KR102654662B1 - Development of a novel pharmaceutics (Plk3 inhibitor) and related materials thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Plk3 억제제를 포함한 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물; 인비트로(in-vitro) 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물; 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물; 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물; 이를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료 방법; 및 베타세포의 사멸 억제 방법에 관한 것이다.The present invention provides a composition for inhibiting in-vitro apoptosis of beta cells containing a Plk3 inhibitor; In-vitro composition for inhibiting reactive oxygen species (ROS); Compositions for preventing or treating diabetes; Food compositions for preventing or improving diabetes; Method for preventing or treating diabetes using the same; and a method for inhibiting the death of beta cells.
Description
본 발명은 Plk3 억제제를 포함한 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물; 인비트로(in-vitro) 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물; 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물; 이를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료 방법; 및 베타세포의 사멸 억제 방법 에 관한 것이다.The present invention provides a composition for inhibiting in-vitro apoptosis of beta cells containing a Plk3 inhibitor; In-vitro composition for inhibiting reactive oxygen species (ROS); Pharmaceutical compositions for preventing or treating diabetes; Food compositions for preventing or improving diabetes; Method for preventing or treating diabetes using the same; and a method for inhibiting the death of beta cells.
당뇨병은 췌장 베타세포가 인슐린을 분비하지 않거나 전신 세포가 인슐린에 내성이 있을 때 발생하는 질환이다. 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병으로 나뉘며 소수의 사람들의 경우 기타 다른 원인에 의해 특정 유형의 당뇨병으로 발전한다. 제1형 당뇨병은 자가면역 반응에 의해 췌장에서 인슐린을 생산하는 랑게르한스의 베타 세포가 파괴되어 정상적인 포도당 저장 기능의 상실로 인하여 발생한다. 제2형 당뇨병은 만성 고혈당증과 세포 인슐린 저항성이 특징이다. 당뇨병은 망막병증, 신장병증, 신경병증 및 심혈관 질환과 관련된 혈관 합병증을 유발한다. 임신성 당뇨병은 이전에 당뇨병이 없었던 임산부에게 발생하는 당뇨병이다. 이는 신체가 임신 중에 충분한 인슐린을 생산할 수 없을 때 발생하며 이러한 여성은 나중에 인슐린 저항성으로 인해 제2형 당뇨병에 걸릴 가능성이 더 높다. 다른 유형의 당뇨병에는 단일 유전자 당뇨병 증후군, 외분비 췌장 질환, 약물 또는 화학 물질에 의해서 유발된 당뇨병이 포함된다. Diabetes is a disease that occurs when pancreatic beta cells do not secrete insulin or when cells throughout the body are resistant to insulin. Diabetes is divided into type 1 diabetes, type 2 diabetes, and gestational diabetes, and a small number of people develop certain types of diabetes due to other causes. Type 1 diabetes occurs due to the loss of normal glucose storage function due to the destruction of the insulin-producing beta cells of Langerhans in the pancreas by an autoimmune reaction. Type 2 diabetes is characterized by chronic hyperglycemia and cellular insulin resistance. Diabetes causes vascular complications associated with retinopathy, nephropathy, neuropathy, and cardiovascular disease. Gestational diabetes is diabetes that occurs in pregnant women who did not previously have diabetes. This occurs when the body cannot produce enough insulin during pregnancy, and these women are more likely to develop type 2 diabetes later in life due to insulin resistance. Other types of diabetes include monogenic diabetes syndrome, exocrine pancreatic disease, and diabetes caused by drugs or chemicals.
한편, 당뇨병에 대한 가장 이상적인 치료를 위해 여러 신약들이 개발되거나 환자에게 사용되고 있으나 (한국 등록특허공보 제10-1880164호), 당뇨병 유도 및 유사 환경 발생시 췌장세포 내에서 일어나는 일련의 부정적 신호 작용을 원천적으로 차단한다거나 인슐린을 안정적으로 분비하고 베타세포의 성장을 균형있게 조절하는 약물의 개발은 여전히 필요한 실정이다.Meanwhile, several new drugs have been developed or used in patients for the most ideal treatment for diabetes (Korean Patent Publication No. 10-1880164), but when diabetes is induced or a similar environment occurs, a series of negative signaling effects that occur within pancreatic cells are fundamentally eliminated. There is still a need to develop drugs that block or stably secrete insulin and balance the growth of beta cells.
이러한 배경 하에서, 본 발명자는 스트렙토 조토신 당뇨 유발물질로 인해 증가하는 Plk3 유전자를 전사단계에서 (초기단계에서) 차단함으로써 췌장 세포내 미토콘드리아 활성산소를 차단은 물론 췌장 분비 섬 세포의 인슐린 분비를 안정화시키는 역할을 하는 물질을 발견하였다.Under this background, the present inventors have developed a method that not only blocks mitochondrial reactive oxygen species within pancreatic cells but also stabilizes insulin secretion in pancreatic islet cells by blocking the Plk3 gene, which increases due to the diabetes-inducing substance streptozotocin, at the transcription stage (at an early stage). A substance that plays a role was discovered.
본 발명의 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물을 제공한다.One object of the present invention is to provide a composition for inhibiting in-vitro apoptosis of beta cells containing a Plk3 inhibitor.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물을 제공한다.Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting reactive oxygen species (ROS) in beta cells containing a Plk3 inhibitor in vitro.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, including a Plk3 inhibitor.
본 발명의 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함한 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving diabetes, including a Plk3 inhibitor.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating diabetes comprising administering a Plk3 inhibitor to a subject.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 인비트로에서 베타세포에 Plk3 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 베타세포의 사멸 억제 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting apoptosis of beta cells, which includes treating beta cells with a Plk3 inhibitor in vitro.
이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 아울러, 본 발명에 기재된 문헌은 본원의 참조로 삽입될 수 있다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Hereinafter, the contents of the present invention will be described in detail as follows. Meanwhile, the description and embodiment of one aspect disclosed in the present invention may also be applied to the description and embodiment of other aspects with respect to common matters. Additionally, all combinations of the various elements disclosed in the present invention fall within the scope of the present invention. In addition, documents described in the present invention may be incorporated herein by reference. In addition, the scope of the present invention cannot be considered limited by the specific description described below.
본 발명의 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸(apoptosis) 억제용 조성물을 제공한다.One aspect of the present invention provides a composition for inhibiting in-vitro apoptosis of beta cells containing a Plk3 inhibitor.
본 발명의 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a composition for inhibiting reactive oxygen species (ROS) in beta cells comprising a Plk3 inhibitor in vitro.
본 발명에서 용어 "베타세포"는 랑게르한스 섬에서 인슐린을 생성할 수 있는 세포이다. 상기 베타세포는 당뇨병 모델 세포일 수 있다. In the present invention, the term “beta cell” refers to a cell capable of producing insulin in the islets of Langerhans. The beta cells may be diabetes model cells.
일 구현 예로, 상기 베타세포는 스트렙토조토신이 처리된 것일 수 있고, 이로 인해 정상세포에 비해 세포 사멸이 증가된 것일 수 있으며, 활성산소종이 증가된 것(특히, 미토콘드리아 활성산소종 증가)일 수 있으며, 미토콘드리아 막전위가 손실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As an example of an embodiment, the beta cells may have been treated with streptozotocin, which may result in increased cell death compared to normal cells and increased reactive oxygen species (particularly, increased mitochondrial reactive oxygen species). , the mitochondrial membrane potential may be lost, but is not limited to this.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes including a Plk3 inhibitor.
본 발명에서 용어 "Polo-like kinase(Plk)"는 유사분열, 감수분열, 세포질 분열, DNA 복제, 염색체 분리. 및 여러 스트레스 반응 과정과 관련된 다양한 기능을 가진 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. 상기 Plk 계열은 포유류에서 Plk1, Plk2, Plk3, 및 Plk4로 구분되며, 본 발명의 Plk는 Plk3를 의미한다. In the present invention, the term "Polo-like kinase (Plk)" refers to mitosis, meiosis, cytokinesis, DNA replication, and chromosome separation. and serine/threonine protein kinases with diverse functions involved in several stress response processes. The Plk family is divided into Plk1, Plk2, Plk3, and Plk4 in mammals, and Plk in the present invention refers to Plk3.
본 기술분야에서 상기 Plk3와 당뇨병 간 관계에 대한 연구 및 보고는 불충분한 반면, 본 발명은 Plk3 억제제를 이용하여 당뇨병을 예방, 치료, 또는 개선할 수 있음을 최초로 규명하였다는 데에 기술적 의의가 있다.While research and reports on the relationship between Plk3 and diabetes are insufficient in the present technical field, the present invention has technical significance in that it is the first to demonstrate that diabetes can be prevented, treated, or improved using a Plk3 inhibitor. .
본 발명의 일 실험예에서는, Plk3 억제가 당뇨병 예방, 치료, 또는 개선에 깊은 연관이 있는 반면, 동일한 Plk 계열 단백질인 Plk1 및 Plk2는 낮은 연관성을 보이는 것을 확인하였다(실험예 3.1 및 도 4 등).In one experimental example of the present invention, it was confirmed that Plk3 inhibition was closely related to the prevention, treatment, or improvement of diabetes, while Plk1 and Plk2, which are the same Plk family proteins, showed a low correlation (Experimental Example 3.1 and Figure 4, etc.) .
일 구현 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 베타세포 사멸(apoptosis)를 감소, 미토콘드리아 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)을 감소, 및/또는 미토콘드리아 막전위 손실을 회복시키는 것일 수 있다,As one embodiment, the Plk3 inhibitor of the present invention may reduce beta cell apoptosis, reduce mitochondrial reactive oxygen species (ROS), and/or restore loss of mitochondrial membrane potential.
일 구현 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 인슐린 불가능의 직접적 요인으로 알려져 있는 불안정한 미토콘드리아 활성산소의 증가를 직접적으로 차단하는 것일 수 있다.As an example of one embodiment, the Plk3 inhibitor of the present invention may directly block the increase in unstable mitochondrial oxygen radicals, which are known to be a direct cause of insulin inability.
본 발명에 있어서, Plk3는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 Plk3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.In the present invention, Plk3 may have, include, or consist of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or may consist essentially of the amino acid sequence. Specifically, the Plk3 may be composed of a polypeptide described in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
상기 Plk3는 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank), Uniprot, 및 Genecard 등에서 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Plk3의 아미노산 서열은 상기 서열번호 로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다. The Plk3 can be obtained from known databases such as NIH GenBank, Uniprot, and Genecard. In the present invention, the amino acid sequence of Plk3 is at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, It may include an amino acid sequence having more than 99.5%, 99.7%, or 99.9% homology or identity. In addition, if the amino acid sequence has such homology or identity and shows efficacy corresponding to the protein containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the protein has an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or added. It is obvious that it is also included within the scope of the present invention.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 발명의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.For example, addition or deletion of sequences, naturally occurring mutations, silent mutations or conservation within the amino acid sequence at the N-terminus, C-terminus and/or within the amino acid sequence that do not alter the function of the protein of the present invention. This is the case with enemy substitution.
