ES2246533T3 - Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. - Google Patents
Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas.Info
- Publication number
- ES2246533T3 ES2246533T3 ES98917294T ES98917294T ES2246533T3 ES 2246533 T3 ES2246533 T3 ES 2246533T3 ES 98917294 T ES98917294 T ES 98917294T ES 98917294 T ES98917294 T ES 98917294T ES 2246533 T3 ES2246533 T3 ES 2246533T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- adenovirus
- fiber
- residues
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/851—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from growth factors; from growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
Abstract
La invención se refiere a fibras de adenovirus modificadas mediante la mutación de uno o más residuos. Los residuos se dirigen hacia receptores de células naturales en la estructura tridimensional de dicho adenovirus. La invención se refiere además a un fragmento de DNA y a un vector de expresión, y la línea de células que expresan dicha fibra, y también se refiere a los adenovirus, los procedimientos para producir este tipo de adenovirus y una célula huésped infectable, así como a sus aplicaciones terapéuticas y las correspondientes composiciones farmacéuticas.
Description
Fibra adenovírica modificada y adenovirus
dianas.
La presente invención se refiere a una fibra
adenovírica mutada en las regiones implicadas en el reconocimiento y
la unión del receptor celular natural de los adenovirus. Se refiere
igualmente a los adenovirus recombinantes que portan en su
superficie dicha fibra, y un ligante que les confiere una
especificidad de huésped modificado o diana hacia un tipo celular
particular, a las células que contienen estos adenovirus, así como a
un método para preparar partículas víricas infecciosas de estos
últimos, destinadas al uso terapéutico. La invención presenta un
interés muy particular para perspectivas de terapia génica,
especialmente en el ser humano.
Gracias a sus propiedades particulares, los
adenovirus se usan en un número creciente de aplicaciones en terapia
génica. Puestos en evidencia en numerosas especies animales, son
poco patógenos, no integradores, y se replican tanto en las células
en división como en las quiescentes. Además, presentan una amplia
gama de huéspedes, y son capaces de infectar un número muy grande de
tipos celulares tales como las células epiteliales, endoteliales,
los miocitos, los hepatocitos, las neuronas y los sinoviocitos
(Bramson et al., 1995, Curr. Op. Biotech. 6,
590-595). Sin embargo, esta ausencia de
especificidad de infección podría constituir un límite para la
utilización de los adenovirus recombinantes; por una parte, a nivel
de la seguridad, puesto que puede haber una diseminación del gen
recombinante en el organismo huésped, y, por otra parte, a nivel de
la eficacia, puesto que el virus no infecta específicamente al tipo
celular que se desea tratar.
De manera general, el genoma adenovírico está
constituido por una molécula de ADN lineal, bicatenario y de
aproximadamente 36 kb, que contiene los genes que codifican las
proteínas víricas, y en sus extremos tiene dos repeticiones inversas
(denominadas ITR por Repetición Terminal Inversa (Invert Terminal
Repeat, en inglés)) que intervienen en la replicación y en la
región de encapsidamiento. Los genes precoces se reparten en 4
regiones dispersas en el genoma adenovírico (E1 a E4; E por precoz
(early, en inglés)), que contienen 6 unidades de
transcripción provistas de sus propios promotores. Los genes tardíos
(L1 a L5; L por tardío (late, en inglés)) recubren, en parte,
las unidades de transcripción precoces, y son, en su mayoría,
transcritos a partir del promotor principal tardío MLP (por Promotor
Principal Tardío (Major Late Promoter, en inglés)).
A título indicativo, todos los adenovirus
utilizados en los protocolos de terapia génica son deficientes para
la replicación, por supresión de al menos la región E1, y se
propagan en una línea celular de complementación, que suministra en
trans las funciones víricas suprimidas. Se utiliza
corrientemente la línea 293, establecida a partir de células de
riñones embrionarios humanos, que complementa eficazmente la función
E1 (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36,
59-72). En la bibliografía se han propuesto
recientemente vectores de segunda generación. Conservan las regiones
en cis necesarias para la replicación del virus en la célula
infectada (las ITR y las secuencias de encapsidamiento), y contienen
supresiones internas importantes con el objetivo de suprimir lo
esencial de los genes víricos cuya expresión in vivo puede
conducir al establecimiento de respuestas inflamatorias o
inmunitarias en el huésped. Los vectores adenovíricos y sus técnicas
de preparación son objeto de numerosas publicaciones accesibles para
el experto en la técnica.
El ciclo infeccioso de los adenovirus se
desarrolla en 2 etapas. La fase precoz preceda la iniciación de la
replicación y permite producir las proteínas precoces que regulan la
replicación y la transcripción del ADN vírico. A la replicación del
genoma le sigue la fase tardía durante la cual se sintetizan las
proteínas estructurales que constituyen las partículas víricas. La
unión de los nuevos viriones toma su sitio en el núcleo. En un
primer momento, las proteínas víricas se unen a fin de formar
cápsidas vacías de estructura icosaédrica, en las que el genoma se
encapsida. Los adenovirus liberados son susceptibles de infectar a
otras células permisivas. Para este fin, la fibra y el pentón base
presentes en la superficie de las cápsidas tienen un papel crítico
en la unión celular de los viriones y su interiorización.
El adenovirus se une a un receptor celular
presente en la superficie de las células permisivas, a través del
intermedio de la fibra trimérica (Philipson et al., 1968, J.
Virol. 2, 1064-1075; Defer et al.,
1990, J. Virol. 64, 3661-3673). Después, la
partícula se introduce mediante endocitosis por unión del pentón
base a las integrinas celulares \alpha_{V}\beta_{3} y
\alpha_{V}\beta_{5} (Mathias et al., 1994, J. Virol.
68, 6811-6814). La capacidad de la fibra
soluble o de anticuerpos anti-fibra para inhibir la
infección demuestra su papel en la unión celular del virus.
La fibra está compuesta de 3 dominios (Chroboczek
et al., 1995, Current Top. Microbiol. Immunol. 199,
165-200):
- (1)
- En N-terminal, la cola, muy conservada de un serotipo a otro, interacciona con el pentón base y asegura el anclaje de la molécula en la cápsida.
- (2)
- El tallo es una estructura con forma de bastoncito, compuesto de un número de repeticiones de hojas \beta, variando este número según los serotipos.
- (3)
- Finalmente, en el extremo distante del tallo, la cabeza es una estructura globular esférica que contiene las señales de trimerización (Hong y Engler, 1996, J. Virol. 70, 7071-7078; Novelli y Boulanger, 1991, J. Biol. Chem. 266, 9299-9303; Novelli y Boulanger, 1991, Virology 185, 365-376). Además, la mayoría de los datos experimentales muestran que el dominio de la cabeza es responsable de la unión a las células permisivas (Henry et al., 1994, J. Virol 68, 5239-5246; Louis et al., 1994, J. Virol. 68, 4104-4106).
Ya se han propuesto en la bibliografía adenovirus
"diana" cuya fibra nativa se modifica a fin de reconocer a un
receptor celular diferente. Así, el documento WO94/10323 describe
mutantes de la fibra de Ad5 en los que una secuencia que codifica un
fragmento de anticuerpo (de tipo scFv) se inserta al final de una de
las 22 unidades repetitivas del tallo, con el objeto de modificar la
especificidad de infección frente a células que presentan el
antígeno diana. El documento US nº 5.543.328 describe una fibra
quimera Ad5 en la que el dominio de la cabeza se sustituye por el
factor de necrosis tumoral (TNF) a fin de interaccionar con el
receptor celular del TNF. En otra construcción, la fibra nativa de
Ad5 se fusiona en su extremo C-terminal al péptido
ApoE permitiendo una unión al receptor LDL (por Lipoproteína de baja
densidad (low density lipoprotein, en inglés)) presente en la
superficie de las células hepáticas. El documento WO95/26412
describe una fibra, modificada mediante incorporación de un ligante
en el extremo C-terminal, que conserva sus
capacidades de trimerización. El documento WO96/26231 describe una
fibra quimera obtenida mediante sustitución de una parte de la fibra
nativa, y en particular de la cabeza, por la parte equivalente de
una fibra adenovírica de otro serotipo, y eventualmente mediante
inserción, en el extremo C-terminal, de un péptido
RGD específico de la vitronectina. Gall et al., J. Virol.,
vol. 70, 1996, p. 2116-2123, describe la
preparación de un adenovirus quimérico en el que se procede a la
sustitución completa de las fibras del adenovirus de tipo 5 por
fibras de adenovirus de tipo 7. Esta sustitución completa (cabeza,
tallo y cola de la fibra) está destinada a modificar la
especificidad de reconocimiento de la partícula adenovírica.
McClelland et al., J. Cell. Biochem, 1995, p. 411, describe
la sustitución de la cabeza de la fibra de Ad5 (delimitada por los
nucleótidos 405-592) por una secuencia capaz de
reconocer un sitio de unión diferente del de la fibra de Ad5. Tras
esta sustitución de la totalidad de la cabeza de la fibra, se
constata que es posible modificar la especificidad de reconocimiento
de la fibra adenovírica.
Como se indica anteriormente, la especificidad de
infección de un adenovirus se determina por la unión de la fibra
adenovírica a un receptor celular situado en la superficie de las
células permisivas. La solicitud de patente francesa 97 01005
destaca el papel de los antígenos del complejo mayor de
histocompatibilidad de clase I y de los módulos III de la
fibronectina como receptor primario y cofactor de los adenovirus,
respectivamente. Sin embargo, pueden intervenir otras proteínas.
Para este fin, trabajos recientes han conjeturado la utilización del
receptor celular de los virus Coxsackie por los adenovirus de tipo 2
y 5 para penetrar en sus células diana (Bergelson et al.,
1997, Science 275, 1320-1323). El problema
que la presente invención propone resolver es modificar la región de
interacción de la fibra adenovírica con el o los receptores
celulares a fin de alterar la especificidad de huésped natural de
los adenovirus que portan la fibra mutada. Para facilitar la
comprensión, se utilizará, en lo siguiente, la expresión "receptor
celular" de los adenovirus para designar el o los polipéptidos
celulares que intervienen directamente o no en la unión de los
adenovirus a sus células diana naturales o en la penetración en el
seno de estas últimas. Bien entendido, dicho receptor puede ser
diferente según los serotipos. La adición de un ligante permite
conferir un nuevo tropismo hacia uno o varios tipos celulares
específicos que portan en su superficie una molécula diana
reconocida por el ligante en cuestión.
La presente invención constituye una mejora de la
técnica anterior porque da a conocer las regiones de la fibra a
mutar, para inhibir o impedir la unión al receptor celular natural
de los adenovirus. Ahora se ha sustituido uno o varios residuos de
la región 443 a 462 de la cabeza de la fibra de Ad5, y se ha
demostrado una inhibición de la capacidad de infección de los
adenovirus correspondientes a células normalmente permisivas. La
introducción del ligante GRP (por péptido liberador de gastrina
(Gastrin Releasing Peptide, en inglés)) en el seno de estas fibras
debería permitir una individualización de la infección hacia las
células que expresan el receptor del GRP. El objetivo de la presente
invención es disminuir las cantidades terapéuticas de adenovirus a
utilizar, e individualizar la infección a las células a tratar. Esta
especificidad es indispensable cuando se utiliza un adenovirus que
expresa un gen citotóxico, para evitar la propagación del efecto
citotóxico a las células sanas. Las ventajas proporcionadas por la
presente invención son una reducción de los riesgos de diseminación
y de los efectos secundarios relacionados con la tecnología
adenovírica.
