KR20030027904A - 연골 및 다른 조직의 복구 및 재생용 조성물 및 방법 - Google Patents

연골 및 다른 조직의 복구 및 재생용 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20030027904A
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Abstract

본 발명은 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양과 같은 인간 또는 동물의 조직을 복구하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 온도-의존적인 폴리머 젤 조성물을 조직으로 전달하여 조직에 부착하게 하며, 조직을 복구하기 위하여 세포 분화를 촉진시키는 단계를 포함한다. 폴리머 이외에도, 조성물은 바람직하게는 전혈, 가공혈, 정맥혈, 동맥혈, 뼈로부터의 혈액, 골수로부터의 혈액, 골수, 탯줄의 혈액, 태반의 혈액, 적혈구, 백혈구, 단핵구, 혈소판, 피브리노젠, 트롬빈 및 혈소판이 풍부한 혈장과 같은 혈액 성분을 포함한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 신규한 조성물에 관한 것이다.

Description

연골 및 다른 조직의 복구 및 재생용 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR THE REPAIR AND REGENERATION OF CARTILAGE AND OTHER TISSUES}
1) 연골 복구의 문제점:
연골: 구조, 기능, 발생, 병리
관절의 연골은 인접하는 뼈 구조에 이동력을 제공하는 동시에 관절의 분절 사이가 마찰이 없도록 하기 위해 가동관절의 접합부에 있는 뼈의 말단을 덮는다. 이러한 특징은 콜라겐 타입 Ⅱ, 나머지 소수의 콜라겐 성분 및 다량의 프로테오글리칸 어그리칸(proteoglycan aggrecan)으로 구성된 세포외 기질(extracellular matrix)에 의해 제공된다. 일반적으로, 섬유성 콜라겐 조직망은 장력 및 절단력에 대해 버티게 하는 한편 높은 전하를 띈 어그리칸은 압축 및 조직사이에서의 체액의 유동성에 대해 저항한다. 적은 마찰력은 관절 표면 및 활액의 특정 분자 조성으로인해 발생할 뿐만 아니라 관절 표면으로 놓이게 되는 동안에 조직 체액의 배출로 인해 발생하게 된다(Atenshian, 1997; Higakiet al., 1997; Schwartz and Hills, 1998).
관절의 연골은 전구연골세포적 간엽조직세포가 중합되고, 유전적 표현형이 콜라겐 타입 Ⅰ에서 콜라겐 타입 Ⅱ 및 어그리칸으로 전환되는 긴 뼈의 발생 과정에 형성된다(Hall, 1983; Pechaket al., 1986). 뼈는 연골세포가 과다하게 발달하고 콜라겐 타입 Ⅹ로 전환되며, 혈관이 침입하고, 기질이 석회화되며, 조골세포가 생성되고 뼈 기질이 생산되는 과정을 통해 형성된다. 성인에 있어서, 관절 연골의 얇은 막이 뼈의 말단부에 존재하며, 세포외 기질의 합성, 조합 및 전환을 통해 연골세포에 의해 유지된다(Kuettner, 1992). 관절 연골 질병은 물리적 외상에 의한 골절 또는 많은 형태의 관절염으로 특징되는 점진적인 부식이 일어날 때에 발병하며, 준연골의 뼈를 노출시켜서 증상을 나타내는 관절통을 일어나게 할때 발병한다(McCarty and Koopman, 1993). 관절 연골과 더불어, 연골조직은 성인의 귀 및 코와 같은 일부 신체 부위에서 유지되며, 이러한 부위는 종종 복구 수술에서 사용된다.
2) 연골 복구: 자연적 반응
관절 연골은 대체로 혈관형성의 부재와 프로테오 글리칸이 풍부한 밀도높은(dense) 세포외 기질 때문에 성인에 있어서 외상에 대하여 제한된 반응을 보인다(newman, 1998; Buckxalter and Mankin, 1997; Minas and Nehrer, 1997).전자는 염증성 및 다잠재성 복구 세포의 출현을 억제하는 반면, 후자는 전도성이 없는 기질에 잔존하는 연골세포의 이동을 억제한다. 그러나, 부연골(subchondral) 뼈를 관통하는 병변은 혈관성인 뼈로 향하는 관을 형성하게 되어 병변 부위에 기원을 두고 있는 뼈 및 골수세포를 잡아들임으로써 피브린을 응고되게 하여 과립(granulation) 조직을 만들게 된다. 과립 조직의 심층 부위는 부연골뼈의 판을 재구성하는는 반면 상층 부위는 섬유연골성 복구 조직으로 변하게 된다. 이러한 조직은 일시적으로 히알린(hyaline) 연골조직이 조직학적 외형을 가지게 되지만 기계적 특징은 가지고 있지 않기 때문에(Weiet al., 1997), 국소적인 기계적인 혼경을 지탱할 수 없어서 외상이 있고난 후 최초 1년이 끝나기 전에 퇴행이 일어나게 된다. 따라서, 성인 관절 연골에 있어서 복구하기 위한 자연적인 반응은 부분적으로 두꺼운 병변에서는 복구 반응이 일어나지 않는 반면(연골의 순환 및 국소적인 연골세포 클로닝이외의) 뼈를 관통하여 전체적으로 두꺼운 병변은 제한되고 실패된 반응을 보여 준다. 그러나, 나이는 중요한 인자인데, 그 이유는 미성숙한 관절 연골에 있는 전체적으로 두꺼운 병변은 성인의 것보다 더 잘 치유되며(DePalmaet al., 1996; Weiet al., 1997), 태아의 관절 연골에 있는 표면적 외상은 혈관 형성 또는 뼈유래 세포의 도움이 없이도 한달안에 완전히 치유되기 때문이다(Nambaet al., 1998).
3) 연골 복구를 도와주기 위한 최근의 시도
징후가 나타나는 연골의 결함을 치료하기 위한 최근의 임상 치료는 하기와같은 목적의 기술을 포함한다: 1) 깍아내기(shaving) 및 좌멸괴사조직제거(debridement)를 통한 불규칙한 표면의 제거, 2) 상기에 기재된 자연적인 복구 반응(즉, 골수 촉진 기술의 군)을 증가시키기 위한 뚫기(drilling), 파쇄하기 또는 마멸에 의한 부연골 뼈의 관통, 3) 남아있는 연골을 관절 형성에 사용하기 위한 관절의 재편성(realignment) 또는 골절술, 4) 약리학적 조절, 5) 조직 이식 및 6) 세포 이식(Newman, 1998; Buckwalter and Mankin, 1997). 상기 방법의 대부분은 증세를 감소시키는데 있어서 단기간(몇 달 내지 수년)에는 효과가 있지만, 처음 수년 이후에는 관절 병변의 복구를 성공적으로 지속적으로 수행할 수 없었다. 깍아내기, 좌멸괴사조직제거, 뚫기, 파쇄하기 및 마멸 연골성형과 같은 골수 촉진 기술은 증상을 일시적으로 완화시켜 주지만, 부가적인 기능을 하는 섬유연골 조직을 생성하여 결국 분해된다. 손상 부위에 성장인자를 제공하는 약리학적 조절은 자연적인 복구를 증가시키지만 지금까지는 충분하지 못하다(Hunziker and Rosenberg, 1996; Sellerset al., 1997). 살아있는 연골세포를 포함한 조골연골 조직의 타가이식 및 동종이식은 훨씬 성공적인 복구 효과를 볼 수 있지만 이식 제공자가 매우 제한되어 있다(Mahomedet al., 1992; Outerbridgeet al., 1995).
4) 골수의 촉진
골수 촉진 기술의 군은 좌멸괴사조직제거, 깎기, 뚫기, 미새파쇄(microfracturing) 및 마멸 관절 성형을 포함한다. 최근에는 상기와 같은 기술이 전체적으로 두꺼운, 즉 부연골 뼈에 도달하며, 크기에 제한이 있어서 전형적으로는 면적이 3 ㎠ 이하인 관절 연골의 초점 병변을 치료하기 위해 정형외과적으로 광범위하게 임상에 사용되고 있다. 상기와 같은 방법의 사용은 최초 프리디 및 그 외의 연구자(Pridie, 1959; Insall, 1967; Depalmaet al., 1966)에 의해 시작되었으며, 이들은 뼈로부터 무혈관성의 연골 결함 부위로 혈액을 공급하기 위해 연골/뼈의 연결 부위를 침해함으로써 관절 연골 병변 부위에서 혈액 응고가 형성될 수 있다고 설명하였다. 이러한 혈종(hematoma)은 일반적인 상처 치유 과정을 거치게 되어 성공적으로 치유되거나 또는 적어도 혈관성 조직의 상처에 반흔(scarring)을 남기게 한다(Clark, 1996). 이후 프리디의 뚫기(drilling) 기술을 변화시킨 마멸 관절성형(brasion arthroplasty)(Childers and Ellwood, 1979; Johnson, 1991) 및 미쇄파쇄(microfracturing)(Rodrigoet al., 1993; Steadmanet al., 1997)가 제안되었다. 마멸 관절성형은 뼈 심층의 부드러운 부위에 있는 혈액을 공급하는 부위까지 비정상적으로 농축(dense)된 부연골 뼈를 마멸시키기 위해 모터 기기를 사용한다. 미세파쇄기술은 부연골 뼈 판(plate)의 충분히 깊은 부위(전형적으로 3 -4 ㎜)를 뚫어서 다시 혈관 공급 부위에 도달하여 연골 병변 부위내에서 혈액을 응고시키게 하기 위해 픽(pick) 또는 송곳을 사용한다. 미쇄파쇄기술을 가진 개업의들은 미쇄파쇄기술이 열에 의해 유발되는 괴사가 적고, 뚫기에 의해 생기는 판의 큰 간격(gap)에 비해 훨씬 적은 구멍을 내기 때문에 부연골 뼈 판의 생물리학적 불안정을 감소시킬수 있어서 뚫기(drilling)보다 높은 성공률을 보인다고 주장한다(Steadmanet al., 1998). 관절연골의 국소 병변을 치료하기 위한 또 다른 연관된 기술은 모자이크 성형 또는 뼈 연골 자가이식(autografttransplantation, OATS)인데, 여기서는 연골/뼈 실린더가 "시품되지 않은" 말초 관절로부터 연골 병변을 포함하는 매우 과부하된 부위로 전달한다(Hangodyet al., 1997).
정형외과 의사들 중에서 어떤 관절 연골 병변이 어떤 형식의 치료를 받아야 하는지에 대한 공통적인 의견일치는 없다. 또한, 특정 징후의 효율적인 치료에 대한 엄밀한 과학적 연구도 없다. 따라서, 연골 병변의 치료를 선택하는 것은 개업의의 시술에 대한 훈련도, 성향 및 개인적인 경험에 많이 의존하게 된다. 이러한 의견일치의 부재에 대한 이유는 다양하며, 치료할 병변 형태의 다양성과 "고품질"의 혈액 응고의 형성에 있어서의 조절되지 않은 성공의 다양성을 포함한다. 이러한 과정에 따라, 고품질의 혈액 응고의 형성과 관련된 몇가지 문제점으로는 1) 연골 병변 부위를 전체적으로 채울 수 없는, 뼈로부터 오는(coming) 혈액 수급의 조절되지 않는 성질, 2) 응고 형성 수분내에 일어나는 혈소판에 의해 유도된 응고 수축(clot contraction)이 응고의 크기를 줄여주고 주위 연골로부터 그것을 분리되게 하는 것(Cohenet al., 1975), 3) 관절활액(synovial fluid) 또는 순환성 관절경검사액(arthroscopy fluid)으로 인한 뼈 혈액의 희석, 4) 활액의 피브린 용해 활성 또는 응고 용해 활성이 있다(Mankin, 1974). 상기 논쟁의 일부는 어떤 연구들의 동기를 부여하였는데, 상기 연구들에서는 혈액 응고가 세포 외에서 형성되고, 응고의 크기가 줄어 연골 메니스커스의 결함 부위(Arnoczkyet al., 1988) 또는 골연골의 결함 부위(Paletteet al., 1992)를 채운다. 일반적인 상처치유 과정과 비슷한 과정이 결함이 있는 상처 부위의 치료를 도와주기 위해 잇따라 일어나게 한다. 이러한 시도는 복구 조직을 이용하여 결함이 있는 부위를 훨씬 더 채우기 용이하게 하지만, 섬유화되기 쉬우며 물리적으로 불충분하기 때문에 복구 조직의 질이 일반적으로 만족할 만하지 않다. 이러한 복구 조직의 불충분한 역할에 대한 접근으로는 1) 혈소판에 의해 유래된 지속적인 응고 수축, 2) 엑스 비보(ex vivo)에서의 과다한 처치로 인한 일부 혈액 구성 성분의 생존력 결핍 및 3) 엑스 비보에서의 응고에 의한 고체화가 결함이 있는 연골 주위로의 세포 부착의 방해 및 채우기의 제한이 있다. 요약하자면, 관절 연골의 제한된 병변을 치료하기 위해 사용하는 최근의 정형외과적인 임상 치료 방법은 대부분 병변 부위 내에서의 혈액 응고의 형성에 의존한다. 그러나, 병변 부위를 채우고, 생존에 적합하게 상처를 치유할 수 있는 모든 적당한 구성 요소(혈소판, 단핵구, 피브린 네트워크 등)를 포함하는 고품질의 혈액 응고를 형성할 수 있는 능력은 일치되지 않고 종종 불만족스러운 결과를 보여준다. 본 발명의 한 실시예에서는 비수축 조직의 전체 부피를 차지하는 혈액을 포함한 상처 치유 구성 요소를 관절 연골의 병변조직으로 전달할 수 있는 조성물 및 그 방법을 제공함으로써 상기의 문제점을 개선한다.
