KR20020013464A - 이종 유전자의 전달을 위한 표적화된 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

이종 유전자의 전달을 위한 표적화된 아데노바이러스 벡터 Download PDF

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KR20020013464A
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Abstract

아데노바이러스 섬유 단백질 및 헥손 단백질의 내부 변형은 아데노바이러스 벡터의 효과적인 표적화를 가능케 한다. 아데노바이러스 표적화를 재지시하는 접근 부위가 확인되었다. 헥손 단백질의 HVR5 루프와 섬유 단백질(노브)의 HI 루프는 상응하는 바이러스의 생존력과 생산성에 영향을 미치지 않는 외래 단백질 서열의 삽입을 고도로 허락한다. 에피토프의 접근성과 기능성은 이웃한 스페이서의 크기에 강하게 좌우된다. 기타 결과는 짧은 표적화 펩티드가 섬유 단백질의 C-말단에 효과적으로 융합될 수 있음을 보여준다. 특정 양태에서, HVR5 부위, 섬유 단백질 HI 루프, 또는 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체 함유 세포를 표적화하는 섬유 단백질 C-말단에서 변형된 일련의 아데노바이러스 벡터를 제조했다. 이러한 벡터는 혈관계의 표적화, 예를 들면 암 또는 심장혈관 질환의 유전자 요법에 특히 유용하다.

Description

이종 유전자의 전달을 위한 표적화된 아데노바이러스 벡터{TARGETED ADENOVIRUS VECTORS FOR DELIVERY OF HETEROLOGOUS GENES}
아데노바이러스 벡터
아데노바이러스는 유전자 요법에서 유전자 전달을 위한 벡터로 이용하기에 특히 유리한 성질을 보인다. 특히, 이는 상당히 넓은 숙주 범위를 가지고, 침묵 세포를 감염시킬 수 있으며, 감염된 세포의 게놈으로 통합되지 않으면서, 현재까지 인간에게서 주된 병리와는 관련이 없다. 아데노바이러스는 관련 유전자를근육(Ragot et al., 1993, Nature 361:647), 간(Jaffe et al., 1992, Nature Genetics 1:372), 신경계(Akli et al., 1993, Nature Genetics 3:224), 종양(Griscelli et al., 1998, PNAS 95:6367), 온전하거나 상처난 혈관 내피세포(van Belle et al., 1998, Human Gene Therapy 9:1013), 활액 조직(Ghivizzani et al., 1998, PNAS 95:4613) 등으로 전달하는데 이용되어왔다. 아데노바이러스 벡터는 유전자를 복제 세포 및 비-복제 세포 모두로 효과적으로 전달한다(예, Crystal, 1995, Science 270:404-410 참조).
아데노바이러스 캡시드
아데노바이러스 캡시드의 특성이 익히 알려져 있다(예, 국제 특허 공개 WO 98/07877 참조).
각종 간행물은 아데노바이러스 헥손 단백질에 관해 기재하고 있고, 접근가능한 부위의 어느 정도 추정을 가능케 한다. 예를 들어 Athapilly 등(1994, J. Mol.Biol.242:430-455)은 2.9A 해상도에서 이의 미세한 결정 구조에 관해 기재하고 있다. Crawford-Miksza 등(1996, J.Virol.70:1836-1844)은 혈청타입-특이적 잔기를 함유하는 7개의 헥손 단백질 초변이 영역의 위치 및 구조에 관해 기록하고 있다. 실제로, 아데노바이러스 헥손의 표면상에서 외래 에피토프의 발현에 관해 보고되었다(Crompton et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 133-139). 그러나, 하기 실시예에서 알 수 있듯이, Crompton 등의 논문은 헥손 단백질을 변형시켜 아데노바이러스를 표적화하는 재생 방법에 관해 교시하고 있지 않다.
부가적인 간행물은 섬유 단백질에 관한 정보를 제공한다(Chroboczek et al.,1995, In Doerfler W. & P. Bohm(Eds.), The molecular repertoire of adenoviruses, pp.163-200, Springer-Verlag; Steward and Burnett, ibid., pp.25-38; Xia et al., 1995, ibid., pp.39-46Fender et al., 1995Virol., 214:110-117; Hong and Engler, 1996, J. Virol., 70:7071-7078). 인간 아데노바이러스 혈청타입 2 및 3의 섬유 노브의 합성 펩티드에 의한 바이러스로의 세포 부착 억제 및 안티-펩티드 항체에 의한 바이러스 중화가 보고되어있다(Liebermann et al., 1996, Virus Research, 45:111-121). Xia 등(1994, Structure, 2:1259-1270)은 1.7A 해상도에서 아데노바이러스 타입 5 섬유 단백질의 수용체-결합 도메인의 결정 구조에 관해 보고하고 있다.
아데노바이러스는 껍질이 없고, 직경 약 65 내지 80 nm의 정 20면체이다. 아데노바이러스 캡시드는 252개의 캡소머를 포함하고, 이 중에서 240개는 헥손이고 12개는 펜톤이다. 헥손과 펜톤은 세가지 상이한 바이러스 폴리펩티드에서 유도된다(Maizel et al., 1968, Virology, 36:115-125; Weber et al., 1997, Virology: 76, 709-724). Ad5 헥손은 세개의 동일한 폴리펩티드(각각 967개 아미노산), 즉 폴리펩티드 II(Roberts et al., 1986, Science, 232:1148-1151)를 포함한다. 펜톤은 캡시드로의 부착 지점을 제공하는 펜톤 염기와, 펜톤 염기에 공유결합되지 않고 펜톤 염기로부터 뻗어나온 트라이머 섬유 단백질을 포함한다.
섬유 단백질은 폴리펩티드 IV(582개 아미노산)의 세개의 동일한 단백질성 서브유닛을 포함하고 테일(tail), 샤프트(shaft) 및 노브(knob)를 포함한다(Devaux et al., 1990, J.Molec. Biol., 215:567-588). 섬유 샤프트는 15개 아미노산의 가반복부를 포함하고, 이는 두 교대 β-가닥과 β-밴드를 형성하는 것으로 여겨진다(Green et al., 1983, EMBO J., 2:1357-1365). 섬유 샤프트의 총 길이와 15개 아미노산 반복부의 수는 아데노바이러스 혈청타입에 따라 달라진다. 예를 들면, Ad2 섬유 샤프트는 37 nm 길이이고 22개 반복부를 포함하는 반면, Ad3 섬유는 11 nm 길이이고 6개 반복부를 포함한다. 상이한 아데노바이러스 혈청타입에서 나온 10개 이상의 섬유 단백질의 서열 분석은 기타 아데노바이러스 단백질 중에서 관찰된 것보다 높은 서열 다양성을 보여주었다. 예를 들면, 밀접히 연관된 Ad2와 Ad5 혈청타입에서 나온 섬유 단백질의 노브 영역은 아미노산 수준에서 65%만이 유사하지만(Chroboczek et al., 1992, Virology, 186:280-285), 이들의 펜톤 염기 서열은 99% 일치한다. 그러나, Ad2와 Ad5 섬유 단백질 모두 서로간의 결합을 차단하기 때문에 아마도 동일한 세포 수용체와 결합한다. 반면에, Ad2와 Ad3 섬유는 20%만이 일치하고(Signas et al., 1985, J. Virol., 53:672-678), 상이한 수용체에 결합한다(Defer et al., 1990, J. Virol., 64(8), 3661-3673).
아데노바이러스 혈청타입 2는 세포에 부착하여 이를 효과적으로 감염시키기 위해 별개의 세포 수용체와 상호작용하게끔 섬유 및 펜톤 염기를 사용하는 것으로 나타났다(Wickham et al., 1993, Cell, 73:309-319). 우선, 바이러스는 적어도 두개의 세포-표면 수용체(Hong et al., 1997, EMBO J., 16:2294-2306; Bergelson et al., 1997, Science, 275:1320-1323; Phillipson et al., 1968, J.Virol., 2:1064-1075; Wickham et al., 1993 supra; Svensson et al., 1981, J.Virol., 38:70-81; and DiGuilmi et al., 1995, Virus Res., 38:71-81) 중 하나에 부착하게끔 섬유 노브(Henry et al., 1994, J.Virol., 68(8): 5239-5246)에 국한된 수용체 결합 도메인을 사용한다. 바이러스 부착에 이어, 펜톤 염기는 헤테로다이머 세포-표면 수용체로 불리는 인테그린 과(family)의 특정 멤버에 결합한다. 긴-샤프트 섬유를 보유하는 Ad2 및 Ad5 혈청타입의 경우, 펜톤 염기는 숙주 세포로의 초기 바이러스 부착과는 상당한 관련이 없다(상기 Wickham et al., 1993).
대부분의 인테그린은 대부분의 세포외 매트릭스 리간드에서 발견되는 트리펩티드 RGD와 같은 리간드에서 아미노산의 짧은 직선 부위를 인식한다. 인테그린 αIIbβ3는 아미노산 서열 KQAGD(서열 번호: )(Kloczewiak et al., 1984, Biochemistry, 23, 1767-1774)에 의해 피브리노겐에 결합하고, α4β1은 코어 서열 EILDV(서열 번호: )(Komoriya et al., 1991, J. Biol. Chem., 266:15075-15079)에 의해 피브로넥틴에 결합한다. αv-함유 인테그린의 β 서브유닛에 존재하는 또다른 구조 모티프, NPXY(서열 번호: )도 인테그린-매개된 내부화에 있어 중요한 것으로 나타났다(Suzuki et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5354).
일단 Ad2 또는 Ad5가 섬유에 의해 세포에 부착하면, 인테그린에 결합하는 펜톤 염기에 의해 클래트린-코팅된 엔도시틱 소포 중으로 수용체-매개 내부화를 겪는다. 결국, 바이러스 입자는 세포의 핵 포어 복합체로 전달되고, 여기서 바이러스 게놈은 핵으로 들어가, 바이러스 염색체로부터 발현을 개시한다.
그러나 유전자 요법에서 아데노바이러스의 사용에 있어 단점은 아데노바이러스 섬유와 펜톤 염기에 대한 수용체를 포함하는 모든 세포가 아데노바이러스를 내부화시킬 것이고, 결국, 유전자(들)가 치료를 필요로하는 세포에만 투여되는 것이 아니라는 점이다. 또한, 섬유 수용체 또는 펜톤 염기 수용체가 결여된 세포는 아데노바이러스-매개 유전자 전달을 방해할 것이다. 아데노바이러스 섬유 수용체가 결여된 것으로 여겨지는 세포는 있더라도 매우 낮은 효율로 아데노바이러스에 의해 형질도입된다(Curiel et al., 1992, supra; Cotton et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4033-4037; Wattel et al., 1996, Leukemia, 10:171-174). 따라서, 특정 세포로 아데노바이러스의 효과적인 직접 진입 및 몇몇 경우 아데노바이러스-매개 유전자 요법에 맞는 세포 범위의 확대는 현 벡터를 개선시킴에 있어 중요한 목표를 이룬다. 두 접근법은 또한 표적 세포에서 유전자 발현을 얻는데 필요한 아데노바이러스 벡터의 양을 상당히 감소시킬 것이고, 보다 높은 투여량의 아데노바이러스와 관련된 부작용 및 합병증을 상당히 감소시킬 수 있다.
아데노바이러스 표적화 방법
아데노바이러스 트로피즘을 변형, 즉, 일반적으로 야생형 아데노바이러스 벡터에 의해 효과적으로 감염되지 않는 특정 세포 타입에 아데노바이러스를 표적화하는데 각종 방법이 이용되어왔다(예, 국제 특허 공개 WO 98/07877 참조). 섬유 단백질, 헥손 단백질, 및 펜톤 염기 단백질 변형법이 이용되어 왔다.
미국 특허 5,559,099는 야생형 펜톤 염기 서열, 및 치료 유전자 이외에 또는 대신에 수용체, 항체, 또는 에피토프에 특이한 비펜톤 아미노산 서열을 지닌 키메라 펜톤 염기 단백질을 포함하는 재조합 바이러스에 관해 기재하고 있다.
미국 특허 5,543,328은 아데노바이러스 섬유가 원하는 세포 타입에 위치한수용체에 특이한 리간드를 포함하는 아데노바이러스를 청구하고 있다. 이러한 아데노바이러스 섬유는 섬유 단백질 헤드 부위 전부 또는 일부를 제거하고 이를 리간드로 대체하거나, 전체 길이의 섬유 단백질과 리간드간에 융합체를 만듦으로써 제조될 수 있다.
국제 특허 공개 WO 95/26412는 리간드의 부착을 위해 C-말단 링커를 함유하도록 아데노바이러스 전체 길이 섬유 단백질의 변형에 관해 기재하고 있다. 링커의 포함은 섬유 단백질 호모트라이머 형성에 대한 입체 장해를 피하기 위한 것으로 기재되어 있다.
국제 특허 공개 WO 96/26281은 (a) 네이티브 섬유 서열 이외에 또는 이것 대신에 비네이티브 아미노산 서열을 지닌 키메라 섬유 단백질, (b) 치료 유전자, 및 임의로 (c) 네이티브 섬유 아미노산 트라이머화 도메인 대신 비네이티브 트라이머화 도메인을 포함하는 재조합 아데노바이러스에 관해 기재하고 있다. 비네이티브 아미노산 서열은 단백질 결합 서열일 수 있고, C-말단에 위치할 수 있다.
국제 특허 공개 WO 97/20051은 야생형 코트 단백질을 지닌 벡터보다 좀더 효과적으로 세포로의 벡터 진입을 지시할 수 있는 비네이티브 아미노산 서열을 지닌 키메라 아데노바이러스 코트 단백질에 관해 기재하고 있다. 비네이티브 서열은 코트 단백질의 C-말단 또는 근처에, 또는 코트 단백질의 노출된 루프에서 내부 코트 단백질 서열중으로 삽입되거나 이를 대신하여 삽입될 수 있다. 코트 단백질은 섬유 단백질, 펜톤 염기 단백질, 또는 헥손 단백질일 수 있다. 스페이서 서열이 포함될 수 있다.
기타 표적화 기술은 예를 들면 브리징 표적화 그룹 또는 표적화 그룹의 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 바이러스 코트 단백질의 후기-발현 변형에 좌우된다(예, 국제 특허 출원 WO 97/05266; 국제 특허 공개 WO 97/23608; 국제 특허 공개 WO 97/32026 참조).
이러한 노력에도 불구하고, 캡시드 표면에 정확히 전개되어 바이러스 증식 및 이의 동종 수용체(들)와의 특이적 결합을 가능케 하기위해 결합 단백질의 적당한 삽입 방식을 확인할 필요가 있다.
또한 이러한 서열을 인식할 수 있는 중요 파라미터를 규정할 필요가 있다. 업계에서는 또한 생체내 표적 세포로 아데노바이러스 벡터를 지시하기에 적당한 특정 표적화 펩티드 서열을 제공할 필요가 있다. 업계의 이들 및 기타 필요성에 대해 본 발명이 어드레싱하고 있다.
본원에서 인용된 간행물은 이러한 간행물이 본 출원에 대한 "선행 기술"로서 유용하다는 인증서로서 해석되어서는 안된다. 각각의 문헌은 본 출원에서 참고 문헌 형식으로 인용된다.
발명의 요약
본 발명은 유리하게도 효과적인 표적화된 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명의 표적화된 벡터는 헥손 단백질 또는 섬유 단백질의 유효 부위로부터 아미노산의 적절한 결실이 특징적이다. 이에 따라, 좀더 구체적인 양태에서, 본 발명은 헥손 HRV5 루프의 최소 일부가 결합 펩티드, 또는 표적화 서열로 대체되어, 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내도록 연결 아미노산 스페이서에 의해플랭킹되는 아데노바이러스에 관한 것이다. 특정 양태에서 아데노바이러스는 헥손 HVR5 루프로부터 약 6 내지 17개 아미노산의 결실(바람직하게는 14개 아미노산을 초과하지 않음)을 포함한다.
기타 특정 양태에서 본 발명은 섬유 HI 루프의 최소 일부가 결합 펩티드, 또는 표적화 서열로 대체되어, 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내도록 연결 아미노산 스페이서에 의해 플랭킹되는 아데노바이러스에 관한 것이다. 특정 양태에서 아데노바이러스는 헥손 HI 루프로부터 약 6 내지 17개 아미노산의 결실(바람직하게는 11개 아미노산을 초과하지 않음)을 포함한다.
추가 양태에서 본 발명은 결합 펩티드 또는 표적화 서열이 연결 스페이서 또는 링커에 의해 섬유의 C-말단에 연결되어, 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내는 재조합 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다.
좀더 구체적인 양태에서, 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 약 13개의 아미노산이 헥손 HVR5 루프로부터 결실된다. 또다른 특정 양태에서, 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 약 11개 아미노산이 섬유 단백질 HI 루프로부터 결실된다. 표적화 펩티드가 결실 부위에 삽입된다. 본 발명의 특정 이점은 표적화 펩티드 서열이 표적화 서열의 N-말단에 놓인 제1 스페이서와 C-말단에 놓인 제2 스페이서에 의해 연결되어야 한다는 발견에 있으며, 여기서 스페이서는 유연성 아미노산 잔기를 포함한다. 바람직하게는, 제1 스페이서 또는 제2 스페이서, 또는 둘모두 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함한다.
특정 측면에서, 헥손 단백질에서 변형된 표적화된 아데노바이러스는 유리하게도 유연성 아미노산 잔기로 이루어진 디펩티드 스페이서를 이용한다. 특정 양태에서, 제1 및 제2 스페이서는 Gly-Ser 디펩티드이다. 이러한 측면의 추가 특정 양태에서, 제1 스페이서는 글라이신 잔기이다.
섬유 단백질 HI 루프가 변형되는 본 발명의 측면에서, 제1 및 제2 스페이서는 유리하게는 유연성 아미노산 잔기로 이루어진 트리-펩티드이다. 본 발명의 이러한 측면의 특정 양태에서, 제1 및 제2 스페이서는 Gly-Ser-Ser 트리 펩티드이다.
바람직하게는, 표적화 서열은 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)에 대한 리간드 에피토프이다. 특히, 표적화 서열은 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2); AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); 및 NQNSRRPSRA(서열 번호:6)로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있다.
헥손 단백질이 변형되는 또다른 양태에서, 스페이서를 포함하는 표적화 서열은
gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:7);
gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:8);
gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser (서열 번호:9);
gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser (서열 번호:10);
gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:11);
gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:12);
gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser (서열 번호:13);
gly-ser-DCRGDCF-gly-ser (서열 번호:14); 및
gly-ser-KKKKKKK-gly-ser (서열 번호:15)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
섬유 단백질이 변형되는 또다른 양태에서, 스페이서를 포함하는 표적화 서열은
gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:16);
gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:17);
gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser (서열 번호:18);
gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser (서열 번호:19);
gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser (서열 번호:20);
gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser (서열 번호:21);
gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser (서열 번호:22);
gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser (서열 번호:23);
gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser (서열 번호:24);
ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:143);
tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:144);
tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:145);
ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:146); 및
ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly (서열 번호:147)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
바람직하게는 연결 스페이서 또는 링커는 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함한다. 바람직한 양태에서 스페이서에서 최초 아미노산은 프롤린이다.
재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청타입, 특히 인간 아데노바이러스 혈청타입 5와 같은 인간 아데노바이러스 서브그룹 C에서 유도될 수 있다. 섬유 단백질은 특히 프레임 내부 결실에 의하거나 또다른 혈청타입의 샤프트로 대체함으로써 야생형 섬유 샤프트보다 짧은 섬유 샤프트를 가지도록 변형될 수 있다. 섬유 샤프트는 서브그룹 C에서 나온 것으로서 반복부 4-16 또는 반복부 4-19를 내포한 프레임 내부 결실을 포함하거나 서브그룹 C에서 나온 것으로서 혈청타입 3(Ad3)의 샤프트로 대체시켜 짧아진다.
본 발명의 또다른 측면에 따르면(헥손 또는 섬유의 변형), 섬유 단백질은 야생형 서열보다 짧게 변형될 수 있다. 예를 들어, 섬유 단백질은 오직 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22; Ad5의 반복부 1-3 및 20-22; 또는 내인성 Ad5 샤프트 대신 아데노바이러스 혈청타입 3(Ad3) 샤프트를 함유하도록 변형될 수 있다.
특정 양태에서, 하기에 예시된 바와 같이, 아데노바이러스는 혈청타입 5 아데노바이러스이다. 추가 양태에서, 본 발명은 섬유 단백질의 C-말단에 링커 펩티드와 표적화 펩티드를 포함하는 특이적 표적화된 아데노바이러스 벡터를 제공한다.바람직하게는, 표적화 서열은 7 내지 15개 아미노산을 포함한 헤파린에 결합하는 FGF-1의 펩티드 분획인 CD87과 같은 UPAR에 대한 리간드이고, 5 내지 10개 라이신 잔기, 바람직하게는 대개 7개의 라이신 잔기로 이루어지거나, 5 내지 10개의 Arg-Arg 및 Leu-Leu 모티프로 이루어진다.
바람직하게는, 표적화 서열은 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2); AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); NQNSRRPSRA(서열 번호:6); RRLLRRLLRR(서열 번호:133); 및 KRGPRTHYGQK(서열 번호:134)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는 링커 펩티드는 서열 PKRARPGS(서열 번호:149)를 포함하고 링커 펩티드를 포함하는 표적화 서열은 서열 PKRARPGSKKKKKKK(서열 번호:132), PKRARPGSRRLLRRLLRR(서열 번호 141) 또는 PKRARPGSKRGPRTHYGQK(서열 번호 140)을 포함한다.