Es por ello que la presente invención tiene por
objeto una fibra de un adenovirus, modificada por mutación de uno o
varios residuos de dicha fibra, caracterizada porque dichos residuos
se dirigen hacia el receptor celular natural de dicho
adenovirus.
El término "fibra" se define ampliamente en
la parte introductoria. La fibra de la presente invención puede
derivar de un adenovirus de origen humano, canino, aviar, bovino,
murino, ovino, porcino, o símico, o también puede ser híbrido y
comprender fragmentos de orígenes diversos. Haciendo referencia a
los adenovirus humanos, se prefiere utilizar los de serotipo C, y
especialmente los adenovirus de tipo 2 ó 5 (Ad2 o Ad5). Se indica
que la fibra de Ad2 contiene 580 aminoácidos (aa), cuya secuencia se
da a conocer en Herissé et al., (1981, Nucleic Acid Res.
9, 4023-4042). La fibra de Ad5 presenta 582
aa, y su secuencia, presentada en el identificador de secuencia 1
(SEC ID nº 1), ha sido determinada por Chroboczek y Jacrot (1987,
Virology 161, 549-554). Cuando la fibra de la
presente invención es originaria de un adenovirus animal, se recurre
preferentemente a los adenovirus bovinos, y en particular a los de
la cepa BAV-3. Estos últimos han sido el objeto de
numerosos estudios, y la secuencia de la fibra se da a conocer en la
Solicitud Internacional WO95/16048. Bien entendido, la fibra de la
presente invención puede presentar otras modificaciones con relación
a la secuencia nativa, además de las que son objeto de la
presente
invención.
invención.
De acuerdo con los objetivos perseguidos por la
presente invención, la fibra según la invención se modifica a fin de
reducir o abolir su capacidad de unión al receptor celular natural.
Tal propiedad se puede verificar mediante el estudio de la capacidad
infecciosa o de la unión celular de los virus correspondientes,
aplicando las técnicas de la técnica anterior, tales como las
detalladas a continuación. Según una forma de realización ventajosa,
las propiedades de trimerización y de unión al pentón base no se ven
afectadas.
En el sentido de la presente invención, el
término "mutación" designa una supresión, una sustitución o
también una adición de uno o varios residuos, o una combinación de
estas posibilidades. Se prefiere más particularmente el caso en el
que las regiones de interacción con el receptor celular natural se
suprimen en su totalidad o en parte, y se sustituyen especialmente
por un ligante específico de una proteína de superficie celular
diferente de la del receptor natural de los adenovirus.
La estructura cristalográfica tridimensional de
la cabeza adenovírica ha sido determinada por Xia et al.
(1994, Structure 2, 1259-1270). Cada monómero
contiene 8 hojas \beta antiparalelas denominadas A a D y G a J, y
6 bucles mayores de 8 a 55 residuos. Por ejemplo, el bucle CD une la
hoja \beta C a la hoja \beta D. Se indica que se considera que
las hojas menores E y F forman parte del bucle DG situado entre las
hojas D y G. A título indicativo, la tabla 1 indica la localización
de estas estructuras en la secuencia de aminoácidos de la fibra de
Ad5, tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1 (SEC
ID nº: 1), representando el +1 el residuo Met iniciador. De manera
general, las hojas forman una estructura ordenada y compacta
mientras que los bucles son más flexibles. Estos términos son
clásicos en el campo de la bioquímica de las proteínas, y se definen
en los documentos base (véase, por ejemplo, Stryer, Biochemistry, 2ª
edición, Cap. 2, p. 11 a 39, Ed. Freeman and Company, San
Francisco).
| Hoja \beta | bucle | ||
| Nomenclatura | residuos | nomenclatura | residuos |
| A | 400 a 403 | AB | 404 a 418 |
| B | 419 a 428 | - | - |
| C | 431 a 440 | CD | 441 a 453 |
| D | 454 a 461 | DG | 462 a 514 |
| G | 515 a 521 | GH | 522 a 528 |
| H | 529 a 536 | HI | 537 a 549 |
| I | 550 a 557 | IJ | 558 a 572 |
| J | 573 a 578 |
Las cuatro hojas \beta A, B, C y J constituyen
las hojas V dirigidas hacia la partícula vírica. Las otras cuatro
(D, G, H e I) forman las hojas R, supuestamente enfrentadas al
receptor celular. Las hojas V parecen tener un papel importante en
la trimerización de la estructura, mientras que las hojas R estarían
implicadas en la interacción con el receptor. Los residuos de la
fibra de Ad2, Ad3, Ad5, Ad7, Ad40, Ad41 y del adenovirus canino CAV,
que forman estas diferentes estructuras, se indican claramente en la
referencia anterior.
Las modificaciones de la fibra adenovírica según
la invención se refieren más particularmente a la parte que
comprende el bucle CD, la hoja D y la parte próxima del bucle DG
(posiciones 441 a 478 de la fibra de Ad2 y de Ad5), y, más
particularmente, la región que se extiende de los residuos 443 a 462
para la Ad5, o 451 a 466 en el caso de la Ad2. La otra región diana
para las modificaciones es la hoja H (aa 529 a 536 de la fibra de
Ad5 y de la fibra de Ad2). Otra alternativa consiste en la
modificación de las hojas menores E (aa 479-482 Ad5)
y F (aa 485-486 Ad5).
Como se indica anteriormente, se puede operar
mediante sustitución de uno o más aminoácidos en las regiones
expuestas. Se pueden citar, a este respecto, los ejemplos siguientes
que derivan de la fibra de Ad5, en la que:
- -
- el residuo glicina en posición 443 se sustituye por un ácido aspártico,
- -
- el residuo leucina en posición 445 se sustituye por una fenilalanina,
- -
- el residuo glicina en posición 450 se sustituye por una asparagina,
- -
- el residuo treonina en posición 451 se sustituye por una lisina,
- -
- el residuo valina en posición 452 se sustituye por una asparagina,
- -
- el residuo alanina en posición 455 se sustituye por una fenilalanina,
- -
- el residuo leucina en posición 457 se sustituye por una alanina o una lisina, y/o
- -
- el residuo isoleucina en posición 459 se sustituye por una alanina.
Es posible asimismo introducir varias
sustituciones en el seno de la región diana de la fibra,
especialmente a nivel de los aminoácidos que forman un codo,
preferentemente de tipo \alpha\alpha (véase la Tabla 2 de Xia
et al., 1994, más arriba). A título ilustrativo, se
pueden citar los dos ejemplos siguientes, en los que la fibra de Ad5
se modifica mediante sustitución:
- -
- del residuo glicina en posición 443 por un ácido aspártico,
- -
- del residuo serina en posición 444 por una lisina, y
- -
- del residuo alanina en posición 446 por una treonina,
o también
- -
- del residuo serina en posición 449 por un ácido aspártico,
- -
- del residuo glicina en posición 450 por una lisina,
- -
- del residuo treonina en posición 451 por una leucina, y
- -
- del residuo valina en posición 452 por una treonina.
Asimismo, los aminoácidos de sustitución se
mencionan únicamente a título indicativo, y cualquier aminoácido
puede ser conveniente para los fines de la presente invención. Se
prefiere, sin embargo, no modificar de manera drástica la estructura
tridimensional. Preferentemente, los aminoácidos que forman un codo
se sustituirán por residuos que forman una estructura similar, tales
como los citados en la referencia de Xia et al. ya
mencionada.
La fibra de la presente invención se puede
igualmente modificar mediante supresión. La región eliminada puede
implicar todo o una parte del dominio expuesto, y especialmente del
bucle CD, de la hoja D, del bucle DG y/o de las hojas E y F.
Haciendo referencia a una fibra de Ad5 según la invención, se puede
citar más particularmente la supresión:
- -
- de la región que se extiende de la serina en posición 454 a la fenilalanina en posición 461,
- -
- de la región que se extiende de la valina en posición 441 a la glutamina en posición 453,
- -
- de la región que se extiende de la valina en posición 441 a la fenilalanina en posición 461, o
- -
- de la región que se extiende de la asparagina en posición 479 a la treonina en posición 486.
Igualmente es posible generar otros mutantes de
sustitución o de supresión en las otras hojas o bucles, como por
ejemplo las hojas G, H e I, y los bucles HI y DG.
Igualmente es posible sustituir, cuando una al
menos de las modificaciones es una supresión de al menos 3 residuos
consecutivos de un bucle y/o de una hoja, los residuos suprimidos
por residuos de un bucle y/o de una hoja equivalente que deriva de
una fibra de un segundo adenovirus susceptible de interaccionar con
un receptor celular diferente del reconocido por el primer
adenovirus. El segundo adenovirus puede ser de cualquier origen
humano o animal. Esto permite mantener la estructura de la fibra
según la invención, confiriéndole una especificidad de huésped que
corresponde a la del segundo adenovirus. Como se indica en Xia et
al. (1994, más arriba), el receptor celular que mide la
infección de los adenovirus de tipo 2 y 5 es diferente del que
interacciona con los adenovirus de tipo 3 y 7. Así, una fibra de Ad5
o de Ad2, a la que se le suprimen al menos 3 residuos consecutivos
entre los especificados aquí arriba, se puede sustituir por los
residuos que provienen de una región equivalente de la fibra de Ad3
o de Ad7, para reducir su capacidad para unirse al receptor de Ad5 y
conferirle una nueva especificidad por el receptor celular de Ad3 o
de Ad7. A título de ejemplo no limitativo, se puede citar la
sustitución de los residuos LAPISGTVQSAHLIIRFD (posición 445 a 462)
de la fibra de Ad5 por los residuos VNTLFKNKNVSINVELYFD de la fibra
de Ad3, o la sustitución de los residuos PVTLTITL (posición 529 a
536) de la fibra de Ad5 por los residuos PLEVTVML de la fibra de
Ad3.
La presente invención se refiere igualmente a una
fibra de un adenovirus que presenta una capacidad de unión al
receptor celular natural sustancialmente reducida, y sin embargo es
capaz de trimerizarse y de unirse al pentón base. Como se indica a
continuación, el receptor celular natural se selecciona
ventajosamente de entre el grupo que consta de los antígenos mayores
de histocompatibilidad de clase I, la fibronectina y el receptor
celular de los virus Coxsackie (CAR), o cualquier otro determinante
de superficie celular que interviene habitualmente o que participa
en la capacidad de infecciosa de los adenovirus.
Según una forma de realización particularmente
ventajosa, la fibra según la invención comprende además un ligante.
En el sentido de la presente invención, el término ligante define
toda entidad capaz de reconocer y unirse a, preferentemente con una
fuerte afinidad, una molécula de superficie celular diferente del
receptor celular natural. Esta molécula se puede expresar o exponer
en la superficie de la célula que se desea seleccionar como diana
(marcador de superficie celular, receptor, péptido antigénico
presentado por los antígenos de histocompatibilidad, etc.). Conforme
a los objetivos buscados por la presente invención, un ligante puede
ser un anticuerpo, un péptido, una hormona, un polipéptido o también
un azúcar. El término anticuerpo comprende especialmente los
anticuerpos monoclonales, los fragmentos de anticuerpos (Fab), y los
anticuerpos de cadena simple (scFv). Estas denominaciones y
abreviaturas son convencionales en el campo de la inmunología.
