KR20010102992A - 표적 ｒｎａ를 검출하는 비-침입적 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비하전 인-함유 골격 결합을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물의 경구 투여에 의해 생체내 특정 mRNA 서열을 표적화하는 방법을 제공한다. 하나 이상의 선택 표적 서열을 포함하는 생체내 RNA 의 존재를 검출하고 정량화하는 방법이 또한 개시된다. 본 발명의 방법은 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적 RNA 의 영역과 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 혼성화하는 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머를 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 올리고머는 또한 표적 RNA 와 세포내에서 복합체를 형성할 수 있고, 소변과 같은 체액에서 측정될 수 있는 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스일 때, 세포로부터 해리된다.

Description

표적 ＲＮＡ를 검출하는 비-침입적 방법{NON-INVASIVE METHOD FOR DETECTING TARGET RNA}
많은 질병 및 다른 의학 상태는 어떤 경우에는 단일 가닥 그리고 다른 경우에는 이중 가닥일 수 있는, 바람직하지 않은 DNA 또는 RNA 의 존재를 특징으로 한다. 이러한 질병 및 상태는 상보성 또는 다른 특이적 결합 수단을 통해 특이적 DNA 또는 RNA 표적 서열 표적화를 포함하는 안티센스 치료법 원칙을 사용하여 치료될 수 있다.
치료적 이용에서, 경구 투여를 위해 조제된 안티센스 올리고머는 일반적으로 생체 내 존재하는 편재된 뉴클레아제 효과 및 세포내에 침투하는 그들의 능력을 제한하는 분자의 전체적인 전하에 기인하는 제한된 성공을 충족시켰다.
진단 및 질병의 치료를 위한 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 개선된 경구 투여를 특정하는 많은 참조가 문헌에서 발견될 수 있다.
다양한 질병 상태의 진단 및 모니터가 상태와 관련된 펩티드, 단백질, 항체 또는 핵산의 분석으로 달성된다.
개인의 유전적 분석은 일반적으로 2 가지 형태의 정보에 초점을 맞춘다: 제 1 의 정보는 예를 들어, 낭성섬유증, 헌팅톤 질병과 같은 다양한 유전적 질병과 관련된 돌연변이 및 예를 들어, 유방암과 같은 유전적 돌연변이와 관련된 것으로 알려진 어떤 암의 분석이다. 제 2 의 정보는 예를 들어, 약제 치료에 대한 반응, 다양한 질병 또는 상태, 또는 다른 조직간의 유전자 발현 수준의 차이와 같은 어떤 상태하에서 유전자 발현의 상대적인 수준의 분석을 포함한다.
통상, 이 형태의 유전적 분석은 생체 외에서, 전형적으로 개인으로부터 혈액 샘플의 조직을 획득하는 단계, 어떤 돌연변이의 부재의 존재 또는 유전자 발현의 향상된 또는 억제된 수준에 대해 게놈 DNA, cDNA 또는 mRNA 를 분석하는 단계에 의해서 수행된다. 돌연변이 또는 발현 수준의 변화를 검출하기 위한 예를 들어, 유전자 칩과 진단 장치는 현재 이용가능하고 개발에 있어 새로운 가능성을 가진다.
유사한 방법이 개인에서 유전자 발현에 대한 치료적 화합물의 효과를 모니터하는 데 사용될 수 있다. 즉, 화합물 투여에 이어, 조직 생검 또는 혈액 샘플을 하나 이상의 표적화 유전자의 발현에 대한 화합물의 효과를 결정하기 위해 치료받은 환자로부터 얻을 수 있다.
이러한 생체내 방법에 의한 돌연변이 및 유전자 발현 수준의 분석은 유전자메이크업 및 개인별 약제 반응에 대한 중요한 정보를 산출하는 능력을 가지지만, 방법은 매우 실행불가능하고, 고비용이고/또는 원하는 정보를 제공할 수 없다. 예를 들어, 조직 샘플을 얻는 것의 어려움 및 환자에 대한 위험때문에, 그리고 분석을 위해 조직 샘플을 정밀검사하는 비용 때문에 유전자 발현을 모니터하기 위해 개인의 조직을 생검하는 것이 일반적으로 실행가능하지 않다.
그러므로, 유전자 돌연변이를 표적화 시킬수 있고, 개인으로부터 조직 또는 세포내 샘플 획득을 요구하지 않고, 이러한 세포 또는 조직으로부터 얻은 핵산 샘플을 측정하지 않은 방법에 의해 치료제에 반응하는 유전자 발현의 수준, 또는 유전자 발현을 모니터할 수 있는 것이 매우 바람직할 것이다.
발명의 개요
본 발명은 mRNA 표적에 의해 암호화된 유전자 산물의 조절된 발현을 초래하는 방식으로 비하전 인-함유 골격 결합을 가지는 뉴클레아제-내성 모르폴리노 안티센스 화합물의 경구 투여에 이해 대상의 생체내, mRNA 의 효과적인 표적화 방법을 제공함으로서 종래기술의 결핍을 해결한다. 한 양태에서, 안티센스 화합물은 바람직하게는 길이 약 8 내지 40 염기, 더욱 바람직하게는 12 내지 25 염기를 가진다.
다른 양태에서, 안티센스 화합물은 바람직하게는 도 2aa-2ae 에서 제시되고, 도 2b-b 에서 , X=NH2, Y=O, 및 Z=O 로 제시된 포스포로디아미데이트에 의해 구체적으로 예증된, 구조로 구성되는 군으로부터 선택되는 서브유닛간 결합을 가진다.
더 나은 양태에서, 모르폴리노 안티센스 화합물은 선택 표적 유전자의 번역개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함한다.
본 발명의 경구로 투여된 안티센스 올리고머에 대한 바람직한 표적 유전자는 예를 들어, 암과 같은 증식성 장애와 관련된 유전자이다. 표본적인 서열은 SEQ ID NO:2 로 확인된 것이다.
관련된 양태에서, 본 발명은 (a) 선택 유전자의 개시코돈, 및 비하전, 인-함유 서브유닛간 결합을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기서열을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적 RNA 의 영역에 혼성화하기 효과적인 양으로 대상에 투여하는 단계, (b) 올리고뉴클레오티드를 투여한 후에 선택된 시간에서 대상으로부터 체액 샘플을 취하는 단계, (c) 샘플내에서안티센스 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA 영역으로 구성되는 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 존재를 검출하는 단계에 의해 수행되는 대상에 표적 RNA 가 관련된 염기-특이적 세포간 결합 이벤트의 발생을 검출하는 방법을 제공한다.
방법의 수행에 있어서, 안티센스 올리고머는 약 8 내지 40 염기의 길이를 가지고 하기의 경구투여에 효과적인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 소변, 타액, 플라즈마, 또는 혈액, 바람직하게는 소변과 같은 체액내의 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스의 검출을 제공한다.
한 양태에서, 헤테로듀플렉스의 검출은 헤테로듀플렉스에 특이적인 항체와 샘플을 반응시키는 단계, 항체-헤테로듀플렉스 결합체의 존재를 검출하는 단계에 의해 수행된다.
다른 경우에, 본 발명의 방법은 리포터 분자를 포함하는 안티센스 올리고머를 제공하여 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스의 검출은 헤테로듀플렉스와 관련된 리포터 분자의 존재를 검출함으로서 수행되게 한다.
본 발명은 대상의 생물학적 상태에 접근하는 진단적 방법을 더 제공하고, 여기에서 생물학적 상태는 표적화 단백질의 발현과 관련되고 방법은 표적 유전자의 발현과 관련된 RNA 의 변화 검출에 사용된다.
하나의 바람직한 이용에서, 방법은 대상에서 치료제에 반응하는 표적 유전자의 발현 변화 검출에 사용될 수 있고, 여기에서 표적 RNA 는 예를 들어, 알려진 질병 상태와 관련된 유전자와 같은 선택 유전자의 발현에 의해 생산된 mRNA 이다.
본 발명은 치료적 및/또는 진단적 이용을 위해 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머의 1 회 또는 다중 이용에 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적과 혼성화하는 표적 RNA 에 상보적인 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머를 포함하는 대상에 표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포간 결합 이벤트의 발생을 검출하는 키트, 및 안티센스 올리고머 및 표적 RNA 사이에 형성된 헤테로듀플렉스를 검출하는 수단을 제공한다.
본 발명의 이러한 목적 및 특징은 하기의 발명의 상세한 설명을 수록된 도면과 결합하여 읽을 때 더욱 분명해 질것이다.
본 발명은 비하전 인-함유 골격 결합을 가지는 뉴클레아제-내성 모르폴리노 안티센스 화합물의 경구 투여에 의해, 대상의 생체내 mRNA 의 효과적인 표적화 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서 하나 이상의 표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포간 결합 이벤트의 검출을 위한 방법 및 키트에 관한 것이고, 여기에서 표적 RNA 를 포함하는 헤테로듀플렉스 및 안티센스 올리고머는 대상에서 취한 체액 샘플에서 검출된다.
도 1 은 폴리머 형성에 적합한 5-원자(A), 6-원자(B) 및 7-원자(C-E) 결합기를 가지는 몇개의 바람직한 서브유닛을 보여준다.
도 2aa-ee 는 각각 도 1 의 서브유닛 a-e 를 사용하여 제조된 aa 내지 ee 로 명명된 표본적인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복 서브유닛 절편을 보여준다.
도 3 은 시간(분) 동안 P450 안티센스 포스포로디티오에이트 모르폴리노 올리고머가 투여된 래트의 플라즈마에서 PMO 단량체의 소멸 및 RNA:PMO 헤테로다이머의 존재의 운동표시이다. 공개 박스는 포스포로디티오에이트 모르폴리노 올리고머에 상응하고, 폐쇄원은 RNA:포스포로디티오에이트 모르폴리노 올리고머 이량체에 상응한다.
정의
본원에 사용될 때, 하기의 용어는 다르게 나타내지 않는 한, 하기의 의미를 가진다.