본래, 표적화된 아데노바이러스에 관해 앞서 기재되었고 본원에서 보다 상세히 설명하겠지만, 본 발명은 아데노바이러스의 캡시드 단백질의 일 부위로부터 네이티브 아미노산 서열을 결실시킨 다음; 표적화 서열의 N-말단에 놓인 제1 스페이서와 C-말단에 놓인 제2 스페이서에 의해 연결되는 표적화 펩티드 서열을 삽입(여기서 스페이서는 유연성 아미노산 잔기를 포함함)시키는 단계를 포함하는, 아데노바이러스 벡터의 세포 트로피즘을 변형시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에 따르면, 표적화 펩티드는 아데노바이러스 Ad5의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 헥손 HVR5 루프의 약 13개 아미노산과; Ad5의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 섬유 단백질 HI 루프의 대략 11개 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 결실 부위에 삽입된다. 바람직한 양태에서, 제1 스페이서는 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함한다. 또다른 바람직한 양태에서, 제2 스페이서는 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함한다.
또한 본 발명은 하기를 포함한다:
· 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 HVR5 루프의 약 13개 아미노산의 결실 및 표적화 서열의 N-말단에 놓인 제1 스페이서와 C-말단에 놓인 제2 스페이서에 의해 연결되는 표적화 펩티드 서열의 결실 부위에서의 삽입을 포함하는 아데노바이러스 헥손(여기서 제1 및 제2 스페이서는 유연성 아미노산 잔기를 포함함).
· 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 HI 루프의 약 11개 아미노산의 결실 및 표적화 서열의 N-말단에 놓인 제1 스페이서와 C-말단에 놓인 제2 스페이서에 의해 연결되는 표적화 펩티드 서열의 결실 부위에서 삽입을 포함하는 아데노바이러스 섬유 단백질 (여기서 제1 및 제2 스페이서는 유연성 아미노산 잔기를 포함함).
· C-말단에 링커 펩티드와 표적화 펩티드를 포함하는 아데노바이러스 섬유 단백질.
본 발명은 또한 구체적으로 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)를 발현시키는 세포를 표적화하는 방법을 제공한다. 특히, 본 방법은캡시드 표면에 앞서 기재된 특정 UPAR 표적화 펩티드를 노출시키도록 변형된 아데노바이러스의 사용을 포함한다. 달리, 본 발명은 앞서 정의된 스페이서 그룹을 포함한 특정 서열을 삽입시켜 헥손 HVR5 루프 또는 섬유 단백질 HI 루프를 변형시킨다.
본 발명에 따라 특정 세포 타입을 표적화하는 방법은 예를 들면 섬유 샤프트가 단지 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22; Ad5의 반복부 1-3 및 20-22; 또는 Ad3 샤프트를 함유하도록 섬유 단백질 샤프트를 짧게 함으로써 추가로 향상될 수 있다. 반복부는 Chroboczek 등(1995, Current Topics in Microbiology and Immunology, Springer Verlag, 199:163-200)이 기재하고 있다.
본 발명은 추가로 표적 세포를 함유한 세포 집단을 본 발명의 표적화된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한 표적 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법을 제공하며, 여기서 표적화 서열은 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 에피토프이다. 특히, 본 발명은 표적 세포를 함유한 세포 집단을 UPAR 결합 펩티드를 드러내도록 변형된 본 발명의 표적화된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한, UPAR를 발현시키는 표적 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 이러한 양태에서, 표적화된 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 종양 세포와 이의 전이, 종양 혈관계, 활성화된 내피 세포, 활성화된 평활근 세포 등을 포함한 활성 분열 및/또는 운동 세포의 형질도입을 위한 이종 치료 유전자 또는 핵산을 포함한다. 그러나, UPAR 표적화된 벡터는 또한 근육, 뇌, 심장 등과 같은 기타 조직의 형질도입을 위한 후보자 벡터로 간주될 수 있다. 좀더구체적으로 말하면, 핵산은 안기오게네시스 억제제, 안기오게닉 인자, 조건부 자살 효과기, 종양 억제제, 증식-억제 단백질(GAX), 또는 임의 분비된 폴리펩티드로서 작용하는 치료 폴리펩티드를 암호화 한다.
특히, 본 발명은 표적 세포를 함유하는 세포 집단을 인테그린 결합 펩티드를 드러내도록 변형된 본 발명의 표적화된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함한, 인테그린을 발현시키는 표적 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법을 제공한다. 이러한 양태에서, 표적화된 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 종양 세포와 이의 전이, 종양 혈관계, 활성화된 내피 세포, 활성화된 평활근 세포 등을 포함한 활성 분열 및/또는 운동 세포의 형질도입을 위한 치료 유전자 또는 핵산을 포함한다. 그러나, 인테그린 표적화된 벡터는 또한 골격근, 뇌, 심장, 조혈 세포, 국소 빈혈 조직 등과 같은 기타 조직의 형질 도입을 위한 후보자 벡터로 간주될 수 있다. 좀더 구체적으로 말하면, 핵산은 안기오게네시스 억제제, 안기오게닉 인자, 조건부 자살 효과기, 종양 억제제, 증식-억제 단백질(GAX), 세포 생존-촉진 인자(특히 Akt/PKB과의 부류에서) 또는 임의 분비된 폴리펩티드로 작용하는 치료 폴리펩티드를 암호화 한다.
이에 따라 본 발명의 추가 목적은 앞서 기재되거나, 앞서 기재된 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 유전자 요법에 의한 질병 치료 방법이다.
본 발명의 또다른 목적은 앞서 기재되거나 앞서 기재된 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터를 함유한 약제, 및 유전자 요법에 의한 질병 치료를위한 약제 제조를 위해 이러한 표적화된 아데노바이러스 벡터의 사용에 있다. 본 발명의 또다른 목적은 이러한 표적화된 아데노바이러스 벡터와 유효량의 약학적으로 허용가능한 부형제를 함유한 약학 조성물에 있다.
이에 따라, 본 발명의 목적은 벡터의 생산성에 악영향을 미치지 않고 트로피즘-변형된 아데노바이러스 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 추가 목적은 결합 펩티드가 접근가능하고 이의 특정 수용체를 효과적으로 인식하는 적당한 삽입 방식을 알아내는데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 표적화 펩티드 서열이 효과적으로 삽입될 수 있도록 네이티브 아데노바이러스 캡시드 단백질로부터 결실될 수 있는 아미노산 잔기의 수를 알아내는 데 있다.
본 발명의 또다른 목적은 표적 수용체에 효과적으로 결합하는 접근가능한 형태의 표적화 펩티드가 적응하도록, 삽입되는 표적화 펩티드의 말단에 포함되는 스페이서 서열의 효과적인 크기 및 특징을 제공하는데 있다.
본 발명의 이들 및 기타 목적은 첨부된 도면과 하기의 상세한 설명에 의해 부가적으로 제공된다.
본 발명은 표적화 아미노산 서열을 포함하도록 섬유 또는 헥손 단백질의 표면 접근 부위를 변형시키는 아데노바이러스 벡터의 효과적인 표적화에 관한 것이다. 본 발명의 성공을 위한 핵심은 표적화 서열의 인식가능한 결합 구조를 제공함에 있어 삽입되는 표적화 서열의 N-말단과 C-말단에 놓인 부가적인 스페이서 아미노산 잔기가 중요하다는 발견에 있다. 이에 따라, 표적화 서열의 접근성과 기능성 및 변형된 단백질의 구조는 이웃한 스페이서의 크기 및 성질에 매우 의존적이다. 기타 결과는 짧은 표적화 펩티드가 섬유 단백질의 C-말단에 효과적으로 융합될 수 있음을 보여준다. 본 발명은 부가적으로 시험관내 및 생체내에서 치료 유전자를 특정 표적 세포로 전달하는 이러한 벡터의 용도에 관한 것이다.
도 1. 헥손 HVR5 영역이 변형된 바이러스를 이용한 W162 세포상에서 중화 분석.
도 2. 아데노바이러스 혈청타입 3(Ad3) 샤프트가 Ad5 샤프트 대신 삽입되는 짧아진 섬유 구성물의 구조.
도 2a: 하이브리드 Ad3/5 섬유의 일반적인 설명;
도 2b: 하이브리드 Ad3/5 섬유의 상세한 설명
도 3: 293 세포에서 노브 경쟁.
도 4: 가용성 헤파린의 증가량에 따른 각종 바이러스를 이용한 hSMC의 감염.
도 5: 가용성 uPAR의 양을 증가시키면서 미리배양된 바이러스로 hSMC 감염.
도 6 및 7: 표적화된 아데노바이러스로 감염된 인간 SMC에서 Gax 발현.
도 8a-8c 및 9: 상이한 표적화된 바이러스를 이용한 Hs578T의 감염.
도 10: 가용성 uPAR을 증가시키면서 미리배양된 바이러스 AE43으로 Hs578T의 감염.
도 11: 가용성 uPAR 또는 가용성 노브의 양을 증가시키면서 미리배양된 바이러스 AE43으로 Hs578T의 감염.
도 12: Vn4 함유 바이러스를 이용한 Hs578T의 감염.
도 13: 넓은 범위의 표적화된 바이러스를 이용한 NIH-3T3의 감염.
도 14a 및 14b: 가용성 uPAR의 양을 증가시키면서 미리배양된 바이러스 BC15X(A) 및 AE43(B)를 이용한 Hs578T의 감염.
앞서 기재한 바와 같이, 아데노바이러스에 의해 효과적으로 감염되지 않는 세포를 포함한 특정 표적 세포에 아데노바이러스 벡터를 표적화하기 위해 아데노바이러스 트로피즘을 변형시키는 일이 업계의 주된 관심사였다. 이를 달성한 몇몇 성공 사례가 있었지만, 본 발명자는 이러한 문제의 실제적 해결, 즉 바이러스 생산성에 악영향을 미치지 않으면서 세포 특이성을 만족스럽게 증가시키는 해결책은 달성되지 않은 것으로 인식한다. 특히, 바이러스 캡시드 단백질에 표적화 펩티드의 도입을 위한 최적 부위, 네이티브 캡시드 단백질에서 결실 크기(존재한다면), 삽입된 표적화 서열의 크기, 및 표적화 서열을 캡시드 단백질에 연결하는 임의 링커 서열의 존재 및 성질에 관해서는 선행 기술에 기재된 적이 없다. 본 발명은 유리하게는 이들 쟁점을 어드레싱하고 있으며, 표적화 펩티드를 위한 공간을 제공하도록 결실되는 네이티브 서열의 크기를 포함한 표적화 서열의 삽입을 위해 최적화된 부위를 제공하고; 표적화 서열을 위한 적절한 크기를 알아낸 다음; 접근성과 표적화 펩티드의 특정 인식을 가능케하는 링커의 크기 및 특성을 알아내고; 관련 세포 마커를 표적 수용체로서 확인함으로써 매우 효과적인 표적화를 제공하고 있다.
특히, 본 발명자는 아데노바이러스 캡시드의 표면에 접근가능한 외래 펩티드를 도입시키고, 이에 따라 바이러스의 본래 트로피즘의 변형을 시도했다. 명심할 사항은, 폴리오바이러스 타입 1의 중화 에피토프가 도입된 변형된 헥손 또는 섬유를 지닌 일련의 작제물을 제작했다. 폴리오바이러스 서열은 동종 중화 항체가 이의 접근성과 작용성을 좀서 상세히 기록하는데 쉽게 활용되도록 선택되었다.
특정 표적 세포로 감염을 제한하도록 헥손과 섬유의 변형은 아데노바이러스 섬유가 네이티브 세포 수용체와 효과적으로 상호작용할 수 없도록 요구한다. 헥손 변형된 캡시드의 경우, 또한 결합 펩티드가 섬유로부터 입체 장해없이 세포 표면상에 동종 수용체와 직접 상호작용할 수 있을 것을 요하다. 이를 위해, 섬유 샤프트를 단축시킬 가능성을 조사했다.
본 발명은 부분적으로는 헥손 단백질과 섬유 단백질에 기능성 표적화 서열을 삽입시키기에 적당한 부위를 확인하는 실험에 근거한다. 헥손 HVR5 루프와 섬유 HI 루프 일부를 대체하여 바이러스 생산성에 악영향을 미치지 않고 표적화 서열을 삽입할 수 있음을 발견했다. 또한, 데이터는 삽입된 서열의 말단에 유연성 링커 펩티드의 도입이 표적화 서열의 접근능력 또는 인식에 중요함을 보여주었다. 또한, uPAR 또는 몇몇 인테그린에 특이적인 리간드의 도입이 시험관내 및 생체내 실험에서 알 수 있듯이 리간드의 접근능력, 변형된 바이러스의 생산성, 표적 세포 타입의 형질도입 효율면에서 성공적으로 달성되었다. 마지막으로, 또한 섬유의 단축이 본래 숙주 세포에 대한 바이러스 친화성을 효과적으로 감소시켜, Ad5의 본래 트로피즘의 제거에 매우 효과적이도록 해준다.
바람직한 양태에서, 여러 접근법을 조합했다. 바람직하게는, 섬유 단백질은 변형된 헥손 HVR5 루프 또는 섬유 HI 루프를 지닌 바이러스에서 짧아진다. 추가 예에서, 짧아진 섬유를 지닌 바이러스는 감염의 1차 단계로서 UPAR를 표적화하기 위해 HI 루프 또는 HVR5에 삽입을 가질 수 있고, 엔도솜에서 바이러스의 내부화를 선호하기 위해 인테그린을 표적화하도록 (각각) HI 루프 또는 HVR5에서 삽입을 가질 수 있다. 임의의 적당한 막 수용체는 또한 동일한 방법, 즉 섬유를 짧게하면서 헥손 및/또는 섬유에 높은 친화성 리간드를 도입하여 표적화될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명은 구체적 정의, 아데노바이러스 벡터, 표적화 펩티드 서열, 및 표적화된 아데노바이러스 벡터의 용도에 관한 단락으로 짜여져 있다. 각종 단락의 헤더와 구조는 명확성과 편의를 위한 것으로 제한을 위한 목적은 아니다.
정의
상세한 설명과 청구항 전체에 걸쳐 각종 용어가 사용되고 있다. 달리 정의된 바가 없으면, 하기 정의가 적용된다:
업계에 사용된 <<벡터>>는 본 발명에 따른 핵산을 숙주 세포로 전달하는 임의 수단이다. 본 발명의 목적상, 용어 벡터는 아데노바이러스가 관련 핵산(발현 제어 서열의 통제하에 있거나, 이에 작동적으로 연결된 유전자)을 표적 세포로 전달하는 유전 공학 기법을 반영하기 위해 "아데노바이러스"를 변형하여 사용된다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 하기에 좀더 상세히 기재되어있다.
세포는 바이러스 DNA가 세포내부로 도입될 때 본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의해 "형질감염"되거나 "감염"되어진다. 세포는 형질감염된 DNA가 표현형에 변화를 일으킬 때 외생 또는 이종 DNA에 의해 "형질전환"된다.
본원에서 사용된 용어 "상응하는"은 정확한 위치가 유사성 또는 상동성이 측정된 분자와 일치하든 상이하든 상관없이 유사하거나 상동인 서열을 말한다. 핵산 또는 아미노산 서열 배열은 스페이서를 포함할 수 있다. 이에 따라, 용어 "상응하는"은 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 수가 아닌, 서열 유사성을 말한다. 예는 본원에 예시된 타입 5 아데노바이러스(Ad5) 이외에 다른 아데노바이러스 혈청타입(2,3 등)의 헥손 단백질 또는 섬유 단백질을 포함한다. 당업자는 상동성 아데노바이러스 캡시드 단백질에 정통하다.
즉, 본 발명은 Ad5의 경우 본원에서 정의된 최적화된 파라미터를 이용하여기타 아데노바이러스 종의 상동성 캡시드 단백질을 변형시킨다. 본원에서 사용된 용어 "상동성"(모든 문법 형태 및 철자 변형에서)은 상위 과(superfamily)(예, 면역글로불린 상위 과)의 단백질을 포함한, "공통 진화 기원"을 보유하는 단백질과 여러 종의 상동성 단백질(예, 마이오신 경쇄 등)(Reeck et al., 1987, Cell 50:667)들간의 상관관계를 말하다. 이러한 단백질들 (및 이의 암호 유전자들)은 높은 정도의 서열 유사성이 반영하듯이 서열 상동성을 가진다.
용어 "결실"은 아데노바이러스 캡시드 단백질의 한정된 영역, 즉, 헥손 또는 섬유 단백질로부터 네이티브 아미노산 잔기의 제거를 말한다. 본 발명에 따르면, 이러한 결실을 위한 바람직한 크기는 약 10 내지 약 20개 아미노산이다. 좀더 바람직하게는, 결실 크기는 약 10 내지 약 15개 아미노산이다. 특정 양태에서, 1 내지 13개 아미노산 서열이 결실된다.
본원에서 사용된 용어 "스페이서" 또는 "스페이서 펩티드" 또는 <<링커>> 또는 <<링커 펩티드>>는 결합 펩티드를 캡시드 캐리어 단백질에 연결하도록 포함된 약 1 내지 약 3개 아미노산 서열을 말한다. 스페이서 또는 링커는 바람직하게는 결합 파트너(예, 수용체)에 의해 인식되는 형태에 표적화 펩티드를 적응시키는 높은 정도의 회전이 자유로운 아미노산 잔기로 이루어진다. 바람직하게는 단 3개의 아미노산이 스페이서에 포함되고; 좀더 바람직하게는, 스페이서는 2개의 아미노산으로 구성된다. 스페이서를 위한 바람직한 아미노산은 글라이신과 세린이다. 특정 양태에서, 스페이서는 서열 Gly-Ser 또는 Gly-Ser-Ser을 지닌 펩티드이다.
본원에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 주어진 값 또는 범위의 20%, 바람직하게는 10%, 좀더 바람직하게는 5% 이내를 의미한다.
아데노바이러스 벡터
아데노바이러스는 본 발명의 핵산을 각종 세포 타입에 효과적으로 전달하도록 변형될 수 있는 진핵 생물 DNA 바이러스이다. 각종 혈청타입의 아데노바이러스가 존재한다. 이들 혈청타입 중, 본 발명의 범위내에서는 타입 2 또는 타입 5 인간 아데노바이러스(Ad2 또는 Ad5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용함이 바람직하다(WO94/26914 참조). 본 발명의 범위내에 사용될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 새, 및 원숭이(예:SAV) 기원의 아데노바이러스를 포함한다. 바람직하게는, 동물 기원의 아데노바이러스는 개 아데노바이러스이고, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스이다(예, Manhattan 또는 A26/61 균주(ATCC VR-800)).
아데노바이러스 벡터는 보통 시험관내, 생체내 또는 생체외 형질감염 또는 유전자 요법 과정에 이용된다. 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터는 복제 결손이며, 즉, 표적 세포에서 자가 복제할 수 없다. 일반적으로, 본 발명의 범위내의 복제 결손 바이러스 벡터의 게놈은 감염된 세포에서 바이러스 복제에 필요한 적어도 일 영역이 결여되어있다. 이들 영역은 (전체 또는 부분) 제거되거나, 업계의 숙련인에게 알려진 기술에 의해 비-기능화될 수 있다. 이들 기술은 전체 제거, (기타 서열, 특히 삽입된 핵산에 의해) 치환, 바이러스 증식을 위해 필요한 영역에 1 이상의 염기의 부분 결실 또는 첨가를 포함한다. 이러한 기술은 유전자 조작 기술을 이용하거나 돌연변이제 처리에 의해 시험관내(분리된 DNA에서) 또는 현장에서 수행될 수 있다. 본 발명의 목적상, 복제 결손 바이러스는 바이러스 입자를 캡시드화하는데 필요한 게놈 서열을 보유한다. 바이러스 유전자 전부 또는 거의 완전히 결핍된 결손 바이러스도 이용될 수 있다.
본 발명의 복제 결손 아데노바이러스 벡터는 적어도 ITR, 캡시드화 서열 및 관련 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 아데노바이러스 벡터의 적어도 E1 영역은 비-기능화된다. E1 영역의 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스 서열의 뉴클레오티드 455에서 3329(PvuII-Bg1II 분획) 또는 382에서 3446(HinfII-Sau3A 분획), 또는 382-3512(HinfI-RsaI 분획)에 이른다. 기타 영역, 특히 E3 영역(WO95/02697), E2 영역(WO94/28938), E4 영역(WO94/28152, WO94/12649 및 WO95/02697), IVa2 영역(WO96/10088) 또는 후기 유전자 L1-L5도 변형될 수 있다.