5) 생체 재료 및 성장 인자
생체 재료 및 성장 인자, 상기 각각 또는 이들을 혼합 사용함으로써 연골 병변 부위를 복구하려는 몇몇 실험적 방법이 제안되었다. 이는 상기에 기재된 골수 촉진 기술군과 유사하다. 응고된 혈액의 피브린 구조(scaffold)는 조립 성형된 생체재료의 구조로 대체될 수 있으며, 응고된 혈액에 존재하는 천연의 세포유사분열인자 및 주화성 인자는 사용자에 의해 조절된 재조합 성장 인자와 같은 수용성 구성 요소의 질 및 종으로 대체될 수 있다. 이러한 시도의 예로는 인슐린-유사-성장 인자(Nixonet al., 1999) 및 전환 성장 인자(transforming growth factor)(Hunzider and Rosenberg, 1996)와 같은 재조합 단백질을 전달하기 위해 피브린 접착제를 사용하는 것을 포함한다. 다른 생체재료로는 폴리락틱산(polylactic acid, PLA), 폴리글리코릭산(polyglycolic acid, PGA), 콜라겐 조직과 같은 생체 재료, 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein)(Sellerset al., 1997; Sellers, 2000; Zhanget al., patent WP 00/44413, 2000), 안지오텐신-유사 펩타이드(Rodgers and Dizerega, Patent WO 00/02905, 2000)를 포함하는 피브린 접착제 및 뼈 단백질 또는 BP로 불리는 다수 단백질을 포함한 뼈추출물(Atkinson, patent WO 00/48550, 2000)과 같은 생체재료의 혼합물이 있다. 상기 마지막 방법에 있어서, BP로 침지된 콜라겐 스폰지는 추가로 피브린/트롬빈 기초의 부착물을 사용하여 연골 결함부위에 잡혀있어야(hold) 하며, 복합체의 형성이 적게되고 상처 치유 환경을 재생산하기가 힘들다. 세포의 부착 및 세포의 이동을 도와주기 위하여 생체재료를 파이브로넥틴(fibronectin) 또는 RGD 펩타이드로 코팅하는 방법이 행해졌다(Breckke and Coutts, patent 6,005,161, 1999). 어떤 종래 방법에서는 수술후에 활액 공간내에 성장 호르몬을 주입하는 것과 골수의 촉진을 결합하였으나 성공적인 결과를 가져오지는 못했다(Dunn and Dunn, patent 5,368,051, 1994). 또한, 콜라겐, 키토산 및 글리코아미노글리칸(glycoaminoglycans)의 혼합물(Collombelet al., patent5,166,187, 1992; suhet al., patent WO 99/47186, 1999), 분쇄된 연골 및 뼈 접착(paste)(Stone, patent 6,110,209, 2000), 복합 성분의 콜라겐-기초 구성(Pahcenceet al., patent 6,080,194, 2000) 및 치료가능한 화학적으로 불활성인 메타크릴레이트-기초의 레진(Bradenet al., patent 5,468,787, 1995)과 같은 특정 생체 재료 조성물들이 제안되었다. 그러나, 상기의 시도들은 1) 연골 결함 부위에서의 생체재료의 보존 및 부착능력의 부족, 2) 활성화된 형태 및 효과적인 농도로 생체재료 분자를 오랜 지속 기간동안 분비하는 것의 부족, 3) 전달된 분자의 복합적이며 조절되지 않는 생물학적 활성, 4) PGA 및 PLA의 산성 분해 산물의 세포 독성, 5) 전달 생체재료의 적당하지 않는 분해 동역학 또는 면역성, 6) 활성이 있는 생체재료의 불필요한 몸 전체 또는 비정상적인 위치에서의 활성(조직의 석회화)와 같은 문제점의 일부를 극복하기에는 불안정하여 임상적으로 실시되지 못하였다. 상기와 같은 시도를 성공적으로 수행하기 위해서는 이러한 문제점들의 일부 또는 전부를 해결 해야한다.
6) 세포 이식
세포 이식과 관련된 기술들은 엑스 비보에서의 계대배양 및 조작을 수행하고 난 뒤 다수의 자가 연골세포(Grandeet al., 1989; Brittberget al., 1994 and 1996; Aston and Bently, 1986; Itayet al., 1987; Wakatiniet al., 1989; Robinsonet al., 1990; Freedet al., 1994; Noguchiet al., 1994; Hendricksonet al., 1994; Kandelet al., 1995; Sams and Nixon, 1995; Specchiaet al.,1996; Frankelet al., 1997; Hycet al., 1997; Kawamuraet al., 1998), 이종 연골세포(Hommingaet al., 1991), 연골막 세포(Chuet al., 1995; Chuet al., 1997) 또는 동종 및 타종의 골수-유래의 간엽세포성 줄기 세포(Wakatiniet al., 1994; Butnariu-Ephrat, 1996; Caplanet al., 1997; Nevoet al., 1998)를 관절의 결함부위로 전달함으로써 연골의 복구 능력을 증가시킬수 있기 때문에 세포 이식과 관련된 기술은 최근의 흥미있는 분야이다. 세포 이식은 다른 연골 복구 기술을 뛰어넘을 수 있는 잠재적인 장점을 가지고 있는데, 그런 장점으로는 1) 연골 및 뼈의 추가적인 상해를 최소화하고, 2) 엑스 비보에서 세포를 생산하기 때문에 공여자의 의존성을 줄여주며, 3) 자연적인 연골 발생의 생물학적 과정을 모방하고, 및 4) 복구를 증진시키기 위해 세포 형태의 맞춤이 가능하다는 것이다. 자가연골세포를 사용한 기술중의 하나가 공공 도메인에 나와 있으며, 미국 및 스웨덴에 있는 수천명의 환자에게 상업적으로 이용되고 있다(http://www.genzyme.com). 상기 기술에서, 연골세포는 부하되지 않은 연골 부위를 생검하여 분리되며, 몇 주 동안 증식시킨 후에 환자의 경골로부터 분리된 봉합되고 피브린-봉합된 골막의 패치(patch) 아래에 주입함으로써 연골 병변으로 재도입된다. 그러나, 이러한 기술의 효과에 대해서는 의문점이 있으며(Messner and Gillquist, 1996; Brittberg, 1997; Newman, 1998), 불행하게도 FDA에서 요구하는 조절 및 비특이적인 집단에 대한 임상적 시도에 대한 목적 달성이 부족하여 잘 알려져 있지 않다. 최근의 동물 연구에서는 주입한 계대배양된 자가연골세포는 상처 치유에 기여하는 바가 매우 적었으며, 골수촉진을 이용하여 획득한 결과와 거의 비슷하였다(Breinanet al., 1997 andBreinanet al., 2000). 따라서, 상기의 방법에서도 결함에 대한 외과적인 처치가 복구의 유도에 있어서의 주된 인자일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포 이식의 매우 큰 잠재적 장점으로 인해 연골 복구에 사용될 목적으로 자가연골세포의 공정 과정(Tuboet al., patent 5,723,331, 1998; Villeneuve, patent 5,866,415, 1999) 뿐만 아니라 지방세포(Mueller and Thaler, patent 5,837,235, 1999; Halvorsenet al., patent EP 1,077,253, 2001), 조혈제 전구체(Peterson and Nousek-Goebl, patent 6,200,606, 2001), 동물 양막 세포(Sackier, 1997) 및 간엽조직 줄기세포(Caplan and Haynesworth, patent 5,811,094, 1998; Naughton and Naughton, patent 5,785,964, 1998; Naughton and Willoughby, patent 5,842,477, 1998; Grande and Lucas, patent 5,906,934, 1999; Johnstone and Yoo, patent 5,908,784, 1999)의 준비와 사용 및 연골 복구에 사용할 연골세포/섬유아세포, 이들의 원조인 상피세포, 지방세포, 태반세포 및 탯줄혈관세포(Purchioet al., patent 5,902,741, 1999)의 사용 및 준비를 보호하기 위하여 과거 2년 동안 수많은 환자들이 승인받고 있다.
7) 세포 전달의 문제점
연골의 복구를 돕기 위한 세포 이식을 하는데 있어서, 이식할 세포를 생존력 및 기능성을 가진 상태로 유지하면서 상처 부위로 전달하는 것이 반드시 필요하다. 지지 조직이 존재 또는 존재하지 않은 상태로 엑스 비보에서 세포가 자랄 때에는 결함 부위보다 약간 크게 이식하여 그 부위에 힘이 가해지게 함으로써 하중을 주게할 수 있다(Aston and Bentley 1986; Wakatiniet al., 1989; Freedet al., 1994; Chuet al., 1997; Frankelet al., 1997; Kawamuraet al., 1998). 하중을 가하는 것은 엑스 비보에서 형성되고 이식될 부위의 위치적, 물리적 및 생물학적 인자에 대해 최적화 되지 않은 조직을 사용하는 데 있어서 필수적이다. 봉합은 관절 표면에 추가적인 상처를 주어 또 다른 제한된 복구 과정을 유도하지만(Breinanet al., 1997), 이식을 봉합하고 고정하는 것은 이식된 부위가 보존되도록 도와줄 수 있다(Sams and Nixon, 1995). 생물학적 접착제를 이용한 시도에서는 제한된 성공을 거두었다(Kandelet al., 1995; Jurgensonet al., 1997). 수축성 콜라겐 젤 또는 피브린 응고와 같은 것으로 이식되거나 또는 지지 조직이 없는 상태로 세포 단독으로만 이식되어 하중이 마땅히 주어지지 않았을 때에는 종종 골막 또는 다른 유사 조직의 봉합된 패치(patch)가 결함이 있는 부위에 이식된 물질을 보존시키기 위해 사용된다(Grandeet al., 1989; Brittberget al., 1994; Grandeet al., 1989; Brittberget al., 1996; Breinanet al., 1997). 이러한 기술은 골막이 가지고 있는 기능에서부터 연골 형성을 촉진시킬 수 있다는 장점을 가지고 있지만(O'Driscollet al., 1988 and 1994), 봉합의 도입 및 골막의 채취 및 관절해부와 관련된 처치의 복잡한 성질로 인해 다시 통증을 받는다. 또한, 세포는 점성의 히알우론산 용액을 사용함으로써 전체적으로 두껍고 깊은 결함 부위에 전달되었다(Robinsonet al., 1990; Butnariu-Ephrat, 1996). 연골 복구를 위한 세포의 원천과 관련하여, 연골 복구에 있어서 젤 메트릭스(Griffithet al., 1998; caplanet al., 1999)에서부터 봉합 및 섬유(Vacantiet al., 1998; Vacanti and Langer,1998a 및 1998b), 스크류 형태의 장치(Schwartz, 1998) 및 자기장 시스템(Halpern, 1997)에 이르기까지의 수많은 전달 매체에 대한 최근에 공개된 몇몇 특허가 있다. 상기에 더불어, 연골 복구를 위한 최근의 세포 전달 기술은 명확히 최적화 되지 않는다. 원하는 세포를 전달하기 위한 매체로는 세포에 적하된 폴리머 용액이 있으며, 세포와 함께 넣음으로써 결함이 있는 부위로 주입하였을 때 고체화되게 하고 결함부위에 부착하여 채우게 되고 물리학적으로 기능을 하는 관절 연골의 세포외 조직을 분화, 합성 및 다량으로 모을 수 있게 한다.
8) 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양을 포함하는 조직의 복구
근육 조직 및 다른 조직을 자연적 및 도움을 받아서 복구하는 것은 상당히 복잡한 생물학적 과정을 가지고 있고, 복구하는 과정을 촉진시키고(뼈의 복구에 있어서), 조직 내부의 복구 능력이 상당히 부족한 조직(연골 복구에 있어서)을 도와주며, 공포(화력을 이용한 치료에 있어서)를 줄이기 위한 다양한 시도가 있다(Clark, 1996). 비록 상처 복구에 관련된 생물학적 조성 및 과정은 상당한 차이가 있지만 상처를 복구하는(태아를 제외한) 전체적인 과정은 동일하다. 조직이 파괴된 부위에는 혈액 응고가 형성되고, 혈소판으로부터 주화성 인자 및 분화촉진 인자가 분비되며 최종적으로는 복구 조직의 세포외 조직 성분을 합성하는 분화에 의한 복구 과정을 수행하게 된다. 복구하려는 특정 부위의 조직 환경을 만들고 특정 부위에 다분화성 복구 세포를 형성하게 함으로써 정확한 형태의 조직, 뼈를 대체할 수 있는 뼈, 피부를 대체할 수 있는 피부 등을 형성할 수 있다. 조직 복구 과정에 있어서 비슷한 형태의 일반적인 성분이 사용될 수 있는 것은 한가지 조직의 복구를 도와주기 위해 사용되는 것이 다른 조직의 복구를 도와주는데에도 성공적으로 사용되는 것을 보면 놀랄만 한 것은 아니다. 자연적인 상처 치유의 정형화된 과정으로부터 심각하게 벗어나지 않는 범위라면 복구를 도와주는 조성물 및 방법을 사용하는 것이 훨씬 더 가능하게 될 것이다. 본 발명에서는 조직을 복구하려는 위치에서 훨씬 효과적으로 부착이 가능하며 비수축성 혈액 응고를 할 수 있는 특정한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 구성 및 바람직한 실시예에서는 복구하기에 가장 힘든 조직중의 하나인 연골을 복구하는 것을 보여준다. 그러나, 같은 원칙에 입각하여 본 발명에 기재된 조성, 방법을 변형하는 것은 다른 조직 즉, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양을 복구하는데에도 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 자명하다.
9) 약제학, 상처 치유, 조직 복구 및 지혈제로의 키토산의 용도
새우 및 게 껍질의 천연 성분인 키틴의 알칼라인 탈아세트화에 의해 생성된 일차 산물인 키토산은 선형 폴리사카라이드의 일종이며, 1-4 연결된 글루코사민(우세한 것) 및 N-아세틸-글루코사민 모노머를 포함한다(Austinet al., 1981). 키토산 및 이의 아미노산이 치환된 유도체는 pH 의존적이고, 생물학적 침식을 받기 쉬우며(bioerodable), 생물적합적인 양이온성 폴리머로써, 상처를 치유하고 뼈를 유도하기 위한 생물의학적 산업(Denuziereet al., 1998; Muzzarelliet al., 1993및 1994), 약물 및 유전자의 전달(Carreno-Gomez and duncan, 1997; Schipperet al., 1997; Leeet al., 1998; Bernkop-schnurch and Pasta, 1998), 세포 성장 및 세포 캡슐화를 위한 골격(Yagiet al., 1997; Eser Elcinet al., 1998; Dillonet al., 1998; Koyanoet al., 1998; Sechriestet al., 2000; Lahijiet al., 2000; Suhet al., 2000)에 사용되었다. 키토산은 이온성 및 불용성 작용으로 위장 상피의 점액층에 부착하여 경구적 약물 전달을 용이하게 하기 때문에 점액 부착성 폴리머로 표현된다(Bernkop-Schnurch and Krajicek, 1998). 키토산은 키티네이즈(Fukamizo and Brzizinski, 1997), 라이소자임(Sashiwaet al., 1990), 셀룰레이즈(Yalpani and Pantaleone, 1994), 프로티에이즈(Terbojevichet al., 1996), 리파제(Muzzarelliet al., 1995)에 의해 효소적으로 절단되기 쉽기 때문에 생분해성(biodegradability)을 갖고 있다. 최근에는, 연골세포가 인간 키토사네이즈(chitosanase)의 아날로그인 키토트리오시데이즈(chitotriosidase)(Vasioet al., 1999)를 발현하는 능력이 있다고 밝혀졌으며, 이러한 생리학적 역할은 N-아세틸-글루코사민(N-acetyl-glucosamine)의 디사카라이드(disaccharide) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)을 포함하고 있어 키토산과 비슷한 선형 폴리사카라이드인 히알우로난의 감성(degradation)이 일어나는 곳에서 작용을 할 것이다.
