JP2008526213A - 自己保護オリゴヌクレオチドを使用する、遺伝子発現を調節するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的遺伝子に相補的な領域及び１つ以上の自己相補的な領域を含む新しい核酸分子、並びに遺伝子発現を調節し、種々の疾患及び感染症を治療するためのそのような核酸分子及びそれらを含む組成物の使用を対象とする。本発明は、遺伝子発現の調節において有用な自己保護オリゴヌクレオチドを含む新しい組成物及び方法を提供する。一実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する領域及び１つ以上の自己相補的な領域を含む単離された自己保護ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つ以上の自己相補的な領域を含む。

Description

本発明は一般的に、自己保護ポリヌクレオチド、並びに遺伝子発現を調節して疾患を治療するためのそれらの使用方法に関する。

（関連技術）
遺伝子サイレンシング、即ち遺伝子発現の抑制の現象は、治療及び診断目的、並びに遺伝子機能そのものの研究において、多大な期待を担っている。この現象の例には、アンチセンス技術及び転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が含まれる。

遺伝子サイレンシングのアンチセンス手法には、近年大きな関心が寄せられている。基本となる概念は単純であるものの、原則的には有効であり、即ち、アンチセンス核酸（ＮＡ）が標的ＲＮＡと塩基対合し、不活性化をもたらす。アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡによる標的ＲＮＡの認識は、ハイブリダイゼーション反応とみなすことができる。標的は配列相補性により結合するため、アンチセンスＮＡを適切に選択して高い特異性を確保しなければならないことが示唆される。標的ＲＮＡの不活性化は、アンチセンスＮＡの性質（修飾又は未修飾のＤＮＡ又はＲＮＡ）、及び抑制を起こす生体系の性質に応じて、種々の経路を介して生じる可能性がある。

しかし、効果的なアンチセンス及びＴＧＳ技術の開発においては、依然として多くの問題が存在する。例えば、ＤＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは短期間の有効性しか示さず、通常は必要な用量において毒性を示し；同様に、アンチセンスＲＮＡの使用は安定性の問題のために有効ではないことが証明されている。ヌクレアーゼの感受性を低減することによりアンチセンスの安定性を改善する試みでは、種々の方法が使用されている。これらには、例えばホスホロチオエート又はメチルホスホネートを使用した通常のホスホジエステル骨格の修飾、２’−ＯＭｅ−ヌクレオチドの組み込み、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用、及び３’−末端キャップ、例えば３’−アミノプロピル修飾又は３’−３’末端連鎖の使用が含まれる。しかし、これらの方法は高価であり、追加の工程を必要とする。更に、非天然のヌクレオチド及び修飾を使用すると、アンチセンス配列をインビボで発現する能力がなくなるため、それらを合成し、後に投与することが必要となる。

したがって、特に高等な脊椎動物の細胞における、インビトロ及びインビボでの遺伝子機能のターゲティング指向された抑制のための有効で持続性のある方法及び組成物、例えば安定性の向上した改良されたアンチセンスＲＮＡ等が依然として必要とされている。

本発明は、遺伝子発現の調節において有用な自己保護オリゴヌクレオチドを含む新しい組成物及び方法を提供する。

一実施形態において、本発明は、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する領域及び１つ以上の自己相補的な領域を含む単離された自己保護ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つ以上の自己相補的な領域を含む。自己相補的な領域は、ポリヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又はそれらの両端に位置する場合がある。

特定の実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はペプチド核酸を含む。

追加の実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ配列に対して非相補的又は半相補的であり、自己相補的な領域に対して非相補的である第の配列を更に含み、前記第２配列は、自己相補的な領域と標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の間に位置する。

特定の実施形態において、自己相補的な領域はステムループ構造を含む。

関連する実施形態において、自己相補的な領域は標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列に対して相補的ではない。

ポリヌクレオチドが２つの自己相補的な領域を有する更に関連する実施形態において、２つの自己相補的な領域は互いに相補的ではない。

特定の実施形態において、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列は、少なくとも１７個のヌクレオチド又は１７〜３０個のヌクレオチドを含む。

他の実施形態において、自己相補的な領域は、少なくとも５個のヌクレオチド、少なくとも１２個のヌクレオチド、少なくとも２４個のヌクレオチド、又は、１２〜４８個のヌクレオチドを含む。

更なる実施形態において、ステムループ構造のループ領域は、少なくとも１個のヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ループ領域は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも６個のヌクレオチドを含む。

別の実施形態において、本発明は、本発明の自己保護ポリヌクレオチドを複数含むアレイを含む。

更なる実施形態において、本発明は、本発明の自己保護ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターを含む。種々の実施形態において、発現ベクターは構成又は誘導ベクターである。

本発明は、生理学的に許容される担体及び本発明の自己保護ポリヌクレオチドを含む組成物を更に含む。

他の実施形態において、本発明は、細胞に本発明の自己保護オリゴヌクレオチドを導入することを含む、遺伝子の発現を低減する方法を提供する。種々の実施形態において、細胞は、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌又は真菌である。一実施形態において、細胞は哺乳動物である。

一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは細胞内に直接導入され、他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞内に単離されたポリヌクレオチドを送達する十分な手段により、細胞外から導入される。

別の実施形態において、本発明は、細胞内に本発明の自己保護ポリヌクレオチドを導入することを含む、疾患を治療する方法を含み、ここで標的遺伝子の過剰発現は疾患に関連する。一実施形態において、疾患は癌である。

本発明は更に、本発明の自己保護ポリヌクレオチドを患者に導入することを含む（ここで単離されたポリヌクレオチドは、感染性物質の進入、複製、組み込み、伝達又は維持を媒介する）、患者における感染を治療する方法を提供する。

更に別の関連する実施形態において、本発明は、本発明の自己保護オリゴヌクレオチドを細胞に導入し（ここで単離されたポリヌクレオチドは遺伝子の発現を抑制し）、細胞の特性に対するポリヌクレオチドの導入の効果を測定して、それにより標的遺伝子の機能を測定することを含む、遺伝子の機能を識別する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、高性能のスクリーニングを使用して実施される。

更なる実施形態において、本発明は、（ａ）長さ１７〜３０個のヌクレオチドであり標的遺伝子に相補的な第１配列を選択すること；（ｂ）自己相補的な領域を含み、第１配列に非相補的である長さ１２〜４８個のヌクレオチドの追加の配列を１つ以上選択すること；及び（ｃ）標的遺伝子に非相補的又は自己相補的であり、工程（ｂ）において選択された追加の配列に非相補的である長さ２〜１２個のヌクレオチドの更に追加の配列を１つ以上選択することを含む、標的遺伝子の発現の調節のための１つ以上の自己相補的な領域を含むポリヌクレオチド配列を設計する方法を提供する。

別の実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、自己相補的な領域を１つ以上欠失している同じポリヌクレオチドよりも、インビボでの半減期が長くなっている。

更に関連する実施形態において、本発明は、細胞に自己保護ポリヌクレオチドを導入することを含む（ここで標的ｍＲＮＡは対応する野生型ｍＲＮＡと比べて突然変異を１つ以上含む、疾患（例えば突然変異したｍＲＮＡ又は遺伝子に関連する疾患）を治療する方法を提供する。特定の一実施形態において、この疾患は嚢胞性線維症である。

同様に、関連する実施形態において、本発明は、細胞に自己保護ポリヌクレオチドを導入することを含む（ここで前記標的ＲＮＡ配列は前記突然変異ｍＲＮＡの領域を含む）、細胞内における突然変異ｍＲＮＡの発現を調節する方法を含む。特定の一実施形態において、突然変異ｍＲＮＡは、嚢胞性線維症に関連する。特定の実施形態において、突然変異ｍＲＮＡは、突然変異体の嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）のポリペプチドをコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡである。別の実施形態において、突然変異ｍＲＮＡは、腫瘍に関連する。別の実施形態において、突然変異ｍＲＮＡは、突然変異体ｐ５３ポリヌクレオチドをコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、インビボ及びインビトロで原核生物及び真核生物における標的遺伝子の発現を抑制する新しい組成物及び方法を提供する。

