 부가되어 있는 경우가 있으며 아미노산을 1 또는 복수 치환함으로써 당쇄의 부가를 조절할 수 있다. 따라서, 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 당쇄가 조절된 단백질도 상기한 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 한은 본 발명의 단백질에 포함된다.

또한 수득된 본 발명의 단백질은 화학적인 수법으로 이의 함유되는 아미노산 잔기를 수식할 수 있으며 펩티다제, 예를 들면, 펩신, 키모트립신, 파파인,브로멜라인, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제 등의 효소를 사용하여 수식하거나 부분 분해하거나 하여 이의 유도체로 개변할 수 있다.

또한, 유전자 재조합법으로 제조할 때에 융합 단백질로서 발현시켜 생체내 또는 생체외에서 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 것으로 변환·가공할 수 있다. 이러한 경우, 유전공학적으로 상용되는 융합생성법을 사용할 수 있지만 이러한 융합 단백질은 당해 융합부를 이용하여 친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 단백질 구조의 수식·개변 등은 예를 들면, 일본생화학회편, 「신생화학실험강좌l, 단백질VII, 단백질공학」, 도쿄가가쿠도진(1993)을 참고로 하여 여기에 기재된 방법 또는 여기서 인용된 문헌에 기재된 방법, 또한 이들과 실질적으로 동일한 방법으로 실시할 수 있다.

또한, 본 발명은 1개 이상의 아미노산 잔기가 동일한 지점에서 천연의 것과 상이한 것, 1개 이상의 아미노산 잔기의 위치가 천연의 것과 상이한 것일 수 있다. 본 발명은 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제에 특유한 아미노산 잔기가 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등) 결실되어 있는 결실 유연체, 특유의 아미노산 잔기의 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등)이 다른 잔기로 치환되어 있는 치환 유연체, 1개 이상(예: 1 내지 80개, 바람직하게는 1 내지 60개, 보다 바람직하게는 1 내지 40개, 더욱 바람직하게는 1 내지 20개, 특히는 1 내지 10개 등)의 아미노산 잔기가 부가되어 있는 부가 유연체도 포함한다. 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 특징인 도메인 구조를갖고 있는 것도 포함될 수 있다. 또한, 동질의 비대칭 아미노케톤 리덕타제 활성을 갖는 것도 들 수 있다.

천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 특징인 도메인 구조가 유지되어 있으면 상기와 같은 변이체는 모두 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제와 실질적으로 동등한 1차 구조 형태 또는 이의 일부를 갖는 것도 포함될 수 있다고 생각되며 또한 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제와 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 갖는 것도 포함될 수 있다고 사료된다. 또한 천연에서 생기는 변이체의 하나인 것도 될 수 있다. 이러한 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제는 하기에서 설명한 바와 같이 분리·정제 처리될 수 있다. 한편, 이와 같이 하여 본 발명은 상기한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열, 그리고 천연의 특성의 전부 또는 일부를 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 폴리펩타이드, 또한 이의 유연체 또는 유도체를 암호화하는 DNA 서열도 포함된다. 당해 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 염기서열은 수식(예: 부가, 제거, 치환 등)한 것도 될 수 있으며 이러한 수식된 것도 포함될 수 있다.

다음에 본 발명의 핵산에 관해서 설명한다.

본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

즉, 1개의 아미노산을 암호화하는 염기서열(코돈)은 복수 존재하므로 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산은 다수 존재한다. 따라서, 이러한 핵산도 본 발명의 핵산에 포함된다. 여기서, 「단백질을암호화한다」는 것은 DNA가 이본쇄인 경우에는 이본쇄의 어느 한 상보쇄가 단백질을 암호화하는 염기서열을 갖는 것을 포함하는 것을 의미하므로 본 발명의 핵산에는 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 직접 암호화하는 염기서열로 이루어진 핵산 또는 이의 상보적인 염기서열로 이루어진 핵산도 포함된다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열은 상기한 미생물로부터 게놈 DNA를 추출하며 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 아미노산 서열에 기초하여 설계한 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR(폴리머라제 연쇄 반응)법에 의해 수득되는 DNA의 염기서열이다.

여기서, 상기 미생물로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법으로서는 특별한 제한은 없지만 예를 들면, 배양하여 수득한 미생물(예: 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주)의 균체를 파쇄하며 통상적인 방법에 따라 염색체 DNA를 원심분리한 다음, RNA를 분해 제거하며 단백질 제거조작을 실시하여 DNA를 정제한다. 이들 조작에 관해서는 「식물 바이오테크놀로지 실험 매뉴얼: 농촌문화사, 252페이지」를 참조할 수 있다. 또한 로도코쿠스속에 속하는 비대칭 아미노케톤 리덕타제 생성능을 갖는 미생물이면 DNA원으로서 적절하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 PCR에 사용되는 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 작제방법으로서는 공지된 방법을 사용할 수 있으며 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 아미노산 정보에 근거하여 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 작제한다.

예를 들면, 상기한 미생물인 동시에 비대칭 아미노케톤 리덕타제 생성능을 갖는 미생물로부터 수득된 정제된 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 아미노산 정보에 근거하여 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 작제할 수 있다. 일반적으로는 아미노산 서열을 기초로 축퇴성·프라이머 등을 작제한다. 프라이머의 작제는 당해 분야에서 공지된 방법으로 실시할 수 있으며 예를 들면, DNA 자동 합성장치를 사용하여 포스포디에스테르법, 포스포트리에스테르법, 포스포아미다이트법 등에 의해 합성할 수 있다. 구체적으로는 로도코쿠스·에리트로폴리스를 영양 배지중에서 배양하여 수득한 균체로부터 비대칭 아미노케톤 리덕타제를 정제하며 필요에 따라 펩타이드 가수분해 효소 등으로 단편화하여 이러한 효소의 아미노산 서열의 정보를 수집한다. 이와 같이 수득된 아미노산 서열의 정보로부터 바람직한 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 작제한다. 이러한 프라이머를 사용하여 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 게놈 DNA를 주형(鑄型)으로 하여 PCR을 실시한다.

PCR 반응은 당해 분야에서 공지된 방법 또는 이와 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 실시할 수 있지만 예를 들면, 문헌[참조: R. Saiki, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350(1985); R. Saiki, et al., Science, Vol. 239, pp. 487(1988); Henry A. Erlich, PCR Techno1ogy, Stockton Press]등에 기재된 방법에 따라서 실시할 수 있다. 반응은 예를 들면, 시판하는 키트나 시약을 이용하여 실시할 수 있다.

수득된 증폭 DNA 단편을 서열분석하여 정제 효소의 아미노산 서열과 상동인 서열을 함유하는 것을 확인하며 이것을 방사성동위원소로 표지하여 프로브로서 다음의 실험 등에 사용한다. 염기서열의 결정은 디데옥시법, 예를 들면, M13 디데옥시법 등의 맥삼 길버트(Maxam-Gilbert)법 등을 사용하여 실시할 수 있지만 시판하는 서열분석 키트, 예를 들면, Taq 디프라이머 사이클 서열분석 키트 등을 사용하거나 자동 염기서열 측정장치, 예를 들면, 형광 DNA 서열분석 장치 등을 사용하여 실시할 수 있다. 프로브 등을 방사성 동위원소 등에 의해 표지하는 데는 시판하는 표지 키트, 예를 들면, 무작위 기본 DNA 라벨링 키트(Boehringer Mannhaim) 등을 사용하여 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자는 예를 들면, 다음 방법으로 클로닝할 수 있다. 구체적으로는 유전자 재조합 기술은 예를 들면, 문헌[참조: T. Maniatis et al., "Molecular Cloning", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.T.(1989); 일본생화학회편, 「속생화학실험강좌l, 유전자 연구법 II」, 도쿄가가쿠도진(1986); 일본생화학회편, 「신생화학실험강좌2, 핵산 III(재조합 DNA 기술)」, 도쿄가가쿠도진(1992); R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68, Academic Press, New York(1980); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100 ＆ 10l, Academic Press, New York(1983); R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 153, 154 ＆ 155, Academic Press, New York(1987)]등에 기재된 방법 또는 이들 문헌에서 인용된 문헌에 기재된 방법 또는 이들과 실질적으로 동일한 방법이나 개변법에 의해 실시할 수 있다. 이들 수법은 본 발명의 목적에 맞추어서 공지된 수법에 독자적인 개변 개량을 가할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열을 갖는 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

본 명세서에서 본 발명에 따른 「엄중 조건하에 하이브리드화한다」란 2개의 DNA 단편이 문헌[참조: 샘브룩 등(Sambrook, J.)의 「대장균에서의 클론 유전자의 발현(Expression of cloned genes in E. coli)」[Molecular Cloning: A laboratory manual(1989)] Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 9. 47-9. 62 및 11.45-11.61]에 기재된 하이브리드화 조건하에 서로 하이브리드화한다는 것을 의미한다.

