JP3420586B2 - 細胞への遣伝子導入のためのベクターおよび方法 - Google Patents

細胞への遣伝子導入のためのベクターおよび方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は、野生型アデノウイルスコート蛋白質を有す
る類似のベクターよりも効率的なキメラコート蛋白質を
含むベクターの細胞内への進入を指示することができる
該コート蛋白質に関する。このようなキメラコート蛋白
質は、ファイバー、ヘキソンまたはペントン蛋白質であ
る。本発明はまた、そのようなキメラアデノウイルスコ
ート蛋白質を含む組換えベクター、並びにそのようなベ
クターの構築方法および使用方法に関する。
発明の背景 アデノウイルスは、２つの属、すなわち、マストアデ
ノウイルス属とアビアデノウイルス属とに分けられるア
デノウイルス科に属する。アデノウイルスは、エンベロ
ープのない、直径約65〜80ナノメートルの正二十面体で
ある（Horneら,J.Mol.Biol.,１,84−86（1959））。ア
デノウイルスキャプシドは252個のキャプソマー（その
うち240個はヘキソンであり、12個がペントンである）
より構成される（Ginsbergら,Virology,28,782−783（1
966））ヘキソンおよびペントンは３つの異なるウイル
スポリペプチドに由来する（Maizelら,Virology,36,115
−125（1968）;Weberら,Virology,76,709−724（197
7））。ヘキソンはそれぞれ967のアミノ酸からなる３つ
の同一のポリペプチド、すなわちポリペプチドIIを含む
（Robertsら,Science,232,1148−1151（1986））。ペン
トンはキャプシドに結合したペントンベースと、ペント
ンベースに非共有結合し且つそこから突き出したファイ
バーを含む。ファイバー蛋白質はそれぞれ582のアミノ
酸からなる３つの同一のポリペプチド、すなわちポリペ
プチドIVを含む。アデノウイルス血清型２（Ad2）のペ
ントンベース蛋白質は、それぞれ571のアミノ酸からな
る５つの同一の蛋白質サブユニット、すなわちポリペプ
チドIIIより構成される環状の複合体である（Boudinら,
Virology,92,125−138（1979））。蛋白質IX、VIおよび
III aもまた、アデノウイルスコート蛋白質に存在し、
ウイルスキャプシドを安定化させると考えられている
（Stewartら,Cell,67,145−154（1991）;Stewartら,EMB
O J.,12（７）,2589−2599（1993））。
いったん細胞に接着すると、アデノウイルスは受容体
を介して細胞のクラスリンで被覆されたエンドサイトー
シス小胞へと内部移行される（Svenssonら,J.Virol.,5
1,687−694（1984）;Chardonnetら,Virology,40,462−4
77（1970））。細胞に進入するビリオンは、多くのウイ
ルス構造蛋白質の殻を脱ぎ捨てながら段階的に分解され
る（Greberら,Cell,75,477−486（1993））。脱被覆過
程の間、pH依存的なメカニズムによって細胞のエンドソ
ームの破壊を引き起こすが（Fitsgeraldら,Cell,32,607
−617（1983））、これについてはまだあまり理解され
ていない。次いで、ウイルス粒子は細胞の核孔複合体へ
と輸送され（Dalesら,Virology,56,465−483（197
3））、そこでウイルスゲノムが核に進入し、そうして
感染を開始する。
アデノウイルスは２つの別個の細胞受容体を使用する
が、効率よく接着して感染するにはその両方が存在しな
ければならない（Wickhamら,Cell,73,309−319（199
3））。まず、Ad2ファイバー蛋白質が、現在のところま
だ同定されていない受容体に結合することによってウイ
ルスを細胞に接着させる。次いで、ペントンベースが、
細胞外マトリックス分子および他の分子への細胞の接着
を仲介するヘテロダイマーの細胞表面受容体のファミリ
ーであるαｖインテグリンに結合する（Hynes,Cell,69,
11−25（1992））。
ファイバー蛋白質は、テール（tail）、シャフト（sh
aft）およびノブ（knob）からなる三量体である（Devau
xら,J.Molec.Biol.,215,567−588（1990））。ファイバ
ーシャフト領域は２つの交互にあるβ鎖およびβベンド
を形成すると信じられている15アミノ酸モチーフの繰り
返しより構成される（Greenら,EMBO J.,２,1357−1365
（1983））。ファイバーシャフト領域の全長および15ア
ミノ酸繰り返し配列（repeat）の数はアデノウイルスの
血清型間で異なる。例えば、Ad2ファイバーシャフトは
長さ37ナノメートルで22個の繰り返しを含むが、一方、
Ad3ファイバーは長さ11ナノメートルで６個の繰り返し
を含む。ファイバー蛋白質の受容体結合ドメインは該蛋
白質の最後の200アミノ酸によってコードされるノブ領
域に局在している（Henryら,J.Virology,68（８）,5239
−5246（1994））。三量体化に必要な領域もまた該蛋白
質のノブ領域に位置している（Henryら，上述）。最後
の40アミノ酸を欠く欠失変異体は三量体化せず、またペ
ントンベースに結合しない（Novelliら,Virology,185,3
65−376（1991））。したがって、ペントンベースの結
合にはファイバー蛋白質の三量体化が必要である。細胞
質で合成された後、ウイルス粒子を形成するために該蛋
白質を核へ方向付ける核局在化シグナルは、該蛋白質の
Ｎ末端領域に位置する（Novelliら（1991），上述）。
ヘキソンとともに、ファイバーはウイルスの主要な抗原
決定基であり、またウイルスの血清型特異性を決定する
（Watsonら,J.Gen.Virol.,69,525−535（1988））。
治療を必要とする罹病細胞または組織に、１またはそ
れ以上の組換え遺伝子を細胞をターゲッティングして送
達するのに、組換えアデノウイルスベクターが用いられ
ている。このようなベクターは、アデノウイルス蛋白質
を発現するために宿主細胞の増殖を必要としないという
利点により特徴づけられる（Horwitzら,In Virology,Ra
ven Press,New York,vol.2,pp.1679−1721（1990）；お
よびBerkner,BioTechniques,６,616（1988）））。さら
に、もしも体細胞遺伝子治療の標的組織が肺であれば、
これらのベクターは通常、向気道上皮性であるという更
なる利点を有する（Straus,In Adenoviruses,Plenan Pr
ess,New York,pp.451−496（1984））。
ヒトの遺伝子治療のための、可能性のあるベクターと
してのアデノウイルスの他の利点は、（ｉ）このような
ベクターを使用すると、組換えが稀にしか起こらない；
（ii）ヒトのアデノウイルス感染は良くあることである
にもかかわらず、アデノウイルス感染によりヒトへの悪
影響を伴うことは知られていない；（iii）アデノウイ
ルスゲノム（それは直鎖状の二本鎖DNAであるが）はか
なりサイズが変動する外来遺伝子を収容するのに走査で
きる；（iv）アデノウイルスベクターは細胞の染色体に
DNAを挿入しないので、その効果は永続的でなく、おそ
らく細胞の通常の機能を妨げない；（ｖ）アデノウイル
スは、脳や肺の細胞のような非***細胞または最終分化
した細胞に感染し得る；および（vi）本質的な特徴とし
て複製能力を有する生のアデノウイルスが、ヒトワクチ
ンとして安全に使用されている（Horwitzら（1990），
上述;Berknerら（1988），上述;Strausら（1984），上
述;Chanockら,JAMA,195,151（1966）;Haj−Ahmadら,J.V
irol.,57,267（1986）;Ballayら,EMBO,４,3861（198
5）;PCT特許出願WO94/17832）。
アデノウイルスを介した遺伝子治療の欠点は、ベクタ
ー投与から２週間後には遺伝子発現の著しい減少が観察
されることである。多くの治療上の適用において、発現
が減少するとウイルスベクターの再投与が必要となる。
しかしながら、再投与の後、該ウイルスベクターのファ
イバーおよびヘキソン蛋白質の両方に対する中和抗体が
生じる（Wohlfart,J.Virology,62,2321−2328（1988）;
Wohlfartら,J.Virology,56,896−903（1985））。ウイ
ルスに対するこの抗体の応答は、ウイルスベクターの効
果的な再投与を妨げるかもしれない。
遺伝子治療において組換えアデノウイルスを使用する
ことのもう一つの欠点は、ある細胞はアデノウイルスを
介した遺伝子送達を容易に受けないことである。例え
ば、αｖインテグリンアデノウイルス受容体を欠くリン
パ球では、アデノウイルスの取り込みが損なわれる（Si
lverら,Virology,165,377−387（1988）;Harvathら,J.V
irology,62（１）,341−345（1988））。このように全
ての細胞に感染する能力を欠くことから、研究者らは、
例えばアデノウイルス受容体を欠くためにアデノウイル
スが感染することができない細胞へアデノウイルスを導
入する方法を探し求めている。詳細には、哺乳動物細胞
に対するリガンド（例えば、トランスフェリン）を含む
DNA−ポリリジン複合体にウイルスをカップリングさせ
ることができる（例えば、Wagnerら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,89,6099−6103（1992）;PCT特許出願WO95/26412）。
同様に、抗体でアデノウイルスファイバー蛋白質を立体
的にブロックすることができ、また組織特異的抗体をウ
イルス粒子に化学的に結合させることができる（Cotten
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,6094−6098（199
2））。
しかしながら、これらのアプローチは、ポリリジン、
受容体リガンドおよび抗体のような大きな分子をウイル
スに共有結合させる付加的工程を必要とする点で不利で
ある（Cotten（1992），上述;Wagnerら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,89,6099−6103（1992））。このことにより生産
コストとともに得られるベクターのサイズが増す。さら
に、ターゲッティングされる粒子複合体は構造的に均質
ではなく、その効率はウイルス粒子、連結する分子およ
び使用されるターゲッティングさせる分子の相対比に鋭
敏に反応する。したがって、アデノウイルスを介した遺
伝子治療が容易に可能な細胞のレパートリーを拡げるの
に、このアプローチは最適ではない。
最近、高い効率でアデノウイルスが入ると考えられて
きた細胞にでさえ、インビボ（in vivo）でのアデノウ
イルスを介した遺伝子導入効率が疑問視されている（Gr
ubbら,Nature,371,802−806（1994）;Dupuitら,Human G
ene Therapy,６,1185−1193（1995））。アデノウイル
スが最初に細胞に接触するためのファイバー受容体は同
定されておらず、他の組織ではどのように提示するか調
べられたことがない。肺と腸管の上皮細胞は最適な形質
導入を可能にするのに十分なレベルのファイバー受容体
を産生していると一般には考えられている。しかしなが
ら、現在に至るまでこの点を確認した研究はない。実際
には、分化した肺上皮へのアデノウイルス遺伝子送達
は、増殖中の、もしくは未分化の細胞への送達より効率
が悪いことが、研究により示唆されている（Grubbら，
上述;Dupitら，上述）。
同様に、アデノウイルスは肺上皮細胞（Rosenfeldら,
Cell,68,143−155（1992））、筋肉細胞（Quantinら,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,89,2581−2584（1992））、内皮細
胞（Lemarchandら,Proc.Natl.Acad.Sci.,89,6482−6486
（1992））、繊維芽細胞（Antonら,J.Virol.,69,4600−
4606（1995））、神経細胞（LaSalleら,Science,259,98
8−990（1993））を含む数多くの組織に形質導入するこ
とが示されている。しかしながら、これらの研究の多く
は、形質導入を達成するために非常に高レベルのウイル
ス粒子を用いており、しばしば100プラーク形成単位（p
fu）／細胞を越えており、感染多重度（MOI）100に相当
する。形質導入を達成するために高いMOIを必要とする
のは、アデノウイルスの感染に伴ういかなる免疫応答
も、高用量を使用すると必ず悪化するであろうから不利
である。
したがって、高い効率で、とりわけ低いMOIで細胞に
感染することができ、増大した感染できる宿主域を示す
ベクター、例えばアデノウイルスベクターがなおも必要
とされている。本発明は、組換えアデノウイルス遺伝子
治療の前述した問題の少なくともいくつかを克服しよう
とするものである。特に、本発明の目的は、広い宿主域
および低いMOIであっても高い効率で細胞に入る能力を
有するベクター（例えば、アデノウイルスベクター）を
提供することであり、それによって投与する組換えアデ
ノウイルスの量を減じ、このような投与の結果生じる全
ての副作用／合併症を減じることである。本発明の更な
る目的は、ウイルス粒子の付加的な化学的修飾を必要と
することなく、ウイルス粒子がアデノウイルスゲノムの
レベルで改変された均質なアデノウイルスを使用するこ
とを含む遺伝子治療方法を提供することである。本発明
のこれらの、そして他の目的および本発明の利点、並び
に本発明の付加的な特徴は、後記の詳細な説明から明確
になるであろう。
発明の簡単な要約 本発明は、非天然の（nonnative）アミノ酸配列を、
好ましくはカルボキシル末端もしくはその近傍に導入す
ることにより、野生型（すなわち天然の）ファイバー蛋
白質とは異なるキメラアデノウイルスコート蛋白質（例
えば、ファイバー、ヘキソンまたはペントン蛋白質）を
提供する。得られるキメラアデノウイルスコート蛋白質
は、キメラアデノウイルスコート蛋白質ではなく野生型
のアデノウイルスコート蛋白質を含むという以外は同一
であるベクターの細胞への進入よりも効率的な、該コー
ト蛋白質を含むベクターの細胞への進入を指示すること
ができる。このように進入効率が増すことによる直接的
な結果の一つは、該キメラアデノウイルスコート蛋白質
が、野生型コート蛋白質を含むアデノウイルスが通常入
ることができないか、あるいは低い効率でしか入ること
ができない数多くの細胞種にアデノウイルスを結合さ
せ、進入させ得ることである。本発明はまた、該キメラ
アデノウイルスコート蛋白質を含むアデノウイルスベク
ター並びに、そのようなベクターの構築方法および使用
方法を提供する。
図面の簡単な説明 図１は、様々な組織由来の細胞への野生型アデノウイ
ルスの結合（投入量に対するパーセント）を示す棒グラ
フである。
図2A−Ｂは、カルボキシ末端に非天然のアミノ酸配列
を含むキメラアデノウイルスファイバー蛋白質（図2B）
を誘導するための、野生型アデノウイルスファイバー遺
伝子（図2A）の末端での核酸配列の付着を示す。示され
ているように、ポリＡテールの長さは変動してよく、そ
の結果、得られる蛋白質中のリジンの数も変動してよ
い。
図３は、中間体の導入ベクターを用いた、キメラファ
イバー蛋白質を含むアデノウイルス導入ベクターpAd BS
59−100 UTVの構築を示す模式図である。詳細には、フ
ァイバーを有しない（すなわちF-）のpAD NS 83−100
（p193NS（△Ｆ）またはpNS（△Ｆ）としても知られ
る）を誘導するのにpAd NS 83−100（p193NS 83−100ま
たはpNS 83−100としても知られている）が使用され
（経路Ａ）、pAd NS 83−100 UTV（p193NS（F5＊）、p1
93（F5＊）またはpNS（F5＊）としても知られる）を誘
導するのにpAd NS 83 100（F-）が使用され（経路
Ｂ）、pAd BS 59−100 UTVを誘導するのにpAd NS 83−1
00 UTVが使用される（経路Ｃ）。
図4A−Ｄは、GV10 UTVの構築に使用されるオリゴヌク
レオチド、すなわち、プライマー、配列番号９（図4
A）、配列番号10（図4B）、配列番号11（図4C）および
配列番号12（図4D）を示す。
図５は、野生型ファイバー蛋白質（WT）と比較した際
の、キメラアデノウイルスファイバー蛋白質（UTV）の
サイズの増加を示すウェスタンブロットを示す。
図6A−Ｂは、野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウ
イルスベクター（すなわち、GV10,白抜き三角）とキメ
ラファイバー蛋白質を含むアデノウイルスベクター（す
なわち、GV10 UTV,塗りつぶした円）の、受容体を有す
る細胞（A549,図6A）および受容体を有しない細胞（HS6
8,図6B）への結合の比較を示すグラフである。
図７は、受容体を有しない細胞（すなわち、HS68線維
芽細胞）へのキメラアデノウイルスファイバー蛋白質の
結合の、コンドロイチン硫酸（白抜き円）、ヘパリン
（塗りつぶした円）、ムチン（塗りつぶした三角）およ
びサケ***DNA（白抜き三角）といった可溶性因子によ
る阻害についての、競合物量（μg/ml）に対する結合UT
V（１分間あたりのカウント（CPM））のグラフである。
図８は、受容体を有しない細胞（すなわち、HS68線維
芽細胞）へのキメラアデノウイルスファイバー蛋白質の
結合の、コンドロイチナーゼ（白抜き円，点線）、ヘパ
リナーゼ（白抜き円，実線）、シアリダーゼ（三角，実
線）といった酵素による阻害についての、酵素希釈に対
する結合UTV（CPM）のグラフである。
図９は、種々の、受容体を有する細胞および受容体を
有しない細胞において得られるリポーター遺伝子の発現
（すなわち相対明単位（RLU））によって評価した際
の、野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウイルスベク
ター（すなわち、GV10）とキメラファイバー蛋白質を含
むアデノウイルスベクター（すなわち、GV10 UTV）によ
るlac Zリポーター遺伝子の導入の比較を示す棒グラフ
である。
図10は、マウス肺において得られるリポーター遺伝子
の発現（すなわち相対明単位（RLU））によって評価し
た際の、野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウイルス
ベクター（すなわち、GV10）とキメラファイバー蛋白質
を含むアデノウイルスベクター（すなわち、GV10 UTV）
によるlac Zリポーター遺伝子の導入の比較を示す棒グ
ラフである。
図11は、野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウイル
スベクター（すなわちGV10,べた塗りの棒）、並びに蛋
白質/DNA相互作用を介して293細胞、A549細胞およびH70
0 Ｔ細胞に結合する可能性のあるキメラファイバーを
含むアデノウイルスベクター（すなわちGV10 UTV,白抜
きの棒）によるリポーター遺伝子（すなわち、pGUS中に
含まれる）の導入を示す棒グラフである。
図12は、アデノウイルスベクターキメラを構築するの
に使用されるプラスミドp193（F5＊）（図３中ではpAd
NS83−100 UTVとして記載され、また、p193（F5＊）ま
たはpNS（F5＊）としても知られる）、並びに該プラス
ミド中に存在する変異ファイバー蛋白質のＣ末端配列
（ポリアデニル化部位を太字にしている）をさらに示す
図である。
図13は、アデノウイルスファイバーキメラを構築する
のに使用されるプラスミドp193NS（F5＊）pGS（K7）（p
193（F5＊）pGS（K7）またはpNS（F5＊）pGS（K7）とし
ても知られる）を示す図である。
図14は、プラスミドpBSS 75−100 pGS（null）（pBSS
75−100 ΔE3 pGS（null）としても知られる）を示す
図である。
図15は、プラスミドpBSS 75−100 pGS（RK32）（pBSS
75−100 ΔE3 pGS（RKKK）２またはpBSS 75−100 ΔE3
pGS（RKKK2）としても知られる）を示す図である。
図16は、プラスミドpBSS 75−100 pGS（RK33）（pBSS