本発明は部分的に、ステムループ構造を形成することができる１つ以上の自己相補的な領域を更に含むアンチセンスオリゴヌクレオチドがより安定であり、標的遺伝子の発現の抑制において顕著により効果的であるという意外な発見に基づいている。特定の実施形態において、本発明は、インビトロ又はインビボにおいて標的遺伝子の発現を抑制するのに有効な組成物を提供する。その増大した有効性を考慮して、本発明の組成物は、付随する毒性は低減しつつ、より低濃度において、細胞又は対象に送達される場合がある。

Ａ．自己保護ポリヌクレオチド
本発明によれば、標的遺伝子から発現されたｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列並びに１つ以上の自己相補的な領域を含む自己保護ポリヌクレオチドが遺伝子発現の調節に使用される。本明細書で使用される自己保護ポリヌクレオチドとは、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子配列の領域に相補的な一本鎖領域、及びステムループ構造のような２本鎖領域を形成することができるポリヌクレオチドの５’又は３’末端の一方又は両方に位置する１つ以上の自己相補的な領域を含む、単離されたポリヌクレオチドを意味する。自己保護ポリヌクレオチドは又、本明細書において自己保護オリゴヌクレオチドとも呼ばれる。本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、安定性及び有効性の向上といった、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ干渉分子のような先行技術のポリヌクレオチド抑制剤よりも優れた意外な利点をもたらす。

特定の実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、標的遺伝子に相補的な配列の領域を複数含む。特定の実施形態において、これらの領域は、同じ標的遺伝子又はｍＲＮＡに相補的であるのに対して、他の実施形態において、これらは２つ以上の異なる標的遺伝子又はｍＲＮＡに相補的である。従って、本発明は、１つ以上の標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的な一連の配列を含む自己相補的なポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、これらの配列は、標的ｍＲＮＡ配列に非相補的又は半相補的であり、自己相補的な領域に非相補的である配列の領域により分離されている。標的遺伝子又はｍＲＮＡに相補的な多重配列を含む自己保護ポリヌクレオチドの他の実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、標的遺伝子に相補的な配列の領域１つ以上の５’末端若しくは３’末端又はそれらの両端において自己相補的な領域を含む。特定の実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、標的遺伝子に相補的な各領域の５’及び３’末端において自己相補的な領域を有する、１つ以上の標的遺伝子に相補的な配列の領域を複数含む。

本明細書で使用される「自己相補的な」という用語は、ヌクレオチド配列の第１領域がヌクレオチド配列の第２領域と結合してＡ−Ｔ（Ｕ）及びＧ−Ｃハイブリダイゼーションの対を形成するヌクレオチド配列を指す。相互に結合するヌクレオチド配列の２つの領域は、隣接する場合もあれば、他のヌクレオチドにより分離される場合もある。「非相補的」という用語は、ヌクレオチドの特定の伸長において、標的とアラインしてＡ−Ｔ（Ｕ）又はＧ−Ｃハイブリダイゼーションを形成するヌクレオチドがないことを指す。「半相補的」という用語は、ヌクレオチドの伸長において、標的とアラインしてＡ−Ｔ（Ｕ）又はＧ−Ｃハイブリダイゼーションを形成する少なくとも１組のヌクレオチド対があるものの、生理学的条件下でのヌクレオチドの伸長における結合を支援するのに十分な数の相補ヌクレオチド対はないことを指す。

「単離された」というという用語は、ある物質の天然の状態において物質に通常付随している成分を少なくとも部分的に含有しない物質を指す。単離は原料又は周囲からの分離の程度を意味する。本明細書で使用される「単離された」とは、例えばＤＮＡに関する場合、他のコーディング配列からは実質的に離れているポリヌクレオチド、及びＤＮＡ分子が非関連のコーディングＤＮＡの大部分、例えば大型の染色体フラグメント又はその他の機能的遺伝子又はポリペプチドコーディング領域を含有しないことを指す。当然ながら、これは元々単離されているＤＮＡ分子を指し、後に人為的にセグメントに付加された遺伝子又はコーディング領域を排除するものではない。

種々の実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはペプチド核酸、又はこれらの型の分子の何れか又は全ての組合せを含む。更に、自己保護ポリヌクレオチドは、修飾された核酸、又は核酸の誘導体又は類縁体を含む場合がある。

核酸の修飾の例には、ビオチン標識、蛍光標識、ポリペプチドに第１アミンを導入するアミノ修飾物質、ホスフェート基、デオキシウリジン、ハロゲン化ヌクレオシド、ホスホロチオエート、２’−ＯＭｅＲＮＡ類縁体、キメラＲＮＡ類縁体、ウオッブル基及びデオキシイノシンが含まれるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される［類縁体」という用語は、本明細書のポリヌクレオチドと同じ構造及び／又は機能（例えば標的への結合）を保持する分子、化合物又は組成物を指す。類縁体の例には、ペプチドミメティック、ペプチド核酸並びに小型及び大型の有機又は無機化合物が含まれる。

本明細書で使用される「誘導体」又は「変異体」という用語は、１つ以上の核酸の欠失、付加、置換又は側鎖修飾により天然のポリヌクレオチド（例えば標的遺伝子配列）とは異なるポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態において、変異体は、標的遺伝子配列の領域に少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。即ち、例えば特定の実施形態において、本発明の自己保護オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子配列の変異体に相補的である領域を含む。

何れの場合においても、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、標的遺伝子又はポリヌクレオチド配列（又はその変異体）の１つ以上の領域に相補的であり、より好ましくは完全に相補的である配列領域を含む。特定の実施形態において、標的遺伝子（又はｍＲＮＡ）に相補的な配列領域の選択は、選択された標的配列の解析、並びに二次構造、Ｔｍ結合エネルギー及び相対的安定性の測定に基づく。このような配列は、宿主細胞における標的ｍＲＮＡへの特異的結合を低減又は禁止する、２量体、ヘアピン又はその他の二次構造を形成することが相対的に不可能であることに基づいて選択してよい。ｍＲＮＡの極めて好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドンにある又はその周辺にある領域、及びｍＲＮＡの５’領域に実質的に相補的である配列が含まれる。これらの二次構造の解析及び標的部位の選択の検討は、例えばＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェアのｖ．４及び／又はＢＬＡＳＴＩＮ２．０．５アルゴリズムソフトウェアを使用して実施することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７， ２５（１７）： ３３８９−４０２）。

別の実施形態において、標的部位は、ＡＡジヌクレオチド配列の存在に関して標的ｍＲＮＡ転写物配列をスキャンすることにより選択される。３’末端の隣接する約１９個のヌクレオチドと組み合わせた各ＡＡジヌクレオチドは、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位である。一実施形態において、調節領域を結合するタンパク質はポリヌクレオチドの結合を妨害する場合があるため、標的部位は５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は開始コドン周辺の領域（約７５塩基内）内に位置しないことが優勢である。更に、潜在的な標的部位は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍのＮＣＢＩサーバーで入手できるＢＬＡＳＴＮ２．０．５のような適切なゲノムデータベースと比較される場合があり、他のコーディング配列との有意な相同性を有する潜在的な標的配列は除外される。

標的遺伝子又はｍＲＮＡは、何れかの種、例えば植物、動物（例えば哺乳動物）、原生動物、ウイルス、細菌又は真菌のものである場合がある。

上述の通り、標的遺伝子配列、及び自己保護ポリヌクレオチドの相補領域は、相互の完全な相補体である場合もあれば、鎖が生理学的条件下で相互にハイブリダイズする限りにおいて、完全な相補体ではない場合もある。

本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的な領域、並びに１つ以上の自己相補的な領域を含む。更に、それらは場合により、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的な領域と自己相補的な領域の間に位置する１つ以上のギャップ領域を含む場合がある。