본 원에 사용될 때, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 "안티센스 올리고뉴클레오티드"와 상호교환적으로 사용되고, 뉴클레오티드 염기서열 및 안티센스 올리고머가 와슨-크릭 염기 결합에 의해 RNA 의 표적 서열과 혼성화하도록 허용하여 표적 서열내의 RNA:올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하는 서브유닛 대 서브유닛 골격을 가지는 올리고머를 말한다. 올리고머는 표적 서열과 정확한 서열 상보성 또는 근사한 상보성을 가질 수 있다. 이러한 안티센스 올리고머는 올리고뉴클레오티드가 이중-가닥 결합제인 경우에 표적 서열을 포함하는 mRNA 의 번역을 차단 또는 저해하거나 유전자 전사를 저해할 수 있다.
본원에 사용될 때, "안티센스 올리고머 조성물" 은 본 발명의 RNA 검출 방법에 사용하기 위한 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 조성물을 말한다. 어떤 경우에, 이러한 "안티센스 올리고머 조성물"은 다수의 안티센스 올리고머를 포함한다.
본 원에 사용될 때, 용어 "화합물", "약제", "올리고머" 및 "올리고뉴클레오티드" 는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관하여 상호교환적으로 사용될 수 있다. 용어는 뉴클레오티드 염기 서열 및 안티센스 올리고머가 와슨-크릭 염기 결합에 의해 RNA 의 표적 서열과 혼성화하도록 허용하여 표적서열과 RNA:올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하는 서브유닛-서브유닛 골격을 말한다. 올리고머는 표적 서열과 정확한 서열 상보성 또는 근사한 상보성을 가질 수 있다. 이러한 안티센스 올리고머는 표적 서열을 포함하는 mRAN 의 번역을 차단 또는 저해할 수 있거나, 유전자 전사를 저해할 수 있거나, 이중-가닥 또는 단일 가닥 서열과 결합할 수 있고, 혼성화할 수 있는 서열에 "특이적" 인 것으로 말해질 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 안티센스 올리고머의 표본적인 구조는 도 1a-e 에서 보여진 모르폴리노 서브유닛 형태를 포함한다. 폴리머가 하나이상의 결합형을 포함할 수 있다는 것이 분명해 질 것이다.
도 1 의 서브유닛 A 는 도 2 의 a-a 에서 보여진 5 원자 반복-단위 골격을 형성하는 1-원자 인-함유 결합을 포함하고, 여기에서 모르폴리노환은 1-원자 포스폰아미드 결합으로 결합된다.
도 1 의 서브유닛 b 는 도 2 의 b-b 에서 보여진대로, 6-원자 단위 반복 골격으로 설계된다. 구조 b 에서, 인산기와 5' 모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y 는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인으로부터 돌출된 X 부분은 플루오르; 알킬 또는 치환 알킬; 알콕시 또는 치환 알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는, 환형 구조를 포함하는 비치환, 단일치환, 또는 이중치환 질소의 어느 것일 수 있다.
도 1 의 구조 c-e 는 도 2 의 c-c 내지 e-e 에 제시된대로 7-원자 단위-길이 골격으로 설계된다. 구조 C 에서 , X 부분은 구조 B 에서와 같고, 부분 Y 는 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 구조 D 에서, X 및 Y 부분은 구조 B 에서와 같다. 구조 E 에서, X 는 구조 B 에서와 같고, Y 는 O, S, 또는 NR 이다. 도 1 a- e 에서 제시된 모든 서브유닛에서, Z 는 O 또는 S 이고, Pi또는 Pj는 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실이다.
본원에 사용될 때, "모르폴리노 올리고머"는 전형적인 폴리뉴클레오티드와 수소결합할 수 있는 염기를 지지하는 골격을 가지는 폴리머 분자를 말하고, 여기에서 폴리머는 5 탄당 골격 부분, 더욱 구체적으로는 뉴클레오티드 및 뉴클레오사이드에 전형적인 포스포디에스테르 결합으로 연결된 리보스 골격이 부족하지만, 대신에 환 질소를 통해 결합하는 환 질소를 포함한다. 바람직한 "모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 도 2b 에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, 여기에서, (i) 구조는 인접 서브유닛의 5'환외 탄소에 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 연결하면서 1 내지 3 원자 길이의 인-함유 결합으로 함께 연결되고, (ii) Pi및 Pj는 폴리뉴클레오티드에서 염기에 염기-특이적 수소 결합에 의한 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 부분이다.
본 원에 사용될 때, 용어 "PMO" 는 하기에 더 개시될 때, 포스포디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 말하고, 여기에서 올리고머는 약 8-40 염기의 길이, 바람직하게는 12-25 염기의 길이 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명의 바람직한 양태는 도 2b 에서 제시되고, 이것은 포스포로디아미데이트 결합으로 결합된 두개의 이러한 서브유닛을 보여준다.
본 발명의 바람직한 양태는 도 2b 에서 제시되고, 이것은 포스포로디아미데이트 결합으로 결합된 두개의 이러한 서브유닛을 보여준다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고모 포함)는 예를 들어, 공유 U.S 특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185,444, 5,521,063,및 5,506,337 에 개시되고, 모든 특허는 본원에 참고문헌으로 특별히 수록된다.
본원에 사용될 때, "뉴클레아제-내성" 올리고머 분자(올리고머)는 그것의 골격은 포스포디에스테르 결합의 뉴클레아제 절단에 쉽게 놓이지 않는 것이다. 표본적인 뉴클레아제 내성 안티센스 올리고머는 포스포로티오에이트 및 포스페이트-아민 DNA (pnDNA)와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체이고, 양자는 모두 하전된 골격, 및 메틸-포스포네이트, 모르폴리노, 및 펩티드 핵산(PNA) 올리고뉴클레오티드를 가지고, 모두는 비하전 골격을 기진다.
본원에 사용될 때, 올리고머가 37℃ 보다 상당히 높은 Tm , 바람직하게는 적어도 50 ℃, 및 전형적으로 60 ℃-80 ℃ 또는 그 이상의 생리적 상태하에서 표적에 혼성화한다면, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고머는 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 혼성화"한다. 이러한 혼성화는 바람직하게는 규정된 이온 강도 및 pH 에서 특이적 서열에 대한 융점(T[m])보다 약 10 ℃, 및 바람직하게는 약 5℃ 낮게 선택된 엄격한 혼성화 조건에 상응한다. 허여된 이온 강도 및 pH 에서, T[m] 은 50 % 의 표적 서열이 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 온도이다.
폴리뉴클레오티드는 혼성화가 두개의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 역평행 구조에서 발생할 때 서로 "상보적인" 것으로 기술된다. 혼성화가 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 제 2 의 폴리뉴클레오티드의 하나의 가닥 사이에서 발생한다면, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 서로 폴리뉴클레오티드에 "상보적" 일 수 있다. 상보성(하나의 폴리뉴클레오티드가 서로 상보적인 정도)은 일반적으로 허용되는 염기-쌍 규칙에 따라, 서로 수소결합을 형성하는 것으로 기대되는 반대 가닥의 염기 비율의 관점에서 정량화될 수 있다.
본원에 사용될 때, 용어,"암-특이적 항원" 은 암 세포에 의해 발현되고 정상 또는 비-암 세포에서는 발현되지 않는 항원을 말한다.
본 원에 사용될 때, "암-관련 항원"은 암세포에서 발현될 수 있으나, 본원에서 c-myc 로 예증된 정상 또는 비-암 세포에서 발현될 수 없는 항원을 말한다.
본 원에서 사용될 때, "c-myc 항원 올리고머"는 c-myc 핵산 서열에 상보적 또는 거의-상보적으로 높은 친화성(즉, "특이적으로 혼성화" )을 가지는 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고머를 말한다.
본 원에서 사용될 때, 폴리뉴클레오티드의 서열이 폴리뉴클레오티드의 제 2 의 서열에 특이적으로 결합하는 제 1 의 서열이라면, 제 1 의 서열은 제 2 의 서열에 관하여 "안티센스 서열"이다.
본원에서 사용될 때, "표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포간 결합 이벤트"는 세포내에서 표적 RNA 서열과 올리고머의 특이적 결합을 말한다. 이러한 결합의 염기 특이성은 서열 특이적이다. 예를 들어, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 서열에서 상보적인 단일-가닥 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
본원에 사용될 때, "뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스"는 편재하는 세포내 및 세포외 뉴클레아제에 의한 생체내 분해에 내성이 있는 그것의 상보적인 표적에 안티센스 올리고머의 결합에 의해 형성된 헤테로듀플렉스를 말한다.
본원에서 사용될 때, mRNA 또는 다른 핵산 서열에 관한 용어 "표적"은 바람직하게는 조혈성 스템 세포에서 발현되는 mRAN 또는 다른 핵산 서열을 말한다. 바람직하게는 발현은 유전자가 더욱 분화된 세포에서 발현되는 것보다 더 큰 범위로 조혈성 스템 세포에서 발현되거나, 조혈성 스템 세포에 발현 특이적이고 더욱 분화된 세포에서 검출가능하지 않은 같은 유전자로부터 유래된 표적 mRNA 를 의미한다.
본원에서 사용될 때, 올리고뉴클레오티드에 관한 "발현 조절"은 RNA 의 발현, 또는 번역을 방해하는 허여된 단백질 발현을 증가 또는 감소시키는 안티센스 올리고머의 능력을 말한다. 증가된 단백질 발현의 경우에, 안티센스 올리고머는 예를 들어, 종양 억제 유전자와 같은 억제 유전자의 발현을 차단할 수 있다. 감소된 단백질 발현에서, 안티센스 올리고머는 주어진 유전자의 발현을 직접적으로 차단할수 있거나 그 유전자로부터 전사된 RNA 의 증가된 분해에 기여한다.
본원에 사용될 때, 안티센스 올리고머에 관한 "유효량"은 대상의 체액에서 연이어 검출가능한 표적 RNA 및 안티센스 올리고머 사이의 헤테로듀플렉스를 형성하는 선택 표적 서열 모두 또는 부분과의 특이적 혼성화에 효과적인, 1 회 투여량 또는 일련의 투여량의 일부로서 포유동물 대상에 투여된 안티센스 올리고머의 양을 말한다.
본 원에 사용될 때, 개인 또는 세포의 "치료"는 개인 또는 세포의 천연 코스를 변형시키려는 시도로서 어느 형태의 중재이다. 치료는 예를 들어, 제약학적 조성물을 제한없이 포함하고, 예방적으로, 또는 병원균 이벤트의 개시 또는 병인제와의 접촉에 연이어 수행될 수 있다.