키토산이 진피, 각막 및 경질 조직의 복구를 촉진하기 위해 단독 또는 다른 성분과 함께하는 여러 가지 형태로 제안됨을 수많은 보고(Sallet al., 1987; Bartone and Adickes, 1988; Okamotoet al., 1995; Inuiet al., 1995; Shigemasa and Minami, 1996; Uenoet al., 1999; Choet al., 1999; Stoneet al., 2000;Leeet al., 2000) 및 발명(Sparkes and Murray, patent 4,572,906, 1986; Mosbey, patent 4,956,350, 1990; Hanssoet al., patent 5,894,070, 1999; Gouda and Larm, patent 5,902,798, 1999; Drohanet al., patent 6,124,273, 2000; JorgensenWO 98/22114, 1998)에서 밝혔다. 상처 복구 과정을 수행하기 위해 유리하다고 공통적으로 언급되는 키토산의 특성으로는 생분해성, 부착성, 탈수소화의 방지 및 박테리아의 침입에 대한 방어력 등이 있다. 또한, 다른 특징으로 주장되는 것으로는 세포를 활성화하고 자연적 주화성을 가지며(Pelusoet al., 1994; Shigemasa and Minami, 1996; Inuiet al., 1995), 지혈능력(Maletteet al., 1983; Malette and Quigley, patent 4,532,134, 1985) 및 섬유증식증을 제한시키는 능력 및 육아조직을 느슨하게 하도록 촉진함으로써 반흔을 형성하는 능력(Bartone and Adickes, 1988; Stoneet al., 2000)이 있다. 비록 키토산이 상처 치유에 있어서 이로운 작용을 한다는 것에 대해서는 일반적으로 알려져 있지만, 이러한 작용의 정확한 메커니즘에 대해서는 알려져 있지 않으며 가장 효과적인 적용 수단 즉 파우더, 현탁, 스폰지, 멤브레인 및 고체 젤 등과 같은 것에 대해서도 알려져 있지 않다. 상기 적용 수단이 불명료한 이유중의 하나로는 기존의 많은 연구에서 사용한 키토산이 화학적으로 분명하게 특징되지 않았고(아세틸의 함량 및 분포, 분자량), 순도가 알려져 있지 않았다는 것이다. 또한, 흥미롭게도 키토산의 잠재적인 지혈 능력은 상처 부위 및 이식된 부위에서 출혈이 되는 것을 줄여주기 위해 직접적으로 적용할 수 있다(Maletteet al., 1983; Malette and Quigley, patent 4,532,134, 1985). 일부 연구자들은 키토산의 지혈 능력이 단독으로 적혈구 세포를 응집하는 능력으로부터 유래된다고 주장하지만(Rao and Sharma, 1997), 다른 연구자들은 키토산의 다양이온성 아민이 가지는 특성이 트롬빈을 배출하기 위해 혈소판을 활성화시키고 일반적인 응고 과정을 수행하며, 따라서 피브리노젠 및 자가로부터 분리된 혈소판과 혼합하였을 때 사용이 가능하다고 주장한다(Cochrumet al., patent 5,773,033, 1998). 본 발명에 있어서, 상기 보고 및 발명에서는 혈액이 용액 상태로 키토산과 혼합되고, 복구하려는 부위에서 혈액 응고를 포함한 키토산의 형태화를 통해 조직을 복구하기 위해 치료적으로 적용할 수 있다는 것에 대한 예가 부족하다는 것을 염두해 두어야 한다.
현재 키토산이 가진 기술적 어려움 중의 하나는 생리학적 pH 및 강한 이온성에서는 용해도가 적기 때문에 용액 상태로 사용하는데 있어 한계가 있다. 따라서 일반적으로는 pH가 3.0 내지 5.6 사이의 범위를 가지고 있는 산성 용액에서 아민 그룹을 양성화 함으로써 키토산을 용해시킬 수 있다. 이러한 키토산 용액은 pH가 6.2 근처까지 올라가더라도 용해된 상태로 존재하게 되며, 여기서 중성화된 아민 그룹은 상호간의 전기적 반발력을 감소시키고, 수소결합력을 가지게 하며, pH 6.3 내지 pH 6.4에서 폴리머가 침전되게 하기 위해 소수성(hydrophobic) 및 반데르발스(Van der Waals) 작용력을 갖게 한다. 기존의 발명에서는(Chenite patent WO 99/07416; cheniteet al., 2000) 폴리올-포스페이트 이중염기성 염(polyol-phosphate dibasic salt)(즉, 글리세롤-포스페이트)을 액체 상태의 키토산 용액과 혼합하면 침전되는 것을 방지하면서 용액의 pH를 높일 수 있다고 주장하였다. 이러한 특정한 염의 존재하에서는 높은 농도(0.5-3%) 및 고분자량(＞수백kDa)의 키토산 용액은 생리학적으로 받아들일 수 있는 중성적 범위인 pH 6.8 및 7.2 사이를 오랜 시간 동안 유지하기 위해 저온 또는 실온의 온도에서 액체로 존재한다. 이러한 개념에서, 어떤 방법으로 키토산과 세포를 혼합하여도 이들의 생존도를 유지시킬 수 있다. 추가로 중요한 특징 중의 하나는 이러한 키토산/폴리올-포스페이트(C/PP) 액체 용액을 적당한 온도로 가열하면 고체화 또는 젤화되어서 이 혼합된 키토산/세포 용액을 신체의 부위 예를 들어 누드 마우스의 피하 공간에 형성된 연골 노듈에 주입 가능하도록 한다(Cheniteet al., 2000). 다른 연구에서는 키토산을 생리학적 pH에서 가용성 상태로 유지시켰지만 키토산의 농도를 감소시키거나(Luet al., Biomaterials, 1999에서는 0.1%까지) 키토산 분자량 및 탈아세트화를 감소시켜야 하는(Choet al., Biomaterials, 1999에서 상기 각각을 350 kDa 및 50%까지) 필요성을 가지고 있음을 주지해야 한다. 또 다른 연구에서는 키토산이 연골세포 및 조골세포의 형태를 유지시켜주는 아주 미세한 환경(microenvironment)에 존재한다고 밝히고 있지만(Suhet al., 2000; Lahijiet al., 2000; Seichristet al., 2000), 이러한 연구는 형태에 있어서 세포와 혼합할 수 있고 주입할 수 있는 액체 키토산이라는 데에 기초하지 않았다. 따라서, NN-디카복실메틸 키토산 스폰지를 BMP7에 적셔서 토끼의 조골연골 결함 부위에 놓이게 하였다(Mattioli-Belmonte, 1999). 여기서는 조직화학적(histochemicl) 및 면역조직화학적(immunohistochemical)으로 일부 개선된 결과를 가져왔지만, 결함 부위를 복구조직으로 완벽하게 채우지 못하고, 결함 부위에 있는 조직을 유지하지 못했기 때문에 극복할 수 없는 문제로 대두되었다. 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해,본 발명은 연골 및 다른 조직을 복구하기 위한 조성물을 전달할 수 있는 몇가지 새로운 해결책을 제공한다.
10) 종래 기술의 요약
연골 복구를 도와주기 위한 종래의 기술을 요약하자면, 매우 제한된 자연적인 관절 연골의 복구 반응을 개선하기 위한 많은 기술이 언급되었고, 실험적인 테스트가 수행되었다. 이러한 기술의 일부는 임상적 시도에 있어서 만족할 만한 수준의 결과를 얻을 수 있었지만, 골수 촉진 기술군을 적용시켰을 때 확인할 수 있는 것에 비교하여 조직 복구를 효과적으로 촉진시킬 수 있는 확실한 실험적인 방법이 없었다. 본 발명에서는 관절 연골을 복구하기 위한 세포 및 혈액 성분을 사용하는데 있어서의 주된 문제점을 기술하고 이를 해결한다. 효과적인 연골 복구 과정을 촉진시키는데 있어서 주된 방해로는 연골 성장을 필요로 하는 공간(조직 증량 또는 재생을 필요로 하는 관절 또는 그 외의 부위) 내에서 적당한 거대분자적 환경을 제공할 수 있는 조성물 및 방법이 부재한다는 것이다. 이러한 거대분자적 환경 또는 조직은 1) 액체 상태에서 활성이 있는 생물학적인 물질(세포, 단백질, 유전자, 혈액 및 혈액 성분)과 함께 쉽게 놓일 수 있어야 하고, 2) 연골 성장을 필요로 하는 부위 또는 전체 결함 부위를 채우기 위해 결함 부위로 주입이 가능하여야 하며, 3) 연골세포적 세포의 형태(연골 조직을 생산하는)라기보다는 오히려 섬유성 세포의 형태(섬유성 조직을 생산하는)를 유도하는 세포 부착 및 세포-의존적인 조직의 수축에 일차적 비단백질성 환경이 제한되게 존재하게 하고, 결함이 있는 막으로부터조직을 진입하지 못하게 하고, 4) 생리학적 수준의 pH 및 삼투압을 가지고 세포독성 물질을 포함하지 않아 세포적합적으로 되게 하며, 5) 분해되어야 하지만 물리학적 하중을 지지할 수 있는 연골 조직을 전체적으로 재건하기 위해 생물학적으로 활성이 있는 물질을 분해되지 않게 함으로써 오랜 시간동안 충분하게 존재할 수 있도록 하여야 한다. 또한, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양과 같은 다른 조직을 복구하기 위해서는 최소의 변형을 통해서 상기와 같은 특성을 조합시켜 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 자명하다.
연골 조직의 복구 및 재생에 사용하기 위한 새로운 조성이 제공된다면 매우 바람직할 것이다.
본 발명은 연골 조직 및 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양을 포함하며 여기에 제한되지 않는 다른 조직의 재생을 향상시키고 복구하기 위하여 적용되는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
도 1의A 내지 도 1의F는 폴리머 용액을 세포와 혼합하여 시험관내에서 고체화하고 연골의 성장을 위해 배양한 것을 나타낸 모식도이고;
도 2의A 내지 도 2의C는 캡슐화한 뒤 키토산/글리세롤-포스페이트 젤에서 배양한 연골세포의 생존도를 나타낸 것이고;
도 3의A 내지 도 3의E는 키토산 젤에서 연골이 형성된 것을 시험관내에서의 글리코사미노글리칸(GAG)의 축적을 측정한 것을 나타낸 것이고;
도 4는 0, 14 및 20일 동안 키토산 젤에서 배양한 일차 연골세포에서 발현된 연골-특정 mRNA를 RNase 방어 분석한 것을 나타낸 것이고;
도 5는 0, 14 및 20일 동안 키토산 젤에서 배양한 일차 연골세포에서 발현된 연골-특정 단백질을 웨스턴 블랏 분석한 것을 나타낸 것이고;
도 6은 연골세포가 존재 또는 존재하지 않은 상태로 배양한 젤 디스크의 물리적 반응을 나타낸 것이고;
도 7은 세포와 혼합한 폴리머 및 이를 마우스에 피하 주사한 것을 나타낸 모식도이고;
도 8의A 및 도 8의B는 누드 마우스의 피하에서 성장한 연골을 톨루이딘 블루를 이용하여 조직학적으로 염색한 것을 나타낸 것이고;
도 9는 일차 연골세포를 포함 또는 포함하지 않은 상태로 키토산 젤을 생체 내로 이식한 후 발현된 연골-특이적 mRNA를 RNase 방어 분석한 것을 나타낸 것이고;
도 10은 일차 연골세포가 존재 또는 존재하지 않은 상태로 키토산 젤을 생체 내로 이식한 후 발현된 연골-특이적 단백질을 웨스턴 블랏 분석한 것을 나타낸 것이고;
도 11은 누드 마우스의 피하 조직에서 자라난 연골 이식의 물리적 특성을 나타낸 것이고;
도 12의A 및 도 12의B는 돼지 대퇴골 관절에 인접한 관절 부위의 연골에만 결함이 있는 엑스 비보의 부위에 가열젤 키토산 용액이 부착한 것을 나타낸 것이고;
도 13의A 및 도 13의B는 가열젤 키토산 용액을 토끼의 연골 결함 부위에 놓아 두어 생체내에서 24시간 동안 잔존하는 것을 나타낸 것이고;
도 14는 토끼의 연골 결함부위에 가열젤 키토산 용액을 주입한 후 24시간 후 상기 키토산 용액이 잔존하는 것을 나타낸 것이고;
도 15A는 혈액/폴리머 혼합물의 제조, 혼합 및 생체외에서의 고체화를 보여주는 모식도이고;
도 15B 및 도 15C는 생체외에서 즉, 아가로즈 웰(도 15B) 또는 유리 또는 플라스틱으로 구성된 튜브(도 15C)에서 액체 혈액/폴리머가 고체화되는 것을 보여주는 것이고;
도 16은 세가지 다른 종으로부터 분리한 혈액을 단독과 혈액/키토산 혼합액의 평균 고체화 시간을 비교한 것이고;
도 17A는 혈액 또는 혈액/폴리머 혼합액의 응고 수축을 유리 용기에 놓아둔후 시간이 지남에 따라 배출되는 혈장을 측정하여 나타낸 것이고;
도 17B 및 도 17C는 유리 튜브(도 17B) 또는 자유롭게 팽창하도록 디스크를 아가로즈 웰에 놓아두고 티로드 버퍼(Tyrode's buffer)에서 배양한(도 17C) 뒤 수축한지 28시간째의 고체 혈액 및 혈액/폴리머 혼합물의 물리적 특징을 나타낸 것이고;
도 18은 다른 액체 폴리사카라이드 용액이 아닌 액체 키토산을 혼합한 것이 헤파린에 의해 유도된 항응고에 대해 역전되는 것을 나타낸 것이고;
도 19의A 내지 도 19의C는 혈액/폴리머 혼합물의 조직학적 구조를 나타낸 것이고;
도 20의A 및 도 20의B는 키토산 용액과 혼합하고 난 뒤 백혈구 및 혈소판의 생존도를 나타낸 것이고;
도 21은 생체외에서 형성된 혈액/폴리머 혼합물로부터 혈액 단백질이 지속적으로 분비되는 것을 혈액 단독의 것과 비교한 것이고;
도 22의A 내지 도 22의C는 관절 연골 결함 부위의 치유를 증가시키기 위해 폴리머/혈액 혼합물을 제조, 혼합 및 주입하는 것을 나타낸 것이고;
도 22의D 및 도 22의E는 인간 관절 연골을 치유하기 위한 치료법을 모식적으로 나타낸 것이고;
도 23의A 및 도 23의B는 뼈를 관통하는 구멍을 갖고 있는 연골 결함에 혈액/폴리머 혼합물을 전달한 뒤 1주일 후에 골수로부터 유래된 복구 세포가 이동하고, 세포주화성이 증가되는 것을 나타낸 것이고; 및
도 24의A 및 도 24의B는 혈액/폴리머 혼합물로 치료한 결함 부위에서 히알린 연골이 성장한 것과 처리하지 않은 결함 부위에서 섬유성 조직이 성장한 것을 비교한 것이다.
본 발명의 목적은 연골 조직을 복구 및 재생하기 위한 신규 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 연골 조직 또는 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양과 같은 다른 조직을 복구, 재생, 재건 또는 증량하기 위한 용도의 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명에서는 생리학적 성분과 혼합할 수 있으며, 혼합물을 신체의 부위에 위치하게 하거나 주입함으로써 조직을 복구, 재생, 재건 또는 증량할 수 있는 폴리머 용액의 용도를 제공한다. 복구되는 조직은 예를 들면 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양을 포함하며, 이에 한정된 것은 아니다.
생물학적 성분은 자가 또는 비자가의 것 원천의 혈액, 혈액 성분 또는 분리된 세포에 기초하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 환자의 조직을 복구하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 온도-의존적인 폴리머 젤 조성물을 도입하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 조직에 부착하여 조직 복구를 위한 세포 분열을 촉진한다.