75−100 ΔE3 pGS（RKKK）３またはpBSS 75−100 ΔE3
pGS（RKKK3）としても知られる）を示す図である。
図17は、プラスミドp193NS F5F2K（p193 F5F2Kとして
も知られる）を示す図である。
図18は、プラスミドp193NS F5F2K（RKKK）２（p193NS
F5F2K（RKKK2）、p193NSF5F2K（RK32）またはp193 F5F
2K（RKKK2）としても知られる）を示す図である。
図19は、プラスミドp193NS F5F2K（RKKK）３（p193NS
F5F2K（RKKK3）、p193 F5F2K（RKKK3）またはp193 F5F
2K（RK33）としても知られる）を示す図である。
図20は、プラスミドpACT（RKKK）３（pACT（RKKK3）
またはpACT（RK33）としても知られる）を示す図であ
る。
図21は、プラスミドpACT（RKKK）２（pACT（RKKK2）
またはpACT（RK32）としても知られる）を示す図であ
る。
図22は、プラスミドpACT H11を示す図である。
図23は、プラスミドpACT H11（RKKK）２（pACT H11
（RKKK2）またはpACT H11（RK32）としても知られる）
を示す図である。
図24は、プラスミドp193 F5F9sK（p193 F5F9−Short
としても知られる）を示す図である。
図25は、プラスミドpSPde1taを示す図である。
図26は、プラスミドpSP2a1phaを示す図である。
「ｊ」は該プラスミド中の破壊されたPpu10I部位を示
す。
図27は、プラスミドpSP2a1pha2を示す図である。
「ｊ」は該プラスミド中の破壊されたPpu10I部位を示
す。
図28は、Ad5（白抜き円）、Adz.F（RGD）（塗りつぶ
した正方形）またはAdz.F（pK7）（白抜き三角）を感染
させた293細胞についての、FFU/細胞に対する感染後日
数のグラフである。
発明の詳細な説明 本発明は、特に、キメラファイバー、ペントンおよび
／またはヘキソン蛋白質のようなキメラコート蛋白質を
含む組換えアデノウイルスを提供する。該キメラコート
蛋白質は、天然のアミノ酸配列に加えてあるいはそれに
代えて、非天然のアミノ酸配列を含む。この非天然のア
ミノ酸配列が、キメラファイバー（または該キメラファ
イバーを含むベクター）がより効率よく細胞に結合し進
入することを可能にする。
したがって、本発明は、非天然のアミノ酸配列を含む
キメラアデノウイルスコート蛋白質であって、キメラア
デノウイルスコート蛋白質ではなく野生型アデノウイル
スコート蛋白質を含む（すなわち、キメラアデノウイル
スコート蛋白質が存在せず、野生型アデノウイルスコー
ト蛋白質が存在する）以外は同一であるベクターの細胞
への進入よりも効率のよいコート蛋白質を含むベクター
の細胞への進入を指示することができる該コート蛋白質
を提供する。
キメラコート蛋白質 本発明の「コート蛋白質」は、好ましくはファイバー
蛋白質（とりわけアデノウイルスファイバー蛋白質）、
ペントン蛋白質（とりわけアデノウイルスペントン蛋白
質）およびヘキソン蛋白質（とりわけアデノウイルスヘ
キソン蛋白質）を包含する。特に、コート蛋白質は、ア
デノウイルスのファイバー、ペントンまたはヘキソン蛋
白質を好ましく包含する。ヒトまたは非ヒトアデノウイ
ルスのいずれの血清型もコート蛋白質遺伝子のソースと
して使用し得るが、アデノウイルスはAd2またはAd5アデ
ノウイルスであるのが最適である。
該コート蛋白質は、その中に野生型アデノウイルス
（すなわち天然の蛋白質、つまり野生型の蛋白質）から
単離される蛋白質には通常見出されないアミノ酸配列を
含むので「キメラ」である。従って、該コート蛋白質は
「非天然のアミノ酸配列」を含む。「非天然のアミノ酸
配列」とは、既知のアデノウイルス血清型の天然ファイ
バーにおいては見出されず、好ましくは遺伝子発現のレ
ベルで（すなわち、「非天然のアミノ酸配列をコードす
る核酸配列」の導入によって）ファイバー蛋白質に導入
されるあらゆるアミノ酸配列を意味する。
このような非天然のアミノ酸配列は、得られるキメラ
蛋白質に、新規細胞表面結合部位によって、細胞に結合
して中に入る能力を与えるアミノ酸配列（すなわち、
「UTV配列」つまりユニバーサルトランスファーベクタ
ー（Universal Transfer Vector）配列）を含み（すな
わち、特定のオーダーで成分残基を有する）、および／
または天然／非天然、非天然／非天然もしくは天然／天
然配列間に得られるキメラ蛋白質のある特定の相対的配
置を作るか維持するために組み込まれた配列（すなわ
ち、「スペーサー配列」）を含む。
非天然のアミノ酸配列は、あるアミノ酸配列中に、あ
るいはそれに代えて挿入され、また、キメラコート蛋白
質のアミノ酸配列の操作は核酸レベルでなされるのが好
ましいので、キメラコート蛋白質中の野生型コート蛋白
質とは異なるアミノ酸配列（すなわち、UTV配列および
スペーサー配列）は、好ましくは全く非天然のアミノ酸
配列か、あるいは天然および非天然のアミノ酸の混合物
を包含し得る。
「細胞表面結合部位」としては、受容体（好ましく
は、それは蛋白質、炭水化物、糖蛋白質またはプロテオ
グリカンである）の他、反対に荷電したいかなる分子
（すなわち、キメラコート蛋白質、好ましくは、ここに
さらに記載されるように、正に荷電した非天然のアミノ
酸配列を含むキメラコート蛋白質とは反対に荷電したも
の）またはキメラコート蛋白質が細胞に結合するように
相互作用し、それによって細胞への進入を促進し得る他
の分子種も包含される。可能性のある細胞表面結合部位
の例としては、それらに限定されないが、例えば、グリ
コサミノグリカン上に見られさらにシアル酸、硫酸およ
び／またはリン酸を含んでもよい、負に荷電したヘパリ
ン、へパラン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸およ
びコンドロイチン硫酸部分；ムチン、糖蛋白質およびガ
ングリオシド上に見られるシアル酸部分；主要組織適合
性複合体Ｉ（MHC I）の糖蛋白質；マンノース、Ｎ−ア
セチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミ
ン、フコース、ガラクトース等を含む、膜糖蛋白質中に
見られる一般的な炭水化物成分；および例えば核酸上の
リン酸部分が挙げられる。しかしながら、本発明のキメ
ラコート蛋白質およびその使用方法は、細胞の相互作用
のいかなる特定のメカニズム（すなわち、特定の細胞表
面結合部位との相互作用）にも限定されないし、またそ
のように解されるべきではない。
さらに、本発明のファイバー蛋白質のようなキメラア
デノウイルスコート蛋白質を含むベクターと比較する
と、野生型アデノウイルスコート蛋白質を含むベクター
の進入効率が減少することに反映されるように、このよ
うな細胞表面結合部位は、以前はアデノウイルスコート
蛋白質（すなわち、ファイバー蛋白質等の野生型アデノ
ウイルスコート蛋白質）との相互作用に利用し得なかっ
たか、あるいは非常に低いレベルでしか利用し得なかっ
たので、該部位は「新規である」。さらに、該結合部位
は、すべてではないにしても、起源に関係なく大多数の
細胞上に存在するという点で新規である。このことは、
野生型アデノウイルスファイバーを含むベクターの進入
効率が減少することに反映されるように、表向きは少し
の集団の細胞上にしか存在しないかあるいは少しの集団
の細胞上でしか利用し得ない、野生型アデノウイルスフ
ァイバー蛋白質が相互作用すると推定される細胞結合部
位とは対照的である。
「進入効率」はいくつかの手段で定量化することがで
きる。特に、進入効率はキメラコート蛋白質をベクタ
ー、好ましくはウイルスベクター中に導入し、細胞への
進入を感染多重度（MOI）の関数としてモニタリングす
ることによって（例えば、リポーター遺伝子のような遺
伝子のベクターを介した細胞への送達によって）定量化
することができる。この場合、キメラアデノウイルスコ
ート蛋白質ではなく野生型アデノウイルスコート蛋白質
を含む以外は同一のベクターと比較した際の、該キメラ
アデノウイルスコート蛋白質を含むベクターの細胞への
進入に必要なMOIの減少は、「より効率的な」進入を示
す。
同様に、進入効率は、キメラもしくは野生型コート蛋
白質を含むベクター、あるいは可溶性のキメラもしくは
野生型コート蛋白質自身が細胞に結合する能力に基づい
て定量化することができる。この場合、代わりに野生型
コート蛋白質を含む同一のベクターまたは野生型コート
蛋白質自身と比較した際の、キメラアデノウイルスコー
ト蛋白質を含むベクターまたはキメラコート蛋白質自身
に提示される結合の増大は、進入効率の増大、すなわち
「より効率的な」進入を示す。
本発明の非天然アミノ酸配列は、好ましくは内部のコ
ート蛋白質配列中にまたはそれに代えて挿入される。あ
るいは、本発明の非天然アミノ酸配列は蛋白質のＣ末端
もしくはその近傍にあることが好ましい。特に、本発明
のコート蛋白質がファイバー蛋白質である場合、非天然
アミノ酸配列は該蛋白質のＣ末端もしくはその近傍にあ
ることが望ましい。本発明のコート蛋白質がペントンま
たはヘキソン蛋白質である場合、非天然アミノ酸配列
は、例えば、下記実施例に記載されるように、該蛋白質
の露出したループ内、特にアデノウイルスヘキソン蛋白
質のループ１および／またはループ２中の超可変領域
（Crawford−Mikszaら,J.Virol.,70,1836−1844（199
6））内にあることが好ましい。すなわち非天然アミノ
酸配列は、コート蛋白質の、細胞と相互作用して結合し
得る領域内にあることが望ましい。
さらに、本発明の方法は、特にヘキソンおよび／また
はペントンベース蛋白質において、延長されたヘキソン
および／またはペントンベース蛋白質を結果として生じ
るように、UTVもしくはUTV様配列を、伸張した（という
か折れ線状の（spiked））構造で含むアデノウイルスベ
クターを創製するのに使用することができるが、ここで
該アミノ酸挿入物は、ビリオンのキャプシド中に存在す
る時には蛋白質から外側に突き出している。特に、この
ような折れ線状のコート蛋白質は、ファイバーのシャフ
トが短く、且つファイバー蛋白質のノブが、該ファイバ
ー蛋白質の残りの部分が由来するアデノウイルスベクタ
ーとは別の血清型のノブ（三量体化ドメインを含む）で
置き換えられているかもしれない「短シャフトファイバ
ー（short−shafted fiber）」（以下さらに記載され
る）とともに組換えアデノウイルス中に組み込むことが
できる。
したがって、短シャフトファイバー蛋白質は、１つの
UTVもしくはUTV様配列を含むキメラペントンベース蛋白
質を有するか、あるいはさらに任意でUTVもしくはUTV様
配列を組み込むことができる「折れ線状の」キメラペン
トンベース蛋白質を有するアデノウイルス中に、好まし
く組み込むことができる。また、短シャフトファイバー
蛋白質は、１つのUTVもしくはUTV様配列を含むキメラヘ
キソン蛋白質を有するか、あるいはさらに任意でUTVも
しくはUTV様配列を組み込むことができる「折れ線状
の」キメラヘキソン蛋白質を有するアデノウイルス中に
組み込むことができる。
最も好ましくは、非天然アミノ酸配列は別の非天然ア
ミノ酸配列、すなわち、介在のスペーサー配列によって
蛋白質に連結される。スペーサー配列は、天然の蛋白質
配列と非天然配列の間、非天然配列と別の非天然配列の
間または天然配列と別の天然配列の間に介在する配列で
ある。
スペーサー配列は、細胞表面結合部位を含む非天然配
列が、細胞と相互作用して結合し得るような様式で、キ
メラ蛋白質の三次元構造（とりわけ、キメラ蛋白質が天
然に存在する際の、すなわち、キャプシドの一部として
の三次元構造）から確実に突き出すように該蛋白質中に
組み込まれることが好ましい。スペーサー配列がコート
蛋白質の内部配列中に挿入されるか、あるいはそれを置
換する場合、１つまたはそれ以上のスペーサー配列が該
キメラコート蛋白質中に存在してもよい。
介在のスペーサー配列は、いかなる適当な長さの配列
でもよいが、（下記実施例においてさらに記載されるよ
うに）「折れ線状の」コート蛋白質を誘導するのに付加
されるスペーサー配列としては、約３〜約400アミノ酸
が好ましく、また、ここで記載される他の適用について
はどれも約３〜約30アミノ酸が好ましい。スペーサー配
列はいかなるアミノ酸を含んでもよい。最も好ましく
は、スペーサー配列は、一般にコート蛋白質が機能する
のを妨害せず、また、特にその他の非天然アミノ酸配列
（すなわち、UTVもしくはUTV様配列）が機能するのを妨
害しないものである。
スペーサー配列ではない非天然アミノ酸配列、すなわ
ちUTV配列もまた、いかなる適当な長さの配列であって
よいが、好ましくは約３〜約30アミノ酸である（スペー
サー配列と同様、UTV配列は任意でより長くてもよく、
例えば約400アミノ酸に達してもよいが）。これらのア
ミノ酸は、真核細胞の表面上に存在する負に荷電した部
分に結合し得る、正に荷電した残基のいずれでも好まし
く、（すべてではないとしても）大多数の真核細胞の表
面上に存在する負に荷電した部分に結合し得るのが最も
好ましい。特に、UTV配列が結合する真核細胞の表面上
に存在するこのような負に荷電した部分としては、前記
「細胞表面結合部位」が挙げられる。
望ましくは、非天然アミノ酸配列は、リジン、アルギ
ニンおよびヒスチジンからなる群より選択されるアミノ
酸を含む。あるいは、これらのアミノ酸は、正に荷電し
た細胞表面結合部位に結合し得る負に電荷した残基であ
ってもよく、例えば、該非天然アミノ酸配列はアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されるア
ミノ酸を望ましく含む。
すなわち、コート蛋白質の非天然アミノ酸配列は、好
ましくは配列番号１（すなわち、Lys Lys Lys Lys Lys
Lys Lys Lys）、配列番号２（すなわち、Arg Arg Arg A
rg Arg Arg Arg Arg）および配列番号３（すなわち、Xa
a Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa,ここで「Xaa」はLysま
たはArgより構成される）であり、該配列の1,2,3,4また
は５残基がそのＣ末端で欠先していてもよい。コート蛋
白質がファイバー蛋白質である場合、該蛋白質は配列番
号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４（すなわ
ち、Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Ly
s Lys Lys Lys）および配列番号５（すなわち、Ala Gly
Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys L
ys Lys Lys Lys）からなる群より選択される配列を含
む、ここで該配列の1,2,3,4または５残基がそのＣ末端
で欠先していてもよい。
また、ヘパリンに結合する配列はヘパリン様受容体へ
の結合に関与するかもしれない（Sawitzkyら,Med.Micro
biol.Immunol.,182,285−92（1993）。同様に、いわゆ
る「ヘパリン結合配列」は、それらが含まれるペプチド
もしくは蛋白質と他の細胞表面結合部位、例えば細胞表
面ヘパラン硫酸プロテオグリカン（Thompsonら,J.Biol.
Chem.,269,2541−９（1994））との相互作用を仲介する
かもしれない。したがって、非天然アミノ酸配列（すな
わち、UTV配列）は、これらの配列、並びに真核細胞の
表面上に広く提示される負に荷電した部分を認識し得る
さらなる配列を含むことが好ましい。
特に、非天然アミノ酸配列は、約20Å離れて位置し、
αヘリックスの反対の方向に面する２つの塩基性アミノ
酸（頻繁にはArg）を含むことが好ましい（Margalitら,
J.Biol.Chem.,268,19228−31（1993）;Maら,J.Lipid Re
s.,35,2049−2059（1994））。他の塩基性アミノ酸はこ
れら２つの残基の間で一方に面して分散し、他方、非極
性残基はもう一方に面して両親媒性構造を形成している
ことが望ましく、最も好ましくは両親媒性構造は、XBBX
BX［配列番号49］もしくはXBBBXXBX［配列番号50］（こ
こでＢは塩基性アミノ酸（すなわち、Lys,Arg他）、Ｘ
は他のいずれかのアミノ酸である）のモチーフを含む。
また好ましくは、UTV非天然アミノ酸配列は、フィブ
ロネクチンや熱ショック蛋白質に存在する共通のヘパリ
ン結合モチーフである配列LIGRKKT［配列番号51］、LIG
RK［配列番号52］またはLIGRR［配列番号53］（Hensen
ら,Biochim.Biophys.Acta,1252,135−45（1995））;Lys
またはArgのいずれかあるいはLysおよびArgの混合物の
７残基の挿入（Frommら,Arch.Biochem.Biophys.,323,27
9−87（1995））；約18アミノ酸からなり、ヘパリン結
合配列を含む、IGFBP−３およびIGFBP−５の共通の塩基
性Ｃ末端領域（Boothら,Growth Regul.,５,1−17（199
5））；らHA受容体RHAMMのＣ末端の35アミノ酸領域内に
位置する２つのヒアルロナン（HA）結合モチーフのいず
れか１つもしくは両方（Yangら,J.Cell Biochem.,56,45
5−68（1994））；ヘパリン結合コンセンサス配列を含
むスタフィロコッカス・アウレウスのビトロネクチンの
ヘパリン結合型を基に作られた合成ペプチド（Ala347−
Arg361）（Liangら,J.Biochem.,116,457−63（199
4））；ウシヘルペスウイルス１の糖蛋白質g IIIのアミ
ノ酸129と310の間の５つのヘパリン結合部位のいずれか
１つまたは２つ以上、あるいは偽狂犬病ウイルスの糖蛋
白質g IIIのアミノ酸90と275の間の４つのヘパリン結合
部位のいずれか１つ（Liangら,Virol.,194,233−43（19
93））；あるいは偽狂犬病ウイルスの糖蛋白質g IIIの
アミノ酸134〜141（Sawitzkyら,Med.Microbiol.Immuno
l.,182,285−92（1993）；ヒトリポ蛋白質リパーゼの27
9〜282位および292〜304位の荷電した残基に対応するヘ
パリン結合領域（Maら，上述）；配列NVSPPRRARVTDATET
TITISW［配列番号54］を有する合成22残基ペプチドN22
W、またはフィブロネクチンを基に作られ、ヘパリン結
合性を示すこの合成ペプチドの残基TETTITIS［配列番号
55］（Inghamら,Arch.Biochem.Biophys.,314,242−246
（1994））；アルツハイマーβ−アミロイド前駆蛋白質
（APP）、並びにヘパリン親和性を調節する種々の他のA
PP様蛋白質のエクトドメイン亜鉛結合部位中に存在する
GVEFVCCP［配列番号56］モチーフ（Bushら,J.Biol.Che
m.,229,26618−21（1994））；ラミニンＡ鎖の十字領域
由来の８アミノ酸残基ペプチド（Tashiroら,Biochem.
J.,302,73−９（1994））;F123−G148およびK121−A134
を含む、セリンプロテアーゼ阻害剤アンチトロビン、II
Iのヘパリン結合領域に基づく合成ペプチド（Tyler−Cr
ossら,Protein Sci.,３,620−７（1994））；ヘパリン
結合領域として提唱されているAPPの14K Ｎ末端フラグ
メントおよびＮ端末付近の領域（すなわち、残基96〜11
0）（Smallら,J.Neurosci.,14,2117−27（1994））；リ
ジンおよびアルギニン残基含量が高いことを特徴とする
ヘパリン結合表皮成長因子様成長因子（HB−EGF）の一
連の21アミノ酸（Thompsonら,J.Biol.Chem.,269,2541−
９（1994））；トロンボスポリジンのヘパリン結合領域
を含む、hep1合成ペプチドに相当する17アミノ酸領域
（Murphy−Ullrichら,J.Biol.Chem.,268,26784−９（19
93））；ヘパリンに結合するヒトフォンビルブラント因
子の23アミノ酸配列（Y565−A587）（Tyler−Crossら,A
rch.Biochem.Biophys.,306,528−33（1993））；ヘパリ
ンと結合するフィブロネクチン由来ペプチドPRARI［配
列番号57］（およびこのモチーフを含むより大きいペプ
チド、例えばWQPPRARI［配列番号58］）（Woodsら,Mol.