본원에 사용될 때, "체액"은 소변, 타액, 플라즈마, 혈액, 척수액, 및 생물학적원의 다른 액체 샘플로부터 얻은 다양한 샘플 형태를 포함하고, 그안에 현탄된 세포 또는 세포 단편, 또는 액체 배지 및 그것의 융출액을 포함한다.
용어 "상대량"은 시험 측정과 대조 측정 사이에서 만들어진 비교에서 사용된다. 반응에서 복합체를 형성하는 상대적인 시약의 양은 대조 표본과 반응하는 양과 비교할 때, 시험 표본과 반응하는 양이다. 대조 표본은 같은 분석에서 분리되어 시험되거나, 그것은 같은 샘플의 일부일 수 있다. (예를 들어, 조직 절개에서 종양성 부위를 에워쌓는 정상 조직)
본원에 사용될 때, 용어 "증식성 장애"는 비정상적 세포 증식을 특징으로 하는 상태를 말하고, 형태학적으로 그리고/또는 유전학적으로 주변 조직과 다른 악성뿐만 아니라 비-악성 세포 군에 적용될 수 있다.
본원에 사용될 때, 용어 "종양" 및 "암"은 성장 조절의 상실을 나타내고 비정상적으로 세포의 큰 클론을 형성하는 상태를 말한다. 종양 또는 암 세포는 일반적으로 접촉 억제를 상실했고 침입적일 수 있고/또는 전이능력을 가진다.
본원에 사용될 때, 암환자에 관한 용어 "개선된 치료적 결과"는 암세포 또는 확실한 종양의 성장을 늦추거나 감소, 또는 암세포의 총 수 또는 총 종양 부담의 감소를 말한다.
II.본 발명의 방법
본 발명의 방법은 상동성 또는 근사한 상동성 표적 RNA 에 높은 친화성으로 결합하는 데 효과적인 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드 유형의 효과적인 경구 투여를 위한 수단을 제공한다.
본 발명은 더욱이 표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포간 결합 이벤트의 발생을 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 뉴클레아제-내성 안티센스 모르폴리노 올리고머, 또는 더욱 일반적으로는 상보성 또는 근사한-상보성 표적 RNA 에 높은 친화성을 가지고 결합할 수 있는 뉴클레아제-내성 모르폴리노 올리고머가 개인에게 투여될 수 있고, 연이어 안티센스 올리고머 및 표적 RNA 의 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 형태로 예를 들어, 소변과 같은 체액에서 검출될 수 있다는 발견에 기초한다.
발견의 기초적인 메카니즘은 청구된 발명의 일부는 아니지만, 발견은 경구로 투여된 안티센스 올리고머가 (i) 체내의 세포로 이동하고 침투할 수 있고, (ii) 표적 RNA 의 상보성 또는 근사한-상보성 표적 영역과 와슨-크릭 염기 쌍에 의해 높은 친화성으로 결합하여, RNA 의 표적 영역과 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있고, (iii) 그것의 발현을 차단할 수 있다는 것을 제시한다.
본 발명의 검출방법에서, 발견은 일단 투여된 안티센스 올리고머는 (i) 체내의 세포로 이동하고 침투할 수 있고, (ii) 표적 RNA 의 상보성 또는 근사한-상보성 표적 영역과 와슨-크릭 염기 쌍에 의해 높은 친화성으로 결합하여, RNA 의 표적 영역과 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있고, (iii)RNA 의 헤테로듀플렉스 영역을 뉴클레아제-분해로부터 보호할 수 있고, (iv) 세포를 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 형태로 혈액으로 유출하고, (v) 예를 들어, 혈액, 소변, 타액등과 같은 체액에서 검출에 충분한 양으로 혈액에서 생존할 수 있다는 것을 제안한다.
A.안티센스 올리고머 화합물 및 조성물
경구로 송달된 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드를 위한 표적
본 발명의 방법에서 사용을 위한 바람직한 표적은 (1) 발생학적으로 그리고/또는 조직 조절된 ; (2) 다양한 질병상태, 구체적으로는 증식성 장애에서 상향-또는 하향-조절된; (3) 환경적 자극에 반응하는 상향- 또는 하향-조절된; 그리고 (4) 치료적 기간에 의해 변형된 RNA 또는 이러한 치료적 기간에 의해 변형된 RNA 의 발현을 포함한다.
어떤 유전적 질병은 정상 조직에서는 존재하지 않는 유전자의 존재를 특징으로 한다. 다른 질병 상태는 정상 세포에서 발현되지 않는 RNA 또는 RNA 번역 산물(즉, 펩티드 또는 단백질)의 변형된 발현을 특징으로 한다. 어떤 질병 상태는 어떤유전자 또는 유전자의 부분의 부재, 또는 유전자 산물 또는 단백질의 발현의 부재 또는 변형을 특징으로 한다.
본 발명의 방법은 질병 상태, 구체적으로 유전적 질병과 관련된 유전자의 발현을 조절 및/또는 모니터하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 구체적인 질병 상태와 관련된 안티센스 올리고머의 주기적 투여 및 대상의 소변에서 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스의 모니터는 특정 질병 상태와 관련된 것으로 당업자에게 알려진 유전자의 발현 검출에 사용될 수있다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 질병 상태의 초기 중재를 위한 수단, 치료적 올리고뉴클레오티드를 투여하는 방법 및 특정 질병 상태와 관련된 RNA(들) 의 존재를 모니터하는 방법을 제공한다. 표본적인 질병상태는 예를 들어, 낭성섬유증, 유방암과 같은 암, 헌팅톤 질병 및 다른 공지된 유전적 질병을 포함한다.
본 발명의 방법은 더욱이 그 자체로 특정 질병 상태 또는 의학적 상태에 특이적인 서로 다르게 발현된 RNA 에 각각 특이적인 다수의 안티센스 올리고머를 투여함으로서 다수의 의학 상태의 어느 것에 대한 스크리닝에의 이용을 발견한다.
두가지 형태의 변형된 유전자 발현은 서로 다른 암 세포에서 함께 또는 독립적으로 발생하는 것이 관찰되었다 [Bishop,Cell(1991) 64;235-248 ;US 특허번호 5,776,683] . 첫번째 형태에서 분명하게 악성 성장 방해에 작용하는 열성 종양 억제 유전자의 감소된 발현이 있다. 두번째 형태에서, 악성 성장 촉진에 작용하거나, 악성에 중요한 어떤 다른 표현형 제공에 작용하는 종양유전자와 같은 우성 유전자의 증가된 발현이다. 유전자의 어떤 형태의 발현의 변형은 대상에 예를 들어, 종양억제 유전자 또는 종양유전자에 특이적인 안티센스 올리고머의 투여에 이어서, 대상의 체액에서 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스의 검출에 의해 모니터될 수 있는 잠재적인 진단성 지시자이다.
암에서 관찰되는 세포내 기능의 변화는 광범위한 원으로부터 발생한다. 어떤 경우에, 변화는 세포내 인자에 의해 유발되고, 다른 경우에, 변형은 악성 형질전환을 일으킨다. 예를 들어, 정상 유전자에서 돌연변이는 원형-종양유전자가 ras 가 점 돌연변이에 의해 형질전환되어 종양유전자가 되는 경우와 같은 세포의 악성 형질전환을 초래할 수 있다. 원숭이 바이러스 40 (SV40) T-항원은 광범위한 기능을 나타내는 또 다른 종양유전자 발현 산물이다 [Fanning,E.,and Knippers, R., Annul.Rev.Biochem.61:55-85(1993)];5,843,737]. 체세포에서 원형-종양유전자의 돌연변이는 증가일로로 인간 암 유발에 중요하게 인식된다. 이러한 돌연변이에 의해 형성된 종양유전자의 어떤 예는; neu, neu/erbB2, fes, fos, myc, myb, fms, Ha-ras, 및 Ki-ras 를 포함한다. 원형-종양유전자를 종양유전자로 전환시키는 돌연변이는 종종 점 돌연변이이다. [U.S. 특허번호 5,843,684 참조] 이러한 돌연변이화된 유전자의 발현으로 형성된 RNA 는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 안티센스 올리고머의 설계를 위한 주형으로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법을 사용하는 RNA 발현의 평가를 위한 다른 표적은 광범위한 화학요법제에 내성이 있는 암 세포와 관련된 RNA 에 특이적인 안티센스 올리고머를 포함한다. 표본적인 표적은 P-당단백질, 복합약제 내성-관련 단백질(MRP), 및 폐 내성 단백질 (LRP) 을 포함한다 [Stein,U.et al.,J Natl Cancer Inst 89:807-813(1997)참조]
한 양태에서, 본 발명의 경구 송달 방법은 예를 들어, 암환자와 같은 대상에 치료 양생법의 일부로서 안티센스 올리고뉴클레오티드 송달에 사용될 수 있다. 이러한 치료의 표본적인 표적은 SEQ ID NO:2 로서 제시된 서열로 예증된 c-myc 에 대한 모르폴리노 올리고머 안티센스를 포함한다.
많은 종양유전자, 종양 억제 유전자 및 암 및 다른 질병상태와 관련된 다른 RNA 에 대한 서열이 당업계에 알려지고 공개 데이타베이스로서 쉽게 이용가능하고, 치료를 위한 안티센스 올리고머의 설계 및 그것의 검출을 위해 사용될 수 있다.
p53 유전자와 같은 종양-억제 유전자, 망막종양 유전자 및 윌 종양 유전자는 또한 악성 형질전환과 관련된다. 모든 대립 유전자가 돌연변이화된 경우에, 종양 억제 유전자의 부재는 종양형성의 증가를 초래하므로 표현형은 열성이다. 이러한 유전자의 정상 발현은 전형적으로 체크되지 않은 세포내 성장을 방지하는 반면에, 그들의 돌연변이는 세포 성장이 체크되지 않도록 하여 세포의 악성 형질전환을 일으킨다. 상당한 관심이 이러한 부류, 세포내 조절에서 그것의 복합체의 역할때문에 특히 p53 의 모든 요소에 집중되었다 [Science 262:1958-1961(1993);US 특허번호 5,843,684]. 이러한 유전자에서 돌연변이는 방광, 뇌, 유방,경부, 결장, 식도, 후두, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 및 갑상선을 포함하는 광범위한 인잔 종양과 관련되었다. 따라서, p53 은 본원에 개시된 대로, 모로폴리노 안티센스 올리고머의 경구 송달에 의해 표적화될 수 있다.
