CN100445386C

CN100445386C - 氨基酮不对称还原酶及其核酸

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Publication number: CN100445386C
Application number: CNB028088239A
Authority: CN
Inventors: 坂本惠司; 北伸二; 津崎和也; 森川忠则; 清水昌; 片冈道彦
Original assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Current assignee: Kyowa Pharma Chemical Co Ltd
Priority date: 2001-03-02
Filing date: 2002-03-01
Publication date: 2008-12-24
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: CN1610745A; EP1371731A1; KR100629642B1; KR20030096268A; ATE480627T1; CA2440025A1; CZ20032343A3; JPWO2002070714A1; US7166452B2; JP4136663B2; DE60237584D1; CA2440025C; EP1371731A4; AU2002234942B2; US20040247583A1; WO2002070714A1; EP1371731B1

Abstract

本发明提供一种蛋白质及对上述蛋白质进行编码的核酸，其为具有通过作用于1-2-甲胺基苯丙酮生成d-假麻黄碱的作用、且具有以下的理化性质的氨基酮不对称还原酶：基质：1-2-甲胺基苯丙酮；适合pH值：pH 8.1；适合温度：55℃；辅酶：NADP；分子量：约28500Da四聚体均聚物。

Description

氨基酮不对称还原酶及其核酸

技术领域

本发明涉及氨基酮不对称还原酶、对上述酶进行编码的核酸、产生上述酶的微生物及使用它们制造旋光性氨基醇的方法。

背景技术

麻黄碱自古以来就被用于发汗、解热、镇咳等目的，人们还知道其中的d-假麻黄碱具有抗炎症作用。另外，人们了解到1-麻黄碱具有血管收缩作用、血压上升作用或发汗等药理作用，因此在医疗上被用作交感神经***。而且，1-麻黄碱还可用于支气管哮喘的治疗。即，制造包含旋光性麻黄碱的旋光性β-氨基醇的方法，在医药或其中间体的制造过程中具有重要意义，因此人们希望获得有效的制造方法。

目前，就用于制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的方法而言，有这样一种方法，即，在得到外消旋体的β-氨基醇之后，利用光学分割或不对称合成等制造特定旋光体的方法。

但是，由于外消旋体的β-氨基醇的分子内有两个不对称碳原子，因此，为了得到特定的旋光体就不得不经过复杂的工序。

例如，根据“Ger.(East)13683，Aug.27，1957”所述，在作为β-氨基醇之一的旋光性麻黄碱的情况下，以苯甲醛为原料并利用酵母的发酵所得到的旋光性苯乙酰甲醇与甲胺还原缩合，可以制成赤合-1-2-甲胺基-1-苯基-1-丙醇、即1-麻黄碱。

而作为制取假麻黄碱的方法，有文献(美国专利第4237304号)记载：以1-麻黄碱为原料，再利用乙酸酐生成噁唑啉，然后水解，再通过反转为苏体即d-假麻黄碱，即可实现。

如上所述，为了实现由1-苯基-2-甲胺基-1-丙醇制造具有所希望的旋光性的假麻黄碱，一旦得到旋光性赤合体的麻黄碱后，需要经过反转为苏体的工序，因此存在工序多且复杂、收率也低的问题。

而且，在上述假麻黄碱的制造中，一方面，在原料酮体还原时，产生相当多的非对映(立体)异构体副产物，另一方面，作为非对映(立体)异构体的原料的回收有困难，经济上也不利。

另外，尽管根据特开平8-98697号公报记载的方法，由分子内有一个不对称碳原子的2-氨基-1-苯乙醇化合物为原料并利用特定微生物可以制造旋光性2-氨基-1-苯乙醇衍生物，但对于具有两个不对称碳原子的β-氨基醇来说，目前尚没有一种有效的制造方法。

发明内容

本发明就是鉴于上述现有技术中的问题而完成的发明，其目的在于，提供一种具有可以以高收率、高选择性由α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的作用的氨基酮不对称还原酶。并且，其目的还在于，提供一种具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质、对上述蛋白质进行编码的核酸、可由上述核酸进行转化的转化子、使用上述转化子制造上述蛋白质的方法，及上述转化子或上述蛋白质的用途。还有一个目的，就是提供一种可由α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物高效地转化成旋光性β-氨基醇的新微生物。

本发明的发明人等，为了达到上述目的，经过反复的深入研究，结果发现：通过使用由特定的微生物精制而成的氨基酮不对称还原酶，可仅对α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物的其中一种对映异构体进行还原，可有选择地、以高收率制造与其相应的四种β-氨基醇异构体中的仅一种异构体，从而完成了本发明。

即，本发明的蛋白质是一种氨基酮不对称还原酶，具有如下特征：其为具有通过作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的作用，且其理化性质为：

基质：1-2-甲胺基苯丙酮；

适合pH值：pH 8.1；

适合温度：55℃；

辅酶：NADP；

分子量：约28500Da的四聚体均聚物。

并且，本发明的蛋白质是以具有序列表的序列号1中所述的氨基酸序列为特征的蛋白质。

另外，本发明的蛋白质是蛋白质或其部分肽，其特征在于，在序列表的序列号1中所述的氨基酸序列中，有一个或多个氨基酸缺损、***、取代或加成的氨基酸序列，且具有氨基酮不对称还原活性。

在此，本发明还包括上述蛋白质的盐、或上述蛋白质的部分肽的盐。

而且，本发明的核酸是具有如下特征的核酸，即，对具有如序列表的序列号1所述的氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸。

还有，本发明的核酸是具有如下特征的核酸，即，具有如序列表的序列号2所述的碱基序列的核酸。

再有，本发明的核酸是具有如下特征的核酸，即，对可在严格的条件下与序列表的序列号2所述的核酸杂交、且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质进行编码的核酸。

在此，本发明的核酸也可是具有如下特征的核酸，即，由序列表的序列号2所述的碱基序列的一部分构成的核酸。

将这些核酸引入胞质遗传体(plasmid)，由此即可得到本发明的载体。

并且，将上述载体引入宿主，则可得到本发明的转换子。而本发明也包括使用这种转换子制造的氨基酮不对称还原酶或其部分肽。

而且，本发明提供一种氨基酮不对称还原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于，包括：在可使转化子增殖的培养基中培养上述转化子的培养工序；由上述培养工序中得到的该转化子精制氨基酮不对称还原酶或其部分肽的精制工序。

另外，本发明的氨基酮不对称还原酶或其部分肽的制造方法，其特征在于，包括：对选自属于摩根氏菌属(Morganella)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、毛霉菌属(Mucor)、犁头霉菌属(Absidia)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、灰树花菌属(Grifola)、散子囊菌属(Eurotium)、灵芝菌属(Ganoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、螺杆状菌属(Helicostylum)、轮枝菌属(Verticillium)、镰刀菌属(Fusarium)、念球菌属(Tritirachium)、被孢霉菌属(Mortierella)、蜜环菌属(Armillariella)、锈腐菌属(Cylindrocarpon)、克雷伯菌属(Klebsiella)、金杆菌属(Aureobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、掷孢酵母菌属(Sporobolomyces)、Sporidiobolus菌属、红球菌属(Rhodococcus)的微生物中的至少一种微生物、且具有可还原1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的能力的微生物进行培养的培养工序；由上述培养工序中得到的微生物对蛋白质或其部分肽进行精制的精制工序，。

并且，本发明的微生物的特征在于，是属于红球菌属Rhodococcus、且具有还原1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的能力的微生物。

其中，上述微生物优选为红串红球菌Rhodococcus erythropolisMAK-34菌株(FERM BP-7451号)。

并且，本发明是一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使权利要求1～3中任一项所述的蛋白质或其部分肽或它们的盐作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

(式中，X表示选自卤原子、低级烷基、可用保护基保护的羟基、硝基及磺酰基中的至少一种，可相同也可不同；n表示0～3的整数；R¹表示低级烷基；R²、R³表示选自氢原子和低级烷基中的至少一种，可相同也可不同；^*表示不对称碳原子)

生成用通式(2)表示的旋光性氨基醇化合物即具有所希望的旋光性的该化合物，

通式(2)：

(式中，X、n、R¹、R²、R³及^*的意义同上所述)。

另外，本发明是一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使上述转化子、选自属于红球菌属的微生物及红球菌(红串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34中的任一种微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

通式(2)：

(式中，X、n、R¹、R²、R³及^*的意义同上所述)。

在上述旋光性氨基醇的制造方法中，优选为，再添加用通式(3)表示的化合物、或其可用于制药的盐或溶剂化物，生成旋光性氨基醇，

通式(3)：

(A表示结构式(Y)或(Z)，

(R⁴表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环或与R⁸结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架)

(R⁵表示氢原子、碳原子数为1～3的烷基、或与R⁶或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁶表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁷表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基)

R⁸表示氢原子、羧基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、与R⁴结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合而成的碳原子数为5～10的烃环；R⁹表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷氧基羰基、可带有取代基的酰基、与R⁵或R⁶结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R¹⁰表示氢原子或可进行取代反应的碳原子数为1～6的烷基)。

附图说明

图1是本发明的氨基酮不对称还原酶的SDS-PAGE得到的电泳相片。

图2是表示本发明的氨基酮不对称还原酶与pH值的关系的曲线图。

图3是表示本发明的氨基酮不对称还原酶与温度的关系的曲线图。

具体实施方式

下面，对本发明的优选实施方式进行详细地说明。

另外，在本说明书和附图中，当以省略形式表示碱基和氨基酸等时，以IUPAC-IUB委员会生物化学术语(Commission on BiochemicalNomenclature)，或该领域中的惯用术语的意义为基准。并且，当氨基酸中存在旋光体时，除非特别说明，均表示L-体。