상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.The term “conservative substitution” means replacing one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. These amino acid substitutions may generally occur based on similarities in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity, and/or amphipathic nature of the residues. Typically, conservative substitutions may have little or no effect on the activity of the protein or polypeptide.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.In the present invention, the term 'homology' or 'identity' refers to the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage. The terms homology and identity can often be used interchangeably.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.The sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, and may be used with a default gap penalty established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing to all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon or a codon taking codon degeneracy into account.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ET AL/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.Whether any two polynucleotide or polypeptide sequences have homology, similarity, or identity can be determined, for example, by Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: It can be determined using a known computer algorithm such as the "FASTA" program using default parameters as in 2444. Or, as performed in the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later), It can be determined using the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) (GCG program package (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop , [ed.,] Academic Press, San Diego, 1994, and [CARILLO ET AL/.] (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073. For example, BLAST from the National Center for Biotechnology Information Database; Alternatively, homology, similarity, or identity can be determined using ClustalW.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 유니터리 매트릭스(unitary matrix) (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.Homology, similarity or identity of polynucleotides or polypeptides is defined in, for example, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482, see, for example, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. This can be determined by comparing sequence information using a GAP computer program such as 48:443. In summary, a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (i.e., nucleotides or amino acids). The default parameters for the GAP program are (1) a unitary matrix (containing values 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: Weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) permutation matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
또한, 상기 Plk3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다. Additionally, the polynucleotide encoding Plk3 can be easily isolated and sequenced using routine procedures.
본 발명에서 용어, "Plk3 억제제"란 Plk3 해독 및 전사과정 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭한다. 본 발명에서 "Plk3"는 별도의 언급이 없는 한 Plk3 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석될 수 있다. In the present invention, the term “Plk3 inhibitor” refers to all agents that reduce Plk3 translation and transcription processes or protein expression or activity. In the present invention, “Plk3” can be interpreted to refer to both Plk3 mRNA and protein, unless otherwise specified.
본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3 단백질, mRNA, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 할 수 있다. 일 예로, Plk3 억제제는 Plk3 유전자 발현(생산)을 조절하는 프로모터 지역에 직접적으로 결합하거나 증폭 신호를 주는 전사인자를 억제하는 물질 또는 단백질 유사체, plk3 유전자에 결합하여 그 발현을 전사 수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 생성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 RNA; 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체, 압타머, 안타고니스트, 또는 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The Plk3 inhibitor of the present invention may target Plk3 protein, mRNA, or polynucleotide encoding the same. For example, a Plk3 inhibitor is a substance or protein analog that binds directly to the promoter region that regulates Plk3 gene expression (production) or inhibits a transcription factor that gives an amplification signal, or a transcription factor that binds to the plk3 gene and inhibits its expression at the transcription level. factor; RNA such as miRNA, siRNA, shRNA, etc., which binds to the generated transcript and decomposes the transcript; It may include, but is not limited to, antibodies, aptamers, antagonists, or compounds that can bind to the expressed protein.
전술한 구현 예 중 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3를 코딩하는 염기서열 또는 이의 단편을 표적으로 하고, 상기 염기서열 또는 이의 단편에 상보적으로 결합하여 Plk3 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 그 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에서 용어, "siRNA(small interfering RNA)" 및 "shRNA(small hairpin RNA"란 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 또는 유전자 침묵(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다. As one example of the above-described embodiments, the Plk3 inhibitor of the present invention targets a base sequence encoding Plk3 or a fragment thereof, and binds complementary to the base sequence or a fragment thereof to inhibit the expression of Plk3 mRNA or protein. It may be. For example, the Plk3 inhibitor of the present invention may be any one or more selected from siRNA, shRNA, miRNA, antisense oligonucleotide, or aptamer. In the present invention, the terms "siRNA (small interfering RNA)" and "shRNA (small hairpin RNA)" are nucleic acid molecules that can mediate RNA interference (RNAi) or gene silencing, and are used to control the expression of target genes. Because it can be suppressed, it is used as an efficient gene knockdown method or gene therapy method.
본 발명에서 용어, "RNA 간섭(RNA interference, RNAi)"이란 표적 유전자의 mRNA와 상동 서열인 센스(sense) RNA와, 이와 상보적인 서열인 안티센스(anti-sense) RNA로 구성되는 이중 사슬 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 도입함으로써 RNA에 의해 전사 후 표적 유전자 mRNA의 파괴를 유도하여 표적 유전자의 발현을 80% 이상 억제할 수 있는 현상으로, 유전자 침묵(silencing)으로도 명명된다.In the present invention, the term "RNA interference (RNAi)" refers to double-stranded RNA (sense RNA, which is a sequence homologous to the mRNA of a target gene) and anti-sense RNA, which is a complementary sequence. This is a phenomenon in which the expression of a target gene can be suppressed by more than 80% by inducing destruction of the target gene mRNA after transcription by RNA by introducing double strand RNA (dsRNA), and is also called gene silencing.
상기 siRNA 및 shRNA는 RNAi 현상을 유도하는 약 20 뉴클레오티드 이상, 21 뉴클레오티드 이상, 22 뉴클레오티드 이상, 23 뉴클레오티드 이상, 24 뉴클레오티드 이상, 또는 25 뉴클레오티드 이상, 및 100 뉴클레오티드 이하의 짧은 dsRNA을 의미한다. The siRNA and shRNA refer to short dsRNAs of at least about 20 nucleotides, at least 21 nucleotides, at least 22 nucleotides, at least 23 nucleotides, at least 24 nucleotides, or at least 25 nucleotides, and at least 100 nucleotides that induce RNAi events.
상기 siRNA 및 shRNA의 제조방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, siRNA 및 shRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA 및 shRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.Methods for producing the siRNA and shRNA are not particularly limited, and methods known in the art can be used. siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. For example, a method of directly chemically synthesizing siRNA and shRNA, a method of synthesizing siRNA and shRNA using in vitro transcription, and a method of synthesizing long double-stranded RNA synthesized by in vitro transcription using enzymes. Methods include cutting, expression through intracellular delivery of shRNA expression plasmids or viral vectors, and expression through intracellular delivery of PCR (polymerase chain reaction)-induced siRNA expression cassettes, but are not limited thereto.
전술한 구현예 중 다른 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3을 타겟으로 하는 shRNA일 수 있다. 본 발명의 Plk3을 타겟으로 하는 shRNA는 센스 올리고뉴클레오티드 및 이와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이에 루프 서열을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 일 예로, 본 발명의 Plk3를 타겟으로 하는 shRNA는 서열번호 2 내지 4의 염기서열중 어느 하나 이상을 센스 올리고뉴클레오티드 및 이와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 포함할 수 있다. 본 발명에서 서열번호 2 내지 4의 염기서열을 포함하는 shRNA는 인간 및 마우스 췌장세포로의 호환이 가능하다. 이는 인간 Plk3(단백질 ID: Q9H4B4) 및 마우스 Plk3(XP_021055741.1)의 상동성 및 동일성 확인 결과에 근거한 것이다.As another example of the above-described embodiments, the Plk3 inhibitor of the present invention may be shRNA targeting Plk3. The shRNA targeting Plk3 of the present invention may include a sense oligonucleotide and an antisense oligonucleotide complementary thereto, and may include a loop sequence between the sense and antisense oligonucleotides, but is not limited thereto. As another example, shRNA targeting Plk3 of the present invention may include any one or more of the base sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4 as a sense oligonucleotide and an antisense oligonucleotide complementary thereto. In the present invention, shRNA containing the base sequences of SEQ ID NOs. 2 to 4 is compatible with human and mouse pancreatic cells. This is based on the results of confirming the homology and identity of human Plk3 (protein ID: Q9H4B4) and mouse Plk3 (XP_021055741.1).
본 발명에서 용어, "miRNA(micro RNA)"란 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다. 본 발명의 Plk3의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 miRNA라면 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 포함될 수 있다.In the present invention, the term "miRNA (micro RNA)" refers to a substance that naturally exists within cells and is involved in the regulation of a specific gene by inducing the RNAi phenomenon. Any miRNA that can inhibit the expression or activity of Plk3 of the present invention is not limited to its type and can be included in the present invention.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 Plk3 표적 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DAN 또는 RNA 서열일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 nt, 8 내지 60 nt, 10 내지 40 nt 또는 10 내지 30 nt일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성된 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시키는 재조합 벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 Plk3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.In the present invention, the term "antisense oligonucleotide" refers to DNA, RNA, or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a characteristic mRNA, which binds to the complementary sequence within the mRNA and inhibits the translation of the mRNA into protein. It can work. The antisense oligonucleotide sequence is complementary to the Plk3 target sequence and may be a DAN or RNA sequence capable of binding to the sequence. The antisense oligonucleotide may be 5 to 100 nt, 8 to 60 nt, 10 to 40 nt, or 10 to 30 nt in length. The antisense oligonucleotide may be synthesized in vitro using a conventional method and administered in vivo, or may be administered in the form of an antisense oligonucleotide synthesized in vivo. Antisense oligonucleotides can be synthesized in vitro by biological/chemical methods according to conventional methods in the technical field of the present invention. In addition, the form in which the antisense oligonucleotide is synthesized in vivo can be realized using a recombinant vector expressing the antisense oligonucleotide, and this method can be easily carried out according to a conventional method in the technical field of the present invention. there is. Therefore, the design of the antisense oligonucleotide of the present invention can be easily produced according to methods known in the art, with reference to the polynucleotide base sequence encoding Plk3.
본 발명의 용어 “항체”는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 이는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않는바, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수한 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 항체는 전체 길이의 경쇄 2개 및 전체 길이의 중쇄 2개를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체의 기능적인 단편 또한 포함한다. 상기 항체의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합성을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 항체는 Plk3에 결합하여 그 활성을 억제할 수 잇는 한 제한 없이 포함할 수 있다.The term “antibody” of the present invention refers to a substance that can specifically bind to the antigenic site of a protein or peptide molecule, and can be prepared by conventional methods known in the art. The form of the antibody is not particularly limited, and as long as it is a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and has antigen binding properties, a part thereof is included in the antibody of the present invention, and not only all immunoglobulin antibodies but also special antibodies such as humanized antibodies are included. May contain antibodies. In addition, the antibody includes intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody. The functional fragment of the antibody refers to a fragment that possesses at least antigen binding properties and may include Fab, F(ab'), F(ab') 2 , and Fv. For the purposes of the present invention, antibodies may be included without limitation as long as they can bind to Plk3 and inhibit its activity.