En el campo de la presente invención, puede ser
particularmente interesante seleccionar como diana una célula
tumoral, una célula infectada, un tipo celular particular o una
categoría de células que portan un marcador de superficie
específico. Por ejemplo, si la célula huésped a seleccionar como
diana es una célula infectada por el virus del VIH (virus de la
inmunodeficiencia humana (Human Immunodeficiency Virus, en inglés)),
el ligante puede ser un fragmento de anticuerpo contra la fusina, el
receptor CD4 o contra una proteína vírica expuesta (glicoproteína de
recubrimiento), o también la parte de la proteína TAT del virus del
VIH que se extiende de los residuos 37 a 72, (Fawell et al.,
1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
664-668). Haciendo referencia a una célula tumoral,
la elección recaerá sobre un ligante que reconoce un antígeno
específico de tumor (por ejemplo, la proteína MUC-1
en el caso del cáncer de mama, algunos epítopos de las proteínas E6
o E7 del virus del papiloma HPV), o sobreexpresado (receptor de
IL-2 sobreexpresado en algunos tumores linfoides,
péptido GRP (péptido liberador de gastrina; de Gastrin Releasing
Peptide, en inglés) sobreexpresado en las células de carcinoma de
pulmón (Michaël et al., 1995 Gene Therapy 2,
660-668) y en los tumores del páncreas, de la
próstata y del estómago). Si se desea seleccionar como dianas a los
linfocitos T, se puede utilizar un ligante del receptor de célula T.
Por otra parte, la transferrina es un buen candidato para
seleccionarla como diana hepática. De manera general, los ligantes
que se pueden utilizar en el contexto de la invención se describen
ampliamente en la bibliografía, y se pueden clonar mediante técnicas
estándares. Es igualmente posible sintetizarlos por vía química y
acoplarlos a la fibra según la invención. Para ello, el acoplamiento
de residuos de galactosilo debería conferir una especificidad
hepática como consecuencia de la interacción con los receptores de
las asialoglicoproteínas. Pero la forma de realización preferida
consiste en insertar el ligante en el extremo
C-terminal de la fibra según la invención, o en
sustitución de los residuos suprimidos cuando una al menos de las
modificaciones es una supresión de al menos 3 residuos
consecutivos.
La presente invención se refiere igualmente a un
fragmento de ADN que codifica una fibra según la invención, así como
a un vector de expresión de tal fragmento. Para este fin se puede
utilizar todo tipo de vector, ya sea de origen plasmídico o vírico,
integrativo o no. Tales vectores están disponibles comercialmente o
se describen en la bibliografía. Igualmente, el experto en la
técnica es capaz de adaptar los elementos de regulación necesarios
para la expresión del fragmento de ADN según la invención. Además,
se puede asociar a una o más sustancias susceptibles de mejorar la
eficacia transfeccional y/o la estabilidad del vector. Estas
sustancias están ampliamente documentadas en la bibliografía,
accesible para el experto en la técnica (véanse, por ejemplo,
Felgner et al., 1989, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32,
115-121; Hodgson y Solaiman, 1996, Nature
Biotechnology 14, 339-342; Remy et
al., 1994, Bioconjugate chemistry 5,
647-654). A título ilustrativo y no limitativo,
pueden ser polímeros, lípidos, especialmente catiónicos, liposomas,
proteínas nucleares y lípidos neutros. Una combinación potencial es
un vector asociado con lípidos catiónicos (DC-Chol,
DOGS, etc.) y lípidos neutros (DOPE).
La presente invención se refiere igualmente a un
adenovirus desprovisto de una fibra nativa funcional, y que
comprende en su superficie una fibra según la invención. Ésta se
puede expresar mediante el genoma adenovírico, o se puede llevar en
trans mediante una línea celular de complementación, tal como
las definidas a continuación. Además, puede comprender un ligante,
tal como se define aquí arriba. Preferentemente, la especificidad de
unión de tal adenovirus con su receptor celular natural está
reducida de manera significativa o, mejor, abolida, debido a la
fibra modificada que porta. La pérdida de la especificidad natural
se puede evaluar mediante estudios de unión celular realizados en
presencia de virus marcados (por ejemplo, con la
^{3}H-timidina según la técnica de Roelvink et
al., 1996, J. Virol. 70, 7614-7621), o
mediante estudios de capacidad infecciosa de células permisivas, o
que expresan la molécula de superficie seleccionada como diana por
el ligante (véanse los ejemplos siguientes).
El ligante se puede acoplar de manera química al
adenovirus según la invención. Pero se prefiere la variante según la
cual las secuencias que codifican el ligante se insertan en el seno
del genoma adenovírico, en particular en el seno de las secuencias
que codifican la fibra modificada según la invención,
preferentemente en fase, a fin de preservar el marco de lectura. La
inserción puede tener lugar en un sitio cualquiera. Sin embargo, el
sitio de inserción preferido está corriente arriba 5' del codón de
parada en el extremo C-terminal o en el lugar de los
residuos suprimidos. Es igualmente factible introducir las
secuencias del ligante en el seno de otras secuencias adenovíricas,
especialmente las que codifican otra proteína de cápsida, como el
hexón o el pentón.
Ventajosamente, un adenovirus según la invención
es recombinante y defectuoso para la replicación, es decir, incapaz
de replicación autónoma en una célula huésped. La deficiencia se
obtiene mediante mutación o supresión de uno o varios genes víricos
esenciales y, especialmente, de toda o de parte de la región E1. Se
pueden considerar supresiones en el seno de la región E3 para
aumentar las capacidades de clonación. Sin embargo, puede ser
ventajoso conservar las secuencias que codifican la proteína gp19k
(Gooding y Wood, 1990, Critical Reviews of Immunology 10,
53-71) a fin de modular las respuestas inmunitarias
del huésped. Bien entendido, el genoma de un adenovirus según la
invención puede igualmente comprender supresiones o mutaciones
suplementarias que afectan a otras regiones, especialmente las
regiones E2, E4 y/o L1-L5 (véase, por ejemplo, la
Solicitud Internacional WO94/28152, y Ensinger et al., 1972,
J. Virol. 10, 328-339, que describen la
mutación termosensible del gen DBP de E2).
Según una forma de realización preferida, un
adenovirus según la invención es recombinante, y comprende uno o
varios genes de interés puestos bajo control de los elementos
necesarios para su expresión en una célula huésped. El gen en
cuestión puede ser de origen cualquiera, genómico, ADNc (ADN
complementario) o híbrido (minigén desprovisto de uno o varios
intrones). Se puede obtener mediante las técnicas convencionales de
biología molecular o mediante síntesis química. Puede codificar un
ARN antisentido, una ribosima o un ARNm que se traducirá después en
polipéptido de interés. Éste puede ser citoplásmico, membranario o
se puede segregar de la célula huésped. Por otra parte, puede
tratarse de todo o parte de un polipéptido tal como se encuentra en
la naturaleza, de un polipéptido quimera que proviene de la fusión
de secuencias de orígenes diversos, o de un polipéptido mutado con
relación a la secuencia nativa que presenta propiedades biológicas
mejoradas y/o modificadas.
En el campo de la presente invención, puede
resultar ventajoso utilizar los genes que codifican los polipéptidos
siguientes:
- -
- citoquinas o linfoquinas (interferones \alpha, \beta y \gamma, interleuquinas y especialmente la IL-2, IL-6, IL-10 o IL-12, factores de necrosis tumoral (TNF), factores estimulantes de colonias (GM-CSF, C-CSF, M-CSF, etc.);
- -
- receptores celulares o nucleares, especialmente los reconocidos por los organismos patógenos (virus, bacterias o parásitos) y, preferentemente, por el virus del VIH o sus ligantes (ligante fas);
- -
- proteínas implicadas en una enfermedad genética (factor VII, factor VIII, factor IX, distrofina o minidistrofina, insulina, proteína CFTR (regulador de la transmisión transmembránica de la fibrosis cística; en inglés, Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), hormonas del crecimiento (hGH);
- -
- enzimas (ureasa, renina, trombina, etc.);
- -
- inhibidores de enzimas (\alpha1-antitripsina, antitrombina III, inhibidores de proteasas víricas, etc.);
- -
- polipéptidos con efecto antitumoral capaces de inhibir al menos parcialmente la iniciación o la progresión de tumores o cánceres (anticuerpos, inhibidores que actúan a nivel de la división celular o de las señales de transdución, productos de expresión de los genes supresores de tumores, por ejemplo p53 o Rb, proteínas que estimulan el sistema inmunitario, etc.);
- -
- proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad de las clases I ó II, o proteínas reguladoras que actúan sobre la expresión de los genes correspondientes;
- -
- polipéptidos capaces de inhibir una infección vírica, bacteriana o parasitaria, o su desarrollo (polipéptidos antigénicos que tienen propiedades inmunógenas, epítopos antigénicos, anticuerpos, variantes transdominantes susceptibles de inhibir la acción de una proteína nativa mediante competición, etc.);
- -
- toxinas (timidina quinasa del virus del herpes simple 1 (TK-HSV-1), ricina, toxina colérica, diftérica, etc.) o inmunotoxinas;
- -
- marcadores (\beta-galactosidasa, luciferaza, etc.);
- -
- polipéptido que tiene un efecto sobre la apoptosis (inductor de apoptosis: Bax, etc., inhibidor de apoptosis Bcl2, Bclx), agentes citostáticos (p21, p16, Rb...), las apolipoproteínas (apoE, etc.), SOD, catalasa, óxido nítrico sintasa (NOS); y
- -
- factores de crecimiento (FGF por factor de crecimiento de fibroblastos (Fibroblast Growth Factor, en inglés), VEGF por factor del crecimiento celular endotelial vascular (Vascular Endotelial cell growth Factor, en inglés), etc.).
Debe destacarse que esta lista no es limitativa y
que se pueden utilizar igualmente otros genes.
Por otra parte, un adenovirus según la invención
puede, además, comprender un gen de selección que permite
seleccionar o identificar las células infectadas. Se pueden citar
los genes neo (que codifican la neomicina fosfotransferasa)
que confiere una resistencia al antibiótico G418, dhfr
(dihidrofolato reductasa), CAT (cloranfenicol
acetil-transferasa), pac (puromicina
acetil-transferasa), o también gpt (xantina
guanina fosforribosil-transferasa). De manera
general, los genes de selección son conocidos por el experto en la
técnica.
Por elementos necesarios para la expresión de un
gen de interés en una célula huésped, se entiende el conjunto de los
elementos que permiten su transcripción en ARN, y la traducción de
un ARNm en proteína. Entre estos, el promotor reviste una
importancia particular. En el campo de la presente invención, puede
derivar de un gen cualquiera de origen eucariota o también vírico, y
puede ser constitutivo o regulable. Por otra parte, se puede
modificar a fin de mejorar la actividad promotora, suprimir una
región inhibidora de la transcripción, hacer un promotor consecutivo
regulable o viceversa, introducir un sitio de restricción, etc.