首先，对本发明的蛋白质进行说明。

本发明的蛋白质的特征在于，是具有通过作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的作用、且具有以下理化性质的氨基酮不对称还原酶：

基质：1-2-甲胺基苯丙酮；

适合pH值：pH 8.1；

适合温度：55℃；

辅酶：NADP；

分子量：约28500Da的四聚体均聚物。

上述蛋白质不仅具有通过作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的作用，而且对1-2-二甲胺基苯丙酮、氨基丙酮、1-氨基-2-丁酮也显示出还原活性。并且，作用于1-氨基-2-丙醇可生成氨基丙酮。

作为除了上述理化性质之外的其它性质，研究了各种金属离子或抑制剂所造成的影响，可以确认会因α，α′-联吡啶、邻二氮杂菲、EDTA等而被抑制。

上述蛋白质是由培养具有氨基酮不对称还原活性的微生物后得到的菌体精制而成。

就上述培养方法来说，可使用公知的方法，只要所用方法是在可使所用微生物能够繁殖的条件下，则没有特殊限制，通常，使用含有碳源、氮源、其它养分的液体培养基。就培养基的碳源来说，只要可用于上述微生物，就都可使用。具体地说，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉、山梨糖醇等糖类；甲醇、乙醇、丙三醇等醇类；富马酸、柠檬酸、乙酸、丙酸等有机酸类及其盐类；石蜡等烃类；或者这些物质的混合物等。作为培养基的氮源，只要可用于上述微生物，就都可使用。具体地说，可以使用氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等无机酸铵盐；富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸铵盐；硝酸钠、硝酸钾等硝酸盐；肉膏、酵母提取液、麦芽膏、蛋白胨等无机或有机含氮化合物；或是这些物质的混合物等。并且，在培养基中也可以适量添加无机盐、微量金属盐、维生素类等通常用于培养的营养源。并且，根据需要，在培养基中也可以添加促进微生物繁殖的物质、可有效保持培养基的pH值的缓冲物质。

微生物的培养可以在适于繁殖的条件下进行。具体地说，可以在下述这样的条件下进行，即：培养基的pH值为3～10，优选为4～9；温度为0～50℃，优选为20～40℃。微生物的培养可以在需氧或厌氧的条件下进行。培养时间优选为10～150小时，但应根据各个微生物来决定适宜的培养时间。

这样培养而成的微生物可通过对该培养液过滤或离心分离而得到菌体，再用水或缓冲液将该菌体仔细洗净。洗净后的菌体悬浊于适量的缓冲液中，使菌体破碎。对于破碎方法没有特殊限制，例如，可以举出乳钵、精磨机(ダィノミル)、French Press、超声波粉碎机等机械粉碎法。由得到的菌体破碎液中利用过滤或离心分离除去固体物而得到细胞物质提取液中的氨基酮不对称还原酶可通过常用的酶分离法而提取。

对于这样的酶分离法没有特殊的限制，可采用公知的方法，例如，硫酸铵沉淀法等盐析法；利用葡聚糖凝胶等的凝胶过滤法；使用具有二乙氨基乙基或羧甲基等的载体等的离子交换色谱法；使用具有丁基、辛基、苯基等疏水基的载体等的疏水色谱法；色素凝胶色谱法；电泳法；透析；超滤法；亲和色谱法；高速液相色谱法等。

另外，也可将上述酶用作固定酶。对于这样的方法没有特殊的限制，可采用公知的方法，可举出将酶或生酶细胞固定化的方法，可以利用共价法或吸附法这样的载体结合法、交联法、遮盖法等进行固定化。并且，根据需要，还可以使用戊二醛、六甲撑二异氰酸酯、六甲撑二异硫氰酸酯等缩合剂。另外，还可以举出其它固定方法，例如，由聚合反应使单体凝胶化的单体法；使大于通常单体的分子进行聚合的预聚法；使聚合物凝胶化的聚合物法；使用聚丙烯酰胺进行的固定化；使用褐藻酸、胶原、明胶、琼脂、角叉胶等天然高分子等进行的固定化；使用光固性树脂、聚氨酯等合成高分子等进行的固定化。

这样精制而得的酶如通过电泳(SDS-PAGE等)确认为单一谱带，则可以判断为精制充分。

而作为具有上述氨基酮不对称还原活性的微生物，优选为选自摩根氏菌属(Morganella)、微杆菌属(Microbacterium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、毛霉菌属(Mucor)、犁头霉菌属(Absidia)、曲霉菌属(Aspergillus)、青霉菌属(Penicillium)、灰树花菌属(Grifola)、散子囊菌属(Eurotium)、灵芝菌属(Ganoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、螺杆状菌属(Helicostylum)、轮枝菌属(Verticillium)、镰刀菌属(Fusarium)、念球菌属(Tritirachium)、被孢霉菌属(Mortierella)、蜜环菌属(Armillariella)、锈腐菌属(Cylindrocarpon)、克雷伯菌属(Klebsiella)、金杆菌属(Aureobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、掷孢酵母菌属(Sporobolomyces)、Sporidiobolus菌属、红球菌属(Rhodococcus)中的至少一种微生物，更具体地，可以举出摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、树状微杆菌(Microbacteriumarborescens)、多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)、简单类诺卡氏菌(Nocardioides simplex)、Mucor ambiguus菌、Mucor javanicus菌、Mucor fragilis菌、Absidia lichtheimi菌、Aspergillus awamori菌、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)、白曲霉菌(Aspergillus candidus)、Aspergillus oryzae var.oryzae菌、Aspergillusfoetidus var.acidus菌、草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、灰树花菌(栗子蘑)(Grifola frondosa)、木鱼酵母菌(Eurotium repens)、赤芝菌(Ganoderma lucidum)、Hypocrea gelatinosa菌、Helicostylum nigricans菌、Verticillium fungicola var.fungicola菌、Fusarium roseum菌、Tritirachium oryzae菌、深黄被孢霉菌(Mortierella isabellina)、蜜环菌(Armillariella mellea)、Cylindrocarpon sclerotigenum菌、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、酯香金杆菌(Aureobacteriumesteraromaticum)、Xanthomonas sp.菌、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、迪氏分枝杆菌(Mycobacterium diemhoferi)、母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、偶发分枝杆菌(Mycobacteriumfortuitum)、氯酚红分枝杆菌(Mycobacterium chlorophenolicum)、赭色掷孢酵母菌(Sporobolomyces salmonicolor)、Sporobolomyces coralliformis菌、Sporidiobolus johnsonii菌、红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)、紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)。

上述微生物，可以是野生种、变异种、或是用细胞融合或遗传基因操作法等手法而衍生成的重组种等任意物种，可以使用至少一种，

而且，作为本发明的具有氨基酮不对称还原活性的微生物之一，可以举出特别有效的具有氨基酮不对称还原活性的新型微生物，即，红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)MAK-34菌株。红串红球菌MAK-34菌株是本发明的发明人等从自然界中分离出的新型微生物，以FERM BP-7451的委托编号，于平成13年(公元2001年)2月15日保存在‘独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セんタ一(

305-8566日本国茨城県っくば市1丁目1番地1中央第6)’。

红串红球菌MAK-34菌株的菌类学性质如下所示：

分类学性质

(1)形态性质

细胞形状：杆菌

细胞大小：1.0×1.5～2.0μm

特征：V型形成

运动性：-

孢子：-

(2)培养性质

培养温度：30℃

菌落状态：圆形、周边侵食状、凸状、微有光泽、乳白色

明胶液化：-

(3)生理学性质

革兰氏染色：+

硝酸盐还原：-

柠檬酸盐的利用：+

尿素酶：+

氧化酶：-

过氧化氢酶：+

对氧的态度：需氧

O/F测试：-

吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase)：-

吡咯烷酮芳酰胺酶(pyrrolidonyl arylamidase)：-

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)：+

β-葡糖醛酸酶：-

β-半乳糖苷酶：-

α-糖苷酶：+

N-乙酰基-β-氨基葡糖酶：-

七叶苷(糖苷酶)：+

糖类的利用性

乳糖：-

麦芽糖：+

甘露糖：+

安息香酸盐：+

2，3-丁二醇：+

柠康酸：-

D-扁桃酸：-

DL-己氨酸：+

庚二酸：-

精胺：-。

(4)对照MicroSeq的数据库对16S rRNA所有碱基序列进行解析。

该菌株和与其为近亲的菌株的差异性

红串红球菌： 0.56％

圆红球菌： 0.76％

兰蒂斯拉维冢村氏菌： 2.54％

藤黄红球菌： 2.94％

根据上述结果，可以得知与红串红球菌相同率达99.44％的有最近亲缘关系的菌群。

并且，本发明的蛋白质是具有序列表的序列号1中所述的氨基酸序列的蛋白质、及、在上述氨基酸序列中具有一个或多个氨基酸缺损、***、取代或加成的氨基酸序列、且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质。

对于实施这种缺损、***、取代、加成的方法没有特别的限制，可使用公知的方法。例如，可以举出在‘日本生化学会編’、“続生化学実験講座1、遗伝子研究法II”、p105(広瀬進)、東京化学同人(1986)；‘日本生化学会編’、“新生化学実験講座2、核酸111(組换ぇDNA技術)”、p233(広瀬進)、東京化学同人(1992)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.154，p.350&p.367，Academic Press，NewYork(1987)；R.Wu，L.Grossman，ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.100，p.457&p.468，Academic Press，New York(1983)；J.A.Wells et al.，“Gene”，Vol.34，p.315(1985)；T.Grundstroem et al.，“Nucleic Acids Res.”，Vol.13，p.3305(1985)；J.Taylor et al.，“Nucleic Acids Res.”，Vol.13，p.8765(1985)；R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.155，p.568，Academic Press，New York(1987)；A.R.Oliphant et al.，“Gene”，Vol.44，p.177(1986)中记载的方法。具体可以举出，例如，利用合成低核苷酸等的指定位置变异导入法(特殊部位的变异倒入法)、定位诱变法、dNTP[αS](Eckstein)法、使用亚硫酸、亚硝酸等的指定区域变异导入法等方法。