DNA 회복 시스템의 요소는 또한 세포, 구체적으로는 세포의 악성 형질전환에극적으로 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 최근에 인간에서 미스매치 회복 시스템이 발견되었다 [Fishel.,R, et al.,Cell 75:1027-1038(1993); Leach, F.S., et al.,Cell 75:1215-1225(1993); and Parsons,R.,Cell 75: 1227-1236(1993)]. 이러한 시스템의 요소는 인간 미스매치 회복 유전자 hMSH2 를 포함한다. 이러한 유전자에서 돌연변이는 유전성 비-폴립증 결장 암(HNPCC)을 포함하는 다양한 암과 관련되어있다 (Aaltonen,L.A.,Science 260: 812-816(1993)] 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 회복 시스템을 모티터하는 데 유용성을 발견한다.
게다가, 본 발명의 방법은 억제 유전자의 발현 재개시, 또는 종양유전자와 같은 우성 유전자의 발현 감소를 요구하는 치료 전략을 모니터하는 데 유용하다. 바람직한 질병은 암, 구체적으로는 방광, 뇌, 경부, 결장, 식도, 후두, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 및 갑상선 암을 포함한다.
본 발명의 방법이 사용될 수 있는 표본적인 질병 상태는 만성 골수종 종양(CML) 을 가진 환자의 경감도 측정하는 것이다. 통상 사용되는 표준 방법은 중기에서 유래된 골수의 세포유전 분석, 종양유전자 서열의 근위 또는 이러한 유전자의 파괴를 검출하기 위한 염색체의 형광 제자리 혼성화(FISH)분석, 종양유전자(BCR-ABL)전사체의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 역전사 폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR), 및 BCR-ABL 단백질의 존재 또는 부재를 결정하기 위한 세포 용균의 웨스턴 블럿 분석에 사용된다. 각각의 이러한 기법은 구체적인 잇점 및 함정을 가지고, 일반적으로 생검 또는 혈액 수집을 요구한다. 따라서, 이러한 기법은 일반적으로 연구 실험실에 제한되고, CML 환자의 경감도를 모니터하는 수단에 대한요구가 존재한다 [Cross,N.C.P., Bailliere's Clin. Haematol.2:389-403(1997)].
본 발명의 방법은 RNA 발현 평가를 위한 비-침입적 과정으로 CML 과 같은 질병 상태를 치료 및/또는 모티터하는 과정을 제공한다.
발현 RNA 를 검출하는 유효하고 효과적인 수단을 제공함으로서, 본 발명의 방법은 유전자가 복제되거나 복제 될 수 있고 정지상태에 있지 않고도, 암(또는 다른 질병상태)에서 과발현될 수 있는 유전자 그자체의 검출 방법에 대한 잇점을 제공한다.
게다가, 본 발명은 종양 억제 유전자 또는 종양유전자 그 자체는 아니지만, 암과 같은 질병 상태의 결과로서 발현된 유전자의 변형된 발현을 검출 또는 모니터하는 수단을 제공한다. 그럼에도 불구하고 이러한 유전자 발현의 평가는 진단성 및/또는 예후성 상태일 수 있다. 예를 들어, 내피 성장 인자 수용체는 45 % 의 유방암 종양에서 과별현되고[Klijn et al.,Endocrine Rev.13:3-17(1992)], IGF-1 수용체는 50-93% 의 유방암 종양에서 과발현된다[Berns et al.,Cancer Res.52:1036-1039(1992)].
성장 인자의 변형된 발현은 질병상태를 초래할 수 있거나 그것의 원인이라는 것이 증명되었다. 예를 들어, 신경 성장 인자 및 섬유아세포 성장 인자는 동물 모델의 알츠하이머병에서 뉴론 세포 성장에 영향을 주는 것을 보였고, 이러한 성장 인자를 암호화하는 핵산의 투여를 포함하는 치료법이 연구 중에 있다[예를 들어, U.S. 특허번호 5,580,859 참조]
본 발명의 방법은 그 자체로 특정 유전자, 및/또는 다양한 질병 상태에서 상향- 또는 하향-조절되는 발현인자의 발현에 의해 생산되는 mRNA 의 수준에 영향을 주는 단백질 또는 다른 분자와 같은 유전자 발현을 조절하는 인자의 발현 평가에 사용될 수 있다. 이러한 인자는 무엇보다도 호르몬, 사이토킨, 세포내 메신저, 전사인자, 발암인자를 포함한다.
작은-세포 폐 암과 관련된, bcl-2 단백질 발현의 하향-조절에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 영향은 진행중인 임상 시험의 대상이다 [예를 들어, Ziegler.A et al.,[J Natl Cancer Inst 89 :1027-1036(1997)]. 본 발명의 방법은 안티센스 올리고머의 주기적 투여 및 이러한 연구에 참여하는 환자 소변의 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스의 모니터에 의해서 유전자 치료법과 같은 시험을 모니터하는 데 사용될 수 있다 [예를 들어, 5,843,684 참조]
본 발명의 방법은 RNA 스플라이싱 이벤트를 진단하고 모니터하는 데 또한 사용될 수 있다. 스플라이싱 과정은 pre-mRNA 및 연이은 엑손의 결합으로 인트론의 제거("제 1 의 전사체" 또는 "pre-mRNA" 내의 RNA 로 전사될 DNA 에 끼어든 비-암호화 영역)를 포함한다. 이상 스플라이싱은 pre-mRNA 내에 돌연변이가 존재하는 경우에 발생할 수 있다. (예를 들어, US 특허번호 5,527,274 참조) 안티센스 치료법은 이러한 이상 스플라이싱 교정에 사용되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 치료법의 결과를 모니터하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 더욱이 많은 미생물의 어느 것에 의한 대상의 감염 및 이러한 감염에 대한 치료적 간섭의 효과 모니터에서 유용성이 있다. 더욱 구체적으로는, 특정 바이러스, 세균 또는 균류에 의한 감염은 진단될 수 있고, 본 발명의 방법을 사용하여 이러한 감염과 관련된 RNA 발현을 평가함으로서 치료법이 모니터될 수 있다. 많은 수의 감염성 미생물과 관련된 특징적인 핵산 서열은 공개 데이타베이이로 이용가능하고 본 발명의 방법에 사용을 위한 특정 안티센스 올리고머의 유전적 설계의 기초로 기능할 수 있다.
예를 들어, 전형적 바이러스 감염 (CMV 와 같은 잠재성 바이러스의 발현으로 유발된 것)은 면역형광분석법, 폴리머라제 사슬 반응(PCR), 및/또는 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 감염된 조직 또는 혈액의 분석으로 모니터된다. 본 방법은 감염과 관련된 바이러스 RNA 에 특이적인 안티센스 올리고머를 대상에 투여하고, 대상의 소변에서 올리고머를 포함하는 헤테로듀플렉스의 연이은 분석에 의한 비-침입적 과정에 의한 활성 감염의 통상적 모니터 방법의 잇점을 제공한다.
B.모르폴리노 안티센스의 잇점
모르폴리노 서브유닛은 (i) 5 탄당 골격 부분, 더욱 구체적으로는 리보스 골격 부분이 결핍되고, (ii) 모르폴리노-기초 서브유닛 군내의 골격 부분은 환 질소를 포함하고, (iii) 모르폴리노-서브유닛 폴리머의 서브유닛에 결합하는 골격은 환 질소에 의한다는 점에서 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오티드 서브유닛과 다르다.
모르폴리노-기초 서브유닛의 중요한 화학적 성질은 안정한, 비하전 골격 결합에 의해 폴리머 형성으로 연결될 수 있는 능력, 및 그렇게 형성된 폴리머가 높은 친화성을 가지고 표적 RNA 를 포함하는 상보적-염기 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 능력이다.
모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 서브유닛 사이의 결합의 형태에 의해 다른형태의 올리고뉴클레오티드와 구별되고, 하기의 방법에서 다르다.
포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 천연 폴리뉴클레오티드는 두개의 상보적 가닥의 Tm (융점) 에서 측정될 때, 상보적-가닥 DNA 및 RNA 에 상대적으로 높은 결합 친화성을 가진다. 생리적 상태하에서, 전형적인 20 mer DNA 가닥은 상보적-가닥 DNA 와 쌍을 형성할 때, 약 72 ℃ 의 Tm 을 가지고, 상보적인-가닥 RNA 와 쌍을 형성할 때, 약 77 ℃ 의 Tm 을 가진다. 이러한 듀플렉스의 양 가닥은 하전된 골격을 가진다.
하전된 포르포디에스테르 연결이 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 같은 다른 하전된 연결로 치환된 폴리뉴클레오티드는 천연 폴리뉴클레오티드에 대한 결합 친화성에서 중요한 손실을 보이고 같은 수의 뉴클로베이스를 포함하는 비하전 올리고뉴클레오티드보다 세포내 섭취면에서 높은 농도를 요구한다.
하전된 포스포디에스테르 연결이 예를 들어, 메틸스포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 및 카르보네이트와 같은 비하전 연결로 치환된 폴리뉴클레오티드는 모두 포스포디에스테르-연결 폴리뉴클레오티드와 비교할 때 DNA 또는 RNA 와의 결합 친화성에서 중요한 감소를 보였다.
따라서, 최적의, 비하전 연결로 연결된 모르폴리노-기초 서브유닛으로 제조된 올리고뉴클레오티드는 상보적-가닥 RNA 또는 DNA 와 쌍을 형성할 때 높은 결합 친화성에 바람직하다.
C.표본적인 c-myc 안티센스 화합물
c-myc 는 세포 성장 및 분화를 조절하는 원형-종양유전자이고 혈관재모델링, 평활근 세포 증식 및 세포외 기질 합성 조절의 과정에 관여할 뿐만 아니라 게다가, 아포토시스에서 역할을 한다. c-myc 의 이상 발현은 종종 인간 암에서 관찰된다. c-myc 의 이상, 구성적 또는 과발현은 폐암, 결장직장 암, 유방암, 방광암, 종양, 폐암등을 포함하는 많은 인간 암과 관련되었다.
myc 원형-종양유전자는 예를 들어, ECA39,p53, 오르니틴 디카르복실라제 (ODC), 알파-프로티모신 및 Cdc 25 A 를 포함하는 다른 유전자의 발현을 직접 조절하는 전사 인자로 개시되었다 (Ben-Yosef,T.,et al.,Oncogene 17(2):165-71,1998).