Alternativamente, puede tratarse del promotor natural del gen a
expresar. Se pueden mencionar, a título de ejemplo, los promotores
víricos CMV (citomegalovirus), RSV (virus del sarcoma de Rous),
promotores del gen TK del virus del HSV-1, promotor
precoz del virus SV40 (virus del simio 40), el promotor adenovírico
MLP, o también los promotores eucariotas de los genes PGK
(fosfoglicerato quinasa) murino o humano, MT (metalotionina),
\alpha1-antitripsina y albúmina (específica del
hígado), inmunoglobulinas (específicas de linfocitos). Igualmente se
puede utilizar un promotor específico de tumor (\alpha
fetoproteína AFP, Ido et al., 1995, Cancer Res. 55,
3105-3109; muc-1; PSA por antígeno
específico de la próstata (prostate specific antigen, en inglés),
Lee et al., 1996, J. Biol. Chem. 271,
4561-4568; y flt 1, específico de las células
endoteliales, Morishita et al., 1995, J. Biol. Chem.
270, 27948-27953).
Asimismo, un gen de interés de uso en la presente
invención puede además comprender elementos adicionales necesarios
para su expresión (secuencia intrónica, secuencia señal, secuencia
de localización nuclear, secuencia terminadora de la transcripción,
sitio de iniciación de la traducción de tipo IRES u otro, etc.), o
también para su mantenimiento en la célula huésped. Tales elementos
son conocidos por el experto en la técnica.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de un adenovirus según la invención,
según el cual:
- -
- se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular apropiada,
- -
- se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
- -
- se recupera dicho adenovirus del cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
La elección de la línea celular depende de las
funciones deficientes del adenovirus según la invención, y se
utilizará una línea de complementación capaz de suministrar en
trans la o las funciones defectuosas. La línea 293 conviene
para complementar la función E1 (Graham et al., 1977, J. Gen.
Virol. 36, 59-72). Para una doble deficiencia
E1 y E2 o E4, se puede utilizar una línea entre las descritas en la
solicitud de patente francesa 96 04413. Igualmente se puede utilizar
un virus auxiliar para complementar el adenovirus defectuoso según
la invención en una célula huésped cualquiera, o también un sistema
mixto que utiliza una célula de complementación y un virus auxiliar
en el que los elementos dependen unos de otros. Los medios de
propagación de un adenovirus defectuoso son conocidos por el experto
en la técnica, que puede referirse por ejemplo a Graham y Prevec
(1991, Methods in Molecular Biology, vol. 7, p.
190-128; ed. E.J. Murey, The Human Press Inc.). El
genoma adenovírico se reconstituye preferentemente in vitro
en Escherichia coli (E. coli) mediante ligación o también
mediante recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la Solicitud
francesa 94 14470). Los procedimientos de purificación se describen
en la técnica anterior. Se puede citar la técnica de centrifugación
en gradiente de densidad.
La presente invención se refiere igualmente a una
línea celular que comprende, bien en forma integrada en el genoma o
bien en forma de episoma, un fragmento de ADN que codifica una fibra
según la invención puesto bajo control de los elementos que permiten
su expresión. Dicha línea puede además ser capaz de complementar un
adenovirus deficiente para una o varias funciones seleccionadas
entre las codificadas por las regiones E1, E2, E4 y
L1-L5. Deriva preferentemente de la línea 293. Tal
línea puede ser útil para la preparación de un adenovirus cuyo
genoma está desprovisto de toda o de parte de las secuencias que
codifican la fibra (a fin de producir una fibra no funcional). La
presente invención tiene igualmente por objeto el procedimiento
correspondiente, según el cual:
- -
- se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular según la invención,
- -
- se cultiva dicha línea transfectada en las condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
- -
- se recupera dicho adenovirus en el cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
La presente invención se refiere igualmente a una
célula huésped infectada por un adenovirus según la invención, o
susceptible de ser obtenida mediante un procedimiento según la
invención. Se trata ventajosamente de una célula de mamífero y,
especialmente, de una célula humana. Ésta puede ser primaria o
tumoral, y de cualquier origen, por ejemplo hematopoyética (célula
madre totipotente, leucocito, linfocito, monocito o macrófago,
etc.), muscular (célula satélite, miocito, mioblasto, célula
muscular lisa), cardíaco, nasal, pulmonar, traqueal, hepático,
epitelial o fibroblasto.
La invención tiene igualmente por objeto una
composición farmacéutica que comprende, como agente terapéutico o
profiláctico, una célula huésped o un adenovirus según la invención,
o susceptible de ser obtenido mediante un procedimiento según la
invención, en asociación con un soporte farmacéuticamente aceptable.
La composición según la invención se destina, particularmente, al
tratamiento preventivo o curativo de enfermedades tales como las
enfermedades genéticas (hemofilia, mucoviscidosis, diabetes o
miopatía de Duchenne, de Becker, etc.), los cánceres, tales como los
inducidos por oncogenes o virus, las enfermedades víricas, como la
hepatitis B o C y el SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida
que resulta de la infección por el VIH), las enfermedades víricas
recurrentes, como las infecciones víricas provocadas por el virus
del herpes, y las enfermedades cardiovasculares, que incluyen las
restenosis.
Una composición farmacéutica según la invención
se puede fabricar de manera convencional. En particular, se asocia
una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico o
profiláctico a un soporte tal como un diluyente. Una composición
según la invención se puede administrar por vía local, sistémica, o
por aerosol, particularmente por vía intragástrica, subcutánea,
intracardíaca, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal,
intratumoral, intrapulmonar, intranasal o intratraqueal. La
administración puede tener lugar en una dosis única o repetida una o
varias veces tras un cierto tiempo de intervalo. La vía de
administración y la dosis apropiadas varían en función de diversos
parámetros, por ejemplo, del individuo o de la enfermedad a tratar,
o también del o de los genes de interés a transferir. En particular,
las partículas víricas según la invención se pueden formular en
forma de dosis comprendida entre 10^{4} y 10^{14} ufp (unidades
formadoras de placas), ventajosamente 10^{5} y 10^{13} y,
preferentemente, 10^{6} y 10^{12} ufp. La formulación puede
igualmente incluir un diluyente, un coadyuvante, un excipiente
farmacéuticamente aceptable, al igual que un agente estabilizante,
conservante y/o solubilizante. Una formulación en disolución salina,
no acuosa o isotónica conviene particularmente para una
administración inyectable. Se puede presentar en forma líquida o
seca (por ejemplo, liofilizado, et.), o en cualquier otra forma
galénica corrientemente utilizada en el campo farmacéutico.
Finalmente, la presente invención se refiere al
uso terapéutico o profiláctico de un adenovirus o de una célula
huésped según la invención, o de un adenovirus susceptible de ser
obtenido mediante un procedimiento según la invención, para la
preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cuerpo
humano o animal mediante terapia génica. Según una primera
posibilidad, el medicamento se puede administrar directamente in
vivo (por ejemplo mediante inyección intravenosa, en un tumor
accesible, en los pulmones por aerosol, etc.). Igualmente se puede
adoptar el enfoque ex vivo, que consiste en extraer células
del paciente (células madre de la médula ósea, linfocitos de la
sangre periférica, células musculares, etc.), transfectarlas o
infectarlas in vitro según las técnicas anteriores, y de
readministrarlas al paciente.
La invención se extiende igualmente a un método
de tratamiento según el cual se administra una cantidad
terapéuticamente eficaz de un adenovirus, o de una célula huésped
según la invención, a un paciente que necesita de tal
tratamiento.
Los siguientes ejemplos ilustran únicamente una
forma de realización de la presente invención.
Las construcciones descritas a continuación se
realizan según las técnicas generales de ingeniería genética y de
clonación molecular, detalladas en Maniatis et al. (1989,
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY), o según las recomendaciones del fabricante cuando se
utilice un kit comercial. Las etapas de clonación que utilizan
plásmidos bacterianos se realizan preferentemente en la cepa de
E. coli 5K (Hubacek y Glover, 1970, J. Mol. Biol. 50,
111-127) o BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol.
166, 557-580). Preferentemente, se utiliza
esta última cepa para las etapas de recombinación homóloga. La cepa
NM522 (Stratagène) conviene para la propagación de los vectores
fágicos M13. Las técnicas de amplificación mediante PCR son
conocidas por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, PCR
Protocols-A guide to methods and applications, 1990,
editado por Innis, Gelfand, Sninsky y White, Academic Press Inc.).
En cuanto a la reparación de los sitios de restricción, la técnica
utilizada consiste en un llenado de los extremos 5' protuberantes
con la ayuda del gran fragmento del ADN polimerasa I de E.
coli (Klenow). Las secuencias nucleotídicas Ad5 son las
utilizadas en el banco de datos Genebank con la referencia
M73260.
En cuanto a la biología celular, las células se
transfectan según las técnicas estándares bien conocidas por el
experto en la técnica. Se puede citar la técnica con fosfato de
calcio (Maniatis et al., más arriba), pero igualmente
se puede utilizar cualquier otro protocolo, tal como la técnica de
DEAE dextrano, la electroporación, los métodos basados en choques
osmóticos, la microinyección, o los métodos basados en el uso de
lípidos catiónicos. En cuanto a las condiciones de cultivo, son las
clásicas. En los ejemplos siguientes se recurre a la línea humana
293 (ATCC CRL1573) y a las líneas murinas Swiss 3T3 (ATCC CCL92),
NR6 (Wells et al., 1990, Science 247;
962-964), NR6-hEGFR (Schneider et
al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
333-336), Daudi HLA- (ATCC CCL213) y Daudi HLA+
(Quillet et al., 1988, J. Immunol. 141,
17-20). Se indica que la línea Daudi se establece a
partir de un linfoma de Burkitt, y naturalmente es deficiente en la
expresión de la \beta-2 microglobulina y, de este
modo, no posee en su superficie las moléculas HLA de clase I (Daudi
HLA-). La línea celular E8.1 derivada de los Daudi se ha generado
mediante transfección de un gen que codifica la
\beta-2 microglobulina a fin de restaurar la
expresión de moléculas HLA de clase I en sus superficies
(Daudi-HLA+; Quillet et al., 1988, J.
Immunol. 141, 17-20). Se entiende que se
pueden igualmente utilizar otras líneas celulares.
El plásmido pTG6593 deriva de p poli II (Lathe
et al., 1987, Gene 57, 193-201) por
introducción del gen completo que codifica la fibra de Ad5 en forma
de un fragmento EcoRI-SmaI (nucleótidos (nt) 30049 a
33093). El fragmento HindIII-SmaI (nt
31994-33093) se aísla y se clona en M13TG130 (Kieny
et al., 1983, Gene 26, 91-99) digerido
por estas mismas enzimas, para dar M13TG6526. Este último se somete
a una mutagénesis dirigida con la ayuda del oligonucleótido oTG7000
(SEC ID nº: 2) (kit Sculptor, mutagénesis in vitro, Amersham)
a fin de introducir un adaptador que codifica una brazo espaciador
de 12 aminoácidos de secuencia PSASASASAPGS. El vector mutado así
obtenido, M13TG6527, se somete a una segunda mutagénesis que permite
introducir la secuencia que codifica los 10 residuos del péptido GRP
(GNHWAVGHLM; Michael et al., 1995, Gene Ther. 2,
660-668). Para ello, se utiliza el oligonucleótido
oTG7001 (SEC ID nº: 3). El fragmento HindIII-SmaI se
aísla del fago mutado M13TG6528, y se introduce mediante la técnica
de recombinación homóloga (Chartier et al., 1996, J. Virol.