并且，有时，很多蛋白质中加成有糖链，可通过取代一个或多个氨基酸而调节糖链的加成。因此，在序列表的序列号1中所述的氨基酸序列中，只要是经过上述糖链调节的蛋白质也具有上述氨基酮不对称还原活性，就属于本发明的蛋白质。

而且，所得到的本发明的蛋白质，还可通过化学方法对其所含的氨基酸残基进行改性，也可以用肽酶，例如胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、番瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、肽链内断酶、肽链端解酶等酶进行改性或部分分解而改变成其衍生物。

并且，也可以在利用遗传基因重组法进行制造时对作为融合蛋白质发现的、在生物体内或生物体外与天然氨基酮不对称还原酶实质上具有同等生物活性的物质进行转化、加工。此时，可采用遗传工程中常用的融合产生法，这样制成的融合蛋白质也可利用其融合部由亲和色谱法等进行精制。蛋白质结构的改性、改变等，可参考‘日本生化学会编’、“新生化学実験講座1、タンパク質VII、タンパク質工学”、東京化学同人(1993)中所记载的方法或其中所引用的文献中所记载的方法，及实质上与其相同的方法来实行。

并且，本发明也可以是一个以上的氨基酸残基在同一性上与天然物质不同的生成物，也可以是一个以上的氨基酸残基的位置与天然物质不同的生成物。本发明还包括天然氨基酮不对称还原酶中所特有的氨基酸残基缺损一个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)的缺损类似体；一个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)的特有的氨基酸残基被其它残基取代的取代类似体；一个以上(例如，1～80个，优选为1～60个，更优选为1～40个，进一步优选为1～20个，特别优选为1～10个等)的氨基酸残基被加成的加成类似体。优选为也包括具有天然氨基酮不对称还原酶特征的领域结构的物质。并且，还可以举出具有同质的氨基酮不对称还原酶活性的物质。

只要维持有天然氨基酮不对称还原酶特征的领域结构，则上述每一种变异体都包含于本发明。而且，可以认为，还包括实质上与本发明的天然氨基酮不对称还原酶具有同等的一次构造形态(conformation)的或其部分构造形态的物质，及实质上与天然氨基酮不对称还原酶具有同等的生物活性的物质。而且还可以是天然生成的变异体中的一种。这样得到的本发明的氨基酮不对称还原酶，如下所述，可进行分离、精制处理。另一方面，这样，本发明也包括上述对多肽进行编码的DNA序列，而且还包括对具有全部天然特性或部分天然特性的氨基酮不对称还原酶的多肽、及其类似体或衍生物进行编码的DNA序列。还可以对该氨基酮不对称还原酶的碱基序列进行改性(例如，加成、消去、取代等)，这种经过改性的产物也属于本发明范围。

下面，对本发明的核酸进行说明。

本发明的核酸的特征在于，对具有序列表的序列号1所述的氨基酸序列的蛋白质进行编码。

即，由于存在多个对一个氨基酸进行编码的碱基序列(密码)，所以存在很多对具有序列表的序列号1所述的氨基酸序列的蛋白质进行编码的核酸。因此，本发明所述核酸也包括这种核酸。在此，“对蛋白质进行编码”是指：当DNA为双链时，互补的双链中的任一方含有对蛋白质进行编码的碱基序列，因此，本发明的核酸还包括由对序列表的序列号1所述的氨基酸序列直接进行编码的碱基序列构成的核酸或由其配对碱基序列构成的核酸。

并且，本发明的核酸的特征在于，具有序列表的序列号2所述的碱基序列。

序列表的序列号2所述的碱基序列是由下述方法得到的DNA碱基序列，即，使用由上述微生物中提取出染色体DNA、根据氨基酮不对称还原酶的氨基酸序列设计的合成低核苷酸引物，由PCR(Polymerasechain reaction聚合酶链反应)法得到的DNA碱基序列。

在此，对于由上述微生物中提取出染色体DNA的方法没有特别的限制，例如，将培养而得的微生物(例如，红串红球菌MAK-34菌株)菌体破碎，由通常的方法对染色体DNA进行离心分离，然后分解除去RNA，进行蛋白质脱除操作，对DNA进行精制。关于这些操作，可参照“植物バィォテクノロジ一実験マニュァル：農村文化社、252頁”。而只要是属于红球菌属的具有氨基酮不对称还原酶产生能力的微生物，即可适用作DNA源。

另外，作为上述用于PCR的低核苷酸引物的制造方法，可采用公知的方法，根据氨基酮不对称还原酶的氨基酸信息制作合成低核苷酸引物。

例如，可根据由上述微生物、且具有氨基酮不对称还原酶产生能力的微生物得到的精制氨基酮不对称还原酶的氨基酸信息，制作合成低核苷酸引物。一般地，根据氨基酸序列制作变性简并引物等。引物的制作可采用本领域公知的方法进行，例如，使用DNA自动合成装置，由磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酰胺法等合成。具体来说，由在培养基中培养红串红球菌而得到的菌体进行氨基酮不对称还原酶的精制，根据需要，通过肽水解酶等形成片段，收集该酶的氨基酸序列的信息。由如此得到的氨基酸序列信息，制作优选的合成低核苷酸引物。使用该引物，形成氨基酮不对称还原酶的染色体DNA模版，进行PCR。PCR反应可使用该领域的公知方法或与其实质上相同的方法或其改进法进行，例如可按照R.Saiki，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Saiki，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；Henry A.Erlich，PCR Technology，Stockton Press等中所述的方法进行。反应可利用例如市售的药剂套件、试剂等进行。

对所得的放大DNA片段进行排序，确认其含有与精制酶的氨基酸序列相同的序列，然后用同位素对其进行标识用作此后实验等中的探试器。碱基序列的确定可采用双脱氧序列分析法，例如M13双脱氧序列分析法等、Maxam-Gilbert法(化学测序法)等，也可以使用市售排序套件，例如Taq双引物环形排序套件等，或自动碱基序列确定装置，例如荧光DNA定序器装置等。以放射性同位素等标记标识物等时，可使用市售标识套件，例如随机待测DNA标识套件(Boehringer Mannhaim)等进行。

并且，本发明的氨基酮不对称还原酶遗传基因可采用例如下述方法进行克隆。具体地说，遗传基因重组技术可采用例如T.Maniatis et al.，“Molecular Cloning”，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，Cold Spring Harbor，N.T.(1989)；‘日本生化学会編’、“続生化学実験講座1、遗伝子研究法II”、東京化学同人(1986)；‘日本生化学会編’、“新生化学実験講座2、核酸III(組换ぇDNA技術)”、東京化学同人(1992)；R.Wu ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.68，Academic Press，New York(1980)；R.Wu et al.ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.100&101，Academic Press，New York(1983)；R.Wu etal.ed.，“Methods in Enzymology”，Vol.153，154&155，Academic Press，New York(1987)等中所述的方法或这些文献中所引用的文献中所述的方法，或与这些方法实质上同样的方法或改进的方法。这些方法也可在公知的方法基础上进行独立的改变、改善，只要其与本发明的目的相符。

并且，本发明的核酸的特征在于，是对在严格的条件下与具有序列表的序列号2所述的碱基序列的核酸杂交、且具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质进行编码的核酸。

在此，本发明的“在严格条件下杂交”的意义是：两个DNA片段在Sambrook，J.等人的“大肠菌中克隆遗传基因的发现(Expression ofcloned genes in E.coli)”(Molecular Cloning：Alaboratory manual(1989))Cold Spring harbor Laboratory Press，New York，USA，9.47-9.62和11.45-11.61中所述的杂交条件下相互杂交。

更具体地说，“严格条件”是指：在温度约45℃、6.0×SSC的条件下进行的杂交。为了进行严格选择，可将洗净工序中的盐浓度选在例如由作为低严格度的约2.0×SSC、50℃到高严格度的约0.1×SSC、50℃的范围内。而且，可将洗净工序的温度由低严格度条件的室温约22℃增大到高严格度条件的约65℃。

另外，本发明的核酸的特征在于，由序列表的序列号2所述的碱基序列构成。

下面，对本发明的载体进行说明。

本发明的载体的特征在于，含有上述核酸。

在此，作为加入上述核酸的胞质遗传体，只要是在遗传基因工程学中常用的宿主细胞(例如，大肠菌、枯草菌等原核细胞宿主、酵母等真核细胞宿主)中可发现能被上述核酸编码的蛋白质的胞质遗传体，则无论何种胞质遗传体均可采用。在这样的序列内，也可以例如引入适于由所选宿主细胞内发现的密码、或设计限制酶的部位。并且，还可含有用于容易发现作为目的的遗传基因的控制序列、促进序列等、对结合作为目的的遗传基因起作用的接头、接合体等、及或对耐抗菌素性等进行控制、或对代谢进行控制、并有益于菌体的拣选的序列等。