본 발명의 용어 “안타고니스트(antagonist)”는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 물질을 의미하며, 수용체의 리간드와 함께The term “antagonist” of the present invention refers to a substance that can directly or indirectly reduce the biological activity of a receptor, and is used together with the receptor’s ligand.
사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 안타고니스트는 Plk3 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다.Including, but not limited to, molecules that may reduce the action of the ligand when used. For the purpose of the present invention, the antagonist may be included without limitation as long as it can bind to the Plk3 protein and inhibit its activity.
일 구현 예로, 상기 안타고니스트는 (1) 후보 물질이 직접 Plk3 전사 프로모터 부위에 결합하여 전사인자와 경쟁적 저해를 하는 경우; (2) 후보 물질이 Plk3 전사 프로모터 부위에서 전사 활성을 지시하는 전사 인자를 촉진하는 조절 인자에 결합 후 그 기능을 억제하는 경우; (3) Plk3 단백질에 직접 결합하여 Plk3 단백질이 하위 단백질이 신호전달을 못하게 막는 경우; (4) Plk3 단백질을 활성을 촉진하는 조절 단백질과 결합하여 그 기능을 억제하는 경우; 또는 (5) Plk3 단백질이 특정 부위에 이동하여 작동하는 것을 사전에 막는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the antagonist may be used when (1) the candidate substance directly binds to the Plk3 transcriptional promoter region and competitively inhibits the transcription factor; (2) when the candidate binds to and then inhibits the function of a regulatory factor that promotes transcription factors that direct transcriptional activity at the Plk3 transcriptional promoter region; (3) When Plk3 protein binds directly to Plk3 protein and prevents downstream proteins from transmitting signals; (4) When Plk3 protein binds to a regulatory protein that promotes its activity and inhibits its function; Or (5) it may be a case of preventing the Plk3 protein from moving to a specific site and operating, but is not limited to this.
본 발명에서 용어, "압타머(aptamer)"란 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 압타머는 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지고, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 압타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 Plk3 mRNA에 결합하여 Plk3의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 압타머는 Plk3 표적 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.In the present invention, the term “aptamer” refers to a single-stranded oligonucleotide, a nucleic acid molecule that has binding activity to a given target. The aptamer may have a size of about 20 to 60 nucleotides, but is not limited thereto, has various three-dimensional structures depending on the sequence, and may have high affinity for a specific substance, such as an antigen-antibody reaction. An aptamer can inhibit the activity of a given target by binding to it. The aptamer of the present invention may be RNA, DNA, modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may also be in a linear or circular form. Preferably, the aptamer may bind to Plk3 mRNA and inhibit the expression or activity of Plk3. Such an aptamer can be prepared from the Plk3 target sequence by a method known to those skilled in the art.
전술한 구현예 중 또 다른 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3를 타겟으로 하는 shRNA를 발현하는 벡터일 수 있다.As another example of the above-described embodiments, the Plk3 inhibitor of the present invention may be a vector expressing shRNA targeting Plk3.
본 발명에서 용어, "벡터(vector)"란 목적하는 DNA 단편을 숙주 세포에 도입시켜 증식할 수 있는 DNA로써 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. "발현 벡터"는 목적하는 코딩서열과, 특정 숙주생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 벡터는 발현 벡터와 동일한 의미로 사용될 수 있다.In the present invention, the term "vector" refers to DNA that can proliferate by introducing a desired DNA fragment into a host cell, and is also called a cloning vehicle. “Expression vector” refers to a recombinant DNA molecule containing a desired coding sequence and an appropriate nucleic acid sequence essential for expressing the operably linked coding sequence in a specific host organism. In the present invention, the vector may be used in the same sense as an expression vector.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있고, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으며, 바이러스 벡터로서 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다.The vector used in the present invention is not particularly limited as long as it can replicate within the host cell, and any vector known in the art can be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses, and bacteriophages in a natural or recombinant state. For example, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors can be used. , pBluescriptII series, pGEM series, pTZ series, pCL series, and pET series can be used, and as viral vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, adenovirus vectors, herpes virus vectors, retrovirus vectors, lentivirus vectors, and vaccinia vectors can be used. Niavirus vectors, poxvirus vectors, herpes simplex virus vectors, etc. can be used.
상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be accomplished by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "형질전환"은 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the term “transformation” refers to introducing a recombinant vector containing a target polynucleotide into a host cell so that the polynucleotide can be expressed within the host cell. As long as the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it can include both of these, regardless of whether it is inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome. The transformation method includes any method of introducing a nucleic acid into a cell, and can be performed by selecting an appropriate standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method, and Examples include, but are not limited to, the lithium acetate-DMSO method.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현 조절 영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In addition, the term "operably linked" as used herein means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence or expression control region that initiates and mediates transcription of the target polynucleotide of the present invention. Operable linkages can be prepared using genetic recombination techniques known in the art, and site-specific DNA cutting and linking can be made using cutting and linking enzymes known in the art, but are not limited thereto.
본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물이다.The pharmaceutical composition of the present invention is a composition for preventing or treating diabetes.
본 발명의 실험예에서, Plk3 억제제를 개체에 투여하여 당뇨병을 치료할 수 있음을 확인하였다.In an experimental example of the present invention, it was confirmed that diabetes can be treated by administering a Plk3 inhibitor to a subject.
일 구현 예로, 본 발명의 당뇨병은 스트렙토조토신(Streptozotocin)에 의해 유발되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment, the diabetes of the present invention may be caused by streptozotocin, but is not limited thereto.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.In the present invention, the term “prevention” refers to all actions that suppress or delay the onset of diabetes by administration of the pharmaceutical composition of the present invention, and “treatment” refers to the treatment of diabetes symptoms by administration of the pharmaceutical composition of the present invention. It refers to any action that improves or changes to advantage.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 구체적으로는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include appropriate carriers, excipients, or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions. At this time, the content of the active ingredient included in the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may include 0.0001% by weight to 10% by weight, specifically 0.001% by weight to 1% by weight, based on the total weight of the composition.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition may be any selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. It may have a single dosage form, or may have several oral or parenteral dosage forms. When formulated, it is prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations contain one or more compounds and at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose ( It is prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups. In addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. there is. Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋을 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" refers to an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type and severity of the individual, age, gender, and severity of the disease. It can be determined based on factors including the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used simultaneously, and other factors well known in the medical field. The pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And it can be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and can be easily determined by a person skilled in the art. The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but for desirable effects, the pharmaceutical composition of the present invention is administered at 0.0001 to 500 mg/day. It may be better to administer in kg, specifically 0.001 to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day, or may be administered several times. The pharmaceutical composition can be administered to various animals such as rats, livestock, and humans by various routes, and the method of administration includes without limitation any conventional method in the art, for example, orally, rectally, intravenously, or intramuscularly. , can be administered by subcutaneous, intrauterine, intrathecal, or intracerebrovascular injection.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.In addition, the pharmaceutical composition of the present invention can be used not only in the form of a medicine for humans, but also in the form of an animal medicine. Here, animals are a concept that includes livestock and companion animals.
본 출원의 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.Another aspect of the present application provides a food composition for preventing or improving diabetes containing a Plk3 inhibitor.
상기 Plk3, Plk3 억제제, 당뇨병, 및 예방 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.The above Plk3, Plk3 inhibitor, diabetes, prevention, etc. are as described in other embodiments.
본 발명에서 용어, "개선"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 당뇨병 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.In the present invention, the term "improvement" refers to any action that improves or benefits the symptoms of a subject suspected of having diabetes or has diabetes by using the pharmaceutical composition of the present invention.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합체, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함한다.The term "food" in the present invention refers to meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, There are vitamin complexes, health functional foods, and health foods, and they include all foods in the conventional sense.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.The above-mentioned functional food (functional food) is the same term as food for special health use (FoSHU), and is a medicine processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to nutritional supply, with high medical effects. It means food. Here, “function” means adjusting nutrients to the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes, such as physiological effects. The food of the present invention can be manufactured by methods commonly used in the industry, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the industry. Additionally, the food formulation can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food. The food composition of the present invention can be manufactured in various types of formulations, and unlike general drugs, it is made from food as a raw material and has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long period of time, and is excellent in portability, so the present invention Foods can be consumed as supplements to prevent or improve diabetes.
상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.The above-mentioned health food refers to food that has a more active health maintenance or promotion effect compared to general food, and health supplement food refers to food for the purpose of health supplementation. In some cases, the terms health functional food, health food, and health supplement are used interchangeably.
구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 유효성분을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.Specifically, the health functional food is a food manufactured by adding active ingredients to food ingredients such as beverages, teas, spices, gum, and confectionery, or by encapsulating, powdering, or suspending them, and when ingested, it has a specific health effect. However, unlike regular drugs, it has the advantage of not having any side effects that may occur when taking the drug for a long time since it is made from food.
본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.The food composition of the present invention is very useful because it can be consumed on a daily basis and can be expected to have a high diabetes prevention or improvement effect.
상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.The composition may further include a physiologically acceptable carrier. The type of carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. Additionally, the composition may contain additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve odor, taste, vision, etc. For example, it may include vitamins A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, niacin, biotin, folate, pantothenic acid, etc. Additionally, it may contain minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn), copper (Cu), and chromium (Cr). Additionally, it may contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, and valine.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.In addition, the composition contains preservatives (potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.), disinfectants (bleaching powder, high bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.), and antioxidants (butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxyanisole). toluene (BHT), etc.), colorants (tar color, etc.), coloring agents (sodium nitrite, sodium nitrite, etc.), bleaching agents (sodium sulfite), seasonings (MSG monosodium glutamate, etc.), sweeteners (dulcine, cyclemate, saccharin, Food additives such as sodium, etc.), flavorings (vanillin, lactones, etc.), leavening agents (alum, D-potassium hydrogen tartrate, etc.), strengtheners, emulsifiers, thickeners (grease), coating agents, gum base agents, foam suppressants, solvents, improvers, etc. (food additives) may be included. The additives can be selected depending on the type of food and used in an appropriate amount.
상기 Plk3 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.The Plk3 inhibitor can be added as is or used with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods. The mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment). In general, when producing a food or beverage, the food composition of the present invention may be added in an amount of 50 parts by weight or less, specifically 20 parts by weight or less, relative to the food or beverage. However, when consumed for a long time for health and hygiene purposes, the content may be below the above range. Since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in amounts above the above range.
본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.As an example of the food composition of the present invention, it can be used as a health drink composition, and in this case, it can contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary drinks. The above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; It may be a sugar alcohol such as xylitol, sorbitol, or erythritol. Sweeteners include natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract; Synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used. The ratio of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, specifically about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the composition of the present invention.