조성물은 최소한 한 개의 혈액 성분을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면 폴리머 조성물을 조직에 도입시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리머 조성물은 적어도 한가지의 혈액 성분과 혼합될 수 있고, 상기 폴리머 조성물은 상기 혈액 성분과 혼합되었을 때 혼합물이 되며, 상기 혼합물은 조만간(in time) 또는 가열시에 비-액체 상태로 변하며, 상기 혼합물은 조직의 복구를 위하여 도입된 부위에 유지되어 부착하는 것을 특징으로 하는 환자 조직을 복구하는 방법이 제공된다.
폴리머는 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 히알우로난(hyaluronan), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate), 케라탄 설페이트(keratan sulfate), 더마탄 설페이트(dermatan sulfate), 헤파린(heparin) 또는 헤파린 설페이트(heparin sulfate)와 같은 천연 또는 변형된 폴리사카라이드(polysaccharide)가 될 수 있다.
폴리머 조성물은 수용성 콜라겐 또는 수용성 젤라틴 또는 폴리아미노산 예를 들어 폴리리신(polylysin)과 같은 천연, 재조합 또는 합성 단백질을 포함할 수 있다.
폴리머 조성물은 폴리락틱산(polylactic acid), 폴리글리콜릭산(polyglycolic acid) 및 카복실릭(carboxylic), 아미노(amino), 설포닉(sulfonic), 포스포닉(phosphonic), 포스페닉(phospenic)과 같은 작용기를 포함하며 하이드록실(hydroxyl), 티올(thiol), 알콕시(alkoxy), 아릴옥시(aryloxy), 아실옥시(acyloxy) 및 아로일옥시(aroyloxy)와 같은 추가적인 작용기를 포함하거나 또는 포함하지 않는 합성 호모 및 차단 코폴리머를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정된 것은 아니다.
폴리머 조성물은 소듐 클로라이드(sodium chloride), 포타슘(potasium), 칼슘(calcium), 마그네슘 포스페이트(magnesium phosphate), 설페이트(sulfate) 및 카복시레이트(carboxylate)와 같은 무기염을 포함하는 버퍼에 초기에(initially) 용해되거나 또는 현탁되는 것이 바람직하다.
폴리머 조성물은 글리세롤-포스페이트(glycerol-phosphate), 프룩토스 포스페이트(fructose phosphate), 글루코스 포스페이트(glucose phosphate), L-세린 포스페이트(L-serine phosphate), 아데노신 포스페이트(adenosine phosphate), 글루코사민(glucosamine), 갈락토사민(galactosamine), HEPES, PIPES 및 MES와 같은 유기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 또는 현탁될 수 있다.
폴리머 조성물은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지고, 250 mOsm/ℓ 내지 600mOsm/ℓ사이의 생리학적 수치로 조정된 삼투압농도를 가지는 것이 바람직하다.
혈액 성분은 예를 들어 혈액, 가공혈, 정맥혈, 동맥혈, 뼈로부터의 혈액, 골수로부터의 혈액, 골수, 탯줄의 혈액 또는 태반의 혈액이 될 수 있으며 반드시 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 혈액 성분은 적혈구, 백혈구, 단핵구, 혈소판, 피브리노젠, 트롬빈 또는 적혈구를 포함하지 않고 혈소판이 풍부한 혈장을 포함할 수도 있다.
또한, 혈액 성분은 시트레이트(citrate), 헤파린 또는 EDTA와 같은 항응고제를 포함할 수 있다. 반대로, 도입된 부위에서 항응고/고체화를 촉진시키기 위해 트롬빈(thrombin), 칼슘, 콜라겐, 엘라직산(ellagic acid), 에피네프린, 아데노신 디포스페이트(adenosine diphosphate), 조직 인자(tissue factor), 포스포리피드(phospholipid) 및 인자 Ⅶ과 같은 항응고 인자를 포함할 수 있다.
혈액 성분은 자가 또는 비자가일 수 있다.
폴리머 조성물은 혈액 성분에 대해 1:100 내지 100:1의 범위로 사용되는 것이 바람직하다.
폴리머 조성물 및 혈액 성분은 음파, 교반기, 볼텍싱기 또는 주사기에서의 수회의 통과를 이용하여 기계적으로 혼합되는 것이 바람직하다.
복구하거나 재생하려는 조직은 예를 들어 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 또는 궤양이 될 수 있으며, 반드시 이에 한정된 것은 아니다. 경우에 따라서는, 신체로 전달하려는 위치는 비정상적인 조직을 제거하기 위해 외과적으로 준비되어야 한다. 복구하려는 조직의 부위로 폴리머 조성물을 전달하기 위한 도관을 만들기 위해 인접 조직 부위 또는 혈관 신생 부위로 관통, 파쇄 또는 뚫기와 같은 과정이 수행될 수 있다.
또한 본 발명에서는 생체 내에서 조직을 복구 또는 재생하기 위한 세포 전달에 사용할 용도의 키토산 용액이 제공되며, 상기 키토산 용액은 0.5 내지 3% w/v의 키토산을 포함하고 가열젤로 형태화하며, 상기 용액은 복구 또는 재생하려는 조직으로 주입하기 전에 세포와 혼합된다. 용액은, 몇가지 예를 들면, 포스페이트, 글리세롤 포스페이트 또는 글루코사민의 첨가로 가열젤화로 유도될 수 있다. 키토산 용액은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것이 바람직하다.
세포는 예를 들어 일차 세포, 계대된 세포, 선별된 세포, 혈소판, 간질 세포, 줄기 세포 및 유전적으로 변형된 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 세포는 히알우론산, 하이드록시에틸셀룰로즈, 콜라겐, 알지네이트 또는 수용성 폴리머를 포함한 전달 용액에 현탁되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 생체외에서의 세포 배양용 젤링 키토산 용액이 제공되며, 상기 키토산 용액은 0.5 내지 3% w/v의 키토산을 포함하고 가열젤으로 형태화되며, 상기 용액은 생체외에서 배양되기 전에 세포와 혼합된다.
폴리머 조성물은 1 kDa 내지 10 MDa의 평균 분자량을 가지는 0.01 내지 10 w/v의 20% 내지 100% 탈아세트화된 키토산 및 혈액 성분을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 조직을 복구하는데 사용하기 위한 폴리머 조성물 및 이의 용도를 제공한다. 또한 상기 조성물은 조직을 복구하기 위해 제조하는 용도로사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 하기의 용어는 아래와 같이 정의하였다.
'폴리머' 또는 '폴리머 용액'이라는 용어는 본 발명에서는 폴리머 용액, 폴리머 현탁, 폴리머 입자 또는 파우더 및 폴리머 미셀 현탁과 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 여기에 한정되지 않는다.
'복구'라는 용어는 관절 및 다른 조직이 복구, 재생, 재건, 대체 또는 증량하는 것을 의미하며, 여기에 한정되지 않는다.
혈액 또는 혈액 성분과 혼합할 때, 폴리머는 액체 용액 또는 액체 현탁액 상태로 있거나 또는 개개의 미립자 상태로 있을 수 있으며, 폴리머 제조의 필수적인 특징으로는 1) 혈액 또는 선택된 혈액 성분과 혼합할 수 있으며, 2) 제조된 혼합물은 조직을 복구, 재생, 재건 또는 증량을 필요로 하는 신체의 부위에 놓이게 하거나 주입할 수 있으며, 3) 혼합물은 놓여지게 될 위치의 조직을 복구, 재생, 재건 또는 증량하는데 효과적인 역할을 한다.
바람직한 실시예는 실시예 5에 나타나 있으며, 여기서는 천연 폴리사카라이드, 키토산 용액은 pH 6.8에서 0.135 ㏖/ℓ의 디소듐 글리세롤 포스페이트 버퍼에 넣어서 1.5% w/v의 농도로 사용하였다. 상기 용액은 3 부피의 혈액에 대해 1부피의 폴리머 용액의 비로 토끼의 말초 혈액과 함께 혼합하였다. 이후 상기 폴리머/혈액 혼합물은 토끼 관절 연골에 외과적으로 결함을 만든 부위에 주입하였으며, 5분 이내에 고체화 되었다(도 22). 치료하는 과정 동안의 조직학적 관찰을 통해,치료한지 6 내지 8주 후에 조직 복구가 촉진된 히알린 연골을 확인할 수 있었다(도 24). 폴리머/혈액 혼합물을 투여하지 않은 대조군 결함에서는 불완전하게 치료되거나 기능을 하지 않는 섬유성 조직 또는 섬유성연골 조직으로 인해 치료되었다(도 24). 상기 실시예는 폴리머/혈액 혼합물을 사용하는 것은 단순히 상처가 난 부위에서 출혈을 유도하여 치료되는 것에 비해 조직을 훨씬 더 효과적으로 치료하고 복구된 조직의 기능을 높여준다는 것을 보여준다. 본 발명의 일부분을 변형하여 시도할 수 있는 것은 당업자에 있어서 자명하다. 다른 폴리머 및 다른 형태의 폴리머 또는 폴리머 혼합물은 키토산 용액과 대체될 수 있으며, 상기에서 언급한 바 있는 세가지 특징적 부위에서 유지된다. 이러한 시도는 연골 이외의 조직 즉, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양을 복구하는데에도 통상적으로 사용될 수 있다. 또한, 조직을 증량하고 재생하는 것에도 적용될 수 있음이 자명하다.
본 발명자들은 본 발명의 작용 기작을 설명하기에 가능한 증거 및 예를 하기와 같이 제시한다. 1) 고체화하기 전에 혈액을 폴리머와 혼합함으로써 혈소판에 의해 유도된 혈액 응고를 억제하고(도 17), 2) 전체 부피의 골격을 유지함으로써 조직을 복구하고 결함을 훨씬 더 증량하며(도 18), 3) 고체화된 폴리머/혈액 혼합물은 조직 주위에 부착하고(도 22의A), 4) 혈액 단독으로 응고된 것에 비해 폴리머/혈액 혼합이 응고된 것으로 부터 세포주화성 및 분화촉진성 단백질 인자가 서서히 분비되며(도 21), 5) 폴리머/혈액 혼합물에서 백혈구 및 혈소판의 생존도가 유지되고(도 20), 6) 복구할 부위에 폴리사카라이드를 공급하는 것은 단백질성 조직이 단독으로 있는 것에 비해 연골 형성을 훨씬 더 많이 유도한다(도 2 내지 도 6, 도 8 내지 도 10, 도 24). 이러한 현상은 본 발명의 실시예에서 일어나는 것이 설명된다. 그러나, 이러한 설명들은 폴리머의 세포내 분해 역학, 키토산에 의한 내인성 인자의 결합/농도를 포함하는 다른 중요한 사건들이 일어나는 가능성을 부정하지는 않는다.
본 발명의 두 번째 바람직한 실시예가 실시예 1 및 실시예 2에 나타나 있으며, 여기에서 가열젤화 키토산 용액이 일차 연골세포를 마우스의 피하조직 부위 또는 시험관내인 배양 용기로 전달하기 위해 사용되었다. 이러한 경우, 혈액 성분이 없는 경우에는 키토산 용액 자체의 고체화되는 능력을 필요로 하며, 이러한 특성은 글리세롤 포스페이트 및 다른 유사한 버퍼를 사용하여 키토산 용액을 특정하게 제조함으로써 부여된다. 본 발명의 실시예에서는 폴리머 용액이 세포와 함께 혼합되고, 젤화가 되는 곳에서 생체내 또는 생체외로 폴리머/세포 용액이 주입되어서 세포의 생존력 및 기능이 유지된다(도 1 내지 도 11). 세포는 키토산 용액과 혼합하기 전에 생리학적 버퍼 또는 다른 세포 전달 현탁액 즉 등장 버퍼에 들어있는 셀룰로즈에 현탁될 수 있다. 본 발명자들은 일차 연골세포를 상기 폴리머 용액과 함께 주입하였을 때 시험관내에서(도 2 내지 도 6) 또는 생체내에서(도 8 내지 도 11) 연골 조직이 형성됨을 제시하는 데이터를 보여준다. 본 발명에 기재된 기술을 부분적으로 변형시키는 것은 당업자에게 있어서 자명하며, 예를 들면 다른 세포, 키토산 용액의 다른 농도 및 버퍼는 동일한 결과를 도출하기 위해 변형될 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 자세히 설명하며, 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시험관내에서의 연골 성장을 위한 일차 연골세포와 가열젤 키토산 용액의 혼합
키토산(0.22g, 85% deacetylated) HCl 염분말은 라미나플로우 후드(laminar flow hood)에 넣어 UV를 쪼여줌으로서 멸균한 후 pH가 약 5.0인 물 7.5 ㎖에 용해시켰다. D(+)-글루코사민(0.215g, 분자량:215.6)은 0.1M NaOH 10 ㎖에 녹인후 22 ㎛ 포어 사이즈의 디스크 필터로 필터하여 멸균하였다. 글리세롤 포스페이트(0.8g, 글리세롤 포스페이트 몰당 4.5 몰의 물이 포함되어 있어서 분자량이 297)는 물 2.0 ㎖에 녹인 후 22 ㎛ 포어 사이즈의 디스크 필터로 필터하여 멸균하였다. 4℃의 멸균된 상태에서 약하게 흔들어 주면서 글루코사민 용액 2.25 ㎖을 키토산 용액으로 한방울씩 떨어뜨렸다. 그리고 난 뒤 상기와 동일한 조건으로 글리세롤 포스페이트 용액 1 ㎖을 떨어뜨렸다. 상기 조제한 용액의 마지막 상태는 용액이었으며, 상기 용액은 약 4℃ 근처로 유지되는 낮은 온도로 유지하면서 약 하루동안 놓아두어 상기 상태가 유지되도록 하였다. 상기 용액의 생리학적 pH는 6.8이고, 생리학적 삼투압농도는 376 mOsm/kg-H2O였다. 상기와 같은 두가지 조건을 유지하는 것은 세포의 생존력을 유지시키기 위해 필요한 중요한 제한 인자이다. 이러한 제한은 세포마다 다양하지만 일반적으로 pH는 6.6 이상 7.8 이하이고, 삼투압농도는 250 이상 450 mOsm/kg-H2O 이하이다. 하이드록시에틸 셀룰로즈(hydroxyethyl cellulose, Fluka) 150 ㎎을 DMEM(Dulbecco's modified Eagles Medium) 6 ㎖에 녹인 용액을 만든 후 22 ㎛ 포어 사이즈의 디스크 필터로 필터하여 멸균하였다. 세포 펠렛은 하이드록시에틸 셀룰로즈-DMEM 용액 2 ㎖에 녹인후 키토산-글리세롤 포스페이트 용액에 첨가하여 혼합하였다. 대조군으로 세포를 포함하지 않은 하이드록시에틸 셀룰로wm-DMEM 용액 2 ㎖을 키토산 용액과 혼합하였다. 상기 용액을 37℃로 가열하게 되면 기존의 발명(Cheniteet al. Patent WO 99/07416)에서 밝힌바 있는 가열젤 용액과 비슷한 상태인 고체 하이드로젤(solid hydrogel)로 바뀌게 된다. 아주 중요한 점으로는 기존의 발명에서는 상기 키토산 용액에서 서모젤성 과정을 거치게 되었을때 세포의 생존력이 유지된다는 것을 밝히지 못하였으며 이러한 키토산 용액은 세포의 전달 및 조직 복구용으로 사용하지 못한다는 것이다.