70, 4805-4810) en el plásmido pTG6590, que
porta el fragmento de genoma adenovírico Ad5 que se extiende de los
nt 27081 a 35935, y se linealiza mediante MunI (nt 32825). El
fragmento SpeI-ScaI (que porta los nt 27082 a 35935
del genoma Ad5 modificados por introducción del brazo espaciador y
del péptido GRP) se aísla del vector anterior denominado pTG8599, y
después se intercambia con el fragmento equivalente de pTG6591
anteriormente digerido por estas mismas enzimas. A título
indicativo, el pTG6591 comprende las secuencias adenovíricas
salvajes de las posiciones 21562 a 35935. Se obtiene el pTG4600, del
que se aísla el fragmento BstEII (nt 24843 a 35233). Después
de la recombinación homóloga con el plásmido pTG3602, que comprende
el genoma Ad5 (descrito más detalladamente en la Solicitud
Internacional WO96/17070), se genera el vector pTG4601.
Se introduce un casete que permite la expresión
del gen LacZ en el lugar de la región adenovírica E1, mediante
recombinación homóloga entre el plásmido pTG4601, linealizado
mediante ClaI, y un fragmento BsrGI-PstI, que
comprende el gen LacZ que codifica la
\beta-galactosidasa bajo control del promotor MLP
de Ad2, y la señal de poliadenilación del virus SV40. Este fragmento
se aísla del vector pTG8526 que contiene el extremo 5' del ADN
genómico vírico (nt 1 a 6241) en el que la región E1 (nt 459 a 3328)
se sustituye por el casete de expresión LacZ. Su construcción está
al alcance del experto en la técnica. El vector final se denomina
pTG4628.
Los virus correspondientes AdTG4601 y AdTG4628 se
obtienen mediante transfección de los fragmentos adenovíricos
liberados de las secuencias plasmídicas mediante digestión
PacI en la línea 293. A título indicativo, AdTG4601 porta el
genoma Ad5 completo en el que el gen de la fibra comprende, en su
extremo 3', un brazo espaciador seguido del péptido GRP. El virus
recombinante AdTG4628 porta además el casete de expresión del gen
informador LacZ bajo control del promotor adenovírico MLP.
La presencia del péptido GRP a nivel de la fibra
adenovírica permite seleccionar como dianas a las células que
expresan en su superficie el receptor de GRP. La expresión de los
mensajeros que codifican este último se estudia en las células 293 y
en las células murinas Swiss-3T3 (Zachary et
al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82,
7616-7620), mediante transferencia Northern. Como
sonda, se utiliza una mezcla de 2 fragmentos de ADN complementarios
de la secuencia que codifica el receptor de GRP, marcados mediante
las técnicas convencionales con isótopo ^{32}P. A título
indicativo, los fragmentos se producen mediante PCR inversa a partir
de los ARN celulares totales, con la ayuda de los oligonucleótidos
oTG10776 (SEC ID nº: 4) y oTG10781 (SEC ID nº: 5) (Battey et
al., 1991, Proc Natl. Acad. Sci. USA 88,
395-399; Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem.
266, 18771-18779). La intensidad de los ARNm
detectados es mucho más importante en el caso de las células
Swiss-3T3 que en las células 293, indicando la
sobreexpresión del receptor GRP por la línea murina.
Se realizan ensayos de competición en los 2 tipos
de células. El competidor está constituido por la cabeza de la fibra
de Ad5 producida en E. coli, cuyas propiedades de unión al
receptor celular adenovírico han sido demostradas (Henry et
al., 1994, J. Virol. 68, 5239-5246). Las
células en monocapa se incuban previamente durante 30 min. en
presencia de PBS, o de concentraciones crecientes de cabeza Ad5
recombinante (0,1 a 100 \mug/ml) en un medio DMEM (Gibco BRL)
complementado con un suero de ternera fetal al 2% (FCS). Después, se
añade el virus AdTG4628, cuya fibra contiene el péptido GRP, a una
multiplicidad de 0,001 unidad infecciosa/célula, durante 24h a 37ºC.
Como control, y según las mismas condiciones de ensayo, se utiliza
el virus recombinante AdLacZ (Stratford-Perricaudet
et al., 1992, J. Clin. Invest. 90,
626-630) que porta un gen de la fibra nativa.
Después, las células se fijan, y se evalúa la expresión del gen LacZ
(Sanes et al., 1986, EMBO J. 5,
3133-3142). El número de células azules es
representativo de la eficacia de la infección vírica. Una inhibición
por competición se traduce por una reducción del número de células
coloreadas, con relación a un testigo sin competidor (PBS).
La adición de cabeza de Ad5 recombinante, a una
concentración de 100 \mug/ml, inhibe fuertemente la infección de
las células 293 por los virus AdLacZ y AdTG4628 (porcentaje de
inhibición de 95% y 98%). Esto sugiere que la presencia del
competidor impide la interacción de la fibra adenovírica con su
receptor celular natural. Por el contrario, los dos virus tienen un
comportamiento diferente sobre las células
Swiss-3T3. La infección del virus AdTG4628 en
presencia de 100 \mug/ml del competidor está sólo parcialmente
inhibida, mientras que, en las mismas condiciones de ensayo, la
infección del virus AdLacZ, que tiene la fibra nativa, está
totalmente inhibida. Estos resultados sugieren que la infección de
las células Swiss-3T3 por el AdTG4628 está en parte
mediada por un receptor independiente, probablemente el receptor de
GRP, que estas células sobreexpresan. En conclusión, la adición del
ligante GRP, en el extremo C-terminal de la fibra,
favorece la infección de las células que expresan el receptor de
GRP, de manera independiente a la interacción
fibra-receptor celular natural.
Este ejemplo describe una fibra que porta las
secuencias EGF en su extremo C-terminal. Para ello,
se utilizan los oligonucleótidos oTG11065 (SEC ID nº: 6) y oTG11066
(SEC ID nº: 7) para amplificar un fragmento
HindIII-XbaI a partir del plásmido M13TG6527. Los
oligonucleótidos oTG11067 (SEC ID nº: 8) y oTG11068 (SEC ID nº: 9)
permiten generar un fragmento XhoI-SmaI (que va del
codón de parada hasta el nt 33093), a partir de M13TG6527. El ADN
complementario del EGF, obtenido de ATCC (nº 59957), se amplifica en
forma de un fragmento XhoI-XbaI con la ayuda de los
oligonucleótidos oTG11069 (SEC ID nº: 10) y oTG11070 (SEC ID nº:
11). Después, los 3 fragmentos digeridos por las enzimas adecuadas
se religan para dar un fragmento HindIII-SmaI, que
contiene el EGF fusionado en el extremo C-terminal
de la fibra. Se aplica el mismo procedimiento de recombinación
homóloga que el descrito en el ejemplo 1 para reponer este fragmento
en su contexto genómico.
Sin embargo, las etapas de clonación se pueden
simplificar introduciendo un sitio único BstBI en la región
diana, mediante las técnicas clásicas de mutagénesis. Se obtienen
pTG4609 y pTG4213 con LacZ. La recombinación homóloga entre pTG4609,
linealizado mediante BstBI, y el fragmento
HindIII-SmaI, anterior, genera el plásmido pTG4225 que
porta la región E1 salvaje. Su equivalente pTG4226, que porta el
casete de expresión LacZ, se obtiene mediante recombinación homóloga
con el pTG4213 digerido mediante BstBI. Los virus AdTG4225 y
AdTG4226 se pueden introducir clásicamente mediante transfección de
una línea celular apropiada, por ejemplo sobreexpresando el receptor
del EGF.
Para ensayar la especificidad de infección de
estos virus, se pueden utilizar las células fibroblásticas murinas
NR6 y las células NR6-hEGFR que expresan el receptor
del EGF humano. Las competiciones con la cabeza de Ad5 recombinante
o con el EGF permiten evaluar la intervención de los receptores
celulares naturales y de EGF para mediar la infección de los
virus.
Se ha realizado la mutación de la región de la
fibra adenovírica, implicada en la interacción con el receptor
celular natural, a fin de eliminar la capacidad de la fibra para
unirse a su receptor natural; y la adición de un ligante permitirá
modificar el tropismo de los adenovirus correspondientes.
Las secuencias de la fibra Ad5, que codifican la
región que se extiende de los residuos 443 a 462 y 529 a 536, se han
sometido a diversas mutaciones. La supresión de la hoja D utiliza el
oligonucleótido de mutagénesis oTG7414 (SEC ID nº: 12), y la
supresión del bucle CD el oligonucleótido oTGA (SEC ID nº: 13). El
oligonucleótido oTGB (SEC ID nº: 14) permite la supresión del bucle
CD y de la hoja D. El oligonucleótido oTG7416 (SEC ID nº: 38)
permite la supresión de la hoja H. Todos estos oligonucleótidos
contienen un sitio BamHI que permite detectar fácilmente los
mutantes e, igualmente, insertar las secuencias que codifican un
ligante, por ejemplo el péptido EGF.
Otros tipos de modificaciones consisten en
sustituir estas regiones suprimidas por las secuencias equivalentes
que provienen de la fibra de Ad3 (D+CD5 en D+CD3 significa que la
región CD y D de la fibra Ad5 se sustituye por su equivalente de
Ad3). En efecto, numerosos datos muestran que el Ad5 y el Ad3 no se
unen al mismo receptor, de manera que tal sustitución debería abolir
la infección mediada por el receptor Ad5 y seleccionar como dianas a
las células que portan el receptor Ad3. La sustitución del bucle CD
Ad5 por el del Ad3 utiliza oTG11135 (SEC ID nº: 15); la sustitución
de la hoja D de la fibra Ad5 por la de la fibra Ad3 se efectúa
mediante el oligonucleótido oTG10350 (SEC ID nº: 16); y la
sustitución de la hoja D y del bucle CD del Ad5 por los del Ad3 se
realiza sobre el mutante anterior con la ayuda del oTG11136 (SEC ID
nº: 17). La sustitución de la hoja H se realiza con la ayuda del
oligonucleótido oTG10352 (SEC ID nº: 39).
Igualmente, se ha modificado esta región diana de
la cabeza adenovírica por una serie de mutaciones puntuales.
- -
- sustitución del codo \alpha\alpha GSLA en codo \alpha\alpha DKLT: oTGC (SEC ID nº: 18),
- -
- sustitución del codo \alpha\alpha SGTV en codo \alpha\alpha DKLT: oTGD (SEC ID nº: 19),
- -
- G443 en D (G443D): oTGE (SEC ID nº: 20),
- -
- L445 en F (L445F): oTGF (SEC ID nº: 21),
- -
- G450 en N (G450N): oTGG (SEC ID nº: 22),
- -
- T451 en K (T451K): oTGH (SEC ID nº: 23),
- -
- V452 en N (V452N): oTGI (SEC ID nº: 24),
- -
- A455 en F (A455F): oTGJ (SEC ID nº:25),
- -
- L457 en K (L457K): oTGK (SEC ID nº: 26),
- -
- I459 en A (I459A): oTGL (SEC ID nº: 27).
Los oTGE a I introducen mutaciones en el bucle CD
de la fibra adenovírica sobre aminoácidos que son no conservativos
entre el Ad5 y el Ad3, mientras que los oTGJ a K se refieren a
aminoácidos de la hoja D no comprometidos en un enlace de hidrógeno
que estabiliza a la estructura.