一般的に、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的な領域は、長さ１７〜３０個のヌクレオチドであり、これらの範囲内の整数値も含まれる。この領域は少なくとも長さ１６個のヌクレオチド、少なくとも長さ１７個のヌクレオチド、少なくとも長さ２０個のヌクレオチド、少なくとも長さ２４個のヌクレオチド、長さ１６〜２４個のヌクレオチド、又は長さ１７〜２４個のヌクレオチドである場合があり、これらの範囲内の何れかの整数値も含まれる。

自己相補的な領域は、一般的に長さ１４〜３０個のヌクレオチド、少なくとも長さ１４個のヌクレオチド、少なくとも長さ１６個のヌクレオチド、又は少なくとも長さ２０個のヌクレオチドであり、これらの範囲内の何れかの整数値も含まれる。特定の実施形態において、自己相補的な領域は、ポリヌクレオチドの５’又は３’末端に位置する。ポリヌクレオチドが２つの自己相補的な領域を含む場合、特定の実施形態において、１つは５’末端に位置し、１つは３’末端に位置する。

好ましい実施形態において、自己相補的な領域は、２本鎖構造を形成するために十分な長さを有する。一実施形態において、自己相補的な領域は、自己相補的な配列の２本鎖領域及び一本鎖配列のループを含むステムループ構造を形成する。従って、一実施形態において、自己相補的な領域の一次配列は、相補的ではないか半相補的である追加の配列により分離される相互に相補的である配列の２つの伸長を含む。最適には至らないが、追加の配列は特定の実施形態において相補的であってもよい。追加の配列はステムループ構造のループを形成するため、２つの相補的な伸長が相互に結合できるようにために必要な折畳を容易にするために十分な長さを有する必要がある。特定の実施形態において、ループ配列は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、又は少なくとも６個の塩基を含む。一実施形態において、ループ配列は４個の塩基を含む。（自己相補的な領域内、即ちステム領域内の）相互に相補的な配列の２つの伸長は、生理学的条件下で相互に特異的にハイブリダイズするために十分な長さを有する。特定の実施形態において、各伸長は４〜１２個のヌクレオチドを含み；他の実施形態において各伸長は少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、又は少なくとも１０個のヌクレオチドを含み、又はこれらの範囲内の何れかの整数値も含む。特定の実施形態において、自己相補的な領域は、少なくとも４個のヌクレオチドのループ配列により分離された少なくとも４個の相補ヌクレオチドの２つの伸長を含む。更に、自己保護ポリヌクレオチドが自己相補的な領域を複数含む場合、好ましい実施形態において、これらの２つの領域は、相互に相補的ではない。更に、好ましい実施形態において、自己相補的な領域は、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的である自己保護ポリヌクレオチドの領域に相補的ではない。

特定の実施形態において、任意のギャップ領域は、少なくとも長さ１個、少なくとも長さ２個、少なくとも長さ３個、少なくとも長さ４個のヌクレオチド、又は長さ１〜６個のヌクレオチドを含み、これらの範囲内の何れかの整数値も含む。種々の実施形態において、ギャップ領域は、標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に相補的ではないか、又は標的ｍＲＮＡ又は遺伝子に半相補的である。一実施形態において、ギャップ領域は、自己相補的な領域のステム領域に相補的ではない。

特定の実施形態において、自己相補的な領域は、例えばステムループ構造を形成するための自己相補的な領域の結合に適した熱力学的パラメータを有している。

一実施形態において、自己相補的な領域は、自由エネルギー解析を介したＲＮＡの使用により熱力学的に計算された後、残存する「非自己相補的な領域」又はループ領域内に含まれるエネルギーと比較されることにより、エネルギー組成が所望の構造、例えばステムループ構造を形成するのに十分であることが確認される。一般的に、ステムループ構造の組成物を決定するに当たっては、ｍＲＮＡ標的領域の異なるヌクレオチド配列が考慮されており、これによりそれらの形成を確実に行っている。自由エネルギー解析式は、ここでもヌクレオチドの型、又はそれが使用される環境のｐＨに相応するように改変される場合がある。当該技術分野では、多くの異なる二次構造の予測プログラムが使用可能であり、それぞれが本発明に従って使用される場合がある。ＲＮＡ及びＤＮＡ塩基の熱力学的パラメータも又、一部が当該技術分野で使用可能な標的配列選択アルゴリズムと組み合わせて一般的に入手可能である。

一実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、（ａ）ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であり、これと生理学的条件下でハイブリダイズすることができる長さ１７〜３０個のヌクレオチド（これらの範囲内の何れかの整数値も含む）を含む配列を含むか、これらからなり、（ｂ）長さ１〜４個のヌクレオチドを含む２つのギャップ領域によりフランキングされ、（ｃ）長さ１６〜２４個のヌクレオチド（これらの範囲内の何れかの整数値も含む）を含む２つの自己相補的な配列を含むか、これらを含む。一実施形態において、各自己相補的な配列は、ステムループ構造を形成することができ、その内の１つが自己保護ポリヌクレオチドの５’末端に位置し、もう１つが３’末端に位置する。

特定の実施形態において、自己相補的な領域は、細胞内の条件のような生理学的条件下において自己保護オリゴヌクレオチドの分解を抑制又は低減する機能を有する。特定の理論に拘束されるものではないが、自己相補的な領域により採用される構造によって、ヌクレアーゼ分解に対するポリヌクレオチドの耐性が自己相補的な領域を欠失しているものよりも高くなると考えられる。更に、自己相補的な領域により採用される構造が存在することで、細胞の取り込みが促進され、望ましくない副作用が低減されると考えられる。従って、種々の実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、本明細書に記載する通り、自己相補的な領域を欠失した同じポリヌクレオチドよりも、インビボでの半減期が長くなっている。半減期は、種々の実施形態において、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍長くなる場合がある。

好ましい実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、標的ｍＲＮＡに結合して、その発現を低減する。標的遺伝子は、既知の標的遺伝子である場合もあれば、或いは既知ではない場合もあり、即ち、ランダム配列が使用される場合もある。特定の実施形態において、標的ｍＲＮＡのレベルは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下する。

本発明の一実施形態において、標的遺伝子発現（即ちｍＲＮＡ発現）の抑制レベルは、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又であり、又はほぼ１００％であり、従って細胞又は生物は、実質的に遺伝子のいわゆる「ノックアウト」と等しい表現型を有することになる。しかし、一部の実施形態では、表現型が遺伝子のいわゆる「ノックアウト」と等しくなるように一部の抑制のみが達成されることが望ましい場合もある、遺伝子発現をノックダウンするこの方法は、治療又は研究のため（例えば、疾患状態のモデルを作成するため、遺伝子の機能を調べるため、薬剤が遺伝子に対して作用するかどうかを試験するため、標的の薬剤送達を確認するため）に使用することができる。

本発明は更に、マイクロアレイを含む、本発明の自己保護ポリヌクレオチドのアレイを提供する。マイクロアレイは、一般的に化学及び生化学反応を実施するためのマイクロメートルからミリメートル範囲の大きさを有する小型のデバイスであり、本発明の実施形態に特に適している。アレイは、半導体産業及び／又は生化学産業において既知であり使用可能な実質的に全ての手法を使用した超小型電子技術及び／又は超小型加工技術を介して構築される場合があるが、但し、そのような技法がポリヌクレオチド配列の堆積及び／又はスクリーニングに適しており、適合している場合にのみ可能となる。

本発明のマイクロアレイは、２つ以上の自己保護ポリヌクレオチドの高性能解析に特に望ましいものである。マイクロアレイは、一般的に本発明の自己保護ポリヌクレオチドを含む個別の領域又はスポットを有するように構築し、各スポットは好ましくはアレイ表面上の位置指定可能な場所において１つ以上の自己保護ポリヌクレオチドを含む。本発明のアレイは、当該技術分野で使用可能な何れかの方法により作成される場合がある。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより開発された光指向化学合成方法（米国特許５，４４５，９３４及び５，８５６，１７４を参照）を使用して、光リソグラフ加工技法に固相光化学合成を組み合わせることにより、チップ表面上で生物分子を合成する場合がある。Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌにより開発された化学堆積手法は、チップ表面上への指向性堆積のために事前に合成したｃＤＮＡプローブを使用している（例えば米国特許５，８７４，５５４を参照）。