4℃에서 액체 상태인 상기 용액은 효소적으로 분리한 일차 연골세포(Buschmanet al., 1992)와 혼합한 후 플라스틱 세포 배양 접시에 부었다(도 1의A 내지 도 1의F). 도 1의A는 세포 펠렛을 혼합한 것이고, 도 1의B는 상기혼합된 세포를 4℃에서 액체 키토산 젤 용액과 혼합한 것이다. 도 1의C 및 도 1의D는 액체 용액을 세포 배양 접시에 부어 37℃에서 30분동안 고체화 한 후, 상기 세포를 포함하고 있는 고체 젤을 DMEM으로 세척한 뒤 부검 펀치(biopsy punch)를 사용하여 구멍을 내어 디스크(disk)를 만든 것이다. 도 1의E는 1,000 ㎛ 포어의 메쉬 그리드(grid)가 48웰 플레이트에 놓여진 것이다. 도 1의F는 세포를 포함하고 있는 키토산 젤 디스크가 각각의 웰에 놓여 배양된 것이다.
세포를 포함하고 있는 젤은 37℃에서 20분간 배양하였다. 부검 펀치를 사용하여 젤을 6 ㎜ 직경, 1 ㎜ 두께로 펀치하여 디스크를 만든 후 이를 3주가 될때까지 배양하였다. 상기 디스크는 각각을 48웰 조직 배양 플레이트에서 배양하였는데, 이때 1000 μM 메쉬의 멸균된 나일론을 배지 바로 밑에 두어 모든 표면에 배지가 닿게 하도록 하였다. 캡슐화한 직후 및 세포를 배양하는 동안 캡슐화된 세포의 90% 이상이 눈으로 관찰 가능하였다(도 2의A 내지 도 2의C). 상기 샘플은 칼세인 AM(calcein AM) 및 에티듐 호모다이머-1(ethidium homodimer-1)과 함께 배양하여 살아있는 세포(녹색) 및 죽은 세포(붉은색)를 눈으로 볼 수 있도록 하였다. 신선하게 분리된 연골세포(도 2의A)는 젤에서 캡슐화되었고, 고체화된 후 즉시 배양한 젤 상에서 생존력을 테스트하거나(도 2의B) 20일이 지난후에 생존력을 테스트하였다(도 2의C). 도 2의C는 세포가 젤의 중앙 부분으로부터 전형적인 연골세포의 형태를 나타냄을 보여준다.
Rat-1, COS, 293T 및 탈분화된 송아지의 관절 연골세포를 포함한 몇몇 다른 세포에서도 세포 배양 및 캡슐화한 후에 상기와 비슷한 세포 생존도를 나타내었으며 젤라틴화 과정이 세포의 생존력을 유지시켜주며 주입을 통한 생체내에서의 세포 전달에도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 세포를 배양한 후 22일 후의 세포를 포함한 젤을 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색한 결과, 캡슐화된 일차 연골세포 주위에 변색염색성 환이 나타나 인접 세포와 융합하는 초기단계에는 프로테오글리칸 또는 GAG가 축적됨을 알 수 있었다(도 3의D). 또한, 상기 지역은 항체로 염색한 결과 어그리칸(aggrecan), 콜라겐 타입 Ⅱ(type Ⅱ collagen) 및 링크 단백질(link protein)에 염색되었다. 또한, 키토산 젤 메트릭스가 톨루이딘 블루와 결합함을 확인하였다(도 3의C). 이러한 특징은 알데하이드 고정을 통하여 젤이 격자 무늬 구조를 가짐을 관찰하는 것을 가능하게 한다. 흥미롭게도, 연골세포 주위에서 관찰되는 GAG 환(ring)은 키토산 메트릭스를 극소량 포함하고 있었으며, 키토산 메트릭스는 연골세포가 생산하는 인자들에 의해 분해되었다(도 3의D). 송아지의 일차 연골세포는 2 ×107세포수/㎖의 농도로 키토산 젤 1 ㎖에 포함되었을 때 캡슐화되었으며 6 ㎜ 디스크에서 20일이 될 때까지 배양하였다. 송아지의 일차 연골세포는 캡슐화되었으며 2% 아가로즈에서 배양하여 평행하게 분석하였다. 0일 및 20일 배양한 아가로즈 젤 배양(도 3의A 및 도 3의B) 및 키토산 젤 배양(도 3의C 및 도 3의D)을 파라핀 절단 및 톨루이딘 블루염색하였다. 0일째에 핵은 어두운 청색으로 염색(도 3의A 및 도 3의C)된 반면에 세포주위의 축적된 GAG는 변색염색성 청-보라색으로 염색되었다(도 3의B 및 도 3의D, 굵은 화살표). 이러한 세포주위의 부위는 어그리칸, 콜라겐 Ⅱ 및 연골 연결 단백질에 대해 면역학적으로 양성이었다.40배 확대한 도 3의E에서 보는 바와 같이, 배양한지 0일, 14일 및 20일째에 GAG의 존재를 DMMB 분석으로 생화학적 정량 분석한 결과, 아가로즈 젤과 비교하여 키토산 젤과 동일한 부위에서 GAG가 축적됨을 확인하였다.
콜라겐 타입 Ⅱ 및 어그리칸의 RNA 분석 결과, 캡슐화된 연골세포에 의해 발현되는 mRNA는 14일 및 22일 배양에서 발현이 매우 높았고(도 4, 레인 4 및 레인 5), 이를 연골에 있는 관절의 연골세포에서 관찰되는 발현의 수준과 상응하였다(도 4, 레인 6). 소의 콜라겐 타입 Ⅱ, 어그리칸 및 GAPDH에 상보적인 안티센스32P-표지된 RNA 탐침자를 소 신장의 tRNA(레인 1) 또는 전체 RNA(레인 2), 0일(레인 3), 14일(레인 4) 또는 20일(레인 5)동안 키토산 젤에서 배양한 107/㎖의 일차 연골세포 또는 성체 소의 관절 연골(레인 6)과 혼성 반응시켰다. 샘플들은 RNase A 및 T1으로 처리한 후 전기영동을 하여 방사선사진법을 수행하였다. 방어된 밴드(protected band)는 각각의 전사체가 존재함을 보여준다. 어그리칸 및 콜라겐 타입 Ⅱ가 지속적으로 발현되는 것을 통해 키토산/글리세롤 포스페이트 젤에 있는 연골세포의 표현형이 유지됨을 확인하였다.
캡슐화된 세포에 의해 생산되는 단백질을 웨스턴 블랏 분석한 것에서는 배양후 2주 및 3주 사이에 연골 조직 연결 단백질이 축적됨을 보여주었다(도 5). 전체 단백질을 추출하여 SDS-PAGE를 수행한 후 비멘틴(vimentin), PCNA, 콜라겐 타입 Ⅱ의 C-프로펩타이드(propeptide) 또는 연골 링크 단백질을 인식하는 항혈청을 이용하여 면역블랏을 수행하였다. 세포를 포함하지 않는 키토산 젤 샘플(레인 1), 송아지 신장 샘플(레인 2), 한쌍의 샘플로 키토산 젤에서 일차 연골세포(107/㎖)를 배양한지 0일째(레인 3 및 레인 4), 14일째(레인 5 및 레인 6) 또는 20일째(레인 7 및 레인 8), 2주된 송아지 관절 연골 샘플(레인 9) 또는 성체 소 연골 샘플(레인 10)을 분석하였다. 그 결과, 연골 특이적 단백질인 CP2 및 링크(link)가 14일 및 20일째 축적될 뿐만 아니라 배양 20일동안은 세포의 증식 마커인 PCNA의 발현이 지속되었다.
소의 일차 관절 연골세포를 포함하는 디스크는 단축 자유 압축 스트레스 완화 테스트(uniaxial unconfined compression stress relaxation test)를 수행하여 배양후 4일 및 13일째에 기계적으로 측정하였다. 세포를 포함하지 않는 대조군 젤에 비교하였을 때 심지어 4일째에도 세포 의존적으로 굳어지는 것(stiffening)이 관찰되었고, 13일째에는 훨씬 더 극적으로(dramatic) 되었다(도 6). 배양후 4일째, 13일째 및 19일째의 디스크(~5㎜ 직경)를 이용하여 10초동안 약 1.5 ㎜ 두께의 디스크의 10%에 5 램프(ramp)를 가해 자유 압축을 수행하고 이에 부가적으로 스트레스 완화(10-20%로부터 두 번째 램프가 그래프에 보임)를 수행하여 유지시켰다. 세포를 포함하지 않는 젤 디스크는 약한 반응을 보인 반면 세포를 포함하는 젤은 배양한 시간이 지남에 따라 더욱 단단해지고, 훨씬 점도가 생겨서 관절 연골과 비슷해졌다.
상기 결과를 복합 포로에라스틱 모델(composite poroelastic model)(Soulhatet al., 1999)을 이용해 분석한 결과, 2배 정도로 비-섬유성 조직 모듈(2.5?5 kPa)이 발견되었고, 섬유성 조직 모듈(fibrillar matrix module)(100?500 kPa)은 5? 정도 증가하였으며, 또한 시험관내인 13일동안의 배양 동안 상기 젤에 있는 일차 연골세포의 존재로 인해 수압 투과성(5?0.08? 10-12 N-s/m4)이 100? 감소함을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 키토산 젤은 세포적합적(cytocompatible)이고 세포감성적(cytodegradable)이며, 연골세포의 표현형을 유지하기 위한 전도성(conductivr)이 있으며, 시험관내에서 확연하게 굳기가 증가하기 때문에 신생 연골 조직을 만들 수 있게 함을 알 수 있었다.
<실시예 2> 가열젤 키토산 용액과 일차 연골세포의 혼합 및 생체 내에서의 연골 성장을 위한 피하주사
특정 부위(in situ)에서의 젤화 시스템이 동물에도 적용되는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 기재된 송아지 관절 연골세포를 키토산 젤 1 ㎖당 1 ×107개 포함하고 있는 키토산 젤 100 - 300 ㎕를 흉선제거된 마우스(athymic mice)(CD1 nu/nu) 등(dorsal)의 피하에 주사하였다(도 7). 송아지 일차 연골세포의 펠렛을 4℃에서 액체 키토산 젤과 혼합하여 세포 농도가 1-2 ×107세포수/㎖이 되도록 한 후, 액체 상태로 100 ㎕를 마취시킨 누드 마우스 등의 피하에 이식(implant)하였다. 주입한 후 5 내지 10분에 특정 부위에서의 젤화가 촉진되었다.
대조군 마우스는 상기와 동일한 방법으로 키토산 젤만 주입하였다. 주입후 10분 이내에 젤이 형성되었다. 이식은 주입후 21일, 48일 및 63일째에회복(recovered)되었다. 톨루이딘 블루 염색에서는 세포를 포함한 이식에 의해 GAG가 과량으로 존재하는 세포외 조직의 생산이 증가함을 보여 주었다(도 8의A). 그러나 키토산 용액 단독으로 이식했을때는 GAG가 축적되지 않았다(도 8의B). 송아지 일차 연골세포 2 ×107세포수/㎖을 포함한 액체 상태의 키토산 젤을 마취된 누드 마우스 등의 피하에 이식하였다. 대조군 마우스에는 액체 키토산 젤 100 ㎕를 단독으로 등의 피하에 이식하였다. 주입하여 48일이 지난 후 이식된 부위를 채취한 뒤(harvest) 파라핀 고정 및 톨루이딘 블루 염색을 하였다. 연골세포로 이식한 샘플에서 다중염색성 보라색 염색이 되어 GAG가 축적됨을 확인하였다(도 8의A). 그러나, 키토산 젤만으로 이식한 샘플에서는 GAG가 축적됨을 확인하지 못하였다(도 8의B).
일차 연골세포를 생체내로 주입한 뒤 48일째에 연골-특이적 mRNA, 즉 콜라겐 타입 Ⅱ 및 어그리칸 mRNA가 발현함을 확인하였다(도 9).
그러나, 키토산 젤 단독으로 이식한 샘플에서는 콜라겐 타입 Ⅱ 및 어그리칸 mRNA의 발현이 확인되지 않았다(도 9). 소의 콜라겐 타입 Ⅱ, 어그리칸 및 GAPDH에 상보적인32P-표지된 RNA 탐침자를 tRNA(레인 1), 소 신장의 전체 RNA(레인 2), 키토산 젤 단독으로 누드마우스의 생체내로 이식한 뒤 48일째(레인 3), 2 ×107세포수/㎖의 일차 연골세포를 포함한 액체 키토산 젤을 생체내로 이식한 뒤 48일째(레인 4) 또는 성체 소 관절의 연골(레인 5)과 혼성 반응시켰다. 상기 샘플은 RNase A 및 T1으로 처리한 후 전기영동을 하여 방사선사진법을 수행하여, 각각의전사체가 존재함을 보여주는 방어된 밴드를 표지하였다. 어그리칸 및 콜라겐 타입 Ⅱ가 발현하는 것을 통해 생체내에서 키토산/글리세롤 포스페이트 젤에 있는 연골세포의 표현형이 유지됨을 확인하였다.
생체내에서의 일차 연골세포를 이용한 이식에서 주입후 48일 및 63일째에 연골-특이적 단백질이 발견되었다(도 10). 그러나, 키토산 젤만 단독으로 이식했을때는 연골-특이적 단백질이 발견되지 않았다(도 10). 전체 단백질을 추출하여 SDS-PAGE를 수행한 후 비멘틴(vimentin), PCNA, 콜라겐 타입 Ⅱ의 C-프로펩타이드 또는 연골 링크 단백질을 인식하는 항혈청을 이용하여 면역블랏을 수행하였다. 키토산 젤에 세포를 포함하지 않는 샘플(레인 1), 송아지 신장 샘플(레인 2), 키토산 젤 단독으로 누드 마우스의 생체내로 이식한 후 63일째의 마우스 각각의 샘플(레인 3 및 레인 4), 2 ×107/㎖의 송아지 연골세포를 포함한 키토산 젤을 생체내로 이식한 후 48일째의 샘플(레인 5) 또는 63일째의 샘플(레인 6), 2주된 송아지 연골 샘플(레인 7) 또는 성체 소 연골 샘플(도 8)을 분석하였다. 그 결과, 연골 특이적 세포외 조직 단백질인 CP2 및 링크가 축적되었으며, 이는 연골세포를 포함하는 키토산 젤로 이식한 것에서만 확인할 수 있었다. 아크로님 PCNA(acronym PCNA)는 '증식하는 세포의 핵 항원'을 의미한다. CP는 콜라겐 타입 Ⅱ 프로펩타이드를 의미하고, 링크는 연골 연결 단백질을 의미한다.