Biol.Cell.,４,605−613（1993））；血小板因子４のヘ
パリン結合領域（Satoら,Jpn.J.Cancer Res.,84,485−
８（1993）；および線維芽細胞成長因子受容体であるチ
ロシンキナーゼ膜貫通糖蛋白質中のK18K配列（Kanら,Sc
ience,259,1918−21（1993））を含む。
さらに、UTV配列は、以下の実施例に記載される他の
配列を含んでもよい。すなわち、UTV配列は、好ましく
は［配列番号１］、［配列番号２］、［配列番号３］、
［配列番号４］、［配列番号５］、［配列番号20］、
［配列番号22］、［配列番号24］、［配列番号26］、
［配列番号28］、［配列番号30］、［配列番号32］、
［配列番号34］、［配列番号36］、［配列番号38］、
［配列番号40］、［配列番号42］、［配列番号46］、
［配列番号48］、［配列番号49］、［配列番号50］、
［配列番号51］、［配列番号52］、［配列番号53］、
［配列番号54］、［配列番号55］、［配列番号56］、
［配列番号57］、［配列番号58］、［配列番号73］、
［配列番号74］、［配列番号76］、［配列番号78］、
［配列番号90］および［配列番号93］からなる群より選
択される。これらの配列はまた、ＣまたはＮ末端で配列
の1,2または３残基が欠失していても使用することがで
きる。また、本発明によれば、スペーサー配列は蛋白質
が機能するのを妨害しないアミノ酸のいかなる配列であ
ってもよいので、前記UTV配列もまたスペーサー配列を
含んでもよい。
非天然アミノ酸配列はまた、前記配列のいずれかの
「均等物」である（すなわち、「UTV様配列」である）
アミノ酸配列を含むことが好ましい。均等物は、（おそ
らく有効性においては小さな相違をもって）同じ機能を
果たすが、そのアミノ酸配列もしくは他の構造的特徴の
点でわずかに異なり得るいかなる配列であってもよい。
特に、均等な配列は、配列の１またはそれ以上の保存的
なアミノ酸置換を含むものである。「保存的なアミノ酸
置換」とは、類似した電荷密度、親水性／疎水性、サイ
ズおよび／または形状の代替アミノ酸によって置換され
るアミノ酸（例えば、I1eに対するVal）である。これと
比較して、「非保存的なアミノ酸置換」とは、異なる電
荷密度、親水性／疎水性、サイズおよび／または形状の
代替アミノ酸によって置換されるアミノ酸（例えば、Ph
eに対するVal）である。
キメラコート蛋白質をコードする核酸 先に示したように、非天然アミノ酸配列はDNAのレベ
ルで導入されるのが好ましい。したがって、本発明はま
た、好ましくは本発明のコート蛋白質をコードする単離
精製された核酸を提供する。ここで非天然アミノ酸配列
をコードする該核酸配列は、配列番号６の配列（すなわ
ち、GGA TCC AA）を含み、それはポリアデニル化部位の
前に位置する。同様に、本発明は、好ましくは配列番号
７（すなわち、GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA
TGT）、配列番号８（すなわち、GCC GGA TCC AAC AAG A
AT AAA GAA TCG TTT GTG TTA）、［配列番号19］、［配
列番号21］、［配列番号23］、［配列番号25］、［配列
番号27］、［配列番号29］、［配列番号31］、［配列番
号33］、［配列番号35］、［配列番号37］、［配列番号
39］、［配列番号41］、［配列番号45］、［配列番号4
7］、［配列番号72］、［配列番号75］、［配列番号7
7］および［配列番号89］からなる群より選択される配
列を含む単離精製された核酸を提供する。さらに本発明
は、これらの核酸の保存的に改変された変種を提供す
る。
「保存的に改変された変種」とは、結果として保存的
なアミノ酸置換を生じる核酸配列上の変化である。これ
と比較して、「非保存的に改変された変種」とは、結果
として非保存的なアミノ酸置換を生じる核酸配列上の変
化である。このような改変を作製する手段は当該技術分
野でよく知られ、且つ以下の実施例に記載されており、
また、市販のキットおよびベクター（例えば、New Engl
and Biolabs,Inc.,Beverly,MA;Clonetech,Palo Alto,C
A）によって成し得るものである。さらに、このような
置換を評価する手段（例えば、細胞に結合し中に入る能
力に及ぼす効果に基づいて）はここで実施例に記載され
ている。
このようなキメラコート蛋白質を作製する手段、特に
DNAのレベルで配列を導入する手段は当該技術分野で周
知であり、代表的なキメラ蛋白質について図２に図示さ
れ、且つ以下の実施例に記載されている。簡単にいえ
ば、該方法はある配列（好ましくは、配列番号６の配列
もしくはその保存的に改変された配列）をコート蛋白質
の配列中に導入することを含む。
以下の実施例に記載される好ましい一態様において
は、キメラ蛋白質が付加的なアミノ酸を組み込むように
結果として得られる蛋白質にフレームシフト変異を導入
するために、該導入は終了コドンまたはポリアデニル化
シグナルのいずれかの前でなされる。
一般に、このことは、ファイバー配列をプラスミドま
たは該配列の操作が容易な他のあるベクター中にクロー
ニングすることによって達成することができる。次い
で、フレームシフト変異を導入すべき配列の側にある制
限部位を同定する。オーバーラップする合成一本鎖セン
スおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから（例え
ば、図４に示されるように、それぞれTAT GGA GGA TCC
AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT AT
T TTT C［配列番号９］およびAAT TGA AAA ATA AAC ACG
TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT C
CA［配列番号10］のセンスおよびアンチセンスオリゴヌ
クレオチドから）、二本鎖合成オリゴヌクレオチドを、
該二本鎖オリゴヌクレオチドが標的配列にフランキング
する制限部位を組み込むように創製する。プラスミドま
たは他のベクターを制限酵素で開裂させ、適合する粘着
末端を有する該オリゴヌクレオチド配列を該プラスミド
または他のベクターに連結して野生型DNAを置換する。
当業者に知られており、例えば市販のキットによって成
し得る（特に、PCRを用いて）ようなインビトロでの部
位特異的突然変異誘発の他の手段を、コート蛋白質コー
ド配列中に変異した配列を導入するのに使用することが
できる。
いったんキメラコート蛋白質中に配列を導入すると、
例えば、5'および3'プライマーを用いたPCR増幅によっ
て、該配列をコードする核酸フラグメントを単離するこ
とができる。例えば、あるキメラコート蛋白質につい
て、図４に示されるように、プライマーTCCC CCCGGG TC
TAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA［配列番号
11］およびプライマーCGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA
［配列番号12］を用いたPCRによって、該フラグメント
を単離することができる。このやり方でこれらのプライ
マーを使用すると、結果として該フラグメントを簡便に
サブクローニングするのに使用することができる制限部
位（すなわち、この場合ではNde IおよびBam H I部位）
にフランキングされた、キメラファイバー含有フラグメ
ントが増幅される。キメラコート蛋白質を生成させる他
の手段も使用することができる。
したがって、コート蛋白質コード配列のどの部分にで
もフレームシフト変異を導入することができる。例え
ば、配列番号６について、蛋白質のＣ末端をコードする
コート蛋白質遺伝子の領域に置くことができ（すなわ
ち、TAA終止コドンの直前に付加することができ）、あ
るいは、配列番号５の配列を含むキメラ蛋白質をコード
する配列番号８の前記コード配列を製造するためのAla
（すなわちＡ）とGln（すなわちＱ）をコードするコド
ンの間のように、より前のコード領域中に置くこともで
きる。同様に、このアプローチは、コード配列中のいっ
そう前にフレームシフト変異を導入するのに使用するこ
とができ、例えば内部（すなわち天然の）コート蛋白質
配列中に挿入するか、それともそれに代えて挿入するこ
とができる。
さらに、二本鎖オリゴヌクレオチドはまた、やはり配
列を操作するのに使用できる。さらなる制限部位を組み
込むことができる。例えば、ベクター中に導入される配
列番号６の配列は、修飾されたBam H I部位−すなわち
パリンドローム状の認識配列上に付加的なヌクレオチド
を追加するという点で、該部位は「修飾されている」−
を含む。この配列はまた、DNA操作に都合のよいいかな
る他の制限部位をも含むように合成することができる。
コート蛋白質コード配列中に組み込まれる場合、該配列
はフレームシート変異を導入するだけでなく、該コート
蛋白質遺伝子中に他のコード配列を導入するのにも使用
することができる。特に、このやり方で導入されるコー
ド配列は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンのコド
ン、あるいはアスパラギン酸およびグルタミン酸のコド
ンを、いずれか１つだけ、あるいはいかなる組み合わせ
でも含むことができる。さらに、新しい翻訳終止コドン
をこれらのアミノ酸コドンの後に続けて、キメラ蛋白質
が非天然アミノ酸配列中に所定の数の付加的アミノ酸だ
けを組み込むように製造されるようにすることができ
る。アミノ酸コドンと翻訳終止コドンは、先に記載した
ように、あるいは当業者に公知の他の手段によって、制
限部位によってフランキングされるこれらの配列を含む
オリゴヌクレオチド（例えば、5'および3'Bam H I部位
を含む）を合成することによって、コート蛋白質中に組
み込まれた、フレームシフト変異を導入する該新規制限
部位中に導入することができる。
天然の受容体結合配列を置換するのに用いられるDNA
のサイズは、例えば、ファイバーの妨害された折り畳み
またはペントンベース／ファイバー複合体の不適切なア
ッセンブリによって制限を受けるかもしれない。前記ア
ミノ酸配列（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸等）をコードするDN
Aが、天然の受容体結合配列を欠失したかさもなくば変
異したファイバー遺伝子配列中に挿入するのに優先的に
選ばれる。さらに、スペーサー配列中に組み込むための
アミノ酸をコードするような他のDNA配列が、天然のコ
ート蛋白質コード配列を置換するのに好ましく使用され
る。
キメラコート蛋白質を含むベクター 本発明の「ベクター」は、当業者がその用語を理解し
ている通り、遺伝子導入用の乗り物（vehicle）であ
る。本発明の包含される４つのタイプのベクターはプラ
スミド、ファージ、ウイルスおよびリポソームである。
プラスミド、ファージおよびウイルスは、それらの核酸
の形態で細胞に導入することができ、また、リポソーム
は核酸を導入するのに使用することができる。したがっ
て、遺伝子導入に使用し得るベクターを、ここでは「導
入ベクター」と称する。
好ましくは、本発明のベクターは、ウイルス、とりわ
けエンベロープのないウイルス、すなわち、非エンベロ
ープ型RNAもしくはDNAウイルスからなる群より選択され
るウイルスである。また、ウイルスはエンベロープを有
するウイルス、すなわち、エンベロープ型RNAもしくはD
NAウイルスからなる群からも選択することができる。こ
のようなウイルスはコート蛋白質を含んでいることが好
ましい。望ましくは、該ウイルスコート蛋白質は、細胞
と相互作用することができるようにキャプシドから外向
きに突き出しているものである。エンベロープ型RNAも
しくはDNAウイルスの場合、該コート蛋白質は、実際に
は脂質エンベロープ糖蛋白質（すなわち、いわゆるスパ
イクまたはペプロマー）であることが好ましい。
特に好ましくは、ベクターは、ヘパドナウイルス科、
パルボウイルス科、パポーバウイルス科、アデノウイル
ス科またはピコルナウイルス科由来の非エンベロープ型
ウイルス（すなわち、RNAまたはDNAウイルスのいずれ
か）である。本発明の好適な非エンベロープ型ウイルス
は、ヘパドナウイルス科、とりわけヘパドナウイルス属
のウイルスである。パルボウイルス科のウイルスは、望
ましくはパルボウイルス属（例えば、哺乳動物および鳥
類のパルボウイルス）またはデペンドウイルス属（例え
ば、アデノ随伴ウイルス（AAV））のウイルスである。
パポーバウイルス科のウイルスは、好ましくはパピロー
マウイルス亜科（例えば、これに限らないが、ヒトパピ
ローマウイルス（HPV）１〜48を含むパピローマウイル
ス）またはポリオーマウイルス亜科（例えば、これに限
らないが、JC、SV40およびBKウイルスを含むポリオーマ
ウイルス）のウイルスである。アデノウイルス科のウイ
ルスは、望ましくはマストアデノウイルス属（例えば、
哺乳動物のアデノウイルス）またはアビアデノウイルス
属（例えば、鳥類のアデノウイルス）のウイルスであ
る。ピコルナウイルス科のウイルスは、好ましくはＡ型
肝炎ウイルス（HAV）、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）または
非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスである。
同様に、ベクターは、ヘルペスウイルス科またはレト
ロウイルス科由来のエンベロープ型ウイルス、あるいは
シンドビスウイルスであってもよい。本発明の好適なエ
ンベロープ型ウイルスは、ヘルペスウイルス科、とりわ
けアルファヘルペスウイルス亜科（例えば、ヘルペス単
純様ウイルス）、シンプレックスウイルス属（例えば、
ヘルペス単純様ウイルス）、ワリセラウイルス属（例え
ば、ワリセラおよび偽狂犬病様ウイルス）、ベータヘル
ペスウイルス亜科（例えば、サイトメガロウイルス）、
サイトメガロウイルス属（例えば、ヒトサイトメガロウ
イルス）、ガンマヘルペスウイルス亜科（例えば、リン
パ球関連ウイルス）およびリンホクリプトウイルス属
（例えば、EB様ウイルス）といった亜科または属のウイ
ルスである。
別の好適なエンベロープ型ウイルスは、レトロウイル
ス科のRNAウイルス（すなわち、好ましくはレトロウイ
ルス）、特に、オンコウイルス亜科、スプーマウイルス
亜科、スプーマウイルス属、レンチウイルス亜科および
レンチウイルス属といった属または亜科のウイルスであ
る。オンコウイルス亜科のRNAウイルスは、望ましくは
ヒトＴ−リンパ球指向性ウイルス１または２型（すなわ
ち、HTLV−１またはTHLV−２）またはウシ白血病ウイル
ス（BLV）、トリ白血病−肉腫ウイルス（例えば、ラウ
ス肉腫ウイルス（RSV）、トリ骨髄芽球症ウイルス（AM
V）、トリ赤芽球症ウイルス（AEV）、ラウス関連ウイル
ス（RAV）−１〜50、RAV−０）、哺乳動物のＣ−タイプ
ウイルス（例えば、Moloneyネズミ白血病ウイルス（MuL
V）、Harveyネズミ肉腫ウイルス（HaMSV）、Abelsonネ
ズミ白血病ウイルス（Ａ−MuLV）、AKR−MuLV、ネコ白
血病ウイルス（FeLV）、サル肉腫ウイルス、細網内皮症
ウイルス（REV）、脾壊死ウイルス（SNV））、Ｂ−タイ
プウイルス（例えば、マウス乳癌ウイルス（MMTV））、
またはＤ−タイプウイルス（Mason−Pfizerモンキーウ
イルス（MPMV）、「SAIDS」ウイルス）である。レンチ
ウイルス亜科のRNAウイルスは、望ましくはヒト免疫不
全ウイルス１または２型（すなわち、HIV−１またはHIV
−２、HIV−１は以前リンパ節症関連ウイルス３（HTLV
−III）および後天性免疫不全症候群（AIDS）関連ウイ
ルス（ARV）と呼ばれていた）、あるいは同定され、AID
SまたはAIDS様疾患に付随する、HIV−１またはHIV−２
に関連した別のウイルスである。「HIV」という頭字語
または「AIDSウイルス」もしくは「ヒト免疫不全ウイル
ス」という用語は、ここではこれらのHIVウイルス並び
にHIV関連およびHIV随伴ウイルスを一般的に指すのに用
いる。さらに、レンチウイルス亜科のRNAウイルスは、
好ましくはヴィスナ／マエディ（Visna/maedi）ウイル
ス（例えば、ヒツジに感染するような）、ネコ免疫不全
ウイルス（FIV）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全
ウイルス（SIV）、ウマ伝染性貧血ウイルス（EIAV）ま
たはヤギ関節炎−脳炎ウイルス（CAEV）である。
特に好ましい本発明のベクターは、アデノウイルスベ
クター（すなわち、アデノウイルス科、最適にはマスト
アデノウイルス属のウイルスベクター）である。他の血
清型のアデノウイルスベクターを使用することもできる
が、望ましくは、このようなベクターはAd2またはAd5ベ
クターである。遺伝子導入に使用されるアデノウイルス
ベクターは野生型（すなわち、複製能力のある）であっ
てもよい。あるいは、アデノウイルスベクターは、ウイ
ルスを複製欠損にすることができる少なくとも１つの修
飾をその中に有する遺伝的材料を含んでもよい。アデノ
ウイルスゲノムに対する修飾としては、DNAセグメント
の付加、DNAセグメントのリアレンジメント、DNAセグメ
ントの欠失、DNAセグメントの置換またはDNA損傷の導入
が挙げられるが、それらに限定されない。DNAセグメン
トは、小さいもので１ヌクレオチド、大きいもので36キ
ロ塩基対（すなわち、おおよそアデノウイルスゲノムの
サイズ）、あるいはまた、アデノウイルスビリオン中に
パッケージングできる最大量（すなわち、約38kb）と同
等であればよい。アデノウイルスゲノムに対する好まし
い修飾としては、E1,E2,E3またはE4領域における修飾が
挙げられる。同様に、アデノウイルスベクターは、共イ
ンテグレーション体（cointegrate）、すなわち、アデ
ノウイルス配列と、他のウイルスもしくはプラスミド配
列のような他の配列との連結物であってもよい。
ウイルスベクター（例えば、特に複製欠損アデノウイ
ルスベクター）に関して、そのようなベクターは完全な
キャプシド（すなわち、アデノウイルスゲノムのような
ウイルスゲノムを含む）か空のキャプシド（すなわち、
ウイルスゲノムが欠失しているかあるいは、例えば物理
的もしくは化学的手段により分解されている）のいずれ
かを含むことができる。同じ考え方に沿えば、方法はウ
イルス、プラスミドおよびファージをそれらの核酸（す
なわち、RNAまたはDNA）の形態で導入するのに利用でき
るから、ベクター（すなわち、導入ベクター）も同様
に、キャプシド蛋白質のようないかなる付随蛋白質もな
しに、また、いかなるエンベロープ脂質もなしに、RNA
またはDNAより構成され得る。同様に、リポソームは細
胞膜と融合することにより細胞への進入をもたらすの
で、導入ベクターはコート蛋白質をコードする構成的核
酸とともにリポソーム（例えば、市販のもの、例えばLi
fe Technologies,Bethesda,MDから市販されているもの
のような）を含むことができる。したがって、本発明に
よれば、ベクターはキメラアデノウイルスコート蛋白質
を「含む」のに対し、導入ベクターはキメラアデノウイ
ルスコート蛋白質を「コードしている」；リポソーム導
入ベクターは、実際に、蛋白質をコードする核酸を含ん
でいるという意味で、特に「コードしている」。
本発明のベクターは、付加的な配列および変異、例え
ば、コート蛋白質自身の内部のあるものを含んでもよ
い。例えば、本発明のベクターは、好ましくはさらにパ
ッセンジャー遺伝子を含む核酸を含んでもよい。
「核酸」とは、ポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）で
ある。「遺伝子」とは、蛋白質または初期RNA分子をコ
ードするあらゆる核酸配列である。「パッセンジャー遺
伝子」とは、通常はベクター中に存在せず、本発明によ
りベクター（例えば、導入ベクター）中にサブクローニ
ングされ、且つ宿主細胞に導入すると細胞内環境の識別
できる変化（例えば、デオキシリボ核酸（DNA）、リボ
核酸（RNA）、ペプチドまたは蛋白質のレベルの増加、
あるいはそれらの生産または分解速度の変化）を伴うあ
らゆる遺伝子である。「遺伝子産物」とは、所定の遺伝
子またはコード配列から転写された、未だ翻訳されてい
ないRNA分子（例えば、mRNAまたはアンチセンスRNA）、
あるいは所定の遺伝子またはコード配列から転写された
mRNA分子から翻訳されたポリペプチド鎖（すなわち、蛋
白質またはペプチド）のいずれかである。遺伝子はコー
ド配列に加えていずれかの非コード配列を含むが、「コ
ード配列」はいかなる非コード（例えば、調節）DNAも
含まない。遺伝子またはコード配列は、もし該分子に沿
う塩基配列が、天然に通常見出される遺伝子またはコー
ド配列を有する配列から変化していれば、あるいは該塩
基配列が天然に通常見出されないものであれば、「組換
え体」である。本発明によれば、遺伝子またはコード配
列は全体または部分的に合成で作ることができ、ゲノミ