特定の実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、当該技術分野で広範に使用されている技法を使用して合成される。他の実施形態において、これは、適切且つ広範に知られた技法を使用して、インビトロ又はインビボで発現される。従って、特定の実施形態において、本発明は、本発明の自己保護ポリヌクレオチドの配列を含む、インビトロ及びインビボの発現ベクターを含む。当業者に良く知られる方法を使用して、自己保護ポリヌクレオチドをコードする配列並びに適切な転写及び翻訳制御因子を含有する発現ベクターが構築される場合がある。これらの方法には、インビトロ組み換えＤＮＡ技法、合成技法及びインビボ遺伝子組み換えが含まれる。このような技法については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．、及びＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．に記載されている。

発現ベクターには一般的に、自己保護ポリヌクレオチドの発現を調節する調節配列が含まれる。発現ベクター内に存在する調節配列には、ベクターの非翻訳領域、例えばエンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域が含まれ、これらは宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を実施する。このような因子は、その強度及び特異性が変動する場合がある。利用するベクター系及び細胞に応じて、任意の数の好適な転写及び翻訳因子、例えば構成及び誘導プロモーターが使用される場合がある。更に、組織特異的又は細胞特異的なプロモーターが使用される場合もある。

哺乳動物細胞における発現においては、哺乳動物遺伝子由来又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般的に好ましい。更には、２つ以上のウイルス系の発現系も一般的に使用できる。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、対象となるポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーター及び３要素のリーダー配列よりなるアデノウイルス転写／翻訳複合体内にライゲーションする場合がある。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域の挿入を使用して、感染した宿主細胞でのポリペプチドの発現が可能な生存ウイルスを得る場合もある（Ｌｏｇａｎ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ， Ｔ． （１９８４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２： ３６５５−３６５９）。更に、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを使用して、哺乳動物宿主細胞内の発現を増大させる場合がある。

特定の実施形態において、本発明は、自己保護ポリヌクレオチドのコンディショナル発現を提供する。細胞及び動物の両方で使用される種々のコンディショナル発現系が当該技術分野で知られ、使用可能であり、本発明は自己保護ポリヌクレオチドの発現又は活性を調節するためのかかる何れかのコンディショナル発現系の使用を意図している。本発明の一実施形態において、例えば誘導発現は、ＲＥＶ−ＴＥＴ系を使用して達成される。この系の要素並びに遺伝子の発現を制御するためにこの系を使用する方法は、文献に詳細に記載されており、テトラサイクリン制御性転写活性因子（ｔＴＡ）又は逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を発現するベクターが市販されている（例えばｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ及びｐｔＴＡ−２／３／４ベクター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ［米国カリフォルニア州パロアルト］）。このような系は、例えば参考として全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５６５０２９８号、第６２７１３４８号、第５９２２９２７号及び関連特許に記載されている。

特定の一実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、ｐＳＵＰＥＲベクター骨格を含むベクター系及び発現する自己保護ポリヌクレオチドに対応する追加の配列を使用して発現される。ｐＳＵＰＥＲベクター系は、ｓｉＲＮＡ試薬を発現する場合、及び遺伝子発現をダウンレギュレートする場合に有用であることが分かっている（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， Ｔ． Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６： ５５０ （２２０２）、及びＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ， Ｔ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ａｕｇｕｓｔ ２２， ２００２）。ｐＳＵＰＥＲベクターは、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ［米国ワシントン州シアトル］から市販されている。

Ｂ．遺伝子発現を調節する方法
本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、種々の目的に使用される場合があり、一般的には全てが標的遺伝子の発現を抑制又は低減する能力に関連している。従って、本発明は、標的遺伝子又はその相同体、変異体若しくはオーソログを含有する細胞に本発明の自己保護ポリヌクレオチドを導入することを含む、１つ以上の標的遺伝子の発現を低減する方法を提供する。更に、自己保護ポリヌクレオチドは、発現を間接的に低減するために使用される場合がある。例えば、自己保護ポリヌクレオチドは第の遺伝子の発現を駆動する転写活性因子の発現を低減することにより、第の遺伝子の発現を低減するために使用される場合がある。同様に、自己保護ポリヌクレオチドは、発現を間接的に増大させるために使用される場合がある。例えば、自己保護ポリヌクレオチドは、第の遺伝子の発現を抑制する転写リプレッサーの発現を低減することにより、第の遺伝子の発現を増大させるために使用される場合がある。

種々の実施形態において、標的遺伝子は、自己保護ポリヌクレオチドを導入する細胞から誘導した遺伝子、内因性遺伝子、外因性遺伝子、トランスジーン、又は細胞のトランスフェクション後に細胞中に存在する病原体の遺伝子の何れかとなる。特定の標的遺伝子及び細胞内に送達される自己保護ポリヌクレオチドの量に応じて、本発明の方法は、標的遺伝子の発現の抑制を部分的又は完全に誘発する場合がある。標的遺伝子を含有する細胞は、何れかの生物（例えば植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌又は真菌）から誘導されるものの場合もあれば、それに含有されるものの場合もある。

標的遺伝子の発現の抑制は、例えば、本発明の分野の当業者の知る技法を使用して、標的遺伝子によりコードされるタンパク質、及び／又は標的遺伝子由来のｍＲＮＡ産物、及び／又は遺伝子の発現に関連する表現型、のレベルの非存在又は観察可能な低下を観察又は検出することが含まれるがこれらに限定されない手段により確認することができる。

本発明の自己保護ポリヌクレオチドの導入により誘発される作用を測定するために検査される場合がある細胞の特徴の例には、細胞増殖、アポトーシス、細胞周期の特性、細胞分化及び形態学的特徴が含まれる。

自己保護ポリヌクレオチドは、直接細胞に（即ち細胞内に）導入される場合もあれば、細胞外の体腔、間質空間内に導入される、生物の循環系に導入される、経口導入される、自己保護ポリヌクレオチドを含有する溶液に生物を浸積することにより導入される、又は細胞内に自己保護ポリヌクレオチドを送達するために十分なその他の手段により導入される場合もある。

更に、自己保護ポリヌクレオチドを発現するように操作されたベクターが細胞内に導入される場合もあり、その場合このベクターが自己保護ポリヌクレオチドを発現することによって、細胞内にこれを導入する。細胞内に発現ベクターを転移させる方法は広範に知られ、当該技術分野で使用可能であり、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、スクレープローディング、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、遺伝子銃及びレトロトランスポジションが含まれる。一般的に、細胞内にベクターを導入する好適な方法は、ベクターの型及び細胞の型、並びに当該技術分野で広範に入手できる教示内容に基づいて当業者により容易に決定される。感染性物質は、当該技術分野で容易に使用可能な種々の手段、例えば経鼻吸入により導入される場合がある。

本発明の自己保護オリゴヌクレオチドを使用した遺伝子発現を抑制する方法は、他のノックダウン及びノックアウト方法、例えば遺伝子ターゲティング、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、２本鎖ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）と組み合わせることにより、標的遺伝子の発現を更に低減する場合がある。

種々の実施形態において、本発明の標的細胞は、初代細胞、細胞系統、不朽化細胞又は形質転換細胞である。標的細胞は体細胞である場合もあれば、生殖細胞である場合もある。標的細胞は非***細胞、例えばニューロンでる場合もあれば、好適な細胞培養条件においてインビトロで増殖できる場合もある。標的細胞は正常細胞である場合もあれば、疾患細胞、例えば既知の遺伝子突然変異を含有するものである場合もある。本発明の真核生物の標的細胞には、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、ネズミ細胞、げっ歯類細胞及び霊長類細胞が含まれる。一実施形態において、本発明の標的細胞は幹細胞であり、これには例えば胚性幹細胞、例えばネズミ胚性幹細胞が含まれる。