바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역(Ad 1.0)에 결실을 가진다. E1-결실된 아데노바이러스의 예가 1997년 11월 11일자에 출원된 EP 185,573 및 FR 97/14383에 기재되어 있으며, 이들은 본원에서 참고된다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1과 E4 영역에 결실을 가진다(Ad 3.0). E1/E4-결실된 아데노바이러스의 예는 WO95/02697 및 WO96/22378에 기재되어 있으며, 본원에서 참고된다. 또다른 바람직한 양태에서, 아데노바이러스 벡터는 E1 영역에 결실을 가지며 여기에 E4 기능성 영역과 핵산 서열이 삽입된다(FR94 13355 참조, 본원에서 참고됨). 본 발명에 유용한 또다른 아데노바이러스 벡터는 WO96/10088에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 복제 결손 재조합 아데노바이러스는 업계의 숙련인에게 알려진 임의 기술에 의해 제조될 수 있다(Levrero et al., 1991, Gene 101: 195; EP 185 573; Graham, 1984, EMBO J. 3:2917). 특히, 이는 관련 DNA 서열을 운반하는 아데노바이러스와 플라스미드간의 상동 재조합에 의해 제조될 수 있다. 상동 재조합은 적절한 세포주에 아데노바이러스와 플라스미드의 공형질감염에 이어 수행된다. 이용되는 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해 형질전환될 수 있고, (ii) 바람직하게는 재조합 위험을 피하기 위해 통합된 형태로 재조합 결손 아데노바이러스의 게놈 일부를 보완할 수 있는 서열을 함유해야 한다. 이용될 수 있는 세포주의 예는 게놈, PER.C6(Bout et al., 1997, Cancer Gene Therapy 4:324; Fallaux et al, 1998, Hum Gen Ther 9:1909-1917) 중으로 통합된 Ad5 아데노바이러 게놈의 좌측 부위(12%)를 함유하는 인간 배 신장 세포주 293(Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59), 및 E1 및 E4 기능을 보완할 수 있는 세포주이고, 이들은 출원 WO94/26914 및 WO95/02697에 기재되어 있다. 바람직한 양태에서는, 이.콜라이(E. coli) 벡터 시스템을 이용하여 아데노바이러스 백본을 생성한다(국제 특허 공개 WO 96/25506; Crouzet et al. 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1414-1419).
실제로, 본 발명의 아데노바이러스를 제조하는 일반적인 기술은 업계에 익히 알려져 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(본원에서 "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes Iand II(D.N.Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization[B.D. Hames & S.J. EHiggins eds. (1985)]; Transcription And Translation[B.D. Hames & S.J.Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I.Freshney, ed.(1986)]; Immobilized cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B.EPerbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc (1994) 참조. 카세트 삽입 부위 도입은 이종 유전자의 삽입의 경우든 헥손 또는 섬유 단백질에 표적화 서열의 삽입이든 상관없이(하기에 예시됨) 이러한 유전자 조작을 촉진한다. "카세트"는 벡터의 특정 제한 부위로 삽입될 수 있는 DNA의 단편을 말한다. DNA 단편은 관련 폴리펩티드를 암호화 하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 해독을 위한 적절한 리딩 프레임에 카세트가 도입되도록 고안된다.
당업자에게 익히 알려진 표준 분자 기술을 이용하여 재조합 아데노바이러스를 회수 및 정제한다(국제 특허 공개 WO 98/00524, 국제 특허 공개 WO96/27677 및 국제 특허 공개 WO 97/08298참조).
본 발명의 아데노바이러스 벡터에 의한 이종 유전자의 발현 .본 발명의 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 이종 유전자를 위한 DNA 암호 서열을 함유한다. DNA "암호 서열"은 전사되어 적절한 조절 서열의 통제하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내 세포에서 폴리펩티드로 해독되는 이중-가닥 DNA 서열이다. 암호 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 출발 코돈과 3'(카복실) 말단에서 해독 종결 코돈에 의해 결정된다. 암호 서열은 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA에서 나온 cDNA, 진핵 생물(예, 포유동물) DNA의 게놈 DNA 서열, 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 암호 서열이 진핵 생물 세포에서 발현된다면, 폴리아데닐화 시그널 및 전사 종결 서열은 보통 암호 서열에 대해 3'에 위치될 것이다. 암호 서열은 RNA 폴리머라제가 암호 서열을 mRNA로 전사한 다음, 트랜스-RNA가 스플라이싱되어 암호 서열에 의해 암호화된 단백질로 해독될 때 세포에서 전사 및 해독 제어 서열의 "통제하"에 있다. 또다른 양태에서, 관련 핵산은 폴리펩티드로 해독되지 않고 특정 안티-센스 치료 분자, 또는 치료 데코이(decoy)로 작용한다.
전사 및 해독 제어 서열은 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 DNA 조절 서열이며, 이는 숙주 세포에서 암호 서열을 발현시킨다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 시그널이 제어 서열이다. "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제와 결합하여 하류 (3' 방향) 암호 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명의 정의의 목적상, 프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 3' 말단에 부착하여 상류 (5' 방향)으로 확장되어 백그라운드 이상으로 검출가능한 수준의 전사를 개시하는데 필요한 최소한의 염기 또는 요소를 포함한다. 프로모터 서열내에서 전사 개시 부위(편의상 예를 들어 뉴클레아제 S1을 이용한 유전자 지도에 의해 규정됨)와, RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)이 발견될 것이다.
이종 단백질의 발현은 업계에 알려진 임의 프로모터/인핸서 요소에 의해 제어될 수 있지만, 이들 조절 요소는 발현을 위해 선택된 표적 세포에서 작용해야 한다. 유전자 발현을 제어하는데 이용될 수 있는 프로모터는 사이토메갈로바이러스직접 초기(CMV-IE 또는 CMV) 프로모터, SV40 초기 프로모터 영역(Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 허프스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al., 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78:1441-1445), 메탈로티오나인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스게닉 동물에 이용되는 동물 전사 제어 영역: 췌장 acinar 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 제어 영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol.Cell.Biol.7:1436-1444), 고환, 유방, 림프구 및 마스트 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 제어 영역(Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.1:268-276), 배 간 및 간암에서 활성인 알파-페토프로테인 유전자 제어 영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648, Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 제어 영역(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, cell 46:89-94), 뇌의 핍지신경교 세포에서 활성인 마이엘린 기본 단백질 유전자 제어 영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), 골격근에서 활성인 마이오신 경쇄-2 유전자 제어 영역(Sani, 1985, Nature 314:283-286), 및 시상하부에서 활성인 생식선자극물 방출 호르몬 유전자 제어 영역(Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"시그널 서열"은 세포 표면에 보내지거나 분비되는 단백질의 암호 서열의 개시부에 포함된다. 이러한 서열은 폴리펩티드를 분비 경로/구획으로 위치시키도록 숙주 세포를 지시하는 성숙 폴리펩티드에 대한 N-말단의 시그널 펩티드를 암호화 한다. 본원에서 사용된 용어 "전위 시그널 서열"은 이러한 종류의 시그널 서열을 말한다. 전위 시그널 서열은 진핵생물과 원핵생물에 네이티브한 각종 단백질과 함께 발견될 수 있고, 종종 두 종류의 미생물에서 작용한다.
특정 이종 유전자는 하기 본 발명 벡터의 사용에 관한 단락에서 논의된다.
표적화 펩티드 서열
임의의 공지된 표적화 서열은 본 발명에 따라 헥손 HVR5 루프 또는 섬유 단백질에 도입될 수 있다. 표적화 펩티드의 예가 문헌에 방대하게 실려있다. 일반적으로, 임의 펩티드 리간드가 리간드의 수용체-결합 서열에 기초한 표적화 서열을 제공할 수 있다. 면역학에서, 이러한 서열은 에피토프로 불리고, 용어 에피토프는 본원에서 수용체에 의해 인식된 리간드 서열을 말하는데 이용될 수 있다. 구체적으로 말해서, 용어 "수용체의 리간드 에피토프"는 편의상 수용체로 불리는 표적 세포 표면상의 결합 파트너에 의해 인식되는 단백질 또는 펩티드 서열을 말한다. 그러나, 본 발명의 목적상, 용어 "수용체"는 표적 세포의 표면에 위치하여 접근가능한 시그널-형질도입 수용체(예, 호르몬, 스테로이드, 사이토킨, 인슐린, 및 기타 생장 인자에 대한 수용체), 인식 분자(예, MHC 분자, B- 또는 T-세포 수용체), 영양소 흡수 수용체(예, 트랜스페린 수용체), 렉틴, 이온 채널, 부착 분자, 세포외 매트릭스 결합 단백질 등을 포함한다. 본 발명의 표적화 펩티드는 이러한 수용체상의 폴레핍티드 또는 카보하이드레이트 부위와 결합할 수 있다.
표적화 펩티드의 크기는 특정 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 실시예에서 알 수 있듯이, 결실된 서열보다 긴 삽입 펩티드는 바이러스 생산성에 악영향을 미치지 않았다. 이에 따라, 본 발명은 결실된 단편보다 몇배 긴 표적화 서열의 이용을 고려중이며; 바람직하게는, 삽입된 펩티드는 결실된 단편보다 단지 200% 정도 길며, 좀더 바람직하게는 삽입된 펩티드는 결실된 단편과 대략 동일한 크기이다.
뉴클레오티드 암호 서열의 축퇴로 인해, 표적화 펩티드 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화 하는 기타 DNA 서열이 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 이들은 대립 변이체, 기타 종의 상동성 변이체, 보존 아미노산 치환이 행해진 변이체, 및 매우 다형태의 아미노산 잔기(아마도 결합 특이성에 있어 중요하지 않음)가 변화된 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 서열내부의 1 이상의 아미노산 잔기는 대등한 작용을 하는 유사한 극성의 또다른 아미노산에 의해 치환되어, 침묵 변형이 이루어질 수 있다. 서열 내부의 아미노산 치환은 아미노산이 속하는 부류의 기타 멤버 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 무극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판및 메티오닌을 포함한다. 방향족 고리 구조를 함유한 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 및 티로신이다. 극성 중성 아미노산은 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 및 글루타민을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산은 아스파르트산과 글루탐산을 포함한다. 이러한 변형은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 등전점에 의해 측정시 겉보기 분자량에 상당한 영향을 미치지 않을 것으로 기대된다.
특히 바람직한 치환은 하기와 같다:
- Arg을 Lys로 치환 및 역으로, 양전하가 유지될 수 있음;
- Asp를 Glu로 치환 및 역으로, 음전하가 유지될 수 있음;
- Thr를 Ser로 치환, 유리-OH가 유지될 수 있음; 및
- Asn를 Gln으로 치환, 유리 CONH2가 유지될 수 있음.
각종 변이체는 매우 유사한 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 핵산은 일반적으로 네이티브 아미노산 서열을 암호화 하는 (올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는) 핵산에 하이브리드화할 것이다. 하기 실시예에 설명되어 있듯이, (PCR 프라이머)의 하이브리드화에 영향을 미치지 않고, 엔도뉴클레아제 절단 부위 또는 변형된 아미노산 잔기를 만들 수 있는 단일 염기 변화에 의해 각종 변형이 도입될 수 있다.
핵산 분자는 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 적절한 온도 및 용액 이온 세기의 조건하에 기타 핵산 분자에 어닐링될 때 cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 또다른 핵산 분자와 "하이브리드화"한다(상기 Sambrook et al., 참조). 온도 및 이온 세기의 조건은 하이브리드화의 "정확도"를 결정한다. 상동 핵산의 예비 선별을 위해, 55℃의 Tm에 해당하는 낮은 정확도 하이브리드화 조건이 이용될 수 있다(예, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 우유, 및 무(無) 포름아미드; 또는 30% 포름아미드, 5 x SSC, 0.5% SDS). 중간 정확도의 하이브리드화 조건은 보다 높은 Tm, 예를 들면 40% 포름아미드, 5 x 또는 6x SCC에 해당한다. 높은 정확도의 하이브리드화 조건은 최고의 Tm, 예를 들면 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 해당한다. 하이브리드화는 두 핵산이 상보적인 서열을 함유할 것을 요구하며, 비록 하이브리드화의 정확도에 좌우되지만, 염기들간의 미스매치도 허용한다. 핵산의 하이브리드화를 위한 적절한 정확도는 업계에 익히 알려진 변수인, 핵산의 길이 및 상보성 정도에 좌우된다. 두 뉴클레오티드 서열간의 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 이들 서열을 지닌 핵산의 하이브리드를 위한 Tm값은 커진다. 핵산 하이브리드화의 상대적 안정성(보다 높은 Tm에 해당됨)은 하기 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 길이가 100 뉴클레오티드 이상의 하이브리드화의 경우, Tm을 계산하는 방정식이 유도되었다(상기 Sambrook et al., 9.50-0.51 참조). 보다 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드화의 경우, 미스매치 위치가 좀더 중요하고, 올리고뉴클레오티드의 길이는 이의 특이성을 결정한다(상기 Sambrook et al., 11.7-11.8 참조). 바람직하게는 하이브리드화 가능한 핵산의 최소 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오티드이고; 바람직하게는 적어도 약 15개 뉴클레오티드이며; 좀더 바람직하게는 길이는 적어도 약 20개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 용어 "표준 하이브리드화 조건"은 Tm55℃를 말하고, 상술된 조건을 이용한다. 바람직한 양태에서, Tm은 60℃이고; 좀더 바람직한 양태에서, Tm은 65℃이다.
인테그린-결합 펩티드 . 표적화 펩티드 서열은 익히 알려진 인테그린-결합 펩티드를 포함한다(예, 미국 특허 4,517,686; 미국 특허 4,589,881; 미국 특허 4,661,111; 미국 특허 4,578,079; 미국 특허 4,614,517; 미국 특허 5,453,489; 미국 특허 5,627,263 참조). 기타 유용한 표적화 펩티드는 국제 특허 공개 WO98/17242 및 유럽 특허 출원 EP 773 441에 기재되어 있다.
인테그린의 표적에 관해, 앞서 지적한 바와 같이 특정 인테그린(이 중 몇몇은 여러 종양 또는 세포 타입에서 과발현됨)에 결합하는 펩티드를 기재한 다수의 간행물이 존재한다. 특정 양태에서, αv 인테그린(및 그 결과 종양 세포 및 이의 전이, 종양 혈관계, 활성화된 내피 세포, 활성화된 평활근 세포, 골격근 세포 등을 포함한 활성 분열 및/또는 이동 세포)이 예를 들어 파아지 디스플레이에 의해 선택된 펩티드를 통해 표적화된다. 본래, 예를 들어 문헌에 기재된 인테그린에 특이적인 펩티드가 본 발명에 이용될 수 있다. 인테그린의 표적화는 또한 바이러스의 내부화를 선호하고, 짧아진 섬유를 지닌 Ad의 감염성을 회복시키는 수단일 수 있다.
우로키나제 수용체 표적화된 펩티드. 하기에 예시된 특정 양태에서, 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자에 대한 수용체(UPAR; 예, CD87)를 표적화하는 펩티드가 각종 간행물에서 선택되었다. 본래, UPAR에 결합하는 펩티드를 총망라한 목록이 존재한다. UPAR에 결합하는 임의 펩티드가 사용될 수 있다.
염기성 표적화 펩티드. 본 발명의 특정 양태에서, 특히 표적화 펩티드에 대해 하기 실시예 4-6에 상세히 기재되어 있다. 예를 들어, 주로 염기성 아미노산 잔기, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘, 좀더 바람직하게는 라이신 또는 아르기닌, 또는 둘모두를 포함하는 표적화 펩티드(예, WO97/20051 참조)가 하기 실시예에 사용되었다. 또다른 예에서, RPR 특허 출원 WO95/21931에 기재된 아르기닌-루신 반복된 모티프 RRLLRRLLRR, 및 헤파린(Digabriele et al, 1998, Science, 393:812-817)에 FGF-1 결합 도메인에서 나온 펩티드 분획 KRGPRTHYGQK와 같은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 결합하는 리간드가 이용되었다.
또한, 헤파린 또는 글리코사미노글리칸에 결합하는 서열이 헤파린-형 수용체로의 결합에 수반될 수 있다(Sawitzky et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol., 182:285-91). 마찬가지로, 소위 <<헤파린 결합 서열>>은 기타 세포 표면 결합 부위, 예를 들어 세포 표면 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과 펩티드 또는 단백질의 상호작용을 매개할 수 있다(Thompson et al., 1994, J.Biol. Chem., 269:254-9).
달리, 표적화 아미노산 서열은 알파 나선의 맞은편 방향으로 마주하여 약 20 Å 떨어져 위치된 두개의 염기성 아미노산(종종 Arg)을 포함한다(Margalit et al., 1993, J.Biol.Chem., 268:19228-31; Ma et al., 1994, J. Lipid Res., 35: 2049-2059). 기타 염기성 아미노산은 한면을 마주하는 이들 두 잔기사이에 분포될 수 있지만, 무극성 잔기는 나머지 측면과 마주하여, 한쪽 측면에 격리된 염기성 잔기를 지닌 나선형 양친매성 구조를 형성한다.
또한, 표적화 서열은 피브로넥틴과 열 쇼크 단백질에 존재하는 공통의 헤파린 결합 모티프(Hansen et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1252:135-45); Lys또는 Arg, 또는 Lys와 Arg의 혼합물의 7 잔기의 삽입(Fromm et al., 1995, Arch. Biochem. Biophys., 323:279-87); 헤파린 결합 서열을 포함하는 약 18개 아미노산의 IGFBP-3 및 IGFBP-5의 공통의 염기성 C-말단 영역(Booth et al., 1995, Growth Regul., 5: 1-17); 하이알우로난(HA) 수용체 RHAMM의 C-말단의 35 아미노산 영역내에 위치된 두 HA 결합 모티프 하나 또는 둘(Yang et al., 1994, J. Cell Biochem., 56: 455-68); 헤파린-결합 컨센서스 서열을 포함하는 스타필로코커스 아루레우스(Staphylococcus aureus) 비트로넥틴의 헤파린-결합 형태 뒤에 모델링된 합성 펩티드(Ala347-Arg361)(Liang et al., 1994, J. Biochem., 116:457-63); 소 허프스바이러스 1 글리코프로테인 gIII의 아미노산 129 내지 310 사이의 5개 헤파린 결합 부위 1 이상 또는 공수병 바이러스 글리코프로테인 gIII의 아미노산 90 내지 275 사이의 4개 헤파린 결합 부위 중 하나(Liang et al., 1993, Virol., 194:233-43); 공수병 바이러스 글리코프로테인 gIII의 아미노산 134에서 141(Sawitzky et al., 1993, Med. Microbiol. Immunol., 182:285-92); 인간 리포프로테인 리파제의 위치 279-282 및 292-304에서 전하를 띤 잔기에 상응하는 헤파린 결합 영역(상기 Ma et al.); 헤파린 결합 성질을 나타내는 피브로넥틴 뒤에 모델링된 서열을 지닌 합성 22 잔기 펩티드, N22W(Ingham et al., 1994, Arch. Biochem. Biophys., 314:242-246); 알츠하이머 베타-아밀로이드 전구체 단백질(APP), 및 헤파린 친화성을 조절하는 각종 기타 APP형 단백질의 엑토도메인 아연 결합 부위에 존재하는 모티프(Bush et al., 1994, J. Biol. Chem., 229:26618-21); 라미닌 A 체인의 크로스-영역에서 유도된 8개 아미노산 잔기 펩티드(Tashiro et al., 1994,Biochem. J., 302:73-9); 펩티드 F123-G148 및 K121-A134를 포함하는 세린 프로테아제 억제제 안티트롬빈 III의 헤파린 결합 영역에 기초한 펩티드(Tyler-Cross et al., 1994, Protein Sci., 3:620-7); APP의 14 K N-말단 분획 및 헤파린 결합 영역으로 제안된 N-말단에 근접한 영역(즉, 잔기 96-110)(Small et al., 1994, J. Neurosci., 14:2117-27); 높은 함량의 라이신과 아르기닌 잔기를 특징으로 하는 헤파린 결합 경피 증식 인자-형 생장 인자(HB-EGF)의 21개 아미노산의 직선 부위(Thompson et al., 1994, J. Biol. Chem, 269:2541-9);트롬보스폰딘의 헤파린 결합 영역을 포함하고 hep 1 합성 펩티드에 상응하는 17개 아미노산 영역(Murphy-Ullrich et al., 1993, J. Biol. Chem., 268:26784-9); 헤파린에 결합하는 인간 von Willebrand 인자의 23개 아미노산 서열(Y565-A587)(Tyler-Cross et al., 1993, Arch. Biochem. Biophys., 306: 528-33); 피브로넥틴-유도된 펩티드 PRARI, 및 헤파린에 결합하는 이러한 모티프를 포함하는 보다 큰 펩티드(Woods et al., 1993, Mol. Biol. Cell., 4:605-613); 혈소판 인자 4의 헤파린 결합 영역(Sato et al., Jpn. J. Cancer Res., 84:485-8); 및 섬유아세포 생장 인자 수용체 티로신 키나제 막횡단 글리코프로테인에서 K18K 서열(Kan et al., 1993, Science 259: 1918-21)을 포함할 수 있다.
표적화 펩티드 서열의 확인 .또다른 양태에서, 표적화 서열은 리간드를 확인하는 익히 알려진 방법을 이용하여 각종 타입의 조합식 라이브러리에서 유도될 수 있다(미국 특허 5,622,699 및 국제 특허 출원 PCT/US96/14600 참조). 일 접근법은 큰 라이브러리를 생산하기 위해 재조합 박테리오파아지를 이용한다. "파이지법"을이용하여(Scott and Smith, 1990, Schience 249:386-390; Cwirla, et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci., 87:6378-6382; Devlin et al., 1990, Science, 249:404-406), 매우 거대한 라이브러리를 작제할 수 있다(106-108화학적 존재). 제2 접근법은 주로 화학적 방법을 사용하는데, 이 중에서 Geysen법[Geysen et al., 1986, Molecular Immunology 23:709-715; Geysen et al., 1987, J. Immunologic Method 102:259-274] 및 Fodor 등의 방법(1991, Science 251:767-773)이 전형적이다. Furka 등(1998, 14th International Congress of Biochemistry, VolumeE5, Abstract FR:013; Furka, 1991, Int. J. Peptide Protein Res.37:487-493), Houghton(1986년 12월에 발행된 미국 특허 4,631,211) 및 Rutter 등(1991년 4월 23일에 발행된 미국 특허 5,010,175)은 표적화 서열로서 시험될 수 있는 펩티드의 혼합물을 생산하는 방법에 관해 기재하고 있다. 또다른 측면에서, 합성 라이브러리(Needels et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4; Ohlmeyer et al., 1993, Proc, Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926; Lam et al., 국제 특허 공개 WO 92/00252; Kocis et al., 국제 특허 공개 WO 9428028) 등을 사용하여 표적화 펩티드를 선별할 수 있다.