Las mutagénesis se pueden realizar sobre el
vector M13TG6526 o M13TG6528. El primero porta el fragmento
HindIII-SmaI salvaje, y, el segundo, este mismo
fragmento modificado por inserción de las secuencias GRP. Los
plásmidos que portan el genoma adenovírico se pueden reconstituir
como se describe anteriormente para los plásmidos pTG4609 (E1
salvaje) y pTG4213 (LacZ en el lugar de la región E1). Los virus se
generan mediante transfección de las células 293, o bien de células
que sobreexpresan el receptor que se une al ligante al que se
refiere. Tales células se pueden generar mediante transfección del
ADN complementario correspondiente. Se utilizan preferentemente
células que no expresan naturalmente el receptor celular natural de
los adenovirus, por ejemplo la línea Daudi (ATCC CCL213).
La viabilidad de los diferentes mutantes se
evalúa mediante transfección de células 293 y
293-Fb+ (células 293 transfectadas por un vector de
expresión de la fibra de Ad5 salvaje). Sin embargo, la eficacia de
transfección es variable de un ensayo a otro, incluso en lo que
concierne a un adenovirus que porta una fibra salvaje que ha
incorporado el péptido GRP en su extremo C-terminal
(AdFbGRP). Para estandarizar los resultados, las placas obtenidas
tras la transfección de las células 293-Fb+ se
amplifican primero en esta misma línea, y se titulan los virus
generados: en este estado pueden portar la fibra salvaje, o la fibra
mutante, o los 2 tipos. Las células 293 se infectan entonces con
estos virus con una baja multiplicidad de infección, que permite
infectar sólo aproximadamente el 10% de las células (MOI de
aproximadamente 0,2 unidades infecciosas/célula), y se determina la
amplitud de la infección vírica 7 días después de la infección,
midiendo la acumulación del ADN vírico y el título vírico. Siendo la
propagación de la infección dependiente de la fibra mutada, los
mutantes interesantes son los que no dan lugar a una infección
productiva, mostrando que la mutación altera la unión al receptor
natural. La capacidad de propagación de los adenovirus que portan la
fibra mutada se compara con la de un adenovirus salvaje y la de un
AdFbGRP.
Los resultados muestran que la inserción del
péptido GRP en el extremo de la fibra salvaje reduce ligeramente el
crecimiento del virus correspondiente con relación a un Ad salvaje,
pero el factor de multiplicación es, sin embargo, del orden de 1000.
Las mutaciones V452N, D+CD5 en D+CD3 y L445F reducen de manera
significativa (factor 3 a 11) la afinidad de la cabeza de la fibra
mutada por el receptor celular natural de los adenovirus. Las
mutaciones \DeltaD (supresión de la hoja D de la fibra Ad5),
\DeltaCD+D (supresión del bucle CD y de la hoja D), CD5 en CD3
(sustitución del bucle CD de un Ad5 por su equivalente de un Ad3),
G443D, A445F, L457K e I459A, suprimen totalmente la propagación de
los virus correspondientes en las células 293 (factor de
multiplicación menor que 1).
Después, se verifica la capacidad de los virus
mutantes para penetrar en las células diana vía el receptor de GRP.
Los mutantes interesantes son los que presentan un factor de
multiplicación significativo (mayor que 1). Para ello, se puede
utilizar una línea denominada 293-GRPR, que expresa
el MHC-I y el receptor de GRP en cantidades
elevadas. Se genera mediante transfección de las células 293 por un
plásmido de expresión eucariota que porta el ADNc del receptor de
GRP (Corjay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266,
18771-18779). El casete de expresión está
constituido por el promotor CMV precoz (Boshart et al., 1985,
Cell 41, 521), las secuencias de corte y empalme del gen
\beta-globina, el ADNc que codifica el receptor de
GRP, y las secuencias polyA del gen \beta-globina.
La selección de los transformantes se efectúa en presencia de
higromicina (350 \mug/ml), y se seleccionan 50 clones, se
amplifican y se ensayan para la expresión del ARNm que codifica el
receptor mediante la técnica de transferencia Northern. Los clones
más productivos se reúnen y se denominan 293-GRPR.
La expresión de la proteína se puede igualmente controlar mediante
FACS con la ayuda de un péptido GRP conjugado con la biotina y la
avidina-FITC, seguido de una detección con la ayuda
de
fluoresceína.
fluoresceína.
Este ejemplo describe la inserción del ligante
EGF en la proteína de cápsida hexón. Bien entendido, se prefiere que
el adenovirus correspondiente haya perdido su capacidad de unión al
receptor celular natural. Su genoma puede incluir, por ejemplo, un
gen de la fibra modificada (véase el ejemplo 3), o puede estar
desprovisto de al menos una parte de las secuencias de la fibra.
Se construye un plásmido de transferencia para la
recombinación homóloga que cubre la región del genoma de Ad5 que
codifica el hexón (nt 18842-21700). El fragmento de
Ad5 HindIII-XhoI (nt 18836-24816) se
clona en pBSK+ (Stratagene), digerido por estas mismas enzimas, para
dar el plásmido pTG4224. Las secuencias que codifican el péptido EGF
se introducen en el bucle hipervariable L1 del hexón, mediante
creación de fragmentos quiméricos mediante PCR: hexón (nt
19043-19647)-XbaI-EGF-BsrGI-hexón
(nt 19699-20312). El fragmento nt 19043 a 19647 se
obtiene mediante amplificación PCR a partir del plásmido pTG3602 con
los oligonucleótidos oTG11102 (SEC ID nº: 28) y oTG11103 (SEC ID nº:
29). El fragmento nt 19699 a 20312 se amplifica a partir del mismo
ADN con los oligonucleótidos oTG11104 (SEC ID nº: 30) y oTG11105
(SEC ID nº: 31). El EGF se clona a partir del ADNc con la ayuda de
los oligonucleótidos oTG11106 (SEC ID nº: 32) y oTG11107 (SEC ID nº:
33), permitiendo poner la secuencia que codifica el EGF en fase con
el hexón. Los productos PCR se digieren por las enzimas adecuadas, y
después se religan. El fragmento quimérico se puede entonces
insertar mediante recombinación homóloga en el plásmido pTG4224,
linealizado por NdeI (nt 19549), para dar pTG4229. Las
secuencias que codifican el hexón modificado se pueden obtener
mediante digestión HindIII-XhoI, y se reponen en sus
contexto genómico mediante recombinación homóloga. Se puede utilizar
el vector pTG3602, pTG4607, pTG4629 linealizado mediante
SgfI, o un vector que porta el genoma adenovírico, al que se
le han suprimido las secuencias de la fibra (como el pTG4607,
descrito a continuación), o que expresa una fibra modificada
conforme al ejemplo 3.
El genoma adenovírico incapaz de producir una
fibra nativa funcional se obtiene mediante una supresión que afecta
al codón iniciador pero que no se extiende a los demás ORF
adenovíricos. Se procede de la manera siguiente: el fragmento
adenovírico en dirección 5' de la supresión (nt 30564 a 31041) se
amplifica mediante PCR con la ayuda de los cebadores oTG7171 y
oTG7275 (SEC ID nº: 34 y 35). La amplificación del fragmento en
dirección 3' (nt 31129 a 33099) utiliza los cebadores oTG7276 y
oTG7049 (SEC ID nº: 36 y 37). Los fragmentos PCR se digieren
mediante XhoI, y se ligan antes de ser introducidos mediante
recombinación homóloga en el vector pTG6591, linealizado mediante
NdeI, para dar pTG4602. Después, el fragmento BstEII,
aislado de este último, se somete a una recombinación homóloga con
el vector pTG3602, digerido mediante SpeI. Se obtiene
pTG4607. El vector pTG4629 es equivalente al pTG4607, pero porta
además el casete de expresión LacZ en el lugar de E1.
Los virus correspondientes se pueden obtener
después de la transfección de células 293, 293-Fb+,
o de células que sobreexpresan el receptor del EGF. El estudio de la
especificidad de infección se podrá realizar como se describe
anteriormente, utilizando el EGF como competidor.
Igualmente se ha generado un mutante de supresión
de las hojas EF del campo de la cabeza de la fibra de Ad5. El
plásmido pTG6593 se digiere mediante HindIII y SmaI, y
el fragmento que porta las secuencias de la fibra se aísla y se
clona en el vector M13TG130 separado mediante ruptura por
HindIII y SmaI. La mutación supresora utiliza el
oligonucleótido indicado en la SEC ID nº 40. El fragmento
HindIII-SmaI mutado se recombina en E. coli con
pTG4609, linealizado mediante BstBI (Chartier et al.,
1996, J. Virol. 70, 4805-4810). Este último
contiene el genoma Ad5 completo que comporta un sitio BstBI
en posición 32940 en dirección 3' del codón de parada de la
fibra.
La capacidad de trimerización de la fibra
modificada se ensaya sobre gel de SDS-PAGE (Novelli
y Boulanger, J. of Biological Chemistry, 1991, 266,
9299-9303) a partir de la proteína producida por vía
recombinante en las células Sf9 de insectos, con la ayuda de un
baculovirus recombinante que porta las secuencias correspondientes
puestas bajo control del promotor polihedrina. Paralelamente, la
viabilidad (o capacidad para propagarse) de los viriones que portan
la fibra mutada se determina mediante transfección de las células
293 y 293Fb+. Finalmente, la unión de la fibra a los receptores
celulares MHC-I y CAR se puede estudiar en ensayos
de competición de infección de un adenovirus recombinante
Ad5-Luc sobre las células Daudi-HLA+
y CHO-CAR (Bergelson et al., 1997, Science
275, 1320-1323). A título indicativo, el
virus Ad5Luc es un adenovirus competente para la replicación que
contiene el gen luciferasa puesto bajo control del promotor precoz
del virus SV40 (virus símico 40) insertado en la región E3 del
genoma adenovírico (Mittal et al., 1993, Virus Research
28, 67-90).
La fibra \DeltaEF se acumula en forma de
trímeros, puede propagarse en las células 293 y 293Fb+, y no es un
competidor de la infección de las células Daudi-HLA+
por el Ad5Luc. Es capaz de inhibir parcialmente la infección de las
células CHO-CAR, pero menos eficazmente que la fibra
salvaje. Esto supone que las hojas E y F son importantes para la
unión del Ad5 al receptor MHC-I que, aunque tiene un
papel más pequeño, puede ser de estabilización en la unión al CAR.