몇 개의 종양유전자 mRNA 의 시험관내 번역은 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 성공적으로 차단됨을 보였다. (c-myc:McManaway, et al.,Lancet 335:808,1990; Watson, et al.,Cancer Res. 51.3996,1991;bcl-2:Reed, et al., Cancer Res.50:6565,1990;myb:Calabrett, et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2351,1991;bcr-ab:Szcylik,et al.,Science 253:562 1991).
본 발명에 따라서, (i) 선택 유전자의 번역 개시코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드, 및 (ii) 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 가지는 경구로 투여된 모르폴리노 안티센스 화합물은 37 ℃ 보다 상대적으로 높은 Tm 을 가진 생리적 조건하에서, 표적 mRNA 내에 포함된 표적 서열에 혼성화할 것이다. 본 발명의 증명을 위해 수행된 시험관 내 및 동물-모델 연구에서 이러한 안티센스 화합물은 (i) 하기의 경구 투여로 효과적으로 섭취되고;(ii) 표적 mRNA 의 번역 저해에 세포내적으로 작용하고, (iii) 예를 들어, 포스포로티오에이트 안티센스 화합물과 같은 다른 형태의 안티센스 화합물 보다 이러한 저해에 훨씬 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징은 상기 언급된 U.S. 특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337 에 상세하게 개시되고, 모든 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 수록된다. 본 발명의 안티센스 올리고머(화합물)는 상기 언급된 특허에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛으로 구성되고, 여기에서 (i) 모르폴리노기는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 연결하면서 1 내지 3 원자의 길이로 비하전 인-함유 연결로 함께 연결되고, (ii) 모르폴리노기에 부착한 염기는 폴리뉴클레오티드의 염기에 염기-특이적 수소 결합으로 결합하기에 효과적인 퓨린-피리미딘 염기-쌍이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 부분은 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 이러한 올리고머의 제조는 U.S. 특허번호 5,185,444(Summerton and Weller,1993) 에 상세하게 개시되고, 이것은 그것의 전체가 참고문헌으로 본원에 수록된다 참고문헌에서 보여진대로, 몇개 형태의 비이온 결합은 모르폴리노 골격 제조에 사용될 수있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 표본적인 골격 구조는 도 1 a-e 에서 보여진 β-모르폴리노 서브유닛 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 연결형을 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도1 의 서브유닛 A 는 모르폴리노 환이 1-원자 포스포아미드 결합으로 연결된 도 2 의 a-a 에서 보여진 5 원자 반복-단위 골격을 형성하는 1-원자 인-함유 결합을 포함한다.
도 1 의 서브유닛 B 는 도2 의 b-b 에서 보여진대로, 6-원자 반복-단위 골격으로 유전적으로 설계된다. 구조 B 에서, 인산기에 5'모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y 는 황, 질소, 탄소, 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인으로부터 늘어진 X 부분은 플루오린; 알킬 또는 치환 알킬;알콕시 또는 치환 알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는, 환 구조를 포함하는 비치환, 단일치환, 또는 이중치환 질소의 어느 것일 수 있다.
도 1 의 서브유닛 C-E 는 도 2 의 c-c 내지 e-e 에 제시된 대로 7-원자 단위-길이 골격으로 유전적으로 설계된다. 구조 C 에서, X 부분은 구조 B 에서와 같고, 부분 Y 는 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 구조 D 에서, X 및 Y 부분은 구조 B 에서와 같다. 구조 E 에서, X 는 구조 B 에서와 같고, Y 는 O, S, 또는 NR 이다. 도 1a-e,z 에 개시된 모든 서브유닛에서, Z 는 O 또는 S 이고 Pi또는 Pj는 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실이다.
바람직한 " 모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 도 2 b-b 에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, 여기에서 (i) 구조는 인접한 서브유닛의 5'환외 탄소에 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소가 결합된 1 내지 3 원자 길이의 결합을 포함하는 포스포로디아미데이트에 의해 함께 연결되고, (ii) Pi및 Pj는 폴리뉴클레오티드내의 염기에 염기-특이적 수소 결합으로서 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기쌍 부분이고, X=NH2, Y=O , 및 Z=O 이다.
상기에 언급된 대로, 올리고뉴클레오티드 화합물은 표적 RNA 의 개시코돈을 포함하는 서열을 가지고, 이는 화합물이 AUG mRNA 번역 개시 위치 및 인접 5' 및 3' 염기(쌍)을 포함하는 표적 RNA 영역에 상보적인 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 본원에서 특정된 화합물에 대한 mRNA 영역을 또한 표적 서열이라 한다. mRNA 는 예비프로세싱될 수 있거나 프로세싱 후의 mRNA 일 수 있다.
화합물은 예를 들어, 적어도 50 ℃ 및 바람직하게는 60 ℃-80 ℃ 인 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 을 가진 생리학적 조건에서 표적 mRNA 에 혼성화하도록 유전적으로 설계된다. 화합물이 표적 서열에 100 % 상보적일 필요는 없지만, 표적 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하여 표적 서열의 발현이 조절되도록 하는 것이 효과적이다. 양호한 특이성을 가지고 결합된 안정하고, 효과적인 결합을 허용하는 올리고머의 적당한 길이는 약 8 내지 40 뉴클레오티드 염기 단위, 및 바람직하게는 약 12 내지 25 염기 단위이다. 만약 존재한다면, 미스매치는 가운데보다는 혼성체 듀플렉스의 말단 영역에 대해 덜 불안정하게한다. 표적과 염기쌍 형성 특이성이 유지되는 것으로 추정되는 표적 염기와 축중 염기쌍 형성을 허용하는 올리고머 염기가 또한 기대된다. 바람직하게는, 화합물은 AUG 부위에 상보적인 내부 3-염기 코돈을 포함하고, 개시 부위에 대한 5' 및 3' 에 상보적인 하나 이상의 염기를 포함한다. c-myc 개시 부위 서열을 포함하는 하나의 표본적인 화합물은 SEQ ID NO:2 로 제시되고, 염기서열; 5'-ACG TGG AGG GGC ATC GTC GC -3'를 가진다. c-myc 개시 위치 포함에 추가하여, 화합물은 약 30 mg/ml 보다 큰 수성 배지에서 가용성을 가진다.
안티센스 화합물의 가용성, 및 화합물의 용액내 저장에서 침전에 대한 저항성은 친수성 올리고머, 또는 하전된 종과 같은 가용성 부분으로 올리고머를 유도하여 더 증가될 수 있다.
표적 RNA 과 헤테로듀플렉스를 형성하는 허여된 안티센스 서열의 효험은 당업계에서 알려진 스크리닝 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 올리고머는 표적 RNA 를 발현하는 세포 배양물과 함께 인큐베이션되고, 헤테로듀플렉스의 존재 또는 부재는 하기에 제시된 것과 같은 기법, 또는 ELISA 또는 웨스턴 블럿과 같은 표준 기법으로 결정될 때 암호화 단백질의 존재 또는 부재를 모니터하여 결정된다. [예를 들어, Pari,G.S.et al.,Antimicrob.Agents and Chemotherapy 39 (5) :1157-1161(1995); Anderson,K.P.et al.,Antimicrob. Agents and Chemotherapy 40 (9):2004-2011(1996) 참조]. 일반적으로 비-표적 서열에 올리고머 분자의 비-특이적 결합이 제한되는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 방법 수행에 사용하는 안티센스 올리고머는 하기의 성질; (A) 뉴클레아제 내성, (B) 즉, 37 ℃보다 상당히 높은 Tm 에서 고 친화성을 가지고 표적 RNA 의 상보적 서열과 혼성화하는 능력, 및 (C)표적 RNA 와 뉴클레아제-내성 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 능력을 가져야만 한다.
이중-가닥 DNA 는 안티센스 분자에 의해 표적화될 수 있지만, 유전자의 관련 영역으로부터 전사된 mRNA 가 더 일반적으로 표적화된다. 이러한 mRNA 는 암호화서열에 추가하여, 표적화될 수 있는 개시자 또는 프로모터 부위, 인트론/엑손 결합 부위, 3'-비번역 영역, 및 5'-비번역 영역을 포함한다.
참여 안티센스 올리고머는 또한 잘 알려진 방법에 따라3H-루신3H-티미딘, 각각의 첨가에 의해 측정될 때 단백질 및 DNA 합성에 대한 효과와 같은 급성 및 만성 세포 독성에 대해 평가된다.
비-표적 서열에 올리고머 분자의 비-특이적 결합은 제한되는 것이 바람직하다. 이러한 올리고머의 어떤 비-서열-특이적 상호작용은 치료적 효과를 보일 수 있있지만(예를 들어, Anderson,1996), 이러한 상호작용은 종종 원하지 않는 부작용을 일으킨다. 비-특이적 결합에 대해 시험하기 위해서, 센스 또는 넌센스 서열과 같은 조절 서열, 또는 미스매치 염기를 포함하는 서열은 제 1 의 스크리닝 시험(시험관내)에 포함될 수 있다. 과도한 표적화 단백질 또는 mRNA 는 안티센스 올리고머가 역효과를 나타내는지 관찰하기 위해 또한 세포 배양물에 첨가될 수 있다. [Bennett,M.R. et al., Circulation 92(7):1981-1993(1995)].
추가 서열이 당업자에 의해 통상 사용되는 방법에 따라 수행된 스크리닝으로 하나 이상의 바람직한 표적 서열을 고려하는 당업자에 의해 제조될 수 있다.
메신저 RNA 서열의 표적화가 바람직하지만, 이중-가닥 DNA 는 듀플렉스 DNA 의 메이저-구루브 위치에 서열-특이적 결합을 위해 유전적으로 설계된 비-이온 프로브를 사용하여 표적화될 수 있다. 이러한 프로브 형태는 U.S. 특허번호 5,166,315 에 개시되고(Summerton and Weller,1992), 이것은 본원에 참고문헌으로수록되고, 또한 표적 유전자의 발현을 차단하는 그것의 능력과 관련하여 본원에서 일반적으로 안티센스 올리고머로 말한다.