作为含于上述胞质遗传体中的启动子(promoter)，在以大肠菌为宿主的胞质遗传体中，可以举出，例如色氨酸(trp)启动子、乳糖(lac)启动子、色氨酸·乳糖(tac)启动子、脂蛋白(lpp)启动子、λ噬菌体PL启动子，在以酵母为宿主的胞质遗传体中，可以举出，例如GAL1、GAL10启动子。

并且，作为以大肠菌为宿主的胞质遗传体，可以举出，例如，pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pVC 119、pSP64、pSP65、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z、pGEM-4Z、pGEM-5Zf(-)、pBluescript KSTM(Stratagene)。作为发现适于在大肠菌中的胞质遗传体载体，可以举出pAS、pKK223(Pharmacia)、pMC 1403、pMC931、pKC30等。

作为以酵母为宿主的胞质遗传体，可以举出，例如，YIp型载体、YEp型载体、YRp型载体、YCp型载体、pGPD-2。

作为宿主细胞，在大肠菌的情况下，例如宿主细胞可以举出来自大肠菌K12菌株的宿主细胞，具体可以举出NM533XL1-Blue、C600、DH1、HB101、JM109等。

在本发明的基因工程学方法中，可以使用作为用于对适于克隆该领域已知的或被广泛应用的限制酶、逆转录酶、DNA片段的结构进行改性或改变的酶的DNA改性·分解酶、DNA聚合酶、末端核苷酸转移酶、DNA连接酶等。作为限制酶，可以举出例如R.J.Roberts，NucleicAcids Res，Vol.13，r165(1985)；S.Linn et al.ed.Nucleases，p.109，ColdSpring Harbor Lab.，Cold Spring Harbor，New York，1982中所述的限制酶。作为逆转录酶，可以举出例如来自莫洛尼鼠类白血病毒(mouseMoloney leukemia virus；MMLV)的逆转录酶(reverse transcriptase)、来自鸟类成髓细胞型白血病病毒(avian myeloblastosis virus；AMV)的逆转录酶，特别是可优选使用RNase H缺损体。作为DNA聚合酶，可以举出例如大肠菌DNA聚合酶及作为其衍生物的克列诺片段、大肠菌噬菌体T4DNA聚合酶、大肠菌噬菌体T7DNA聚合酶、耐热菌DNA聚合酶。

作为末端核苷酸转移酶，可以举出例如R.Wu et al.ed.，“Methods inEnzymology”，Vol.100，p.96，Academic Press.New York(1983)中所述的将脱氧核苷酸(dNMP)加成在3′-OH末端的脱氧核苷酸转移酶(TDTase)。

作为DNA改性·分解酶，例如可以举出核酸外切酶、核酸内切酶，具体来说，可以举出，例如，蛇毒磷酸二酯酶、脾脏磷酸二酯酶、大肠菌DNA核酸外切酶I，大肠菌DNA核酸外切酶III、大肠菌DNA核酸外切酶VII、λ核酸外切酶、DNase I、核酸酶S1、细球菌(Micrococcus)核酸酶。

作为DNA连接酶，可以举出，例如大肠菌DNA连接酶、T4DNA连接酶。

作为适于克隆DNA遗传基因构筑DNA基因库的载体，可以举出，例如胞质遗传体、λ噬菌体、粘粒、P1噬菌体、F因子、YAC。其中，优选为来自λ噬菌体的载体，具体来说，可以举出，例如卡隆(Charon)4A、卡隆21A、λgt10、λgt11、λDASH II、λFIX II、λEMBL3、λZAP II ^TM(Stratagene)。

通过将本发明的载体导入如上所述的宿主细胞中，就可以得到能够产生本发明的氨基酮不对称还原酶的微生物或动物细胞等的转化子。本发明也包括这种转化子。

对于上述转化方法没有特别的限制，可以使用公知的方法进行。例如，在氯化钙、聚乙二醇等的存在下，使DNA与使用适当的细胞壁溶解酶调制而成的原质化细胞接触的方法；磷酸钙法；脂质转染法、电穿孔法(例如，E.Neumann et al.，“EMBO J”，Vol.，pp.841(1982))、微注射法、由基因枪打入的方法。

并且，通过使用上述转化子，就能够将本发明的蛋白质制成重组蛋白质。本发明也包括这种重组蛋白质的制造方法。

并且，在得到本发明的蛋白质内含物的情况下，也可以通过溶液化处理，例如，用盐酸胍、尿素等变性剂，并根据需要在2-巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原剂的存在下进行处理，精制成活性酶。可以直接将产生酶的细胞作为酶而使用。

作为用于制造上述重组蛋白质的转化子，可以举出例如具有导入氨基酮不对称还原酶基因的载体(pKK223-3)的大肠菌(JM109)MAK-EX41(BP-7452)。根据布达佩斯条约，MAK-EX41菌株是本发明的发明人等从自然界中分离出的新型微生物，自平成13年(公元2001年)2月15日(原始保存日)，以BP-7452的委托编号，保存在‘日本国茨城県っくば市東1丁目1番3号’(邮编305-8566)的‘経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所(NIBH)’。

下面，说明本发明的旋光性氨基醇的制造方法。

本发明的旋光性氨基醇化合物的制造方法是一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使权利要求1～3中任一项所述的蛋白质或其部分肽或它们的盐作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

(式中，X表示选自卤原子、低级烷基、可用保护基保护的羟基、硝基及磺酰基中的至少一种，可相同也可不同；n表示0～3的整数；R¹表示低级烷基；R²、R³表示选自氢原子和低级烷基中的至少一种，可相同也可不同；*表示不对称碳原子)

通式(2)：

(式中，X、n、R¹、R²、R³及^*的意义同上所述)。

首先，对本发明所涉及的、以通式(1)表示的α-氨基酮进行说明。

上述通式(1)所示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物是具有如下所述结构的物质，即，X表示选自卤原子、低级烷基、可由保护基保护的羟基、硝基及磺酰基中的至少一种，可相同也可不同；n为0～3的整数；R¹为低级烷基；R²、R³为选自氢原子和低级烷基中的至少一种，可相同也可不同；*表示不对称碳原子。

下面，对上述α-氨基酮化合物中所含有的取代基X进行说明。作为上述卤原子来说，可以举出氟原子、氯原子、溴原子及碘原子等。

并且，作为低级烷基来说，优选为碳原子数为1～6的烷基，可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等。这些基团可以是直链状或支链状的任一种结构。并且，还可以带有氟原子或氯原子等卤原子、羟基、烷基、氨基或烷氧基等作为取代基。

羟基也可以由保护基保护，作为这种保护基，可以举出用水处理能除去的、用酸或弱碱能除去的、加氢能除去的、路易斯酸催化剂及硫脲等能除去的等保护基，在上述保护基中，包括：可以带有取代基的酰基、可以带有取代基的甲硅烷基、烷氧烷基、可以有取代基的低级烷基、苄基、对甲氧基苯甲基、2，2，2-三氯乙氧基羰基、烯丙氧羰基及三苯甲基等。

另外，在上述酰基中，包括乙酰基、氯乙酰基、二氯乙酰基、三甲基乙酰基、苯酰基及对硝基苯酰基等。另外，还可带有羟基、烷基、烷氧基、硝基及卤素原子等取代基。在上述硅烷基中，包括三甲基硅烷基、叔丁基二甲硅烷基及三芳基硅烷基等。并且，还可带有烷基、芳基、羟基、烷氧基、硝基及卤原子等取代基作为取代基。在上述烷氧烷基中，包括甲氧基甲基及2-甲氧基乙氧基甲基等。上述低级烷基中包括碳原子数为1～6的烷基，可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等。这些基团可以是直链状或支链状的任一种结构。并且，还可以带有氟原子或氯原子等卤原子、羟基、烷基、氨基及烷氧基等取代基。

并且，上述X可以是硝基或磺酰基，具体地可以举出甲基磺酰基等。

而且，上述X的数值n为0～3的整数，优选为0。

并且，上述通式(I)中的R¹表示低级烷基。这种低级烷基优选为碳原子数为1～6的烷基，具体可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等。这些基团可以是直链状或支链状的任一种结构。

R²、R³表示氢原子或低级烷基。在上述低级烷基中，包括碳原子数为1～6的烷基，可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等。这些基团可以是直链状或支链状的任一种结构。

并且，就上述α-氨基酮化合物的盐来说，可以举出α-氨基酮化合物的盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐等无机酸盐或者乙酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐。

上述α-氨基酮，很容易通过下述方法合成，即，将所对应的1-苯基酮衍生物的α碳原子卤化后，例如溴化，再将溴基等卤素置换为胺(Ger.(East)11，332，Mar.12，1956)。

而且，本发明的旋光性氨基醇的制造方法是一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使上述转化子、选自属于红球菌属的微生物及红球菌(红串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34中的任一种微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

通式(2)：

(式中，X、n、R¹、R²、R³及*的意义同上所述)。

而本发明的蛋白质为如上所述的蛋白质。

即，本发明的蛋白质是一种氨基酮不对称还原酶，具有如下特征：它具有通过作用于1-2-甲胺基苯丙酮而生成d-假麻黄碱的作用，且其具有以下的理化性质：

基质：1-2-甲胺基苯丙酮；

适合pH值：pH 8.1；

适合温度：55℃；

辅酶：NADP；

分子量：约28500Da的四聚体均聚物。

并且，上述蛋白质是具有序列表的序列号1中所述的氨基酸序列的蛋白质，是具有在上述蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺损、***、取代或加成的氨基酸序列的蛋白质。

而在本发明的旋光性氨基醇的制造方法中，可以采用直接在反应***中添加上述转化子、属于红球菌属的微生物及红球菌(红串)Rhodococcus(erythropolis)MAK-34(FERM BP-7451号)以替代上述蛋白质来制造旋光性氨基醇化合物。