本発明の自己保護ポリヌクレオチド及び方法は、例えば、炎症性疾患、心臓血管疾患、神経系疾患、腫瘍、脱髄疾患、消化系疾患、内分泌系疾患、生殖系疾患、血液リンパ疾患、免疫学的疾患、精神障害、骨格筋疾患、神経学的障害、神経筋疾患、代謝疾患、性感染症、皮膚及び結合組織の疾患、泌尿器疾患及び感染症を含むがこれらに限定されない広範な種類の疾患又は障害の何れかを治療するために使用される場合がある。

これらの方法は、特定の実施形態では動物にて、特定の実施形態では哺乳動物にて、特定の実施形態ではヒトにて実施される。

従って、一実施形態において、本発明には、遺伝子の脱調節、過剰発現又は突然変異に関連する疾患の治療又は予防のために自己保護オリゴヌクレオチドを使用する方法が含まれる。例えば、自己保護ポリヌクレオチドを癌性細胞又は腫瘍に導入することによって、癌原性／腫瘍発生性の表現型の維持に必要な、又はそれに関連する遺伝子の発現が抑制される場合がある。疾患又はその他の病状を予防するために、標的遺伝子は、例えば疾患／病状の開始又は維持に必要なものが選択される場合がある。治療には、疾患に関連する何れかの症状又は病状に関連する臨床適応症の緩解が含まれる。

更に、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、遺伝子突然変異に関連する疾患又は障害を治療するために使用される。一実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、突然変異した遺伝子又は対立遺伝子の発現を調節するために使用される。当該実施形態において、突然変異した遺伝子は、突然変異した遺伝子の領域に相補的な領域を含む自己保護ポリヌクレオチドの標的である。この領域は突然変異を含む場合があるが、必須ではなく、遺伝子の別の領域も又ターゲティングされ、それにより突然変異体の遺伝子又はｍＲＮＡの発現の低下をもたらす場合がある。特定の実施形態において、この領域は突然変異を含み、関連する実施形態において、得られた自己保護オリゴヌクレオチドは、突然変異体のｍＲＮＡ又は遺伝子の発現を特異的に抑制するが、野生型のｍＲＮＡ又は遺伝子は抑制しない。このような自己保護ポリヌクレオチドは、例えば対立遺伝子が突然変異しているものとしていないものがある状況において特に有用である。しかし、他の実施形態において、この配列は必ずしも突然変異を含んでいなくてもよく、従って、野生型配列のみを含む場合がある。このような自己保護ポリヌクレオチドは、例えば全ての対立遺伝子が突然変異している状況において特に有用である。当該技術分野では、種々の疾患及び障害が遺伝子の突然変異に関連するか、これにより誘発されることが知られており、本発明はこのような疾患又は障害何れかの自己保護ポリヌクレオチドによる治療を包含する。例えば、一実施形態において、嚢胞性線維症は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子をターゲティングする自己保護ポリヌクレオチドを使用して治療される。別の実施形態において、癌はｐ５３遺伝子又は対立遺伝子をターゲティングする自己保護ポリヌクレオチドを使用して治療される。特定の実施形態において、ｐ５３遺伝子又は対立遺伝子は、突然変異体のｐ５３遺伝子又は対立遺伝子である。

特定の実施形態では、病原体の遺伝子が抑制のためにターゲティングされる。例えば、遺伝子は宿主の免疫抑制を直接誘発するか、又は病原体の複製、病原体の伝達、若しくは感染の維持に必須である可能性がある。更に、標的遺伝子は宿主への病原体の進入、病原体又は宿主による薬剤代謝、病原体のゲノムの複製又は組込み、宿主内における感染の樹立又は拡大、又は次世代の病原体の構築を担う病原性遺伝子又は宿主遺伝子である場合もある。予防の方法（即ち感染の防止又は危険性の低減）並びに感染に関連する症状の頻度又は重症度の低減は、本発明に包含される。例えば、病原体による感染の危険性がある細胞又は既に感染している細胞、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症は、本発明に基づく自己保護ポリヌクレオチドの導入による治療のためにターゲティングされる場合がある。

他の特定の実施形態において、本発明は、何れかの型の癌の治療又は治療法の開発のために使用される。本明細書に記載した方法を使用して治療できる腫瘍の例には、神経芽腫、骨髄腫、前立腺癌、小細胞肺癌、結腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、脳腫瘍、乳癌、白血病、リンパ腫等が含まれるが、これらに限定されない。

自己保護ポリヌクレオチド及び発現ベクター（ウイルスベクター及びウイルスを含む）は、インビトロ又はｅｘ ｖｉｖｏにて細胞に導入され、その後動物に投入して治療に付す場合もあれば、インビボ投与により患者に直接導入される場合もある。即ち、本発明は、特定の実施形態において、遺伝子療法の方法を提供する。本発明の組成物は、２つ以上の方法の何れかにより患者に投与される場合あり、例えば、非経腸、静脈内、全身、局所、経口、腫瘍内、筋肉内、皮下、腹腔内、吸入、又は何れかのこのような送達方法が含まれる。一実施形態において、組成物は、非経腸投与、即ち関節内、静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内投与される。特定の実施形態において、リポソーム組成物は、静脈内注入により投与されるか、又は瞬時注射により腹腔内投与される。

本発明の組成物は、患者への送達に好適な医薬組成物として製剤化される場合がある。本発明の医薬組成物は、１つ以上の緩衝液（例えば中性乾燥食塩水又はリン酸塩緩衝食塩水）、炭水化物（例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストロース又はデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド又はアミノ酸（例えばグリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート形成剤（例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン）、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、製剤をレシピエントの血液と等張、低張又は弱低張にする溶質、懸濁剤、濃厚化剤及び／又は保存料を更に含むことが多くなる。或いは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として製剤化される場合がある。

患者に投与される自己保護オリゴヌクレオチドの量は、種々の要因、例えば疾患、及び使用するベクターから発現される自己保護オリゴヌクレオチドのレベル（ベクターを投与する場合）を基に、医師が容易に決定することができる。用量当たりの投与量は、一般的に最低治療用量を上回るが毒性用量を超えない量となるように選択される。用量当たりの量の選択は、２つ以上の要因、例えば患者の病歴、その他の療法の使用、及び疾患の性質等により異なる。更に、投与量は、患者の治療への応答、及び治療に関連する副作用の有無又は重症度に応じて、治療期間を通して調整される場合がある。

本発明には更に、これまで未知であった機能の標的遺伝子の活性を抑制するための自己保護ポリヌクレオチドの使用を含む、生物における遺伝子機能を同定する方法が含まれる。従来の遺伝子スクリーニングによる時間と手間のかかる単離に代わり、機能ゲノム学は、標的遺伝子活性の量を低減し、及び／又はその時期を改変するために本発明を使用することにより、特徴付けされていない遺伝子の機能を測定することを想定している。本発明は、医薬品の潜在的標的の決定、発達に関連する正常及び病理学的事象の解明、生後の発達／加齢に関与するシグナリング経路の決定等において使用される場合がある。ゲノム及び発現した遺伝子の供給源、例えばコウボ、Ｄ・メラノガスター及びＣ・エレガンスのゲノムからヌクレオチド配列情報を取得する、次第に速まる速度を本発明と組み合わせることで、生物（例えば線虫）中の遺伝子の機能を決定することができる。特定のコドンを使用するための種々の生物の優先性、関連する遺伝子産物の配列データベースの検索、遺伝形質の連鎖マップとヌクレオチド配列誘導元の物理的地図との相関、及び人工知能法を使用して、このような配列決定プロジェクトで取得されるヌクレオチド配列から推定オープンリーディングフレームを定義する場合もある。

一実施形態において、例えば遺伝子の機能又は生物学的活性を特定するために、自己保護オリゴヌクレオチドが使用され、発現配列タグ（ＥＳＴ）から得られる部分配列に基づいて遺伝子発現が抑制される。成長、発達、代謝、疾患耐性又はその他の生物学的プロセスにおける機能的な改変は、ＥＳＴの遺伝子産物の正常な役割を示す。