모르폴리노 올리고머는 안정한, 비하전 골결 결합에 의해 폴리머 형태로 결합될 수 있고, 높은 친화성을 가지고 표적 RNA 를 포함하는 상보적-염기 표적 핵산과 혼성화할 수 있다. 각 모르폴리노 서브유닛의 환 질소를 통한 서브유닛 결합에 관련된 성질의 조합은 천연 폴리뉴클레오티드 또는 다양한 하전 또는 비하전 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 자연 발생 뉴클레오티드의 "하나 이상의" 유사체를 포함하는 폴리뉴클레오티드에서는 발견되지 않는다.
본 발명에 따라서, 안티센스 올리고머는 표적 RNA 에 포함된 선택 표적 서열의 영역에 특이적으로 혼성화하도록 유전적으로 설계될 수 있다. 그러므로 알려진 서열을 가지는 어느 유전자의 발현 산물은 당업게에 알려진 합성에 관한 통상의 기법을 사용하여 안티센스 올리고머의 형성을 위한 주형으로 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이러한 안티센스 올리고는 본 발명의 방법내에 포함될 수 있고 표적 유전자의 발현에 관한 스크리닝에 사용될 수 있다. 따라서, 스플라이싱 RNA 및 비-스플라이싱 RNA 모두는 본 발명의 방법에 사용가능한 안티센스 올리고머의 유전적 설계를 위한 주형으로 작용할 수 있다.
예를 들어, 둘이상의 생물학적 샘플에서 발현된 RNA 와 같은 둘 이상의 RNA 서열 사이의 차이는 예를 들어, 바람직하게는 하나의 조직에서는 발현되나 다른 조직에서는 발현되지 않는 특정 유전자내의 돌연변이와 같은 차이를 반영하는 안티센스 올리고머의 합성 기초로서 작용할 수 있다. 이러한 바람직한 발현은 정성적 또는 정량적일 수 있다.
상기에 개시된 다양한 결합을 가지는 안티센스 올리고머는 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 광범위하게 사용된 포스포로티오에이트-결합 올리고뉴클레오티드 유사체는 Applied Biosystems Inc. 또는 Pharmacia 로부터 이용가능한 상업적 DNA 합성기상에서 표준 포스포르아미다이트 또는 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 화학을 사용하여 제조될 수 있다. 포스파이트 결합은 표준 요오드 시약 대신에 3H-1,2-벤조디티올-3-온-1,1-디옥사이드를 가지고 산화시킴으로서 포스포로티오에이트로 전환될 수 있다 (예를 들어, Agrawal,Smith,Iyer 참조).
III.발명의 실행 양식
A.안티센스 올리고머의 투여
하나의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 올리고머와 mRNA 표적을 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 혼성화하도록 하는 제약학적으로 허용가능한 담체에 포함된 비-하전 인-함유 골격 결합을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물의 효과적인 경구 송달을 제공한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 표적 RNA 에 안티센스 올리고머의 효과적인 경구 송달을 제공하여, 안티센스 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 존재 또는 부재의 결정은 대상의 표적 RNA 의 존재 또는 부재를 반영한다.
다른 바람직한 구체예에서, 효과적인 송달은 또한 안티센스 치료법에 대해 일반적으로 효과적으로 당업자에게 알려진 많은 방법의 어느 것에 의해 달성될 수 있고, 표적 RNA 에 안티센스 올리고머의 효과적인 송달을 초래한다.
본 발명에 따라서, 이러한 안티센스 올리고머 송달의 경로는 예를 들어, 정맥내, 피하지방내, 복강내, 근육내, 및, 동맥내 주사뿐만 아니라 흡입 및 경피 송달과 같은 비경구적 경로를 포함하여 다양한 전신 경로를 제한없이 포함한다. 어떤 경우에 특정 조직 또는 영역에 직법 투여에 의해 표적화된 송달이 바람직하다. 약제를 표적 위치에 송달하거나 약제를 혈액내에 도입하기에 효과적인 어느 방법이 또한 기대된다는 것이 이해된다.
안티센스 올리고머의 표적화는 또한 특정 조직 또는 위치에 직접적인 주사, 즉, 종양에 직접적 주사에 의해 종양과 관련된 특정 RNA 서열(즉, 종양 억제 유전자 또는 종양유전자)의 발현 증가를 용이하게 하는 것에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 안티센스 올리고머는 올리고를 예를 들어, 항체/올리고머 결합체와 같은 특정 조직 또는 세포 형태에 표적화하는 작용을 하는 분자와 결합될 수 있다.
안티센스 올리고머의 경피 송달은 예를 들어, 국소적 투여와 같은 곳에 채택된 제약학적으로 허용가능한 담체의 사용에 의해 달성될 수 있다. 모르폴리노 송달에 유용한 하나의 분자 결합체는 1996,11,6 일 공개된 PCT 특허출원 WO 97/40854 에 개시되고, 본원에 참고문헌으로 수록된다.
전형적으로, 안티센스 올리고머의 1 회 이상의 투여량이 일반적으로 약 1 주 내지 약 2 주의 기간동안 규칙적인 간격으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 바람직한 투여량은 약 1mg 올리고머/환자 내지 약 25 mg 올리고머/환자(체중 70 kg 에 기초)이다. 어떤 경우에, 25 mg 올리고머/환자보다 많은 투여량이 필요할 수 있다. IV 투여의 경우에, 바람직한 투여량은 약 0.5 mg 올리고머/환자 내지 약 10 mg올리고머/환자이다. (성인 체중 70 kg 에 기초)
안티센스 화합물은 일반적으로 적어도 200-400 nM 안티센스 올리고머의 최고 혈액 농도를 초래하기에 효과적인 양 및 방식으로 투여된다. 체액, 예를 들어, 소변에서 헤테로듀플렉스의 존재는 투여후, 전형적으로 3-18 시간, 바람직하게는 투여후 약 6-12 시간에서 모니터된다.
IV.안티센스 송달 분석 방법
A.헤테로듀플렉스의 검출
RNA 발현의 지표로서 기능하기 위해서, 안티센스 올리고머;RNA 헤테로듀플렉스는 그것이 세포막을 통과할 때 혼성화를 유지하고 분해에 저항할 수 있는 충분한 안정성을 가져야만 한다. 구체적으로, 안티센스 올리고머: RNA 헤테로듀플렉스가 소변에서 검출된다면, 그것은 또한 핼액 내로 간극 체액을 통해 송달되어야만 하고, 신장을 통해 소변으로 여과되어야만 한다. 그러므로, 헤테로듀플렉스는 Tm, 및 따라서, 대부분의 폴리뉴클레오티드 듀플렉스의 안정성에 영향을 주는 것으로 알려진 이온강도, pH, 및 온도, 조건상의 변화에 견디어야만 한다. 이러한 헤테로듀플렉스는 동물로부터 수거된 소변에서 검출가능하고 정량화할 수 있다.
소변 검출에 사용을 위한 하나의 표본적인 분석 포맷에서, 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스를 포함하는 샘플은 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스에 특이적으로 결합 또는 변형하는 화합물(예를 들어, 특정 헤테로듀플렉스에 특이적인 단일클론 항체(mAb))과 반응하고, 이어서 변형 또는 결합 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스를 검출한다.
다른 표본적인 분석 포맷에서, 안티센스 올리고머는 대상에 투여전에 리포터 분자를 가지고 접합시켜서 변형되고, 비결합 리포터 표지 안티센스 올리고머로부터 헤테로듀플렉스를 분리하고, 헤테로듀플렉스-관련 리포터 분자를 검출한다. 어떤 경우에, 이러한 분리는 크로마토그래피 또는 전기영동을 통해 수행될 수 있다.
표본적인 검출 방법은 분광광도계 검출(예를 들어, 형광 검출기로), 또는 항체를 사용한 검출(예를 들어, FACS 분석)을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 동시 형광 검출로 크로마토그래프 분리 또는 겔의 염색에 의한 검출로 전기영동분리, 형광 또는 자동방사선 검출과 같은 분석을 개발하기 위해 분리 방법과 결합될 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되고, 허여된 안티센스 올리고머 및 표적 RNA 에 쉽게 적용가능하다.
핵산을 표지화하기 위해 당업계에서 알려진 어느 형광 분자, 예를 들어, 플루오레신 및 카르복시 플루오레신, 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노 플루오레신(5-DTAF)와 같은 플루오레신 유도체; 에오신; Texas Red 및 테트라메틸로드아민과 같은 로드아민; U.S 특허번호 4,957,870 및 4,888,867 에 개시된 티아졸 오렌지, 옥사졸 엘로우 및 관련 염료와 같은 시아닌 염료; 피렌; La JollaBlue 와 같은 포르피린 염료가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 형광 표지는 형광 수명이 측정된 관련 시간에 대다수 양립가능하도록 텀블링 시간에 영향을 주는 온도, 점도, 및 형광 염료가 결합되는 올리고뉴클레오티드를 고려하여 선택되어야 한다. 형광표지는 표지로부터 형광물질의 방출 또는 표적 서열에 프로브의 혼성화를 방해하지 않도록 신호 프라이머에 공유결합으로 연결 또는 결합된다 [U.S. 특허번호 5,614,617및 5,652,099 참조].
다른 경우에, Smith, L.M.,et al.Nuc.Acids Res. 13 (7) :2399 (1985) 에 개시된 대로, 반응성 아미노기에 부착된 서열의 5' 말단을 가지고 허여된 표지에 서열 상보성을 가지는 안티센스 올리고머가 합성될 수 있다. 이러한 경우에, 비오틴, 펩티드, 또는 알칼리 포스파타제와 같은 효소가 5' 아미노기에 부착될 수 있다 [U.S. 특허번호 5,783,391 참조]
또 다른 구체예에서, 헤테로듀플렉스는 예를 들어, 질량 분광계로 체액으로부터 분리후에 검출될 수 있다. 본 발명을 증명하기 위해 수행된 연구에서, 헤테로듀플렉스 RNA: 모르폴리노 올리고머는 질량 분광계에 의해 2 개의 다른-MW 분획(2개의 헤테로듀플렉스 가닥)으로 쉽게 분해된다. 그러므로 이 방법은 2 개의 부분 가닥의 관점에서 헤테로듀플렉스의 양성 확인을 제공한다.