下面，对本发明的以通式(2)表示的旋光性氨基醇进行说明。

在上述通式(2)中，X、n、R¹、R²、R³及*的意义与上述通式(1)相同。而且就具有所期望的光学活性的β-氨基醇来说，可以举出(1S，2S)氨基醇。

就进行上述反应时的反应条件来说，可以是，例如，收集在液态培养基中振荡培养而得的转化菌，在得到的菌体中加入氨基酮水溶液(浓度：0.1～10％)，将pH值调整到6～8，同时在温度10～40℃下反应数小时～1天。反应结束后，将菌体分离，将反应溶液中的生成物分离出来，这样，就可以得到旋光性氨基醇。在此，同样也可由转化菌的处理菌体(干燥菌体、固定菌体等)或转化菌得到的酶、或固定酶等进行反应。

并且，在本发明的旋光性氨基醇的制造方法中，在反应体系中再加入由通式(3)所示的化合物、或其可用于制药的盐或溶剂化作用产物，就可以更高效率生成旋光性氨基醇，其中，在通式(3)中，

上述式中A表示结构式(Y)或(Z)，

(R⁴表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环或与R⁸结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架。)

(R⁵表示氢原子、碳原子数为1～3的烷基、或与R⁶或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁶表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁷表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基；R⁸表示氢原子、羧基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、与R⁴结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合而成的碳原子数为5～10的烃环；R⁹表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷氧基羰基、可带有取代基的酰基、与R⁵或R6^结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R¹⁰表示氢原子或可进行取代反应的碳原子数为1～6的烷基。)

在上述通式(3)中，作为碳原子数为1～3的烷基来说，可以是直链状、支链状中的任一种结构，具体来说，可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基等。并且，作为碳原子数为1～6的烷基来说，可以是直链状、支链状中的任一种结构，具体来说，可以举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基及己基等。作为碳原子数为5～10的烃环来说，可以举出环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基及环癸基等。

在含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架中，作为杂原子来说，可以举出氮原子、氧原子、硫原子等，特别优选为氮原子、氧原子；就5～8元环的杂环状骨架来说，可以举出吡咯烷、哌啶、咪唑烯、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、四氢噻吩及吗啉等。

并且，就碳原子数为1～6的烷氧基羰基来说，可以举出甲氧基羰基、乙氧基羰基、异丙氧基羰基、异丁氧基羰基及叔丁氧基羰基等。作为酰基来说，可以举出甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、三甲基乙酰基、苯酰基及戊酰基等。当上述碳原子数为1～3或碳原子数为1～6的烷基、碳原子数为1～6的烷氧基羰基或酰基有取代基时，对于取代基的种类、取代位置及取代基的数量没有限制，作为取代基来说，可以举出例如氟原子或氯原子等卤原子、羟基、烷基、羧基、氨基、烷氧基、硝基及芳基等。另外，作为可用于制药的盐来说，可以举出盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；醋酸盐、柠檬酸盐等有机酸盐；钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铵盐等无机碱盐及三乙胺、环己胺等有机碱盐。

作为如通式(3)所示的化合物来说，可以举出例如1-乙酰胺基-2-羟丙烷、1-甲胺基-2-羟丙烷、1-氨基-2-羰丙烷、1-氨基-2-羟基环戊烷、1-氨基-2，3-二羟丙烷、L-苏氨酸、4-氨基-3-羟丁酸、1-氨基-2-羰基环己烷、吗啉、3-羟基吡咯烷、3-羟基哌啶、2-氨甲基四氢呋喃、1-(2-羟丙基)氨基-2-羟丙烷、1-叔丁氧基羰基氨基-2-羟丙烷、2-氨基-3-羟丁烷、DL-丝氨酸、1-氨基-2-羟丙烷、1-氨基-2-羟丁烷、1-氨基-2-羟基环己烷。其中，在具有不对称碳原子的化合物中，不特别限于所述化合物，即可以是旋光体，也可以是外消旋体。

通过将这些活性诱导剂添加到培养基中，诱发微生物的活性，其后的旋光性β-氨基醇的生成，比不添加活性诱导剂时更高效地进行。活性诱导剂既可以各自单独使用，也可以以多种诱导剂的混合物的形式使用。这样的活性诱导剂的添加量，相对于培养基而言，优选为0.01～10重量％。

如上所述，对将天然的氨基酮不对称还原酶例如来自红串红球菌的天然的氨基酮不对称还原酶或实质上与其具有同等活性的蛋白质进行编码的基因结构做出了明确的阐示，可期待在由含有对上述蛋白质进行编码的碱基序列的DNA实现转化的宿主细胞、使用该宿主细胞的蛋白质的制造方法、及使用这些蛋白质及宿主细胞制造旋光性氨基醇等方面有飞跃性的进展，而且，有可能利用氨基酮不对称还原酶的改性使酶活性得到飞跃性的提升。

实施例

以下，根据实施例对本发明作更具体的说明。但是，本发明并不局限于下述实施例。

实施例1

(氨基酮不对称还原酶的精制)

向含有组成(pH 7.0)为葡萄糖1％、磷酸氢二钾0.3％、硫酸镁·7水合物0.02％、胨1.5％、氯化钠0.2％、酵母提取液0.1％的5ml培养基的试管中植入红串红球菌MAK-34，在28℃下进行3天的振荡培养，将得到的试品接种到具有上述组成的500ml培养基中，在28℃下进行3天的振荡培养。将该前培养液接种到上述组成中添加有1-氨基-2-羟丙烷0.1％的501培养基中，在28℃下进行2天的培养。

用离心分离机对上述培养液进行处理，得到湿菌体3785g。在该菌体的1kg中，加入含有10％甘油、1mM氯化镍、1mM烟酸的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液1000ml(pH 8.5)，经过90～100分钟的超声波粉碎后，再用超离心分离(33,000rpm，60分钟)得到759ml的无细胞提取液。将该无细胞提取液对上述缓冲液作透析。将该酶液770ml注入DEAE-Sephacel柱(5.6×20cm)，利用氯化钠的直线浓度梯度(0.15→0.8M)进行洗提。将上述洗提出的酶活性部分173ml对上述缓冲液作透析。将该酶液173ml加入Mono Q HR 10/10柱(1.0×10cm)，利用氯化钠的直线浓度梯度(0→0.6M)进行洗提。将上述洗提出的酶活性部分28ml对不含有烟酸的上述缓冲液作透析。将该酶液28ml注入HiTrapBlue(1ml)，用含有10％甘油、1mM氯化镍、2mM烟酸、1.0M氯化钠、0.024％NADP⁺的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.5)洗净交换柱，得到洗提出的酶活性部分8.7ml。在得到的酶液8.7ml中加入1.2M硫酸铵，然后将其注入至Phenyl Superose HR 5/5(0.5×5cm)，利用硫酸铵的直线浓度梯度(1.2→0M)进行洗提。用Amicon(ァミコン)YM10超滤洗提出的2.12ml酶活性部分，再将得到的酶浓缩液150μl注入至Superose 12HR 10/30(1.0×30cm)，用含有10％甘油、1mM氯化镍、1mM烟酸、0.15M氯化钠的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.5)进行洗提。将洗提出的酶活性部分1.45ml对含有10％甘油、1mM氯化镍、1mM烟酸的10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.5)作透析，结果，就能得到含有精制酶293μg的精制酶液。

这样精制而得的氨基酮不对称还原酶具有如下所述的性质。

(1)基质特性和酶活性：

将1M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.0)10μl、16mMNAPD+25μl、精制酶液215μl保存在43℃，再加入1-氨基-2-羟丙烷1μl，生成氨基丙酮。根据340nm波长下的吸光度的变化测定随着反应NADPH的增减。酶活性的测定是以一分钟内1μmol的1-氨基-2-羟丙烷被氧化作为1单位(U)的酶活性。其结果，总活性为126mU，比活性为432mU/mg，活性收率为0.22％。

同样，可以确认，可作用于1-2-甲胺基苯丙酮、1-2-二甲胺基苯丙酮、1-氨基-2-丁酮。

(2)分子量

用超滤法测定时约为105,000，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定时约为28,500(图1)。由此推测，本发明的酶是由分子量约为28,500的4个亚单元构成的四聚体蛋白质。

(3)适合pH值

将精制酶液10μL、水420μL、1M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液20μL、16mM NADP⁺水溶液50μL混合，在45℃下培养，再加入2μL的1-氨基-2-丙醇进行反应。根据用分光光度计在340nm的吸光度随时间的变化算出活性(图2)。其结果，适合pH值为约8.1。

(4)适合温度

将精制酶液10μL、水420μL、0.1M PIPES缓冲溶液(pH7.5)20μL、16mM NADP⁺水溶液50μL混合，在各种温度下进行培养，再加入2μL的1-氨基-2-丙醇进行反应。根据用分光光度计在340nm的吸光度随时间的变化算出活性(图3)。其结果，适合温度为55℃。

(5)抑制剂、金属离子的影响：

1mM浓度α，α′-联吡啶、1mM浓度的邻二氮杂菲、1mM浓度的EDTA都会抑制酶的活性。

实施例2

(氨基酮不对称还原酶基因的克隆和在大肠菌中的发现)

(1)精制酶的氨基酸部分序列确定

将1nmol的冻结干燥的氨基酮不对称还原酶(亚单元分子量约为28,500)在50μl的含有8M尿素的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.6)中溶解，在37℃下经1小时得到改性。然后再添加50μl的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH8.6)，使尿素浓度为4M。再添加0.5μl(0.006nmol，E/S＝1/167)的赖氨酰肽链内切酶(和光纯药)，在30℃下，经6小时消化。将得到的消化肽由逆相柱(Amersham Biosciences)分取，用ABI公司476A蛋白质序列测定仪对氨基酸序列进行分析。结果如下。