보다 구체적으로는 「엄중 조건」이란 약 45℃에서 6.0×SSC에서 하이브리드화를 실시하는 것을 가리킨다. 엄중 조건의 선택을 위해 세정공정에서의 염 농도를 예를 들면, 낮은 엄중 조건으로서 약 2.0×SSC, 50℃로부터 높은 엄중 조건으로서 약 0.1×SSC, 50℃까지 선택할 수 있다. 또한, 세정공정의 온도를 낮은 엄중 조건의 실온, 약 22℃로부터 높은 엄중 조건의 약 65℃까지 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산이다.

다음에 본 발명의 벡터에 관해서 설명한다.

본 발명의 벡터는 상기한 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터이다.

여기서, 상기 핵산이 도입되는 플라스미드로서는 유전공학적으로 상용되는 숙주 세포(예: 대장균, 고초균 등의 원핵세포 숙주, 효모 등의 진핵세포 숙주) 중에서 상기 핵산에 암호화되어 있는 단백질이 발현될 수 있는 플라스미드이면 어떠한 플라스미드라도 양호하다. 이러한 서열내에는 예를 들면, 선택한 숙주 세포로 발현하는 데 적절한 코돈을 도입하거나 제한효소 부위를 설치할 수 있다. 또한, 목적하는 유전자의 발현을 용이하게 하기 위한 제어서열, 촉진서열 등의 목적하는 유전자를 결합하는 데 유용한 링커, 어댑터 등, 또한 항생물질 내성 등을 제어하거나 대사를 제어하거나 하며 균체의 선별 등에 유용한 서열 등을 함유시킬 수 있다.

상기 플라스미드에 포함되는 프로모터로서는 대장균을 숙주로 하는 플라스미드에서는 예를 들면, 트립토판(trp) 프로모터, 락토스(lac) 프로모터, 트립토판·락토스(tac) 프로모터, 리보프로테인(lpp) 프로모터, λ 파아지 PL 프로모터를 들 수 있으며 효모를 숙주로 하는 플라스미드에서는 예를 들면, GALl, GAL 10 프로모터를 들 수 있다.

또한, 대장균을 숙주로 하는 플라스미드로서는 예를 들면, pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pVC119, pSP64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ-19R/-19U, pGEM-3, pGEM-4, pGEM-3Z, pGEM-4Z, pGEM-5Zf(-), pBluescript KSTM(Stratagene)을 들 수 있다. 대장균에서의 발현에 적합한 플라스미드 벡터로서는 pAS, pKK223(Pharmacia), pMC1403, pMC93l, pKC30 등을 들 수 있다.

효모를 숙주로 하는 플라스미드로서는 예를 들면, YIp형 벡터, YEp형 벡터, YRp형 벡터, YCp형 벡터, pGPD-2를 들 수 있다.

숙주 세포로서는 숙주 세포가 대장균의 경우, 예를 들면, 대장균 K12주에서 유래하는 것을 들 수 있으며 구체적으로는 NM533 XL1-Blue, C600, DHl, HB10l,JM109 등을 들 수 있다.

본 발명의 유전공학적 수법에서는 당해 분야에서 공지되거나 범용되고 있는 제한효소, 역전사 효소, DNA 단편을 클로닝하는데 적합한 구조로 수식하거나 또는 변환하기 위한 효소인 DNA 수식·분해효소, DNA 폴리머라제, 말단 뉴클레오타이드성 트란스페라제, DNA 리가제 등을 사용할 수 있다. 제한효소로서는 예를 들면, 문헌[참조: R.J. Roberts, Nucleic Acids Res, Vol. 13, r165(1985); S. Linn et al. ed. Nucleases, p.109, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982]에 기재된 것을 들 수 있다. 역전사 효소로서는 예를 들면, 마우스 몰로니 백혈병 바이러스(mouse Moloney leukemia virus; MMLV) 유래의 역전사 효소, 닭 골수 아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus; AMV) 유래의 역전사 효소를 들 수 있으며 특히는 RNase H 결손체를 바람직하게 사용할 수 있다. DNA 폴리머라제로서는 예를 들면, 대장균 DNA 폴리머라제, 이의 유도체인 크레노우·프래그먼트, 대장균 파아지 T4 DNA 폴리머라제, 대장균 파아지 T7 DNA 폴리머라제, 내열균 DNA 폴리머라제를 들 수 있다.

말단 뉴클레오타이드성 트랜스퍼라제로서는 예를 들면, 문헌[참조: R. Wu et al. ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p.96, Academic Press, New York(1983)]에 기재된 3'-OH 말단에 데옥시뉴클레오타이드(dNMP)를 부가하는 TdTase를 들 수 있다.

DNA 수식·분해효소로서는 예를 들면, 엑소뉴클레아제, 엔도뉴클레아제를 들 수 있으며 구체적으로는 예를 들면, 뱀독 포스포디에스테라제, 비장 포스포디에스테라제, 대장균 DNA 엑소뉴클레아제I, 대장균 DNA 엑소뉴클레아제III, 대장균 DNA 엑소뉴클레아제VII, λ 엑소뉴클레아제, DNaseI, 뉴클레아제Sl, 마이크로코쿠스(Micrococcus) 뉴클레아제를 들 수 있다.

DNA 리가제로서는 예를 들면, 대장균 DNA 리가제, T4 DNA 리가제를 들 수 있다.

DNA 유전자를 클로닝하여 DNA 라이브러리를 구축하는 데 적합한 벡터로서는 예를 들면, 플라스미드, λ 파아지, 코스미드, P1 파아지, F인자, YAC를 들 수 있다. 이중에서도 λ 파아지 유래의 벡터가 바람직하며 구체적으로는 예를 들면, Charon 4A, Charon 21A, λgt10, λgt1l, λDASHII, λFIXII, λEMBL3, λZAPII^TM(Stratagene)을 들 수 있다.

본 발명의 벡터를 상기한 바와 같은 숙주 세포에 도입함으로써 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제를 생성할 수 있는 미생물 또는 동물세포 등의 형질전환체가 수득된다. 이러한 형질전환체도 본 발명에 포함된다.

형질 전환방법으로서는 특별한 제한은 없으며 공지된 방법을 사용하여 실시할 수 있지만 예를 들면, 적당한 세포벽 용해효소를 사용하여 조제한 원형질체화한 세포에 염화칼슘, 폴리에틸렌글리콜 등의 존재하에 DNA를 접촉시키는 방법이나 인산칼슘법, 리포펙션법, 전기천공법(예: E. Neumann et al., "EMBO J", Vo.1, pp.841(1982)), 미세주입법, 유전자총에 의해 도입하는 방법을 들 수 있다.

또한 형질전환체를 사용함으로써 본 발명의 단백질을 재조합 단백질로서 제조할 수 있다. 이러한 재조합 단백질의 제조방법도 본 발명에 포함된다.

또한 본 발명의 단백질이 봉입체로서 수득되는 경우에는 가용화 처리, 예를 들면, 염산 구아니딘, 요소 등의 변성제, 또한 필요에 따라 2-머캅토에탄올, 디티오스레이톨 등의 환원제 존재하에 처리하여 활성형 효소로서 정제할 수 있다. 효소로서는 효소 생성세포를 그대로 사용할 수 있다.

재조합 단백질의 제조에 사용되는 형질전환체로서는 예를 들면, 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자를 도입한 벡터(pKK 223-3)를 보유하는 대장균(JM 109) MAK-EX41(BP-7452)을 들 수 있다. MAK-EX41은 평성13년 2월15일(원기탁일)로부터 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1가 1반 3호(우편번호 305-8566)의 경제산업성 산업기술종합연구소 생명공학공업기술연구소(NIBH)에 부타페스트 조약에 근거하여 기탁되어 있으며 수탁번호 BP-7452로서 보관되어 있다.

다음에 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법에 관해서 설명한다.

본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 상기한 단백질을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 아미노알콜의 제조방법이다.

화학식 1

화학식 2

상기식에서,

X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상이며,

n은 O 내지 3의 정수이며,

R¹은 저급 알킬기이며,

R²및 R³은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,

*는 비대칭 탄소이다.

우선, 본 발명에 따른 화학식 1의 α-아미노케톤에 관해서 설명한다.