標的遺伝子を含有する未損傷の細胞／生物内に自己保護ポリヌクレオチドを容易に導入できることから、本発明はハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）に使用することができる。例えば、異なる発現遺伝子を抑制できる自己保護ポリヌクレオチドを含有する溶液は、順序付けされたアレイとして微量定量プレート配置された個々のウェルに入れることができ、各ウェル内の未損傷の細胞／生物について、標的遺伝子活性の抑制に起因する挙動又は発達における何らかの変化又は修飾があるかどうかを評価することができる。標的遺伝子の機能は、遺伝子活性が抑制された場合に細胞／生物に及ぼす作用から評価することができる。一実施形態において、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、化学ゲノムスクリーニングに使用され、即ち、本発明の自己保護ポリヌクレオチドを使用した遺伝子発現の低減によりモデル化される、疾患を退行させる化合物の能力が試験される。

ＲＦＬＰ又はＱＴＬ解析により生物の特性が多形に遺伝子的に関連していると判明した場合、本発明は、その遺伝子的多形が特性を直接担っているかどうかに関する知見を得るために使用することができる。例えば、遺伝子多形を定義するフラグメント、又はそのような多形の周辺の配列を増幅して、ＲＮＡを作成し、自己保護ポリヌクレオチドを生物に導入して、特性の改変が抑制に相関するかどうかを調べることができる。

本発明は又、必須遺伝子の抑制を可能にする場合にも有用である。そのような遺伝子は、特定の発達段階又は細胞コンパートメントにおいてのみ細胞又は生物の生存能力に必須となる場合がある。標的遺伝子の活性を、これが生存能力に必須でない場合又は場所において抑制することにより、コンディショナル突然変異の機能的等価物が産生される場合がある。本発明は、標的のゲノムに永久突然変異を導入することなく、生物の特定の発生時期及び場所における自己保護ポリヌクレオチドの付加を可能にする。同様に、本発明は、所望の時にのみ自己保護ポリヌクレオチドを発現する誘導又はコンディショナルベクターの使用を意図している。

本発明は又、遺伝子産物が創薬又は新薬開発のための標的であるかどうかを確認する方法に関する。分解のために遺伝子に対応するｍＲＮＡをターゲティングする自己保護ポリヌクレオチドが、細胞又は生物内に導入される。細胞又は生物をｍＲＮＡの分解が起こる条件下に維持することで、遺伝子の発現が低下する。この遺伝子発現の低下により細胞又は生物に作用が及ぶかどうかが調べられる。遺伝子発現の低下が作用を及ぼす場合は、遺伝子産物が創薬又は新薬開発の標的となる。

Ｃ．自己保護ポリヌクレオチドの設計及び生成方法
本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、自己保護ポリヌクレオチドの利点を付与する１つ以上の２本鎖領域を含有する二次構造（一般的にステムループ構造）を採用するように配置された、一連の新規で固有の機能的配列を含む。従って、特定の実施形態において、本発明には、本発明の自己保護ポリヌクレオチドを設計する方法が含まれる。そのような方法では一般的に、自己保護ポリヌクレオチドの種々の配列成分の適切な選択が行われる。

一実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドの基本設計は、以下の通りとなる：
設計モチーフ：
（ステムＡ）（ループＡ）（ステムＢ）（Ｘ）（標的）（Ｘ）（ステムＣ）（ループＢ）（ステムＤ）
ｘ＝任意のスペーサー
従って、関連する実施形態において、自己保護ポリヌクレオチドは、以下の通り設計される：
ａ．標的ヌクレオチド配列から始める。この長さ及び組成は、全ステム及びループ領域の長さ及び配列組成に影響する。

ｂ．ステムＡ及びＤは、酵素適合性のために特定のヌクレオチドを必要とする場合がある。

ｃ．標的の等しい長さ領域に支配的な融点を持つ（４〜１２個の）ヌクレオチドを含むステムＡ及びＢの候補を構築する。ステム鎖は、相互にＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ相補性を有する。

ｄ．標的の等しい長さ領域に支配的な融点を持つ（４〜１２個の）ヌクレオチドを含むステムＣ及びＤの候補を構築する。ステム鎖は、相互にＡ−Ｔ、Ｇ−Ｃ相補性を有するが、ステムＡ及びＢに対する相補性は有さない。

ｅ．（４〜８個の）Ａ−Ｔリッチのヌクレオチドを使用してループ候補を構築し、ループＡ及びＢとする。

ｆ．各モチーフ候補の隣接配列を構築する。

ｇ．所望のパラメータを有するソフトウェアを使用して候補配列を折り畳む。

ｈ．出力から、所望のステム／ループ構造を有する一端又は両端でフランキングされた一本鎖標的領域を有する構造を特定する。

一実施形態において、標的遺伝子の発現を調節するための自己相補的な領域を１つ以上有するポリヌクレオチド配列（即ち自己保護ポリヌクレオチド）を設計する方法には、（ａ）長さ１７〜３０個のヌクレオチドからなり、標的遺伝子に相補的な第１配列を選択すること；及び（ｂ）自己相補的な領域を含み、第１配列に非相補的である、長さ１２〜４８個のヌクレオチドの追加の配列を１つ以上選択することが含まれる。別の実施形態において、この方法は更に、（ｃ）標的遺伝子に非相補的又は半相補的であり、工程（ｂ）で選択された追加の配列に非相補的である、長さ２〜１２個のヌクレオチドの更に追加の配列を１つ以上選択することが含まれる。

これらの方法には、特定の実施形態において、工程（ｂ）で選択された配列により採用された二次構造を決定又は予測することにより、例えばそれらの配列がステムループ構造を採用できることを判定することが含まれる。

同様に、これらの方法には、例えばインビボ又はインビトロ試験系において、設計したポリヌクレオチド配列の標的遺伝子発現抑制能力を試験することを含む確認工程が含まれてもよい。

本発明は更に、本明細書に記載した相補性に基づき自己保護ポリヌクレオチドの配列を選択するためのコンピュータプログラムの使用を意図する。即ち、本発明は、自己保護ポリヌクレオチド配列を選択するために使用されるコンピュータソフトウェアプログラム、及び前記ソフトウェアプログラムを格納するコンピュータ読み取り可能な媒体、並びに本発明のプログラムの１つを格納するコンピュータを提供する。

特定の実施形態において、ユーザーは、標的遺伝子の配列、場所又は名称に関する情報をコンピュータに提供する。コンピュータは、この入力を本発明のプログラムにおいて使用することにより、ターゲティングする標的遺伝子の適切な領域を１つ以上同定し、本発明の自己保護ポリヌクレオチドにおいて使用する相補配列を出力又は提供する。次に、コンピュータプログラムは、この配列情報を使用して、自己保護ポリヌクレオチドの自己相補的な領域１つ以上の配列を選択する。一般的に、プログラムは、標的遺伝子、又は標的ｍＲＮＡに相補的な自己保護ポリヌクレオチドの領域を含む、ゲノム配列とは相補的でない配列を選択する。更に、プログラムは、相互に相補的ではない自己相補的な領域の配列を選択する。所望により、プログラムは又、ギャップ領域の配列も提供する。適切な配列を選択すると、コンピュータプログラムは、ユーザーにこの情報を出力又は提供する。

本発明のプログラムは更に、標的遺伝子を含有する生物のゲノム配列に関する入力、例えば公的又は私的なデータベース、並びに特定の配列の二次構造及び／又はハイブリダイゼーション特性を予測する追加のプログラムを使用することにより、自己保護ポリヌクレオチドが正しい二次構造を採用しており、非標的遺伝子にハイブリダイズしないことを確認する。

本発明は、本明細書に記載の通り自己保護ポリヌクレオチドが標的遺伝子の発現を低減するのに極めて有効であるという意外な発見に部分的に基づいている。自己保護ポリヌクレオチドは、安定性又はヌクレアーゼ耐性及び有効性の向上といった、以前に記載したアンチセンスＲＮＡよりも優れた有意な利点をもたらす。更には、自己保護ポリヌクレオチドを使用することで、ｄｓＲＮＡ分子に伴うオフターゲット抑制が実質的に不要となっていることから、本発明の自己保護ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡに使用される従来のｄｓＲＮＡ分子よりも優れた追加の利点ももたらす。