ックまたは相補DNA（cDNA）配列を含むことができ、DNA
またはRNAの形態で提供され得る。
非コード配列または調節配列にはプロモーター配列が
包含される。「プロモーター」は、RNAポリメラーゼの
結合を指示し、それによってRNA合成を促進するDNA配列
である。「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を
刺激または阻害するDNAのシス活性化因子である。転写
を阻害するエンハンサーはまた、「サイレンサー」とも
呼ばれる。エンハンサーは、それがいずれの配向におい
ても、数キロ塩基対までならその距離を越えて、転写さ
れる領域の下流の位置からでさえ機能し得るという点
で、プロモーター中にのみ見出される配列特異的DNA結
合蛋白質のためのDNA結合部位（それは「プロモーター
因子」とも云われる）とは異なる。本発明によれば、プ
ロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合（例え
ば、コード配列とプロモーターの両方が１つのパッセン
ジャー遺伝子を構成する場合）、該コード配列は該プロ
モーターに「機能的に連結している」。
したがって、「パッセンジャー遺伝子」はいかなる遺
伝子であってもよいが、望ましくは治療遺伝子もしくは
リポーター遺伝子のいずれかである。好ましくは、パッ
センジャー遺伝子はベクターが内部に取り込まれた細胞
内で発現し得るものである。例えば、パッセンジャー遺
伝子はリポーター遺伝子、すなわち何らかのやり方で細
胞内で検出することができる蛋白質をコードする核酸配
列を包含し得る。パッセンジャー遺伝子はまた、例え
ば、RNAもしくは蛋白質のレベルでその効果を発揮する
治療遺伝子を包含し得る。例えば、嚢胞性線維症の治療
のための嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子cD
NAのように、導入された治療遺伝子にコードされる蛋白
質を遺伝病の治療に使用することができる。治療遺伝子
にコードされる蛋白質は、結果的に細胞を殺すこと（細
胞胞）によってその治療効果を発揮するかもしれない。
例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、遺伝
子発現そのものが殺細胞を導くか、あるいは遺伝子発現
により、細胞をある特定の薬剤の殺作用に選択的に感受
性となるようにすることができる（例えば、HSVチミジ
ンキナーゼ遺伝子の発現により、細胞はアシクロビル、
ガンシクロビル、およびFIAU（１−（２−デオキシ−２
−フロオロ−β−Ｄ−アラビノフラシル）−５−ヨード
ウラシル）を含めた抗ウイルス性化合物に感受性とな
る）。
さらに、治療遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセ
ージもしくはリボザイム、スプライシングや3'プロセッ
シング（例えば、ポリアデニル化）に影響する蛋白質を
コードすることによってRNAレベルでその効果を発揮す
ることができ、あるいは、おそらくはとりわけmRNA蓄積
速度の変化、mRNA輸送の変化、および／または転写後調
節の変化を仲介することによって、細胞内で別の遺伝子
の発現レベルに影響することで作用する蛋白質をコード
することができる（すなわち、ここでは遺伝子発現は、
転写開始からプロセスされた蛋白質の生産までのすべて
の工程を含めるものと広く解釈されている）。したがっ
て、「治療遺伝子」という用語の使用は、これらの、お
よびより一般的に遺伝子治療と称され、当業者に知られ
ている他のいかなる態様をも包含することを意図するも
のである。同様に、遺伝子治療のために、あるいはイン
ビトロまたはインビボでの所定の細胞または組織におけ
る遺伝子発現の効果を研究するために、組換えアデノウ
イルスを用いることができる。
ファイバー蛋白質のようなキメラコート蛋白質を含む
組換えアデノウイルス、およびパッセンジャー遺伝子ま
たは特定の細胞で発現し得る遺伝子をさらに含む組換え
アデノウイルスは、本発明にしたがって、導入ベクタ
ー、好ましくはウイルスもしくはプラスミド導入ベクタ
ーを使用することにより作ることができる。このような
導入ベクターは、先に記載したようなキメラアデノウイ
ルスコート蛋白質遺伝子配列を含んでいることが好まし
い。該キメラコート蛋白質遺伝子配列は、欠失した天然
の配列の代わりに、あるいは天然の配列に加えて非天然
の配列を含む。
組換えキメラコート蛋白質遺伝子配列（例えば、ファ
イバー遺伝子配列）は、その発現および受容体または蛋
白質特異性および機能的親和性、三量体化能、ペントン
ベース結合および他の生化学的特徴の評価のために、ア
デノウイルス導入ベクターからバキュロウイルスまたは
適当な原核もしくは真核の発現ベクターに移すことがで
きる。
したがって、本発明はまた、キメラアデノウイルスコ
ート蛋白質遺伝子配列（好ましくはファイバー遺伝子配
列）を含む組換えバキュロウイルス発現ベクター並びに
原核および真核の発現ベクターを提供するが、それもま
た、ここで定義されるように「導入ベクター」である。
該キメラコート蛋白質遺伝子配列（例えば、ファイバー
遺伝子配列）は、天然のアミノ酸配列に加えて、あるい
はそれに代えて非天然の配列を含み、それによって得ら
れるキメラコート蛋白質（例えば、ファイバー蛋白質）
が、該天然配列が結合する結合部位以外の結合部位に結
合することを可能にする。キメラ遺伝子をアデノウイル
スベクターからバキュロウイルスまたは原核もしくは真
核の発現ベクターに移すことによって、高い蛋白質発現
が達成できる（総蛋白質のおよそ５〜50％がキメラファ
イバーである）。
本発明のベクターは、コート蛋白質のコード配列の内
側、それに代えて、またはその外側に、ファイバー蛋白
質のようなコート蛋白質が三量体化する能力に影響を与
えるか、あるいはプロテアーゼ認識配列を含む付加的な
配列をさらに含むことができる。三量体化する能力に影
響を与える配列とは、ファイバー蛋白質であるキメラコ
ート蛋白質の三量体化を可能にする１つまたはそれ以上
の配列である。プロテアーゼ認識配列を含む配列とはプ
ロテアーゼによって切断され、それによってキメラコー
ト蛋白質（またはその一部）の除去および別のコート蛋
白質による細胞への該組換えアデノウイルスの接着をも
たらす配列である。ファイバー蛋白質であるコート蛋白
質とともに使用する場合、該プロテアーゼ認識部位はフ
ァイバーの三量体化およびファイバー蛋白質の受容体特
異性に影響しないことが好ましい。例えば、本発明の一
態様において、好ましくはファイバー蛋白質またはその
一部がプロテアーゼ認識配列によって欠失し、次いで、
好ましくは先に記載したようにスペーサー配列を使用し
て、新規な細胞表面結合部位がペントンベースまたはヘ
キソンコート蛋白質のいずれかに組み込まれる。
本発明のベクターおよび導入ベクターの製造におい
て、導入ベクターは当業者に知られた標準的な分子遺伝
学的技術を用いて構築される。ベクター（例えば、ビリ
オンまたはウイルス粒子）はウイルスベクターを用いて
製造される。例えば、 本発明のベクターおよび導入ベクターの製造におい
て、導入ベクターは当業者に知られた標準的な分子遺伝
学的技術を用いて構築される。ベクター（例えば、ビリ
オンまたはウイルス粒子）はウイルスベクターを用いて
製造される。例えば、本発明のキメラコート蛋白質を含
むウイルスベクターは、図３に示されるように、いかな
るE4相補配列も含まない細胞に、（１）キメラファイバ
ーおよび野生型E4遺伝子を含む直鎖状ベクター、および
（２）E4-の直鎖状ベクターを与えることによって構築
することができる。下記実施例に記載されるように、こ
の方法論によれば、結果として該配列間で組換えが起こ
り、最初のE4-ベクターの一部とE4+ベクターの一部、特
にキメラファイバー配列を含む領域を含むベクターが生
成する。
同様に、ファイバーキメラ含有粒子は、標準的な細胞
株、例えば、現在アデノウイルスベクター用に使用され
ているものの中で製造することができる。製造および精
製の後、ファイバーを欠失させるべき粒子は、ファイバ
ー蛋白質を切断してウイルス粒子から遊離させ、ファイ
バーの無い粒子を生じさせる配列特異的プロテアーゼで
該粒子を消化することによりファイバーを無くさせる。
例えば、トロンビンはベクター中に組み込まれ得る既知
のアミノ酸配列を認識してそこで切断する（Stenfloら,
J.Biol.Chem.,257,12280−12290（1982））。同様に、
ファイバー遺伝子を欠く欠失変異体、例えば、H2dl80
2、H2dl807およびH2dl1021（Falgoutら,J.Virol.,62,62
2−625（1988））を、ベクターの構築に使用することが
できる。これらのファイバーを有しない粒子は安定で、
且つ細胞に結合し感染し得ることが分かっている（Falg
ouら，上述）。このようにして得られた粒子は、次いで
ペントンベースまたは他のコート蛋白質を介して特定の
組織にターゲッティングすることができる（好ましくは
このような他のコート蛋白質は１つまたはそれ以上の本
発明の非天然アミノ酸配列を含む）。
あるいは、さらなる改変を有するキメラファイバー蛋
白質を含む組換えアデノウイルスは、受容体結合および
三量体化ドメインを含む、ファイバー蛋白質の天然のノ
ブ領域を除去し、非天然の三量体化ドメイン（Peterand
erlら,Biochemistry,31,12272−12276（1992））および
本発明の非天然アミノ酸配列で置換することによって製
造することができる。キメラファイバー蛋白質を含む組
換えアデノウイルスはまた、ノブ領域において点突然変
異を誘発し、三量体化し得るクローンを単離することに
よっても製造することができる。いずれかの場合で、し
かも上記したような天然の受容体特異的結合配列の除去
および置換に関しては、非天然アミノ酸配列をコードす
る１またはそれ以上の核酸配列のコピーを適切な位置に
挿入することにより、新しい蛋白質結合ドメインを、フ
ァイバー蛋白質のＣ末端上もしくはファイバー蛋白質の
露出したループ中に付加することができる。このような
ファイバー蛋白質は、ペントンベース蛋白質に結合し得
るように三量体化できることが好ましい。
キメラファイバー蛋白質を生成するための上記方法は
また、他のキメラコート蛋白質、例えば、キメラヘキソ
ンまたはペントン蛋白質を作るのにも用いることができ
る。
実例となる使用 本発明は、細胞に結合することができ、高い効率で細
胞内に入るのを仲介することができるキメラ蛋白質、並
びにそれを含むベクターおよび導入ベクターを提供す
る。キメラコート蛋白質自身は多数の用途、例えば、イ
ンビトロでのアデノウイルスの細胞への結合を研究する
道具としての用途（例えば、Wickhamら（1993），上述
により、先に示されたようなスキャッチャード解析によ
って）、インビトロでのアデノウイルスの受容体への結
合をブロックするための用途（例えば、実施例に記載さ
れるように、抗体、ペプチドおよび酵素を用いて）、お
よびアデノウイルスが細胞への進入を果たす結合部位へ
の結合を競合させることによってインビボでのアデノウ
イルス感染を防御するための用途を有する。
キメラコート蛋白質を含むベクターはまた、系統の作
出にも、また新しいベクターを作る手段としても使用す
ることができる。例えば、非天然アミノ酸配列は核酸に
結合することができ、組換えによって新しいベクターを
生み出す手段として細胞内に導入することができる。同
様に、ベクターを遺伝子治療に使用することができる。
例えば、本発明のベクターは、矯正DNA、すなわち、欠
損するか損なわれた機能をコードするDNA、または、例
えば細胞内でのみ活性のある細胞毒素をコードするDNA
のような慎重な殺傷剤を標的細胞に送達することにより
数多くの疾患のいずれかを治療するのに用いることがで
きる。このような治療の対象となり得る疾患としては、
例えば、癌（例えば黒色腫、膠腫または肺癌）、遺伝病
（例えば嚢胞性線維症、血友病または筋ジストロフィ
ー）、病原性の感染（例えばヒト免疫不全ウイルス、結
核または肝炎）、心臓病（例えば壊死組織に再灌流させ
るための血管形成術または血管新生促進の後の妨害的再
狭窄）および自己免疫障害（例えばクローン病、大腸炎
または関節リウマチ）が挙げられる。
特に、遺伝子治療は、野生型アデノウイルスファイバ
ー蛋白質が結合する高レベルの受容体を表面上欠いてお
り、そのため現在のアデノウイルスを介した遺伝子治療
へのアプローチが最適ではない様々な組織（例えば、単
球／マクロファージ、線維芽細胞、ニューロン、平滑筋
および上皮細胞への送達）に付随する疾患、障害もしく
は状態を処置するのに行うことができる。これらの細胞
より構成される組織（およびそれらに付随する疾患、障
害もしくは状態）としては、それらに限定されないが、
内皮（例えば血管新生、再狭窄、炎症および腫瘍）、ニ
ューロン組織（例えば腫瘍およびアルツハイマー病）、
上皮（例えば皮膚、角膜、腸および肺の障害）、造血細
胞（例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV−1,HIV−２）、
癌および貧血）、平滑筋（例えば再狭窄）および線維芽
細胞（例えば炎症）が挙げられる。
さらに、治療遺伝子を導入する代わりに、リポーター
遺伝子、またはある種のマーカー遺伝子を、本発明のベ
クター（特にアデノウイルスベクター）を用いて導入す
ることができる。マーカー遺伝子およびリポーター遺伝
子は、例えば、細胞の分化や細胞の運命を研究するのに
有用であり、またあり得ることとして診断目的にも有用
である。さらに、β−ガラクトシダーゼリポーター遺伝
子、緑色蛍光蛋白（GFP）をコードする遺伝子もしくは
β−グルクロニダーゼ遺伝子のような標準的なリポータ
ー遺伝子は、例えば、生きている宿主中でのアッセイの
手段として、あるいは、例えば、標的細胞を除去する手
段としてインビボで使用することができる（例えば、Mi
ndenら,Biotechniques,20,122−129（1996）;Youvan,Sc
ience,268,264（1995）；米国特許第5,432,081号;Deona
rainら,Br.J.Cancer,70,786−794（1994）参照）。
同様に、宿主を、本質的にある特定の蛋白質をインビ
ボで製造する手段として使用するために遺伝子を導入す
ることが望ましいかもしれない。この考え方に沿って、
トランスジェニック動物が、例えば、トランスジェニッ
クのウシ種の乳中に組換えポリペプチドを産生させるた
めに使用されている（例えばPCT国際出願WO 93/2556
7）。遺伝子導入をするための他の「非治療的」理由と
しては、動物モデルを用いたヒト疾患の研究（例えば、
腫瘍発生研究のためのp53腫瘍抑圧遺伝子ノックアウト
を含むトランスジェニックマウスおよび他のトランスジ
ェニック動物の使用、グルコース代謝とアルツハイマー
病の病原の研究のための損なわれたグルコーストレラン
スとヒトアルツハイマーアミロイド前駆蛋白質モデル用
のトランスジェニックモデルの使用、他）が挙げられ
る。
これら前記の実例となる使用は決して包括的なもので
はなく、本発明は、ここでの開示において、明記されて
はいないがそこから導かれるようなさらなる使用を包含
することが意図される。同様に、本発明のさまざまな側
面を用いて得られる数多くの利点がある。
例えば、本発明のユニバーサルターゲッティングベク
ターの使用は、（１）該ベクターはすべての細胞および
組織に使用できる可能性がある、（２）すべての細胞株
での使用に１つのベクターしか必要とせず、独立のベク
ターを共トランスフェクションする必要がない、（３）
該ベクターは野生型ファイバー蛋白質を含むベクターに
ついて観察されるよりも増大した効率で遺伝子を送達し
得る、（４）従来のベクターと異なり、該ベクターは特
定の細胞をターゲッティングせず、その代わりに全体的
と思われるやり方で形質導入効率を増加させる、（５）
該ベクターは、野生型ファイバー蛋白質を含むベクター
と比較すると、少ない用量（すなわち、感染多重度（MO
I））で使用しても遺伝子導入を仲介することができ、
したがって、おそらく現在利用可能なアデノウイルスベ
クターに伴う投与量に関連する欠点を減じる、および
（６）該ベクターは、現在利用できる細胞株を用いて増
殖および維持することができるので、有利である。
ユニバーサルターゲッティングアデノウイルスベクタ
ーのような、ユニバーサルターゲティングベクターが潜
在的に持つ、すべての、もしくはほとんどの組織に結合
しその中に入る能力は幾つかの利点を有する。これらの
利点としては、多くの組織への遺伝子送達効率が増大す
ること、すべての組織に遺伝子を送達し得る単一のベク
ターを入手できること、および遺伝子送達に必要な成分
を簡単に製造できることが挙げられる。さらに、このよ
うなユニバーサルターゲッティングベクターは、蛋白質
/DNA相互作用によりベクター上のDNAを「ピギーバック
方式で輸送すること」によって、外因性DNAを細胞内に
送達する能力を含む。
このようなユニバーサルターゲッティングベクターの
可能性のあるさらなる利点としては、野生型ファイバー
蛋白質が結合するファイバー受容体を低レベルで発現す
る細胞への送達効率が実質的に増加すること（例えば10
ないし100倍に増加する）、並びに野生型ファイバーが
結合するファイバー受容体を発現する細胞または組織へ
の効率も増加することが挙げられる。さらに、投与量を
減らしてベクターを使用する結果、アデノウイルス付随
性の炎症、アデノウイルスに対する体液性（免疫）応答
およびアデノウイルスに対する細胞傷害性Ｔリンパ球の
応答が減少するはずである。
さらに、該ベクターは慣用の手段により単離精製され
得る点で有利である。ベクター中の変化はゲノムレベル
でなされるので、他のベクター（例えば、Cottenら，上
述;Wagnerら，上述を参照）に付随するような、面倒で
コストのかかる産生後の修飾を必要としない。同様に、
特殊な受容体を発現する細胞株も必要ではない。UTVベ
クターは、ファイバーを改変していない野生型ベクター
と同様の力価まで増殖され得る。
投与手段 本発明のベクターおよび導入ベクターは、インビトロ
またはインビボのいずれかで細胞に接触させて使用する
ことができる。本発明によれば、「接触させること」
は、ベクターを細胞内に導入するいかなる手段も包含
し、その方法はいかなる特定の導入手段にも依拠しない
し、また、そのように解されるべきではない。導入手段
は当業者によく知られ、また、以下に例示される。
すなわち、導入は、例えば、インビトロ（例えば、遺
伝子治療の生体外（ex vivo）タイプの方法または組織
培養研究で）またはインビボのいずれかで、エレクトロ
ポーレーション、形質転換、形質導入、接合もしくはト
リペアレンタルメイティング、（共）トランスフェクシ
ョン、（共）感染、カチオン性脂質との膜融合、DNAで
コーティングされたマイクロプロジェクタイルによる高
速発砲、リン酸カルシウム−DNA沈殿とのインキュベー
ション、単一細胞への直接マイクロインジェクション等
によって達成され得る。同様に、ベクターはカチオン性
脂質、例えば、リポソームによって導入することができ
る。このようなリポソームは市販されている（例えば、
Life Technologies,Gibco BRL,Gaithersburg,MDより供
給されるLipofectin 、LipofectamineTM等）。さら
に、導入できる容量を増し、および／またはインビボで
の毒性を低減したリポソーム（例えば、PCT特許出願WO
95/21259）を本発明において使用することができる。他
の方法もまた利用でき、当業者に知られている。
本発明によれば、「宿主」（および、したがって宿主
由来の「細胞」）は、本発明のベクターを導入すること
ができるいかなる宿主をも包含し、したがって、それら
に限定されないが、両生類、鳥類、魚類、昆虫、爬虫類
もしくは哺乳類を含む動物を包含する。最も好ましく
は、宿主は哺乳動物、例えば、齧歯類、霊長類（例えば
チンパンジー、サル、尾ナシザル、ゴリラ、オランウー
タン、または手長ザル）、ネコ、イヌ、有蹄類（例えば
反芻動物またはブタ）、並びに、特にヒトである。
ユニバーサルターゲッティングベクターは表向きには
すべての細胞に進入するので、細胞はこのようなベクタ
ーが入ることができるいかなる細胞であってもよい。特
に、ユニバーサルターゲッティングベクターは低レベル
もしくは検出できないレベルのファイバー受容体を表現
する細胞（それに限定されないが、内皮、平滑筋、ニュ
ーロン、造血または線維芽細胞を含む）への遺伝子導入
のために使用することができる。
当業者には、本発明のベクター（特にアデノウイルス
ベクター）を遺伝子治療（例えば、Rosenfeldら,Scienc
e,252,431−434（1991）;Jaffeら,Clin.Res.,39（２）,
302A（1991）;Rosenfeldら,Clin.Res.,39（２）,311A
（1991）;Berkner,Bio Techniques,６,616−629（198
8）を参照）、化学療法およびワクチン接種の目的で動
物に投与するのに適当な方法を利用することができ、ま
た、１つ以上の経路が投与に使用できるが、ある特定の
経路が他の経路よりもより迅速でより効果的な反応を提
供し得ることがわかるであろう。医薬上許容され得る賦