본 발명 벡터의 용도
아데노바이러스 벡터의 제조에 관해 앞서 제공된 간행물은 이러한 벡터의 각종 용도에 관해 기재하고 있다.
생체내 악성 세포중으로 치료 유전자의 표적화된 도입은 종양의 효과적인 치료를 제공할 수 있다. 몇몇 치료 모델이 시도되었다. 예를 들어, 일 치료법은 정상 종양 억제제 유전자(예, p53, 망막아종 단백질, p16 등) 및/또는 활성화된 종양유전자의 억제제를 종양 세포로 전달한다. 두번째 치료법은 사이토킨 유전자의 도입에 의해 생체내 종양 세포의 면역원성의 향상을 수반한다. 세번째 치료법은 종양 세포에 화학요법제에 대한 감성을 제공할 수 있는 효소를 암호화 하는 유전자의 도입을 수반한다. 허프스 심플렉스 바이러스-티미딘 키나제(HSV-tk) 유전자는 뉴클레오시드 유사체(갱시클로비르(ganciclovir))를 독성 중간산물로 특이적으로 전환시켜 분열 세포의 사멸을 야기할 수 있다. 최근에 Culver 등(Science, 1992, 256:1550-1552)은 레트로바이러스 형질도입에 의해 HSV-tk 유전자의 전달 후, 차후 갱시클로비르 치료법이 실험 동물에서 뇌 종양 억제를 효과적으로 야기하는 것으로 보고하고 있다. Woo 등의 미국 특허 5,631,236은 HSV-tk 또는 VZV-tk를 암호화 하는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 고형 종양에 대한 유전자 요법에 관해 기재하고 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 예를 들어 UPAR에 결합하는 펩티드를 이용하여 관련 핵산을 종양 자체, 이의 전이 또는 종양 혈관계에 표적화하는데 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 벡터는 안기오게네시스 억제제 또는 안티-안기오게닉 인자에 대한 유전자를 암호화한다. "안티-안기오게닉 인자"는 특히 내피 세포 이동을 차단시킴으로써 안기오게네시스를 억제하는 분자이다. 이러한 인자는 (우로키나제의 아미노-말단 분획)과 같은 억제성인 안기오게닉 단백질 분획, 안기오스타틴 및 엔도스타틴과 같은 안기오게네시스 억제 인자; 우로키나제형 수용체 또는 FGF/VEGG 수용체와 같은 안기오게닉 인자의 가용성 수용체;내피 세포 생장 인자 수용체를 차단하는 분자[O'Reilly et al., Cell 88:277-285(1997); O'Reilly, Nat. Med. 2:689-692(1996)], 및 Tie-1 또는 Tie-2 억제제를 포함한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 안티-안기오게닉 인자는 본 발명의 벡터를 이용하여 종양으로 형질감염되는 유전자에 의해 암호화될 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 예를 들어, 본 발명의 벡터를 이용하여 본 발명에 따라 안티-안기오게닉 단백질을 암호화 하는 유전자를 종양, 이의 전이 또는 종양 혈관계에 전달할 수 있다. 안티-안기오게닉 인자의 예는 EGF-형 도메인을 함유한 우로키나제의 아미노 말단 분획(ATF)(예, ATF의 아미노산 잔기 약 1 내지 약 135); 예를 들어 면역글루불린 또는 인간 혈청 알부민과 함께 융합 단백질로서 제공된 ATF[WO93/15199]; 안기오스타틴[O'Reilly et al., Cell 79:315-328(1994)]; 메탈로프로테이나제의 조직 억제제[Johnson et al., J. Cell. Physiol. 160:194-202 (1994)]; 또는 안기오게닉 인자를 위한 수용체의 가용성 형태(가용성 VGF/VEGF 수용체 및 가용성 우로키나제 수용체를 포함, 이에 한정되지 않음)와 같은 FGF 또는 VEGF의 억제제[Wilhem et al., FEBS Letters 337:131-134(1994)]를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
또다른 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 후기-혈관형성 재협착증을 억제하기 위해 이동 평활근 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 자살 유전자의 전달에 의해 재협착증을 억제하기 위한 아데노바이러스의 사용예는 WO06/05321에 기재되어 있다. 혈관 평활근 세포 증식 및 재협착증을 억제하기 위해 GAX 단백질(증식 억제 단백질)을 암호화하는 아데노바이러스의 사용에 관해서는 WO96/30385에 기재되어 있다. 기타 유전자는 세포독성 유전자(HSV 티미딘 키나제), 메탈로프로테이나제 억제제(TIMP), 내피 세포 NOS 또는 동맥경화 보호 인자(예, ApoE)일 수 있다.
근육 또는 뇌 특이적 펩티드가 포함되는 본 발명의 벡터도 또한 중추 신경계(CNS) 장애의 경우 보호 또는 재생 생장 인자를 선택적으로 전달하는데 이용될 수 있다. CNS로 유전자 전달을 위해 아데노바이러스의 사용 예는 WO94/08026, WO95/25804 및 WO95/26408에 기재되어 있다.
골격근- 또는 심장-특이적 펩티드가 포함되는 본 발명의 벡터도 또한 안기오게닉 인자(예; VEGF, FGF, 안기오포이에틴 과(family)의 멤버), 세포 생존-촉진 인자(예, akt/PKB 과의 멤버), 강력한 대사를 수반하는 유전자(예, 포스폴람반 또는 아데닐릴 사이클라제), 사이토킨 및 이의 수용체(예, IL-6, IL 10, CXCR4, CXCR1, sdf1, MCP 1, GM-DSF) 및 말초 동맥 질환 또는 관상 동맥 질환의 치료에 유용한 아폽토스에 대항한 보호 유전자(akt)를 선택적으로 전달하는데 이용될 수 있다.
좀더 일반적인 방법으로 본 발명의 벡터에 표적화 세포 유전자 효소, 혈액 유도체, 인슐린 또는 생장 호르몬과 같은 호르몬, 림포카인: 인터루킨, 인터페론, TNF 등(프랑스 특허 92 03120), 생장 인자, 예를 들면 VEGF 또는 FGF와 같은 안기오게닉 인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소, 영양 인자, 특히 신경퇴행성 질환(신경계를 손상시키는 외상, 또는 망막 퇴행)의 치료를 위한 신경영양 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGG, GMF, IFGF, NT3, NT5, HARP/플레이오트로핀, 또는 뼈 생장 인자, 조혈 인자 등, 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(프랑스 특허 91 11947), 응고를 수반하는 유전 암호 인자: 예를 들면, 인자 VII, VIII 및 IX, 자살유전자(예, 티미딘 키나제 및 사이토신 데아미나제), 헤모글로빈 또는 기타 단백질 운반자용 유전자, 지질 대사를 수반하는 단백질(아포리포프로테인 A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J 및 apo(a) 중에서 선택된 아포리포프로테인 타입)에 상응하는 유전자, 예를 들어 리포프로테인 리파제, 간 리파제, 레시틴-콜레스테롤 아실트랜스퍼라제, 7-알파-콜레스테롤 하이드록실라제, 포스파티딜 산 포스파타제와 같은 대사 효소, 또는 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질과 인지질 전달 단백질과 같은 지질 전달 단백질, 예를 들어 LDL 수용체, 렘난트 킬로마이크론 수용체 및 스캐빈저 수용체 중에서 선택된 HDL-결합 단백질 또는 수용체 등이 전달될 수 있다. 부가적으로, 비만 치료를 위해 렙틴을 첨가할 수 있다.
표적화된 벡터의 유전자에 의해 암호화될 수 있는 기타 단백질 또는 펩티드 중, 항체, 단일-쇄 항체(ScFv)의 가변 분획 또는 면역요법, 예를 들어 감염성 질환, 종양, (안티이디오타입 항체의 사용을 수반할 수 있는) 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환의 치료를 위해 인식 능력을 보유한 임의의 기타 항체 분획을 강조함이 중요하다. 관련 기타 단백질로는 가용성 수용체, 예를 들면 가용성 CD4 수용체 또는 예를 들어 안티-HIV 요법에 이용될 수 있는 TNF에 대한 가용성 수용체, 근무력증 치료에 이용될 수 있는 아세틸콜린에 대한 가용성 수용체; 기질 펩티드 또는 효소 억제제, 또는 예를 들어 천식, 혈전증 및 재협착증 치료를 위한 수용체 또는 부착 단백질의 아고니스트 또는 안타고니스트인 펩티드; 인공, 키메라 또는 끝잘린 단백질이 있지만 이에 한정되지 않는다. 관련 호르몬 중, 당뇨병의 경우 인슐린, 생장 호르몬 및 칼시토닌이 언급될 수 있다.
상기 유전자는 또한 표적 세포에서 발현시 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 제어할 수 있는 안티센스 서열 또는 유전자로 대체될 수 있다. 유럽 특허 140 308에 기재된 기술에 따르면, 이러한 서열은 예를 들면 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사되어 단백질로의 해독을 차단할 수 있다. 치료 유전자는 또한 표적 RNA를 선택적으로 파괴할 수 있는 라이보자임 암호 서열을 포함할 수 있다(유럽 특허 321 201).
본 발명은 본 발명의 전형으로 제공된 하기 비제한적인 실시예를 통해 보다 쉽게 이해될 수 있다. 실시예에 제시된 모든 변형은 언급이 없을 시 조합될 수 있다.
실시예 1: Ad5의 헥손 HVR5 루프의 조작
본 실시예는 아미노산(aa) 269에서 281인 Ad5 헥손의 HVR5 루프를, 루프의 극단에서 가장 잘 보존된 잔기(위치 268에서 세린, 및 위치 282에서 프롤린)를 온전하게 보전하면서 조작하면 뜻밖에도 효과적인 아데노바이러스 트로피즘 공학을 제공함을 증명해 준다. Ad5 헥손에서 제거되는 서열은 TTEAAAGNGDNLT(서열 번호:25)(즉, 우리의 작제물은 공개된 Ad5 서열에 비해 본래 헥손 잔기 273에서 트레오닌을 알라인으로 치환됨)이고, 보존된 플랭킹 서열은 FFS(상류) 및 PKVV(하류)이다.
재료 및 방법
헥손의 HVR5 루프의 조작을 위해 셔틀 플라스미드의 작제. 하기 두 프라이머쌍을 이용하여 HVR5 루프의 플랭킹 영역을 함유하면서 HVR5 루프를 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)(Zukowski et al., 1983, PNAS 80:1101-1105)의 xylE 마커 유전자로 대체한 제1 중간 플라스미드 IE28을 제작했다:
hex-19243G(5'-ATGGGATGAAGCTGCTACTG-3') (서열 번호:26)과
hex-19623D(5'-tcgcgaGAAAAATTGCATTTCCACTT-3')(서열 번호:27), 및
hex-19685G(5'-CCTAAGGTGGTATTGTACAG-3')(서열 번호:28)과
hex-20065D(5'-AGCAGTAATTTGGAAGTTCA-3')(서열 번호:29).
이들 프라이머를 사용하여 표준 PCR 기술에 따라 Ad5 게놈의 뉴클레오티드 19245-19639 및 19685-20084 각각에 상응하는 헥손 유전자 부위를 증폭시켰다(Genbank 기탁 번호 M73260). 프라이머 hex-19623D는 제한 부위 NruI를 함유하고 프라이머 hex-19685G는 Ad5 서열에서 약간 변형되어 헥손의 단백질 서열의 변형없이 Bsu361을 만들었다(뉴클레오티드 19690: A→G). 각 PCR 산물을 플라스미드 pCRII(Invitrogen)에서 클로닝하여 각각 플라스미드 IE21과 IE22를 생성했다. DNA 서열 분석으로 적절한 클로닝을 확인했다.
xylE 유전자의 발현 카세트를 함유한 플라스미드 pαxylEΩ(Frey et al., 1988, Gene 62:237-247)를 EcoRI으로 제한하고, T4 DNA 폴리머라제로 블런트 말단을 만든 다음 HindIII로 절단했다. 이러한 DNA 분획을 블런트 말단된 BamHI-HindIII IE21 플라스미드 중으로 클로닝하여, 플라스미드 IE26을 작제했다. 마지막으로, IE26에서 나온 HindIII-XbaI 분획과 IE22에서 나온 XhoI-HindIII 분획을 앞서 기재된 SalI-XbaI로 절단된 플라스미드 pXL2756 중으로 클로닝시켜(Crouzet etal., 1997, PNAS 94:1414-1419) 셔틀 플라스미드 IE28을 제작했다.
HVR5 루프에서 변형된 모든 플라스미드는 xylE 유전자를 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 대체시켜 플라스미드 IE28로부터 유도되었다. 간단히 말해, 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 이중 나선을 형성하고 이를 NruI-Bsu36I로 절단된 IE28 중으로 클로닝시키며, 단 IE31 플라스미드는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 BsrGI-NruI로 절단된 IE28에 연결시켜 얻어졌다. 0.5 M 카테콜을 분무시킨 후 xylE를 발현시키는 박테리아의 황색 염색에 기초한 표현형 선별을 이용했다(상기 Zukowski et al., 1983). 하기 표는 사용된 올리고뉴클레오티드의 목록과 상응하는 셔틀 플라스미드의 명칭을 나타내고 있다:
관련 플라스미드 백본과 바이러스의 작제 . 헥손 유전자의 HVR5 루프 대신 xylE 유전자를 함유한 중간 플라스미드 백본을 작제하여 HVR5 루프의 차후 조작을 촉진했다. 이를 위해, 셔틀 플라스미드 IE28을 Crouzet 등(상기 1997)에 기재된 방법에 따라 G4977 박테리아 균주에서 플라스미드 백본 pXL3006(이 플라스미드는 E1 영역 대신 CMV-lacZ 발현 카세트를 지닌 PacI-절개성 E1E3-결실된 아데노바이러스게놈을 함유함)과 재조합하여 플라스미드 백본 pXL3006과는 xylE-함유 HVR5 서열에서 차이가 나는 플라스미드 백본 IE28c를 얻었다.
모든 셔틀 플라스미드 IE30에서 IE47을 "xylE 선별"을 이용하여 플라스미드 백본 IE28c와 재조합하여 플라스미드 백본 IE30c에서 IE47c를 얻었다. PacI 효소를 이용한 절단 후, 리포펙타민(Gibco BRL)을 이용하여 이들 절단된 백본 중 2㎍(또는 5㎍)을 911 세포(또는 293 세포)에 형질감염시켜 상응하는 바이러스 AdIE30에서 AdIE47을 생성했다. 이들 HVR5-변형된 E1E3-결실된 아데노바이러스는 동일한 CMV-lacZ 발현 카세트를 발현시킨다.
동일한 방법으로 모든 기타 HVR5-변형된 아데노바이러스(예, 노출 uPAR- 또는 인테그린-결합 펩티드; 하기 실시예 참조)를 작제했다.
세포 및 항체 .293 및 W162 세포를 10% 태 송아지 혈청이 보충된 MEM(Gibco BRL)에 보관했다. 911 세포(Fallaux et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7:215)를 10% 태 송아지 혈청이 보충된 DMEM에서 증식시켰다. R.Crainic박사(프랑스 파리 Pasteur Institute)가 Blondel et al, 1983, Virology 126:707에 기재된 폴리오바이러스 타입 1에 대항한 C3 모노클로날 항체(C3 mAb)를 제공했다. RPR-Gencell 설비에서 완전 Ad5 캡시드에 대항한 L5 토끼 폴리클로날 항체를 생산했다(프랑스 비트리 RPR SA).
바이러스 . 모든 바이러스를 전통적인 방법에 따라 E1-트랜스보충 세포(예, 293 세포)에서 증폭시켰다. Hirt 과정을 이용하여 얻어진 바이러스 DNA상의 제한 분석 및 삽입체 서열 분석을 통해 바이러스의 패턴/존재를 조절했다. 바이러스 스톡을 293 세포에서 제조하고, CsCl 구배로 정제하며, PD10 컬럼(Pharmacia)을 이용하여 염분을 제거한 다음 -80℃에서 10% 글리세롤이 보충된 PBS에 보관했다. 911 세포상의 플라크-형성 단위(PFU)를 헤아리고/헤아리거나 X-Gal 염색 후 W162 세포를 감염시킨지 이틀 후 lacZ-형질도입 단위(TDU)를 헤아림으로써 생물학적 정량분석을 수행했다(Dedieu et al., 1997, J. Virol. 71:4626). 음이온-교환에 의해 바이러스 입자(VP) 수를 헤아려 물리적 정량분석을 수행했다.
중화 시험 . 안티 폴리오바이러스 C3 모노클로날 항체의 1/2 ㎕를 정제된 바이러스 105TDU와 함께 37℃에서 1시간 동안 PBS에서 배양하고, 혼합물을 37℃에서 추가 1시간 동안 6 웰-플레이트중의 W162 세포상으로 흡수시켰다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 프레시 배지를 세포에 첨가하여 37℃에서 2일간 배양했다. 세포 단층을 포름알데히드(0.37%)-글루탈알데히드(0.2%)로 고정시키고, X-Gal로 염색한 다음, 청색 세포를 헤아렸다.
면역침전 프로토콜 .CsCl-정제된 바이러스의 바이러스 입자(1010)를 비-변성 배양 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% NP40) 400 ㎕에 재현탁시킨다음 4℃에서 1시간 동안 안티 폴리오바이러스 C3 모노클로날 항체 0.1㎕로 배양했다. 배양 완충액으로 미리 평형화된 단백질 A-세파로스 400 ㎕를 첨가하고, 4℃에서 추가 1시간 동안 배양했다. 배양 후, 혼합물을 마이크로원심분리기에서 단기간의 원심분리로 스피닝시켰다. 펠릿을 배양 완충액 1 ㎖로 2회 세척하고 4℃에서 20분간 10 mM Tris pH 7.5 1 ㎖, 0.1% NP40으로 1회 세척했다. 단백질 A-항체-바이러스 복합체를 함유한 펠릿을 Laemmli 완충액 1x 50 ㎕에 재현탁하고 상등액을 짧은 원심분리 후 모았다. 상등액 10 ㎕를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Novex)으로 분석했다. ECL 과정(Amersham)에 따라 완전 Ad5 캡시드에 대항한 L5 토끼 폴리클로날 혈청을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행했다.
결과
HVR5 루프의 변형을 위한 작제 방법.두 부류의 작제물을 제조했다. 첫번째 부류는 외래 서열의 Ad5 HVR5 루프를 크기면에서 상당히 차이가 있는 기타 Ad5 혈청타입의 HVR5 루프로 대체하여 외래 서열의 Ad5 HVR5 루프의 "능력"을 평가하기 위해 고안되었다.
이종특이적 HVR5 루프를 지닌 Ad5-계 아데노바이러스
바이러스 하기의 HVR5 서열 Ad5의 HVR5 루프를 대체하는 서열 서열 번호:
Ad IE 30 Ad2:14 aa NTTSLNDRQGNATK 56
Ad IE 32 Ad30:6 aa STTINI 57
Ad IE 33 Ad 19:17 aa TPGANPPAGGSGNEEYK 58
생존력 대조를 위해, 본 출원인은 Crompton 등이 공개한 변형(1994, J. Gen. Virol. 75:133-139)(여기서 폴리오바이러스 타입 3 에피토프를 HVR5를 포함한 보다큰 결실부 대신에 도입했음)을 도입했다. 중요하게는, 크롬프톤 바이러스를 초기에 Ad2 변형된 헥손을 함유한 플라스미드와 Ad5-계 아데노바이러스 게놈 간의 상동 재조합에 의해 작제했다. 이러한 바이러스는 Ad2와 Ad5 사이에 4-잔기의 보다 큰 HVR5 결실을 외래 펩티드 대신 사용되는 키메라 헥손 단백질을 나타낸다. Crompton 등의 작제물을 가능한 유사하게 재생하기 위해, Crompton 등의 외래 펩티드가 TTEAAAGNGDNLT(서열 번호:60) 대신 Ad5의 헥손 잔기 269에서 285(TTEAAAGNGDNLTPKVV; 서열 번호:59)를 대신하여 도입되는 EDRAG 기술에 의해 Ad5-계 바이러스(Ad IE31)을 작제했다.
대조 바이러스 AdIE31의 삽입
바이러스 Ad5의 HVR5 루프를 대신하는 서열
Ad IE31 NLDSLEQPTTRAQKPRLD (서열 번호:61)
두번째 부류의 작제물에서, 폴리오바이러스 타입 1의 직선 에피토프(DNPASTTNKDK; 서열 번호 62)를 중화시켜 HVR5 루프(aa 269에서 281)을 대체했다. 이러한 모델 결합-펩티드를 각종 이웃한 부위(즉, 루신 및/또는 글라이신 및/또는 세린 잔기로 구성된 각종 링커가 사용됨)에 삽입하여 바이러스 생존력과 펩티드 접근성에 대한 이의 중요성을 평가했다.