세포를 포함하지 않는 젤을 생체내에 이식한 것에서는 풀과 같은 점도가 나타났으나, 세포를 포함하는 젤을 이식한 후 3 내지 5 ㎜ 직경으로 구멍을 낸 디스크로 테스트한 것에서는 매우 단단하게 되는 것이 관찰되었고, 세포를 포함하지 않은 젤을 생체외로 이식한 것에서는 디스크가 단단하게 되는 것을 관찰할 수 없었다(도 11). 상기의 결과는 키토산 가열젤 용액을 운반자로써 포함하여 주입하면 특정 부위로 연골세포를 전달할 수 있음을 보여준다. 주입된 연골세포는 관찰 가능할 정도의 양이 유지되며, 프로테오글리칸이 풍부한 세포외 조직을 합성하고 모아줌으로써(assemble) 충분한 기간동안 기능을 하는 연골 조직을 형성할 수 있도록 단단하게 해준다. 도 11은 2 ×107/㎖의 송아지 일차 연골세포를 포함한 액체 상태의 키토산 젤 100 ㎕를 마취된 누드 마우스의 등에 피하주사한 것이다. 대조군 마우스는 액체 키토산 젤 100 ㎕를 단독으로 마우스의 등에 피하주사하였다. 주입한 지 48일 후에 이식된 부위를 채취하였다. 키토산 젤만을 단독으로 이식한 것은 물리학적 테스트를 수행하기 곤란한 상태인 풀과 같은 점성을 나타내었다. 일차 연골세포로 이식한 것은 연골의 형태를 나타내었으며, 상기 이식한 것의 중심으로부터 3 ㎜로 구멍을 뚫은 뒤에 0.05 g/분의 완화를 주면서 2.5% 두께의 압축을 사용하여 자유 압축 테스트를 수행하였다. 그 결과, 42일 동안 생체외에 남겨둔 대조군의 디스크에 비해 세포를 포함하여 이식한 48일째의 평형 상수는 20% 및 50%의 압축 감소를 보였다. 생체내에서 자란 연골세포가 로딩된 젤은 기능을 하는 연골 조직의 합성 및 모임으로 인해 48일 동안 단단하게 바뀌었다(도 8의A).
<실시예 3> 가열젤 키토산 용액의 연골 및 뼈 표면으로의 흡착
연골 복구를 위해 사용하는 본 발명의 키토산 가열젤 형태(formulation)가가진 뛰어난 장점 중의 하나로는 조직 복구(repair), 재생(regeneration), 재건(reconstruction) 또는 증량(bulking)을 필요로하는 몸 안에 있는 불규칙한 형태를 가진 강(cavity) 및 불규칙한 연골 결함에 부착하고 이에 일치되는 능력을 가지고 있다는 것이다. 최근의 많은 조직 복구를 위한 시도는 상기와 같은 관점에 있어서 많은 어려움이 있었다. 세포를 포함하지 않은 키토산 글리세롤 포스페이트 액체 젤을 엑스 비보(ex vivo)로 돼지 대퇴골 좌상돌기의 내부연골(뼈와 관계없음) 결함 부위로에 전달하였다. 생검 펀치를 사용하여 관절 연골에 디스크 모양의 결함을 만들었고(도 12의A), 실시예 1에서 기재한 키토산 용액을 상기의 결함이 있는 부위로 주입한 후 37℃ 배양기에서 고체화되게 놓아 두었다. 연골 결함이 있는 부위에 젤이 남아있는지를 관찰한 뒤 관절화되는 연골의 표면은 대항하였고(oppose), 관절의 움직임은 모사되었다(simulate)(도 12의B). 상기 젤은 결함 부위에 잔존할 뿐만 아니라 뼈 주위 및 연골 표면에 부착하였으며 수축되지 않았다. 도 12의A 및 도 12의B에서는, 액체 키토산 젤을 6 ㎜ 직경의 완전히 두꺼운 연골 결함 부위에 놓아 두었으며(도 12의A), 이를 습도가 유지되는 37℃ 배양기에서 30분간 고체화되도록 놓아두었다. 그리고 난 후 관절을 닫았으며(closed), 수분 동안 관절의 움직임을 모사하였다. 상기 관절 움직임을 모사한 후 결함이 있는 모든 부위에 키토산 젤이 남아있고 부착되었다(도 12의B).
또한, 내부연골 결함부위의 생체내에서의 충진(filling)을 토끼의 슬개골 홈에 수행하였다. 미세 수술칼을 사용하여 연골 아래쪽에서 딱딱하게 석회화된 연골레이어 쪽으로 깍아냄으로써 직사각형(4 ㎜ ×5 ㎜) 모양의 결함을 만들었다. 또한, 16 게이지 니들(needle)을 사용하여 미세 파쇄 구멍을 만들었다. 상기 실시예 1에서 기재한 가열젤 키토산 용액을 상기 결함 부위에 주입한 뒤 특정 부위에서 5분동안 고체화되게 한 후에(도 13의A) 토끼의 무릎 관절을 봉합하였다. 이후 토끼를 자유롭게 돌아다니게 한 뒤에 다음날 안락사시켜 조직학적 분석을 하기 위한 무릎 관절을 준비하였다(도 13의B). 살아있는 뉴질랜드 화이트 토끼를 마취시킨 후 대퇴골 슬개골의 홈에 있는 연골률(trochlea)에 3 ×4 ㎜ 크기로 연골에만 결함을 만들었다. 16 게이지 니들(needle)을 사용하여 수개의 미세 파쇄 구멍을 만들었다. 이후 액체 가열젤 키토산을 결함이 있는 부위에 넣은 후 젤이 특정 부위에서 굳도록 5분동안 놓아두었다(도 13의A). 관절을 닫은 후 24시간 동안 토끼를 자유롭게 움직이도록 한 후 희생시켜 관절을 절개하였다(도 13의B).
조직학적 분석에서는 토끼의 아주 얇은 관절 층(0.8 ㎜ 두께)에 가열젤 키토산 젤이 두께가 아주 얇은 상태로 잘 보존됨을 나타내 주었다(도 14). 상기 젤은 뼈 주위 및 연골 조직에 아주 잘 부착되어 있어 보존력이 뛰어남을 알 수 있었으며, 따라서 연골 및 다른 조직을 복구하기 위한 주입가능한 가열젤 폴리머 전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 도 13의B에 있는 관절 및 결함(가열젤 키토산으로 충진한 후 생체내에서 24시간 동안 놓아둔 것)을 고정시키고, LR 화이트 플라스틱 레진으로 봉매시킨 후 절단하여 톨루이딘 블루로 염색하였다. 결함을 교차 절단한 것에서는 키토산 젤이 특정 부위에서 보존될 뿐만 아니라 결함이 있는 뼈의 표면 및 연골에 부착함을 확인하였다.
<실시예 4> 혈액/폴리머 혼합물의 제조, 혼합 및 시험관내서의 고체화
혈액을 액체 폴리머 용액과 혼합하기 위해 몇가지 다른 혼합 방법이 사용되었다(도 15A). 혈액 및 폴리머를 용기에서 혼합하여 혈액과 폴리머가 균등하게 섞여 있도록 만들었다.
일반적으로, 3 부피의 혈액을 1 부피의 등장성/등삼투압성 용액에 있는 1.5% 폴리사카라이드(polysaccharide)에 혼합하였다. 키토산 젤의 경우, 70 mM HCl 및 135 mM ?-글리세롤 포스페이트에 키토산을 1.5% 녹였다. 혈액/폴리머의 첫번째 혼합 방법에서는 먼저 첫번째 1cc 주사기에 전혈 750 ㎕를 넣고, 두 번째 1cc 주사기에 액체 폴리머 250 ㎕를 넣었다. 상기 주사기를 내부 결합시킨 뒤 양쪽을 앞뒤로 40회 펌프해주면서 완전히 균일하게 섞일때까지 혼합하였다. 두 번째 혼합 방법에서는 먼저 액체 폴리머 용액 625 ㎕을 수개의 3 ㎜ 내지 6 ㎜ 스틸볼(steel ball)이 포함된 2.0 ㎖ 동결용기(Corning)에 넣었다. 다음으로 상기 용기에 전혈 1.875 ㎖을 넣어 용기의 뚜껑을 닫은 후 10초 동안 강하게 흔들어 주어 혼합하였다. 세 번째 혼합 방법에서는 액체 폴리머 용액 2 ㎖을 멸균된 12 ㎖짜리 유리 보로실리케이트 용기(InterGlass 5cc serological vial)에 넣었다. 상기 용기를 고무 마개(rubber stopper) 및 메탈 크림퍼(metal crimper)로 닫은 후, 20 게이지 니들의 10 ㎖ 주사기를 사용하여 상기 용기내로 25 ㎖의 공기 압력을 걸어주었다. 적당한 혈액 채취 방법을 사용하여 토끼의 동맥, 사람 또는 말의 동맥으로부터 혈액을 빼내어 멸균된 10 ㎖ 주사기로 넣었다. 상기 주사기에 20 게이지의 주사바늘을꽂은 후 용기의 고무 마개로 꽂아서 말초 혈액 6 ㎖을 용기내로 주입하였다. 상기 용액을 최고 속도로 10초 동안 혼합하였다. 상기에 기재된 방법으로 혼합하고 난 뒤의 혼합액은 실온에서는 4 ㎖ 보로실리케이트 유리 용기에 넣고, 37℃에서는 플라스틱 용기에 넣었으며 또는 아가로즈 웰(도 15B 및 도 15C) 또는 엑스 비보로는 관절 연골 결함에 넣었다. 대조군으로는 말초 전혈을 이용하여 상기와 동일하게 처치를 하였다. 다른 대조군으로, EDTA 처리된 바큐테이너 용기(vacutainer vial)에 들어있는 혈액을 사용하여 CBC 및 혈소판의 수를 측정하였다. 모든 혈액 샘플을 이용하여 각 종의 정상 CBC 및 혈소판 수를 테스트하였다. 종과는 무관하게 제조된 혈액/폴리머는 혼합 후 2.5 내지 18분 안에 유리 용기의 벽에 강하게 부착되고 고체화되었다(도 16). 일반적으로 혼합된 전체 말초 혈액은 혈액/키토산 젤과 비교하여 훨씬 느리게 고체화되었다(도 16). 액체 키토산 젤을 포함하거나 포함하지 않은 각각의 혈액 샘플을 혼합한 뒤, 혼합하고 나서 최초 또는 두번째 혼합 용기에서 부착성 고체 덩어리가 생길때까지의 시간을 측정함으로써 고체화되는 시간을 측정하였다.
혈액/히알우론산(hyaluronic acid), 혈액/하이드록시에틸 셀룰로즈(hydroxyethyl cellulose) 및 혈액/알지네이트(alginate)를 포함한 추가적인 혈액/폴리머 용액을 테스트한 결과, 상기 혼합액은 혈액 단독에 비해 단기간에 고체화 됨을 확인하였다(도 17A). 상기 결과를 통해, 키토산 액체 젤을 전체 말초 혈액에 혼합하면 응고 형성을 촉진시키며, 혈액/키토산 젤의 고체화 시간은 임상적으로 사용하기에 적합함을 알 수 있었다. 혼합된 신선한 토끼의 말초 혈액 또는토끼 혈액을 PBS 또는 키토산을 포함한 1.5% 폴리사카라이드 용액이 들어있는 글리세롤 포스페이트 버퍼와 혼합하여 수축력을 측정하였다. 또한, 혼합하지 않은 신선한 혈액도 함께 분석하였다. 글리세롤 포스페이트 버퍼 혼합액에 들어있는 헤파린 처리된 혈액/키토산도 분석하였다. 각 샘플로부터 500 ㎕를 37℃에서 4 ㎖ 유리 튜브에 넣었다. 여러 시점의 시간에 각 튜브로부터 배출된 혈장을 수거하여 질량을 측정한 후 응고 수축된 양을 측정하였다. 혈액/키토산 글리세롤 포스페이트 혼합을 제외한 모든 샘플은 최초 부피의 30-50%까지 수축되었다. 혈액/키토산 혼합액은 최초 부피의 약 90%까지 유지하여 수축을 최소화하였다.
응고된 전혈에 대해 고체화된 혈액/폴리머 혼합액의 수축정도를 비교하는 테스트를 하기 위해 몇가지 대조군을 사용하여 혈액/폴리머 샘플 어레이 상에서 응고 수축 테스트를 수행하였다(도 17A, 도 17B 및 도 17C). 대조군 그룹은 흔들지 않은 전체 말초 혈액 또는 흔든 전체 말초 혈액 또는 3 :1 부피비로 생리식염수와 함께 흔든 전체 말초 혈액으로 구성되어 있다. 상기 샘플들은 3 부피의 전체 말초 혈액을 1 부피의 1.5% 폴리사카라이드 용액(알지네이트, 하이드록시에틸 셀룰로즈 또는 히알우론산)이 녹아 있는 PBS와 함께 흔들어서 제조한 실험군 샘플과 비교하였다. 다른 샘플은 3 부피의 전체 말초 혈액을 1 부피의 키토산-글리세롤 포스페이트 용액과 혼합한 것으로 구성되어 있다. 고체화된 후 18 시간까지의 간격에서, 각 조건에서 배출된 혈청은 3회 측정하여 수축의 기준으로 결정했다. PBS를 첨가 또는 무첨가한 말초 혈액 샘플은 최초 질량의 30%까지 수축하였다(도 17A). 폴리사카라이드 알지네이트, 하이드록시에틸 셀룰로즈 또는 히알우론산과 함께 혼합한말초 혈액은 최초 질량의 40-50%까지 수축하였다(도 17A). 혈액/키토산 젤 샘플은 최초 질량의 90%까지 수축하여 아주 소량의 수축 정도를 보였다(도 17A). 또한, 헤파린 처리된 혈액/키토산 젤 샘플은 최초 질량의 85%까지 수축하여 아주 제한된 수축을 보였다(도 17A). 상기 결과를 통해, 혈액/키토산 젤은 수축에 대해 저항하며, 연골 결함 내로 공간을 채울수 있는 피브린을 훨씬 많이 공급할 수 있다고 결론지었다. 도 17B 및 도 17C에서는 혈액(1), 혼합된 혈액(2), 혈액/PBS(3), 글리세롤 포스페이트에 들어있는 혈액/키토산(4), 헤파린 처리된 혈액/키토산(5), 혈액/알지네이트(6), 혈액/하이드록시에틸 셀룰로즈(7) 및 혈액/히알우론산(8)을 포함한 샘플을 보여준다.
항-응고된 혈액을 특정 부위에서 혈액/폴리사카라이드 고체화 이식을 생성하는데 사용할 수 있는지 확인하기 위해, 1.5 mM EDTA, 0.38% 시트레이트(citrate), 산-0.38% 시트레이트 덱스트로즈(citrate dextrose) 또는 소듐 헤파린(sodium heparin)(Becton Dickinson)으로 처리된 3 부피의 혈액을 1 부피의 키토산-글리세롤-포스페이트 용액과 혼합하였다. 키토산-글리세롤-포스페이트 용액은 헤파린-(도 18), EDTA- 및 시트레이트-유도된 항응고를 반전시킬 수 있다. 글리세롤-포스페이트 용액에 든 1.5% 키토산 또는 세가지 다른 1.5% 폴리사카라이드 용액 1 부피를 전체 말초 혈액 3 부피와 혼합하였다. 각 샘플의 500 ㎕를 유리 보로실리케이트 튜브에 넣은후 37℃에서 60분 동안 고체화 되도록 놓아두었다. 상기 세가지 다른 폴리사카라이드 용액은 히알우론산-PBS(1), 하이드록시에틸 셀룰로즈-PBS(2), 알지네이트-PBS(3) 및 키토산-글리세롤 포스페이트(4)를 포함하고 있다. 대조군으로써, 헤파린 처리된 혈액(5)을 분석하였다. 60분 후에, 상기 튜브를 수평으로 놓아은뒤 빛으로 관찰하였다(photodocumented). 그 결과, 키토산-글리세롤 포스페이트 혼합 및 헤파린 처리된 혈액만이 고체화되었다.