B.분석 과정
하나의 분석 방법에서, 헤테로듀플렉스는 예를 들어, 비오틴과 같은 올리고머 결합기에 형광-표지 스트렙타비딘과 같은 적당한 리포터를 결합시킨 후에, 적당한 리포터의 존재하에서 직접 검출된다.
다른 접근법에서, 표적 핵산에 특이적인 표적 핵산 서열, 및/또는 그것의 보체는 예를 들어, PCR 에 의해 복제수가 선택적으로 증가된다[ Saiki et al., Science 230,1350(1985); U.S. 특허번호 4,683,195 및 4,682,202].
또 다른 접근법에서, 채액 샘플은 리포터 표지되거나 제 1 차 항체에 대해 제 2 차 표지 항체의 결합에 의해서 연이어 표지된 항체와 같은 헤테로듀플렉스 결합제와 반응한다.
본 발명에 따른 분석은 하나 이상의 시험 샘플 및 대조 샘플상에서 가능한 거의 같은 조건하에서 동시에 수행될 수 있다. 당업계에서 이해할 때, 대조 샘플은 시험 샘플과 유사하지만, 무 표적 또는 특정 시약 결핍을 포함하는 것으로 이해된다. 표본적인 대조는 표적 RNA 가 결핍된 대상으로부터 같은 형태의 체액 샘플 및 안티센스 올리고머 조성물의 투여 전에 채취하고 투여후에 1 회 이상 채취한 같은 대상의 샘플을 포함한다. 첨가된 표적 또는 첨가된 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스에 대한 대조는 그 이하의 수준에서는 표적을 포함하지 않는 샘플과 표적을 포함하는 샘플 구별이 가능하지 않은 수준을 확립하는 데 사용될 수 있다. 공지된 농도의 표적 범위를 가지는 대조 샘플이라면, 시험 샘플에서 표적의 농도가 측정될 수 있다.
본 발명의 분석법을 수행한 샘플은 소변, 타액, 플라즈마, 혈액 또는 다른 체액과 같은 비-프로세싱 체액 샘플, 조직 배양물 배지 또는 음식재료일 수 있다.어떤 경우에, 방법은 표적의 검출을 방해하는 물질을 제거하도록 프로세싱된 생물학적 샘플상에서 수행된다. 다양한 안티센스 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스 검출 방법에 더욱 적당한 샘플을 얻기 위해 생물학적 샘플을 프로세싱하는 방법은 당업계에 잘 알려진다.
샘플을 포함하는 관련 체액은 소변, 플라즈마, (또는 혈청), 전혈액, 타액, 뇌척수액 및 생검 조직으로부터 얻은 액체를 포함한다. 소변 및 타액은 본 발명의 방법에 따른 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 존재 검출에 바람직한 체액이다. 소변또는 타액의 샘플 분석을 포함하는 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 결정은 이러한체액 샘플이 전문화된 의학 장비 또는 설비의 요구없이, 그리고 대상에 불쾌함이 거의 또는 전혀 없이 얻어질 수 있는 잇점을 제공한다. 샘플은 검출 또는 정량화 전에 헤테로듀플렉스를 정제 또는 부분적으로 정제하기 위해 예를 들어, HPLC 또는 전기영동에 의해 예비처리될 수 있다.
V.방법의 이용분야
전술한 개시로부터, 본 발명의 조성물 및 방법은 표적 유전자의 mRNA 의 번역 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드, 및 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 가진 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드 유형의 효과적인 경구 투여를 위한 수단을 제공하는 데 잇점을 제공한다는 것이 이해될 수 있다.
본원에 개시된 경구 투여 방법은 또한 적당한 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 소변과 같은 체액에서 쉽게 검출가능한 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 안티센스 올리고머의 송달에 의해 표적 RNA 발현의 존재 결정에 유용성을 발견한다. 또한 본원에 개시된 방법이 대상 체액에서 RNA 의 존재를 결정하는 것이 바람직한 상황에서 광범위한 이용가능성을 가진다는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 방법은 안티센스 올리고뉴클레오티드로 치료될 수 있는 상태에서 임상 실험에서 유용성을 찾는다. 본원에 개시된 비하전 모르폴리노 안티센스 올리고머는 효과적이고 비-독성 투여량이 적어도 200-400 nM 안티센스 올리고머의 최고 혈액 농도 유발에 효과적인 양 및 방식으로 경구 투여 될 수 있는 구체적인 잇점을 제공한다.
본 발명의 방법은 많은 표적 유전자의 어느 것의 발현에 의해 생산된 mRNA 의 검출에 유용하다. 관심의 표적은 상기에 자세하게 개시되고 교체적으로 스플라이싱된 mRNA 및 돌연변이, 삽입, 또는 결실을 가지는 발현 유전자를 제한없이 포함한다.
본 발명의 방법은 또한 환경적 자극에 대한 반응에서 발생하는 유전자 발현 평가에 사용될 수 있다. 예를 들어, 메탈로티에나인 유전자의 발현은 의학 연관과 관련된 중금속에의 노출에 반응하여 증가를 보였다.
따라서, 방법은 예를 들어, 중금속 노출 잠재성을 가지는 환경의 노동자의 경우에 노동자에게 메탈로티에나인 RNA 에 특이적인 안티센스 올리고머를 투여하는 단계, 및 대상의 소변에서 메탈로티에나인 RNA 및 하나 이상의 안티센스 올리고머를 포함하는 헤테로듀플렉스의 배출을 모니터하는 단계에 의하는 것과 같이, 메탈로티에나인 발현의 주기적 평가에 의해 이러한 노출을 모니터 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 방법은 특정 유전자의 변형된 발현을 유발하는 것으로 알려진 많은 환경 자극의 어느 것에의 노출은 모니터 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법의 어느 것도 허여된 표적 RNA 발현의 일상적인 모니터에 사용하기 위한 키트 포맷에 쉽게 채용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 참고로 언급된 모든 특허 및 문헌은 여기에 일체로서 참고문헌으로 수록된다.
하기의 실시예는 예시하지만, 본 발명을 제한하는 어느 방식으로 해석되지는않는다.
(실시예 1)
시험관내 및 생체내에서 뉴클레아제-내성 안티센스 올리고: RNA 헤테로듀플렉스의 형성
시험관내 연구
듀플렉스 형성을 혼성화에 이어 4.75 시간동안 36 V 에서 작동하는 12 % 비-변성 아크릴아마이드겔상에서 듀플렉스 형성의 가시화를 허용하는 안티센스 올리고머와 다양한 mRNA 를 혼합하여 평가했고, 듀플렉스 형성 및 RNAse 내성을 검출하기 위해 에티듐 브로마이드로 염색했다. 겔상에서 올리고뉴클레오티드의 이동은 질량대비 전하에 기초하고, 듀플렉스의 경우에, 질량은 RNA 자체의 질량의 거의 2 배이지만, PMO 가 중성일 때 어떠한 전하도 첨가되지 않는다. 듀플렉스의 이동은 아크릴아마이드 겔 농도에 따라 다양하다.
c-myc 에 대한 α 글로빈 합성 mRNA 25-mer (SEQ ID NO:1) 및 비-상보적 PMO 올리고머 안티센스 (SEQ ID NO:2) , 또는 상보적인, α 글로빈 안티센스 PMO 25-mer (SEQ ID NO:3) 를 RNAse 의 존재 또는 부재하에서 혼합했다.
α 글로빈 합성 25-mer 를 c-myc 에 대한 안티센스인 서열을 기지는 비-상보적인 PMO 25-mer (PMO 122-126,SEQ ID NO:2)와 함께 혼합했을 때, 단지 단일 밴드를 하기의 겔 전기영동에서 관찰했고 밴드의 분자량은 합성 mRNA 25-mer 의 분자량과 일치했다. 그러나, α 글로빈 합성 25-mer 를 상보적인, α 글로빈 안티센스PMO 25 mer (SEQ ID NO:3) 와 혼합했을 때, 2 개의 밴드를 mRNA 25-mer 에 대해 예견된 속도로 이동하는 더 낮은 밴드 및 약 200-염기쌍의 올리고머에 대해 예견된 속도로 이동하는 제 2 의 밴드를 하기의 겔 전기영동에서 관찰했다. 아래 위치한 밴드는 아니지만, 위에 위치한 밴드는 로딩전에 RNAseBM 또는 RNAseT1 에 의한 처리에 내성이 있었다.
결과는 PMO:RNA 듀플렉스에 대한 기대된 겔 이동 점에서 희미한 밴드, 및 RNA 단독에 대해서는 무-밴드로 나타날 때, RNAse 내성 듀플렉스가 α 글로빈 합성 mRNA 25-mer (SEQ ID NO:1) 및 RNAseBM 의 존재에서 상보적인 안티센스 PMO (SEQ ID NO:3) 사이에 형성된다는 것을 나타냈다.
결과는 또한 PMO:RNA 듀플렉스에 대한 기대된 겔 이동 점에서 밴드, 및 RNA 가 듀플렉스의 일부가 아닌 경우에 분해될 수 있다는 것을 나타내면서 RNA 단독에 대해서는 무-밴드를 나타낼 때, RNAse 내성 듀플렉스가 α 글로빈 합성 mRNA 25-mer (SEQ ID NO:1) 및 RNAseT1 의 존재에서 상보적인 안티센스 PMO (SEQ ID NO:3) 사이에 형성된다는 것을 나타냈다.
상보성 대 비-상보성 mRNA : 안티센스 올리고머쌍의 혼합물로 전기영동의 결과 비교는 듀플렉스가 그것의 상보적인 안티센스 PMO 올리고머사이에 형성되고, 듀플렉스는 RNAse 에 의한 분해에 내성이 있다는 것을 확증한다. RNAse 의 존재 및 부재하에서 상보적인 mRNA :안티센스 올리고머쌍 혼합물의 상대적인 겔 전기영동 이동 속도는 듀플렉스가 α 글로빈 합성 mRNA 25 -mer (SEQ ID NO:1) 및 상보적인 안티센스 PMO (SEQ ID NO:3) 사이에 형성된다는 것과 과량의 α 글로빈 합성 mRNA는 RNAse 의 부재에서 존재한다는 것을 보여준다.