本発明の実施では、当該技術分野の範囲に含まれる細胞生物学、分子生物学、微生物学及び組み換えＤＮＡの種々の従来の技法が使用される。そのような手法については、文献に詳細に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）；及びＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ． Ｎ， Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）を参照されたい。

実施例１
ＧＬ２ターゲティング自己保護ポリヌクレオチドｐＳＵＰＥＲ発現ベクターの設計及び製造
ＧＬ２ ｍＲＮＡをターゲティングする自己保護ポリヌクレオチドを発現する、ＧＬ２−１２８９ ｐＳＵＰＥＲ、ＧＬ２−０２０９ ｐＳＵＰＥＲ及びＧＬ２−１５３２ ｐＳＵＰＥＲと標記される発現ベクターを、以下の設計パラメータに従い、ｐＳＵＰＥＲベクター骨格を使用して作成した。「５’−３’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ」とは、プラスミド中の非コーディングＤＮＡ鎖を指し；「５’−３’ＲＮＡ−ｔｒａｎｓ」とは、プラスミド由来の発現ＲＮＡ転写物を指し；「５’−３’ＲＮＡ−ｓｔｒｕｃｔ」とは、プラスミドから発現されたＲＮＡ転写物の折畳構造を指し；「３’−５’ｃｏｄｉｎｇ＿ａｓ」とは、プラスミド中のコーディングＤＮＡ鎖を指す。

１．ＧＬ２−１２８９ ｐＳＵＰＥＲのｓｐＤＮＡ設計理論

２．ＧＬ２−０２０９ ｐＳＵＰＥＲのｓｐＤＮＡ設計理論

３．ＧＬ２−１５３２ ｐＳＵＰＥＲのｓｐＤＮＡ設計理論

以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｐＳｕｐｅｒベクター内にサブクローニングするためのＧＬ２遺伝子の領域をＰＣＲ増幅した：

増幅した配列は、通常の分子及び細胞生物学の技法を使用して、ｐＳｕｐｅｒベクター（一般的にＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３６６４６に記載；Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ［米国ワシントン州シアトル］より入手）内にサブクローニングした。

実施例２
自己保護ポリヌクレオチドによる遺伝子発現の抑制
本発明の自己保護オリゴヌクレオチドの抑制作用は、ルシフェラーゼを安定的に生成するヒト胚性腎細胞系統２９３−Ｌｕｘを使用して、インビボの遺伝子発現に対する作用を検査することにより明らかにした（ＧＬ２型）。細胞を血清含有培地５００μＬの２４ウェルディッシュ中にプレーティングした。細胞が概ね６０％コンフルエントとなった時点で、それらを、Ｍｉｒｕｓ’ＴｒａｎｓＩＴ−ｓｉＱｕｅｓｔ試薬１μＬを使用して、ルシフェラーゼ遺伝子に相補的なＲＮＡ配列の領域を含む自己保護オリゴヌクレオチド５０ｐｍｏｌ（又はスクランブルルシフェラーゼ配列を含む陰性対照）でトランスフェクトした。詳細には、使用した自己保護ポリヌクレオチドには、ｓｐ−１９−１２８９、ｓｐ−１９−２０９、ｓｐ−１９−１５３２、ｓｐ−１７−１２８９及びｓｐ−１７−２０９が含まれた。これらの自己保護ポリヌクレオチドのそれぞれにおいて、第１の数（１７又は１９）は標的ルシフェラーゼｍＲＮＡに相補的な領域の長さを指し、第２の数（１２８９、２０９又は１５３２）は相補領域でターゲティングされるルシフェラーゼ遺伝子の第１塩基を指す。細胞は２４時間で採取し、細胞溶解物を照度計で読み取った。

試験した５つの自己保護オリゴヌクレオチドのうち、２つが対照値の５０％〜６０％までルシフェラーゼ発現を低減し、他の２つが対照値の約７５％又は８０％までルシフェラーゼ発現を低減した（表１）。

これらのデータにより、本発明の自己保護ポリヌクレオチド配列が、インビボの遺伝子発現を低減するのに有効であることが示され、遺伝子過剰発現に関連する疾患及び障害の治療を含む種々の目的にこれらを使用できることが立証されている。

実施例３
ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を使用した、哺乳動物細胞におけるｐ５３遺伝子発現の抑制
哺乳動物細胞のｐ５３遺伝子発現の低減における本発明の自己保護オリゴヌクレオチドの有効性を、培養細胞を使用して明らかにした。７５％コンフルエントの２９３−Ｈ細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＢＳＡ ３００μＬを含有する２４ウェルプレート中で、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国ウィスコンシン州マディソン］）２μＬと表２に示した５０ｎｍｏｌのｓｐＲＮＡオリゴヌクレオチド又はｐ５３ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。

ｐ５３遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＮ０８２９２３）は、その転写されたｍＲＮＡ内に、以前に公開されているＲＮＡｉ標的配列を含有している。この標的部位のｍＲＮＡ配列は、ＧＡＣＵＣＣＡＧＵＧＧＵＡＡＵＣＵＡＣ（配列番号１６）である。この配列をターゲティングする「ｓｉＲＮＡ ｐ５３＿ｐｕｂｌｉｃ」及び「ｓｐＲＮＡ ｐ５３＿ｐｕｂｌｉｃ（９．０）」と標記されるｓｉＲＮＡ及びｓｐＲＮＡオリゴヌクレオチドを作成した。これらのオリゴヌクレオチドは、以下の配列を含有しており、ｓｐＲＮＡ ｐ５３＿ｐｕｂｌｉｃ（９．０）は以下に示す構造を有していた。

追加のｓｐＲＮＡオリゴヌクレオチドを作成して、以下のｐ５３ｍＲＮＡ部位をターゲティングしたところ、これは非折畳（ｎ．．１９）：ＵＧＣＣＣＵＣＡＡＣＡＡＧＡＵＧＵＵＵ（配列番号２０）であることが判明した。

ｓｐＲＮＡｐ５３＿８３は、ｎ．．１９結合モチーフの両端に短いステム／ループ構造を含有しており、以下の５’−３’配列及び構造を含んでいる：

ｓｐＲＮＡｐ５３＿８３ ＮＯ−５’は、ｎ．．１９結合モチーフの３’末端側に短いステム／ループ構造を含有しており、以下の５’−３’配列及び構造を含んでいる：

ｓｐＲＮＡｐ５３＿８３＿Ｌｏｎｇは、ｎ．．１９結合モチーフの両端に、より長いステム／ループ構造を含有しており、以下の５’−３’配列及び構造を含んでいる：

ｓｐＲＮＡｐ５３＿８３＿ＬｏｎｇＮＯ−５’は、ｎ．．１９結合モチーフの３’末端側に、より長いステム／ループ構造を含有しており、以下の５’−３’配列及び構造を含んでいる：

細胞を受動溶解緩衝液１００μＬ中において４８時間で回収した。１：４０希釈物１００μＬを、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｐ５３ ＴｉｔｅｒＺｙｍｅ ＥＩＡキット（米国ミシガン州アンアーバー）を使用して試験することにより、存在するｐ５３の量を測定した。表２に示す結果は、試験時に標準曲線を作成するに当たって使用した対照標準物質からの推定値として、ｐ５３をピコグラムで示している。ｐ５３のノックダウン率は、擬似トランスフェクションウェルと比べたｐ５３のピコグラムに基づいている。

これらを比較したところ、ｓｉＲＮＡ ｐ５３ ｐｕｂｌｉｃを使用して得た結果は、ｐ５３が１６０ｐｇであった（内因性ｐ５３の３２％ノックダウン）。

これらの結果は、本発明の自己保護オリゴヌクレオチドが哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を低減するのに有用であることを証明しており、遺伝子の過剰発現、脱調節、不適切な発現又は遺伝子の突然変異により誘発される疾患、例えば、ｐ５３の突然変異により誘発される腫瘍を治療する際のこれらの有用性を裏付けている。更にこれらの結果は、本発明の自己保護ポリヌクレオチドが、標的遺伝子発現の低減において、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドよりも有効性が高いことも示している。