La inserción de un nuevo ligante debería permitir redirigir la
capacidad de infección hacia las células que portan el receptor
reconocido por el ligante.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Transgene S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 11 rue de Molsheim
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Estrasburgo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 67000
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TELÉFONO: (33) 03 88 27 91 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- FAX: (33) 03 88 27 91 01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- DIRECCIÓN: 3 rue Michael Ange
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: París
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75794 Cedex 16
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (33) 01 44 96 40 00
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- FAX: (33) 01 44 96 50 00
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Fibra adenovírica modificada y adenovirus diana
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 581 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: fibra Ad5
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN EN EL MAPA: 31063 A 33120 DEL GENOMA Ad5
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7000 (código por PSASASASAPGS)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGATTCTT TAGCTGCCGG GAGCAGAGGC GGAGGCGGAG GCGCTGGGTT CTTGGGCAAT
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7001 (código por GRP)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGATTCTT TACATCAGGT GGCCCACAGC CCAGTGGTTT CCGCTGCCGG GAGCAGA
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10776
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTCCACGG GGAAGATTGTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10781
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGTGTCTG TCTTCACACT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11065
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAAGCTTG AGGTTAACCT AAGCAC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11066
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGTCTAGAG CTGCCGGGAG CAGAGGCG
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11067
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCTCGAGT TATGTTTCAA CGTGTTTAT
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11068
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTGCCCGGGG AGTTTATTAA TATC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11069 (clonación EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGTCTAGAA ATAGTGACTC TGAATGTCCC C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11070 (clonación EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTCGAGC ACAAACGATT CTTTAGCGCA GTTCCCACCA CTTCAG
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7414 (supresión de la hoja D)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGCACTCCA TTTTCGTCGG ATCCTTGAAC TGTTCCAGAT AT
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGA (supresión del bucle CD)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTATAATAA GATGAGCACT GGATCCAGCC AAAACTGAAA CTG
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGB (supresión de los bucles CD y f.D)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGCACTCC ATTTTCGTCG GATCCAACAG CCAAAACTGA AACTG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 88 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: adenovirus humano Ad5 y Ad3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11135 (bucle CD5 y CD3)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Adenovirus (Mastadenovirus)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10350 (Hoja D5 en D3)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAGCACTCC ATTTTCGTCA AAGTAGAGCT CCACGTTGAT ACTTTGAACT GTTCCAGATA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGG
\hfill64
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 88 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus Ad5 y Ad3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11136 (CD+D5 en CD+D3)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 56 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGC (Sustitución de Codo GSLA en DKLT)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGAACTGTT CCAGATATTG GGGTCAGTTT GTCTTTAACA GCCAAAAGTG AAACTG
\hfill56
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGD (Sustitución de Codo SGTV en DKLT)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATAAGATGA GCACTTTGGG TCAGTTTGTC TATTGGAGCC AAACTGAA
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGE (Sustitución de G443 en D)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGATATTG GAGCCAAACT GTCTTTAACA GCCAAAACTG AAAC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGF (Sustitución de L445 en F)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTTCCAGAT ATTGGAGCGA AACTGCCTTT AACAGCCAAA AC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGG (Sustitución de G450 en N)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGAGCACTT TGAACTGTGT TAGATATTGG AGCCAAACTG CC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGH (Sustitución de T451 en K)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGATGAGC ACTTTGAACC TTTCCAGATA TTGGAGCCAA ACTG
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGI (Sustitución de V452 en N)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTATAATAA GATGAGCACT TTGGTTTGTT CCAGATATTG GAGCC
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGJ (Sustitución de A455 en F)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCAAATCTT ATAATAAGAT GGAAACTTTG AACTGTTCCA GATATTGG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGK (Sustitución de L457 en K)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATTTTCGT CAAATCTTAT AATTTTATGA GCACTTTGAA CTGTTCC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTGL (Sustitución de I459 en A)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCACTCCATT TTCGTCAAAT CTAGCAATAA GATGAGCACT TTGAAC
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11102 (Clonación hexon)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGTTCATCC CTGTGGACCG TGA
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11103 (Clonación hexón)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCTCTAGA GTTGAGAAAA ATTGCATTTC CACTTGAC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11104 (Clonación hexón)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTATTGTAC AGTGAAGATG TAG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11105
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTTGGAAGG ACTGTACTTT AGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11106 (Clonación ADNc EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGTCTAGT GGCGAATAGT GACTCTGAAT GTCCCCTG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG11107 (Clonación ADNc EGF)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCACTGTACA ATACCACTTT AGGGCGCAGT TCCCACCACT TCAGG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7171 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGTTAACT TGCACCAGTG C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7275 (Supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGCTCGAGC TGCAACAACA TGAAGAT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7276 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTCGAGA CTCCTCCCTT TGTATCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5 (Ad5)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7049 (supresión de la fibra)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCCCGGGA GTTTATTAAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG7416 (supresión de la hoja H)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTTTCCTGT GTACCGTTGG ATCCTTTAGT TTTGTCTCCG TT
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 64 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 3
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis oTG10352 (hoja H5 en H3)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMAS: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Mastadenovirus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Adenovirus 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CEPA CLÍNICA: oligonucleótido de síntesis (supresión de las hojas E y F)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTATAGGCT GTGCCTTCGG ATCCCCAATA TTCTGGGTCC AG
\hfill42
Claims (30)
1. Fibra de un adenovirus modificada mediante
mutación de sustitución de uno o varios residuos de dicha fibra,
caracterizada porque dichos residuos están dirigidos hacia el
receptor celular natural de dicho adenovirus y comprendidos en la
parte de dicha fibra que comprende el bucle CD, la hoja D y el bucle
DG, teniendo por efecto dicha mutación reducir o abolir la capacidad
de unión de dicha fibra modificada al receptor celular natural.
2. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
1, caracterizada porque se modifica mediante mutación de
sustitución de uno o varios residuos en la parte de dicha fibra que
comprende el bucle CD, la hoja D y la parte próxima al bucle DG.
3. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
1 ó 2, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus
de tipo 5 (Ad5), y porque dicha fibra comprende toda o parte de la
secuencia tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1
(SEC ID nº: 1), y porque se modifica por mutación de sustitución de
uno o varios residuos de la región comprendida entre los residuos
441 a 478 de la SEC ID nº: 1 y, preferentemente, 443 a 462.
4. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
1, caracterizada porque se modifica por mutación de
sustitución de uno o varios residuos comprendidos en las hojas E y F
de dicha fibra.
5. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
4, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus 5
(Ad5), y porque dicha fibra comprende toda o parte de la secuencia
tal como se muestra en el identificador de secuencia nº 1 (SEC ID
nº: 1), y porque se modifica por mutación de sustitución de uno o
varios residuos de la región comprendida entre los residuos 479 a
486 de la SEC ID nº: 1.
6. Fibra de un adenovirus Ad5 según la
reivindicación 3, caracterizada porque se modifica mediante
sustitución:
- -
- del residuo glicina en posición 443 por un residuo ácido aspártico,
- -
- del residuo leucina en posición 445 por un residuo fenilalanina,
- -
- del residuo valina en posición 452 por un residuo asparagina,
- -
- del residuo alanina en posición 455 por un residuo fenilalanina,
- -
- del residuo leucina en posición 457 por un residuo alanina o lisina, o
- -
- del residuo isoleucina en posición 459 por un residuo alanina.
7. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
1 ó 2, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus
de tipo 2 (Ad2), y porque dicha fibra se modifica por mutación de
sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre
los residuos 441 a 478, y preferentemente 451 a 466, de dicha
fibra.
8. Fibra de un adenovirus según la reivindicación
1, caracterizada porque dicho adenovirus es el adenovirus de
tipo 2 (Ad2), y porque dicha fibra se modifica por mutación de
sustitución de uno o varios residuos de la región comprendida entre
los residuos 479 a 486 de dicha fibra.
9. Fibra de un adenovirus según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque presenta una
capacidad de unión al receptor celular natural sustancialmente
reducido en comparación con una fibra no modificada, y porque es
capaz de trimerizar.
10. Fibra de un adenovirus según una de las
reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende además
un ligante capaz de reconocer una molécula de superficie celular
diferente del receptor celular natural de dicho adenovirus.
11. Fibra de un adenovirus según la
reivindicación 10, caracterizada porque el ligante se
selecciona de entre el grupo que consiste en un anticuerpo, un
péptido, una hormona, un polipéptido, o también un azúcar.
12. Fibra de un adenovirus según la
reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el ligante se
inserta en el extremo C-terminal de la fibra.
13. Fragmento de ADN o vector de expresión que
codifica una fibra de un adenovirus según una de las
reivindicaciones 1 a 12.
14. Línea celular caracterizada porque
comprende, bien en forma integrada en el genoma o bien en forma de
episoma, un fragmento de ADN según la reivindicación 13 puesto bajo
control de los elementos que permiten su expresión en dicha línea
celular.
15. Línea celular según la reivindicación 14,
caracterizada porque es capaz además de complementar un
adenovirus deficiente de una o varias funciones seleccionadas entre
las funciones codificadas por las regiones E1, E2, E4 y
L1-L5.
16. Línea celular según la reivindicación 14 a
15, caracterizada porque deriva de la línea 293.
17. Adenovirus caracterizado porque está
desprovisto de una fibra nativa funcional, y porque comprende una
fibra según una de las reivindicaciones 1 a 12, siendo dicha fibra
codificada según una de las reivindicaciones 1 a 12 por el genoma de
dicho adenovirus, o suministrada en trans por una línea
celular según una de las reivindicaciones 14 a 16.
18. Adenovirus caracterizado porque está
desprovisto de una fibra funcional, y porque comprende una fibra
según una de las reivindicaciones 1 a 12 y un ligante capaz de
reconocer una molécula de superficie celular diferente del receptor
celular natural de dicho adenovirus.
19. Adenovirus según la reivindicación 18,
caracterizado porque el ligante se selecciona de entre el
grupo que consiste en un anticuerpo, un péptido, una hormona, un
polipéptido, o también un azúcar.
20. Adenovirus según una de las reivindicaciones
18 y 19, caracterizado porque el ligante se inserta en el
extremo C-terminal de la fibra.
21. Adenovirus según una de las reivindicaciones
17 a 19, caracterizado porque el ligante se inserta en una
proteína de cápsida distinta de la fibra, especialmente el hexón o
el pentón.
22. Adenovirus según una de las reivindicaciones
17 a 21, caracterizado porque se trata de un adenovirus
recombinante defectuoso para la replicación.
23. Adenovirus según la reivindicación 22,
caracterizado porque se le suprime toda o parte de la región
E1 y, opcionalmente, toda o parte de la región E3.
24. Adenovirus según la reivindicación 23,
caracterizado porque se le suprime además toda o parte de la
región E2, E4 y/o L1-L5.
25. Adenovirus según una de las reivindicaciones
22 a 24, caracterizado porque comprende un gen de interés
seleccionado de entre los genes que codifican una citoquina, un
receptor celular o nuclear, un ligante, un factor de coagulación, la
proteína CFTR, la insulina, la distrofina, una hormona de
crecimiento, una enzima, un inhibidor de enzima, un polipéptido con
efecto antitumoral, un polipéptido capaz de inhibir una infección
bacteriana, parasitaria o vírica y, especialmente el VIH, un
anticuerpo, una toxina, una inmunotoxina y un marcador.
26. Procedimiento para producir un adenovirus
según una de las reivindicaciones 17 a 25, caracterizado
porque:
- -
- se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular apropiada,
- -
- se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
- -
- se recupera dicho adenovirus de dicho cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
27. Procedimiento para producir un adenovirus
cuyo genoma está desprovisto de toda o parte de las secuencias que
codifican una fibra, caracterizado porque:
- -
- se transfecta el genoma de dicho adenovirus en una línea celular según una de las reivindicaciones 14 a 16,
- -
- se cultiva dicha línea celular transfectada en condiciones apropiadas para permitir la producción de dicho adenovirus, y
- -
- se recupera dicho adenovirus en el cultivo de dicha línea celular transfectada y, eventualmente, se purifica sustancialmente dicho adenovirus.
28. Célula huésped que comprende un adenovirus
según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido mediante un
procedimiento según la reivindicación 26 ó 27.
29. Composición farmacéutica que comprende un
adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido
mediante un procedimiento según la reivindicación 26 ó 27, o una
célula huésped según la reivindicación 28, en asociación con un
soporte farmacéuticamente aceptable.