상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.In addition to the above, the health drink composition includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid, salts of pectic acid, alginic acid, salts of alginic acid, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, It may contain alcohol or carbonating agent. Additionally, it may contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, or vegetable beverage. These ingredients can be used independently or in combination. The ratio of these additives is not very important, but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
본 발명의 식품 조성물은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 유효성분을 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.The food composition of the present invention may be included in various weight percentages if it can exhibit the effect of preventing or improving diabetes. Specifically, the active ingredient may be included in an amount of 0.00001 to 100% by weight or 0.01 to 80% by weight based on the total weight of the food composition. .
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.Another aspect of the present application provides a method for preventing or treating diabetes, comprising administering a Plk3 inhibitor to a subject.
상기 Plk3, Plk3 억제제, 당뇨병, 예방, 및 치료 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.The Plk3, Plk3 inhibitor, diabetes, prevention, and treatment are the same as described in other embodiments.
본 발명의 용어 "개체"는 당뇨병이 발병되었거나 발병 가능성이 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 인간을 제외한 것일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.The term "individual" in the present invention refers to all animals such as rats, mice, and livestock, including humans, that have developed or are likely to develop diabetes. Specifically, it may be a mammal, including humans, but may also be excluding humans, and is not limited thereto.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여 시 비강 투여, 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 주입방식을 선택할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.The term "administration" of the present invention means introducing the composition of the present invention into an individual by any appropriate method, and the composition may be administered through various routes such as oral or parenteral. Specifically, for parenteral administration, injection methods such as nasal administration, external application to the skin or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection can be selected. Additionally, the composition can be administered in a pharmaceutically effective amount.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 인비트로에서 베타세포에 Plk3 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 베타세포의 사멸 억제 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of inhibiting apoptosis of beta cells, comprising treating beta cells with a Plk3 inhibitor in vitro.
상기 Plk3, Plk3 억제제, 및 베타세포 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.The Plk3, Plk3 inhibitor, and beta cells are the same as described in other embodiments.
본 발명을 이용하여 효과적으로 Plk3를 억제하여 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다.Using the present invention, diabetes can be prevented or treated by effectively inhibiting Plk3.
도 1A 내지 1G는 스트렙토조토신 당뇨병 유도 물질 하에 발생되는 베타세포 내 세포 사멸과 이에 대한 억제 효과를 나타낸 도이다 (A, Evian; B, Smartwater; C, Aquafina; D, Fiji; E, Icelandic; F, Evamor; G, Eternal; H, Dasani; I, Crystal geyser; J, 실험물질(natural COA); K, Poland spring; L, Nestle pure life; M, Essentia; N, Ice mountain; O, commercial media (DMEM, Gibco)).
도 2A 내지 2E는 베타세포에서 스트렙토조토신으로 유발된 ROS 생성 차단 효과를 나타낸 도이다
도 3A 내지 3D는 활성 산소를 통한 미토콘드리아 막 전위 조절을 나타낸 도이다.
도 4A 내지 4F는 베타 세포에서 스트렙토조토신을 통한 미토콘드리아 매개 세포자멸사 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5A 내지 5D는 Plk3 의 미토콘드리아 활성 산소를 증가시키는 조절 단백질의 효과를 나타낸 도이다.
도 6A 내지 6C는 3D 오르가노이드 모델에서 스트렙토조토신 유발 당뇨병 스트레스 하 췌장 베타세포의 인슐린 분비 조절을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명 효과의 도식 모델을 나타낸 도이다.
도 8A 내지 8E은 Plk3 shRNA를 이용한 STZ 당뇨 자극 물질이 유도시키는 미토콘드리아 활성산소 증가 및 세포자멸사 억제 효과를 나타낸 도이다.Figures 1A to 1G are diagrams showing apoptosis in beta cells occurring under the diabetes-inducing substance streptozotocin and its inhibitory effect (A, Evian; B, Smartwater; C, Aquafina; D, Fiji; E, Icelandic; F , Evamor; G, Eternal; H, Dasani; I, Crystal geyser; J, experimental material (natural COA); K, Poland spring; L, Nestle pure life; M, Essentia; N, Ice mountain; O, commercial media ( DMEM, Gibco)).
Figures 2A to 2E are diagrams showing the effect of blocking ROS production induced by streptozotocin in beta cells.
Figures 3A to 3D are diagrams showing the regulation of mitochondrial membrane potential through active oxygen.
Figures 4A to 4F are diagrams showing the inhibitory effect of mitochondria-mediated apoptosis through streptozotocin in beta cells.
Figures 5A to 5D are diagrams showing the effect of Plk3, a regulatory protein that increases mitochondrial reactive oxygen species.
Figures 6A to 6C are diagrams showing the regulation of insulin secretion by pancreatic beta cells under streptozotocin-induced diabetic stress in a 3D organoid model.
Figure 7 is a diagram showing a schematic model of the effect of the present invention.
Figures 8A to 8E are diagrams showing the effect of increasing mitochondrial reactive oxygen species and suppressing apoptosis induced by STZ diabetes stimulant using Plk3 shRNA.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples. However, the following examples are merely preferred embodiments for illustrating the present invention and are therefore not intended to limit the scope of the present invention thereto. Meanwhile, technical matters not described in this specification can be fully understood and easily implemented by anyone skilled in the technical field of the present invention or a similar technical field.
실시예 1. 세포 및 세포주, 시약 및 유전자 침묵(gene silencing)Example 1. Cells and cell lines, reagents and gene silencing
모든 세포 주는 판매 업체로부터 공급받았다. 베타 TC-6 및 베타 TC-tet 마우스 췌장 분비 섬 세포주는 15%의 FBS, 스트렙토마이신, 및 페니실린이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)에서 배양하였다. 세포 배양을 위해서 분말 배지 성분은 시판되는 다양한 수용액(Evian, Smartwater, Aqua - fina, Fiji, Icelandic, Evamor, Eternal, Dasani, Crystal Geyser, Dr. coa(COA water), Poland Spring, Nestle pure life, Essentia, Ice mountain)에 용해시켰다. 연구에 사용된 모든 상업용 물은 온라인(인터넷) 또는 지역 식료품점(미네소타주 로체스터)에서 구입했다. 그 후, 그 배지는 0.2 μm의 다공성 막을 사용하여 여과시킴으로써 즉시 멸균하였다. DMEM 배지 분말(Millipore - Sigma, Burlington, Mass)을 실온에서 14 가지 다른 상업용 살균된 물에 희석했다. 팩 내부는 모든 배지 분말이 사용되도록 하기 위해 멸균수로 철저히 헹구었다. 총 부피가 1L가 되도록 멸균수로 채워진 배지를 여과하고 병모양인 0.2μm 막 필터(Millipore - Sigma, Burlington , MA)를 사용하여 즉시 멸균했다. 2',7' 디클로로플루오레세인 디아세테이트(2′, 7'-Dichlorofluorescein diacetate, DCF-DA), 요오드화 프로피듐(Propidium Iodide, PI, P 4864), N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC), 과산화수소(H2O2), 스티그마텔린(stigmatellin), 말로네이트(malonate), 로테논(rotenone) 및 아지드화 나트륨(sodium azide)은 Sigma - Aldrich에서 구입했다. MitoSOX 및 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴 카르보시아닌 요오드화물(5,5′, 6,6'-tetrachloro-1,1′',3,3′'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodide, JC-1)은 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 구입했다. 파라포름알데히드 용액(Paraformaldehyde Solution, MFCD 00133991) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 62248)은 Thermo Scientific에서 구입하였다. MG132(Z-Leu-Leu-Leu-al, S2619)는 Selleck Chemicals에서 구입하였다. Plk3 렌티바이러스(lentiviral) shRNA 와 음성 대조군 shRNA는 Creative Biogene Company에서 구입하였다.All cell lines were supplied from the vendor. Beta TC-6 and beta TC-tet mouse pancreatic secretory islet cell lines were cultured in Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM) containing 15% FBS, streptomycin, and penicillin. For cell culture, powdered media components are available in various commercially available aqueous solutions (Evian, Smartwater, Aqua - fina, Fiji, Icelandic, Evamor, Eternal, Dasani, Crystal Geyser, Dr. coa (COA water), Poland Spring, Nestle pure life, Essentia , Ice mountain). All commercial water used in the study was purchased online or from a local grocery store (Rochester, Minnesota). Afterwards, the medium was immediately sterilized by filtration using a 0.2 μm porous membrane. DMEM medium powder (Millipore - Sigma, Burlington, Mass) was diluted in 14 different commercial sterile water solutions at room temperature. The inside of the pack was thoroughly rinsed with sterile water to ensure that all medium powder was used. The medium filled with sterile water was filtered to a total volume of 1 L and immediately sterilized using a bottle-shaped 0.2 μm membrane filter (Millipore - Sigma, Burlington, MA). 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), Propidium Iodide (PI, P 4864), N-acetylcysteine (NAC) , hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), stigmatellin, malonate, rotenone, and sodium azide were purchased from Sigma - Aldrich. MitoSOX and 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (5,5',6,6'-tetrachloro-1 ,1′’,3,3′’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodide, JC-1) was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR). Paraformaldehyde Solution (MFCD 00133991) and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 62248) were purchased from Thermo Scientific. MG132 (Z-Leu-Leu-Leu-al, S2619) was purchased from Selleck Chemicals. Plk3 lentiviral shRNA and negative control shRNA were purchased from Creative Biogene Company.
실시예 2. 세포 성장 곡선 측정 및 DAPI 염색Example 2. Cell growth curve measurement and DAPI staining
Beta TC-6 또는 Beta TC-tet 세포를 일반 물(대조군)과 실험물질로 제조한 각각의 배지에서 배양하고 72시간 동안 스트렙토조토신을 처리하였다. 또한 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 사용하여 측정하였다. 세포를 3일동안 배양하고 MTT 용액을 20분간 염색한 후 Fluorescent Microplate Reader(GE-Nios Plus, Tecan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 3.7% 파라포름알데히드(Sigma -Aldrich)가 포함된 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco-Invitrogen)에 고정했다. 1X PBS로 3회 세척한 후, 세포를 PBS 완충액에서 0.5 mg/ml DAPI 용액(세포자멸사를 측정하기 위해)과 함께 10분 동안 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 두 번 세척하고 UV 광선 하에서 형광 현미경으로 검사했다.Beta TC-6 or Beta TC-tet cells were cultured in normal water (control) and each medium prepared with the test substances and treated with streptozotocin for 72 hours. Additionally, cell viability was measured using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Cells were cultured for 3 days, stained with MTT solution for 20 minutes, and absorbance was measured using a Fluorescent Microplate Reader (GE-Nios Plus, Tecan). Cells were fixed in phosphate-buffered saline (PBS, Gibco-Invitrogen) containing 3.7% paraformaldehyde (Sigma -Aldrich) for 10 min at room temperature. After washing three times with 1X PBS, cells were incubated with 0.5 mg/ml DAPI solution (to measure apoptosis) in PBS buffer for 10 min. The cells were then washed twice with PBS and examined under a fluorescence microscope under UV light.