HVR5 루프에 폴리오바이러스 타입 1 에피토프의 삽입.
바이러스 상류 링커 사용된 에피토프 하류 링커 서열 번호:
Ad IE35 없음 DNPASTTNKDK L 63
Ad IE37 G DNPASTTNKDK 없음 64
Ad IE40 S DNPASTTNKDK 없음 65
Ad IE41 G S DNPASTTNKDK 없음 66
Ad IE43 G DNPASTTNKDK LG G 67
Ad IE44 G DNPASTTNKDK LG S 68
Ad IE45 G DNPASTTNKDK LS 69
Ad IE46 G DNPASTTNKDK LSG 70
Ad IE47 G DNPASTTNKDK LS S 71
바이러스의 생존력. Ad5 HVR5 루프 대신 Ad2, Ad19, 또는 Ad30 HVR5 루프를 지닌 3종류의 바이러스, 및 폴리오바이러스 타입 1 에피토프를 함유한 9 종류의 키메라 바이러스는 생존했다. 생산성 손실은 관찰되지 않았다. 뜻밖에도, 대조 바이러스 Ad IE31은 강한 노력에도 불구하고 찾아낼 수 없었다.
면역침전 분석에 의한 폴리오바이러스 에피토프 접근성 평가.
비-변성 조건에서 동종 안티폴리오바이러스 모노클로날 항체(C3 mAb)를 이용하여 폴리오바이러스 에피토프를 운반하는 바이러스상에서 면역침전 실험을 수행했다. 하기 표 5에 얻어진 데이터가 요약되어 있다:
C3 mAb를 이용한 면역침전
바이러스 HVR5 루프에 삽입된 펩티드 면역침전
Ad IE35 DNPASTTNKDK-L -
Ad IE37 G-DNPASTTNKDK -
Ad IE40 S-DNPASTTNKDK -
Ad IE41 GS-DNPASTTNKDK -
Ad IE43 G-DNPASTTNKDK-LGG ++
Ad IE44 G-DNPASTTNKDK-LGS ++
Ad IE45 G-DNPASTTNKDK-LS ++
Ad IE46 G-DNPASTTNKDK-LSG ++
Ad IE47 G-DNPSTTNKDK-LSS ++
폴리오바이러스 에피토프의 하류 링커의 존재는 대부분의 경우에 헥손 표면에 결합 펩티드의 적절한 제시 및/또는 접근성을 허락하기 때문에 변형된 바이러스 캡시드로의 C3 mAb 부착에 있어 중요한 것으로 밝혀졌다. 변형된 바이러스가 면역침전 이전에 변성될 때, 이들 모두를 C3 mAb로 효과적으로 면역침전시켰다(도시되지 않음).
중화 분석에 의한 폴리오바이러스 에피토프 기능성 평가 .C3mAb가 폴리오바이러스 감염을 위해 중화될 때, 본 출원인은 이것이 또한 폴리오바이러스 에피토프를 운반하는 Ad의 감염성을 중화시킬 수 있을 것으로 기대했다. W162 원숭이 세포의 감염 이전에 PBS(즉, 네이티브 조건하에)에서 전체 Ad IE 바이러스 부류로 C3mAb를 배양했다. 데이터는 도 1에 주어진다. 이들 데이터는 면역침전 결과와 완벽하게 상관되며, 즉, 비-변성 조건하에 C3 mAb에 부착할 수 있는 모든 바이러스가 이러한 항체에 의해 중화되었다.
토의
데이터는 아데노바이러스의 HVR5 루프의 변형이 기능적일 수 있고 특정 결합 단백질과 변형된 헥손이 특이적으로 상호작용할 수 있음을 보여준다. 그러나 결합 펩티드 에피토프의 접근성(면역침전 분석)과 기능성(중화 분석)이 최소 스페이서/이웃한 서열에 좌우됨을 보여주기 때문에 특정 삽입 모델이 요구된다.
Crompton 등의 결론과는 대조적으로, 우리의 결과는 또한 Ad5 헥손의 aa 269에서 285의 결실이 바이러스 증식 및/또는 생존력에 치명적임을 보여준다. 이는 잔기 282에서 285가 모노머 또는 트라이머로서 헥손 구조에 필수적인 HVR5 루프의 하류에 위치된 베타-가닥에 위치한다는 사실로서 설명될 수 있다. 이에 따라, Crompton 등이 제공한 것보다 좀더 정확하고 정밀한 본 접근법은 뜻밖에도 상기의 단점을 극복했고 변형된 트로피즘이 구비된 살아있는 바이러스를 제공했다(하기 참조).
실시예 2: 섬유 HI 루프의 조작
Ad5 섬유의 HI 루프의 결실을 수행했다: 섬유 노브에서 제거된 서열은 잔기 538-548(즉, 서열 GTQETGDTTPS)(서열 번호: 72)을 포함한다. 이의 플랭킹 서열은 TLN(상류) 및 AYS(하류)이다.
재료 및 방법
섬유의 HI 루프의 조작을 위해 셔틀 플라스미드의 작제 . 하기 두 프라이머쌍을 이용하여 HI 루프의 플랭킹 영역을 함유하고 HI 루프가 xylE 유전자로 대체된 제1 중간 플라스미드 pJD3를 만들었다:
HIgul (5'-CAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATG-3')(서열 번호:73)과
HIgdl (5'-GGTTACCGGTTTAGTTTTGTCTCCGTTTAA-3')(서열 번호:74), 및
HIdul (5'-AGCGCTTACTCTATGTCATTTTCATGGGAC-3')(서열 번호:75)과
HIddl(5'-GAGTTTATTAATATCACTGATGAGCGTTTG-3')(서열 번호:76).
이들 프라이머 쌍을 이용하여 표준 PCR 기법에 따라 Ad5 게놈의 뉴클레오티드 32255-32634 및 32712-33090 각각에 상응하는 섬유 및 E4orf7 유전자를 증폭시켰다(Genbank 기탁 번호 M73260). 프라이머 HIgd1 및 HIdul가 HI 루프에 바로 인접한 섬유 단백질 서열을 변화시키지 않으면서 제한 부위 BstEII과 Eco47III 각각을작제하는 방향으로 고안된다. 이들 부위는 외래 펩티드를 HI 중으로 직접 클로닝하는데 추가로 이용되었다(하기 표 5 참조).
각 PCR 산물을 플라스미드 PCR2.1(Invitrogen)중으로 클로닝하여 플라스미드 PCR2.1-H4 및 PCR2.1-I2 각각을 생성하고, 이를 서열분석했다.
xylE 유전자의 발현 카세트를 함유한 플라스미드 pαxylEΩ를 EcoRI으로 제한하고, T4 DNA 폴리머라제로블런트 말단을 만든 다음, HindIII로 절단했다.
이러한 DNA 분획을 HindIII-제한된 PCRII(Invitrogen) 중으로 서브클로닝하여 플라스미드 IE23을 제조했다. IE23의 NsiI-XhoI 분획을 NsiI-XhoI으로 절단된 PCR2.1-H4 플라스미드 중으로 도입하여, 플라스미드 pJD2를 생성했다. 마지막으로, pJD2의 SacI-XbaI 분획 및 CPR2.1-I2의 SpeI-XhoI 분획을 SacI-SalI에 의해 절단된 앞서 기재된(상기 Crouzet et al., 1997) 플라스미드 pXL2756 중으로 클로닝시켜 셔틀 플라스미드 pJD3를 제조했다.
HI 루프에서 변형된 모든 플라스미드는 xylE 유전자를 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 대체시켜 플라스미드 pJD3에서 유도되었다. 간단히 말해, 상보성 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 이중 나선을 형성하고 BstEII-Eco47III로 절단된 pJD3 중으로 클로닝시켰다. 0.5M 카테콜로 분무 후 xylE를 발현시키는 벡터의 황색 염색에 기초한 표현형 선별을 이용했다. 하기 표는 사용된 올리고뉴클레오티드 목록 및 상응하는 셔틀 플라스미드의 명칭을 나타내고 있다:
표 5. HI 루프를 대체하는데 이용되는 올리고뉴클레오티드의 예
관련 플라스미드 백본 및 바이러스의 작제 . 섬유 유전자의 HI 루프 대신 xylE 유전자를 함유한 중간 플라스미드 백본을 우선 작제하여 변형된 HI 루프를 드러내는 플라스미드 백본의 차후 선별을 용이하게 한다. 이를 위해, 셔틀 플라스미드 pJD3를 상기 Crouzet 등이 기재한 방법에 따라 G4977 박테리아 균주에서 플라스미드 백본 pXL3006과 재조합하여 플라스미드 백본 pBX를 얻었고, 이는 E1 대신CMV-lacZ 발현 카세트를 함유한 PacI-절단성 E1E3-결실된 아데노바이러스 게놈, 및 HI 루프에 xylE 마커를 드러낸다.
"xylE 선별"을 이용하여 셔틀 플라스미드 pJD5, 7 및 6, 및 pCF1 에서 pCF8을 플라스미드 백본 pBX와 재조합하여 플라스미드 백본 pBV2, 5 및 9, 및 pBC1에서 pBC8 각각을 얻었다. PacI 효소로 절단 후, DNA 2 ㎍(또는 5㎍)를 리포펙타민(Gibco BRL)을 이용하여 911 세포(또는 293 세포)에서 형질감염시켜 상응하는 바이러스 vBV2, 5 및 9, 및 vBC1에서 vBC8을 생성했다.
기타 방법 .상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포, 항체, 바이러스, 면역침전 분석, 및 중화 분석을 행하였다.
결과
HI 루프 삽입 벡터의 작제 방법 .일련의 두 작제물을 제조했다. 첫번째 부류는 외래 서열의 Ad5 HI 루프를 크기면에서 약간 상이한 기타 아데노바이러스 혈청타입 HI 루프로 대체하여 이러한 루프의 "능력"을 평가하게끔 고안했다.
섬유 단백질 HI 루프에서 삽입 능력.
바이러스 하기의 HI 서열 Ad5의 HI 루프를 대체하는 서열 서열 번호:
VBV2 Ad2:12 aa GTSESTETSEVS 99
VBV5 Ad5:11 aa GTQETGDTTPS 100
VBV9 Ad9:6 aa QETQCE 101
두번째 부류의 작제물에서, HI 루프를 폴리오바이러스 타입 1의 중화 에피토프(DNPASTTNKDK)(서열 번호:62)로 대체했다. Ad5 HI 루프의 N-말단부와 네이티브 환경/단백질의 폴리오바이러스 서열에서 매우 유사한 3D 구조로 인해, 에피토프의상류에 최소 하나의 잔기 링커(글라이신)을 첨가했다. 이는 바이러스 증식 및 펩티드 접근성에 미치는 영향력을 평가하기 위해 상이한 길이의 스페이서 및 조성물이 포함되는 삽입부의 하류의 경우에는 해당되지 않는다.
섬유 단백질 HI 루프에 폴리오바이러스 타입 1 에피토프의 삽입
바이러스 사용된 에피토프 하류 링커 서열 번호:
vBC1 DNPASTTNKDK S 102
vBC2 DNPASTTNKDK G S 103
vBC3 DNPASTTNKDK S S 104
vBC4 DNPASTTNKDK GGS 105
vBC5 DNPASTTNKDK SSS 106
vBC6 DNPASTTNKDK GSS 107
vBC7 DNPASTTNKDK SGS 108
vBC8 DNPASTTNKDK 없음 109
바이러스의 생존력 . Ad5 HI 루프 대신 Ad2, Ad5 또는 Ad9 HI 루프를 지닌 세가지 대조 바이러스와 폴리오바이러스 에피토프를 함유한 8 종류의 키메라 바이러스가 살았다. 생산성 손실은 관찰되지 않았다.
면역침전 분석에 의한 폴리오바이러스 에피토프 접근성 평가.
폴리오바이러스 에피토프를 운반하는 바이러스의 면역침전 실험을 비-변성 조건에서 동종의 안티폴리오바이러스 C3mAb를 이용하여 수행했다. 하기 표가 데이터를 요약하고 있다:
C3mAb를 이용한 면역침전에 의해 검출되는 표적화 서열의 인식
바이러스 HI 루프에 삽입된 펩티드 면역침전
vBC1 G-DNPASTTNKDK-S -
vBC2 G-DNPASTTNKDK-GS +/-
vBC3 G-DNPASTTNKDK-SS +
vBC4 G-DNPASTTNKDK-GGS ++
vBC5 G-DNPASTTNKDK-SSS ++
vBC6 G-DNPASTTNKDK-GSS ++
vBC7 G-DNPASTTNKDK-SGS ++
vBC8 G-DNPASTTNKDK -
이들 데이터는 HVR5 루프 삽입의 경우와 같이 변형된 캡시드에 C3 mAb 항체의 결합이 중요하게도 최소 길이의 스페이서 서열의 존재에 좌우됨을 보여준다. 특히, 3 잔기의 하류 링커는 가장 효과적인 결합을 제공한다. 바이러스가 면역침전 분석 이전에 변성될 때, C3mAb 항체와 모두 결합할 수 있었다(도시되지 않음).
중화 분석에 의한 폴리오바이러스 에피토프 기능성 분석 . 섬유-변형된 바이러스의 감염성을 중화시키는 C3mAb의 능력은 이것이 헥손-변형된 캡시드의 경우 실시예 1에 예시된 면역침전 데이터와 상관관계가 있는지를 결정하기 위해 평가되었다. 그러나, 헥손 변형시의 결과와는 달리, C3mAb로 섬유-변형된 바이러스를 배양한 다음 감염성 억제가 없었다(주어진 데이터가 없음). 상이한 설명이 제시될 수 있다. 특히, 240개 헥손 트라이머에 비해 비리온 표면상에 단 12개의 섬유 트라이머가 존재한다. 이에 따라, 헥손-변형된 캡시드에 결합하는 항체의 밀도는 직접적, 또는 인테그린-매개된 내부화에 영향을 미치도록 펜톤 염기의 RGD 모티프의 입체 장해에 이어 감소된 바이러스 감염성을 가질 수 있다. 어떠한 경우든, HI-변형된 캡시드로 C3mAb 특이적 결합은 바이러스와 이의 표적 세포간의 네이티브 상호작용을 방해하지 못했다.
토의
데이터는 아데노바이러스의 HI 루프가 외래 펩티드로 대체될 수 있고 상응하는 바이러스가 i) 살아있으면서, ii) 바이러스 생산성에 엄청난 영향을 미치지 않음을 입증해 준다. 데이터는 또한 도입된 펩티드의 특이적 인식이 적당한 이웃한 링커(즉, 최소 크기의 유연성 링커)를 요구함을 입증해 준다.
실시예 3: 섬유 단백질 길이의 변형 - 짧은 섬유
Ad9와 같은 기타 혈청타입(짧은-섬유 혈청타입)과 Ad5의 세포-결합 경로(긴-섬유 혈청타입)를 비교해 볼때, 섬유 샤프트 길이는 인터티픽(intertypic) 섬유(Ad5 샤프트를 또다른 짧은-섬유 혈청타입인 Ad3 샤프트로 치환), 또는 네이티브 단백질에서 22개 대신 오직 6 또는 9개 반복부를 보유하는 짧아진 Ad5 샤프트를 고안하여 변형되었다.
재료 및 방법
짧아진 섬유를 지닌 셔틀 플라스미드의 작제 . 짧아진 섬유를 함유한 3개의 셔틀 플라스미드를 작제했다. 이들 중 둘(pSF1과 pSF2)은 섬유 샤프트내에 주된 결실을 나타내지만, 세번째 것(pIF1)은 Ad5 샤프트 대신 Ad3 샤프트에 정박한다. 모든 작제물은 Ad5 테일과 노브 도메인을 보유한다.
pSF1을 작제하기 위해, 프라이머 두쌍을 사용했다:
5M3g(5'-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3')(서열 번호:110)와
5M3d(5'-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3')(서열 번호:111), 및
5M17g(5'-TTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTAC-3')(서열 번호:112)와
5M17d(5'-GAAACTGGAGCTCGTATTTGACTGCCACAT-3')(서열 번호:113).
이들 프라이머를 이용하여 표준 PCR 기법에 따라 Ad5 게놈의 뉴클레오티드 30885에서 31329 및 31936에서 32351에 각각 상응하는 섬유 유전자 부위를 증폭시켰다(Genbank 기탁 번호 M73260). 프라이머 5M3g와 5M17d는 각각 제한 부위 SalI와 SacI을 함유한다는 점에서 Ad5 서열과 약간 상이하다. SalI 또는 SacI으로 절단 후, 이들 PCR 산물을 연결하고 SacI-SalI로 절단된 pXL2756 중으로 클로닝하여, 샤프트 반복부 4에서 16을 포함한 프레임 결실을 지닌 pSF1 플라스미드를 생성했다.
pSF2를 작제하기 위해, 두 프라이머쌍을 사용했다:
5M3g(5'-ATTTCTGTCGACTTTATTCAGCAGCACCTC-3')(서열 번호:114)와
5M3d(5'-GTTTGACTTGGTTTTTTTGAGAGGTGGGCT-3')(서열 번호:115), 및
5M20g(5'-CTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAA-3')(서열 번호:116)와
5M20d(5'-ATCCAAGAGCTCTTGTATAGGCTGTGCCTT-3')(서열 번호:117).
이들 프라이머를 사용하여 표준 PCR 기법에 따라 Ad5 게놈의 뉴클레오티드 30885에서 31329 및 32110에서 32530에 각각 상응하는 섬유 유전자 부위를 증폭시켰다. 프라이머 5M3g와 5M20d는 각각 제한 부위 SalI와 SacI을 함유한다는 점에서 Ad5 서열과 약간 상이하다. SalI 또는 SacI으로 절단 후, 이들 PCR 산물을 연결하고 SacI-SalI로 절단된 pXL2756 중으로 클로닝시켜, 샤프트 반복수 4에서 19를 포함한 프레임 결실을 보이는 pSF2 플라스미드를 생성했다.
제한 부위에 의존함이 없이 PCR에 의해 DNA 서열을 재조합하는 Horton 등(4)이 기재한 유전자 SOEing법을 이용하여 pIF1 플라스미드를 만들었다. Ad5 테일과 노브 및 Ad3 샤프트로 구성된 인터티픽 섬유 유전자를 함유한 pIF1 플라스미드를 작제하는데 연속 5 단계가 필요했다. Ad5 섬유 테일을 함유한 초기 PCR 산물을 하기 프라이머를 이용하여 Ad5 게놈으로부터 증폭시켰다:
SOE35Tg(5'-TACAAGTCGACAACCAAGCGTCAGAAATTG-3')(서열 번호:118)와
SOE35Td(5'-AAGACTTAAAACCCCAGGGGGACTCTCTTG-3')(서열 번호:199).
프라이머 SOE35Tg는 약간의 변형을 지닌 Ad5 뉴클레오티드 30660에서 30689와 거의 매치되어 SalI 부위를 만든다. SOE35Td 프라이머내의 밑줄친 15개 염기는 Ad3 섬유 샤프트의 제1 반복부 서열과 매치되고 남은 15개 염기는 Ad5의 섬유 테일 말단 서열에 상응한다.
Ad3 섬유 샤프트를 함유한 제2 PCR 산물을 하기 프라이머를 이용하여 Ad3 섬유 유전자로부터 증폭시켰다:
SOE35Sg(5'-GAGAGTCCCCCTGGGGTTTTAAGTCTTAAA-3')(서열 번호:120)와
SOE35Sd(5'-GGTCCACAAAGTGTTATTTTTCAGTGCAAT-3')(서열 번호:121).
두 프라이머에서 밑줄친 염기는 Ad5 섬유 유전자(각각 테일 및 노브 서브도메인)에 함유되고, 나머지 것들은 Ad3 샤프트에서 유래된 것들이다.
Ad5 섬유 노브 부위를 함유한 제3 PCR 산물을 하기 프라이머를 이용하여 Ad5 섬유 유전자로부터 증폭시켰다:
SOE35Kg(5'-CTGAAAAATAACACTTTGTGGACCACACCA-3')(서열 번호:122)와
SOE35Kd(5'-TCCTGAGCTCCGTTTAGTGTAATGGTTAGT-3')(서열 번호:123).
SOE35Kg 프라이머에서 밑줄친 염기는 Ad3 섬유 샤프트의 마지막 반복부 서열에 적합한 반면, 남은 것들은 Ad5 섬유 노브의 제1 뉴클레오티드에 상응한다. 프라이머 SOE35Kd는 약간의 변형을 지닌 Ad5 뉴클레오티드 32634에서 32663에 거의 매치되어 SacI 부위를 만든다. 첫번째 두 PCR 산물을 혼합하고, 변성시킨 다음 PCR 조건하에 재어닐링시켜, 제1 산물의 상부 가닥과 제2 산물의 기저부 가닥을 중첩시키고 서로에 대해 프라이머로서 작용하게 했다. 이러한 중첩이 폴리머라제에 의해 연장될 때 하이브리드 산물이 형성되었다. SOE 반응에서 프라이머 SOE35Tg와 SOE35Sd의 포함은 재조합 산물이 형성된 후 이를 PCR 증폭시킬 수 있다(앞서 인용된 Horton 등의 도면 참조). 이는 Ad5 테일에 이어 Ad3 샤프트를 함유한 PCR 산물을 만든다. 마지막으로, 이러한 마지막 PCR 산물과, 프라이머 SOE35Tg와 SOE35Kd를 이용한 제3 PCR 산물을 이용하여 동일한 SOE 과정을 수행하면, Ad5 테일, Ad3 샤프트 및 Ad5 노브로 이루어진 인터티픽 섬유를 함유한 DNA 분획을 만들고, 이를 독특한 제한 부위 SalI와 SacI를 이용하여 플랭킹했다(도 2). 이들 효소를 이용하여 절단한 후, 마지막 PCR 산물을 SalI-SacI으로 절단된 pXL2756 플라스미드 중으로 클로닝하여, pIF1 셔틀 플라스미드를 만들었다.