形剤もまた当業者によく知られており、容易に入手可能
である。賦形剤の選択は組換えベクターの投与に使用さ
れる特定の方法によって部分的に決定されるであろう。
したがって、本発明における使用には非常に多様な好適
な製剤がある。以下の方法および賦形剤は単なる例示で
あって何ら限定するものではない。
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液剤、例えば水、生
理食塩水、オレンジジュースのような希釈剤に溶解され
た有効量の化合物、（ｂ）それぞれ予め決められた量の
有効成分を固形剤または顆粒剤として含むカプセル剤、
サッシェ剤または錠剤、（ｃ）適当な液体中の懸濁液
剤、および（ｄ）適当な乳液剤からなり得る。錠剤型
は、ラクトース、マンニトール、コーンスターチ、馬鈴
薯デンプン、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、
コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウ
ム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸
および他の賦形剤、着色剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、
保存剤、着香剤、並びに薬理学的に適合する賦形剤のう
ちの１つまたはそれ以上を含み得る。トローチ型は、有
効成分を香味成分、通常はシュクロースおよびアカシア
またはトラガカントゴム中に含み得るし、また、香錠剤
は有効成分をゼラチンおよびグリセリン、またはシュク
ロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に含み、
乳化剤、ゲル剤などは有効成分に加えて、当技術分野に
おいて知られているような賦形剤を含有する。
本発明のベクターまたは導入ベクターは単独で、ある
いは他の適当な成分と組み合わせて、吸入によって投与
されるエアロゾル製剤にすることができる。このような
エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパ
ン、窒素等の加圧された許容され得る推進ガス中におく
ことができる。それらはまた、ネブライザー噴霧器やア
トマイザー噴霧器のような非加圧製剤用の医薬として製
剤化され得る。
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝
剤、静菌剤、および意図する受容者の血液と製剤とを等
張にする溶質を含み得る水性および非水性の等張滅菌注
射溶液剤、並びに懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定
化剤および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸
濁化剤が挙げられる。当該製剤はアンプルやバイアルの
ような単位用量または複数回用量を封入した容器で提供
され、注射用に、使用直前に滅菌した液状賦形剤、例え
ば水を添加すればよいだけのフリーズドライ（凍結乾
燥）された状態で保存することができる。即席の注射溶
液剤および懸濁液剤は、以前に記載された種類の滅菌し
た散剤、顆粒剤および錠剤から調製することができる。
さらに、本発明のベクターまたは導入ベクターは、乳
化用基剤や水溶性基剤のような種々の基剤と混合するこ
とにより坐薬としてもよい。
膣投与に適した製剤は、有効成分に加えて当技術分野
において適当であると知られているような担体を含むペ
ッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡ま
たはスプレー剤として提供され得る。
本発明によれば、動物、特にヒトに投与される用量は
目的の遺伝子、使用される組成物、投与方法および治療
される特定部位および生物によって変化する。しかしな
がら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分である
べきである。
先に示したように、本発明のベクターまたは導入ベク
ターはまた、インビトロでの有用性を有する。そのよう
なベクターは、アデノウイルスの細胞接着および細胞感
染の研究における研究用の道具として、また、結合部位
−リガンド相互作用の測定方法に使用することができ
る。同様に、天然の受容体結合配列に加えて、あるいは
それの代わりに非天然のアミノ酸配列を含む組換えコー
ト蛋白質は、例えば、受容体−リガンドアッセイに、ま
た、インビトロまたはインビボでの接着蛋白質として使
用することができる。
以下の実施例に本発明をさらに説明するが、勿論これ
らはその範囲を何ら限定されるように解釈されるべきで
はない。
実施例１ この実施例において野生型アデノウイルスの細胞に対
する結合能によって決定される、異なる細胞におけるア
デノウイルス受容体のレベルの研究について述べる。
これらの実験では、野生型ファイバーを含むアデノウ
イルスの、種々の組織由来の細胞に対する結合能を評価
した。以前に記載されているように（Wickhamら,Cell,7
3,309−319（1993）参照）、Ad5株のアデノウイルス粒
子を［Ｈ］−チミジンで標識した。亜飽和レベル（su
bsaturating level）のチミジン標識されたアデノウイ
ルスを、20μg/mlの可溶性ファイバー蛋白質の存在下ま
たは非存在下で約30〜60分間プレインキュベートした10
6個の細胞200μｌに加え、該細胞を４℃で１時間、該ウ
イルスと共にインキュベートし、冷リン酸緩衝生理食塩
水（PBS）で３回洗浄した。残っている細胞結合カウン
トはシンチレーションカウンターで測定された。特異的
な結合は、ファイバー存在下での細胞結合カウント（す
なわち、counts per minute（cpm））を、ファイバー非
存在下での細胞結合カウントから引くことによって測定
した。ファイバーの存在下での結合は、放射活性のある
ウイルス粒子の全投入量（input）の２％を決して超え
なかった。結果は３回の測定を平均して得られた。
図１に示されるように、かなりの数の異なる組織由来
の細胞は、野生型アデノウイルスのこれらの細胞に対す
る相対的非結合性で示されるように、ファイバー受容体
をほとんど、または全く発現しなかった。上皮起源の細
胞（すなわち、Chang細胞、HeLa細胞およびA549細胞を
含む「受容体（＋）」細胞）は高レベルのアデノウイル
スに結合した。それに比べて、非上皮細胞（すなわち単
球／マクロファージ、繊維芽細胞、ニューロン、平滑筋
細胞および上皮細胞のような「受容体（−）」細胞）
は、上皮様細胞に比べ10倍またはそれ以上のウイルス結
合の減少を示した。
これらの結果は、「受容体（＋）」の上皮細胞と比較
して、アデノウイルスは「受容体（−）」の非上皮細胞
に相対的に結合しにくく、したがってその中に進入する
能力も相対的に低いという従来認識されていなかったこ
とを確認するものである。おそらく、この能力のなさ
は、これらの細胞上では、野生型アデノウイルスファイ
バー蛋白質に対する受容体の提示が低いことによると考
えられる。
実施例２ この実施例においては、キメラコート蛋白質、特にキ
メラアデノウイルスファイバー蛋白質を含むアデノウイ
ルスベクターの構築について述べる。
非上皮組織のような臨床的に意味のある組織上に、限
られた数だけしかファイバー受容体が存在しないことに
よって課された形質導入の制限を克服するために、修飾
アデノウイルスベクターを、図2Aおよび2Bに描写される
ように構築し、ここで「ユニバーサルトランスファーベ
クター」あるいはUTVと呼ばれるベクターを誘導した。
特に、フレームシフト変異がアデノウイルスコート蛋白
質をコードする遺伝子、この場合にはファイバー遺伝子
内で引き起こされた。野生型アデノウイルスでは、非修
飾のファイバー遺伝子は一揃えの翻訳終止シグナル（TA
A）と転写ポリアデニル化シグナル（AATAAA）を含んで
いる。ポリアデニル化シグナルは転写物の3'末端へのポ
リＡテールの付加を指示する。ポリＡテールは通常、ざ
っと約20から約200ヌクレオチドぐらいを含んでいる。
転写後、核から出てきて、TAAの終止シグナルがリボゾ
ームによる翻訳の停止を命令する。
それに比べて、UTVベクターの修飾ファイバー遺伝子
はフレームの合った翻訳「終止」シグナルを欠いてい
る。正常な転写およびmRNAへのポリＡ伸長の付加の後、
終止コドンがないので、リポゾームはポリＡ領域まで転
写産物の翻訳を続ける。コドンAAAはアミノ酸リジンを
コードするので、結果として得られる、UTVによって作
られたキメラファイバー遺伝子翻訳産物は、Ｃ末端に一
続きのポリリジン残基、すなわち、Lys Lys Lys Lys Ly
s Lys Lys Lys［配列番号:1］の付加を含んでいる。キ
メラファイバー蛋白質では、ポリリジン残基は一般的に
約３から30残基から成っているので、ポリリジン列の長
さを制限すべく細胞プロセスが働くこともありうる。し
かしながら、どのような場合であれ、蛋白質のポリリジ
ン修飾ならびにここに記載される更なる修飾は、高レベ
ルの野生型アデノウイルスファイバー蛋白質受容体を欠
く細胞（すなわち、「受容体（−）細胞」）にUTVを効
率よく結合させる。
ベクターの構築と同定に関しては、株、プラスミドお
よびウイルスの作成、ゲル電気泳動、プラスミド単離を
含むDNA操作、DNAクローニングおよびシークエンシン
グ、ウエスタンブロット解析等のような標準的な分子お
よび遺伝子技術は当業者に知られているように、および
標準的な実験室マニュアル（例えば、Maniatisら,Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,第２版（Cold spri
ng Harbor,NY,1992）;Ausubelら,Current Protocols in
Molecular Biology,（1987））に詳しく記述されてい
るようにして行った。分子的操作に用いられた制限酵素
およびその他の酵素は、商業的供給元から購入され、
（例えば、Boehringer Mannheim,Inc.,Indianapolis,In
diana;New England Biolabs,Beverly,Massachusetts;Be
thesda Research Laboratories,Bethesda,Maryland）、
製造元の推奨に従って使用した。実験に使用した細胞
（例えば形質転換されたヒト胎児性腎細胞株293細胞
（すなわち、CRL 1573細胞）やアメリカン タイプ
カルチャー コレクションによって供給されるその他の
細胞）は、以前に記述されているように（Erzerumら,Nu
cleic Acids Research,21,1607−1612（1993））標準的
な無菌培養用試薬、培地および技術を用いて培養し維持
された。
結果的に、ファイバーの終止コドンのフレームシフト
変異は、修飾BamH I部位（すなわち、GGATCCAA［配列番
号:6］）をアデノウイルス導入ベクターに導入すること
によって引き起こされた。これは図３に示されているよ
うに、導入プラスミドpAd NS 83−100（これはp193NS 8
3−100またはpNS 83−100としても知られている）から
始めることで行われた。pAd NS 83−100は、Ad5ゲノム
の83−100地図単位領域におよぶ、ファイバー遺伝子を
含むAd5のNde IからSal Iまでのフラグメントをプラス
ミドpNEB193（New England Biolabs,Beverly,MA）にク
ローニングすることにより構築した。
pAd NS 83−100のNde I−Mun Iフラグメントを、クロ
ーニングを容易にするために5'Nde I部位と3'MuN I部位
にフランキングしているBamH I部位を含む合成オリゴヌ
クレオチドで置換した。２本鎖合成オリゴヌクレオチド
フラグメントはオーバーラップ合成１本鎖センスおよび
アンチセンスオリゴヌクレオチド、すなわち、それぞ
れ、センスプライマーTAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TC
G TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C［配列
番号:9］、アンチセンスプライマーAAT TGA AAA ATA AA
C ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT
CCT CCA［配列番号:10］（それぞれ図4Aおよび4Bに示さ
れている）から創製された。オーバーラップオリゴマー
の末端はNde IおよびMun I部位へ、直接クローニングで
きるように突出部を持つように作成された。
得られた導入プラスミドである、pAd NS 83−100
（F-）（これはp193NS（ΔＦ）またはpNS（ΔＦ）とし
ても知られている）は、ファイバー遺伝子のコード配列
の最初の50塩基対以外は全て欠いている（すなわち、
「ファイバー（−）」である）。ベクターはさらに、ア
デノウイルスE4コード配列全体を含んでいる。プラスミ
ドは合成Nde I/Mun Iオリゴヌクレオチド内に含めたAAT
AAAポリアデニル化シグナルを保持しており、そして新
しいBamH I制限部位をも組み込んでいる。
ファイバー遺伝子の最後のコドンに続いて修飾BamH I
部位を組み込んで変異ファイバー遺伝子を創製する一
方、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でファイバー遺伝子
を増幅するために、該変異ファイバー遺伝子をファイバ
ー（−）pAd NS 83−100プラスミドに合成センスおよび
アンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーを用いて組
み込んだ。この組み込まれた修飾BamH I部位はアミノ酸
グリシンおよびセリンをコードする役割も果たし、その
結果、GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT［配
列番号:7］のキメラ核酸配列ができる。修飾ファイバー
遺伝子はこのように、Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Va
l Leu Lys Lys Lys［配列番号:4］という配列（ここで
ポリリジン列の長さは変動可能である。）の結果として
得られるキメラファイバー蛋白質を延長してコードす
る。ファイバー増幅のために用いられる合成オリゴヌク
レオチドは、図4Cおよび4Dにそれぞれ示されているよう
に、プライマーTCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC T
TG GGC AAT GTA TGA［配列番号:11］およびプライマーC
GT GTA TCC ATA TGA CAC AGA［配列番号:12］であっ
た。
ついで、増幅された遺伝子産物を制限酵素Nde Iおよ
びBamH Iで切断し、導入ベクターpAd NS 83−100 UTV
（p193NS（F5＊）、p193NS（F5＊）またはpNS（F5＊）
としても知られる）を作成するために、ファイバー
（−）プラスミドのpAd NS 83−100のNde I/BamH I部位
にクローニングした。pAd NS 83−100 UTVのNde IからS
al Iまでの全体のアデノウイルス配列を、pAd BS 59−1
00 UTV（p193NS（F5＊）、p193NS（F5＊）またはpNS（F
5＊）としても知られる）を創製するためにファイバー
（−）プラスミドpAd BS 59−100にクローニングした。
UTVアデノウイルスベクターを293細胞中で、相同組換
えによって創製した。すなわち、E4+ pAd BS 59−100 U
TV導入ベクターをSal Iで線状化し、あらかじめアデノ
ウイルスベクターA2Fで感染させた293細胞にトランスフ
ェクトした。A2FベクターはGV10ベクターから誘導され
た。Ad5をもとにしたベクターであるGV10はRous肉腫ウ
イルスプロモーターの制御下にあるlac Z遺伝子を含ん
でいる（すなわち、RSV lac Zを含んでいる。）GV10で
のリポーター遺伝子の挿入はE1領域内でなされる（すな
わち、ベクターはE1-である。GV10ベクターはE3領域の
欠失を含んでいるが、E4+である。GV10（すなわち、RSV
lac Z E1- E3- E4+）比べると、A2Fは必須のE4アデ
ノウイルス遺伝子の欠失をさらに含んでいるが、E3
+（すなわち、RSV lac Z E1- E3+ E4-）である。
293細胞はE1相補的配列を含んでいるが、E4相補的配
列は含んでいない。E4相補的配列の欠如は、293細胞株
でのE4- A2Fベクターの複製を妨げる。しかしながら、2
93細胞にA2FウイルスとpAd BS 59−100 UTVを共トラン
スフェクションすると、UTV導入ベクターとA2Fアデノウ
イルスゲノムとの間で相同組換えが起こり、293細胞内
で複製可能な、キメラファイバー蛋白質を含むE3+ E4+
アデノウイルスゲノムを産生する。この特定の結果とし
て得られるUTVベクターをGV10 UTVと名付けた。
GV10 UTVベクターを標準的なプラーク単離技術を293
細胞に用いることによって単離した。プラーク精製を連
続３回行うと、GV10 UTVベクターはファイバー変異を含
み、且つE4- A2Fベクターによるいかなる混入もなかっ
た。GV10 UTVベクターでのキメラファイバー配列の存在
は逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT−PCR）を用い
たファイバーmRNAをシークエンシングすることにより確
認された。このことは、キメラファイバーmRNAでのポリ
アデニンテールの存在を証明した。
同様にして、ベクターによるキメラファイバー蛋白質
の産生をウェスタンブロットにより確認した。これを行
うために、野生型アデノウイルスファイバー蛋白質を含
むGV10またはキメラファイバー蛋白質を含むGV10 UTVの
どちらかを、５感染多重度（MOI）で293細胞に感染させ
た。感染２日後に、細胞を洗浄し、ついで３回の凍結融
解サイクルにより、PBS中で溶解した。ライセートを遠
心分離により、澄明にし、10％ドデシル硫酸ナトリウム
／ポリアクリルアミドゲルに付した。電気泳動の後、該
蛋白質をニトロセルロースに移し、ファイバーに対する
ポリクローナル抗体を用いた化学発光によって検出し
た。該ウェスタンブロットを図５に示す。この図から分
かるように、蛋白質の移動は、非修飾の62キロダルトン
のWTファイバー蛋白質よりも、約1.5〜約2.0キロダルト
ンキメラUTVファイバーのほうが大きいことを示してい
る。
これらの結果は、ここで示された方法を、キメラファ
イバー蛋白質を産生すべくファイバー蛋白質に修飾を導
入するために用い得ることを確認している。同様の技術
がヘキソンまたはペントン蛋白質に修飾を導入するため
に、または同様の修飾（例えば、アルギニン、リジンお
よび／またはヒスチジンを含む、またはアスパラギン酸
および／またはグルタミン酸を含むアミノ酸列の付加、
或いは、コート蛋白質のコード領域への任意のこれらの
配列の付加）を導入するために用いることができる。
実施例３ この実施例において、キメラファイバー蛋白質のよう
なキメラコート蛋白質を含むアデノウイルスベクターの
細胞への結合を、可溶性野生型ファイバー蛋白質の存在
下または非存在下で、野生型のアデノウイルスベクター
と比較して述べる。
これらの実験には、アデノウイルスが、高効率で（す
なわち受容体（＋）細胞）または低効率で（すなわち受
容体（−）細胞）結合することが実施例１で確認された
細胞を用いた。上皮細胞株A549を代表的な受容体（＋）
細胞として用い、繊維芽細胞株HS 68を代表的な受容体
（−）細胞として用いた。A549またはHS 68細胞の集密
的な（confluent）単層を、０から約10μg/mlまでの範
囲の可溶性ファイバー蛋白質濃度で、４℃でプレインキ
ュベートした。キメラファイバー蛋白質（UTV）を含むG
V10 UTVベクターまたは野生型ファイバー蛋白質（WT）
を含むGV10ベクターは、実施例１で示されたように、ト
リチル化チミジンで標識した。ついで約20,000cpmの［3
H］−チミジン標識されたGV10 UTVまたはGV10ベクター
を、細胞とともに４℃で約２時間インキュベートした。
該細胞を冷PBSで３回洗浄し、細胞結合cpmをシンチレー
ションカウンティングによって測定した。結果を２回の
測定の平均として得、A549およびHS 68細胞株それぞれ
に対し、図6Aおよび6Bに示す。
図6A−Ｂで分かるように、GV10 UTVベクターのキメラ
ファイバー蛋白質は受容体（＋）細胞（図6A）および受
容体（−）細胞（図6B）の両方に、高効率で結合するこ
とが出来た。それに比べて、野生型ファイバーを含むGV
10ベクターは受容体（＋）細胞に対する結合において効
率的であった。特に、放射標識されたGV10 UTVは、ファ
イバー受容体を検出可能なレベルで発現している細胞
（すなわち、A549肺胞上皮細胞）にGV10よりも約２〜2.