실시예 3. 웨스턴 블롯 분석 및 항체Example 3. Western blot analysis and antibodies
2개의 다른 췌장 베타 세포주의 단백질 용해물 샘플은 RIPA 용해 완충액에 얼음이 추가된 상태에서 1mM PMSF를 포함한 프로테아제(protease) 억제제를 추가하여 용해시켰다. 단백질 용해물 샘플은 4-8시간 동안 아크릴아마이드을 이용한 10-15 % SDS-Page 겔을 준비하여 분리한 다음 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유의 TBS-T 완충액에서 블락(block)처리하였다. 다음으로, PVDF 막을 1차 항체와 함께 배양하였다. 막을 1% TBST로 3회 세척한 후 관련 토끼 항-마우스 IgG-HRP 2차 항체(Abcam)와 함께 1시간 동안 배양했다. Cleaved Caspase-8(Asp384, #9748) 및 Cleaved Caspase-9 (Asp 353, #9509)를 인식하는 마우스 단클론 항체는 Cell Signaling에서 구입하였다. 절단된 PARP (Asp214, ab32064) 및 Plk 2 (ab137539)를 인식하는 토끼 다클론 항체는 Abcam에서 입수했다. Cleaved Caspase-3 (Asp175, #9661)를 인식하는 토끼 다클론 항체는 Cell Signaling에서 구입했다. Plk1을 인식하는 마우스 단클론항체 (35- 206)와 Plk3 invitrogen을 인식하는 토끼 다클론항체 (PA5-97143) 는 Invitrogen에서 구입하였다. 항-베타-액틴 마우스 항체는 Sigma에서 구입하였다. Protein lysate samples from two different pancreatic beta cell lines were lysed by adding protease inhibitors containing 1mM PMSF to RIPA lysis buffer in the presence of ice. Protein lysate samples were separated by preparing a 10-15% SDS-Page gel using acrylamide for 4-8 hours and then transferred to a PVDF membrane. The membrane was blocked in TBS-T buffer of 5% non-fat milk for 1 hour at room temperature. Next, the PVDF membrane was incubated with primary antibody. Membranes were washed three times with 1% TBST and then incubated with the relevant rabbit anti-mouse IgG-HRP secondary antibody (Abcam) for 1 h. Mouse monoclonal antibodies recognizing Cleaved Caspase-8 (Asp384, #9748) and Cleaved Caspase-9 (Asp 353, #9509) were purchased from Cell Signaling. Rabbit polyclonal antibodies recognizing truncated PARP (Asp214, ab32064) and Plk 2 (ab137539) were obtained from Abcam. Rabbit polyclonal antibody recognizing Cleaved Caspase-3 (Asp175, #9661) was purchased from Cell Signaling. Mouse monoclonal antibody (35-206) recognizing Plk1 and rabbit polyclonal antibody (PA5-97143) recognizing Plk3 invitrogen were purchased from Invitrogen. Anti-beta-actin mouse antibody was purchased from Sigma.
실시예 4. 유세포 분석Example 4. Flow cytometry
FACS에 의한 세포 주기 프로파일의 분석을 위해, 유도 후 시간 경과에 따라 세포를 수확하였다. 췌장 베타 TC-6 분비 섬 세포를 실험군 및 대조군 각각의 배지에서 배양한 후 스트렙토조토신을 72시간 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 70% 메탄올로 고정하고 (ROS를 위해서는 CM-H 2DCFDA(5μg/ml))를 RNase A(100mg/ml, Sigma-Aldrich) 함유물과 함께 실온에서 30분 동안 처리하였다. FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson, CA)를 사용하여 DNA 함량을 분석했다. 실험은 독립적으로 세 번 수행되었다.For analysis of cell cycle profiles by FACS, cells were harvested over time after induction. Pancreatic beta TC-6 secreting islet cells were cultured in each medium of the experimental and control groups and then treated with streptozotocin for 72 hours. Cells were then fixed with 70% methanol (for ROS, CM-H 2DCFDA (5 μg/ml)) and treated with RNase A (100 mg/ml, Sigma-Aldrich) for 30 min at room temperature. DNA content was analyzed using a FACScan flow cytometer (Becton Dickinson, CA). The experiment was performed independently three times.
실시예 5. ROS 생성 측정 및 면역형광분석Example 5. Measurement of ROS production and immunofluorescence analysis
Beta TC-6는 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 배양하였고 그 후, 스트렙토조토신(STZ)으로 18시간 동안 처리했다. 세포를 CM-H2DCFDA (5μg/ml) 또는 MitoSOX (5μM)로 30분 동안 염색한 다음 형광 현미경으로 관찰했다. 면역형광분석을 위해, 세포를 실온에서 10분 동안 3.7% 파라포름알데히드(Sigma - Aldrich)에 고정시켰다. 면역형광분석을 위해 Beta TC-6 세포는 지정된 플라스미드(Flag 또는 Flag-Plk3)로 형질감염(transfected)되거나 지정된 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염되었다. 그 다음, 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 세포를 배양한 다음 스트렙토조토신으로 18시간 동안 처리하였다. 세포를 3.7% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정하고 0.2% Triton X- 100으로 10분 동안 막 투과를 위해 상온 정치시켰다. 그 후 표준 프로토콜을 사용하여 토끼 다클론 항-Plk3(Invitrogen)과 함께 세포를 37°C에서 24시간 동안 배양했다. 각 실험에서 형광 현미경으로 100-200개의 세포들을 모니터링하였고 ROS 또는 단백질 위치 변경을 정량화 하기 위해 이전에 설명한 대로 검증했다. 실험은 독립적으로 세 번 수행하였다. 세포 내 ROS 생성은 형광현미경(Olympus LX71 현미경)을 사용하여 측정하였고, 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Universal Imaging, Westchester, PA)를 사용하여 분석하였다. 미토콘드리아 전자전달계 중 어떤 것이 스트렙토조토신 처리에 의해 조절되는지 결정하기 위해 항산화제(NAC), 로테논(10μM), 말로네이트(100μM)가 있는 상태에서 세포를 4시간 동안 배양했다. 세포들은 MitoSOX (5 μM)에 30분 동안 염색되었고 면역형광분석을 위해서 채취하였다. 초록(또는 빨강) 형광은 480nm(빨강의 경우 572nm)의 여기 파장과 535nm(빨강의 경우 600nm)의 방사체 주파수 대역을 이용하여 정량화 하였다. 형광 이미지는 다양한 시야(fields of view)에서 촬영하였고 ROS 형광 강도는 세포 수에 따라 정량화 하였다.Beta TC-6 was cultured in each experimental group and control medium and then treated with streptozotocin (STZ) for 18 hours. Cells were stained with CM-H2DCFDA (5 μg/ml) or MitoSOX (5 μM) for 30 min and then observed under a fluorescence microscope. For immunofluorescence analysis, cells were fixed in 3.7% paraformaldehyde (Sigma - Aldrich) for 10 min at room temperature. For immunofluorescence analysis, Beta TC-6 cells were transfected with the indicated plasmids (Flag or Flag-Plk3) or infected with the indicated plasmids (control shRNA or Plk3 shRNA). Next, cells were cultured in each experimental group and control medium and then treated with streptozotocin for 18 hours. Cells were fixed in 3.7% paraformaldehyde for 10 minutes and permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 10 minutes at room temperature. Cells were then incubated at 37°C for 24 h with rabbit polyclonal anti-Plk3 (Invitrogen) using standard protocols. In each experiment, 100–200 cells were monitored by fluorescence microscopy and validated as previously described to quantify ROS or protein localization changes. The experiment was performed independently three times. Intracellular ROS production was measured using a fluorescence microscope (Olympus LX71 microscope), and images were analyzed using MetaMorph software (Universal Imaging, Westchester, PA). To determine which of the mitochondrial electron transport chains was regulated by streptozotocin treatment, cells were incubated for 4 h in the presence of antioxidants (NAC), rotenone (10 μM), and malonate (100 μM). Cells were stained with MitoSOX (5 μM) for 30 minutes and harvested for immunofluorescence analysis. Green (or red) fluorescence was quantified using an excitation wavelength of 480 nm (572 nm for red) and an emitter frequency band of 535 nm (600 nm for red). Fluorescence images were taken in various fields of view, and ROS fluorescence intensity was quantified according to cell number.
실시예 6. 미토콘드리아 막 전위 측정(△Ψm)Example 6. Measurement of mitochondrial membrane potential (△Ψm)
ΔΨm의 변화를 확인하기 위해 Beta TC-6 췌장 분비 섬 세포를 18시간 동안 스트렙토조토신이 처리된 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 37°C에서 30분 동안 JC-1 (5 mM)과 함께 배양하고 JC-1 염색 완충액으로 두 번 세척했다. JC-1은 490nm에서 활성화되었다. JC-1 염색된 세포의 510-560 nm에서 활성화를 조사하기 위해 형광 현미경(Olympus LX71 현미경)을 사용하였고 570-620 nm에서의 조사를 위해 방출 필터를 사용하였다. 방출 형광을 필터링하고 FACScan 유세포 분석기(Becton Dickson)를 사용하여 FITC (녹색, 530nm) 채널에 대한 이미지를 수집했다. 형광은 MetaMorph 소프트웨어(Universal Imaging, Westchester, PA, USA)로 분석되었다. 미토콘드리아 탈분극은 적색/녹색 형광 강도 비율의 감소를 이용하여 분석하였다. 실험은 독립적으로 세 번 수행하였다.To confirm changes in ΔΨm, Beta TC-6 pancreatic secretory islet cells were cultured in each experimental group and control medium treated with streptozotocin for 18 hours. Next, cells were incubated with JC-1 (5 mM) for 30 min at 37°C and washed twice with JC-1 staining buffer. JC-1 was activated at 490 nm. A fluorescence microscope (Olympus LX71 microscope) was used to examine activation at 510-560 nm in JC-1 stained cells, and an emission filter was used for examination at 570-620 nm. Emitted fluorescence was filtered and images were collected on the FITC (green, 530 nm) channel using a FACScan flow cytometer (Becton Dickson). Fluorescence was analyzed with MetaMorph software (Universal Imaging, Westchester, PA, USA). Mitochondrial depolarization was analyzed using the decrease in red/green fluorescence intensity ratio. The experiment was performed independently three times.