①MFNSIEGRSVVVTGGSK(N末端) (序列号3)

②RLGEMTSEDMDSVFGVNVK (序列号4)

③AAQMGFIRTAAIELAPK (序列号5)

④XXILAVQAMMPXL (序列号6)

⑤XITINAVLPGNVITEGLDGLGQEYLDQM (序列号7)

上述肽的分取条件如下所示。

***：SMART system

交换柱：μRPC C2/C18 SC2.1/10

流速：100μl/min

提取液：A，0.1％TFA

B，0.1％TFA/80％CH₃CN

洗提条件：0-15min(100％A)→15-75min(100％A→100％B)的梯度提取。

柱温：室温

检测波长：214nm及280nm

(2)染色体DNA的制作

由离心分离机收集对数增殖期后期的菌体(MAK-34)。将得到的菌体悬浊于TES buffer(5mM Tris，1mM EDTA，2.5％蔗糖，pH8.0)。在该悬浊液中添加EDTA、水、溶菌酶和蛋白酶K，在37℃下，缓缓搅拌2.5小时。然后，在添加SDS后，对搅拌后的溶菌样品依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿进行处理，以除去蛋白质。在其中添加3M醋酸钠1/10容积、乙醇2.5倍容积，用玻璃棒卷取DNA。然后，依次用70％、80％、90％的乙醇洗净，将风干后的DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.8)中，将经过核糖核酸酶(RNase)A处理过的样品依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿进行处理，以除去蛋白质。在其中添加3M醋酸钠1/10容积、乙醇2.5倍容积，使DNA沉淀，此后，用70％的乙醇洗净、风干后溶解在TE缓冲液中，得到染色体DNA溶液(36ng/μ)。

(3)氨基酮不对称还原酶基因的放大

根据氨基酮不对称还原酶的内部肽的氨基酸序列(序列号3～7)，分别合成具有如下的碱基序列的、与N-末端氨基酸序列的有义链相对应的有义引物MAK-Sensel(序列号8)和与内部肽序列的反义链相对应的反义引物MAK-Antil(序列号9)。MAK-Sensel和MAK-Antil均是简并引物(degenerate primer)，在碱基序列中，y表示T或C，s表示C或G，h表示T或C或A，r表示A或G，m表示C或A，w表示A或T，n表示A或C或G或T。

MAK-Sensel：

Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg(序列号3的一部分)

ATG TTy AAy wsn ATh GAr GGn mG(序列号8)

MAK-Antil：

Met Gln Asp Leu Tyr Glu Gln Gly Leu(序列号7的一部分)

CAT yTG rTC nAr rTA yTC yTG nCC nA(序列号9)

以氨基酮不对称还原酶的染色体DNA为模版，在下述条件下进行PCR。PCR的放大采用例如R.Sakai，et al.，Science，Vol.230，pp.1350(1985)；R.Sakai，et al.，Science，Vol.239，pp.487(1988)；PCR Technology，Stockton Press(1989)等中所述的方法实施。由PCR的放大，得到约0.6kb的放大DNA片段。

以下示出PCR的条件

染色体DNA(36ng/μl) 5μl

有义引物(49μM) 3μl

反义引物(41μM) 3μl

dNTP(各2.5mM) 4μl

ExTaq聚合酶(TAKARA) 0.3μl

ExTaq聚合酶缓冲液 5μl

H₂O 29.7μl

合计 50μl

并且，温度条件如下所示

94℃/4分钟

94℃/1分钟、50℃/1分钟、72℃/1.5分钟：35循环

72℃/10分钟

在确定所得的放大DNA片段的碱基序列后，改变氨基酸序列时，结果可以发现与氨基酮不对称还原酶的内部肽的部分氨基酸序列相同的部分。

在确定碱基序列时，为了确定碱基序列不明区域的碱基序列，进行反向聚合酶链式反应(inverse PCR)。反向聚合酶链式反应可如H.Ochman，et al.，Genetics，Vol.120，pp.621(1988)等中所述的方法进行。

首先，对染色体DNA溶液进行限制酶(BglII)处理、苯酚氯仿处理、乙醇沉淀而得到DNA片段，对得到的DNA片段用T4DNA连接酶(TAKARA)处理，然后进行自身连接。然后，对其进行苯酚氯仿处理、乙醇沉淀，将这样得到的环状化DNA作为模版，使用由碱基序列已知的部分设计的有义引物(IPCR-S1)和反义引物(IPCR-A1)，在下述条件下进行PCR。由PCR放大，得到约2kb放大的DNA片段。

IPCR-A1(向上流动流)

AATACCCGGACCATTCCCAAGCCGAT(序列号10)

IPCR-S1(向下流动流)

TCGAAACTTCTGGGCGTGGAAGGGTT(序列号11)

PCR条件如下所示

环状化DNA(500ng)

有义引物(100μM) 0.5μl

反义引物(100μM) 0.5μl

dNTP (各2.5mM) 4μl

ExTaq聚合酶(TAKARA) 0.5μl

ExTaq聚合酶缓冲液 5μl

H₂O 39.5μl

合计 50μl

并且，PCR时的温度条件如下所示。

94℃/4分钟

94℃/1分钟、60℃/1分钟、72℃/4分钟：30循环

72℃/10分钟

确定所得的放大DNA片段的碱基序列后，可确认含有原来的碱基序列、由780bp构成的ORF。由此判明，氨基酸序列变换的结果是包含氨基酮不对称还原酶基因的全长(序列号1)。

(4)氨基酮不对称还原酶基因在大肠菌中的发现

根据如上所述而阐明的氨基酮不对称还原酶基因的碱基序列，设计附加有限制酶部位的引物。下面表示其序列。

ExS

GATGAATTCCAAATGTTCAACTCCATTGA(序列号12)

EcoR I Start

EsA

TGAAGCTTTCGTCGCTTGTCTTACAGTTC(序列号13)

HindIII Stop

使用这些引物，以染色体DNA为模版，在下述条件下进行PCR。其结果是，得到约0.8kb的放大DNA片段。PCR的条件如下所示。

染色体DNA(36ng/μl) 5μl(180ng)

有义引物(100μM) 0.5μl

反义引物(100μM) 0.5μl

dNTP(各2.5mM) 8μl

LA-Taq聚合酶(TAKARA) 0.5μl

LA-Taq聚合酶缓冲液 5μl

Mg²⁺ 5μl

H₂O 25.5μl

合计 50μl

PCR时的温度条件如下所示。

94℃/4分钟

94℃/1分钟、60℃/1分钟、72℃/1.5分钟：25循环

72℃/10分钟

由于这样得到的PCR产物的两端分别有EcoR I和HindIII的限制酶部位，因此，在由QIA quick PCR Purification Kit(QIAGEN)进行精制后，进行限制酶(EcoR I、HindIII)处理。在琼脂糖电泳后，对经过处理的产物进行染色体带的切出，用GFX PCR DNA，Gel BandPurification Kit进行精制。将其与完成限制酶(EcoR I、HindIII)处理的胞质遗传体pKK223-3进行连接反应(Ligation Kit，TAKARA)，构筑发现载体。然后，使该载体依照“Molecular Cloning”second ed.，1989，ed.by J.Sambrook et al.，Cold Spring Habor Laboratory Press中所述方法，对E.coli JM 109的感受态细胞进行转化，完成转化操作。另外，该转化子通过菌落PCR反应选择具有抗安比西林性的菌株，转化处理按照氯化钙法进行。

用含有胰胨1％、酵母提取液0.5％、氯化钠0.5％、安比西林100μg/mL、IPTG 1mM的500mL培养液在37℃下，将该重组大肠菌MAK-EX41振荡培养16小时。将得到的菌体用水洗净，然后利用超声波处理除去不溶物，调制成10mL粗酶提取液。在该粗酶提取液的0.1mL中，加入并混合2-甲胺基-1-苯丙酮盐酸盐1mg、水、0.02mL的1M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液pH7.5、葡萄糖10mg、葡糖脱氢酶0.1mg、NADP+0.1mg，制成1mL的反应溶液，在37℃下，进行24小时的反应。反应后，由反应溶液中除去不溶物，将上清液加入至HPLC(μBondapakphenyl Waters公司制，直径4mm，长300mm，洗提液为0.05M磷酸钠缓冲溶液(含乙腈7％)，pH 6.5，流速0.8mL/分钟，检测光波长UV220nm)进行分析，结果确认生成了0.5mg的假麻黄碱。再经HPLC(スミキラルAGP，住化分析中心社制，直径4mm，长150mm，洗提液为0.03M磷酸钠缓冲溶液，pH 7，流速0.5mL/分钟，检测光波长UV220nm)分析，结果可以确认，所得到的假麻黄碱都是d-假麻黄碱。

保有将上述氨基酮不对称还原酶的基因导入的载体的大肠菌MAK-EX41于平成13年(公元2001年)2月15日(原始保存日)，以FERMBP-7452的委托编号，保存在‘独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セんタ一(

305-8566日本国茨城県っくば市1丁目1番地1中央第6)’。

实施例3

(d-(1S，2S)-假麻黄碱的生成)