화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물이며, 상기식에서, X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며, n은 0 내지 3의 정수이며, R¹은 저급 알킬기이며, R²및R³은 동일하거나 상이할 수 있으며 수소원자 및 저급 알킬기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며, *는 비대칭 탄소를 나타내는 구조를 갖는 것이다.

이하, α-아미노케톤에 함유되는 치환기 X에 관해서 설명한다. 상기 할로겐 원자로서는 불소원자, 염소원자, 브롬원자 및 요오드 원자 등을 들 수 있다.

또한, 저급 알킬기로서는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 바람직하며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다. 또한, 치환기로서 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 아미노기 또는 알콕시기 등을 가질 수 있다.

보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기의 보호기로서는 물로 처리하여 제거할 수 있는 것, 산 또는 약염기로 제거할 수 있는 것, 수소 첨가로 제거할 수 있는 것, 루이스산 촉매 및 티오요소 등으로 제거할 수 있는 것 등을 들 수 있으며 상기 보호기에는 치환기를 가질 수 있는 아실기, 치환기를 가질 수 있는 실릴기, 알콕시알킬기, 치환기를 가질 수 있는 저급 알킬기, 벤질기, p-메톡시벤질기, 2,2,2-트리클로로에톡시카보닐기, 알릴옥시카보닐기 및 트리틸기 등이 포함된다.

또한, 아실기에는 아세틸기, 클로로아세틸기, 디클로로아세틸기, 피발로일기, 벤조일기 및 p-니트로벤조일기 등이 포함된다. 또한, 치환기로서 하이드록실기, 알킬기, 알콕시기, 니트로기 및 할로겐 원자 등을 가질 수 있다. 실릴기에는 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기 및 트리아릴실릴기 등이 포함된다. 또한, 치환기로서 알킬기, 아릴기, 하이드록실기, 알콕시기, 니트로기 및 할로겐 원자 등의 치환기를 가질 수 있다. 알콕시알킬기에는 메톡시메틸기 및 2-메톡시에톡시메틸기 등이 포함된다. 저급 알킬기에는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 포함되며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다. 또한, 치환기로서 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 아미노기 및 알콕시기 등을 가질 수 있다.

또한, X는 니트로기 또는 설포닐기일 수 있으며 구체적으로는 메틸설포닐기 등을 들 수 있다.

또한, X의 수 n은 0 내지 3의 정수이며, 바람직하게는 0이다.

또한, 화학식 I 중의 R¹은 저급 알킬기이다. 이러한 저급 알킬기로서는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 바람직하며 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다.

R²및 R³은 수소원자 또는 저급 알킬기이다. 저급 알킬기에는 탄소수 1 내지 6의 알킬기가 포함되며, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 이들은 직쇄상 또는 측쇄상의 어느 하나의 구조를 취할 수 있다.

또한, α-아미노케톤 화합물의 염으로서는 염산염, 황산염, 질산염, 인산염,탄산염 등의 무기산의 염 또는 아세트산, 시트르산 등의 유기산의 염을 들 수 있다.

α-아미노케톤은 대응하는 1-페닐케톤 유도체의 α 탄소를 할로겐화, 예를 들면, 브롬화한 다음, 브롬기 등의 할로겐을 아민으로 치환함으로써 용이하게 합성할 수 있다[문헌참조: Ger.(East) 1l, 332, Mar. 12, 1956].

또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물에 상기 형질전환체, 로도코쿠스속에 속하는 미생물 및 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 미생물을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 아미노알콜의 제조방법이다.

화학식 1

화학식 2

또한, 본 발명의 단백질은 상기한 것이다.

즉, 본 발명의 단백질은 1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여 d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 가지며 또한 하기의 이화학적 성질을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제인 것을 특징으로 하는 단백질이다.

기질: 1-2-메틸아미노프로피오페논

최적 pH: pH 8.1

최적온도: 55℃

조효소: NADP

분자량: 약 28500Da의 동종사량체

또한, 상기 단백질은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질, 상기 단백질의 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질이다.

또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법에서는 단백질을 대신하여 형질전환체, 로도코쿠스속에 속하는 미생물, 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주(FERM BP-7451호)를 직접 반응계 중에 첨가하여 광학활성 아미노알콜의 제조를 실시할 수 있다.

다음에 본 발명에 따른 화학식 2의 광학활성 아미노알콜에 관해서 설명한다.

화학식 2에서의 X, n, R^l, R², R³및 *는 화학식 1과 동일하다. 또한 목적하는 광학활성을 갖는 β-아미노알콜로서는 (1S, 2S)아미노알콜을 들 수 있다.

상기 반응을 실시할 때의 반응조건으로서는 예를 들면, 액체 배지에서 진탕 배양한 형질전환균을 집균하며 수득된 균체에 아미노케톤 수용액(0.1 내지 10% 농도)를 가하여 pH를 6 내지 8로 조정하면서 온도 10 내지 40℃에서 수시간 내지 1일 동안 반응시키면 양호하다. 반응 종료후, 균체를 분리하여 반응액 중의 생성물을 분리함으로써 광학활성 아미노알콜을 수득할 수 있다. 여기서 형질전환균의 처리 균체(건조 균체나 고정화 균체 등)나 형질전환균으로부터 수득되는 효소 또는 고정화 효소 등도 동일하게 하여 실시할 수 있다.

또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법에서는 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 용매화물을 반응 시스템에 추가로 가하여 반응을 실시함으로써 보다 효율적으로 광학활성 아미노알콜의 제조를 실시할 수 있다.

화학식 3

상기식에서,

A는 구조식 Y(여기서, R⁴는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R⁸과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이다)또는 Z(여기서, R⁵는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R⁶또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁶은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R⁵또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁷은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다)이며,

R⁸은 수소원자, 카복실기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, R⁴와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격, R⁶과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환이며,

R⁹는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기, 치환기를 가질 수 있는 아실기, R⁵또는 R⁶과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며,

R¹⁰은 수소원자 또는 치환될 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다.

화학식 3에서, 탄소수 1 내지 3의 알킬기로서는 직쇄상, 측쇄상의 어느 하나일 수 있으며 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기 등을 들 수 있다. 또한, 탄소수 1 내지 6의 알킬기로서는 직쇄상, 측쇄상의 어느 하나일 수 있으며 구체적으로는 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, i-부틸기, s-부틸기, t-부틸기, 펜틸기 및 헥실기 등을 들 수 있다. 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환으로서는 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로노닐 및 사이클로데카닐 등을 들 수 있다.

헤테로원자 1 내지 3개를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격에서 헤테로원자로서는 질소원자, 산소원자, 황원자를 들 수 있으며 특히 바람직하게는 질소원자, 산소원자를 들 수 있으며 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격으로서는 피롤리딘, 피페리딘, 이미다졸리딘, 피페라진, 테트라하이드로푸란, 테트라하이드로피란, 테트라하이드로티오펜 및 모르폴린 등을 들 수 있다.

또한, 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기로서는 메틸옥시카보닐기, 에틸옥시카보닐기, 이소프로필옥시카보닐기, 이소부틸옥시카보닐기 및 t-부틸옥시카보닐기 등을 들 수 있다. 아실기로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피오닐기, 부티릴기, 이소부티릴기, 피발로일기, 벤조일기 및 발레릴기 등을 들 수 있다. 상기한 탄소수 1 내지 3 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 탄소수 1 내지 6의 알킬옥시카보닐기 또는 아실기가 치환기를 갖는 경우에는 치환기의 종류, 치환 위치 및 치환기의 수로 한정되지 않지만 치환기로서는 예를 들면, 불소원자나 염소원자 등의 할로겐 원자, 하이드록실기, 알킬기, 카복실기, 아미노기, 알콕시기, 니트로기 및 아릴기 등을 들 수 있다. 또한, 약제학적으로 허용되는 염으로서는 염산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산의 염, 아세트산, 시트르산 등의 유기산의 염, Na, K, Mg, Ca, 암모니아 등의 무기염기의 염 및 트리에틸아민, 사이클로헥실아민 등의 유기염기의 염을 들 수 있다.