실시예 7. 일시적 형질감염, 바이러스 감염 및 안정 형질도입Example 7. Transient transfection, viral infection, and stable transduction
일시적인 과발현 연구를 위해 Beta TC-6 세포는 먼저 기존의 혈청 함유 배지를 버리고 1xPBS로 3회 헹군 다음 무혈청 배지로 교체하고 5분 동안 방치되었다. 그 다음, 세포는 lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 같은 형질감염 시약을 사용하여 Flag 또는 Flag-tagged된 Plk3로 일시적으로 형질감염시켰다. 6시간 후, 형질감염 시약이 들어 있는 무혈청 배지를 버리고 1XPBS로 다시 헹궜다. 신선한 혈청이 첨가된 배지로 교체한 후 세포를 24시간 동안 배양한 후 형광현미경으로 유전자 발현을 확인하였다. 바이러스 감염은 Beta TC-6 세포의 경우 60~70%의 세포 밀도에서 수행되었고 세포 배양 배지는 하루 전에 폴리브렌(polybrene)으로 전처리되었다. Plk3 lentiviral shRNA (Creative Biogene)는 12시간 동안 세포에 감염되도록 처리하였고 이 후 새로운 배지로 교체하였다. 2 ㎍/ml 퓨로마이신(Sigma-Aldrich)으로 감염된 세포는 선택적으로 채취하였다. 대조군 shRNA는 음성 대조군으로 동시에 사용되었다.For transient overexpression studies, Beta TC-6 cells were first discarded of the existing serum-containing medium, rinsed three times with 1xPBS, then replaced with serum-free medium and left for 5 min. Next, cells were transiently transfected with Flag or Flag-tagged Plk3 using a transfection reagent such as lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 6 hours, the serum-free medium containing the transfection reagent was discarded and rinsed again with 1XPBS. After replacing the medium with fresh serum, the cells were cultured for 24 hours and gene expression was confirmed using a fluorescence microscope. Viral infections were performed at a cell density of 60–70% for Beta TC-6 cells, and cell culture media were pretreated with polybrene one day prior. Plk3 lentiviral shRNA (Creative Biogene) was used to infect cells for 12 hours and then replaced with fresh medium. Infected cells were selectively harvested with 2 μg/ml puromycin (Sigma-Aldrich). Control shRNA was used simultaneously as a negative control.
실시예 8. 3D 오르가노이드 분석 및 인슐린 측정Example 8. 3D organoid analysis and insulin measurement
3D 오르가노이드 분석을 위해 마우스 췌장 분비 섬 베타 TC-6 또는 베타 TC-tet 세포를 NanoCulture plates(Scivax, Japan)에서 배양했다. 세포를 조직 인큐베이터 배양한 후, 인터넷이나 지역 식료품점에서 구입한 14개의 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 세포 배양 후 스트렙토조토신을 72시간 동안 처리한 배지에서 배양한 세포와 동일한 2D 배양 조건에서 세포를 배양하였다. 세포 구(cell sphere) 수를 관찰하고 0, 3, 5 및 7 일에 나누어 관찰하였다. 세포는 1시간 동안 KRBH 완충액에서 3mM 포도당 또는 25mM 포도당과 함께 배양하였다. 상등액 배지의 포도당 자극 인슐린 분비는 Crystal Chem ELISA 키트(Downers Grove, IL)로 측정하였다For 3D organoid analysis, mouse pancreatic secretory islet beta TC-6 or beta TC-tet cells were cultured on NanoCulture plates (Scivax, Japan). After culturing the cells in a tissue incubator, culturing the cells in each of the 14 experimental and control media purchased online or at a local grocery store, the cells were cultured in the same 2D culture conditions as the cells cultured in the media treated with streptozotocin for 72 hours. did. The number of cell spheres was observed and observed separately on days 0, 3, 5, and 7. Cells were incubated with 3mM glucose or 25mM glucose in KRBH buffer for 1 hour. Glucose-stimulated insulin secretion in the supernatant medium was measured with a Crystal Chem ELISA kit (Downers Grove, IL).
실시예 9. 통계 분석Example 9. Statistical analysis
시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 실험 각각에 대해 최소 3개의 독립적인 결과를 평가하고 통합 데이터를 평균 ± 표준 오차로 표시했다. 결과는 개별 데이터 포인트 또는 평균 ±SD로 표현하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.0; GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 산점도 및 막대 그래프의 통계적 비교는 Holm-Sidak 사후 테스트와의 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 2원 ANOVA를 사용하여 수행되었다. <0.05의 P값은 유의미한 것으로 간주되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05(*), P < 0.01(**), P < 0.001(***)로 정의하였으며, ns는 유의하지 않음을 나타내었다.At least three independent results were evaluated for each in vitro or ex vivo experiment and pooled data were expressed as mean ± standard error. Results were expressed as individual data points or mean ± SD. Statistical analyzes were performed using GraphPad Prism software (version 6.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Statistical comparisons of scatter plots and bar graphs were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) or two-way ANOVA for multiple comparisons with Holm-Sidak post hoc test. A P value of <0.05 was considered significant. Statistical significance was defined as P < 0.05 (*), P < 0.01 (**), and P < 0.001 (***), and ns indicated not significant.
실험예 1. 스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병에서 β-세포 생존을 보호하는 물질 확인Experimental Example 1. Identification of substances that protect β-cell survival in streptozotocin (STZ)-induced diabetes
당뇨병 스트레스 모델에 대한 췌장 β-세포의 생존 가능성을 확인하기 위해 스트렙토조토신 처리 후 두 개의 다른 베타 TC-6 또는 베타 TC-tet 췌장분비 섬 세포를 테스트했다. 베타 TC-6의 IC50이 MTT 분석을 사용하여 50μM임을 확인하였다. 다른 췌장 세포의 결과와 유사하게 Beta TC-tet은 스트렙토조토신이 췌장 β-세포 사멸에 강하게 영향을 미친다는 것을 보여주었다 (도 1A). 현재 판매되고 있는 15가지 물을 준비한 배지에 스트렙토조토신을 처리하여 세포 배양액을 준비하고 베타세포를 배양하였다. 그 결과, 일반 물(대조군)이 스트렙토조토신에 의해 유도된 베타 TC-6 세포를 세포자멸사로부터 보호하지 않는 반면 닥터코아 (이하, 실험물질)는 이를 억제한다는 것을 발견했다 (도 1B 내지 1D). 다른 췌장 분비 섬 세포(Beta TC-tet)에서도 동일한 결과가 얻어졌다 (도 1D). 일반 물과 실험물질로부터 얻은 베타 세포 용해물의 면역 블롯 분석은 실험물질을 사용하여 배양한 세포에서는 활성화된 PARP1 단백질 수준이 감소한 것을 밝혔다(도 1E). 또한 fractionated DNA 함량을 통해 세포 주기와 세포 상태를 예측하는 방법인 유세포 분석을 사용하였으며 이때 sub-G1 값이 나오는 경우 이는 세포자멸(apoptosis)을 의미한다. 스트렙토조토신 처리에 의해 증가된 베타세포의 sub-G1 개체군은 실험물질에 의해 감소되었다 (도 1F). 또한 스트렙토조토신 세포 사멸이 괴사의 영향을 받는지 여부를 테스트했다. 30mM의 스트렙토조토신으로 처리된 베타 세포는 괴사를 보인 반면, 우리가 IC50으로 발견한 50μM의 스트렙토조토신에서는 괴사가 관찰되지 않았다 (도 1 G). 이는 괴사가 50μM의 스트렙토조토신으로 인하여 발생한 세포 사멸에 어떠한 영향도 미치지 않았음을 의미한다. 또한, 이러한 결과는 실험물질이 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 대표 예 물질임을 시사한다. To determine the viability of pancreatic β-cells in a diabetic stress model, two different beta TC-6 or beta TC-tet pancreatic islet cells were tested after streptozotocin treatment. The IC50 of beta TC-6 was confirmed to be 50 μM using MTT assay. Similar to the results in other pancreatic cells, Beta TC-tet showed that streptozotocin strongly affected pancreatic β-cell death (Figure 1A). Streptozotocin was treated with streptozotocin in a medium prepared from 15 types of water currently on the market, a cell culture medium was prepared, and beta cells were cultured. As a result, it was found that plain water (control group) did not protect beta TC-6 cells induced by streptozotocin from apoptosis, whereas Dr. Core (hereinafter referred to as experimental material) inhibited this (Figures 1B to 1D). . The same results were obtained with other pancreatic secretory islet cells (Beta TC-tet) (Figure 1D). Immunoblot analysis of beta cell lysates obtained from plain water and test substances revealed that activated PARP1 protein levels were reduced in cells cultured with test substances (Figure 1E). In addition, flow cytometry, a method of predicting cell cycle and cell state through fractionated DNA content, was used, and a sub-G1 value indicates apoptosis. The sub-G1 population of beta cells increased by streptozotocin treatment was decreased by the test substance (Figure 1F). We also tested whether streptozotocin cell death is affected by necrosis. Beta cells treated with 30 mM streptozotocin showed necrosis, whereas no necrosis was observed with 50 μM streptozotocin, which we found as IC50 (Figure 1 G). This means that necrosis had no effect on cell death caused by 50 μM streptozotocin. Additionally, these results suggest that the experimental substance is a representative substance with activity against streptozotocin-induced diabetes and cell death.
실험예 2. ROS를 통한 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실 조절 확인Experimental Example 2. Confirmation of loss control of mitochondrial membrane potential (△Ψm) through ROS
2-1. 당뇨병 조절과 연계된 ROS 하향조절 확인2-1. Confirmation of ROS downregulation linked to diabetes control
실험예 1에서 확인한 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 실험물질로 처리 후, 산화제에 민감한 염료인 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester(CM-H2DCFDA)로 베타 세포를 염색하여 스트렙토조토신 유도 ROS 생성 변화를 조사했다(도 2A 및 B). After treatment with the experimental substance having activity against streptozotocin-induced diabetes and apoptosis confirmed in Experimental Example 1, 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester ( Changes in streptozotocin-induced ROS production were investigated by staining beta cells with CM-H2DCFDA) (Figures 2A and B).
그 결과, 스트렙토조토신으로 유도된 ROS 생성은 일반 생수로 처리된 배양 대조군 췌장 세포에서 증가했지만 실험물질에서는 유의미하게 억제되었다(도 2A). Beta TC-tet에서와 같은 결과를 Beta TC-6에서도 얻었다(도 2B). 또한, 유세포 분석을 통해 실험물질이 당뇨병 단계에서 항산화 활성을 가지고 있음을 확인했으며(도 2C), 이는 ROS 생성 하향 조절이 당뇨병 조절에 필수적인 역할을 할 수 있음을 시사한다. As a result, streptozotocin-induced ROS production increased in cultured control pancreatic cells treated with plain bottled water, but was significantly suppressed in the experimental substance (Figure 2A). The same results as in Beta TC-tet were also obtained in Beta TC-6 (Figure 2B). In addition, flow cytometry confirmed that the test substance had antioxidant activity in the diabetes stage (Figure 2C), suggesting that down-regulation of ROS production may play an essential role in diabetes control.