5倍良く結合した。GV10ベクターのすべての結合が競合
する組換えファイバー蛋白質によって阻害されたが、GV
10 UTVベクターは約40％しか競合するファイバーの添加
によって阻害されなかった。ファイバー受容体を欠くHS
68ヒト***繊維芽細胞に対する、野生型アデノウイル
スファイバーを含むGV10ベクターの検出可能な結合は観
察されなかった。それに比べ、GV10 UTVベクターは効率
よくHS 68細胞に結合し、競合するファイバー蛋白質の
添加は結合に何ら影響を及ぼさなかった。
これらの結果はキメラコート蛋白質（すなわち、キメ
ラファイバー蛋白質）を含むGV10 UTVベクターの結合が
野生型アデノウイルスファイバー受容体を介して起こる
のではなく、そのかわりに現在のところ未確認のファイ
バー受容体を介して起こることを確認した。さらに、こ
の結果はキメラファイバー蛋白質のようなキメラコート
蛋白質のアデノウイルスベクターへの組み込みが改良さ
れたアデノウイルスベクターをもたらすことを確認し
た。すなわち、GV10 UTVベクターによって構成される修
飾は上述した野生型アデノウイルスの受容体（−）細
胞、特に非上皮細胞に対する結合に対しての相対的な能
力のなさを克服することを可能にし、また修飾ベクター
を受容体（＋）細胞により高い効率で結合させる。
実施例４ この実施例において、種々の可溶性因子およびこれら
可溶性因子の阻害剤が、キメラファイバー蛋白質を含む
アデノウイルスの受容体（−）のHS 68繊維芽細胞に対
する結合を阻害する能力の研究について述べる。
これらの実験では、サケ***DNA、ムチン、コンドロ
イチン硫酸およびヘパリンを含む種々の負に荷電した分
子によるGV10 UTV結合の阻害を評価した。コンドロイチ
ン硫酸およびヘパリンは硫酸基から電荷を得て負に荷電
した分子である。ムチンはシアル酸部分の存在により負
に荷電し、DNAはリン酸部分が組み込まれているために
負に荷電している。250μｌの結合バッファー（すなわ
ち、Dulbecco's Modified Eagle Media（Ｄ−MEM））中
のUTV約20,000cpmを、約１×10-3から約１×104μg/ml
までの範囲の負に荷電した分子の濃度で、室温で約30分
間インキュベートした。インキュベーション後、該混合
物を氷上で冷却し、ついで24穴プレートで平板培養し
（plated）、あらかじめ冷却しておいたHS 68細胞に添
加した。細胞を約１時間インキュベートした後、該細胞
をPBSで３回洗浄した。細胞結合cpmをシンチレーション
カウンティングで測定し、２回の測定の平均として報告
した。
図７に示すように、競合する野生型ファイバー蛋白質
の存在はGV10 UTVベクター（すなわちキメラファイバー
を含む）のHS 68細胞に対する結合に影響を及ぼさなか
ったのに対し、負に荷電した競合分子はGV10 UTVの結合
を阻害することができた。ヘパリンおよびDNAが最も効
果的であったが、４種の分子は全てHS 68細胞に対する
GV10 UTVの結合を阻害することができた。これらの分子
はGV10ベクター（すなわち野生型ファイバーを含んでい
る）の高レベルでファイバー受容体を発現している細胞
（すなわちA549細胞；データ示さず）に対する結合に対
して顕著な影響を及ぼさない。
これらの結果は、負に荷電した分子が、キメラファイ
バー蛋白質によって仲介されるGV10 UTVベクターの細胞
への結合を阻害することができることを確認した。この
阻害はおそらく、GV10 UTVファイバー上に存在する正に
荷電したポリリジン残基に負に荷電した分子が結合する
ことによるものである。従って、GV10 UTVベクターの細
胞への結合の際にこれらの負に荷電した分子を切断する
酵素の影響を調べた。
HS 68細胞を24穴プレートで平板培養し、ヘパリナー
ゼ（Sigma,St.Louis,MO）、コンドロイチナーゼ（Sigm
a）およびシアリダーゼ（Boehringer Mannheim,Inc.）
の約0.0001から１までの範囲の希釈液とともに37℃で45
分間、ついで４℃で15分間プレインキュベートした。コ
ンドロイチナーゼはコンドロイチン硫酸を切断するのに
対し、ヘパリナーゼはヘパリンおよびヘパリン硫酸を切
断し、シアリダーゼはシアル酸を切断する。希釈液の最
初の初期濃度は以下の通りであった。ヘパリナーゼ25U/
ml（Ｕ＝0.1μモル／時間、pH＝7.5、25℃）コンドロイ
チナーゼ2.5U/ml（Ｕ＝1.0μモル／分、pH＝8.0、37
℃）、シアリダーゼ0.25U/ml（Ｕ＝1.0μモル／分、pH
＝5.5、37℃）。インキュベーション後、細胞を冷PBSで
３回洗浄し、ついで、20,000cpmの標識GV10 UTVベクタ
ーと共に、４℃で約１時間インキュベートした。ついで
該細胞を冷PBSで３回洗浄し、細胞結合cpmをシンチレー
ションカウンティングで測定した。結果は２回の測定の
平均として報告された。
図８に示すように、細胞表面から負に荷電した分子を
除去する酵素でのHS 68細胞の前処理は、キメラファイ
バー蛋白質を含むGV10 UTVベクターが細胞表面で、負に
荷電した部分と相互作用することを確認している。特
に、HS 68細胞についてはヘパリナーゼのほうがシアリ
ダーゼより効果的であったが、ヘパリナーゼとシアリダ
ーゼは両方とも、GV10 UTV結合を減少させることがで
きた。
従って、これらの結果はキメラファイバー蛋白質を含
むベクター（すなわちGV10 UTVベクター）は、野生型の
アデノウイルスとは違って、細胞進入に影響を及ぼすた
めに細胞表面上の負に荷電した分子と新規なやり方で相
互作用することを確認している。これらの結果はさら
に、正に荷電した分子（例えば、リジン）の代わりに負
に荷電した残基（例えば、アスパラギン酸およびグルタ
ミン酸）を含むベクターを同様に、細胞表面に存在する
正に荷電した分子を介して結合し、細胞内進入に影響を
及ぼすために用いることができることを示している。
実施例５ この実施例においてキメラファイバー蛋白質のような
キメラコート蛋白質を含むアデノウイルスベクター（例
えば、GV10 UTV）に仲介される異なるタイプの細胞への
遺伝子送達を、ファイバー蛋白質のような野生型のコー
ト蛋白質を含むアデノウイルス（例えばGV10）によって
介在される遺伝子送達と比較して評価する。
これらの実験は、キメラファイバー蛋白質を含むベク
ター（すなわち、GV10 UTV）と比べた、野生型ファイバ
ー蛋白質を含むベクター（すなわち、GV10）によるlac
Z遺伝子送達の相対的なレベルを、上皮様細胞（すなわ
ち、HeLa細胞、A549細胞、HepG2細胞およびH700 Ｔ細
胞）、平滑筋細胞（すなわち、HA SMC細胞およびHI S
MC細胞）、内皮細胞（すなわち、HUVEC細胞およびCPAE
細胞）、繊維芽細胞（すなわち、HS 68細胞およびMRC
−５細胞）、グリオブラストーマ細胞（すなわち、U118
細胞）および単球マクロファージ細胞（すなわち、THP
−１細胞）について比較した。アデノウイルスによる形
質導入の１日前に、約２×105の細胞を24多穴プレート
へ播種した。ついで、各ウェルをGV10（すなわち、野生
型アデノウイルスファイバー蛋白質を含む）またはGV10
UTV（すなわち、キメラアデノウイルスファイバーを含
む）によって1MOIで250μｌの容量で約１時間感染させ
た。そしてウェルを洗浄し、２日間インキュベートし
た。その後、細胞ライセートのlac Z活性を測定した。
結果は２回の測定の平均値として報告された。
図９に示されているように、選定した細胞株へリポー
ター遺伝子を導入するためのGV10 UTVベクターの使用
は、キメラファイバー蛋白質（UTV）の存在がファイバ
ー受容体を低いレベルまたは検出不可能なレベルで発現
している細胞（すなわち、受容体（−）細胞）へのlac
Z遺伝子送達を野生型ベクター（GV10）に比較して約５
から約300倍増加させることを確認している。ファイバ
ー受容体を高レベルで発現している細胞（すなわち、受
容体（＋）細胞）では、キメラファイバー蛋白質のGV10
UTVベクターへの組み込みが結果として遺伝子送達を約
３倍にまで増加させる。
野生型ファイバー蛋白質を含むアデノウイルス（すな
わちGV10）による受容体（−）非上皮細胞の導入で観察
される、受容体（＋）上皮細胞と比較した場合のこの発
現の減少は、実施例３で報告されているように、これら
の異なるタイプの細胞に結合するベクターの相対的な能
力に直接関連している。これらの結果は野生型アデノウ
イルスファイバー蛋白質の受容体の低発現が現在のアデ
ノウイルスベクターによるそれらの効率的な導入の重大
な制限因子であるという見解を支持している。
同様に、キメラコート蛋白質（すなわち、キメラファ
イバー蛋白質）のインビボでの遺伝子導入を増大させる
能力を調べた。10mM MgCl2および10mM Tris（pH7.8）
を含む生理食塩水溶液50μｌ中の約１×108pfuのGV10を
３匹のBALB/cマウスに経鼻腔的に接種した。もう３匹の
マウスに同じ投与量のGV10 UTVを接種した。２匹のマ
ウスには生理食塩水溶液だけを投与した。投与２日後、
該動物を犠牲にし、肺についてlac Z活性を測定した。
肺の液体窒素での素早い凍結（snap−freezing）、乳鉢
と乳棒による組織のすりつぶし、およびすりつぶした組
織の1.0mlのlac Zリポーター溶解バッファー（Promega
Corp.,Madison,WI）での溶解によって肺を解析の為に調
製した。蛍光光度解析をlac Z活性をモニターするため
に用い、この実験の結果は各動物群から測定された平均
活性として報告された。
これらの実験の結果を、図10に示す。図から分かるよ
うに、キメラファイバー蛋白質（UTV）を含むGV10 UTV
ベクターによって仲介されるインビボでの遺伝子導入
は、野生型ファイバー蛋白質を含むベクター（GV10）に
比べ、マウス肺への送達が平均８倍高くなる結果となっ
た。
従って、これらの結果はアデノウイルスベクターのキ
メラコート蛋白質（この場合、キメラファイバー蛋白
質）の組み込みはインビボおよびインビトロの両方でベ
クターを介した遺伝子送達の効率を、野生型ファイバー
蛋白質を含むアデノウイルスベクターに比べて実質的に
上昇させることを確認する。さらに、該結果は低いファ
イバー受容体の発現が肺およびその他の組織において観
察される準最適（suboptimal）送達に寄与する１つの重
要な因子であるという結論を支持している。また、該結
果は肺およびその他の組織への遺伝子導入（例えば、GF
TR遺伝子の送達）のために現在利用可能なアデノウイル
スベクターに比べて、GV10 UTV並びに他の類似のUTVベ
クターの優位性を確認している。
実施例６ この実施例において、キメラコート蛋白質（例えば、
キメラファイバー蛋白質）を含む本発明のベクターの、
蛋白質/DNA相互作用によってパッセンジャーDNAと相互
作用し、およびそれによって、「ピギーバック」様式で
そのDNAを細胞に運ぶ能力を評価する。
これらの実験には、受容体（＋）上皮細胞（すなわ
ち、293細胞、A549細胞およびH700 Ｔ細胞）への遺伝
子導入を調べるために、野生型ファイバーを含むアデノ
ウイルスベクター（すなわち、GV10）およびキメラファ
イバー蛋白質を含むアデノウイルス（すなわち、GV10 U
TV）が用いられた。対照実験では、以前記載したベクタ
ーで細胞を変換した。実験条件において、キメラアデノ
ウイルスファイバー蛋白質がプラスミドDNAと複合体を
形成することができるように、ベクターをβ−グルクロ
ニダーゼリポーター遺伝子を含むプラスミドpGUSととも
にインキュベートした。詳しくは、約５×107のGV10ま
たはGV10 UTVの活性のある粒子（すなわち、蛍光フォー
カス単位（fluorescence focus units（ffu））を約2.5
μｇのプラスミドpGUS DNAと共に１時間インキュベー
トした。ついで該混合物に10％ウシ胎児血清を含むDMEM
250μｌ中の約２×105の指示細胞（indicated cell）を
添加した。それからβ−グルクロニダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼの両活性をトランスダクション後10日目
に、蛍光光度解析によって評価した。細胞でのβ−グル
クロニダーゼの発現をlac Z発現の為のβ−ガラクトシ
ダーゼ解析と同様にして、β−グルクロニダーゼがＸ−
glu基質との反応を触媒する時の青色色素の生成をモニ
ターすることによって、モニターした。
これらの実験の結果を図11に示す。GV10ベクター（す
なわち野生型ファイバー蛋白質を含む）またはGV10 UTV
ベクター（すなわちキメラファイバー蛋白質を含む）の
どちらかを上皮細胞へのリポーター遺伝子のシス導入に
用いた時には同等のレベルのlac Zの発現が得られた。
それに比べ、野生型のベクターは、β−グルクロニダー
ゼ遺伝子の発現によって評価されるように、全ての上皮
細胞において比較的低いレベルでのみプラスミドpGUSを
細胞内へ導入できなかった。以前記載されているように
（PCT特許出願WO95−21259）、この遺伝子導入の基底レ
ベルは、おそらく、いあわせた分子（bystander molecu
les）の受容体を介する取り込み（RME）によって達成さ
れた。しかしながら、キメラファイバー蛋白質を含むGV
10 UTVベクターを用いるとpGUSプラスミドの導入は実質
的に増加した。293細胞への遺伝子導入の場合には、pGU
Sプラスミド指示性のβ−グルクロニダーゼ発現はGV10
UTVベクターに仲介されたシス連結した（cis−linked）
リポーター遺伝子の導入後に観察される発現を上回っ
た。
これらの結果は、本発明のキメラファイバー蛋白質の
ようなキメラコート蛋白質を含むベクターが、シスに位
置していない核酸の該ベクターでの導入の増加を示すこ
とを確認する。表向きには、この高められた遺伝子導入
はキメラファイバー上の負に荷電した残基（例えば、ポ
リリジン列残基）の間の蛋白質/DNA相互作用が起こるこ
とによって影響されており、結果として核酸のベクター
への結合が生じる。しかしながら、その他の向上方法も
また可能である。
実施例７ この実施例において、ファイバー蛋白質のＣ末端にUT
VあるいはUTV様の配列を含有する、さらなるプラスミド
の構築について述べる。
実施例２に記載の、導入プラスミドp193（F5＊）（図
12;p193NS（F5＊）、pNS（F5＊）、およびpAd NS 83−1
00 UTVとしても知られている）を、キメラアデノウイル
スファイバー蛋白質を含有する、これらのさらなるプラ
スミドの構築の為の出発点として用いた。図12に描写さ
れるように、p193（F5＊）は、最後のファイバー蛋白質
コドンとフレームシフトされたファイバー蛋白質の終止
コドンとの間にBamH I部位を有する変異したファイバー
遺伝子を含有している。ここで記載されるように構築さ
れた、さらなる変異導入プラスミドは、ファイバーＣ末
端に、アミノ酸グリシン／セリン反復リンカー、標的配
列、および終止コドンをコードする配列を含有してい
る。これらのプラスミドは合成オリゴヌクレオチドをp1
93（F5＊）のBamH I部位にクローニングすることによっ
てつくられ、図13に描写されるような導入プラスミドp1
93NS（F5＊）pGS（K7）（p193（F5＊）pGS（K7）または
pNS（F5＊）（pK7）としても知られている）を調製し
た。
つまり、野生型のAd5ファイバー遺伝子の配列は： であり、ここで「TAA」は停止コドンであり、ポリアデ
ニル化配列を太字で示している。p193（F5＊）に存在す
る変異ファイバー遺伝子のＣ末端は： ここで下線を施した配列は、ファイバー蛋白質に導入さ
れた変異したBamH I部位を示し、ポリアデニル化配列を
太字で示している。一方、p193NS（F5＊）pGS（K7）に
存在するファイバー遺伝子のＣ末端のアミノ酸配列は： ここで下線を施した配列は、ファイバー蛋白質に導入さ
れた変異したBamH I部位を示し、太字で示されている配
列はＣ末端に付加されたポリリジン列を示す。このアミ
ノ酸配列は、核酸配列:GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG A
GT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAG TAA［配列番
号21］によってコードされ、ここで「TAA」は停止コド
ンである。
導入プラスミドp193NS（F5＊）pGS（K7）を作るため
に使用したオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドは： pK7s（センス）、GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC
TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAA TAA G［配列番号6
1］;pK7a（アンチセンス）、GA TCC TTA CTT CTT CTT T
TT CTT CTT TTT AGA GCC ACT CCC TGA ACC TGA TCC T
［配列番号62］である。該センスおよびアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを等モルの割合で混合し、p193NS（F5
＊）のBamH I部位にクローニングし、p193NS（F5＊）pG
S（pK7）を調製した。p193NS（F5＊）pGS（pK7）中の正
確に方向づけられたインサートの確認は、pK7sセンスプ
ライマーおよび下流のアンチセンスオリゴヌクレオチド
プライマーA5a32938、CAGGTTGAATACTAGGGTTCT［配列番
号63］を用いたPCRによって行った。また、該A5a32938
プライマーを用いてインサートの領域内のDNA配列のシ
ークエンシングによって、該プラスミドが正確に方向づ
けられたインサートを含有していることを確認した。
ファイバー蛋白質のＣ末端に、UTVあるいはUTV様の細
胞標的配列を付加的に含有するさらなる変異導入プラス
ミドの構築に導入プラスミドp193NS（F5＊）を用いた。
これらのプラスミドはp193NS（F5＊）pGS（null）（p19
3（F5＊）pGS（null）またはp193（F5＊）pGSとしても
知られている）、pBSS 75−100 pGS（null）、pBSS 75
−100 pGS（RK32）、pBSS 75−100 pGS（RK33）、およ
びpBSS 75−100 pGS（tat）を包含している。
p193NS（F5＊）pGS（null）を構築するために、相補
的オーバーラップオリゴヌクレオチドpGSs、GATCCGGTTC
AGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAAA［配列番号64］およびp
GSa GATCTTTAACTAGTCGAGCCACTGCCAGATCCTGAACCG［配列
番号65］をBamH I消化したp193NS（F5＊）プラスミド内
へのダイレクトライゲーション用に構築した。正確に方
向づけられているクローンの確認は、pGSsプライマーお
よび下流のアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー
A5a32938を用いるPCRによって行った。また、A5a32938
プライマーを用いてインサートの領域内のDNA配列のシ
ークエンシングによって、該プラスミドが正確に方向づ
けられているインサートを含有していることも確認し
た。
図14に描写されている、ベクターpBSS 75−100 pGS
（null）（pBSS 75−100 ΔE3 pGS（null）としても知
られている）を、pBSS 75−100由来のNhe I−Sal Iフラ
グメントを、対応するp193NS（F5＊）pGS（null）由来
のフラグメントで置き換えることによって構築した。次
いで、該プラスミドをSpe Iで部分消化し、クレノウフ
ラグメントで埋め、次いでベクターを再連結することに
よって、ファイバーキメラ遺伝子内にはないSpe I部位
を削除した。得られたベクターは、アミノ酸配列Ala Gl
n Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr
Ser［配列番号24］をコードする適切な核酸配列:GCCCAA
GAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAA［配列番
号23］（ここで「TAA」は停止コドンである）を含んで
いる。
プラスミドpBSS 75−100 pGS（RK32）（pBSS 75−100
ΔE3 pGS（RKKK）２またはpBSS 75−100 ΔE3 pGS（RK
KK2）としても知られている）、pBSS 75−100 pGS（RK3
3）（pBSS 75−100 ΔE3 pGS（RKKK）３、またはpBSS 7
5−100 ΔE3 pGS（RKKK3）としても知られている）、お
よびpBSS 75−100 pGS（tat）のインサートをSpe I消化
したpBSS 75−100 pGS（null）プラスミド内へのダイレ
クトライゲーション用の構築した。図15に描写されてい
るpBSS75−100 pGS（RK32）を構築するために、相補的
オーバーラップオリゴヌクレオチド、RK32s、CTAGAAAGA
AGAAACGCAAAAAGAAGA［配列番号66］およびRK32a、CTAGT
CTTCTTTTTGCGTTTCTTCTTT［配列番号67］を用いた。得ら
れたベクターは、アミノ酸配列Ala Gln Glu Gly Ser Gl
y Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys
Arg Lys Lys Lys Thr Ser［配列番号26］をコードする
適切な核酸配列： GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAA
GAAACGCAAAAAGAAGACTAGTTAA［配列番号25］（ここで「T
AA」は停止コドンである）を含む。
図16に描写されているpBSS 75−100 pGS（RK33）を構
築するために、相補的オーバーラップオリゴヌクレオチ
ド、RK33s、CTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGA
［配列番号68］およびRK33a、CTAGTCTTCTTCTTTCTTTTTTT
TTTGCGCTTCTTCTTCTTT［配列番号69］を用いた。得られ
たベクターは、アミノ酸配列Ala Gln Glu Gly Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Ar
g Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser［配列番号2
8］をコードする適切な核酸配列： GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAA
GAAGCGCAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGACTAGTTAA［配列番号27］
（ここで「TAA」は停止コドンである）を包含してい
る。
pBSS 75−100 pGS（tat）を構築するために、相補的
オーバーラップオリゴヌクレオチド、TATs、CT AGT TAT
GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA T［配
列番号70］およびTATa、CT AGA TGC CCG TCT TCG TTG C
CT GCG CTT TTT TCT CCC ATA A［配列番号71］を用い
た。得られたベクターは、アミノ酸配列Thr Ser Tyr Gl
y Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ser Ser
［配列番号73］をコードする関連する核酸配列:ACT AGT
TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA T
CT AGT［配列番号72］を包含している。
正確に方向づけられたクローンの確認は、３つの各プ
ラスミドのそれぞれ用のセンスプライマー（RK32s、RK3
3s、またはTATs）を用い、且つ下流のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドプライマーA5a32938を用いるPCRによっ