実施例４
ＳｉＱｕｅｓｔ試薬を使用した哺乳動物細胞におけるｐ５３遺伝子発現の抑制
哺乳動物細胞のｐ５３遺伝子発現の低減における自己保護オリゴヌクレオチドの有効性を、異なるトランスフェクション剤により培養細胞を使用して明らかにした。６５％コンフルエントの２９３−Ｈ細胞を、ＤＭＥＭ／１０％ＢＳＡ ３００μＬを含有する２４ウェルプレート中で、ＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｓｉＱＵＥＳＴ^ＴＭ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ［米国ウィスコンシン州マディソン］）１μＬと表３に示した５０ｎｍｏｌのｓｐＲＮＡ又はｐ５３ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

細胞を受動溶解緩衝液１００μＬ中において４８時間で回収した。１：４０希釈物１００μＬを、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｐ５３ ＴｉｔｅｒＺｙｍｅ ＥＩＡキットを使用して試験することにより、存在するｐ５３の量を測定した。表３に示す結果は、試験時に標準曲線を作成するに当たって使用した対照標準物質からの推定値として、ｐ５３をピコグラムで示している。ｐ５３のノックダウン率は、擬似トランスフェクションウェルと比べたｐ５３のピコグラムに基づいている。

これらを比較したところ、ｓｉＲＮＡ ｐ５３ ｐｕｂｌｉｃを使用して得た結果は、ｐ５３が２１５ｐｇであった（内因性ｐ５３の３４％ノックダウン）。

これらの結果は、本発明の自己保護オリゴヌクレオチドが哺乳動物細胞における標的遺伝子発現を低減するのに有用であることを証明しており、遺伝子の過剰発現、脱調節、不適切な発現又は遺伝子の突然変異により誘発される疾患、例えば、ｐ５３の突然変異により誘発される腫瘍を治療する際のこれらの有用性を裏付けている。更にこれらの結果は、本発明の自己保護ポリヌクレオチドが、標的遺伝子発現の低減において、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドよりも有効性が高いことも示している。

本明細書において言及した、及び／又は出願データシートに列挙した上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許公開文献は全て、参考として全体が本明細書に組み入れられる。

以上にて本発明の特定の実施形態を説明の目的のためにのみ本明細書に記載してきたが、本発明の趣旨及び適用範囲を逸脱しない範囲で種々の変更が行われる場合があることに留意されたい。

図１は、本発明の代表的なポリヌクレオチドの図である。（Ａ）は標的ｍＲＮＡに相補的な配列を含む領域を示し；（Ｂ）は自己相補的な領域を示し；（Ｃ）は自己相補的な領域により形成されるステムループ構造のループ領域を示し；（Ｄ）は標的ｍＲＮＡに相補的な配列を含む領域と自己相補的な領域の間のギャップ領域を示す。

Claims (41)

1. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する領域及び１つ以上の自己相補的な領域を含む、単離されたポリヌクレオチド。
2. 前記ポリヌクレオチドが２つ以上の自己相補的な領域を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
4. 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
5. 前記ポリヌクレオチドがペプチド核酸を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
6. 前記自己相補的な領域が、前記ポリヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又はそれらの両端に位置する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
7. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の１つ以上の追加の領域を更に含み、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の該領域が、前記ポリヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端又はそれらの両端に位置する自己相補的な領域により分離されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
8. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の前記領域が、同じ標的ｍＲＮＡに対して相補的である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の前記領域が、２つ以上の異なるｍＲＮＡに対して相補的である、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
10. 標的ｍＲＮＡ配列に対して非相補的又は半相補的であり、かつ自己相補的な領域に対して非相補的である第２配列を更に含み、該第２配列が、該自己相補的な領域と該標的ｍＲＮＡ配列に相補的な配列との間に位置する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
11. 前記自己相補的な領域がステムループ構造を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
12. 前記自己相補的な領域が、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な前記配列に対して相補的ではない、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
13. 前記ポリヌクレオチドが２つの自己相補的な領域を含み、該２つの自己相補的な領域が互いに相補的ではない、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
14. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な前記配列が少なくとも１７個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
15. 標的ｍＲＮＡ配列に相補的な前記配列が１７〜３０個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
16. 前記自己相補的な領域が少なくとも５個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
17. 前記自己相補的な領域が少なくとも２４個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
18. 前記自己相補的な領域が１２〜４８個のヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
19. 前記ループが少なくとも４個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
20. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを複数含む、アレイ。
21. 請求項１に記載のポリヌクレオチドをコードする、発現ベクター。
22. 生理学的に許容される担体及び請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
23. 請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む、遺伝子の発現を低減する方法。
24. 前記細胞が植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌又は真菌である、請求項２３に記載の方法。
25. 前記細胞が哺乳動物のものである、請求項２３に記載の方法。
26. 単離された前記ポリヌクレオチドが細胞に直接導入される、請求項２３に記載の方法。
27. 単離された前記ポリヌクレオチドを細胞に送達するのに十分な手段により、単離された該ポリヌクレオチドが細胞外から導入される、請求項２３に記載の方法。
28. 疾患を治療する方法であって、該方法は、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、該ｍＲＮＡの過剰発現が該疾患に関連する、方法。
29. 該疾患が癌である、請求項２８に記載の方法。
30. 患者の感染を治療する方法であって、該方法は、請求項１に記載の単離された該ポリヌクレオチドを該患者に導入することを含み、該単離されたポリヌクレオチドが感染性物質の進入、複製、組込み、伝達又は維持を媒介する、方法。
31. 遺伝子の機能を同定する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを細胞に導入する工程であって、該単離されたポリヌクレオチドは遺伝子の発現を抑制する、工程；及び、
    （ｂ）細胞の特性に対する工程（ａ）の効果を測定して、それにより遺伝子の機能を決定すること、
    を含む、方法。
32. 前記方法がハイスループットスクリーニングを使用して実施される、請求項３１に記載の方法。
33. 標的遺伝子の発現の調節のための１つ以上の自己相補的な領域を含むポリヌクレオチド配列を設計する方法であって、
    （ａ）長さ１７〜３０個のヌクレオチドの、標的遺伝子に相補的な第１配列を選択する工程；
    （ｂ）自己相補的な領域を含み、該第１配列に非相補的である長さ１２〜４８個のヌクレオチドの追加の配列を１つ以上選択する工程；及び、
    （ｃ）該標的遺伝子に非相補的又は自己相補的であり、工程（ｂ）において選択された該追加の配列に非相補的である長さ２〜１２個のヌクレオチドの更に追加の配列を１つ以上選択して、それにより標的遺伝子の発現の調節のためのポリヌクレオチド配列を設計する工程、
    を含む、方法。
34. 前記ポリヌクレオチドが、自己相補的な領域を１つ以上欠失している同じポリヌクレオチドよりも、インビボでの長い半減期を示す、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
35. 疾患を治療する方法であって、該方法は、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、前記ｍＲＮＡが対応する野生型ｍＲＮＡと比べて突然変異を１つ以上含む、方法。
36. 前記疾患が嚢胞性線維症である、請求項３５に記載の方法。
37. 細胞内における突然変異ｍＲＮＡの発現を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリヌクレオチドを細胞に導入することを含み、前記標的ＲＮＡ配列が該突然変異ｍＲＮＡの領域を含む、方法。
38. 前記突然変異ｍＲＮＡが嚢胞性線維症に関連する、請求項３７に記載の方法。
39. 前記突然変異ｍＲＮＡが、突然変異体の嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）のポリペプチドをコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
40. 前記突然変異ｍＲＮＡが腫瘍に関連する、請求項３７に記載の方法。
41. 前記突然変異ｍＲＮＡが、突然変異体ｐ５３ポリヌクレオチドをコードする遺伝子から発現されたｍＲＮＡである、請求項４０に記載の方法。

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