2-2 ROS 증가의 유래(미토콘드리아) 확인2-2 Confirmation of origin (mitochondria) of ROS increase
베타 세포에서 스트렙토조토신에 의한 ROS 증가가 미토콘드리아에서 유래했는지 확인하기 위해 미토콘드리아 ROS를 과산화물로 검출하는 데 널리 사용되는 MitoSOX 프로브를 사용하였다 (도 2D 및 E). 미토콘드리아 ROS는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 검출되었으며 수치는 대조군보다 약 3배 높았다. 스트렙토조토신 유도 미토콘드리아 ROS 상승은 실험물질에서 배양된 베타 세포에서는 일어나지 않았다. 이러한 결과는 다른 베타 세포에서도 유사했다 (도 2E). To determine whether the streptozotocin-induced ROS increase in beta cells originated from mitochondria, we used the MitoSOX probe, which is widely used to detect mitochondrial ROS as superoxide (Figure 2D and E). Mitochondrial ROS was detected in streptozotocin-treated cells, and the levels were approximately three times higher than those in the control group. Streptozotocin-induced mitochondrial ROS elevation did not occur in beta cells cultured in the test material. These results were similar in other beta cells (Figure 2E).
스트렙토조토신에 의해 조절되는 미토콘드리아 전자전달계 전자전달과정을 알아내기 위해 항산화제(NAC), 미토콘드리아 호흡 전자전달 복합체 I 억제제(로테논), 복합체 II 억제제(malonate), 복합체 III 억제제(stigmatelin) 또는 복합 IV 억제제(sodium azide)의 존재 하에 세포를 배양하였고 미토콘드리아 ROS를 면역 형광 분석법으로 평가했다(도 3A). To determine the mitochondrial electron transport chain electron transport process regulated by streptozotocin, antioxidants (NAC), mitochondrial respiratory electron transport complex I inhibitor (rotenone), complex II inhibitor (malonate), complex III inhibitor (stigmatelin) or combinations were used. Cells were cultured in the presence of an IV inhibitor (sodium azide), and mitochondrial ROS was assessed by immunofluorescence assay ( Fig. 3A ).
그 결과, 스트렙토조토신으로 유도된 ROS가 로테논, 스티그마탈린, 아지드화나트륨 및 NAC에 의해 차단된다는 것을 확인하였다. 반면, 다른 억제제인 말로네이트는 스트렙토조토신에 의해 유도된 미토콘드리아 ROS 생성을 억제하는 데 실패했다. 상기 결과는 베타 세포에서 스트렙토조토신 처리에 의한 미토콘드리아 ROS의 생성이 미토콘드리아 전자전달복합체 I/III/IV형에서 일어나는 것임을 입증한 것이다. As a result, it was confirmed that ROS induced by streptozotocin was blocked by rotenone, stigmatalin, sodium azide, and NAC. On the other hand, another inhibitor, malonate, failed to inhibit streptozotocin-induced mitochondrial ROS production. The above results demonstrate that the generation of mitochondrial ROS by streptozotocin treatment in beta cells occurs in mitochondrial electron transport complex types I/III/IV.
2-3. 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실 조절 확인2-3. Confirmation of loss control of mitochondrial membrane potential (△Ψm)
미토콘드리아 막전위(MMP; △Ψm)는 ATP 생성에 핵심적인 역할을 하기 때문에 세포의 건강상태를 확인하는 중요한 지표로 널리 사용되고 있다. MMP에 따라 녹색 또는 적색 형광 수율로 나누어 분석하는 JC-1 형광 염료를 사용하였다. Since mitochondrial membrane potential (MMP; △Ψm) plays a key role in ATP production, it is widely used as an important indicator to check the health status of cells. JC-1 fluorescent dye was used, which was analyzed in terms of green or red fluorescence yield depending on the MMP.
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 스트렙토조토신이 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)를 자극하여 MMP의 감소를 유발함을 확인했다. 스트렙토조토신 처리에 의한 미토콘드리아 기능 장애는 3-4배 증가했는데, 이는 스트렙토조토신이 베타 세포에서 강력한 MMP 의존성 세포독성을 유도함을 의미한다. 그러나, 실험물질로 준비한 배지는 이러한 효과를 방지하여 스트렙토조토신 처리에 의해 생성된 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실을 회복시킴을 시사한다. 동일한 취지로 H2O2 유도 실험에서 실험물질의 항산화 활성에 대한 연구를 재현하였으며 이전 실험과 동일한 결과를 얻었다(도 3C 및 D).As a result, as shown in Figure 3B, it was confirmed that streptozotocin stimulates the mitochondrial membrane potential (△Ψm) and causes a decrease in MMP. Mitochondrial dysfunction was increased 3-4-fold by streptozotocin treatment, indicating that streptozotocin induces strong MMP-dependent cytotoxicity in beta cells. However, the medium prepared with the experimental substances prevents this effect, suggesting that it restores the loss of mitochondrial membrane potential (△Ψm) generated by streptozotocin treatment. With the same purpose, the study on the antioxidant activity of the test substance was reproduced in the H 2 O 2 induction experiment, and the same results as the previous experiment were obtained (Figures 3C and D).
실험예 3. 스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병에서 Plk3 발현 조절 확인Experimental Example 3. Confirmation of Plk3 expression regulation in streptozotocin (STZ)-induced diabetes
3-1. 세포자멸사 및 Caspase-9 및 3 확인3-1. Apoptosis and Caspase-9 and 3 confirmed
미토콘드리아는 또한 포유동물 세포에서 세포자멸사를 활성화하는 데 필수적인 역할을 한다. 미토콘드리아에 의한 세포자멸사는 cytochrome c와 caspase-9를 결합시켜 caspase-3를 활성함으로써 작동하므로, caspase-9 및 3을 확인하였다. Mitochondria also play an essential role in activating apoptosis in mammalian cells. Mitochondrial apoptosis works by combining cytochrome c and caspase-9 to activate caspase-3, so caspase-9 and 3 were identified.
그 결과, 스트렙토조토신이 처리된 대조군 세포에서는 절단된 caspase-9 와 -3 단백질 수준이 증가했지만 실험물질로 준비한 배지에서는 증가하지 않았다(도 4A). 이는 세포자멸사가 caspase-8과 관련된 세포 사멸과 관계가 없음을 시사한다. As a result, cleaved caspase-9 and -3 protein levels increased in control cells treated with streptozotocin, but did not increase in the medium prepared with the test substances (Figure 4A). This suggests that apoptosis is not related to caspase-8-related cell death.
3-2. 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 물질의 Plk3의 단백질 안정화 음성 제어 확인3-2. Confirmation of negative control of protein stabilization of Plk3 for substances with activity against streptozotocin-induced diabetes and apoptosis
스트렙토조토신이 처리된 췌장 세포에서 Plk1 및 Plk2와 달리 유의하게 증가된 Plk3 단백질 발현을 관찰했다 (도 4A, B 및 C). 반면, 실험물질로 제조한 배지에서는 Plk3의 높은 단백질 발현이 관찰되지 않았으며, 이는 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 물질이 Plk3의 단백질 안정화를 음성 제어함을 시사한다. In streptozotocin-treated pancreatic cells, we observed significantly increased protein expression of Plk3, unlike Plk1 and Plk2 (Figures 4A, B, and C). On the other hand, high protein expression of Plk3 was not observed in the medium prepared with the experimental substance, suggesting that substances with activity against streptozotocin-induced diabetes and apoptosis negatively control protein stabilization of Plk3.
또한, 췌장세포 내 세포 사멸이 세포 내 ROS 증가로 인한 것인지 여부를 조사하기 위해 세포를 H2O2로 처리했다. 실험물질 역시 변화를 확인하기 위해 동일한 조건에서 배양하였다(도 4B). Additionally, to investigate whether apoptosis in pancreatic cells was due to increased intracellular ROS, cells were treated with H 2 O 2 . The test material was also cultured under the same conditions to confirm changes (Figure 4B).
그 결과, 과산화수소(H2O2)를 처리한 췌장 세포에서 caspase-9와 -3에 의해 활성화된 단백질인 절단된 단백질의 수준이 도 4A에서 확인할 수 있듯 스트렙토조토신 처리된 세포에서와 같이 유의하게 증가하였다. 이러한 단백질의 변화는 plk3 억제제인 실험물질에 의해 억제되었다. 또한, 스트렙토조토신에 의해 유도된 세포자멸사가 세포 내 ROS를 증가시킴을 확인하기 위해 스트렙토조토신 처리 후 항산화 억제제인 NAC를 사용하였을 때 상기 기능이 억제됨을 입증하였다(도 4C). 실험물질은 Beta TC-6 세포에서 내인성 Plk3 단백질을 감소시킬 뿐만 아니라 스트렙토조토신 또는 H2O2와 같은 외부 스트레스에 의해 증가된 Plk3 단백질을 차단함을 확인하였다(도 4A, B, C). As a result, in pancreatic cells treated with hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), the level of cleaved proteins, which are proteins activated by caspase-9 and -3, was significant as in streptozotocin-treated cells, as can be seen in Figure 4A. increased significantly. These protein changes were suppressed by the experimental substance, a plk3 inhibitor. In addition, to confirm that apoptosis induced by streptozotocin increases intracellular ROS, it was demonstrated that this function was inhibited when NAC, an antioxidant inhibitor, was used after streptozotocin treatment (Figure 4C). It was confirmed that the experimental substance not only reduces endogenous Plk3 protein in Beta TC-6 cells, but also blocks Plk3 protein increased by external stress such as streptozotocin or H 2 O 2 (Figure 4A, B, C).
실험물질이 Plk3 단백질을 분해할 수 있는지 여부를 알아내기 위해 베타 TC-6 세포를 도 4ABC와 동일한 조건에서 프로테아좀 억제제인 MG 132로 처리했다(도 4D). 스트렙토조토신은 베타세포에서 Plk3 단백질의 수준을 현저히 증가시켰고 이 단백질의 증가는 실험물질에 의해 감소되었다. 그러나, 실험물질에 의한 Plk3 단백질 감소 효과는 MG132 처리에도 불구하고 전혀 변하지 않았다. 또한, 실험물질이 사용된 스트렙토조토신 처리한 배지에서 항산화 활성에 대한 연구를 재현한 결과 NAC 처리와 동일한 결과를 얻었다(도 4E 및 F).To determine whether the test substance could degrade Plk3 protein, beta TC-6 cells were treated with MG 132, a proteasome inhibitor, under the same conditions as in Figure 4ABC ( Figure 4D ). Streptozotocin significantly increased the level of Plk3 protein in beta cells, and the increase in this protein was decreased by the test substance. However, the effect of reducing Plk3 protein by the test substance did not change at all despite MG132 treatment. In addition, as a result of reproducing the study on antioxidant activity in the streptozotocin-treated medium using the test substance, the same results as NAC treatment were obtained (Figures 4E and F).