て行った。A5a32938プライマーを用いてインサートの領
域内のDNA配列のシークエンシングによって、各自プラ
スミドが正確に方向づけられたインサートを含有してい
ることもまた確認された。
実施例８ この実施例において、ファイバーループ内にUTVドメ
インを含有するプラスミドの構築について述べる。
ファイバー蛋白質の露出ループ内にUTV配列（および
／またはスペーサー配列）を含有するプラスミドは、任
意の上述の配列（および任意のさらなるUTV様配列）を
ファイバー蛋白質に組み入れることによって構築され
る。これは図17に描写されるさらなる導入ベクターp193
NS F5F2K（p193 F5F2Kとも呼ばれる）を構築するため
の、プラスミド導入ベクターp193NS（F5＊）の既成の利
用法である。プラスミドp193NS F5F2Kは、該蛋白質内の
露出ループをコードしているAd2ファイバー遺伝子内に
ユニークなSpe I制限部位を含有している。すなわち、p
193NS F5F2K内に存在するファイバー遺伝子はファイバ
ー配列： を含み、ここで下線を施した配列はファイバー遺伝子内
に導入された新規なSpe I部位を示す。
次いで、このベクターを、標的配列をSpe I部位にク
ローニングするために用いた。特に、ヘパリン結合ドメ
インを有する８つの塩基性アミノ酸RKKKRKKK（Arg Lys
Lys Lys Arg Lys Lys Lys［配列番号74］）の範囲をコ
ードする核酸配列を、オーバーラップセンスおよびアン
チセンスオリゴヌクレオチドを用いて、p193 F5F2KのSp
e I部位にクローニングした。
すなわち、該（RKKK）２配列は、部分的に配列： を有する。
RKKKRKKK［配列番号74］ペプチドモチーフを有するポ
リGS（RKKK）２配列をクローニングするために、実施例
７に記載の、27merのセンスオリゴクレオチドRK32sおよ
び27merのアンチセンスオリゴヌクレオチドRK32aを用い
た。p193NS F5FK2のSpe I部位に該結合ドメインをコー
ドするDNA配列をクローニングすることによって、p193N
S F5F2K（RKKK）２を構築した。該結合ドメインをコー
ドしている該オーバーラップセンスおよびアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、まず最初にアニーリングし、つ
づいてSpe I制限部位に直接連結させて、図18に描写さ
れているp193NS F5F2K（RKKK）２を得た。このプラスミ
ドはまた、p193NS F5F2K（RKKK2）、p193NS F5F2K（RK3
2）、またはp193 F5F2K（RKKK2）としても知られてい
る。p193NS F5F2K（RKKK）２内に存在するファイバーノ
ブの修飾ループの関連部分は： である。
さらに、（RKKK）３配列あるいはこの配列の他の変異
体がp193NS F5F2Kに挿入され得る。この配列は、部分的
には： を有する。該配列は、39merのセンスオリゴヌクレオチ
ド（RKKK）３（ｓ）（即ち、配列CT AGA AAG AAG AAG C
GC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG A［配列番号79］を含
む）、および39merのアンチセンスオリゴヌクレオチド
（RKKK）３（ａ）（即ち、配列CT AGT CTT CTT CTT TCT
TTT TTT TTT GCG CTT CTT CTT T［配列番号80］を含
む）を用いて挿入され得る。得られたプラスミドp193NS
F5F2K（RKKK）３を図19に描写する。このプラスミドは
またp193NS F5F2K（RKKK3）、p193 F5F2L（RKKK3）、ま
たはp193 F5FK（RK33）としても知られている。p193 F5
F2K（RKKK）３内に存在するファイバーノブの修飾ルー
プの関連部分は： である。
実施例９ この実施例において、UTVあるいはUTV様配列を含むキ
メラペントンベース蛋白質を含有するプラスミドの構築
について述べる。
外来性の配列の挿入を容易にする為に、部分的に、Ad
5ゲノムのユニークなBamH I/Pme Iフラグメント（13259
−21561）を有し、且つ、就中、αＶインテグリン結合
ドメインを構成する８アミノ酸の欠失、該欠失した領域
のユニークなSpe I部位を構成するアミノ酸での置換を
含むペントンベース蛋白質を含有するプラスミドを操作
することによって導入プラスミドpACT（ΔRGD）（米国
特許5,559,099ではプラスミドpATとしても記載されてい
る）を誘導した。
図20に描写されているpACT（RKKK）３（pACT（RKKK
3）またはpACT（RK33）としても知られている）を構築
するために、相補的オーバーラップオリゴヌクレオチド
RK33aおよびRK33aをSpe I消化したpACT（ΔRGD）プラス
ミドに直接連結した。正確に方向づけられたクローンの
確認は、該プラスミド用のRK33aプライマーおよび上流
のセンスオリゴヌクレオチドプライマーA5s15002を用い
るPCRによって行った。A5s15002プライマーを用いるイ
ンサートの領域内のDNA配列のシークエンシングによっ
て、該プラスミドが正確に方向づけられたインサートを
含有していることもまた確認した。pACT（RKKK）３内の
キメラペントンベース蛋白質となるであろうUTVドメイ
ンの関連部分は： である。
RK32sおよびRK32aオーバーラッププライマーを用い
て、図21に描写されるプラスミドpACT（RK32）（pACT
（RKKK2）またはpACT（RKKK）２とも呼ばれ得る）を、
同様にして構築することができる。pACT（RKKK）２のキ
メラペントンベース内に存在するUTVドメインの関連部
分は： である。
実施例10 この実施例において、アデノウイルスヘキソン蛋白質
内にUTVあるいはUTV様配列を含み、特にアデノウイルス
ヘキソン蛋白質の露出ループ内にこれらの配列を含有す
るプラスミドの構築について述べる。
これらのプラスミドは、図22に描写される別の導入プ
ラスミドであるプラスミドpACT H11を利用して構築され
得る。プラスミドpACT H11そのものは、プラスミドpACT
（Ad5ゲノムの13259から21561からなる）由来であっ
て、ヘキソン蛋白質コード配列（およそ18842−21700に
対応する）の大部分を含有する。特に、pACT H11は、Ad
5ヘキソン蛋白質のループ１領域にXba I部位を組み入れ
ることによって構築され得る。ループ１もしくはループ
２領域のどちらかに、もしくはヘキソン蛋白質のその他
の露出ループにXba I部位または他のいかなる便宜の良
い制限部位を組み入むために、同様の技術が使用され得
る。Ad5DNA由来のループ１領域をPCRによって増幅する
ために、そして同時にループ１領域に変異したXba I部
位をもたらす変異を導入するためにセンスおよびアンチ
センスプライマーを使用することができる。特に、pACT
内に生じる、自然に生じるユニークな制限部位Apa Iを
含有するセンスプライマー、 およびユニークな制限部位BsrG Iを含有するアンチセン
スプライマー、ATCTTCACTGTACAATACCACTTTAGGAGTCAAGTT
ATCACCTCTAGATGCGGTCGCCT［配列番号82］を用いること
ができる。Apa IをBsrG Iフラグメントに置き換える為
に、Xba I部位を含有するPCR産物を、BsrG IおよびApa
Iで切断し、そしてpACTにクローニングして戻した。得
られたプラスミドpACT H11は、ヘキソンのループ１への
UTV配列の挿入の為のユニークなXba I部位を含有してい
る。pACT H11クローン内でのXba I部位の存在は、Xba I
を用いる制限消化（該プラスミドを線状化するはずであ
る）することによって確認することができる。
変異していないヘキソンループ１のアミノ酸配列は、
配列TEATGNGDNL［配列番号83］を含む。対照的に、pACT
H11（図22）では、野生型のTEA残基につづく、変異し
たヘキソンループ１のアミノ酸配列は、配列TASRGDNL
［配列番号40］（即ち、核酸配列ACCGCATCTAGAGGTGATAA
CTTG［配列番号39］によってコードされている）を含
む。
そしてpACT H11のXba I部位は、RKKKRKKK［配列番号7
4］のような一般的な標的配列を、例えばオーバーラッ
プオリゴヌクレオチドRK32sおよびRK32aを用いてクロー
ニングするために、ユニークな部位として使用すること
ができる。そのような操作から得られた特定のプラスミ
ド、すなわちpACT H11（RKKK）２（またはpACT H11（RK
32）またはpACT H11（RKKK2））を図23に描写する。こ
のプラスミドは、配列： である。
他のUTVまたはUTV様の配列もまたヘキソン蛋白質のル
ープ１領域内に、および／またはヘキソン蛋白質のルー
プ２領域内にクローニングすることができる。例えば、
さらにUTV配列がクローニングされ得るユニークな制限
部位（Xba I部位のような）を含むプラスミドpACT H12
（示さず）を作製するために、ヘキソンループ２をコー
ドする配列を変異をおこさせるために同様のアプローチ
を用いることができる。
また、相補的オーバーラップオリゴヌクレオチドRK33
sおよびRK33aを用い、そして該PCR産物をXba I消化した
pACT H11プラスミドに直接連結させることによって、プ
ラスミドpACT H11（RKKK）３（またはpACT H11（RKKK
3）またはpACT H11（RK33）を構築することができる。
正確に方向づけられたクローンの確認は、該プラスミド
用のRK32センスプライマーおよび適当な下流のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによっ
て行うことができる。下流のアンチセンスオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いてインサートの領域内のDNA配
列をシークエンシングすることによって、該プラスミド
が正確に方向づけられたインサートを含有していること
もまた確認した。類似の導入ベクター、特に類似の導入
ベクターpACT H11（RKKK）２およびpACT H12（RKKK）３
を構築するために、同様のアプローチを行うことができ
る。
実施例11 この実施例において、短シャフトファイバー蛋白質を
有するプラスミドの構築について述べる。特に、この実
施例においてプラスミドp193 F5F9sKの構築について述
べる。
プラスミドp193 F5F9sK（p193 F5F9K−Shortとしても
知られている）を図24に描写する。このベクターは、Ad
5ファイバーシャフトのおよそ３分の２を欠失し、そし
て該Ad5ファイバーノブがAd9ファイバーノブで置換され
ているキメラファイバー蛋白質をコードする。
該プラスミドp193 F5F9K−shortはp193NS（F5＊）か
ら構築された。ファイバー遺伝子由来の最後のシャフト
反復およびノブをコードしているAd9配列を増幅するた
めに、オリゴヌクレオチドプライマー、GGACTAGTAG CAT
TTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC［配列番号84］およびCCGGA
TCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG［配列番号85］を用いた。
次いで、通常の技術を用いてPCR産物を精製し、制限酵
素Nhe IおよびBamH Iで消化してp193NS（F5＊）導入プ
ラスミドのNhe I/BamH I領域へ該PCR産物をクローニン
グした。得られた短シャフトファイバー蛋白質を後述の
ようにアデノウイルスベクターの構築に用いることがで
きる。さらに、１つ乃至それ以上の任意の上述のUTVま
たはUTV様配列を短シャフトファイバーに組み込むこと
ができ、そして得られたファイバーを細胞送達（cell d
elively）に用いることができる。
実施例12 この実施例において、それによって細胞への接触およ
び細胞ターゲティングへの寄与をより可能にする伸長し
たヘキソンおよび／またはペントンベース蛋白質を生じ
るように、伸長構造内、特にヘキソンおよび／またはペ
ントンベース蛋白質内に、UTVまたはUTV様配列を含有す
るプラスミドの構築について述べる。得られたキメラ蛋
白質はセンス内に「折れ線状に」ウイルス表面から突き
出るであろう非天然のアミノ酸配列の挿入を包含する。
RGD配列に従う32アミノ酸のα−ヘリックスドメイン
をコードするペントン遺伝子の領域を増幅するために、
プライマー1alpha（ｓ）、 GGGCTGCAGGCGGCCGCAGAAGCTGAAGAGGCAGCCACACGGGCTGAGGA
GAA［配列番号86］および1alpha（ａ）、 GGGGTGCACACAGCTTCGGCCTTAGCGTTAGCCTGTTTCTTCTGAGGCTT
CTCGACCT［配列番号87］を使用することができる。この
32アミノ酸配列は配列 ATRAEEDRAEAEAAAEAAAPAAQPEVEKPQKK［配列番号88］を含
む。使用される該プライマーはまた、どちらかの末端に
追加のα−ヘリックス配列をコードすることができる、
すなわち、例えば最終的に増幅されたDNA配列は配列： をコードしている。強調されている配列は該プライマー
によってコードされている非ペントン配列に対応し、下
線を施した配列は、２つの互換性のある制限部位Sfc I
およびApaL Iによってコードされているアミノ酸を表
す。α−ヘリックス構造を予測するために設計された通
常のコンピュータープログラムによると、これらのアミ
ノ酸配列もまた、無傷のalphaヘリックスを保存してい
る。
これらのアミノ酸配列をコードしているPCR産物を、S
fc IおよびApaL Iの両方で切断し、再連結し、そして再
び両酵素で切断することができる。類似部位（like−si
te）の類似部位への連結は再切断の為の部位を保存する
が、しかしながら、互換性はあるが類似していない部位
の連結は該部位を破壊する。従って、連結した産物の再
切断時には、PCR産物の当初のサイズの倍数である多数
のフラグメントがつくられる。完全に再切断されたフラ
グメント（およそ150bp）、およそ300bpのフラグメント
（１つの制限部位が破壊されている）およびおよそ450b
pのフラグメント（２つの制限部位が破壊されている）
等がある。従って、該方法は、より大きな「折れ線（ス
パイク）」をつくりあげるべく、大きな、中断されてい
ないα−ヘリックス領域を蛋白質にクローニングするた
め、あるいは該蛋白質の伸長の為に、50アミノ酸（1alp
ha）をコードするもとの配列を２倍（2alpha）、３倍
（3alpha）等にする。
例えば、プラスミドpSP2alpha（図26に描写）をつく
りあげるために、2alpha2倍産物（すなわち2alpha2）を
プラスミドpSPdelta（図25に描写）の最初のPpul0 I部
位にクローニングすることができる。該プラスミドpSPd
eltaは、基本プラスミドpUC19から、または他の任意の
適当なクローニングプラスミドから構築される。ウイル
ス粒子表面からUTV配列（あるいは他の任意のターゲテ
ィング配列）を持ち上げさせるペントンまたはヘキソン
蛋白質のさらなる修飾を行うために、pSPdelta導入プラ
スミドを用いることができる。折れ線状構造（例えば
「タワー」型）内での該ターゲティング配列の持ち上げ
は、該ファイバー蛋白質による、ペントンおよびヘキソ
ンの細胞表面との相互作用の立体障害を最小にし、そし
て細胞表面との相互作用の為に該キメラペントンおよび
ヘキソン蛋白質をより接近させるであろう。
該プラスミドpSPdeltaは、UTV配列の組み込みのため
のユニークなSpe Iクローニング部位を含有している。
該Spe Iクローニング部位は、UTV配列をウイルス粒子表
面から離れて持ち上げるであろうアミノ酸をコードして
いるDNA配列の取り込みをもたらすPpu10 Iクローニング
部位にどちらか一方の側で隣接している。pUC19のユニ
ークなXba I部位に、Xba I部位に直接挿入するように設
計されているオーバーラップオリゴヌクレオチドをクロ
ーニングすることによってpSPdeltaプラスミドを構築し
た。特に該センスオリゴヌクレオチドは： CTAGAGCAGCTATGCATGAAGGGACTAGTGGAGAGATGCATGCAGCCT
［配列番号19］である。該アンチセンス、相補的オリゴ
ヌクレオチドは： CTAGAGGCTGCATGCATCTCTCCACTAGTCCCTTCATGCATAGCTGCT
［配列番号92］である。該オリゴヌクレオチドを等モル
の割合で混合し、pUC19のXba I部位にクローニングし
た。正確なインサートの存在は、インサート領域にわた
るシークエンシングによって、およびPpu10 Iで該プラ
スミドを切断することによって確認することができる。
インサートのどちらか一方の側のXba I部位はあとのク
ローンにおけるこの部分の除去に都合が良い。
pSPdelta内にはPpu10 Iが２つ存在するので、該プラ
スミドは只一つの部位が切断される様にPpu10 Iを用い
た消化によって部分的に制限することができる。ApaL I
およびSfc I部位を含むPCR産物の互換性のあるPpu10 I
部位への連結は、該プラスミド内の最初のPpu10 I部位
を破壊するであろうし、また該ApaL IおよびSfc I部位
をも破壊するであろう。これらの破壊された部位を図26
（pSP2alpha2プラスミドを示している）に「ｊ」によっ
て表している。そして図27に描写される、UTV配列ある
いは他のよく似たターゲティング配列の挿入クローニン
グのためにSpe I部位を含有しているプラスミドpSP2alp
ha2を作るために第２のダブレット産物をpSP2alpha2プ
ラスミドの残っているPpu10 I部位にクローニングする
ことができる。予想される2alpha2蛋白質の二次元構造
のコンピューター解析は、それがSpe Iクローニング部
位の領域内であるということを除いては完全なαヘリッ
クスであろうことを明確にしている。
つまり、pSPdeltaが配列： を含む一方でpSP2alphaは配列： を含み、そしてpSP2alpha2は配列： を含む。
UTVまたはUTV様配列のような標的配列をプラスミドpS
P2alpha2のSpe I部位にクローニングすることができ
る。特にRK32sおよびRK32aオーバーラップオリゴヌクレ
オチドをpSP2alpha2（RKKK）２（またはpSP2 alpha2（R
K32）またはpSP2alpha2（RKKK2））をつくりあげるため
にSpe I部位にクローニングすることができる。プラス
ミドpSP2alpha2（RKKK）３（またはpSP2alpha2（RK33）
またはpSPSalpha2（RKKK3）を同様に構築することがで
きる。別に、pACT 2alpha2（RKKK）２（pACT 2alpha2
（RKKK2）あるいはpACT 2alpha2（RK32）とも呼ばれ得
る）をつくりあげるために、Xba Iを用いた制限によっ
て該プラスミドから全2alpha2α−ヘリックスドメイン
を除去し、そしてpACT（ΔRGD）の互換性のあるSpe I部
位にクローニングすることができる。pACT 2alpha2（RK
KK）３（pACT 2alpha2（RKKK3）あるいはpACT 2alpha2
（RK33）とも呼ばれ得る）を作製するために同様の技術
を用いることができる。
同様にして、pACT H11 2alpha2（RKKK）２（pACT H11
2alpha2（RKKK2）またはpACT H11 2alpha2（RK32）と
もよばれ得る）をつくりあげる為に、2alpha2 α−ヘリ
ックスドメインをpACT H11のXba I部位にクローニング
することによって折れ線状となる（spiked）キメラヘキ
ソン蛋白質（例えばそれらの伸長をもたらす配列を包含
している）を構築することができる。pACT H12 2alpha2
（RKKK）２（pACT H12 2alpha2（RKKK2）あるいはpACT
H12 2alpha2（RK32）とも呼ばれ得る）を作製するため
に同様の技術を用いることができる。
実施例13 この実施例において、UTVあるいはUTV様配列をアデノ
ウイルスファイバー蛋白質内に含むすでに記載されてい
るものにに加え、さらなるアデノウイルスベクターの構
築について述べる。
ファイバー内にUTV修飾を有するアデノウイルスベクタ
ーの構築は、当業者により多くの方法で遂行されてい
る。上述のプラスミドからUTVファイバーベクターを創
製する方法の一つは、まずプラスミドDNAをSal Iで線状
化し、ついでこのDNAを、トランスフェクションの前にE
4欠失アデノウイルスで感染させた293パッケージング細
胞株にトランスフェクトすることである。E4を欠失した
アデノウイルスベクターは、293細胞株のような細胞株
内で複製することは不可能であり、トランスにアデノウ
イルスE1領域を供給するだけである。修飾ファイバー遺
伝子およびE4領域を含む該プラスミドのE4欠失したDNA
との組換えは、複製反応能のある（replication−compe
tent）、修飾ファイバー遺伝子を担持するE4を有するベ
クターを生じる。
従って、プラスミドp193NS（F5＊）pGS（K7）、pBSS
75−100 pGS（null）、pBSS 75−100 pGS（RKKK）２、p
BSS 75−100 pGS（RKKK）３、pBSS 75−100 pGS（ta
t）、p193NS F5F2K（RK32）、およびp193NS F5F9sKをそ
れぞれSal Iで線状化し、E4を欠失したアデノウイルス
ベクター、GV11A.Z（サイトメガロウイルス（CMV）プロ
モーターの制御下にLacZ遺伝子を担持している）もしく
はGV11A.S（CMVプロモーターの制御下に分泌アルカリホ
スファターゼ遺伝子を担持している）のいずれかで１時
間前に感染させた293細胞にトランスフェクトした。結
果として生じるアデノウイルスベクターAdZ.F（pK7）、
AdZ.F（pGS）、AdZ.F（RKKK）２（AdZ.F（RKKK2）ある
いはAdZ.F（RK32）としても知られる）、AdZ.F（RKKK）
３（AdZ.F（RKKK3）あるいはAdZ.F（RK33）としても知
られる）、AdZ.F（tat）、AdZ.F5F2K（RKKK）２（AdZ.5
F2K（RKKK2）あるいはAdZ.F（RK32）としても知られ
る）、およびAdZ.FF5F9sK（AdZ.FF5F9sK−Shortとして
も知られている）を得、293細胞上での連続してプラー
キング（plaquing）を２回行い精製した。
インサート領域にわたるPCRによって、またHirt抽出
によってベクターで感染させた293細胞から得られたウ
イルスDNAの制限解析（restriction analysis）によっ
て、全てのベクターが正確な配列を含んでいることを確
認した。また、要求されれば蛋白質のサイズを調べるた
めにウエスタン解析（前述）を行うこともできる。ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動したベクター粒子および
／またはベクターで感染させた細胞のライセート由来の
ファイバー蛋白質のウエスタン解析は、非修飾のファイ
バー蛋白質に比べ、そのファイバー蛋白質の移動度にお
いて付加されているアミノ酸の存在と矛盾のない対応す
るシフトを示した。例えば、AdZ.F（pK7）粒子のウエス
タン解析は、そのファイバー蛋白質がAdZ.F（pK7）ファ
イバー蛋白質に付加されたアミノ酸の存在と矛盾なく、
非修飾のファイバーを含んでなるAdZベクターのものに
比べて上にシフトしていることを確認した。
上に概略したのと同じ方法（あるいは僅かに変えた方
法）を用いて、ここで同様に地図が描写されている他の
プラスミドをアデノウイルスベクターにすることができ
る。
実施例14 この実施例において、UTVあるいはUTV様配列をアデノ
ウイルスペントンベース蛋白質内に含んでいるアデノウ
イルスベクターの構築について述べる。
キメラペントンベース蛋白質を含むアデノウイルスベ
クターを作る方法は、例えばWickhamら,J.Virol.,70,68
31−6838（1996）に記載されている。上に記載の、キメ
ラペントンベース蛋白質を含有するpACTベクター（例え
ば導入プラスミドpACT 2alpha2（RKKK）２、pACT H12 2
alpha2（RKKK）２およびpACT（ΔRGD））が、該プラス