在含有葡萄糖1％、胨0.5％、酵母提取液0.3％的5ml培养基中植入表1所示各微生物，在30℃下进行48小时的振荡培养。在对培养液进行离心分离而得到菌体后，将菌体放入试管，然后在其中加入0.1M磷酸钠缓冲溶液(pH 7.0)1ml并悬浊化。再在该悬浊液中加入d 1-2-甲胺基-苯丙酮盐酸盐1mg，在30℃下振荡24小时以进行反应。反应结束后，将反应液离心分离而除去菌体，将上清液加入HPLC，得到旋光性假麻黄碱(μBondapakphenyl Waters公司制，直径4mm，长300mm，洗提液为0.05M磷酸钠缓冲溶液(含乙腈7％)，pH 5.0，流速0.8ml/分钟，检测光波长UV220nm)。

绝对配置和光学纯度用HPLC(住化分析中心制カラムスミキラルAGP，直径4mm，长150mm，0.03M磷酸钠缓冲溶液，pH 7.0，流速0.5ml/分钟，检测光波长220nm)测定。其结果如表1和表2所示，仅选择性地得到d-假麻黄碱。

生成的d-假麻黄碱的光学纯度及生成量如表1和表2所示。以下的生成量都换算成盐酸盐的量来表示。

表1

表2

实施例4

在含有葡萄糖1％、胨0.5％、酵母提取液0.3％的培养基中植入摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO 3848，在30℃、需氧环境下进行48小时振荡培养。将该培养液5ml离心分离得到菌体，然后风干，将得到的干燥菌体放入1ml的0.05M三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(pH7.5)中悬浊化。在上述干燥菌体悬浊液中加入葡萄糖50mg、葡糖脱氢酶0.2mg、NADP 0.6mg、NAD 0.6mg、d1-2-甲胺基-苯丙酮盐酸盐10mg，在28℃、300rpm条件下反复振荡。反应48小时后，与上述实施例3相同，利用HPLC测定反应液的假麻黄碱生成量和光学纯度。

其结果是，生成0.79mg/ml的d-假麻黄碱盐酸盐，其光学纯度为100％。

实施例5

(添加诱导剂所造成的影响(1))

在培养基1(表3)中，添加5ml的1-氨基-2-羟基丙烷到试管中，使其浓度为5g/1，用硅橡胶塞封闭，在高压锅内、121℃的条件下进行30分钟的杀菌。在该培养基中和没有添加诱导剂的培养基中，分别植入红串红球菌MAK-34菌株，在30℃、300rpm条件下进行48小时振荡培养。将培养液0.5ml在10000G条件下，进行20分钟离心分离，除去上清液后得到菌体，再在其中加水悬浊化，从而得到均匀的悬浊液。在此悬浊液中加入水、缓冲溶液、d1-2-甲胺基-苯丙酮盐酸盐10mg，取出上述混合液1ml加入试管中，在30℃、150rpm条件下进行12小时振荡反应。反应结束后，利用离心分离除去菌体，将上清液加入至HPLC，测定假麻黄碱的生成量。(HPLC条件：μBondapakphenyl Waters公司制，直径4mm，长300mm，洗提液为0.05M磷酸钠缓冲溶液(含乙腈7％)，pH 6.5，流速0.8ml/分钟，检测光波长UV220nm)

其结果如表4所示，添加诱导剂培养后的假麻黄碱的生成量，与没添加诱导剂的培养相比显著增加。

表3

培养基1的组成	培养基2的组成	培养基3的组成	培养基4的组成
培养基1的组成	培养基2的组成	培养基3的组成	培养基4的组成	蔗糖 1％玉米浸渍液 0.5％磷酸一钾 0.1％磷酸二钾0.3％对氢基安息香酸 0.01％pH7.0	葡萄糖 0.1％胰胨 0.5％酵母提取液 0.5％磷酸二钾 0.1％pH7.0	葡萄糖 1％细菌胨 0.5％酵母提取液 0.3％pH7.0	可溶性淀粉 1％葡萄糖 0.5％NZ胺类A 0.3％胰胨 0.5％酵母提取液 0.2％磷酸二钾 0.1％MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.05％

表4

No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg
No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg	1	Rhodococcuserythropolis	MAK-34	1	0.0180	1.260
2	Mycobacteriumchlorophenolicum	IFO-15527	3	0.0320	0.770	1	Rhodococcuserythropolis	MAK-34	1	0.0180	1.260
2	Mycobacteriumchlorophenolicum	IFO-15527	3	0.0320	0.770	3	Mycobacteriumsmegmatis	IAM-12065	3	0.0480	0.210
4	Nocardioides simplex	IFO-12069	2	0	0.190	3	Mycobacteriumsmegmatis	IAM-12065	3	0.0480	0.210
4	Nocardioides simplex	IFO-12069	2	0	0.190	5	Klebsiella pneumoniae	IFO-3319	2	0.0180	0.066
6	Absidia lichtheimi	IFO-4409	4	0.0035	0.220	5	Klebsiella pneumoniae	IFO-3319	2	0.0180	0.066
6	Absidia lichtheimi	IFO-4409	4	0.0035	0.220	7	Aspergillus awamori	IFO-4033	4	0.00048	1.170
8	Aspergillus candidus	IFO-5468	4	0.0092	0.018	7	Aspergillus awamori	IFO-4033	4	0.00048	1.170
8	Aspergillus candidus	IFO-5468	4	0.0092	0.018	9	Penicillium cyaneum	IFO-5337	4	0.0310	1.260
10	Hypocrea gelatinosa	IFO-9165	4	0.0058	0.640	9	Penicillium cyaneum	IFO-5337	4	0.0310	1.260
10	Hypocrea gelatinosa	IFO-9165	4	0.0058	0.640	11	Helicostylum nigricans	IFO-8091	4	0.0067	0.520
12	Tritirachium oryzae	IFO-7544	4	0.0047	0.078	11	Helicostylum nigricans	IFO-8091	4	0.0067	0.520
12	Tritirachium oryzae	IFO-7544	4	0.0047	0.078	13	Armillariella mellea	IFO-31616	4	0.0042	0.460

实施例6

(添加诱导剂所造成的影响(2))

除使用表4所示的微生物及培养基以代替实施例5的微生物之外，其它方面与实施例5一样地进行培养、反应。菌体的分离，通过离心分离或由培养液过滤(No.(3)及No.(6)～No.(13))进行。其结果如表4所示，添加1-氨基-2-羟丙烷进行培养的情况下的d-假麻黄碱的生成量与没有添加诱导剂的情况相比，明显增大。

实施例7

(添加诱导剂所造成的影响(3))

除使用1-氨基-2-羟丁烷代替实施例5的1-氨基-2-羟丙烷以外，其它与实施例5一样进行培养、反应。菌体的分离，通过离心分离或由培养液过滤来进行。其结果如表5所示，添加有化合物进行培养的情况下的假麻黄碱的生成量与没有添加化合物的情况相比，明显增大。

表5

No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg
No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg	(14)	RhodococcusErythropolis	MAK-34	1	0.018	0.65
(15)	Mycobacteriumsmegmatis	IAM-12065	3	0.048	0.17	(14)	RhodococcusErythropolis	MAK-34	1	0.018	0.65

实施例8

(添加诱导剂所造成的影响(4))

除使用1-氨基-2-环己烷代替实施例5的1-氨基-2-羟丙烷以外，其它与实施例5一样进行培养、反应。菌体的分离，通过离心分离或由培养液过滤来进行。其结果如表6所示，添加有化合物进行培养的情况下的假麻黄碱的生成量与没有添加化合物的情况相比，明显增大。

表6

No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg
No.	微生物	No.	培养基	生成量(无添加)mg	生成量(添加)mg	(16)	RhodococcusErythropolis	MAK-34	1	0.018	0.23
(17)	Mycobacteriumsmegmatis	IAM-12065	3	0.048	0.13	(16)	RhodococcusErythropolis	MAK-34	1	0.018	0.23

实施例9

(添加诱导剂所造成的影响(5))

在含有蔗糖1.0％、玉米浸渍液0.5％、磷酸二氢钾0.1％、磷酸氢二钾0.3％、对氨基安息香酸0.01％、各种诱导剂0.1％的pH7.0的培养基5ml中植入红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)MAK-34，在30℃条件下进行48小时振荡培养。对培养液进行离心分离而得到菌体后，放入试管，在该试管中加入0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)1.0ml而悬浊化。然后在该悬浊液中加入d 1-2-甲胺基苯丙酮盐酸盐10mg、葡萄糖20mg，在30℃条件下进行16小时的振荡反应。反应结束后，对反应液进行离心分离以除去菌体，将上清液加入至HPLC，得到旋光性假麻黄碱(μBondaspherephenyl Waters公司制，直径4mm，长150mm，洗提液为0.05M磷酸钠缓冲溶液(含乙腈7％、pH6.5)，流速0.8ml/分钟，检测光波长220nm)。其生成量如表7所示，与没有添加诱导剂的情况相比，明显地显示出高的值。