이러한 화학식 3의 화합물로서는 예를 들면, 1-아세틸아미노-2-하이드록시프로판, 1-메틸아미노-2-하이드록시프로판, 1-아미노-2-옥소프로판, 1-아미노-2-하이드록시사이클로펜탄, 1-아미노-2,3-디하이드록시프로판, L-트레오닌, 4-아미노-3-하이드록시부탄, 1-아미노-2-옥소사이클로헥산, 모르폴린, 3-하이드록시피롤리딘, 3-하이드록시피페리딘, 2-아미노메틸-테트라하이드로푸란, 1-(2-하이드록시프로필)아미노-2-하이드록시프로판, 1-t-부틸옥시카보닐아미노-2-하이드록시프로판, 2-아미노-3-하이드록시부탄, DL-세린, 1-아미노-2-하이드록시프로판, 1-아미노-2-하이드록시부탄, 1-아미노-2-하이드록시사이클로헥산을 들 수 있다. 이들 중에서 비대칭 탄소원자를 갖는 화합물에서는 특별히 기재가 없는 한, 광학활성체 또는 라세미체일 수 있다.

이들 활성 유도제를 배지중에 첨가함으로써 미생물의 활성이 유도되며 이후의 광학활성 β-아미노알콜의 생성은 무첨가시와 비교하여 효율적으로 진행된다.활성 유도제는 각각 단독으로 사용할 수 있거나 복수의 유도제의 혼합물로 사용할 수 있다. 이러한 활성 유도제의 첨가량은 배지에 대해 O.01 내지 10중량%가 바람직하다.

이상 설명한 바와 같이 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제, 예를 들면, 로도코쿠스 에리트로폴리스 유래의 천연의 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또한 이것과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 구조가 명백하게 되며 단백질을 암호화하는 염기서열을 함유하는 DNA로 형질전환시킨 숙주 세포, 당해 숙주 세포를 사용하는 단백질의 제조방법, 또한 이들 단백질 및 숙주 세포를 사용하는 광학활성 아미노알콜의 제조 등의 용도에서 비약적인 발전을 기대할 수 있으며 또한 비대칭 아미노케톤 리덕타제 그 자체의 개변에 의해 효소 활성의 비약적인 상승을 할 수 있게 한다.

발명의 개시

본 발명은 종래 기술이 갖는 과제를 감안하여 이루어진 것이며 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물로부터 목적하는 광학활성을 갖는 β-아미노알콜을 고수율이면서 또한 고선택적으로 제조할 수 있는 작용을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질, 단백질을 암호화하는 핵산, 핵산으로 형질전환시킨 형질전환체, 형질전환체를 사용하는 단백질의 제조방법 및 형질전환체 또는 단백질의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물로부터 효율적으로 광학활성 β-아미노알콜을 생산하는 신규 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은 상기 목적을 달성하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 특정한 미생물로부터 정제된 비대칭 아미노케톤 리덕타제를 사용함으로써 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물의 한쪽의 경상(鏡像) 이성체만을 환원시키며 대응하는 β-아미노알콜의 4종류의 이성체 중에서 1종류만을 선택적이면서 또한 고수율로 제조할 수 있는 것을 밝혀내고 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명의 단백질은 1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여, d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 가지며 또한, 하기의 이화학적 성질을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제인 것을 특징으로 하는 단백질이다.

기질: 1-2-메틸아미노프로피오페논

최적 pH: pH 8.1

최적온도: 55℃

조효소: NADP

분자량: 약 28500Da 동종사량체

또한, 본 발명의 단백질은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질이다.

또한, 본 발명의 단백질은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 또한 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 이들의 부분 펩타이드이다.

여기서 단백질의 염 또는 단백질의 부분 펩타이드의 염도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

또한, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 2에 기재된 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하며 또한, 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산이다.

여기서, 본 발명의 핵산은 서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열의 일부로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산일 수 있다.

이들 핵산을 플라스미드 등에 도입함으로써 본 발명의 벡터를 수득할 수 있다.

또한, 상기 벡터를 숙주에 도입함으로써 본 발명의 형질전환체를 수득할 수 있다. 이러한 형질전환체를 사용하여 제조한 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드의 제조방법은 상기한 형질전환체를 당해 형질전환체가 증식할 수 있는 배지중에서 배양하는 배양공정 및 배양공정에서 수득된 당해 형질전환체로부터 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드를 정제하는 정제공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

또한, 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드의 제조방법은 모르가넬라(Morganella)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 스핑고박테리움(Sphingobacterium)속, 노카르디오이데스(Nocardioides)속, 무코르(Mucor)속, 아브시디아(Absidia)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 그리폴라(Grifola)속, 유로티움(Eurotium)속, 가노데르마(Ganoderma)속, 하이포크레아(Hypocrea)속, 헬리코스틸룸(Helicostylum)속, 베르티실리움(Verticillium)속, 푸사리움(Fusarium)속, 트리티라치움(Tritirachium)속, 모르티에렐라(Mortierella)속, 아르밀라리엘라(Armillariella)속, 실린드로카르폰(Cylindrocarpon)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 아우레오박테리움(Aureobacterium)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus)속, 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물 그룹에서 선택되는 하나 이상의 미생물이며 또한, 1-2-메틸아미노프로피오페논을 환원하여 d-슈도에페드린을 생성하는 능력을 갖는 미생물을 배양하는 배양공정 및 배양공정에서 수득된 미생물로부터 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드를 정제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이다.

또한, 본 발명의 미생물은 로도코쿠스 속에 속하며 또한, 1-2-메틸아미노프로피오페논을 환원하여 d-슈도에페드린을 생성하는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 미생물이다.

이중에서도 미생물이 로도코쿠스 에리트로폴리스(Rhodococcus erythropolis) MAK-34주(FERM BP-7451호)인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 단백질 또는 이의 부분 펩타이드 또는 이들의 염을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 아미노알콜의 제조방법이다.

상기식에서,

X는 동일하거나 상이할 수 있으며 할로겐 원자, 저급 알킬기, 보호기로 보호될 수 있는 하이드록실기, 니트로기 및 설포닐기로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 기이며,

n은 O 내지 3의 정수이며,

R¹은 저급 알킬기이며,

*는 비대칭 탄소이다.

또한, 본 발명의 광학활성 아미노알콜의 제조방법은 화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 상기 형질전환체, 로도코쿠스속에 속하는 미생물 및 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 미생물을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 것을 특징으로 하는 광학활성 아미노알콜의 제조방법이다.

화학식 1

화학식 2

상기 광학활성 아미노알콜의 제조방법에서는 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 용매화물을 추가로 첨가하여 광학활성 아미노알콜을생성시키는 것이 바람직하다.

상기식에서,

A는 구조식 Y(여기서, R⁴는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R⁸과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이다) 또는 구조식 Z(여기서, R⁵는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R⁶또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁶은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R⁵또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁷은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다)이며,

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만 본 발명은 하기의 실시예로 한정되지 않는다.

실시예 1

(비대칭 아미노케톤 리덕타제의 정제)

로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34를 글루코스 1%, 인산수소 2칼륨 0.3%, 황산마그네슘·7수화물 0.02%, 펩톤 1.5%, 염화나트륨 0.2%, 효모 추출물 0.1%의 조성(pH 7.0)을 갖는 배지 5ml를 함유하는 시험관에 식균하여 28℃에서 3일 동안 진탕 배양한 것을 상기 조성을 갖는 배지 500ml에 접종하며 28℃에서 3일 동안 진탕 배양한다. 이전의 배양액을 상기 조성에 1-아미노-2-하이드록시프로판 0.1%를 가한 배지 50l에 접종하며 28℃에서 2일 동안 배양한다.

상기 배양액을 원심분리기로 처리하여 습균체 3785g을 수득한다. 이러한 균체 1kg에 글리세롤 10%, 염화니켈 1mM, 니코틴산 1mM을 함유하는 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.5) 1000ml를 가하여 90-100분 동안 초음파 파쇄한 다음, 초원심 분리(33,000rpm, 60분 동안)에 의해 무세포 추출액 759ml를 수득한다. 이러한 무세포 추출액을 완충액에 대하여 투석을 실시한다. 이러한 효소액 770ml를 DEAE-Se phacel 칼럼(5.6×20cm)에 부하하고 염화나트륨의 직선 농도 구배(0.15→0.8M)로 용리한다. 용출된 효소 활성 분획 173ml를 완충액에 대하여 투석을 실시한다. 이러한 효소액 173ml를 Mono Q HR 10/10 칼럼(1.0×10cm)에 부하하고 염화나트륨의 직선 농도 구배(0→0.6M)로 용리한다. 용출된 효소 활성 분획 28ml를 니코틴산을 함유하지 않은 완충액에 대하여 투석을 실시한다. 이러한 효소액 28ml를 HiTrap Blue(1ml)에 부하하고 10% 글리세롤, 1mM 염화니켈, 2mM 니코틴산, 1.0M 염화나트륨, 0.024% NADP⁺를 함유하는 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.5)으로 칼럼을 세정하여 용출된 효소 활성 분획 8.7ml를 수득한다. 수득된 효소액 8.7ml에 황산암모늄 1.2M을 가한 것을 페닐 슈퍼로스(Phenyl Superose) HR 5/5(0.5×5cm)에 부하하고 황산암모늄의 직선 농도 구배(1.2→0M)로 용리한다. 용출된 효소 활성 분획 2.12ml를 아미콘 YM10으로 한외여과하고 수득된 효소 농축액 150μl를 슈퍼로스 12HR 10/30(1.0×30cm)에 부하하고 글리세롤 10%, 염화니켈 1mM, 니코틴산 1mM, 염화나트륨 0.15M을 함유하는 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.5)으로 용리한다. 용출된 효소 활성 분획 1.45ml를 글리세롤 10%, 염화니켈 1mM, 니코틴산 1mM을 함유하는 10mM 트리스염산 완충액(pH 8.5)에 대하여 투석을 실시한 결과, 정제 효소 293μg을 함유하는 정제 효소액을 수득한다.