ミドを線状化するために例えばBamH Iで消化され得る。
Ad5ゲノム内の14561および15710の位置で野生型Ad5を切
断する制限エンドヌクレアーゼXmn IでAd5 DNAが消化
され得る。２つの大きなフラグメントをより小さな1kb
片からわけて精製し、ついで該線状化プラスミドと一緒
に適当な細胞株（例えば293細胞株）にトランスフェク
トして、組換えウイルスを生産する。
このやり方で生産されたアデノウイルスベクターを、
潜在的に混入している修飾されていないベクターから、
293細胞上でのプラーク精製を連続して２回行って精製
する。ついで得られたベクターがペントンベース領域に
正確な配列を含んでいることを、つづくベクターで感染
させた293細胞のHirt抽出によって得られるウイルスDNA
の制限解析によって確認する。インサートの存在を確認
するために、ウイルスDNA由来のインサート領域を増幅
することによって調製されるPCR産物のシークエンシン
グを用いることもできる。ポリアクリルアミドゲルで電
気泳動したキメラペントンベースのウエスタン解析は、
修飾されていないペントンベースに比べ、ペントンベー
スの移動度においてキメラ蛋白質に付加されたアミノ酸
の存在に矛盾のない対応するシフトを示すはずである。
実施例15 この実施例において、UTVあるいはUTV様配列をヘキソ
ン蛋白質内に含むアデノウイルスベクターの構築につい
て述べる。
ウイルスAdZ.H（RKKK）２を構築するために、オーバ
ーラップし、そして完全なAdZ.H（RK32）を創製すべくP
me I−BamH I apACT H11（RK32）配列のどちらか一方の
側で組換えがおこるであろうDNA配列を含むレフトおよ
びライトのベクターアームを調製する。レフトアームを
構築するために、精製Ad5 DNAを、14499、15283、1901
7、23063、23656、23411、および31102の位置でAd5を切
断するAge Iで制限消化する。そして０−14499フラグメ
ントをレフトアームとして用い、ゲル電気泳動によって
他のフラグメントから精製することができる。Drd IでA
d5 DNAを消化することによってライトアームを調製す
ることができる。Drd IはAd5を5458、7039、14004、155
93、17257、および21023の位置で切断する。そして2102
3−35938bpフラグメントをライトアームとして用い、ゲ
ル電気泳動によって残りのフラグメントから精製するこ
とができる。ついでこれら２つのフラグメントをpACT H
11（RK32）由来のPme I/BamH Iフラグメントとともに29
3細胞へトランスフェクトする。Pme IはAd5の13258の位
置で切断し、BamH IはAd5の21562の位置で切断する。Ad
Z.H（RKKK）３をつくるために同様の技術を用いること
ができる。
実施例16 この実施例において、短シャフトファイバー蛋白質を
含むベクターの構築について述べる。
導入プラスミドp193 F5F9Kshort由来のアデノウイル
スの構築のためにここで記載した方法は、他の短シャフ
トファイバー由来の他のアデノウイルスベクターの構築
のために用いることができる。すなわち、アデノウイル
スの不可欠なE4領域を含有している導入プラスミドp193
F5F9KshortをSal Iで切断し、そしてアデノウイルスベ
クターAdSE.E4Gusで１時間前もって感染させた293細胞
にトランスフェクトした。AdSE.E4Gusはアデノウイルス
ゲノムのE4領域を欠いており、E4遺伝子の相補性がない
ときには、293細胞内で複製することができない。つま
り、E4遺伝子を得るべくAdSE.E4GusDNAがp193 F5F9Ksho
rtプラスミドDNAと組換えを起こす時にのみ、該ベクタ
ーは293細胞内で複製することができる。この組換え現
象の際に、新しく作られたベクターもまた、該プラスミ
ドによってコードされている変異ファイバー蛋白質コー
ド配列を獲得する。ついで、F5F9Kshortファイバーキメ
ラを含有する生存可能な組換え体E4+アデノウイルス
を、トランスフェクション５日後のトランスフェクトさ
れた細胞のライセートをプラーキングすることによって
単離した。得られたベクターAdSE.F5F9Kshortを、293細
胞上での連続した２回のプラーキングを含む通常のウイ
ルス学的な技術を用いて単離、精製した。該ベクターが
正確なインサートを含有していることを、ウイルスDNA
のPCRおよび制限解析によって確認した。ファイバー遺
伝子のどちらか一方の側で複製のもととなる（prime）
オリゴヌクレオチドプライマーは、該PCR産物が短くな
ったキメラファイバー遺伝子によってコードされている
正確なサイズのものであることを確認した。該ベクター
DNAの制限解析は新しいベクターが、Ad9ファイバーノブ
に対してユニークな正確な制限部位を含有していること
を示した。
実施例17 この実施例において、短シャフトファイバー蛋白質お
よびUTVまたはUTV様配列を組み込んでいるキメラペント
ンベース蛋白質を含むアデノウイルスベクターの構築に
ついて述べる。
この構築のために、上述のようにAds.F9sKウイルスDN
AをXmn Iで消化することができる。ついでプラスミドpA
CT H11（RK32）を制限酵素Pme IおよびBam Iで切断す
る。該制限消化されたウイルスおよびプラスミドDNAを
精製し、293細胞へトランスフェクトする。得られたベ
クターを293細胞上でプラーク精製を２回連続して行う
ことによって単離し、Hirt抽出によってベクター感染さ
せた293細胞から得られたウイルスDNAの制限解析によっ
てペントンベース領域内に正確なインサートを含有して
いることを確認する。
ウイルスDNA由来のインサート領域の増幅により調製
されるPCR産物のシークエンシングもまたインサートの
存在を確認するために使用され得る。ポリアクリルアミ
ドゲル上でのキメラペントンベースのウエスタン解析
は、修飾されていないペントンベースに比べ、キメラペ
ントンベースの移動度において付加された非天然のアミ
ノ酸配列の存在（および天然のアミノ酸の不在）に矛盾
無く対応するシフトを示すはずである。
上に概略した方法と同じ、あるいは僅かに変えた方法
を利用することによって、ここにその地図を表してい
る、アデノウイルスベクターにしなかった他のプラスミ
ドを作ることができる。特に、短シャフトファイバー蛋
白質を、さらに必要に応じてUTVあるいはUTV様配列を組
み込むことができる「折れ線状の」キメラペントンベー
ス蛋白質をもつアデノウイルスに組み込むことができ
る。
実施例18 この実施例において、短シャフトファイバー蛋白質お
よびUTVまたはUTV様配列を組み込んでいるキメラヘキソ
ン蛋白質を含むアデノウイルスベクターの構築について
述べる。
UTVを含有するキメラヘキソン蛋白質を含むベクター
を作るためにウイルスDNAをAdZ.F9sKのようなシャフト
の短いベクターから単離し、上述の制限酵素で切断する
ことができる。他の全ての工程は、例えば実施例17に記
載されているのと同じである。得られたベクターは、短
シャフトファイバー蛋白質とUTVまたはUTV様配列を組み
込んでいるキメラヘキソン蛋白質を含有しているはずで
ある。さらにこのアプローチを異なるキメラヘキソン蛋
白質を含む導入プラスミドの変種を用いて行うことがで
きる。特に短シャフトファイバー蛋白質を、さらに必要
に応じてUTVあるいはUTV様配列を組み込むことができる
「折れ線状の」キメラヘキソン蛋白質をもつアデノウイ
ルスに組み込むことができる。
実施例19 この実施例において、UTVまたはUTV様配列を含む本発
明のベクター、特にアデノウイルスベクターの評価につ
いて述べる。
例えば、UTVまたはUTV様配列の付加がウイルスのアッ
センブリに影響を及ぼさないことを確認する為に、ベク
ターのウイルス増殖動力学（kinetics）を調べることが
できる。プラスミドを含有するUTV配列の典型として、p
Ad.F（pK7）の増殖の様子をモニタリングし、配列SACDC
RGDCFCGTS［配列番号93］に存在するRGDペプチドモチー
フの挿入を含有している野生型のアデノウイルス（Ad
5）およびアデノウイルスベクターAdZ.F（RGD）の増殖
の様子と比較した。これらの検討のために、293細胞
に、５活性ウイルス粒子／細胞の感染多重度でAdZ.F（R
GD）あるいはpAd.F（pK7）のどちらかを感染させ、細胞
あたり生産された感染性粒子の数（蛍光フォーカス単位
（fluorescent focus units）（FFU））を、感染１、
２、および３日後に細胞の回収につづいて測定した。Ad
Z.F（RGD）あるいはAdZ.F（pK7）の力価は幾分低かった
が、Ad5の力価と劇的に異なるということはなかった。
図28に見ることができるように、AdZ.F（RGD）およびAd
Z.F（pK7）のピークの力価は、それぞれAd5のピークの
力価の86％および56％であった。これらの結果は、２つ
のベクターの増殖動力学が実質的に配列、特にUTVまた
はUTV様配列のファイバー蛋白質末端への付加によって
影響されないことを明確にしている。該結果はまた、UT
VまたはUTV様配列を含んでいるさらなるベクターが常軌
を逸した増殖動態は示さないであろうことも示唆してい
る。
さらに、負に荷電した分子（例えばヘパリン、ヘパラ
ン硫酸、コンドロイチン硫酸等）、可溶性のアデノウイ
ルスコート蛋白質によって、あるいはそのような負に荷
電した部分を切断する試薬（コンドロイチナーゼ、ヘパ
リナーゼ、シアリダーゼ等）で細胞を前処理することに
よって阻害されるはずの、それらの細胞への結合あるい
は遺伝子の送達の能力についてUTVまたはUTV様配列を含
んでいるベクターを評価することができる（例えばWick
hamら,Nature Biotechnology,14,1570−1573（1996）お
よび上記の実施例参照）。可溶性のファイバー蛋白質は
UTVベクターの細胞への結合の大部分を阻害することは
ないであろう（Wickhamら，（1996）、上述）。これら
の結果は、UTVまたはUTV様配列のペントン、ヘキソンあ
るいはファイバーへの組み込みが、キメラコート蛋白質
を含む組換えアデノウイルスの遺伝子導入をもたらすた
めの能力を減ずるものではないであろうことを示唆して
いる。
また、本発明のUTVベクターが、組換えアデノウイル
ス上のポリカチオンの血液中のポリアニオンでの飽和に
よる全身送達（systemic delivery）に限定されるもの
ではないことを確認するために、インビボでの感染ある
いは全血の存在下で行われるインビトロでのトランスフ
ェクションの検討を行うことができる。そのような結合
が粒子性ウイルスの標的細胞導入のための能力を妨げる
という場合には、該ウイルスを高用量で、好ましくはそ
のような高用量に伴ういかなる免疫応答も減ずることが
できるように分割して投与することができる（例えば、
アデノウイルスベクターの別の血清型の投与、あるいは
PCT国際出願WO96/12406に記載の技術;Mastrangeliら,Hu
man Gene Therapy,７,79−87（1996））。
ここに挙げた特許、特許出願、および刊行物を含むす
べての引例は、各個々の引例がここに完全に明らかにさ
れたと同程度に、言及することによってそっくりそのま
まそれにより組み入れられるものである。
本発明を、好ましい実施態様を強調して説明してきた
が、当業者には好ましい実施態様が変更され得ること、
本発明がここで具体的に記載された以外によっても実施
され得ることが自明であろう。本発明は、そのようなバ
リエーションや別の方法を包含することを意図してい
る。従って、本発明は添付の請求の範囲によって定義さ
れる該発明の精神と範囲に包含されるすべての変形を含
むものである。
配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人：ジェンベク、インコーポレイテッド （ii）発明の名称：細胞への遺伝子導入のためのベク
ターおよび方法 （iii）配列の数:12 （iv）通信住所： （Ａ）受信人：レイデグ、ボイト アンド メイヤ
ー、リミテッド （Ｂ）通り：ツー プルデンシャル プラザ、スイ
ート4900 （Ｃ）都市：シカゴ （Ｄ）州：イリノイ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号:60601 （ｖ）コンピューターリーダブル形式： （Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC 互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：パテントイン リリース＃1.
0,バージョン＃1.25 （vi）現在の出願人に関するデータ： （Ａ）出願番号:PCT （Ｂ）出願日:1996年11月27日 （vii）優先出願に関するデータ： （Ａ）出願番号:US 08/563,368 （Ｂ）出願日:1995年11月28日 （Ｃ）分類： （viii）アトニー／エージェント 情報： （Ｃ）参考／事件一覧表番号:74862 （２）配列番号１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号1: （２）配列番号２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号2: （２）配列番号３に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:8アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特色 （Ｃ）他の情報:XaaはLysまたはArg （xi）配列：配列番号3: （２）配列番号４に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:15アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号4: （２）配列番号５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:18アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号5: （２）配列番号６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:8塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号6: （２）配列番号７に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:30塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号7: （２）配列番号８に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:36塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（ゲノミック） （xi）配列：配列番号8: （２）配列番号９に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:55塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（合成） （xi）配列：配列番号9: （２）配列番号10に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:57塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（合成） （xi）配列：配列番号10: （２）配列番号11に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:43塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（合成） （xi）配列：配列番号11: （２）配列番号12に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ:21塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類:DNA（合成） （xi）配列：配列番号12:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:92） (31)優先権主張番号 ０８／７０１，１２４ (32)優先日 平成８年８月21日(1996．8．21) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 前置審査 (72)発明者 ブロー、ダグラス イー. アメリカ合衆国、メリーランド州 20832、オルネイ、シャロウブルック レーン、3900 (56)参考文献 １．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，1994，Ｖ ｏｌ．299，Ｎｏ．１，ｐ．49−58 ２. Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/075 A61K 48/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】コート蛋白質の内部配列中に、またはそれ
    に代えて挿入される非天然アミノ酸配列を含むキメラア
    デノウイルスコート蛋白質であって、 （ｉ）該非天然アミノ酸配列が、 ３または４以上の隣接する正に荷電したアミノ酸残基を
    含む非天然アミノ酸配列； ７つの隣接するリジン残基、アルギニン残基またはリジ
    ンおよびアルギニン残基を含む非天然アミノ酸配列； ３〜30の隣接するリジン残基を有するＣ末端非天然アミ
    ノ酸配列； 少なくとも１つのアミノ酸の欠失を含む天然アミノ酸配
    列を含む、３〜30の隣接するリジン残基を有するＣ末端
    非天然アミノ酸配列； ヘパリン結合配列を含む18アミノ酸からなるIGFBP−３
    とIGFBP−５に共通の塩基性Ｃ末端領域； HA受容体RHAMMのＣ末端の35アミノ酸領域内に位置する
    ２つのヒアルロナン結合モチーフのいずれか一方または
    両方； ヘパリン結合コンセンサス配列を含むスタフィロコッカ
    ス・アウレウスのビトロネクチンのヘパリン結合型を基
    に作られた合成ペプチド（Ala347−Arg361）； ウシヘルペスウイルス１の糖蛋白質g IIIのアミノ酸129
    と310の間の５つのヘパリン結合部位のいずれか１つま
    たは２つ以上； 偽狂犬病ウイルスの糖蛋白質g IIIのアミノ酸90と275の
    間の４つのヘパリン結合部位のいずれか１つまたは２つ
    以上； 偽狂犬病ウイルスの糖蛋白質g IIIのアミノ酸134〜141; ヒトリポ蛋白質リパーゼの279〜282位および292〜304位
    の荷電した残基に対応するヘパリン結合領域； ラミニンＡ鎖の十字領域由来の８アミノ酸残基ペプチ
    ド； セリンプロテアーゼインヒビター アンチトロンビンII
    Iのヘパリン結合領域に基づく合成ペプチドF123−G148; セリンプロテアーゼインヒビター アンチトロンビンII
    Iのヘパリン結合領域に基づく合成ペプチドK121−A134; APPのＮ末端ヘパリン結合領域； リジンおよびアルギニン残基含量が高いことを特徴とす
    るヘパリン結合表皮成長因子様成長因子の21アミノ酸フ
    ラグメント； トロンボスポンジンヘパリン結合領域を含む17アミノ酸
    フラグメント； hep1合成ペプチド； ヒトフォンビルブラント因子の23アミノ酸配列（Y565−
    A587）； 血小板因子４のヘパリン結合領域； 線維芽細胞増殖因子受容体であるチロシンキナーゼ膜貫
    通糖蛋白質中のK18K配列；または 配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配
    列番号５、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列
    番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号32、配列番
    号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号
    42、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号5
    0、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号5
    4、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号5
    8、配列番号73、配列番号74、配列番号76、配列番号7
    8、配列番号90および配列番号93からなる群より選択さ
    れる配列； であり、 （ii）以下の（ｉ′）〜（vi′）の１または２以上で特
    徴づけられるキメラアデノウイルスコート蛋白質。 （ｉ′）対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質よ
    りも広い範囲の動物細胞に結合し、且つ特定のタイプの
    動物細胞に選択的ではない； （ii′）上皮細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細
    胞、グリオブラストーマ細胞および単球細胞に結合す
    る； （iii′）野生型の血清型５ファイバー蛋白質よりも高
    い効率で、HA SMC細胞、HuVec細胞、CPAE細胞、HS 68
    細胞、MRC−５細胞、U118細胞およびTHP−１細胞に結合
    する； （iv′）対応する野生型アデノウイルスコート蛋白質よ
    りも広い範囲の動物細胞の表面に存在する部分に結合す
    る； （ｖ′）動物細胞の表面に存在する負に荷電した部分に
    結合する； （vi′）ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、デル
    マタン硫酸、シアル酸、ケラチン硫酸およびコンドロイ
    チン硫酸からなる群より選択される少なくとも１つの細
    胞表面部分に結合する
  2. 【請求項２】該非天然アミノ酸配列が配列番号４または
    配列番号５を含み、且つ３〜30の隣接するリジン残基を
    含む、請求の範囲１のキメラアデノウイルスコート蛋白
    質。
  3. 【請求項３】該非天然アミノ酸配列が該蛋白質の露出し
    たループ中に存在する請求の範囲１または２のキメラア
    デノウイルスコート蛋白質。
  4. 【請求項４】該非天然アミノ酸配列がスペーサー配列を
    含む、請求の範囲１〜３のいずれかのキメラアデノウイ
    ルスコート蛋白質。
  5. 【請求項５】該キメラアデノウイルスコート蛋白質がフ
    ァイバー蛋白質である、請求の範囲１〜４のいずれかの
    キメラアデノウイルスコート蛋白質。
  6. 【請求項６】該キメラアデノウイルスコート蛋白質がヘ
    キソン蛋白質またはペントン蛋白質である、請求の範囲
    １〜４のいずれかのキメラアデノウイルスコート蛋白
    質。
  7. 【請求項７】請求の範囲１〜６のいずれかのキメラアデ
    ノウイルスコート蛋白質を含むベクター。
  8. 【請求項８】請求の範囲１〜６のいずれかのキメラアデ
    ノウイルスコート蛋白質をコードするベクター。
  9. 【請求項９】該ベクターが非エンベロープ型ウイルスか
    らなる群より選択されるウイルスベクターである、請求
    の範囲７または８のベクター。
  10. 【請求項１０】該ウイルスベクターがアデノウイルスベ
    クターである、請求の範囲９のベクター。
  11. 【請求項１１】該ベクターが治療活性のある遺伝子を含
    むものである、請求の範囲７〜10のいずれかのベクタ
    ー。
  12. 【請求項１２】請求の範囲７〜11のいずれかのベクター
    を含む宿主動物細胞。
  13. 【請求項１３】該治療活性のある遺伝子を細胞内に導入
    および発現させ、それによって該細胞を遺伝的に修飾す
    るための、請求の範囲11のベクターを含有する薬剤。
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