플라스미드 pSF1, pSF2 및 pIF1의 서열을 분석했다.
관련 플라스미드 백본과 바이러스의 작제. 세종류 셔틀 플라스미드 pSF1, pSF2 및 pIF1을 상기 Crouzet 등이 기재한 방법에 따라 G4977 박테리아 균주에서 플라스미드 백본 pXL3006(E1 영역 대신 CMV-lacZ 발현 카세트를 지닌 PacI-절단성 E1E3-결실된 재조합 아데노바이러스 게놈을 함유함)과 재조합하여 플라스미드 백본pBS1, pBS2 및 pBI1 각각을 얻었다. PacI으로 절단 후, 리포펙타민(Gibco BRL)을 이용하여 911 세포(또는 293 또는 PER.6 세포)에서 DNA 2㎍(또는 5㎍)을 형질감염시켜 상응하는 바이러스 vBS1, vBS2 및 vBI1을 생성했다. 셔틀 플라스미드 IE28과 pBI1, pBS1 및 pBS2 플라스미드 백본간의 상동 재조합에 의해 중간 플라스미드 백본 AE31, AE32 및 AE33을 작제했다. 짧은-샤프트 섬유를 지닌 HVR5 헥손 루프 대신 xylE 발현 카세트를 함유하는 이들 플라스미드 백본을 추가로 이용하여 짧은-샤프트 섬유와 HVR5-변형된 헥손을 조합한 플라스미드 백본의 회수를 촉진하였다(예, UPAR- 또는 인테그린-결합 펩티드의 삽입; 실시예 10 참조).
동시에, 셔틀 플라스미드 pJD3와 pBI1, pBS1 및 pBS2 플라스미드 백본간의 재조합에 의해 중간 플라스미드 백본 AE34, AE35 및 AE36을 작제했다. 이들 플라스미드 백본을 추가 이용하여 짧은-샤프트 섬유와 HI-변형된 섬유를 조합한 플라스미드 배본의 회수를 촉진하였다(예, UPAR- 또는 인테그린-결합 펩티드의 삽입).
기타 방법. 세포, 항체, 바이러스, 면역침전 분석, 및 중화 분석은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같다.
결과 및 토의
짧아진 섬유 단백질을 지닌 단백질은 헥손 표면에 노출된 결합 펩티드의 접근성을 증가시키고/증가시키거나 야생형(즉, 네이티브) 바이러스/세포 상호작용을 감소시킬 것으로 기대된다. 이들 작제물은 표 9에 요약되어 있다.
짧아진 섬유 단백질 아데노바이러스
바이러스 키메라 섬유의 구조
vBI1 Ad5 테일 - Ad3 샤프트 - Ad5 노브
vBS1 Ad5의 짧은-샤프트 섬유(샤프트 반복부 4-16을 포함한 결실)
vBS2 Ad5의 짧은-샤프트 섬유(샤프트 반복부 4-19를 포함한 결실)
(비록 정도는 상이하지만) 세 경우 모두 바이러스 생산성이 엄청나게 감소되었는데, 가장 유력하게는 세포 수용체와 효과적으로 상호작용하는 변형된 섬유의 무능력 탓인 것 같다. 이러한 초기 단계에서 발생한 결함은 실제로 바이러스 후기 단백질의 정상 축적과 함께 293-감염된 세포(즉, Xgal-+)에서 정상의 바이러스 DNA 복제 파라미터에 의해 지지된다. 또한, 비-변성 조건하에 웨스턴 블랏팅은 변형된 섬유의 적절한 트라이머화가 세 경우 모두에서 일어남을 보여주었다.
vBS1이 CAR(콕사키 및 아데노바이러스 수용체)-양성 세포에 덜 효과적으로 결합하지만, 이는 실험실 수준으로 PER.C6에서 증폭될 수 있다. 도 3에서 알 수 있듯이, vBS1으로 293 세포를 감염시키면 네이티브 Ad5 섬유를 지닌 대조 바이러스에 비해 세포 형질도입에서 10배 감소됨이 관찰되었는데, 이는 Ad 수용체 결합에 있어 중요한 손실을 나타낸다. 이 실험에서, 293 세포를 PBS와 함께 배양하거나 실온에서 30분간 50 moi(VP/세포)로 감염시키기 이전에 실온에서 30분간 섬유 노브(100 ㎍/㎖)를 정제했다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 단백질 추출물을 제조하기 이전에 37℃의 배지에서 24시간 동안 추가 배양했다. 특이적 lacZ 발현을 정량했다(단위/단백질 추출물).
이들 데이터를 기초로 하여, vBS1 작제물 또는 이의 대조 바이러스(변형되지않은 샤프트)를 C57/B16 마우스에 정맥내 주사하여 주된 기관에서 lacZ 발현의 프로필을 측정했다. 조직화학에 의해 간, 심장 및 폐에서 β-갈락토시다제 발현을 분석했다. 결과는 하기 표 10에 제시되고 있다(XGal-양성 세포%: 값의 평균 및 범위).
주된 기관에서 트랜스유전자 발현 프로필
주사량(VP) 대조 바이러스 vBS1
간 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5) 15(10-20)50(50-60)50(20-80) 0(0-0)5(2-5)15(10-20)
심장 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5) 000 000
폐 3.109(n=5)1010(n=5)3.1010(n=5) 000 000
이들 데이터는 간에서 두 아데노바이러스의 경우에 투여량-반응 효과를 보여주지만, XGal-양성 세포는 처리된 그룹으로부터 심장과 폐 조직에서 확인될 수 없었다. 가장 흥미로은 것은, 섬유 샤프트가 짧아질수록 간 형질도입이 10배 감소하며 이는 재조합 아데노바이러스가 부가적인, CAR-의존적, 진입 경로에 사용된다면 섬유 샤프르가 대부분의 생체내 원하는 기관/세포로의 감염을 지시하게끔 하는 조작의 유용성을 강조한다.
실시예 4: 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체를 발현시키는 세포의 특이적 표적화
각종 높은 친화성 uPAR-결합 펩티드는 헥손 HVR5 및 섬유 HI 루프내에 포함되거나, 섬유 단백질의 C-말단에 첨가된다. 이들 펩티드는 야생형 ATF(Rettenberg et al., 1995, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 376:587-594) 및 돌연변이체 ATF(Magdolen et al., 1996, Eur. J. Biochem.237:743-751), 파아지 라이브러리(Goodson et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7129-7133), 및 관련 돌연변이체, 또는 인간 비트로넥틴(Waltz et al., 1997, J. Clin. Invest. 100:58-67)에서 유래된 것이다. 모든 바이러스는 E1 유전자 대신 삽입된 유전자 발현 카세트(lacZ 또는 Gax)를 함유한다.
헥손 HVR5 루프 및 섬유 단백질 HI 루프에 이들 펩티드의 삽입 방법은 상기 실시예 1과 2의 폴리오바이러스 에피토프의 경우에 기재된 바와 같다. 섬유 단백질의 단축은 실시예 3에 기재된 바와 같이 달성된다. 추가 재료 및 방법은 하기와 같다.
PERC6 세포의 세포 배양
PER.C6 세포를 Dulbecco 변형된 배지(DMEM), 10% FCS 및 37℃에서 10% CO2대기중의 10 mM MgCl2에서 증식시켰다(Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther, 9:1909-1917).
재조합 아데노바이러스 게놈
프랑스 출원 FR 2 730 504에 기재된 EDRAG 기술을 이용하여 이.콜라이에서 상동 재조합에 의해 재조합 아데노바이러스 게놈을 RK2-유도된 플라스미드 중으로 클로닝시켰다. WO 97/10343에 기재된 바와 같이,임의 recA+이.콜라이 균주에서 재조합을 가능하게 하는 자살 셔틀에서 R6K 기원으로 복제의 ColE1 기원을 대체시켜 기술을 단순화했다. 자살 플라스미드(셔틀 플라스미드로도 언급됨)를 적절한 제한 부위에서 삽입된 Ad5 서열에 의해 작제하고 순차적 PCR에 의해 서열을 변형시켰다. 제한 효소 지도 및 서던 분석에 의해 EDRAG 작제물의 온전성을 평가했다. PCR 증폭 또는 상동 재조합에 수반되는 영역을 서열 분석으로 확인했다.
플라스미드 백본 pXL3215는 E1 영역 대신 라우스 육종 바이러스 프로모터의 통제하에 이.콜라이 lacZ 유전자를 지닌 PACi-절단성 E1 및 E3-결실된 Ad5-계 게놈(프랑스 출원 FR 2 730 504)을 함유하는 57.8 kb 길이의 RK2 유도체이다. 플라스미드 pXL3527은 pXL3215에서 자살 셔틀 pXL3521을 이용하여 이.콜라이 lacZ 발현 카세트를 인간 GAX 발현 카세트로 교체하여 유도된 것이다; 이는 AV1.0CMV.Gax 아데노바이러스의 생성을 야기한다. 플라스미드 pXL3497은 pXL2689에서 유도되고(Crouzet et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:1414-1419) 섬유 단백질의 C-말단에 (Gly-Ser)5-(Lys)7 펩티드를 나타낸다. Pac1 제한 및 E1-트랜스보충 세포에서 형질감염에 이어, 이러한 백본을 이용하여 Wickham 등(1997, J Virol, 71:8211-8229)이 기재한 AdZ.F(pK7)bgal과 일치하는 바이러스 AV1.kCMV.lacZ를 생성했다.
아데노바이러스의 생성 및 정량
T25 ㎠ 플라스크에 lipofectAMINE의 존재하에 PER.C6 세포에서 아데노바이러스 게놈의 형질감염을 수행했다. 간단히 말해서, H2O에서 희석된 PacI-절단된 DNA 플라스미드 5 ㎍을 리포펙타민 23 ㎕와 혼합했다. 부드럽게 혼합한 후, 현탁액을 실온에서 30분간 배양했다. 한편, 50-60% 합류 세포를 포스페이트로 완충된 식염수로 2회 세척한 다음 lipofectAMINE/DNA 혼합물로 교체하고 여기에 혈청없이 DMEM 3.8 ㎖를 첨가했다. 세포를 37℃에서 5 내지 8시간 동안 배양한 후, 배지를 10% 태 송아지 혈청 및 10 mM MgCl2를 함유한 DMEM으로 교체했다. 형질감염 3일 후 세포를 하나의 T75 ㎠ 플라스크로 분할했다. 세포 및 상등액을 완전 CPE(10-14일)에 수거하고 3회 동결/해동시킨 다음 원심분리에 이어 상등액을 모았다. EDRAG 기술은 상동(즉, 클로날) 집단을 만들고; 이에 따라 플라크 정제는 필요없다.
세파로스 형 지지체상에서 크로마토그래피에 의해 아데노바이러스 입자를 정확히 정량했다.
T150 ㎠ 플라스크에서 세포당 10 내지 100 바이러스 입자의 MOI에서 재조합 아데노바이러스로 대략 70% 합류에서 PER.C6 세포를 감염시켰다. 세포병리 효과가 완료될 때, 세포 및 상등액을 수거하여, 3회 동결/해동시켜, 원심분리한 다음 상등액을 모았다. 특정 경우, 회수 공정은 적절해야 한다(하기 참조).
시험관내 각종 기원의 1차 세포(평활근 세포 및 인간 기원의 내피 세포의 경우에), 및 감염되지 않는 인간 및 비-인간 종양 세포주의 패널에서 변형된 바이러스의 감염성을 평가하는데 이유는 이들이 이들의 세포 표면에서 제한된 수준의 아데노바이러스 수용체를 발현시키기 때문이다(실시예 8-10 참조). Ad5에 의해 쉽게 감염되는 세포를 이용할 경우 재조합 노브를 경쟁자로 이용했다.
펩티드 표적화 uPAR의 삽입에 의한 HI 루프에서 변형된 바이러스
Ad5 섬유의 잔기 538에서 548(GTQETGDTTPS)(서열 번호:72)을 빼내어 GSS 링커로 플랭킹된 6개의 상이한 펩티드로 대체했다. 상응하는 셔틀 플라스미드, 플라스미드 백본 및 바이러스의 작제는 실시예 2에 상세히 기재된 대로 수행했다. 모든 바이러스는 생존하지만, 몇몇(특히 바이러스 AE43, AE44 및 AE45)은 변형되지 않은 대조 바이러스에 비해 변화된 안정성을 나타내었다. 그러나 하기 과정을 이용하여 대조 바이러스에 필적할 정도의 수율(즉, 10000-20000 VP/세포)을 얻을 수 있었다: 감염 3일 후 PER.C6-감염된 세포를 수거하고 연속 동결/해동 사이클 대신 약한 완충액(Tris 10 mM pH7.5, MgCl2 1mM, Tween 20 1%, NaCl 0.25M)을 이용하여 용해시켰다; CsCl 구배상의 초원심분리에 의해 바이러스를 정제했다.
uPAR 표적화 펩티드의 HI 루프 삽입
아데노바이러스플라스미드 선택된 펩티드 링커를 지닌 펩티드 서열 번호:
pAE42 ATF 도메인(성숙 인간 우로키나제 aa 14-32) gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser 16
pAE45 돌연변이된 ATF 도메인(uPAR에 대해증가된 친화성) gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser 17
pAE48 파아지-디스플레이에 의해 선택된 펩티드 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser 19
pAE46 상기 선택된 펩티드의 돌연변이체 gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser 18
pAE43 인간 비트로넥틴에서 uPAR-결합 펩티드(Vn4) gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser 20
pAE44 인간 비트로넥틴에서 uPAR-결합 펩티드(Vn3) gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser 21
펩티드 표적화 uPAR의 삽입에 의한 HVR5 루프에서 변형된 바이러스
Ad5 헥손의 잔기 269에서 281(TTEATAGNGDNLT)(서열 번호:125)를 적당한 링커(gly-ser)에 의해 두 측면상에 플랭킹된 상기 6개의 uPAR-결합 펩티드로 대체했다. 상응하는 플라스미드 백본 및 아데노바이러스의 작제를 실시예 1과 같이 수행했다. 모든 바이러스는 살아있었다. 작제물 중 몇몇(예, AE27, AE28)은 약간의 불안정성을 나타내었고 이에 따라 정제했다(상기 참조).
uPAR 표적화 펩티드의 HVR5 루프 삽입
아데노바이러스플라스미드 선택된 펩티드 링커를 지닌 펩티드 서열 서열 번호:
pAE26 ATF 도메인 gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser 7
pAE29 돌연변이된 ATF 도메인 gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser 8
pAE47 파아지-디스플레이에 의해 선택된 펩티드(Goodson et al., 1994, PNAS 91:7129-7133) gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser- 10
pAE30 상기 선택된 펩티드의 돌연변이체 gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser- 9
pAE27 인간 비트로넥틴의 uPAR-결합 펩티드(Vn4) gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser 11
pAE28 인간 비트로넥틴의 uPAR-결합 펩티드(Vn3) gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser 12
펩티드 표적화 uPAR의 삽입 및 짧아진 섬유의 정박에 의해 HI 루프에서 변형된 바이러스.
Ad5 섬유의 잔기 538에서 548(GTQETGDTTPS)(서열 번호:72)를 삭제하고 앞서 기재된 적당한 링커(gly-ser-ser)에 의해 두 측면상에 플랭킹된 6개의 uPAR-결합 펩티드로 대체했다. 하기 표에 요약되어 있듯이 짧아진 섬유 샤프트(실시예 3 참조)와 이들 변형을 조합했다:
펩티드 표적화 uPAR의 삽입에 의해 HI 루프에서 변형된 짧은-샤프트 바이러스 부류
테일 샤프트 노브 변형
Ad5 테일 Ad3 샤프트 Ad5 HI 루프 삽입
Ad5 테일 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22 Ad5 HI 루프 삽입
Ad5 테일 Ad5의 반복부 1-3 및 20-22 Ad5 HI 루프 삽입
펩티드 표적화 uPAR의 삽입 및 짧아진 섬유의 정박에 의해 HVR5 루프에서 변형된 바이러스.
Ad5 헥손의 잔기 269에서 281를 상술된 바와 같이 적당한 링커(gly-ser)에 의해 플랭킹된 6개 상이한 펩티드로 대체했다. 이들 변형을 추가로 상술된 섬유 샤프트의 단축과 조합했다.
예를 들어, 바이러스 AE65는 헥손 HVR5 대신 gly-ser 링커에 의해 플랭킹된 NQNSRRPSRA 펩티드(서열 번호 6)를 함유하고 짧아진 섬유(샤프트 결실은 반복부 4-16을 포함함)를 지닌다. 또다른 예는 Vn3 펩티드 대신 DCRGDCF 펩티드를 함유하는 것을 제외하고는 AE65와 일치하는 바이러스 AE63이다(실시예 10, 도 13 참조).
8개 아미노산 링커의 C-말단 첨가에 이어 펩티드 표적화 uPAR에 의한 표적화를 위해 변형된 바이러스
섬유의 종결 코돈을 링커의 프롤린 코돈으로 대체한다. 모든 작제물에 이용된 링커 서열은 PKRARPGS이다.
섬유 단백질 암호 서열의 3' 말단을 변형시켜 FspI 부위를 도입했다. PCR 돌연변이를 이용하여 FspI를 위한 신규 인식 부위를 도입하는 침묵 돌연변이를 만드는 단일 염기 치환(뉴클레오티드 32778)을 행했다. Ad5 섬유 노브를 프라이머 MOL1(5'-ggaactttagaaatggagatcttactgaagg-3')(서열 번호:126)과 MOL3(5'-cgattctttattcttgcgcaatgtatgaaaaag-3')(서열 번호:127)를 이용하여 Ad5 게놈으로부터 증폭시켰다.
프라이머 MOL3는 약간의 변형을 지닌 Ad5 뉴클레오티드 32762-32794와 거의매치되어 FspI 제한 부위를 만든다. 이러한 증폭 산물을 pCR2.1(Invitrogen)에 도입시켜 pMA51을 창조했다.
섬유 단백질 암호 서열의 종결 코돈에서 하류 영역을 PCR-돌연변이로 변형시켜 올리고뉴클레오티드 MOL2(5'-cttaagtgagctgcccggggag-3')(서열 번호:128)와 MOL4(5'-ggatccaatgaacttcatcaagt-3')(서열 번호:129)를 이용하여 폴리A 영역의 상류에 AatII, NruI, SpeI 제한 부위를 도입하고, pCR2.1(Invitrogen)에서 클로닝시켜 pMA52를 만들었다.
두개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 링커 펩티드를 암호화 하는 서열을 생성했다: MOL7(5'-aattctgcgcaagaaccaaagagggccaggcccggatcctaagacgtct-3')(서열 번호:130) 및 MOL8(5'-ctagagacgtcttaggatccgggcctggccctctttggttcttgcgcag-3')(서열 번호:131). 이러한 이중 나선을 pBSSK의 EcoRI과 XbaI 부위 사이에 클로닝하고 (Stratagene) pMA53을 만들었다.
마지막으로, pMA51의 분획 BglII-FspI와 pMA53의 FspI-XbaI을 pXL2756의 BamHI과 XbaI 부위 중으로 클로닝하여 링커 서열을 섬유 단백질 암호 서열의 3'-말단에 도입시켜 벡터 pMA55를 창조했다.
pMA52의 SmaI-AatII 분획을 pMA55 SmaI-AatII 제한 부위 중으로 클로닝하여 셔틀 벡터 pMA56을 작제했다. 상기 Crouzet 등이 기재한 방법에 따라 셔틀 플라스미드 pMA55를 G4977 박테리아 균주에서 플라스미드 백본 pXL3006과 재조합시켜 C-말단 변형을 지닌 섬유를 암호화하는 PacI-절단성 E1E3-결실된 CMV/lacZ 재조합 바이러스 게놈을 함유한 플라스미드 백본 22.3을 얻었다.
추가 클로닝을 수행하여 PKRARPGS 링커를 이용하여 섬유의 C-말단에 uPAR-표적화 리간드를 첨가했다. 간단히 말해서, 이들 변형을 암호화 하는 셔틀 플라스미드를 작제하고 EDRAG법에 따라 G4977 박테리아 균주에서 아데노바이러스 플라스미드 백본 pXL3091(E1 대신 RSV-lacZ), pXL3006(E1 대신 CMV-lacZ) 또는 pXL3527(E1 대신 hGax 발현 카세트)과 재조합시켜 lacZ 또는 Gax 발현 카세트 및 C-말단 변형된 섬유 단백질을 지닌 아데노바이러스 백본을 생성했다.
bC12x를 제외한, 모든 예상 바이러스를 회수하기 이전에 PacI-제한된 백본을 911, 293 또는 PER.C6 세포로 형질감염시켰다. 이들의 생산성(VP/세포)은 변형되지 않은 대조 바이러스에 필적할 만했다.