이와 같이 정제된 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 성질을 하기에 기재한다.

(1) 기질특이성 및 효소 활성:

1M 트리스염산 완충액(pH 8.0) 10μl, 16mM NADP+25μl, 정제 효소액 215μl를 43℃로 유지하며 1-아미노-2-하이드록시프로판 1μl를 가하여 아미노아세톤을 생성시킨다. 반응에 따르는 NADPH의 증감을 340nm 파장의 흡광도 변화로 측정한다. 효소 활성의 측정은 하기 조건에서 1분 동안에 1μmol의 1-아미노-2-하이드록시프로판이 산화되는 효소 활성을 1단위(U)로 한다. 그 결과, 전체 활성은 126mU, 비활성은 432mU/mg, 활성 수율은 0.22%이다.

동일하게 하여 1-2-메틸아미노프로피오페논, 1-2-디메틸아미노프로피오페논, 1-아미노-2-부타논에 작용하는 것이 확인된다.

(2) 분자량

겔 여과법을 사용하여 측정한 경우에는 약 105,000, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법을 사용하여 측정하는 경우에는 약 28,500이다(도 1). 이러한 점으로부터 본 효소는 분자량 약 28,500의 서브유니트 4개로 이루어진 4량체 단백질이라고 사료된다.

(3) 최적 pH

정제 효소액 10μl, 물 420μl, 1M 트리스염산 완충액 20μl, 16mM NADP⁺수용액 50μl를 혼합하여 45℃에서 항온 처리하며 1-아미노-2-프로판올 2μL를 가하여 반응시킨다. 분광 광도계로 340nm 흡광도의 시간 변화로부터 활성을 산출한다(도 2). 그 결과, 최적 pH는 약 8.1이다.

(4) 최적온도

정제 효소액 10μL, 물 420μL, 0.1MPIPES 완충액(pH 7.5) 20μL, 16mM NADP⁺수용액 50μL를 혼합하여 각종 온도에서 항온 처리하며 1-아미노-2-프로판올 2μL를 가하여 반응시킨다. 분광 광도계로 340nm 흡광도의 시간 변화로부터 활성을 산출한다(도 3). 그 결과, 최적온도는 55℃이다.

(5) 억제제, 금속이온의 영향:

1mM 농도의 α,α'-디피리딜, 1mM 농도의 o-페난트롤린, 1mM 농도의 EDTA에 의해 각각 효소 활성은 억제된다.

실시예 2

(비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자의 클로닝과 대장균에서의 발현)

(1) 정제 효소의 아미노산 부분서열 결정

동결건조한 비대칭 아미노케톤 리덕타제 1nmol을(서브유니트 분자량 약 28,500으로서) 8M 요소를 함유하는 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.6) 50μl에 용해하고 37℃에서 1시간 동안 변성시킨다. 여기에 50mM 트리스염산 완충액(pH 8.6)50μL를 첨가하여 요소 농도를 4M로 한다. 12nmol/ml의 라이실엔도펩티다제(와코쥰야쿠) 0.5μl(0.006nmol, E/S=l/167)을 첨가하고 30℃에서 6시간 동안 분해를 실시한다. 수득된 분해 펩타이드를 역상 칼럼(아마샴파마시아바이오테크)로 분취(分取)하여 ABI사 476A 단백질 서열분석기로 아미노산 서열의 분석을 실시한다. 결과는 하기와 같다.

①MFNSIEGRSVVVTGGSK(N 말단)(서열 3)

②RLGEMTSEDMDSVFGVNVK(서열 4)

③AAQMGFIRTAAIELAPK(서열 5)

④XXILAVQAMMPXL(서열 6)

⑤XITINAVLPGNVITEGLDGLGQEYLDQM(서열 7).

상기 펩타이드의 분취조건을 하기에 기재한다.

시스템: SMART 시스템

칼럼: μRPC C2/C18 SC2.1/10

유속: 10Oμl/분

용리액: A, 0.1% TFA

B, 0.1% TFA/80% CH₃CN

용출 조건: 0-15분(100% A)→15-75분(100% A→100% B)의 농도 구배 용출

칼럼 온도: 실온

검출 파장: 214nm 및 280nm.

(2)게놈 DNA의 작제

대수 증식기 후기의 균체(MAK-34)를 원심분리기로 집균한다. 수득된 균체를 TES 완충액(5mM Tris, 1mM EDTA, 2.5% 슈크로스, pH 8.0)에 현탁한다. 이러한 현탁액에 EDTA, H₂O, 라이소자임과 프로테이나제 K를 첨가하고 37℃에서 2.5시간 동안 천천히 교반한다. 여기에 SDS 첨가후, 교반한 용균 샘플을 페놀, 페놀/클로로포름, 클로로포름으로 순차적으로 처리하여 단백질 제거조작을 실시한다. 여기에 3M 아세트산나트륨 1/10 용적, 에탄올 2.5배 용적을 첨가하여 DNA를 유리 막대에 감아 붙인다. 이것을 70%, 80%, 90%의 에탄올로 순차적으로 세정하여 바람으로 건조시킨 DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1mM EDTA, pH 7.8)에 용해하며 RNase A 처리한 샘플을 페놀, 페놀/클로로포름, 클로로포름으로 순차적으로 처리하여 단백질 제거조작을 실시한다. 여기에 3M 아세트산나트륨 1/10 용적, 에탄올 2.5배 용적 첨가하여 DNA를 침전시킨 다음, 70% 에탄올로 세정하여 바람으로 건조시킨 후에 TE 완충액에 용해하여 게놈 DNA 용액(36ng/μ)을 수득한다.

(3) 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자의 증폭

비대칭 아미노케톤 리덕타제의 내부 펩타이드의 아미노산 서열(서열 3 내지 7)을 기초하여 하기와 같은 염기서열을 갖는 N-말단 아미노산 서열의 센스 스트랜드에 대응하는 센스 프라이머 MAK-센스l(서열 8)과 내부 펩타이드 서열의 안티센스 스트랜드에 대응하는 안티센스 프라이머 MAK-안티1(서열 9)를 각각 합성한다. MAK-센스1 및 MAK-안티1은 각각 축퇴성 프라이머(degenerate primer)이며 염기서열중에서 y는 T 또는 C, s는 C 또는 G, h는 T 또는 C 또는 A, r은 A 또는 G, m은 C 또는 A, w는 A 또는 T, n은 A 또는 C 또는 G 또는 T를 각각 나타낸다.

MAK-센스1:

Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg(서열 3의 일부)

ATG TTy AAy wsn ATh GAr GGn mG(서열 8)

MAK-안티1:

Met Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Gly Leu(서열 7의 일부)

CAT yTG rTC nAr rTA yTC yTG nCC nA, (서열 9).

비대칭 아미노케톤 리덕타제의 게놈 DNA를 주형으로 하여 하기 조건으로 PCR을 실시한다. PCR 증폭은 예를 들면, 문헌[참조:R. Sakai, et al., Science, Vol. 230, pp. 1350(1985); R. Sakai, et al., Science, Vol. 239, pp. 487(1988); PCR Technology, Stockton Press(1989)] 등에 기재된 방법에 따라 실시된다. PCR 증폭에 의해 약 0.6kb의 증폭 DNA 단편을 수득한다.

하기에 PCR의 조건을 기재한다.

염색체 DNA(36ng/μl) 5μl

센스 프라이머(49μM) 3μl

안티센스 프라이머(41μM) 3μl

dNTP(각 2.5mM) 4μl

ExTaq 폴리머라제(TAKARA) 0.3μl

ExTaq 폴리머라제 완충액 5μl

H ₂ O 29.7μl

합계 50μl

또한, 온도조건은 하기와 같다.