하이드록시에틸 셀룰로즈, 알지네이트 또는 히알우론산을 사용한 헤파린 처리된 혈액/폴리사카라이드 혼합액은 고체화되지 않았다(도 18). 상기 결과를 통해 항-응고된 혈액을 사용하면 특정 부위에서 혈액/폴리사카라이드 고체화 이식을 생성할 수 있음을 알 수 있었다.
고체화된 혈액/폴리머 샘플의 조직학적 절단을 통해 상기 혼합물은 균일하고, 혼합 또는 고체화 단계 이후에도 적혈구는 용혈되지 않으며, 혈소판이 활성화되어 기능을 할 수 있는 상태(피브린 조직의 생성양이 많은 것을 통해 증명됨)임을 알 수 있었다(도 19의A 내지 도 19의C). 고체화된 혈액/키토산 혼합물을 고정하고 LR 화이트 플라스틱으로 봉매한 뒤, 절단하고 톨루이딘 블루로 염색하였다(20 ×확대한 도 19의A에서는 전체적으로 균일하게 혼합됨을 보여준다. 100 ×확대한 도 19의B에서는 내부에서 혼합된 적혈구 세포 및 키토산 하이드로폴리머를 보여준다. 전자 스캐닝 현미경을 사용하여 2000 ×확대한 도 19의C에서는 혈액/키토산 복합체를 통틀어 피브린 섬유 조직이 존재하는 것이 명백함을 보여준다).
혼합 및 고체화한 뒤 몇 시간 후 눈으로 확인 가능한 몇 개의 백혈구가 잔존하였다(도 20). 말초 전혈은 키토산 젤과 혼합한 후 고체화 되도록 놓아두었다. 도 20의A에서는 고체화된지 60분 후에 살아있는 세포를 염색하는 칼세인 AM/에티듐 호모다이머-1으로 염색된 살아 있는 백혈구 세포(녹색 세포, 굵은 화살표), 살아있는 혈소판(녹색 세포, 작은 화살표) 및 죽은 백혈구 세포(붉은 핵)에 플러그가 존재함을 보여준다. 도 20의B는 고체화 한 뒤 180분 후에 샘플을 고정화시키고 이를 LR-화이트에 봉매한 뒤 투과전자현미경으로 확인한 것이다. 혼합하고 고체화된지 3시간 이후의 투과전자현미경 사진은 세포의 생존도를 나타내주는 말초 단핵구(화살표의 머리부분)를 통해 대식세포화가 활성화되는 것을 나타내준다.
고체화한 뒤 혈액 또는 혈액/키토산으로부터 분리된 전체 혈청 단백질을 분석하였다. 같은 부피의 혈액 또는 혈액/키토산 젤은 아가로즈 웰에 고체화되었다. 디스크를 1 ㎖ PBS를 포함하고 있는 48웰 플레이트의 각각의 웰로 옮긴 후 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 이후 4, 5, 7 및 19시간에 상기 디스크를 37℃에서 신선한 PBS로 교체하였다. 상기 PBS로 세척한 것은 분석하기 전에 다른 세포를 제거하기 위해 가볍게 원심 분리하였다. 일부 디스크는 PBS에 들어 있는 상태에서 3 또는 19시간 후에 전체 단백질을 분석하기 위해 추출하였다. 디스크 또는 PBS로 세척한 디스크에 포함된 전체 단백질은 SDS-PAGE로 분석하여 시프로 오렌지(sypro orange)로 염색하였다. 혈액/키토산 샘플의 전체 혈청 단백질은 혈액 샘플과 비교하여 훨씬 천천히 지속되어 분비되었다(도 21). 상기 결과를 통해, 혈액 응고로 채워져 있는 결함에 비교했을 때 혈액/키토산으로 채워져 있는 결함에서 혈액 및 상처 치유에 관계하는 혈소판 유래의 단백질이 훨씬 지속되고 지연되게 분비됨을 알 수 있었다. 혈액/키토산 젤 또는 혈액 단독의 고체 디스크는 최초 액체 부피 150 ㎕로부터 생성되었다. 생성된 디스크는 3시간 동안 PBS 1 ㎖로 세척한 뒤 추가로 PBS 1 ㎖을 이용하여 4, 5, 7 및 19시간째에 세척하였다. 세척한지 3 내지19시간 후에 상기 디스크는 전체에 포함되어 있는 단백질을 수용화하기 위해 GuCl로 추출하였다. 수용성 단백질은 동일 부피의 GuCl 추출물 또는 PBS 세척으로부터 침전되었으며 SDS-PAGE 젤을 이용하여 분리시키고, 전체 단백질은 시프로 오렌지를 사용하여 전체 단백질을 염색하였다. 19시간 동안의 세척 동안 혈액 디스크에 비해 혈액/폴리머 디스크에서는 훨씬 많은 양의 단백질이 유지되었다. 또한, 혈액 자체보다는 혈액/키토산을 PBS로 19시간 동안 세척하였을 때, 훨씬 천천히 지속적으로 혈청 단백질이 PBS 세척한 것으로 분비되었다.
<실시예 5> 관절 연골 결함의 치유를 증가시키기 위한 혈액/폴리머 혼합물의 제조, 혼합 및 주입
부연골 뼈에 구멍을 뚫어 생긴 연골 결함 부위에 말초 혈액/키토산-글리세롤 포스페이트 혼합물을 액체 상태로 전달한 후 특정 부위에서 고체화 되도록 놓아두었다(도 22의A 내지 도 22의C). 도 22의A는 성체(7달 이상) 뉴질랜드 화이트 토끼의 대퇴골 슬개골의 홈에 형성된 3 ×4 ㎜의 사각형 모양으로 전체적으로 두꺼운 연골 결함을 보여준다. 뼈에서 혈액이 관찰될 때까지 1 ㎜ 직경의 미세한 구멍 4개를 뚫었다. 도 22의B는 글리세롤 포스페이트 용액에 있는 1 부피의 키토산에 3 부피의 전혈을 혼합한 후에 결함 부위에 채운 것을 보여준다. 도 22의C는 5분 후에 특정 부위에서 혈액/키토산 이식한 것이 고체화된 것을 보여준다. 막낭(capsule) 및 피부를 봉합한 후에 상기 동물은 자유롭게 움직이게 하여 회복될 수 있도록 하였다.
인간 환자에게 동일하게 처치한 모식도는 도 22의D에 나타나 있으며, 여기서는 미리 준비한 연골 결함 부위에 액체 혈액/폴리머를 관절미세적으로(arthroscopic) 주사하여 특정 부위에서 고체화되게 하였다. 선택적으로, 결함 부위를 관절미세적으로 주사한 액체 폴리머는 뼈-유래된 혈액과 혼합하였다(도 22의E). 도 22의D에 나타난 것과 같이 환자의 혈액을 엑스 비보에서 폴리머와 혼합한 후 미리 준비된 결함 부위에 관절미세적으로 주사하거나 도 22의E에 나타난 것과 같이 관절미세적으로 주사하거나 개방된 무릎 수술 동안 폴리머를 전달한 후 결함 부위에서 분리한 환자의 혈액을 사용하여 결함 부위에서 혼합하였다.
본 발명의 개념을 증명하기 위해 혈액/키토산 젤 치료의 효과를 토끼에서 테스트하였다. 성체, 관절적으로 성체화된 뉴질랜드 화이트 토끼(7달 및 그 이상)를 이소플로렌/산소(iosfluorene/oxygen) 가스로 마취하고 잇따라 자일라진-케타민(xylazine-ketamine)을 이용하여 마취시켰다. 이상슬개골(parapatellar)의 절개 및 슬개골의 대체로 대퇴골 슬개골 연골륜(trochlea)에 홈을 만들었다. 미세수술용 칼로 대퇴골 슬개골 연골륜의 홈에 4 ×5 ㎜ 이상의 전체적으로 두꺼운 연골 결함을 만들었다. 4℃ PBS를 사용하여 세정하면서 미세드릴(microdrill)을 사용하거나 상업적으로 판매되는 송곳 및 망치를 사용하여 네 개의 4 ㎜ 깊이, 1 ㎜ 직경의 뼈를 관통하는 구멍을 뚫었다. 결함 부위는 PBS로 세척한 뒤 혈액이 나오는 정도에 따라 PBS에 녹인 멸균된 에피네프린(2 ㎍/㎖)을 200 ㎕까지 투여하였다. 연골 결함 부위는 PBS로 적신 멸균된거즈로 덮었다. 배큐테이너 주사바늘(vacutainerTMneedle) 및 처리되지 않은 벡톤 디킨슨사(Becton dickinson)의 4cc짜리 배큐테이너 용기(vacutainerTMvial)을 사용하여 토끼 귀 대동맥으로부터 말초 혈액을 분리하였다.
한 개의 처치에 있어서, 750 ㎕의 혈액을 멸균된 1cc 주사기에 넣었다. 250 ㎕의 키토산-글리세롤 포스페이트 용액(1.5% 키토산/70 mM HCl/135 mM ?-글리세롤 포스페이트)이 들어있는 두 번째 주사기는 멸균된 플라스틱 커넥터를 사용하여 혈액을 포함한 주사기와 내부 연결하였다. 주사기는 앞 뒤로 40회 펌프하였다. 상기 혼합된 것을 한 개의 주사기로 옮기고 20 게이지 바늘을 부착하였다. 상기 혼합액을 절반 정도 제거한 후 약 25 ㎕ 정도 되는 한 방울을 결함 부위에 놓이게 하였다. 각각의 처치에 있어서, 혈액 2 ㎖을 멸균된 3.2 ㎜ 직경의 스테인레스 스틸 비드 6개 및 1.5% 키토산/70 mM HCl/135 mM ?-글리세롤 포스페이트 667 ㎕를 포함하는 폴리프로필렌 동결 튜브에 넣었다. 상기 튜브의 뚜껑을 닫은 후 약 40 내지 50회로 강하게 10초 동안 흔들어 주었다. 상기 액체 혈액/키토산 혼합액을 멸균된 1cc 주사기를 사용하여 용기로부터 제거한 뒤 20 게이지 니들을 주사기에 꽂았다. 상기 주사기로부터 200 ㎕를 제거한 후 약 25 ㎕ 정도의 한 방울을 연골 결함 부위를 채우기 위해 넣었다. 상기 혈액/키토산 혼합액은 5분 동안 고체화 되도록 놓아둔 후 막낭 및 피부를 봉합하고 감염되지 않게 하였다. 상기 토끼를 1주(n=1, 수컷), 51일 또는 56일(n=2, 수컷 1마리, 암컷 1마리)에 죽였다. 관절을 고정, 탈석회화(decalcified), LR/화이트 플라스틱으로 봉매한 뒤 톨루이딘 블루로 염색하였다. 혈액/키토산으로 처리한 결함에서는 치료한지 1주일째에 다수의 세포주화성(chemotactic) 세포가 혈액/키토산으로 채워진 부위로 이동함을 보여주었다(도 23의A). 처리하지 않은 결함의 경우는 결함 부위의 맨 윗부분 쪽에만 혈액이 응고되어 상대적으로 약한 세포주화성 반응을 보였다(도 23의B). 성인 뉴질랜드 화이트 토끼의 대퇴골 슬개골 연골륜에 미세 드릴을 사용하여 홈을 만들어 연골의 결함을 만든 후 한 마리는 혈액/키토산 젤로 채워넣고 나머지는 처리하지 않은 상태로 놓아 두었다. 치료를 한지 1주일 뒤에 관절을 고정, LR-화이트로 봉매한 뒤 톨루이딘 블루로 염색하였다. 연골 표면 아래 2 내지 3 ㎜에서 다수의 세포가 혈액/키토산으로 채워진 결함 부위로 이동한 반면(도 23의A), 처리하지 않은 동일한 결함 부위에서는 이동하는 세포를 거의 관찰할 수 없었다(도 23의B).
두 마리 토끼(수컷 1마리, 암컷 1마리)를 치료한 지 5 내지 8주 뒤에 혈액/키토산 처리된 결함 부위는 히알린(hyaline) 복구 조직으로 채워졌다(도 24의A). 이 혈액/키토산-기초의 복구 조직은 히알린, GAG-풍부한 연골 복구 조직을 가지고 있었다. 처리하지 않거나 혈액 단독으로 처리한 미세 파쇄된 결함의 복구 조직은 섬유성연골(fibrocartilage)을 가지고 있었다(도 24의B). 그러나, 상기 전달을 한 뒤 3주에 결함 부위 또는 바로 아래 부위에서 혈액/키토산 또는 혈액이 응고된다는 조직학적 소견은 볼 수 없었다. 성인 뉴질랜드 화이트 토끼 두마리의 대퇴골 슬개골에 미세드릴을 사용하여 홈을 만들어 연골 결함을 만든 뒤 한 마리는 혈액/키토산 젤로 채워넣고 나머지는 처리하지 않은 상태로 놓아두었다. 상기 치료를 한지 51일 또는 56일에 관절을 고정, LR-화이트로 봉매한 뒤 톨루이딘 블루로 염색하였다. 도 24의A에서 보는 바와 같이 혈액/키토산으로 처리한 결함 부위의 복구 조직에는 변색염색된 히알린 연골이 결함 표면에 부착하고 결함 부위를 채우고 있었다. 도 24의B에서 보는 바와 같이 처리하지 않은 결함 부위의 복구 조직은 GAG를 변색염색하지 않아 섬유성-연골을 보였으며, 오직 부분적으로 결함부위를 채웠다.