表7

No.	化合物名	生成量(mg)
No.	化合物名	生成量(mg)	(18)	1-乙酰氨基-2-羟丙烷	3.00
(19)	1-甲胺基-2-羟丙烷	2.83	(18)	1-乙酰氨基-2-羟丙烷	3.00
(19)	1-甲胺基-2-羟丙烷	2.83	(20)	1-氨基-2-羰基丙烷	1.97
(21)	1-氨基-2-羟基环戊烷	1.93	(20)	1-氨基-2-羰基丙烷	1.97
(21)	1-氨基-2-羟基环戊烷	1.93	(22)	1-氨基-2，3-二羟丙烷	1.55
(23)	L-苏氨酸	1.12	(22)	1-氨基-2，3-二羟丙烷	1.55
(23)	L-苏氨酸	1.12	(24)	4-氨基-3-羟丁酸	0.97
(25)	1-氨基-2-羰基环己烷	0.26	(24)	4-氨基-3-羟丁酸	0.97
(25)	1-氨基-2-羰基环己烷	0.26	(26)	吗啉	0.11
(27)	3-羟基吡咯烷	0.11	(26)	吗啉	0.11
(27)	3-羟基吡咯烷	0.11	(28)	3-羟基哌啶	0.10
(29)	2-氨甲基-四氢呋喃	0.10	(28)	3-羟基哌啶	0.10
(29)	2-氨甲基-四氢呋喃	0.10	(30)	1-(2-羟丙基)氨基-2-羟丙烷	0.05
(31)	1-叔丁氧基羰基氨基-2-羟丙烷	0.05	(30)	1-(2-羟丙基)氨基-2-羟丙烷	0.05
(31)	1-叔丁氧基羰基氨基-2-羟丙烷	0.05	(32)	2-氨基-3-羟丁烷	0.05
(33)	DL-丝氨酸	0.04	(32)	2-氨基-3-羟丁烷	0.05
(33)	DL-丝氨酸	0.04		无添加	0.02

产业上的可利用性

如上所述，根据本发明的氨基酮不对称还原酶、蛋白质、核酸及微生物，能够提供一种具有可以以高收率、高选择性由α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物制造具有所希望的旋光性的β-氨基醇的作用的氨基酮不对称还原酶。并且，还能提供一种具有氨基酮不对称还原活性的蛋白质、对上述蛋白质进行编码的核酸、可由上述核酸转化的转化子、使用上述转化子制造蛋白质的方法及上述转化子或上述蛋白质的用途。而且，能够提供可由α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物高效地转化成旋光性β-氨基醇的新型微生物。

序列表

<110>第一精密化学股份有限公司

<120>氨基酮不对称还原酶及其核酸

<130>FP02-0052-00

<140>

<141>

<150>JP2001-58698

<151>2001年3月2日

<160>13

<170>PatentIn Ver.21

<210>1

<211>259

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>1

Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys Gly Ile Gly Leu Gly Met Val Arg Val Phe Ala Arg Ala Gly Ala

20 25 30

Asn Val Leu Met Thr Ala Arg Asp Ala Leu Thr Leu Glu Arg Ala Ala

35 40 45

Glu Gly Leu Asn Gly Leu Pro Gly Ala Val Ser Thr Leu Gln Val Asp

50 55 60

Val Thr Asn Pro Asp Ser Leu Ala Gly Met Ala Glu Val Ala Ala Glu

65 70 75 80

Arg His Gly Gly Ile Asp Val Leu Cys Ala Asn Ala Gly Ile Phe Pro

85 90 95

Ser Lys Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe

100 105 110

Gly Val Asn Val Lys Gly Thr Ile His Ala Val Gln Ala Cys Met Pro

115 120 125

Trp Leu Glu Thr Ser Gly Arg Gly Arg Val Val Val Thr Ser Ser Ile

130 135 140

Thr Gly Pro Val Thr Gly Tyr Pro Gly Trp Ser His Tyr Gly Ala Ser

145 150 155 160

Lys Ala Ala Gln Met Gly Phe Ile Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala

165 170 175

Pro Lys Arg Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr

180 185 190

Glu Gly Leu Asp Gly Leu Gly Gln Glu Tyr Leu Asp Gln Met Ala Ser

195 200 205

Ser Val Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ser Val Glu Asp Ile Ala Asn Ala

210 215 220

Ala Leu Phe Phe Ala Leu Asp Glu Ala Ala Tyr Ile Thr Gly Gln Ser

225 230 235 240

Leu Ile Val Asp Gly Gly Gln Val Leu Pro Glu Ser Ala Met Ala Leu

245 250 255

Gly Glu Leu

<210>2

<211>780

<212>DNA

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>2

atgttcaact ccattgaagg tcgttcggtc gtcgtcaccg gcggtagcaa gggcatcggc 60

ttgggaatgg tccgggtatt cgcgcgcgca ggggccaatg tgctcatgac cgcgcgagac 120

gctctgactc tcgaacgtgc cgcggagggt ttgaatggtc ttcctggcgc ggtctccaca 180

cttcaagtcg acgtcacgaa tcctgactcc ttggccggta tggcagaagt tgcggccgag 240

cgacacggag gaatcgacgt gttgtgcgcg aacgctggga tcttcccgtc gaagcggttg 300

ggagagatga cctcggagga catggacagc gtattcggcg tcaacgtcaa ggggaccatc 360

cacgccgtgc aagcgtgcat gccgtggctc gaaacttctg ggcgtggaag ggttgtcgtg 420

acatcgtcga tcaccggacc cgtaaccggt tatccgggtt ggtcgcacta cggggcaagc 480

aaggctgcgc agatgggctt catccgaact gctgccattg agttggcacc gaagaggatc 540

acgatcaacg ccgtcttgcc cggcaacgtg atcaccgagg ggctcgacgg tttgggacag 600

gaatatctcg accaaatggc gtccagcgtc ccggccggca gtctgggcag cgtcgaggat 660

atcgccaatg ccgcactgtt ctttgcactg gacgaagccg cgtacatcac cggtcagtcg 720

ttgatcgtag atggtggaca ggttcttccg gagtcggcga tggcgctcgg cgaactgtaa 780

<210>3

<211>17

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>3

Met Phe Asn Ser Ile Glu Gly Arg Ser Val Val Val Thr Gly Gly Ser

1 5 10 15

Lys

<210>4

<211>19

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>4

Arg Leu Gly Glu Met Thr Ser Glu Asp Met Asp Ser Val Phe Gly Val

1 5 10 15

Asn Val Lys

<210>5

<211>17

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>5

Ala Ala Gln Met Gly Phe Ile Arg Thr Ala Ala Ile Glu Leu Ala Pro

1 5 10 15

Lys

<210>6

<211>13

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>6

Xaa Xaa Ile Leu Ala Val Gln Ala Met Met Pro Xaa Leu

1 5 10

<210>7

<211>28

<212>PRT

<213>红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)

<400>7

Xaa Ile Thr Ile Asn Ala Val Leu Pro Gly Asn Val Ile Thr Glu Gly

1 5 10 15

Leu Asp Gly Leu Gly Gln Glu Tyr Leu Asp Gln Met

20 25

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

简并引物

<400>8

atgttyaayw snathgargg nmg 23

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

简并引物

<400>9

catytgrtcn arrtaytcyt gnccna 26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>10

aatacccgga ccattcccaa gccgat 26

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>11

tcgaaacttc tgggcgtgga agggtt 26

<210>12

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>12

gatgaattcc aaatgttcaa ctccattga 29

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：合成多核苷酸

<400>13

tgaagctttc gtcgcttgtc ttacagttc 29

Claims

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如序列表的序列号1所述。

2.一种如权利要求1所述的蛋白质的盐。

3.一种核酸，其编码如序列表的序列号1所述的氨基酸序列的蛋白质。

4.一种核酸，其碱基序列如序列表的序列号2所述。

5.一种含有权利要求3或4所述的核酸的载体。

6.一种保有权利要求5所述的载体的转化子。

7.一种蛋白质的制造方法，其特征在于，在权利要求6所述的转化子中表达而得到蛋白质。

8.一种氨基酮不对称还原酶的制造方法，其特征在于：包括：

在可使权利要求6所述的转化子增殖的培养基中培养该转化子的培养工序；

由所述培养工序中得到的该转化子精制氨基酮不对称还原酶的精制工序。

9.一种权利要求1所述的氨基酮不对称还原酶的制造方法，其特征在于：包括：

对保藏编号为FERM BP-7451的红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)MAK-34菌株进行培养的培养工序；

由所述培养工序中得到的微生物对权利要求1所述的蛋白质进行精制的精制工序。

10.一种具有还原1-2-甲胺基苯丙酮生成d-假麻黄碱能力的红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)MAK-34菌株，其保藏编号为FERMBP-7451。

11.一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使权利要求1所述的蛋白质或它们的盐作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

式中，X表示选自卤原子、低级烷基、可用保护基保护的羟基、硝基及磺酰基中的至少一种，可相同也可不同；n表示0～3的整数；R¹表示低级烷基；R²、R³表示选自氢原子和低级烷基中的至少一种，可相同也可不同；*表示不对称碳原子；

通式(2)：

式中，X、n、R¹、R²、R³及*的意义同上所述。

12.一种旋光性氨基醇化合物的制造方法，其特征在于：使权利要求6所述的转化子或权利要求10所述的微生物作用于用通式(1)表示的α-氨基酮化合物或其盐的对映体混合物，

通式(1)：

通式(2)：

式中，X、n、R¹、R²、R³及*的意义同上所述。

13.如权利要求12所述的旋光性氨基醇的制造方法，其特征在于：再添加用通式(3)表示的化合物、或其可用于制药的盐或溶剂化作用产物，生成旋光性氨基醇，

通式(3)：

A表示结构式(Y)或(Z)，

R⁴表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环或与R⁸结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架，

R⁵表示氢原子、碳原子数为1～3的烷基、或与R⁶或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁶表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～3的烷基、与R⁸结合而成的碳原子数为5～10的烃环、与R⁵或R⁹结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R⁷表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基；

R⁸表示氢原子、羧基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、与R⁴结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架、与R⁶结合而成的碳原子数为5～10的烃环；R⁹表示氢原子、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷基、可带有取代基的碳原子数为1～6的烷氧基羰基、可带有取代基的酰基、与R⁵或R⁶结合而成的含有1～3个杂原子的5～8元环的杂环状骨架；R¹⁰表示氢原子或可进行取代反应的碳原子数为1～6的烷基。