94℃/4분

94℃/1분, 50℃/1분, 72℃/1.5분: 35사이클

72℃/10분.

수득된 증폭 DNA 단편의 염기서열을 결정한 후에 아미노산 서열로 변환한 바, 비대칭 아미노케톤 리덕타제의 내부 펩타이드의 부분 아미노산 서열과 동일한 영역이 발견된다.

염기서열을 결정할 때에 염기서열이 불명확한 영역의 염기서열의 결정을 하기 위해 역 PCR을 실시한다. 역 PCR은 예를 들면, 문헌[참조: H. Ochman, et al., Genetics, Vol. 120, pp. 621(1988)]등에 기재된 방법에 따라서 실시된다.

우선, 게놈 DNA 용액을 제한효소(BglII)로 처리하고 페놀클로로포름 처리, 에탄올 침전에 의해 수득된 DNA 단편을 T4 DNA 리가제(TAKARA)로 처리하여 자가 연결한다. 이것을 페놀클로로포름 처리, 에탄올 침전시킴으로써 수득되는 환형 DNA를 주형으로 하여 염기서열이 공지된 부분으로부터 설계한 센스 프라이머(IPCR-S1) 및 안티센스 프라이머(IPCR-A1)를 사용하여 하기 조건으로 PCR을 실시한다. PCR 증폭에 의해 약 2kb의 증폭 DNA 단편을 수득한다.

IPCR-A1(상류 방향)

AATACCCGGACCATTCCCAAGCCGAT(서열 10)

IPCR-S1(하류 방향)

TCGAAACTTCTGGGCGTGGAAGGGTT(서열 11)

하기에 PCR의 조건을 기재한다.

환형 DNA(500ng)

센스 프라이머(100μM) 0.5μl

안티센스 프라이머(100μM) 0.5μl

dNTP(각 2.5mM) 4μl

ExTaq 폴리머라제(TAKARA) 0.5μl

ExTaq 폴리머라제 완충액 5μl

H ₂ O 39.5μl

합계 50μl

또한, PCR시의 온도조건을 하기에 기재한다.

94℃/4분

94℃/1분, 60℃/1분, 72℃/4분: 30사이클

72℃/10분

수득된 증폭 DNA 단편의 염기서열을 결정하며 전번의 염기서열을 포함하여 780bp로 이루어진 ORF가 확인된다. 이것을 아미노산 서열로 변환한 결과, 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자 전체 길이를 포함하고 있는 것으로 판명되었다(서열1).

(4) 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자의 대장균에서의 발현

상기에서 명백해진 비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자의 염기서열을 기초하여 제한효소 부위를 부가한 프라이머를 설계한다. 하기에 이의 서열을 기재한다.

ExS

GATGAATTCCAAATGTTCAACTCCATTGA(서열 12)

EcoRI 개시

EsA

TGAAGCTTTCGTCGCTTGTCTTACAGTTC(서열 13)

HindIII 종료

이들 프라이머를 사용하여 게놈 DNA를 주형으로 하여 하기의 조건으로 PCR을 실시한다. 그 결과, 약 0.8kb의 증폭 DNA 단편이 수득된다. PCR의 조건을 하기에 기재한다.

게놈 DNA(36ng/μl) 5μl(180ng)

센스 프라이머(100μM) 0.5μl

안티센스 프라이머(100μM) 0.5μl

dNTP(각 2.5mM) 8μl

LA-Taq 폴리머라제(TAKARA) 0.5μl

LA-Taq 폴리머라제 완충액 5μl

Mg²⁺5μl

H ₂ O 25.5μl

합계 50μl

하기에 PCR시의 온도조건을 기재한다.

94℃/4분

94℃/1분, 60℃/1분, 72℃/1.5분: 25사이클

72℃/10분

이와 같이 수득된 PCR 산물은 양쪽 말단에 각각 EcoRI와 HindIII의 제한효소 부위를 가지므로 QIA 퀵 PCR 정제 키트(QIAGEN)로 정제한 다음, 제한효소(EcoRI와 HindIII)로 처리한다. 이것을 아가로스 겔 전기영동한 다음, 밴드의 절단 인출을 실시하고 GFX PCR DNA 겔 밴드 정제 키트로 정제한다. 이것을 제한효소(EcoRI와 HindIII)로 처리한 플라스미드 pKK223-3과 연결(Ligation Kit, TAKARA)하여 발현 벡터를 구축한다. 다음에 당해 벡터를 문헌[참조: "Molecular Cloning" second ed., 1989, ed. by J. Sambrook et al., Cold Spring Habor Laboratory Press]에 기재된 방법에 따라 사용하여 이. 콜리 JM109의 콤피턴트 세포를 형질전환시킨다. 또한, 당해 형질전환체는 암피실린 내성주를 콜로니 PCR함으로써 선택하며 형질전환 처리는 염화칼슘법에 따른다.

이러한 재조합 대장균 MAK-EX41을 트립토판 1%, 효모 추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%, 암피실린 100μg/mL, IPTG 1mM을 함유한 500mL 배지에서 37℃, 16시간 동안 진탕 배양한다. 수득된 균체를 물로 세정한 후, 초음파 처리하여 불용물을 제거하여 조효소 추출액 10ml를 조제한다. 이러한 조효소 추출액 0.1mL에 2-메틸아미노-1-페닐프로파논 염산염 1mg, 물, 1M 트리스염산 완충액(pH 7.5) 0.02mL, 글루코스 10mg, 글루코스데하이드로게나제 0.1mg, NADP+0.1mg을 가하여 혼합하며 1mL의 반응액으로 하여 37℃, 24시간 동안 반응시킨다. 반응후, 반응액으로부터 불용물을 제거하고 상등액을 HPLC 분석[μ Bondapakphenyl 워터즈사제, 직경 4mm, 길이 300mm, 용리액 0.05M 인산나트륨 완충액(아세토니트릴 7% 함유), pH 6.5, 유속 0.8mL/분, 검출 파장 UV 220nm]으로 처리한 결과, 0.5mg의 슈도에페드린이 생성된 것을 확인했다. 또한 HPLC 분석(스미키랄 AGP, 스미카분세키센터사제, 직경 4mm, 길이 150mm, 용리액 0.03M 인산나트륨 완충액, pH 7, 유속 0.5mL/분, 검출 파장 UV 220nm)으로 처리한 결과, 수득한 슈도에페드린은 모두 d-슈도에페드린인 것을 확인했다.

비대칭 아미노케톤 리덕타제 유전자를 도입한 벡터를 보유하는 대장균 MAK-EX41은 수탁번호: FERM BP-7452로서 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1가 1반지 1 쥬오 제6)에 평성13년 2월15일에 수탁되어 있다.

실시예 3

(d-(1S, 2S)슈도에페드린의 생성)

글루코스 1%, 펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.3%를 함유하는 배지 5ml에 표 1에 기재된 각 미생물을 식균하여 30℃, 48시간 동안 진탕 배양을 실시한다. 배양액을원심분리하여 균체를 수득한 다음, 시험관에 투입하고 여기에 0.1M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 1ml를 가하여 현탁시킨다. 여기에 dl-2-메틸아미노-프로피오페논 염산염 1mg를 가하고 30℃에서 24시간 동안 진탕하여 반응을 실시한다. 반응 종료후, 반응액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 HPLC로 처리하여 광학활성 슈도에페드린을 수득한다(μBondapakphenyl워터즈사제, 직경 4mm, 길이 300mm, 용리액 0.05M 인산나트륨 완충액(7% 아세토니트릴 함유), pH 5.0, 유속 0.8mL/분, 검출 광파장 UV 220nm).

절대 배치 및 광학순도는 HPLC(스미카분세키센터제 칼럼스미키랄 AGP, 직경 4mm, 길이 150mm, 0.03M 인산나트륨 완충액, pH 7.0, 유속 0.5mL/분, 검출 광파장 220nm)으로 측정한다. 그 결과, 표 1 및 표 2에 기재된 바와 같이 d-슈도에페드린 만이 선택적으로 수득된다.

생성된 d-슈도에페드린의 광학순도 및 생성량은 표 1 및 표 2와 같다. 이하, 생성량은 모두 염산염으로 환산한 양이다.