8개 아미노산 링커에 이어 펩티드 표적화 UPAR의 C-말단 첨가에 의해 변형된 바이러스
아데노바이러스 백본/바이러스 선택된 펩티드 펩티드의 서열 서열 번호:
bc9x(RSV lacZ) ATF 도메인(aa 14-32) LNGGTCVSNKYFSNIHWCN 1
bc10x(RSV lacZ) 돌연변이된 ATF 도메인(aa 14-32) LNGGTAVSNKYFSNIHWCN 2
bc12x(RSV lacZ) 파아지-디스플레이에 의해 선택된 펩티드 AEPMPHSLNFSQYLWYT 4
bc11x(RSV lacZ) 상기 선택된 펩티드의 돌연변이체 AEPMPHSLNFSQYLWT 3
bc13x(RSV lacZ) 비트로넥틴 uPAR-결합 도메인 Vn3 NQNSRRPSRA 6
bc14x(RSV lacZ)bc15x(CMV lacZ)및 pXL3570(Gax) 비트로넥틴 uPAR-결합 도메인 Vn4 RGHSRGRNQNSR 5
부가적인 실험에서, 이들 변형을 앞서 예시한 바와 같이 섬유 샤프트의 단축과 조합했다.
실시예 5: αv 인테그린 수용체를 발현시키는 세포의 특이적 표적화
높은 친화성 αv 인테그린 결합 펩티드(CDCRGDCFC, RGD-4C로도 언급됨; Pasqualini et al, 1997, Nature Biotech. 15:542 참조) 및 이의 변이체(DCRGDCF, RGD-2C로 언급됨)가 섬유 HI 헥손 및 HVR5 루프내에 포함되거나, 섬유 단백질의 C-말단에 첨가된다. 이들 바이러스는 바이러스에서 결실된 E1 영역에 삽입된 이종 유전자(lacZ)를 함유한다.
헥손 HVR5 루프 및 섬유 단백질 HI 루프에 이들 펩티드의 삽입 방법은 상기 실시예 1과 2에 기재된 폴리오바이러스 에피토프의 경우에 기재된 바와 같다.
짧아진 섬유와 관련되거나 관련됨이 없이, 펩티드 표적화 αv 인테그린의 삽입에 의한 HI 루프에서 변형된 바이러스
Ad5 섬유의 잔기 538-548을 삭제하고 GSS 링커로 플랭킹된 펩티드로 대체했다. CMVlacZ 발현 카세트를 함유한 아데노바이러스 플라스미드 백본을 PER.C6 세포에서 형질감염시켰다: 바이러스 AE60은 살아있었고 대조 바이러스에 필적할 정도의 생산성을 지닌 PER.C6 세포에서 증폭될 수 있는 반면, PacI-절단된 pAE59 DNA의 반복된 형질감염은 상응하는 바이러스를 생성하지 못했는데, 이는 이러한 특정 작제물이 효과적으로 증식할 수 없음을 암시한다.
펩티드 표적화 αv 인테그린의 삽입에 의해 HI 루프에서 변형된 바이러스
아데노바이러스 백본 선택된 펩티드 링커를 지닌 펩티드 서열 서열 번호:
pAE59 CDCRGDCFC(서열 번호:124) gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser 22
pAE60 DCRGDCF(서열 번호 148) gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser 23
짧아진 섬유와 결부되어 펩티드 표적화 αv 인테그린의 삽입에 의해 HI 루프에서 변형된 바이러스가 얻어진다.
짧아진 섬유와 관련되거나 관련됨이 없이, 펩티드 표적화 αv 인테그린의 삽입에 의해 HVR5 루프에서 변형된 바이러스.
Ad5 헥손의 아미노산 269-281를 삭제하여 GS 링커로 플랭킹된 펩티드(상기 표에 기재된 것과 동일한 서열이 이용되었음)로 대체했다. LacZ 또는 hGax 발현 카세트를 함유한 아데노바이러스 플라스미드를 PER.C6 또는 911에서 형질감염시켜 모두 3종류의 바이러스를 회수했다. 293세포에서 AE58과 AE63 바이러스의 경우에 생산성 손실이 관찰되었지만, AE57은 정상적으로 기능했다: 이는 아마도 AE58의 경우에 헥손의 부정확한 폴딩/안정성에 기인하는 것 같고, AE63의 경우는 짧아진 섬유의 Ad 수용체 결합의 감소에 기인하는 것 같다.
짧아진 섬유와 관련되거나 관련됨이 없이, 펩티드 표적화 αv 인테그린의 삽입에 의해 HVR5 루프에서 변형된 바이러스
아데노바이러스백본 선택된펩티드 링커를 지닌 펩티드 서열 서열 번호: 섬유 샤프트의 특성
pAE58 CDCRGDCFC(서열 번호:124) gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser 13 변형되지 않음
pAE57(LacZ) 및 pXL3664(Gax) DCRGDCF(서열 번호:148) gly-ser-DCRGDCF-gly-ser 14 변형되지 않음
pAE63 DCRGDCF(서열 번호:148) gly-ser-DCRGDCF-gly-ser 14 짧아짐(re Ad5의 22)
헥손에서 RGD-2C 펩티드의 포함을 섬유의 C-말단에서 링커-펩티드 서열 PKRARPGS-K7(서열 번호 132)의 첨가와 조합했다. 상응하는 바이러스는 살았다.
실시예 6: 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 표적화된 바이러스의 작제
EDRAG 기술을 이용하여 이.콜라이에서 아데노바이러스 게놈의 유전자 변형에 의해 lacZ 또는 Gax 발현 카세트를 함유한 섬유-변형된 아데노바이러스를 작제하고 911 또는 PER.C6 세포에서 생산했다(실시예 4의 재료 및 방법 참조).
헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 결합할 것으로 예상되는 3종류 리간드를 확인했다: Wickham 등(1997, J Virol, 71:8221-8229)이 기재한 헵타라이신 직선 부위(K7), 특허 출원 WO95/21931에 기재된 아르기닌-루신 반복된 모티프 RRLLRRLLRR(서열 번호 133), 및 Digabriele 등(1998, Science, 393:812-817)이 기재한 헤파린 KRGPRTHYGQK(서열 번호 134)에 결합하는 FGF-1의 펩티드 분획.
나머지 것들 중, 5 바이러스는 섬유의 C-말단에 헵타라이신 K7 직선 부위를 가지며 트랜스유전자(lacZ 또는 Gax) 및/또는 연결의 존재(링커가 없음, (GS)5 또는 PKRARPGS)에서 차이가 난다. 바이러스 3497이 참조용으로(Wickham et al.,1997, J Virol, 71:8221-8229) 포함된다. 시험관내 및 생체내 바이러스 생산 및 형질도입 효율의 측면에서 링커 및/또는 펩티드의 중요성을 평가했다.
E1 영역에 삽입된 이종 유전자(lacZ)를 함유한 바이러스에서 헥손 HVR5 또는 섬유 HI 루프내에 폴리라이신 직선 부위도 포함된다.
헤파란 설페이트 프로테오글리칸 표적화된 바이러스
아데노바이러스 백본 캡시드의 변형
pAE61 헥손 aa 269-281를 GS-K5-GS(서열 번호 135)로 치환
pAE62 섬유 aa 538-548을 GSS-K7-GSS(서열 번호 136)으로 치환
pXL3497(lacZ) 및pXL3528(gax) 섬유 C-말단에 첨가된 (GS)5-K7(서열 번호 137)
pXL3496(lacZ) 및pXL3569(gax) 섬유 C-말단에 첨가된 PKRARPGS-K7(서열 번호 138)
pXL3631(lacZ) 섬유 C-말단에 첨가된 K7(서열 번호 139)
pXL3662(lacZ) 및pXL3665(gax) 섬유 C-말단에 첨가된 PKRARPGS-KRGPRTHYGQK(서열 번호 140)
pXL3663(lacZ) 및pXL3666(gax) 섬유 C-말단에 첨가된 PKRARPGS-RRLLRRLLRR(서열 번호 141)
모든 이들 바이러스는 살아있고 E1 트랜스보충 세포에서 증폭될 수 있었다. 하기 표 18은 moi 10 내지 100 VP/세포로 세포 감염 후 PER.C6 세포에서 수행된 일 실험에서 얻어진 수율을 요약하고 있다.
PER.C6 세포에서 바이러스의 증폭
바이러스 바이러스 입자/세포
3497 1200
3528 2300
3496 2700
3569 1000
3631 6000
3662 12160
생산성은 이러한 C-말단 섬유 연장에 의해 다양하게 영향을 받았다. 전체적으로, 이것 및 기타 데이터는 섬유 C-말단에 첨가된 연결 링커 서열의 존재가 아데노바이러스 감염 사이클/행동에 굉장한 영향을 미침을 보여준다.
주어진 링커 서열의 경우, 외래 펩티드의 존재/성질도 중요한 파라미터인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, RRLLRRLLRR 펩티드(AVl.fCMV.lacZ 또는 Ad3663)를 지닌 작제물이 매우 낮은 역가의 수율을 보인 반면 KRGPRTHYGQK 펩티드(AVl.fCMV.lacZ 또는 Ad3662)로 치환하면 생산성을 회복했다.
회수 과정도 대부분의 바이러스의 경우에 최적화되어야 한다. 상술된 68%의 총 입자 회수의 경우, 예를 들어, Ad3497의 총 5.1012VP는 2-단계 크로마토그래피 과정에 의해 성공적으로 정제되어 마지막으로 Tris 20 mM pH 8.4-10% 글리세롤에서 재현탁되었다.
실시예 7: HI 루프내에 Vn4 펩티드를 지닌 바이러스의 작제
실시예 4에 언급된 바와 같이, AE43 바이러스는 최적화된 회수 과정을 요구하는 다소 약간 수준의 불안정성을 나타냈다. 유리한 결합 특성의 상실없이 안정성을 회복하기 위해서는, Vn4 펩티드를 각종 이웃한 부위의 HI 루프에 도입했다(하기 표 19 참조). 상응하는 바이러스(E1 대신 lacZ 또는 Gax 발현 카세트를 포함함)를 이.콜라이에서 재조합 클로닝에 의해 작제하고 실시예 4에 기재된 바와 같이 911 또는 PER.C6 세포에서 증폭시켰다.
HI 루프에서 Vn4 펩티드를 지닌 바이러스
바이러스 캡시드의 변형 서열 번호
AE43 섬유 aa 538-548을 GSS-Vn4-GSS로 치환 20
GL11 섬유 aa 538-548을 GSS-Vn4+Vn3-GSS*로 치환 143
GL12 섬유 aa 538-548을 GTSE-Vn4-GSS로 치환 144
GL13 섬유 aa 538-548을 GTQE-Vn4-GSS로 치환 145
GL14 섬유 aa 538-548을 GSSS-Vn4-GSS로 치환 146
GL16 섬유 aa 538-548을 GSS-Vn4-GGS로 치환 147
GL17 섬유 aa 541-548을 SS-Vn4-GSS로 치환 142
3630(lacZ) 및3629(Gax) 섬유 aa 546(Thr)과 547(Pro) 사이에 SS-Vn4-GS의 삽입 150
* Vn4+Vn3 = RGHSRGRNQNSRRPSRA는 인간 비트로넥틴에서 유도됨
거의 모든 작제물은 변형되지 않은 대조 바이러스에 필적할 만한 생산성을 나타내었다(하기 표 20 참조).
바이러스 바이러스 입자/세포
대조 바이러스 20000 (n=2)
AE43 20000 (n=2)
GL11 200 (n=1)
GL12 20000 (n=3)
GL13 25000 (n=2)
GL14 20000 (n=1)
GL16 4000 (n=2)
GL17 15000 (n=3)
3630 10000 (n=3)
3629 14000 (n=1)
바이러스 안정성은 이러한 변형에 상이하게 영향을 받았다. 특히, 이들 중 몇몇(예, AE43, GL11, GL14 및 GL16)은 동결/해동의 연속 사이클에 민감하여 감염된 세포는 회수를 위해 약한 조건(Tris 10 mM pH 7.5, MgCl2 1mM, Tween 20 1%, NaCl 0.25M)에서 용해되어야 하며, 이는 바이러스 행동에 미치는 링커 서열의 영향력을 강조한다(실시예 9, 도 12 참조).
실시예 8: 인간 1차 세포에서 표적화된 바이러스의 평가
재료 및 방법
세포 배양
Mader 등(1992, J Gerontol. Biol. Sci. 47:b32-b36)에 따라 성인 수컷 Spraggue-Dawley 래트 또는 성인 뉴질랜드 흰토끼의 흉부 대동맥으로부터 래트 및 토끼 평활근 세포의 1차 배양액을 제조했다. 세포를 10% 태 소 혈청(FBS)과 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 37℃에서 증폭시켰다. 인간 대동맥 평활근 세포 및 HUVEC를 Clonetics로부터 구입하고 제조자의 지시에 따라 배양했다.
아데노바이러스 매개된 시험관내 유전자 전달 및 유전자 발현 분석
실험 1 내지 2일 이전에 세포를 24-웰 또는 12-웰 플레이트상에 시이딩했다. 37℃에서 1시간 동안 무혈청 배양 배지에서 희석된 아데노바이러스 벡터의 배양에 의해 세포를 moi 100 또는 1000 (VP/세포)로 감염시켰다. 세포를 세척하고 생장 배지를 48시간 동안 첨가하여 β-갈락토시다제를 발현시켰다. 세포를 용해시켜 형광 β-갈락토시다제 유전 리포터 시스템 II(Clontech)를 이용하거나 Xgal로 염색시켜 β-갈락토시다제 활성을 평가했다.
결과
β 갈락토시다제 리포터 유전자를 암호화 하는 유전자의 작제
하기 두 표 21과 22에 제시된 데이터는 대부분의 바이러스가 대조 바이러스보다 좀더 효과적으로 hSMC를 형질도입시킬 수 있고, 바이러스 AE30, AE42, AE43,AE44, AE45, AE57, AE58, AE61, AE62, BC15X 및 3497은 시험관내 및 생체내 추가 연구를 위한 우수한 후보임을 보여준다. 별도 계대된 1000 VP/세포의 moi로 감염된 1차 SMC에서 수행된 실험은 변형된 다수 바이러스의 경우 매우 상당한 형질도입이 얻어졌음을 입증해 준다(표 21과 22에 예가 제공됨). 추출물을 감염 48시간 후에 제조하고 이 시간째에 단백질과 β-갈락토시다제 활성을 정량했다. 형질도입 효율은 lacZ 특이적 활성 수준과 비교하여 평가되었다(RLU/단백질 추출물).
실험 #1
바이러스 인간 SMC에서 형질도입 효율
대조구 1
AE30 3.5
AE43 53
AE44 23
AE45 10
3497 115
BC15X 26
실험 #2
바이러스 인간 SMC에서 형질도입 효율
대조구 1
AE27 16
AE29 6
AE30 133
AE42 95
AE43 825
AE48 31
AE57 846
AE58 264
AE60 52
AE61 781
AE62 772
BC15X 47
하기 표 23은 여러 종의 SMC에서 얻어진 데이터를 요약하고 있다: 대부분의바이러스는 비-인간 세포를 효과적으로 형질도입할 수 있는데, 이는 진입 경로에서 종 장벽이 없음을 나타낸다.
여러 종에서 나온 SMC의 감염
바이러스 래트 SMC에서형질도입 효율 돼지 SMC에서형질도입 효율 토끼 SMC에서형질도입 효율
대조구 1 1 1
BC15X - 97(n=1) -
AE 43 77 (n=2) 753(n=2) 131(n=3)
AE 62 166(n=2) 2166(n=2) 320(n=5)
3497 50(n=2) 349(n=2) 55(n=2)
3496 295(n=2) 2318(n=2) 437(n=2)
AE 57 - 2960(n=1) -
AE 63 21(n=2) 293(n=2) 23(n=2)
n=실험 횟수
캡시드 변형에 이어 관찰된 형질도입의 증가가 최소한 부분적으로는 감염성 증가에 기인함을 증명하기 위해, moi 1000 VP/세포로 감염된 인간 SMC에서 추출된 바이러스 DNA상에서 정량 PCR을 수행했다. 동시에, 단백질 추출물에서 RLU 측정을 행했다.
표 24는 최상의 후보자 바이러스를 특징으로 하는 인간 평활근 세포 형질도입 효율 값이 (정도에 있어 상이하지만) 모든 경우에 DNA 진입 증가와 상관관계가 있음을 보여준다. 상관관계는 바이러스 AE43과 BC15X의 경우에 특히 우수하다.
게놈 전달 및 트랜스유전자 발현
바이러스 게놈/세포a RLU/㎍ 총 단백질 RLU 비(ratio) 게놈 비(ratio)
대조구AE30AE43AE453497BC15X 3.32118742712440 191641677345102077981851206221151255004672 13.5531011526 16426.51303812.3
a 게놈/세포는 PCR에 의해 정량된 바이러스 게놈의 양과 감염된 세포 수간의 비임b RLU 비: 표시된 바이러스의 RLU 수준과 대조 바이러스의 RLU 수준간의 비.c 게놈 비: 표시된 바이러스의 게놈의 양과 대조 바이러스의 게놈의 양간의 비
SMC에서 진입 경로는 도 4와 5에서 설명하듯이 가용성 헤파린 또는 가용성 uPAR를 경쟁시켜 분석되었다.
도 4에서, hSMC를 가용성 헤라린의 투여량을 증가시키면서 moi 1000 (VP/세포)로 감염시켰다. 세포를 PBS에서 세척한 다음 37℃에서 추가 배양했다. 추출물을 감염 후 48시간째에 제조하고 이 시간째에 총 단백질과 β-갈락토시다제 활성을 정량했다. 데이터는 폴리라이신-함유 바이러스에 의한 hSMC의 감염이 가용성 헤파린에 의해 특이적으로 억제됨을 보여주는데 이는 이들 바이러스가 세포 표면의 세포 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 부착함을 보여준다. 반면, 예상했듯이, AE43은 이러한 특이적 진입 경로를 사용하지 않는다.
도 5에서, 바이러스를 가용성 uPAR의 투여량을 증가시키면서(0에서 9.4 ㎍/㎖) 미리배양한 다음 moi 1000 (VP/세포)로 hSMC상에서 배양시켰다. 세포를 PBS에서 세척한 다음 37℃에서 추가 배양했다. 추출물을 감염 48시간 후에 제조하고 이 시간째에 총 단백질 및 β-갈락토시다제 활성을 정량했다. 데이터는 몇몇 uPAR-표적화 바이러스(예, AE43)에 의한 hSMC의 감염이 재조합 가용성 uPAR에 의해 특이적으로 억제됨을 보여준다. 이러한 hSMC는 이의 세포 표면에서 uPAR을 강하게 발현시키는데(주어진 데이터는 없음) 이는 세포 진입을 위한 이러한 특정 수용체의 사용을 암시한다.
Gax 암호 표적화된 아데노바이러스
웨스턴 블랏(하기 도면)을 이용하여 감염된 hSMC에서 Gax 발현 수준을 분석했다. Gax 발현의 최고 수준 증가는 바이러스 3528(섬유의 C-말단에서 K7)로 감염시킨 후에 얻어졌다. moi 3000 VP/세포에서 모든 변형된 바이러스의 경우에 Gax 단백질이 검출되었지만, 동일한 moi에서 대조 바이러스로 감염된 세포에서 Gax 발현은 검출되지 않았다.
도 6은 표적화된 아데노바이러스로 감염된 인간 SMC에서 Gax 발현을 설명하고 있다. 표시된 moi(VP/세포)로 감염시킨 후 24시간 째 단백질 추출물을 제조했다. (1) AV1.0CMVrGax moi 3.104, (2) AV1.0CMVrGax moi 104, (3) 3528 moi 104, (4) 3528 moi 3.103, (5) 3528 moi 300, (6) 3569 moi 3.103, (7) 3569 moi 300, (8) 3570 moi 104및 (9) 3570 moi 3.103.
도 7은 표적화된 아데노바이러스로 인간 SMC를 감염시킨 후 Gax 발현을 설명하고 있다. 표시된 moi(VP/세포)로 감염시킨지 24시간 후에 단백질 추출물을 제조했다.
좌측 패널: (1) AV1.0CMVrGax moi 3.104(2) AV1.0CMVhGax moi 3.104, (3)AV1.0CMVhGax moi 3.103, (4) 3528 moi 3000, (5) 3528 moi 300, (6) 3528 moi 30, (7) 3569 moi 3000, (8) 3569 moi 300 및 (9) 3569 moi 30.
우측 패널: (1) AV1.0CMVrGax moi 3.104(2) AV1.0CMVhGax moi 3.104, (3) AV1.0CMVhGax moi 3.103, (4) 3570 moi 3000, (5) 3570 moi 300, (6) 3570 moi 30, (7) 3569 moi 3000, (8) 3569 moi 300 및 (9) 3629 moi 30.
상이한 moi로 hSMC를 감염시킨 후 FACS 분석에 의해 Gax 발현을 입증했다. 비록 이러한 기술의 감도가 웨스턴 블랏보다 높지만, 결과는 웨스턴 실험과 상관되고 하기 표 25에서 보여주듯이 hSMC를 효과적으로 형질도입하는 능력면에서 바이러스 3570과 3629보다 바이러스 3528과 3569가 비교적 우수함을 보여준다.