본 발명에서는 구체적으로 실시하기 위한 특정한 참고문헌을 기재하였으나 여러가지로 변형하여 수행할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 자명하다. 따라서, 상기에 기재된 내용 및 이에 대한 도면은 본 발명의 내용을 나타내기 위해 사용한 것일뿐 반드시 이에 한정된 것은 아니다. 예를 들어, 용액 상태로 키토산을 혈액과 혼합하여 폴리머/혈액이 응고하도록 놓아 둔 것은 상당하게 수축하지는 않았으며, 세포주화적 및 분화촉진성 혈액 단백질이 서서히 배출되고 혈액 세포의 생존도가 유지되어 관절 연골 결함 부위를 상당히 많이 복구시킬 수 있음을 보여주었다. 또한, 상기와 동일한 결과를 도출하기 위해 키토산 용액을 다르게 제조할 수도 있다는 것은 당업자에게 있어서 자명하다. 예를 들면, 1) 다양한 키토산 농도 및 혈액과의 혼합비, 2) 버퍼의 형태 및 농도를 변형시킨 액체 용액의 다양한 선택, 3) 키토산 혼합의 액체 현탁 및 4) 미립자의 키토산 파우더를 적당한 혼합 기술로 혼합하여 이러한 미립자가 혈액 전체에 분포되게 하며 일부분이 용해되도록 하는 것을 포함한다. 사용 가능한 다른 폴리머로는 1) 전구응고적 상태에서 형태화함으로써(낮은 농도를 사용하거나 트롬빈과 혼합하는 것) 항-응고적 작용을 할 수 있다면 히알우로난(hyaluronan)과 같은 다른 폴리사카라이드 및 2) 동일한 효과를 수행하기 위해 사용될 수 있는 폴리리신(polylysin) 또는 콜라겐과 같은 단백질폴리머가 있다. 비록 이러한 후자의 접근 방법은 면역성, 독성 및 세포 부착/수축의 영향 때문에 본 발명에서 언급한 것 만큼 성공적이지는 않지만, 본 발명에서 언급한 조성물 및 다른 형태의 조성물은 본 발명의 폴리머 제조의 특성을 포함하고 있기 때문에 본 발명의 일부로 간주되었다. 본 발명의 폴리머 제조의 특성으로는 1) 혈액 또는 혈액으로부터 선택된 성분과 혼합이 가능하고, 2) 제조된 혼합물은 조직 복구를 필요로 하는 신체의 부위에 주입하거나 놓이게 할 수 있으며, 3) 혼합물은 놓여진 위치에서 조직을 복구, 재생, 재건 또는 증량하는 이점을 가지고 있다는 것이다.
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Claims (99)

  1. 조직에 부착하여 조직 복구를 위한 세포 분열을 촉진시키는 온도-의존적인 폴리머 젤 조성물을 조직에 도입하는 단계를 포함하는 환자 조직의 복구 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 한가지의 혈액 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 폴리머 조성물을 조직에 도입시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리머 조성물은 적어도 한가지의 혈액 성분과 혼합될 수 있고, 상기 폴리머 조성물은 상기 혈액 성분과 혼합되었을 때 혼합물이 되며, 상기 혼합물은 조만간 또는 가열시에 비-액체 상태로 변하며, 상기 혼합물은 조직의 복구를 위하여 도입된 부위에 유지되고 부착하는 것을 특징으로 하는 환자 조직의 복구 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머는 변형된 또는 천연의 폴리사카라이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 키토산, 키틴, 히알루로난, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린 및 헤파린 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 천연, 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 폴리리신인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 천연 단백질은 가용성 콜라겐 또는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 폴리락틱산, 폴리글리콜릭산, 카복실릭, 아미노, 설포닉, 포스포닉, 포스페닉 작용기를 포함하며 추가적인 작용기를포함하거나 포함하지 않는 합성 호모 및 차단 코폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 추가적인 작용기는 하이드록실, 티올, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시 및 아로일옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 무기염을 포함하는 버퍼에 초기에 용해되거나 또는 현탁되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 무기염은 소듐, 클로라이드, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트, 설페이트 및 카복시레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 글리세롤-포스페이트, 프룩토스 포스페이트, 글루코스 포스페이트, L-세린 포스페이트, 아데노신 포스페이트, 글루코사민, 갈락토사민, HEPES, PIPES 및 MES로 구성된 유기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 또는 현탁되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 용액은 250 mOsm/ℓ 내지 600 mOsm/ℓ사이의 생리학적 수치로 조절된 삼투압농도를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 전혈, 가공혈, 정맥혈, 동맥혈, 뼈로부터의 혈액, 골수로부터의 혈액, 골수, 탯줄의 혈액 및 태반의 혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구, 백혈구, 단핵구, 혈소판, 피브리노젠 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구가 제거된 혈소판이 풍부한 혈장을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 항응고된 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 혈액 성분은 시트레이트, 헤파린 또는 EDTA로 구성된 군으로부터 선택되는 항응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 도입된 부위에서 응고/고체화를 촉진시키기 위해 전구-응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 전구-응고제는 트롬빈, 칼슘, 콜라겐, 엘라직산, 에피네프린, 아데노신 디포스페이트, 조직 인자, 포스포리피드 및 응고 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 자가 또는 비-자가인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 혈액 성분에 대해 1:100 내지 100:1의 비로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 3항에 있어서, 상기 폴리머 조성물 및 혈액 성분은 음파, 교반, 볼텍싱 또는 주사기에서의 다중 통과를 이용하여 기계적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 3항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직은 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 상악안면 조직, 측두하악 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 폴리머 및 혈액 성분을 포함하며, 조직의 복구에 사용하기 위한 폴리머 조성물.
  29. 폴리머 조성물을 조직에 도입시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리머 조성물은 적어도 한가지의 혈액 성분과 혼합될 수 있고, 상기 폴리머 조성물은 상기 혈액 성분과 혼합되었을 때 혼합물이 되며, 상기 혼합물은 조만간 또는 가열시에 비-액체 상태로 변하며, 상기 혼합물은 조직의 복구를 위하여 도입된 부위에서 유지되고 부착하는 것을 특징으로 하는 환자 조직의 복구에 사용되기 위한 폴리머 조성물.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머는 변형 또는 천연 폴리사카라이드인 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 키토산, 키틴, 히알우로난, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린 및 헤파린 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  32. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 천연, 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 폴리리신인 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  34. 제 32항에 있어서, 상기 천연 단백질은 가용성 콜라겐 또는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  35. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 폴리락틱산, 폴리글리콜릭산, 카복실릭, 아미노, 설포닉, 포스포닉, 포스페닉 작용기를 포함하며 추가적인 작용기를 포함하거나 포함하지 않는 합성 호모 및 차단 코폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 추가적인 작용기는 하이드록실, 티올, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시 및 아로일옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  37. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 무기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 또는 현탁되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 무기염은 소듐, 클로라이드, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트, 설페이트 및 카복시레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  39. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 글리세롤-포스페이트, 프룩토스 포스페이트, 글루코스 포스페이트, L-세린 포스페이트, 아데노신 포스페이트, 글루코사민, 갈락토사민, HEPES, PIPES 및 MES로 구성된 유기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 현탁되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  40. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  41. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 용액은 250 mOsm/ℓ 내지 600 mOsm/ℓ 사이의 생리학적 수치로 조절된 삼투압농도를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  42. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 전혈, 가공혈, 정맥혈, 동맥혈, 뼈로부터의 혈액, 골수로부터의 혈액, 골수, 탯줄의 혈액 및 태반의 혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  43. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구, 백혈구, 단핵구, 혈소판, 피브리노젠 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  44. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구가 제거된 혈소판이 풍부한 혈장을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  45. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 항응고된 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 혈액 성분은 시트레이트, 헤파린 또는 EDTA로 구성된 군으로부터 선택되는 항응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  47. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 전달된 부위에서 응고/고체화를 촉진시키기 위해 전구-응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 전구-응고제는 트롬빈, 칼슘, 콜라겐, 엘라직산, 에피네프린, 아데노신 디포스페이트, 조직 인자, 포스포리피드 및 응고 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  50. 제 29항에 있어서, 상기 혈액 성분은 자가 또는 비-자가의 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  51. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 혈액 성분에 대해 1:100 내지 100:1의 다양한 비로 각각 사용되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  52. 제 29항에 있어서, 상기 폴리머 조성물 및 혈액 성분은 음파, 교반, 볼텍싱 또는 주사기에서의 다중 통과를 이용하여 기계적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  53. 제 29항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직은 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양으로 구성된군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  54. 조직 복구를 위한 온도-의존적인 폴리머 젤 조성물의 용도.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 조성물은 최소한 혈액 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  56. 폴리머 조성물을 조직에 도입시키는 단계를 포함하며, 상기 폴리머 조성물은 적어도 한가지의 혈액 성분과 혼합될 수 있고, 상기 폴리머 조성물은 상기 혈액 성분과 혼합되었을 때 혼합물이 되며, 상기 혼합물은 조만간 또는 가열시에 비-액체 상태로 변하며, 상기 혼합물은 조직의 복구를 위하여 도입된 부위에 유지되고 부착하는 것을 특징으로 하는 조직 복구를 위한 폴리머 조성물의 용도.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머는 변형된 또는 천연 폴리사카라이드인 것을 특징으로 하는 용도.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 폴리사카라이드는 키토산, 키틴, 히알루로난, 글리코사미노글리칸, 콘드로이틴 설페이트, 케라탄 설페이트, 더마탄 설페이트, 헤파린 및 헤파린 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  59. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 천연, 재조합 또는 합성 단백질 또는 폴리아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  60. 제 59항에 있어서, 상기 폴리아미노산은 폴리리신인 것을 특징으로 하는 용도.
  61. 제 59항에 있어서, 상기 천연 단백질은 가용성 콜라겐 또는 젤라틴인 것을 특징으로 하는 용도.
  62. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 폴리락틱산, 폴리글리콜릭산, 카복실릭, 아미노, 설포닉, 포스포닉, 포스페닉 작용기를 포함하며 추가적인 작용기를포함하거나 포함하지 않는 합성 호모 및 차단 코폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 추가적인 작용기는 하이드록실, 티올, 알콕시, 아릴옥시, 아실옥시 및 아로일옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  64. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 무기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 현탁되는 것을 특징으로 하는 용도.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 무기염은 소듐, 클로라이드, 포타슘, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트, 설페이트 및 카복시레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  66. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 글리세롤-포스페이트, 프룩토스 포스페이트, 글루코스 포스페이트, L-세린 포스페이트, 아데노신 포스페이트, 글루코사민, 갈락토사민, HEPES, PIPES 및 MES로 구성된 유기염을 포함하는 버퍼에 용해되거나 현탁되는 것을 특징으로 하는 용도.
  67. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 조성물은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 용도.
  68. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 용액은 250 mOsm/ℓ 내지 600 mOsm/ℓ 사이의 생리학적 수치로 조절된 삼투압농도를 가지는 것을 특징으로 하는 용도.
  69. 제 56항에 있어서, 상기 혈액 성분은 전혈, 가공혈, 정맥혈, 동맥혈, 뼈로부터의 혈액, 골수로부터의 혈액, 골수, 탯줄의 혈액 및 태반의 혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  70. 제 56항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구, 백혈구, 단핵구, 혈소판, 피브리노젠 및 트롬빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  71. 제 56항에 있어서, 상기 혈액 성분은 적혈구가 제거된 혈소판이 풍부한 혈장을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  72. 제 54항에 있어서, 상기 혈액 성분은 항응고된 것을 특징으로 하는 용도.
  73. 제 72항에 있어서,상기 혈액 성분은 시트레이트, 헤파린 또는 EDTA로 구성된 군으로부터 선택되는 항응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  74. 제 56항에 있어서, 상기 혈액 성분은 전달된 부위에서 응고/고체화를 촉진시키기 위해 전구-응고제를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  75. 제 74항에 있어서, 상기 전구-응고제는 트롬빈, 칼슘, 콜라겐, 엘라직산, 에피네프린, 아데노신 디포스페이트, 조직 인자, 포스포리피드 및 응고 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  76. 제 75항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ인 것을 특징으로 하는 용도.
  77. 제 56항에 있어서, 상기 혈액 성분은 자가 또는 비-자가인 것을 특징으로 하는 용도.
  78. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 성분은 혈액 성분에 대해 1:100 내지 100:1의 다양한 비로 각각 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  79. 제 56항에 있어서, 상기 폴리머 성분 및 혈액 성분은 음파, 교반, 볼텍싱 또는 주사기에서의 다중 통과를 이용하여 기계적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  80. 제 56항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조직은 연골, 메니스커스, 인대, 건, 뼈, 피부, 각막, 치주 조직, 농양, 절제된 암 및 궤양으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  81. 생체내 조직을 복구하거나 또는 재생하기 위한 세포 전달용 키토산 용액의 용도에 있어서, 상기 키토산 용액은 0.5-3% w/v의 키토산을 포함하고 가열젤로 제형화되며, 상기 용액은 복구 또는 재생되는 조직으로 주입되기 전에 세포와 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  82. 제 81항에 있어서, 상기 키토산 조성물은 포스페이트, 글리세롤 포스페이트 또는 글루코사민의 첨가에 의해 가열젤로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
  83. 제 81항에 있어서, 상기 키토산 용액은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 용도.
  84. 제 81항에 있어서, 상기 세포는 자가 또는 비-자가인 것을 특징으로 하는 용도.
  85. 제 81항에 있어서, 상기 세포는 일차 세포, 계대된 세포, 선별된 세포, 혈소판, 간질 세포, 줄기 세포 및 유전적으로 변형된 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  86. 제 81항에 있어서, 상기 세포는 전달 용액에 혼탁하는 것을 특징으로 하는 용도.
  87. 제 86항에 있어서, 상기 전달 용액은 히알우론산, 하이드록시에틸셀룰로즈, 콜라겐, 알지네이트 또는 수용성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  88. 생체외 세포 배양용 젤화 키토산 용액의 용도에 있어서, 상기 키토산 용액은 0.5-3% w/v의 키토산을 포함하고 가열젤로 제형화되며, 상기 용액은 복구 또는 재생되는 조직으로 주입되기 전에 세포와 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  89. 제 88항에 있어서, 상기 키토산 조성물은 포스페이트, 글리세롤 포스페이트 또는 글루코사민의 첨가에 의해 가열고체로 유도되는 것을 특징으로 하는 용도.
  90. 제 89항에 있어서, 상기 키토산 용액은 6.5 내지 7.8 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 용도.
  91. 제 89항에 있어서, 상기 세포는 일차 세포, 계대된 세포, 선별된 세포, 혈소판, 간질 세포, 줄기 세포 및 유전적으로 변형된 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  92. 제 89항에 있어서, 상기 세포는 전달 용액에 혼탁되는 것을 특징으로 하는 용도.
  93. 제 91항에 있어서, 상기 전달 용액은 히알우론산, 하이드록시에틸셀룰로즈, 콜라겐, 알지네이트 또는 수용성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  94. 1 kDa 내지 10 MDa의 평균 분자량을 가지는 0.01 내지 10% w/v의 20% 내지100% 탈아세텔화된 키토산 및 혈액 성분을 포함하는 폴리머 조성물.
  95. 제 94항에 있어서, 상기 키토산은 유기 또는 무기 포스페이트 버퍼에 용해되는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  96. 제 95항에 있어서, 상기 유기 또는 무기 포스페이트 버퍼는 포스페이트 또는 글리세롤 포스페이트를 포함하는 버퍼인 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  97. 제 95항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 키토산은 용해 상태에 있으며, 상기 조성물은 6.5 내지 7.4 사이의 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 폴리머 조성물.
  98. 제 3항에 있어서, 상기 체내에 도입되는 부위는 비정상적인 조직을 제거하기 위해 외과적으로 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제 98항에 있어서, 상기 복구를 필요로 하는 조직은 폴리머 조성물이 복구를 필요로 하는 부위로 이동하기 위한 채널을 형성하기 위하여 인접 조직 부위 또는 혈관화된 부위로 관통하기, 파쇄하기 또는 뚫기를 통해 외과적으로 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
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