미생물	광학 순도(%)	생성량(mg/mL)
속	IFO	생성량(mg/mL)	d-에페드린	l-에페드린	d-슈도에페드린	l-슈도에페드린
마이크로박테리움 아르보레센스	3750	0	0	100	0	0.16
클레브시엘라 뉴모니에	3319	0	0	100	0	0.30
아우레오박테리움 에스테라로마티쿰	3751	0	0	100	0	0.14
크산토모나스 종	3084	0	0	100	0	0.049
슈도모나스 푸티다	14796	0	0	100	0	0.10
마이코박테리움 스메그마티스	IAM 12065	0	0	100	0	0.24
마이코박테리움 디에른호페리	14797	0	0	100	0	0.25
마이코박테리움 바카에	14118	0	0	100	0	0.28
모르티에렐라 이사벨리나	8308	0	0	100	0	0.15
실린드로카르폰 스클레로티게눔	31855	0	0	100	0	0.09
스포리디오볼루스 존소니이	6903	0	0	100	0	0.07
로도코쿠스 에리트로폴리스	MAK 34	0	0	100	0	0.30

미생물	생성량(mg/mL)	광학순도(%)
속	생성량(mg/mL)	IFO	d-슈도에페드린
노카르디오이데스 심플렉스	12069	0.35	99.0
마이코박테리움 플레이	13160	0.27	95.6
무코르 암비구스	6742	0.07	93.0
무코르 쟈바니쿠스	4570	0.04	95.0
무코르 프라길리스	6449	0.17	90.0
아브시디아 리히테이미	4009	0.04	93.0
아스퍼질러스 아와모리	4033	0.18	93.0
아스퍼질러스 니거	4416	0.11	90.0
아스퍼질러스 오리재	4177	0.18	91.0
아스퍼질러스 캔디두스	5468	0.07	94.0
아스퍼질러스 오리재	IAM 2630	0.08	92.0
아스퍼질러스 오리재 변종 오리재	6215	0.05	95.0
페니실리움 옥살리쿰	5748	0.06	94.0
그리폴라 프론도사	30522	0.08	92.0
유로티움 레펜스	4884	0.08	92.0
가노데르마 루시둠	8346	0.05	92.2
하이포크레아 젤라티노사	9165	0.27	92.2
헬리코스틸룸 니그리칸스	8091	0.27	93.2
아스퍼질러스 포에티두스 변종 아시두스	4121	0.43	91.9
베르티실리움 펀지콜라 변종 펀지콜라	6624	0.10	92.7
푸사리움 로세움	7189	0.40	89.6
트리티라치움 오리재	7544	0.34	92.0
아르밀라리엘라 멜레아	31616	0.28	91.0
스포로볼로마이세스 살모니칼라	1038	0.14	95.0
스포로볼로마이세스 코랄리포르미스	1032	0.2	95.0

실시예 4

글루코스 1%, 펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.3%를 함유하는 배지에 모르가넬라 모르가니이 IFO 3848을 식균하여 30℃에서 48시간 동안 호기적으로 진탕 배양한다. 이러한 배양액 5ml를 원심분리하여 균체를 수득한 후에 바람으로 건조하여 수득된 건조 균체를 0.05M 트리스염산 완충액(pH 7.5) 1ml에 현탁 한다. 건조 균체 현탁액에 글루코스 50mg, 글루코스데하이드로게나제 0.2mg, NADP 0.6mg, NAD 0.6mg,d1-2-메틸아미노-프로피오페논 염산염 10mg을 가하여 28℃, 300rpm으로 왕복 진탕한다. 48시간 동안 반응을 실시한 다음, 반응액을 상기 실시예 3와 동일하게 HPLC에 의해 슈도에페드린의 생성량 및 광학순도를 측정한다.

그 결과, d-슈도에페드린 염산염이 0.79mg/ml 생성되며 이의 광학순도는 100%이다.

실시예 5

(유도제 첨가에 의한 영향(1))

배지 1(표 3)에 1-아미노-2-하이드록시프로판을 5g/L이 되도록 가하여 시험관에 5mL 투입하고 실리콘 마개를 하여 오토클레이브로 121℃, 30분 동안 멸균한다. 이러한 배지 및 유도제 무첨가의 배지에 각각 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주를 식균하여 30℃, 48시간, 300rpm에서 진탕 배양을 실시한다. 배양액 0.5ml를 10000G, 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거함으로써 수득된 균체에 물을 가하여 현탁하며 균일한 현탁액으로 한다. 여기에 물, 완충액, dl-2-메틸아미노-프로피오페논 염산염 10mg을 가하여 1mL로 하여 시험관에 투입하고 30℃, 12시간, 150rpm에서 진탕하여 반응을 실시한다. 반응 종료후, 원심분리하여 균체를 제거하며 상등액을 HPLC로 처리하여 슈도에페드린 생성량을 측정한다.[HPLC 조건: μBondapakphenyl워터즈사제, 직경 4mm, 길이 300mm, 용리액 0.05M 인산나트륨 완충액(7% 아세토니트릴 함유), pH 6.5, 유속 0.8mL/분, 검출 파장 UV 220nm]

그 결과, 표 4에 기재된 바와 같이 유도제를 첨가하여 배양하는 경우의 슈도에페드린의 생성량은 무첨가의 배양과 비교하여 현저한 증대를 나타낸다.

배지 1의 조성	배지 2의 조성	배지 3의 조성	배지 4의 조성
사카로스 1%옥수수침지액 0.5%인산1칼륨 0.1%인산2칼륨 0.3%p-아미노벤조산 0.01%pH 7.0	글루코스 0.1%트립톤 0.5%효모 추출물 0.5%인산2칼륨 0.1%pH 7.0	글루코스 1%박토펩톤 0.5%효모 추출물 0.3%pH 7.0	가용성 전분 1%글루코스 0.5%NZ 아민타입 A 0.3%트립톤 0.5%효모 추출물 0.2%인산2칼륨 0.1%황산마그네슘 7수화물 0.05%

번호	미생물	번호	배지	생성량(무첨가)mg	생성량(첨가)mg
1	로도코쿠스 에리트로폴리스	MAK-34	1	0.0180	1.260
2	마이코박테리움 클로로페놀리쿰	IFO-15527	3	0.0320	0.770
3	마이코박테리움 스메그마티스	IAM-12065	3	0.0480	0.210
4	노카르디오이데스 심플렉스	IFO-12069	2	0	0.190
5	클레브시엘라 뉴모니에	IFO-3319	2	0.0180	0.066
6	아브시디아 리히테이미	IFO-4409	4	0.0035	0.220
7	아스퍼질러스 아와모리	IFO-4033	4	0.00048	1.170
8	아스퍼질러스 캔디두스	IFO-5468	4	0.0092	0.018
9	페니실리움 시아네움	IFO-5337	4	0.0310	1.260
10	하이포크레아 젤라티노사	IFO-9165	4	0.0058	0.640
11	헬리코스틸룸 니그리칸스	IFO-8091	4	0.0067	0.520
12	트리티라치움 오리재	IFO-7544	4	0.0047	0.078
13	아르밀라리엘라 멜레아	IFO-31616	4	0.0042	0.460

실시예 6

(유도제 첨가에 의한 영향(2))

실시예 5의 미생물을 대신하여 표 4에 기재된 미생물 및 배지를 사용하는 것 외에는 실시예 5와 동일하게 하여 배양, 반응을 실시한다. 균체의 분리는 원심분리 또는 배양액에서의 여과[번호 (3) 및 번호 (6) 내지 (13)]에 의해 실시한다. 그 결과, 표 4에 기재된 바와 같이 1-아미노-2-하이드록시프로판을 첨가하여 배양하는 경우에 d-슈도에페드린의 생성량은 무첨가의 배양과 비교하여 현저한 증대를 나타낸다.

실시예 7

(유도제 첨가에 의한 영향(3))

실시예 5의 1-아미노-2-하이드록시프로판을 1-아미노-2-하이드록시부탄으로 대신하는 것 외에는 실시예 5와 동일하게 하여 배양, 반응을 실시한다. 균체의 분리는 원심분리 또는 배양액에서의 여과에 의해 실시한다. 그 결과, 표 5에 기재된 바와 같이 화합물을 첨가하여 배양하는 경우에 슈도에페드린의 생성량은 무첨가의 배양과 비교하여 현저한 증대를 나타낸다.