인간 SMC의 감염 후 Gax 발현의 FACS 평가(Gax 발현 세포(%)는 감염 24시간 후에 측정했음)
바이러스 10000 VP/세포 1000 VP/세포 100 VP/세포
AV1.0CMVrGax 100% 52% -
AV1.0CMVhGax 86% 8% -
3528 nd 99% 99%
3569 nd 99% 99%
3570 nd 99% 8%
3629 nd 99% 18%
실시예 9: 인간 종양 세포에서 표적화된 바이러스의 시험관내 평가
Hs578T 세포(인간 유방암 세포)는 대부분 이의 세포 표면에 제한된 양의 바이러스 수용체를 발현시키기 때문에 Ad5 감염에 대해 매우 내성적이다. 실제로,세포의 50%를 감염시키기 위해서는 105VP/세포만큼 높은 moi가 필요하다. 캡시드-변형된 벡터의 패널에 의해 형질도입되는 이들의 능력을 시험했다.
도 8a, 8b, 8c 및 9는 여러 표적화된 바이러스를 이용한 Hs578T 감염에 관해 설명하고 있다. 감염 48시간 후에 세포 추출물을 제조했다. 데이터는 AE43, AE44, AE45 또는 3497이 이러한 세포 타입을 형질도입하는데 매우 효과적임을 보여준다.
AE43의 감염 경로는 가용성 노브 섬유 또는 가용성 uPAR을 경쟁시켜 분석되었다(도 10과 11).
도 10에서, AE43을 가용성 uPAR로 미리배양한 다음 Hs578T를 감염시켰다. 감염 48시간 후에 세포 추출물을 제조했다.
도 11에서, AE43을 가용성 uPAR(10㎍/2 108VP) 또는 가용성 노브(100 ㎍/㎖)로 미리배양한 다음 Hs578T를 감염시켰다. 감염 48시간 째 세포 추출물을 제조했다.
결과는 AE43이 전통적인 노브-CAR 경로로 세포에 진입하지 않고 uPAR-의존 진입 경로를 이용함을 보여준다.
마지막으로, Hs578T 세포를 형질도입하는 능력면에서 Vn4-함유 바이러스 3630, GL12, GL14 또는 GL17을 AE43과 비교했다. 도 12에서 알 수 있듯이, 감염 48시간 후, 연결 링커의 존재는 실제로 HI 루프에 삽입된 결합 펩티드가 세포 표면의 특이적 수용체와 상호작용하는 효율에 굉장히 영향을 미칠 수 있다.
실시예 10: 쥐 종양 세포에서 표적화된 바이러스의 시험관내 평가
쥐 NIH-3T3 세포는 세포의 50% 를 감염시키는데 100000 VP/세포 이상이 필요하기 때문에 Ad5 감염에 매우 내성적이다. 캡시드-변형된 바이러스의 패널에 의해 형질도입되는 능력을 시험했다. 세포 추출물을 감염 48시간 후에 제조했다. 도 13은 AE28, AE43, AE44, AE58, AE57 또는 AE62가 특히 효과적임을 입증하는 대표적인 실험에서 나온 데이터를 포함한다. 또한, 중요하게는, AE63(짧은 섬유, 헥손에서 RGD-2C)은 짧은-샤프트 대조 바이러스(vBS1; 헥손에 삽입이 없음)와 관련된 결함을 부분적으로 구조할 수 있는 것으로 나타났다. 네이티브 진입 경로에 영향을 주는 캡시드 변형(예, 짧은 샤프트를 지닌 섬유)은 감염을 위해 부가적인, CAR-독립 경로를 제공하는 캡시드 변형과 조합될 수 있다.
AE43과 BC15X의 감염 경로를 가용성 uPAR과 경쟁시켜 분석했다(도 14a와 14b). 도 14a와 14b에서, 세포를 배양하기 이전에 가용성 uPAR의 투여량을 증가시켜가며 바이러스 BC15X(A)와 AE43(B)를 미리배양했다(각각 moi 1000 및 200 VP/세포). 세포를 세척하고 37℃에서 48시간 동안 추가 배양한 다음 세포 추출물을 제조했다. 이들 및 기타 데이터는 이들 바이러스가 감염을 위해 uPAR을 사용함을 보여준다.
실시예 11: 재협착증 토끼 모델에서 표적화된 바이러스의 생체내 평가
표적화된 몇몇 바이러스의 생체내 평가를 재협착증에 우수한 모델인 죽종증 더블 상처 토끼 모델에서 수행했다: 전달은 죽종증 장공 동맥에서 일어나며; 토끼에게는 매일 120 g의 1% 콜레스테롤 식이를 공급했으며 3주째 기구 혈관형성술에의한 초기 상처를 2.5 mm 직경의 Nycomed 기구 카테테르로 수행했다. 1주 후, 아데노바이러스 유전자 전달을 수행했다.
β-갈락토시다제를 위한 SMC 염색의 현미경 정량을 사용하여 유전자 전달 효율을 조사했다(조직 화학 분석). 간단히 말해, 32 단편/동맥을 조사하여 XGgal-양성 세포를 헤아렸다. 데이터는 1 동맥의 경우 32 단편 중에서 최고의 스코어로서 표시되었다. 결과는 하기 표 26에 나타나 있다.
재협착증 토끼 모델에서 표적화된 바이러스의 생체내 평가
주입된 바이러스 1011VP/동맥 5.1011VP/동맥
대조 바이러스 양성 동맥: 0/8 양성 동맥:7/10*<30 염색된 세포를 지닌 6 동맥*200-400 염색된 세포를 지닌 1 동맥
AE57헥손에서 RGD-2C 양성 동맥:0/6 양성 동맥:2/2*<30 염색된 세포를 지닌 2 동맥
AE43HI 섬유에서 VN4 양성 동맥:5/6*<30 염색된 세포를 지닌 2 동맥*30-100 염색된 세포를 지닌 2 동맥*>400 염색된 세포를 지닌 1 동맥
BC15XC-말단 섬유에서 VN4 양성 동맥:4/4* <30 염색된 세포를 지닌 1 동맥* 30-100 염색된 세포를 지닌 1 동맥* 100-200 염색된 세포를 지닌 1 동맥* 200-400 염색된 세포를 지닌 1 동맥
이들 데이터는 아데노바이러스 AE43과 BC15X가 변형되지 않은 대조구에 비해 엄청나게 증가된 효율로서 동맥벽을 형질도입시킴을 보여준다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 양태에 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 기재된 것 이외에 본 발명의 각종 변형이 상기 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 행해질 수 있다. 이러한 변형도 첨부된 청구항의 범위내인 것으로 한다.
핵산 또는 폴리펩티드의 경우에 주어진 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 분자량 또는 분자 질량값 모두 근사치이고 설명을 위해 주어지는 것으로 해석한다.
본원에서 언급된 각종 간행물들은 본원에서 참고된다.

Claims (88)

  1. 헥손 HRV5 루프의 최소 일부가 결합 펩티드 또는 표적화 서열로 대체되고, 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내도록 연결 아미노산 스페이서에 의해 플랭킹되는 아데노바이러스.
  2. 제 1 항에 있어서, 헥손 HVR5 루프로부터 약 6 내지 17개의 아미노산의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 헥손 HVR5 루프로부터 14개 아미노산을 초과하지 않는 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 헥손 HVR5 루프로부터 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 약 13개 아미노산의 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산을 포함하는 아데노바이러스.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산을 포함하는 아데노바이러스.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나에서 최초 아미노산이 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 아데노바이러스.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서에서 최초 아미노산이 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 아데노바이러스.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나에서 최초 아미노산이 글라이신 잔기인 아데노바이러스.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서의 최초 아미노산이 글라이신 잔기인 아데노바이러스.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나가디펩티드인 아데노바이러스.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나가 Gly-Ser 디펩티드인 아데노바이러스.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)에 대한 리간드 에피토프인 아데노바이러스.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 항에 있어서, 표적화 서열이 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2); AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); 및 NQNSRRPSRA(서열 번호:6)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아데노바이러스.
  15. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서를 포함한 표적화 서열이
    A. gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:7);
    B. gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:8);
    C. gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser (서열 번호:9);
    D. gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser (서열 번호:10);
    E. gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:11);
    F. gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:12);
    G. gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser (서열 번호:13);
    H. gly-ser-DCRGDCF-gly-ser (서열 번호:14); 및
    I. gly-ser-KKKKKKK-gly-ser (서열 번호:15)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아데노바이러스.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입에서 유도된 아데노바이러스.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 서브그룹 C에서 유도된 아데노바이러스.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입 5에서 유도된 아데노바이러스.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 단백질이 야생형 섬유 샤프트보다 짧은 섬유 샤프트를 가지도록 변형되는 아데노바이러스.
  20. 제 19 항에 있어서, 섬유 샤프트가 프레임내 결실에 의해 짧아지는 재조합아데노바이러스.
  21. 제 19 항에 있어서, 섬유 샤프트가 또다른 혈청타입의 샤프트로 대체되어 짧아지는 재조합 아데노바이러스.
  22. 제 19 항에 있어서, 섬유 샤프트가 인간 서브그룹 C(Ad2 또는 Ad5)에서 유도된 것이고 혈청타입 3(Ad3)의 샤프트로 대체되어 짧아지는 재조합 아데노바이러스.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 샤프트가 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22; Ad5의 반복부 1-3 및 20-22; 또는 아데노바이러스 혈청타입 3(Ad3) 샤프트를 함유하는 아데노바이러스.
  24. 헥손 HI 루프의 최소 일부가 결합 펩티드, 또는 표적화 서열로 대체되고, 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내도록 연결 아미노산 스페이서에 의해 플랭킹되는 아데노바이러스.
  25. 제 24 항에 있어서, 헥손 HI 루프로부터 약 6 내지 17개의 아미노산 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 헥손 HI 루프로부터 11개 아미노산을 초과하지 않는 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 헥손 HI 루프로부터 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 약 11개의 아미노산 결실을 포함하는 아데노바이러스.
  28. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하는 아데노바이러스.
  29. 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하는 아데노바이러스.
  30. 제 24 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나에서 최초 아미노산이 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 아데노바이러스.
  31. 제 24 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서에서 최초 아미노산이 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산인 아데노바이러스.
  32. 제 24 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나에서 최초 아미노산이 글라이신 잔기인 아데노바이러스.
  33. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서의 최초 아미노산이 글라이신 잔기인 아데노바이러스.
  34. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나가 트리펩티드인 아데노바이러스.
  35. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 중 적어도 하나가 Gly-Ser-Ser 트리펩티드인 아데노바이러스.
  36. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)에 대한 리간드 에피토프인 아데노바이러스.
  37. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 항에 있어서, 표적화 서열이 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2);AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); 및 NQNSRRPSRA(서열 번호:6)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아데노바이러스.
  38. 제 24 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서를 포함한 표적화 서열이
    A. gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:16);
    B. gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:17);
    C. gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser (서열 번호:18);
    D. gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser (서열 번호:19);
    E. gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser (서열 번호:20);
    F. gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser (서열 번호:21);
    G. gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser (서열 번호:22);
    H. gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser (서열 번호:23);
    I. gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser (서열 번호:24);
    J. ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:143);
    K. tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:144);
    L. tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:145);
    M. ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:146); 및
    N. ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly (서열 번호:147)로 이루어진 그룹 중에서선택되는 아데노바이러스.
  39. 제 24 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입에서 유도되는 아데노바이러스.
  40. 제 24 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 서브그룹 C에서 유도되는 아데노바이러스.
  41. 제 24 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입 5에서 유도되는 아데노바이러스.
  42. 제 24 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 단백질이 야생형 섬유 샤프트보다 짧은 섬유 샤프트를 가지도록 변형되는 아데노바이러스.
  43. 제 42 항에 있어서, 섬유 샤프트가 프레임내 결실에 의해 짧아지는 재조합 아데노바이러스.
  44. 제 42 항에 있어서, 섬유 샤프트가 또다른 혈청타입의 샤프트로 대체되어 짧아지는 재조합 아데노바이러스.
  45. 제 42 항에 있어서, 섬유 샤프트가 인간 서브그룹 C(Ad2 또는 Ad5)에서 유도된 것이고 혈청타입 3(Ad3)의 샤프트로 대체되어 짧아지는 재조합 아데노바이러스.
  46. 제 24 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 샤프트가 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22; Ad5의 반복부 1-3 및 20-22; 또는 아데노바이러스 혈청타입 3(Ad3) 샤프트를 함유하는 아데노바이러스.
  47. 결합 펩티드, 또는 표적화 서열이 기능적으로 캡시드 표면에서 결합 특이성을 나타내도록 연결 스페이서 또는 링커에 의해 섬유의 C-말단에 연결되는 재조합 아데노바이러스 벡터.
  48. 제 47 항에 있어서, 연결 스페이서가 글라이신, 세린, 트레오닌, 알라닌, 시스테인, 아스파테이트, 아스파라진, 메티오닌 및 프롤린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  49. 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서, 스페이서에서 최초 아미노산이 프롤린인 재조합 아데노바이러스.
  50. 제 47 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입에서 유도되는 재조합 아데노바이러스.
  51. 제 50 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 서브그룹 C에서 유도되는 재조합 아데노바이러스.
  52. 제 50 항에 있어서, 인간 아데노바이러스 혈청타입 5에서 유도되는 재조합 아데노바이러스.
  53. 제 47 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 단백질이 야생형 섬유 샤프트보다 짧은 섬유 샤프트를 가지도록 변형되는 아데노바이러스.
  54. 제 53 항에 있어서, 섬유 샤프트가 프레임내 결실에 의해 짧아진 재조합 아데노바이러스.
  55. 제 53 항에 있어서, 섬유 샤프트가 또다른 혈청타입의 샤프트로 대체되어 짧아진 재조합 아데노바이러스.
  56. 제 47 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 샤프트가 서브그룹 C에서 유도된 것이고 반복부 4-16 또는 반복부 4-19를 포함한 프레임내 결실을 포함하는 재조합 아데노바이러스.
  57. 제 47 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유 샤프트가 서브그룹 C에서 유도되고 혈청타입 3(Ad3)의 샤프트로 대체되어 짧아진 재조합 아데노바이러스.
  58. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 5 내지 30개의 아미노산을 포함한 스페이서 또는 링커 펩티드를 포함하는 아데노바이러스.
  59. 제 47 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 또는 링커 펩티드가 서열 PKRARPGS(서열 번호 149)를 포함하는 아데노바이러스.
  60. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)에 대한 리간드 에피토프인 아데노바이러스.
  61. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 7 내지 15개 아미노산을 포함한, 헤파린에 결합하는 FGF-1의 펩티드 분획인 아데노바이러스.
  62. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 5 내지 10개의 라이신 잔기로 구성되는 아데노바이러스.
  63. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 대개 7개의 라이신 잔기로 구성되는 아데노바이러스.
  64. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 5 내지 10개의 Arg-Arg 및 Leu-Leu 모티프로 구성된 아데노바이러스.
  65. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 서열이 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2); AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); NQNSRRPSRA(서열 번호:6); RRLLRRLLRR(서열 번호:133); 및 KRGPRTHYGQK(서열 번호:134)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아데노바이러스.
  66. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드를 포함한 표적화 서열이 서열 PKRARPGSKKKKKKK(서열 번호 132)를 포함하는 아데노바이러스.
  67. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드를 포함한 표적화 서열이 서열 PKRARPGSRRLLRRLLRR(서열 번호 141)을 포함하는 아데노바이러스.
  68. 제 47 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 펩티드를 포함한 표적화 서열이 서열 PKRARPGSKRGPRTHYGQK(서열 번호 140)을 포함하는 아데노바이러스.
  69. A. 아데노바이러스의 캡시드 단백질의 일 부위로부터 네이티브 아미노산 서열을 삭제하고;
    B. 표적화 서열의 N-말단의 제1 스페이서와 C-말단의 제2 스페이서에 의해 연결된 표적화 펩티드 서열을 삽입시키는 단계를 포함하는 아데노바이러스 벡터의 세포 트로피즘의 변형 방법에 있어서,
    표적화 펩티드가 헥손 HVR5 루프로부터 아데노바이러스 Ad5의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 약 13개의 아미노산; 및 섬유 단백질 HI 루프로부터 Ad5의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 약 11개의 아미노산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 결실 부위에 삽입되는 방법.
  70. 제 69 항에 있어서, 제1 스페이서가 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하는 방법.
  71. 제 69 항에 있어서, 제 2 스페이서가 글라이신과 세린으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산을 포함하는 방법.
  72. 제 69 항에 있어서, 표적화 서열이 우로키나제-형 플라스미노겐 활성자 수용체(UPAR)에 대한 리간드 에피토프인 방법.
  73. 제 72 항에 있어서, 표적화 서열이 LNGGTCVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:1); LNGGTAVSNKYFSNIHWCN(서열 번호:2); AEPMPHSLNFSQYLWT(서열 번호:3); AEPMPHSLNFSQYLWYT(서열 번호:4); RGHSRGRNQNSR(서열 번호:5); 및 NQNSRRPSRA(서열 번호:6)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  74. 제 69 항에 있어서, 스페이서를 포함한 표적화 서열이 HVR5 루프에 삽입되고 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
    A. gly-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:7);
    B. gly-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser (서열 번호:8);
    C. gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser (서열 번호:9);
    D. gly-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser (서열 번호:10);
    E. gly-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:11);
    F. gly-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:12);
    G. gly-ser-CDCRGDCFC-gly-ser (서열 번호:13);
    H. gly-ser-DCRGDCF-gly-ser (서열 번호:14); 및
    I. gly-ser-KKKKKKK-gly-ser (서열 번호:15).
  75. 제 69 항에 있어서, 스페이서를 포함한 표적화 서열이 섬유 단백질 HI 루프에 삽입되고, 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법:
    A. gly-ser-ser-LNGGTCVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:16);
    B. gly-ser-ser-LNGGTAVSNKYFSNIHWCN-gly-ser-ser (서열 번호:17);
    C. gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWT-gly-ser-ser (서열 번호:18);
    D. gly-ser-ser-AEPMPHSLNFSQYLWYT-gly-ser-ser (서열 번호:19);
    E. gly-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser-ser (서열 번호:20);
    F. gly-ser-ser-NQNSRRPSRA-gly-ser-ser (서열 번호:21);
    G. gly-ser-ser-CDCRGDCFC-gly-ser-ser (서열 번호:22);
    H. gly-ser-ser-DCRGDCF-gly-ser-ser (서열 번호:23);
    I. gly-ser-ser-KKKKKKK-gly-ser-ser (서열 번호:24);
    J. ser-ser-RGHSRGRNQNSRRPSRA-gly-ser (서열 번호:143);
    K. tyr-ser-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:144);
    L. tyr-gln-glu-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:145);
    M. ser-ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-ser (서열 번호:146);
    N. ser-ser-RGHSRGRNQNSR-gly-gly (서열 번호:147).
  76. 제 69 항에 있어서, 섬유 단백질 샤프트를 단축시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  77. 제 69 항에 있어서, 섬유 샤프트가 Ad5의 반복부 1-3 및 17-22; Ad5의 반복부 1-3 및 3-20; 또는 Ad3 샤프트를 포함하는 방법.
  78. HVR5 루프로부터 아데노바이러스 혈청타입5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 269에서 대략 아미노산 잔기 281에 상응하는 약 13개의 아미노산의 결실; 및 결실 부위에 표적화 서열의 N-말단의 제1 스페이서와 C-말단의 제2 스페이서에 의해 연결된 표적화 펩티드 서열의 삽입을 포함하는 아데노바이러스 헥손.
  79. HI 루프로부터 아데노바이러스 혈청타입 5(Ad5)의 대략 아미노산 잔기 538에서 대략 아미노산 잔기 548에 상응하는 약 11개 아미노산의 결실; 및 결실 부위에 표적화 서열의 N-말단의 제1 스페이서와 C-말단의 제2 스페이서에 의해 연결된 표적화 펩티드 서열의 삽입을 포함하는 아데노바이러스 섬유 단백질.
  80. C-말단에 링커 펩티드와 표적화 펩티드를 포함하는 아데노바이러스 섬유 단백질.
  81. 표적 세포를 함유한 세포 집단을 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항의 아데노바이러스, 또는 제 69 항 내지 제 77항 중 어느 한 항의 방법에 따라 얻어진 아데노바이러스와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법에 있어서, 표적화 서열이 표적 세포상의 수용체에 대한 리간드 에피토프인 방법.
  82. 표적 세포를 함유한 세포 집단을 제 13 항, 제 60 항 또는 제 72 항의 표적화된 아데노바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는, UPAR을 발현시키는 표적 세포에서 유전자를 선택적으로 발현시키는 방법.
  83. 제 81 항에 있어서, 표적화된 아데노바이러스 벡터가 종양 치료 유전자를 암호화하는 이종 유전자를 포함하는 방법.
  84. 제 81 항에 있어서, 아데노바이러스가 재협착증 치료 유전자를 포함하는 방법.
  85. 제 1 항 내지 제 68 항의 표적화된 아데노바이러스 벡터, 또는 제 69 항 내지 제 77 항의 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는 유전자 요법에 의한 질환의 치료방법.
  86. 유전자 요법에 의한 질환 치료용 약제를 제조하기 위해 제 1 항 내지 제 68 항의 표적화된 아데노바이러스 벡터, 또는 제 69 항 내지 제 77 항의 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터의 용도.
  87. 제 1 항 내지 제 68 항의 표적화된 아데노바이러스 벡터, 또는 제 69 항 내지 제 77 항의 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터를 함유한 약제.
  88. 제 1 항 내지 제 68 항의 표적화된 아데노바이러스 벡터, 또는 제 69 항 내지 제 77 항의 방법에 따라 얻어진 표적화된 아데노바이러스 벡터, 및 유효량의 약학적으로 활성인 부형제를 함유하는 약학 조성물.
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