30. Utilización terapéutica o profiláctica de un
adenovirus según una de las reivindicaciones 17 a 25, u obtenido
mediante un procedimiento según la reivindicación 26 ó 27, o de una
célula huésped según la reivindicación 28, para la preparación de un
medicamento destinado al tratamiento del cuerpo humano o animal por
terapia génica.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9703987 | 1997-04-02 | ||
| FR9703987A FR2761688A1 (fr) | 1997-04-02 | 1997-04-02 | Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles |
| FR9704747A FR2761689B1 (fr) | 1997-04-02 | 1997-04-17 | Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles |
| FR9704747 | 1997-04-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2246533T3 true ES2246533T3 (es) | 2006-02-16 |
Family
ID=26233432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98917294T Expired - Lifetime ES2246533T3 (es) | 1997-04-02 | 1998-04-02 | Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6569677B1 (es) |
| EP (1) | EP0991763B1 (es) |
| JP (1) | JP2001522236A (es) |
| AT (1) | ATE305513T1 (es) |
| AU (1) | AU741728B2 (es) |
| CA (1) | CA2285565A1 (es) |
| DE (1) | DE69831741T2 (es) |
| DK (1) | DK0991763T3 (es) |
| ES (1) | ES2246533T3 (es) |
| FR (1) | FR2761689B1 (es) |
| WO (1) | WO1998044121A1 (es) |
Families Citing this family (43)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| WO1999055365A1 (en) | 1998-04-30 | 1999-11-04 | Cornell Research Foundation, Inc. | Adenoviral vectors with tandem fiber proteins |
| EP1112372A1 (en) | 1998-09-11 | 2001-07-04 | Genvec, Inc. | Alternatively targeted adenovirus |
| EP1020529B1 (en) * | 1998-11-20 | 2005-06-01 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| IL133032A (en) * | 1998-11-20 | 2007-06-03 | Introgene Bv | Adenoviral gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells and /or endothelial cells |
| JP2000279178A (ja) * | 1999-02-24 | 2000-10-10 | Japan Found Cancer Res | ウイルスベクター |
| DE19932688B4 (de) | 1999-07-13 | 2009-10-08 | Scil Proteins Gmbh | Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen |
| JP2003514577A (ja) * | 1999-11-25 | 2003-04-22 | トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム | 改変アデノウイルス繊維および使用 |
| JP2003534805A (ja) * | 2000-05-31 | 2003-11-25 | ユニバーシティ オブ サスカチュワン | 変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス |
| EP1364038A2 (en) * | 2000-06-02 | 2003-11-26 | Novartis AG | Adenovirus particles with mutagenized fiber proteins |
| US20060228334A1 (en) * | 2002-07-10 | 2006-10-12 | Manuel Rosa-Calatrava | Modified adenoviral fiber with ablated to cellular receptors |
| US20060281090A1 (en) * | 2003-05-01 | 2006-12-14 | University Of Washington Uw Tech Transfer- Invention Licensing | Capsid-modified adenovirus vectors and methods of using the same |
| CA2524499A1 (en) * | 2003-05-14 | 2004-11-25 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa | Broadening adenovirus tropism |
| DE10324447A1 (de) | 2003-05-28 | 2004-12-30 | Scil Proteins Gmbh | Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin |
| GB0313132D0 (en) | 2003-06-06 | 2003-07-09 | Ich Productions Ltd | Peptide ligands |
| WO2005030927A2 (en) * | 2003-09-23 | 2005-04-07 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for in vivo inflammation monitoring |
| EP3269390B1 (en) * | 2004-01-23 | 2021-02-17 | MSD Italia S.r.l. | Chimpanzee adenovirus vaccine carriers |
| DE102004049479A1 (de) | 2004-10-11 | 2006-04-13 | Scil Proteins Gmbh | Proteinkonjugate zur Verwendung in Therapie, Diagnose und Chromatographie |
| US20070010016A1 (en) * | 2005-03-11 | 2007-01-11 | Mccelland Alan | Gene transfer with adenoviruses having modified fiber proteins |
| US9056090B2 (en) * | 2005-06-17 | 2015-06-16 | Msd Italia Srl | Hepatitis C virus nucleic acid vaccine |
| WO2007094653A1 (en) * | 2006-02-13 | 2007-08-23 | Vereniging Voor Christelijk Hoger Onderwijs, Wetenschappelijk Onderzoek En Patientenzorg | Adenovirus particles having a chimeric adenovirus spike protein, use thereof and methods for producing such particles. |
| EP1925664A1 (en) * | 2006-11-15 | 2008-05-28 | Scil proteins GmbH | Artificial binding proteins based on a modified alpha helical region of ubiquitin |
| WO2009111738A2 (en) * | 2008-03-06 | 2009-09-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Single cycle replicating adenovirus vectors |
| ES2441803T3 (es) | 2009-12-14 | 2014-02-06 | Scil Proteins Gmbh | Un método para identificar proteínas de ubicuitina heteromultímeras modificadas con capacidad para unirse a ligandos |
| WO2012172055A1 (en) | 2011-06-15 | 2012-12-20 | Scil Proteins Gmbh | Dimeric binding proteins based on modified ubiquitins |
| WO2014153204A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
| DK3253785T3 (da) | 2015-02-06 | 2019-07-08 | Navigo Proteins Gmbh | Hidtil ukendte egfr-bindingsproteiner |
| AU2016293063B2 (en) | 2015-07-16 | 2018-11-08 | Navigo Proteins Gmbh | Novel immunoglobulin-binding proteins and their use in affinity purification |
| US10584152B2 (en) | 2015-07-20 | 2020-03-10 | Navigo Proteins Gmbh | Binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation |
| EP3390428B1 (en) | 2016-02-23 | 2019-09-25 | Salk Institute for Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| EP4155411A1 (en) | 2016-02-23 | 2023-03-29 | Salk Institute for Biological Studies | Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics |
| AU2017260274A1 (en) | 2016-05-04 | 2018-11-01 | Navigo Proteins Gmbh | Targeted compounds for the site-specific coupling of chemical moieties comprising a peptide linker |
| JP7181612B2 (ja) | 2016-08-11 | 2022-12-01 | ナフィゴ プロテインズ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | アルカリ安定性免疫グロブリン結合タンパク質 |
| US11352647B2 (en) | 2016-08-17 | 2022-06-07 | The Broad Institute, Inc. | Crispr enzymes and systems |
| US20200283743A1 (en) | 2016-08-17 | 2020-09-10 | The Broad Institute, Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| AU2017375633C1 (en) | 2016-12-12 | 2023-04-27 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
| US20200405639A1 (en) | 2017-04-14 | 2020-12-31 | The Broad Institute, Inc. | Novel delivery of large payloads |
| US11414466B2 (en) | 2017-11-07 | 2022-08-16 | Navigo Proteins Gmbh | Fusion proteins with specificity for ED-B and long serum half-life for diagnosis or treatment of cancer |
| EP3710039A4 (en) | 2017-11-13 | 2021-08-04 | The Broad Institute, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH |
| CN113544266A (zh) | 2018-12-17 | 2021-10-22 | 博德研究所 | Crispr相关转座酶***和其使用方法 |
| WO2020236972A2 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | The Broad Institute, Inc. | Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems |
| US11149286B1 (en) | 2020-08-17 | 2021-10-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Adenovirus vectors and methods for using adenovirus vectors |
| WO2023196818A1 (en) | 2022-04-04 | 2023-10-12 | The Regents Of The University Of California | Genetic complementation compositions and methods |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU6133394A (en) * | 1993-02-09 | 1994-08-29 | Scripps Research Institute, The | Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton |
| FR2705686B1 (fr) | 1993-05-28 | 1995-08-18 | Transgene Sa | Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes. |
| US5543328A (en) * | 1993-08-13 | 1996-08-06 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having modified fiber proteins |
| US5820868A (en) | 1993-12-09 | 1998-10-13 | Veterinary Infectious Disease Organization | Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system |
| US6312699B1 (en) * | 1994-03-28 | 2001-11-06 | Uab Research Foundation | Ligands added to adenovirus fiber |
| US5846782A (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| WO1996013597A2 (en) * | 1994-10-28 | 1996-05-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved adenovirus and methods of use thereof |
| FR2727689A1 (fr) | 1994-12-01 | 1996-06-07 | Transgene Sa | Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral |
| US5770442A (en) * | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| IL124654A0 (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-06 | Genvec Inc | Vectors and method for gene transfer to cells |
| CA2348158A1 (fr) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Transgene S.A. | Fibre adenovirale modifiee et utilisations |
-
1997
- 1997-04-17 FR FR9704747A patent/FR2761689B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-04-02 US US09/402,401 patent/US6569677B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-02 ES ES98917294T patent/ES2246533T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-02 AT AT98917294T patent/ATE305513T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-02 JP JP54126098A patent/JP2001522236A/ja not_active Ceased
- 1998-04-02 DE DE69831741T patent/DE69831741T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-02 AU AU70547/98A patent/AU741728B2/en not_active Ceased
- 1998-04-02 CA CA002285565A patent/CA2285565A1/fr not_active Abandoned
- 1998-04-02 EP EP98917294A patent/EP0991763B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-02 DK DK98917294T patent/DK0991763T3/da active
- 1998-04-02 WO PCT/FR1998/000668 patent/WO1998044121A1/fr active IP Right Grant
-
2003
- 2003-04-01 US US10/402,954 patent/US7256036B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK0991763T3 (da) | 2006-02-20 |
| JP2001522236A (ja) | 2001-11-13 |
| CA2285565A1 (fr) | 1998-10-08 |
| ATE305513T1 (de) | 2005-10-15 |
| WO1998044121A1 (fr) | 1998-10-08 |
| FR2761689B1 (fr) | 1999-06-25 |
| US20030175243A1 (en) | 2003-09-18 |
| AU741728B2 (en) | 2001-12-06 |
| DE69831741T2 (de) | 2006-07-06 |
| FR2761689A1 (fr) | 1998-10-09 |
| EP0991763B1 (fr) | 2005-09-28 |
| AU7054798A (en) | 1998-10-22 |
| EP0991763A1 (fr) | 2000-04-12 |
| US6569677B1 (en) | 2003-05-27 |
| US7256036B2 (en) | 2007-08-14 |
| DE69831741D1 (de) | 2006-02-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2246533T3 (es) | Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. | |
| US6455314B1 (en) | Alternatively targeted adenovirus | |
| AU724189B2 (en) | Vectors and methods for gene transfer to cells | |
| AU732770B2 (en) | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs | |
| US6951755B2 (en) | Vectors and methods for gene transfer | |
| ES2256302T3 (es) | Vectores adenovirales para la transduccion de condrocitos. | |
| AU753809B2 (en) | Recombinant adenoviral vectors comprising a splicing sequence | |
| JP2001505047A (ja) | 高キャパシティーアデノウイルスベクターの開発の促進に使用するためのパッケージング細胞系 | |
| US6740511B1 (en) | Modified adenoviral fibre and uses thereof | |
| AU2002344190B8 (en) | Adenovirus protein IX, its domains involved in capsid assembly, transcriptional activity and nuclear reorganization | |
| AU2002344190A1 (en) | Adenovirus protein IX, its domains involved in capsid assembly, transcriptional activity and nuclear reorganization | |
| JP2003534805A (ja) | 変化した親和性を有する改変ウシアデノウイルス | |
| US7560527B1 (en) | Modified adenovirus fibre and uses | |
| MXPA98004203A (es) | Vectores y metodos para la transferencia genica acelulas |