번호	미생물	번호	배지	생성량(무첨가)mg	생성량(첨가)mg
(14)	로도코쿠스 에리트로폴리스	MAK 34	1	0.018	0.65
(15)	마이코박테리움 스메그마티스	IAM-12065	3	0.048	0.17

실시예 8

(유도제 첨가에 의한 영향(4))

실시예 5의 1-아미노-2-하이드록시프로판을 1-아미노-2-하이드록시헥산으로 대신하는 것 외에는 실시예 5와 동일하게 하여 배양, 반응을 실시한다. 균체의 분리는 원심분리 또는 배양액에서의 여과에 의해 실시한다. 그 결과, 표 6에 기재된 바와 같이 화합물을 첨가하여 배양하는 경우에 슈도에페드린의 생성량은 무첨가의 배양과 비교하여 현저한 증대를 나타낸다.

번호	미생물	번호	배지	생성량(무첨가)mg	생성량(첨가)mg
(16)	로도코쿠스 에리트로폴리스	MAK 34	1	0.018	0.23
(17)	마이코박테리움 스메그마티스	IAM 12065	3	0.048	0.13

실시예 9

(유도제 첨가에 의한 영향(5))

사카로스 1.0%, 옥수수 침지액 0.5%, 인산2수소칼륨 0.1%, 인산수소2칼륨 0.3%, p-아미노벤조산 0.01%, 각종 유도제 0.1%를 함유하는 pH 7.0의 배지 5ml에 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34를 식균하여 30℃, 48시간 동안 진탕 배양을 실시한다. 배양액을 원심분리하여 균체를 수득한 다음, 시험관에 투입하고 여기에 0.2M 인산나트륨 완충액(pH 7.0) 1.0ml를 가하여 현탁한다. 여기에 dl-2-메틸아미노프로피오페논 염산염 10mg, 글루코스 20mg를 가하여 30℃에서 16시간 동안 진탕하여 반응을 실시한다. 반응 종료후, 반응액을 원심분리하여 균체를 제거하며 상등액을 HPLC로 처리하여 광학활성 슈도에페드린을 수득한다[μBondaspherephenyl Waters사제, 직경 4mm, 길이 150mm, 용리액 0.05M 인산나트륨 완충액(7% 아세토니트릴 함유, pH 6.5), 유속 0.8ml/분, 검출 파장 220nm].

이의 생성량은 표 7에 기재된 바와 같이 유도제 무첨가의 경우와 비교하여 현저하게 높은 값을 나타낸다.

번호	화합물명	생성량(mg)
(18)	1-아세틸아미노-2-하이드록시프로판	3.00
(19)	1-메틸아미노-2-하이드록시프로판	2.83
(20)	1-아미노-2-옥시프로판	1.97
(21)	1-아미노-2-하이드록시사이클로펜탄	1.93
(22)	1-아미노-2,3-디하이드록시프로판	1.55
(23)	L-트레오닌	1.12
(24)	4-아미노-3-하이드록시부탄산	0.97
(25)	1-아미노-2-옥시사이클로헥산	0.26
(26)	모르폴린	0.11
(27)	3-하이드록시피롤리딘	0.11
(28)	3-하이드록시피페리딘	0.10
(29)	2-아미노메틸-테트라하이드로푸란	0.10
(30)	1-(2-하이드록시프로필)아미노-2-하이드록시프로판	0.05
(31)	1-t-부틸옥시카보닐아미노-2-하이드록시프로판	0.05
(32)	2-아미노-3-하이드록시부탄	0.05
(33)	DL-세린	0.04
	무첨가	0.02

이상 설명한 바와 같이 본 발명의 비대칭 아미노케톤 리덕타제, 단백질, 핵산 및 미생물에 따르면 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물로부터 목적하는 광학활성을 갖는 β-아미노알콜을 고수율이면서 또한 고선택적으로 제조할 수 있는 작용을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제를 제공할 수 있게 된다. 또한 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질, 단백질을 암호화하는 핵산, 핵산으로 형질전환시킨 형질전환체, 형질전환체를 사용하는 단백질의 제조방법 및 형질전환체 또는 단백질의 용도를 제공할 수 있게 된다. 또한, α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물로부터 효율적으로 광학활성 β-아미노알콜로 변환시키는 신규 미생물을 제공할 수 있게 된다.

Claims

1-2-메틸아미노프로피오페논에 작용하여 d-슈도에페드린을 생성하는 작용을 갖고 하기의 이화학적 성질을 갖는 비대칭 아미노케톤 리덕타제인 단백질.

기질: 1-2-메틸아미노프로피오페논

최적 pH: pH 8.1

최적온도: 55℃

조효소: NADP

분자량: 약 2850ODa 동종사량체

서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.

서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖고 비대칭 아미노케톤 환원 활성을 갖는 단백질 또는 이들의 부분 펩타이드.

제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 단백질의 염 또는 단백질의 부분 펩타이드의 염.

서열목록의 서열 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산.

서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열을 갖는 핵산.

제5항에 따른 핵산과 엄중 조건하에 하이브리드화하고 비대칭 아미노케톤 환원활성을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산.

서열목록의 서열 2에 기재된 염기서열의 일부로 이루어진 핵산.

제5항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 핵산을 함유하는 벡터.

제9항에 따른 벡터를 보유하는 형질전환체.

제10항에 따른 형질전환체에서 발현시켜 수득되는 단백질 또는 이의 부분 펩타이드.

제10항에 따른 형질전환체를 당해 형질전환체가 증식될 수 있는 배지중에서 배양하는 배양공정 및 배양공정에서 수득된 당해 형질전환체로부터 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드를 정제하는 정제공정을 포함하는 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드의 제조방법.

모르가넬라(Morganella)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 스핑고박테리움(Sphingobacterium)속, 노카르디오이데스(Nocardioides)속, 무코르(Mucor)속, 아브시디아(Absidia)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 그리폴라(Grifola)속, 유로티움(Eurotium)속, 가노데르마(Ganoderma)속, 하이포크레아(Hypocrea)속, 헬리코스틸룸(Helicostylum)속, 베르티실리움(Verticillium)속, 푸사리움(Fusarium)속, 트리티라치움(Tritirachium)속, 모르티에렐라(Mortierella)속, 아르밀라리엘라(Armillariella)속, 실린드로카르폰(Cylindrocarpon)속, 클레브시엘라(Klebsiella)속, 아우레오박테리움(Aureobacterium)속, 크산토모나스(Xanthomonas)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스포로볼로마이세스(Sporobolomyces)속, 스포리디오볼루스(Sporidiobolus)속, 로도코쿠스(Rhodococcus)속에 속하는 미생물 그룹에서 선택되는 하나 이상의 미생물이고, 1-2-메틸아미노프로피오페논을 환원시켜 d-슈도에페드린을 생성하는 능력을 갖는 미생물을 배양하는 배양공정 및 배양공정에서 수득된 미생물로부터 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 부분 펩타이드를 정제하는 공정을 포함하는, 비대칭 아미노케톤 리덕타제 또는 이의 부분 펩타이드의 제조방법.

로도코쿠스 속에 속하고 1-2-메틸아미노프로피오페논을 환원시켜 d-슈도에페드린을 생성하는 능력을 갖는 미생물.

제14항에 있어서, 로도코쿠스 에리트로폴리스 MAK-34주(FERM BP-7451호)인 미생물.

화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 단백질 또는 이의 부분 펩타이드 또는 이들의 염을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 광학활성 아미노알콜의 제조방법.

화학식 1

화학식 2

상기식에서,

n은 O 내지 3의 정수이며,

R¹은 저급 알킬기이며,

*는 비대칭 탄소이다.

화학식 1의 α-아미노케톤 화합물 또는 이의 염의 에난티오머 혼합물에 제10항에 따른 형질전환체, 제14항 및 제15항에 따른 미생물로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 미생물을 작용시켜 화학식 2의 광학활성 아미노알콜 화합물에서 목적하는 광학활성을 갖는 당해 화합물을 생성시키는 광학활성 아미노알콜의 제조방법.

화학식 1

화학식 2

상기식에서,

n은 O 내지 3의 정수이며,

R¹은 저급 알킬기이며,

*는 비대칭 탄소이다.

제17항에 있어서, 화학식 3의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 용매화물을 추가로 첨가하여 광학활성 아미노알콜을 생성시키는 광학활성 아미노알콜의 제조방법.

화학식 3

상기식에서,

A는 구조식 Y(여기서, R⁴는 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환 또는 R⁸과 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이다) 또는 구조식 Z(여기서, R⁵는 수소원자, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 또는 R⁶또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁶은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1 내지 3의 알킬기, R⁸과 결합하여 이루어진 탄소수 5 내지 10의 탄화수소환, R⁵또는 R⁹와 결합하여 이루어진 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 8원환의 헤테로 환상 골격이며, R⁷은 수소원자, 치환기를 가질 수 있는 탄소수 1내지 6의 알킬기이다)이며,