생체내 연구
안티센스 올리고머를 래트에 복강내 주사했고 뒤이어 생체내 안정한 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 형성은 래트 소변에서 연이어 검출가능했다.
각 시험 동물의 경우에, 투여 후 24 시간동안 수거된 1 ml 의 소변을 염을 제거하기 위해 6000 내지 8000 nw 컷오프 투석 튜빙(Spectra/Pro) 에서 표준 분석 완충액에 대해 투석했다. 투석된 샘플을 10 분동안 DNAse 및 RNAseH 와 함께 인큐베이션했고, Savant Speed-Vac 에서 건조했다. 건조 샘플을 50 μl 물에서 용해했고, 25 μl 를 12 % 비-변성 아크릴아마이드 겔상에 래인 당 로딩했다.
부분적 간절제술시에, 래트에 식염수, 3 n몰, 75 n몰 또는 375 n몰의 c-myc 에 대한 PMO 122-126 25-mer 안티센스(SEQ ID NO:2)를 투여했다. 겔 전기영동의 결과는 PMO:RNA 헤테로듀플렉스의 밴드와 일치하는 200 bp DNA 래더 밴드 근처로 이동하는 DNAse 및 RNAse-내성 밴드의 존재를 보였다. 이 밴드의 출현은 투여된 PMO 의 양에 의존하고, 래트에 식염수를 주사하는 경우에 부재한다. 래트에서, 부분적인 간절제술시에 c-myc 에 대해 PMO 122-126 25-mer 안티센스의 375 n몰이 허여된 경우에, 밴드는 PMO:RNA 듀플렉스의 검출에 이어 PMO 에 대한 생체내 노출을 지지하는 PMO:RNA 의 이동 패턴과 일치하는 것이 관찰된다.
이러한 관찰은 동물에 PMO 의 투여에 기초하여 특이적, 검출가능한 안티센스 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 생체내 형성을 지지한다. 이 헤테로듀플렉스는 세포내에서 형성되고, 뉴클레아제에 내성이 존재하고 세포막을 통해 신장 혈액 공급을 위하여 그것의 송달동안 삼투압의 변화, 신장에서의 소변의 제거에 안정적이다.
(실시예 2)
안티센스 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스로 생체내 연구
플루어레신 결합 올리고머를 검출할 수 있는 도구(Applied Biosystems Model 672 GeneScanner)를 사용하여 수행된 표준화 연구를 다양한 길이; 15-mer, 20-mer, 24-mer 및 38-mer 리보자임의 플루어레신-결합 올리고머의 이동 속도 결정에 사용했다. 이동 속도를 GeneScanner 겔상에서 평가했고 표준화 연구는 PMO:RNA 듀플렉스의 검출에 GeneScanner 접근법의 유용성을 확증했다. 표준화 연구는 Applied Biosystems Model 672 GeneScanner 이 길이 및 농도에 기초하여 플루어레신 결합 올리고머 구별이 가능하다는 것을 보여준다.
생체내 연구
래트에 래트 시토크롬 P-4503A2 에 대한 안티센스(SEQ ID NO:6)인 카르복시플루어레신-결합 PMO(SEQ ID NO:5)를 주사했다.
주사 후 1 시간 경과된 래트로부터 채취한 혈액에서 제조된 플라즈마 샘플의 GeneScanner 크로마토그램은 270 및 340 분에서 이동한 형광 부분을 포함했다 ( 서로 다르게 이동하는 2 개의 가능한 카르복시플루어레신 결합때문에 2 개의 피크). 주사 후 24 시간 경과된 래트로부터 제조된 플라즈마 샘플은 대략 75 및 80 분에서 이동한 형광 부분을 포함했다. 질량 분광계 데이타(제시되지 않음)는 더 짧은 이동시간은 PMO 의 분해 때문이 아니라는 것을 확증하고 PMO:RNA 헤테로듀플렉스가 그 시간동안 형성되었다는 것을 나타낸다.
도 3 은 P450 안티센스 PMO 의 투여후 다양한 시간에서 취한 샘플 분석의 결과를 나타내고, 이러한 투여에 따른 래트 플라즈마에서 PMO 단량체의 소멸 및 RNA:PMO 헤테로다이머의 존재를 나타낸다. 플라즈마에서 듀플렉스의 상당한 양의 출현은 대다수의 비-듀플렉스 PMO 가 일반적으로 "분배 페이즈" 로 명명되는 것처럼 플라즈마를 이탈하기 전에는 발생하지 않는다. PMO 헤테로듀플렉스는 PMO 단량체가 상보적인 mRNA 전사체가 위치한 대상의 조직으로 분배된 후 까지는 플라즈마내에서 축적되지 않는다. 하전된 RNA:PMO 듀플렉스는 아마도 이러한 조직에서 형성되고 세포밖으로 유출되고 플라즈마로 반환된다. 전체적인 과정은 몇 시간을 요구한다.
p450 안티센스 PMO (SEQ ID NO:5) 의 투여후에, 플루어레신을 신장 및 간 모두에서 검출했다.
신장 조직 샘플의 크로마토그램은 350 분에서의 밴드는 비-듀플렉스 PMO 와 일치하고, 80 분에서의 추가적인 밴드는 듀플렉스 및 모 PMO 가 간질성 공간 또는 신장 세포에 존재할 수 있다는 것을 나타내면서, PMO:RNA 헤테로듀플렉스와 일치한다는 것을 보여주었다. 간 조직 샘플은 필수적으로 모두 듀플렉스 PMO 이고 훨씬 더 PMO:RNA 헤테로듀플렉스라는 것을 보였다. 이러한 결과는 P450 mRNA 전사체의 수준이 간 보다 신장에서 훨씬 낮다는 관찰과 일치한다.
비-듀플렉스 안티센스 PMO 올리고머 및 안티센스 PMO 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 소변 제거의 시간 코스를 반영하는 연구는 PMO:RNA 헤테로듀플렉스의 형성 및 조직에서 플라즈마로의 유출에 이은 소변에서 그것의 궁극적인 출현은 몇 시간을 요구한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 구체적인 방법 및 구체예와 관련되어 개시되었지만, 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

Claims (19)

  1. (a) 대상에 비하전 인-함유 골격 결합을 가지는 뉴클레아제-내성 모르폴리노 안티센스 화합물을 경구 투여하는 단계;및
    (b) 상기 올리고머를 상기 표적에 의해 암호화된 유전자 산물의 조절된 발현 유발에 효과적인 방식으로 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적 mRNA 의 영역에의 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 혼성화도록 허용하는 단계를 포함하는, 대상의 생체내에서 mRNA 서열을 표적화하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 모르폴리노 안티센스 화합물은 약 8 내지 40 염기의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 모르폴리노 안티센스 화합물은 선택 표적 유전자의 번역 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 안티센스 올리고머 골격은 도 2a-a 내지 도 2 e-e 에 제시된 구조로 구성되는 군으로부터 선택되는 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 표적 유전자는 증식성 장애와 관련되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 증식성 장애는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 모르폴리노 안티센스 화합물은 SEQ ID NO:2 로 확인된 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. (a) (i) 인간c-mycmRNA 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드, 및 (ii) 비하전, 인-함유 서브유닛간 결합을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물을 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적 RNA 의 영역에의 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의한 혼성화 감소에 유효한 양으로 대상에 투여하는 단계,
    (b) 상기 투여후에 선택된 시간에서, 대상으로부터 체액의 샘플을 채취하는 단계, 및
    (c) 안티센스 올리고머 및 상기 표적 RNA 영역으로 구성되는 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 존재를 상기 샘플에서 검출하는 단계를 포함하는, 대상에서 표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포내 결합 이벤트의 발생을 검출하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 안티센스 올리고머는 약 8 내지 40 염기의 길이를 가지는것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 투여는 경구 투여에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 체액은 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 상기 검출은 샘플을 상기 헤테로듀플렉스에 대해 특이적인 항체와 반응시키는 단계, 및 항체-헤테로듀플렉스 결합체의 존재를 검출하는 단계에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 8 항에 있어서, 상기 안티센스 올리고머는 리포터 부분을 포함하고 상기 검출은 헤테로듀플렉스와 관련된 상기 리포터 부분의 존재를 검출함으로서 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 표적 RNA 는 선택 유전자의 발현에 의해 생산된 mRNA 이며, 대상에서 치료제에 반응하는 표적 유전자의 발현상의 변화 검출에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 8 항에 있어서, 선택 유전자는 공지된 질병 상태와 관련된 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 8 항에 있어서, 상기 투여는 다수의 이러한 안티센스 올리고머를 투여하는 단계를 포함하고, 상기 검출은 상기 헤테로듀플렉스의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계를 포함하며, 공지된 질병 상태와 관련된 다수의 유전자 돌연변이 중 하나의 검출에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 8 항에 있어서, 상기 표적 RNA 는 이 바이러스에 의한 감염에 특이적인 RNA 이며, 추정되는 바이러스에 의한 대상의 감염 검출에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 8 항에 있어서,
    (i) 단계 (a)-(c) 의 다음에, 대상에 치료제를 투여하고 상기 치료제의 투여후에 선택시간에서, 단계 (a)-(c) 를 반복하는 단계; 및
    (ii) 치료제 투여전에 채취한 체액 샘플에서 검출된 헤테로듀플렉스의 양을 치료제 투여후에 채취한 샘플에서 검출된 헤테로듀플렉스의 양과 비교하는 단계를 더 포함하며, 표적 유전자의 발현을 조절하는 데 있어서 치료제의 효험 모니터에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
  19. (a) 인간 c-myc mRNA 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 뉴클레오티드, 및 (ii) 37 ℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로 표적 RNA 의 영역과 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의한 혼성화 감소에 유효한 양으로 비하전, 인-함유 서브유닛간 결합을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물; 및
    (b) 안티센스 올리고머 및 표적 RNA 사이에 형성된 헤테로듀플렉스 검출 수단을 포함하는, 대상에서 표적 RNA 를 포함하는 염기-특이적 세포내 결합 이벤트의 존재를 검출하기 위한 키트.
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