3-3. Plk3의 미토콘드리아 ROS와 세포자멸사 조절 여부 확인3-3. Determination of whether Plk3 regulates mitochondrial ROS and apoptosis
Plk3의 발현이 미토콘드리아 ROS와 세포자멸사를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 Plk3가 과 발현된 세포가 형질감염되지 않은 정상 베타 세포에 비해 미토콘드리아 ROS를 유의하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 5A). 형광현미경 하에서 정상 베타 세포에서의 Plk3 단백질의 발현 수준은 매우 낮았고 미토콘드리아 ROS도 밝게 측정되지 않았지만 스트렙토조토신 처리된 췌장 세포에서 두 신호가 모두 증가하여(도 5B) 도 4의 웨스턴 블롯의 결과로 나온 단백질 수준 패턴과 일치했다. Plk3가 없는 경우 미토콘드리아 ROS 생성이 극적으로 감소했으며 이러한 결과는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 더 두드러졌다. 스트렙토조토신에 의해 증가된 Plk3 단백질 및 미토콘드리아 ROS의 발현은 실험물질을 사용하여 만든 배지에서 유의미하게 감소하였다(도 5C). To determine whether the expression of Plk3 regulates mitochondrial ROS and apoptosis, we first confirmed that cells overexpressing Plk3 significantly increased mitochondrial ROS compared to normal non-transfected beta cells (Figure 5A). Under fluorescence microscopy, the expression level of Plk3 protein in normal beta cells was very low and mitochondrial ROS was not brightly measured, but both signals were increased in streptozotocin-treated pancreatic cells (Figure 5B), resulting from the Western blot in Figure 4. This was consistent with the protein level pattern. In the absence of Plk3, mitochondrial ROS production was dramatically reduced, and this result was more pronounced in streptozotocin-treated cells. The expression of Plk3 protein and mitochondrial ROS, which were increased by streptozotocin, was significantly decreased in the medium prepared using the test substances (Figure 5C).
3-4. Plk3 억제에 의한 베타세포의 세포 자멸사 조절 확인3-4. Confirmation of apoptosis regulation of beta cells by Plk3 inhibition
또한, Plk3 생성 미토콘드리아 ROS가 스트렙토조토신이 처리된 베타 세포에서 세포 사멸을 유도여부를 확인하였고 Plk3 유전자 결실 또는 실험물질이 그 효과를 억제할 수 있는지 여부 또한 조사하였다. 상당한 수의 세포 사멸 세포가 스트렙토조토신 처리된 세포와 Plk3로 과 발현된 세포 각각에서 관찰되었다 (도 5D). 또한, 스트렙토조토신으로 처리된 베타 세포의 세포자멸사가 Plk3 녹다운에 의해 유의하게 감소된다는 것을 발견했다. In addition, we confirmed whether Plk3-generated mitochondrial ROS induced cell death in beta cells treated with streptozotocin, and also investigated whether Plk3 gene deletion or experimental substances could inhibit the effect. A significant number of apoptotic cells were observed in streptozotocin-treated cells and cells overexpressed with Plk3, respectively (Figure 5D). Additionally, we found that apoptosis of beta cells treated with streptozotocin was significantly reduced by Plk3 knockdown.
3-5. Plk3 shRNA의 당뇨병 세포 자멸 방지 확인3-5. Confirmation of prevention of diabetes apoptosis by Plk3 shRNA
Plk3 shRNA가 스트렙토조토신-유발 세포자멸을 방지한다는 것을 더 증명하기 위해 우리는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 Plk3 construct(또는 빈 벡터)를 안정적으로 발현시키고 이때 세포자멸사하는 세포를 계산했다. 미토콘드리아 ROS에 의한 세포자멸사는 Plk3 shRNA를 안정적으로 발현하는 스트렙토조토신 처리 세포에서 감소한 반면, shRNA 내성 Plk3으로 재구성하면 세포자멸사 정도가 회복되었다(도 5D). 그러나 Plk3 shRNA- 저항성 Plk3 유도하는 재구성에 의한 세포자멸사의 재증가는 실험물질에 의해 재 억제되었다. To further demonstrate that Plk3 shRNA prevents streptozotocin-induced apoptosis, we stably expressed the Plk3 construct (or empty vector) in streptozotocin-treated cells and counted apoptotic cells. Mitochondrial ROS-induced apoptosis was reduced in streptozotocin-treated cells stably expressing Plk3 shRNA, whereas reconstitution with shRNA-resistant Plk3 restored the extent of apoptosis ( Fig. 5D ). However, the re-increase of apoptosis due to Plk3 shRNA-resistant Plk3-induced reconstitution was re-inhibited by the experimental substance.
상기 결과는 Plk3 매개 세포자멸사가 미토콘드리아 ROS의 활성화와 밀접한 관련이 있음을 시사한다(도 5A, B, D).The above results suggest that Plk3-mediated apoptosis is closely related to the activation of mitochondrial ROS (Figure 5A, B, D).
실험예 4. 3D 오르가노이드 모델 상 스트렙토조토신 유발 당뇨병에서 인슐린 분비 조절에 미치는 영향 확인 . Experimental Example 4. Confirmation of the effect on the regulation of insulin secretion in streptozotocin-induced diabetes in a 3D organoid model .
포도당으로 자극한 생체 외 모델에서 췌장 베타 세포의 인슐린 분비를 조사했다(도 6). 인체의 각 조직과 다양한 세포는 많은 복잡한 모양으로 구성되어 있기 때문에 정확한 데이터를 얻고 이의 분석을 위해서는 인체와 같은 최상의 생물학적 환경을 구축해야 했다. 3D 세포 배양은 세포에게 최적의 자연적인 환경을 직접 제공함으로써 세포가 자연적인 인체와 유사한 환경에서 살 수 있도록 하여 세포의 기능을 돕도록 하는 최고의 배양 시스템 중 하나이다. 이 배양법은 콜라겐이나 다른 기질(matrix)과 같은 지지체를 사용하거나 세포 배양 접시의 표면에 나노물질을 부착시켜 최적의 세포 성장을 돕는다는 점에서 2D 방법과 구별된다(도 6A). 이 실험을 위해 나노플레이트를 이용한 3D 스페로이드(spheroid) 배양을 사용하였고, 세포주를 파종한 지 3일 후에 모든 췌장 세포가 스페로이드를 형성하기 시작했다(도 6A). Insulin secretion from pancreatic beta cells was examined in an in vitro model stimulated with glucose (Figure 6). Since each tissue and various cells in the human body are composed of many complex shapes, it was necessary to build the best biological environment like the human body to obtain accurate data and analyze it. 3D cell culture is one of the best culture systems that helps cells function by directly providing the optimal natural environment to cells, allowing them to live in an environment similar to the natural human body. This culture method is different from the 2D method in that it helps optimal cell growth by using a support such as collagen or another matrix or attaching nanomaterials to the surface of a cell culture dish (Figure 6A). For this experiment, 3D spheroid culture using nanoplates was used, and 3 days after seeding the cell line, all pancreatic cells began to form spheroids (Figure 6A).
그 결과, plk3 억제제의 대표인 실험물질로 준비된 배지가 ROS를 통한 스트렙토조토신 유도 세포자멸사를 차단한다는 것을 알 수 있다(도 6B). 또한, 일반 물에서 스트렙토조토신 처리된 베타 세포가 대조군 세포보다 포도당 자극에 의한 상등액 배지의 인슐린 분비가 더 낮았지만 plk3 억제제인 실험물질이 사용된 배지에서 배양된 세포들의 경우 3D 배양 시스템에서 여전히 인슐린을 생산한다는 것을 발견했다(도 6C). As a result, it can be seen that the medium prepared with the experimental substance, a representative plk3 inhibitor, blocks streptozotocin-induced apoptosis through ROS (Figure 6B). In addition, although beta cells treated with streptozotocin in plain water had lower insulin secretion in the supernatant medium by glucose stimulation than control cells, cells cultured in medium using the test substance, a plk3 inhibitor, still secreted insulin in the 3D culture system. was found to produce (Figure 6C).
상기 결과는 plk3 억제제가 베타 세포의 성장을 안정화하고 인슐린 분비를 촉진하는 역할을 하는 것뿐만 아니라 당뇨병을 예방 및 치료하는 역할 또한 하는 것을 시사한다 (도 7).The above results suggest that the plk3 inhibitor not only plays a role in stabilizing the growth of beta cells and promoting insulin secretion, but also plays a role in preventing and treating diabetes (FIG. 7).
실험예 5. shRNA 추가 확인Experimental Example 5. Confirmation of additional shRNA
베타 TC-6 세포를 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염(infection)시키고 면역블로팅(immunoblotting)으로 인해 Plk3 단백질 변화를 관찰하였다(도 8A). 감염시킨 세포는 스트렙토조토신으로 18시간 동안 처리한 후 MitoSOX (5μM)로 30분 동안 염색한 다음 면역형광분석하고 이를 정량분석하였다(도 8B 및 8C). Beta TC-6 cells were infected with plasmids (control shRNA or Plk3 shRNA), and changes in Plk3 protein were observed by immunoblotting (Figure 8A). The infected cells were treated with streptozotocin for 18 hours, stained with MitoSOX (5 μM) for 30 minutes, and subjected to immunofluorescence analysis for quantitative analysis (Figures 8B and 8C).
또한, 베타 TC-6 세포를 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염(infection)시키고 24시간 후, 스트렙토조토신으로 72시간 처리하고 형광 현미경분석(fluroscence microscopy)하고 이를 정량분석하였다(도 8D 및 8E). 모든 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.In addition, beta TC-6 cells were infected with plasmid (control shRNA or Plk3 shRNA), and 24 hours later, they were treated with streptozotocin for 72 hours and quantitatively analyzed by fluorescence microscopy (Figures 8D and 8E). All experiments were performed independently three times.
이 때, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군 shRNA(scrambled control shRNA lentiviral vector)는 서열번호 5이며, Plk3 shRNA는 하기 서열번호 2 내지 4와 같다.At this time, as shown in Table 1 below, the control shRNA (scrambled control shRNA lentiviral vector) is SEQ ID NO: 5, and the Plk3 shRNA is SEQ ID NO: 2 to 4 below.
그 결과, 3 종의 shRNA(서열번호 2 내지 4)이 당뇨병 세포의 세포자멸사를 감소시킴을 확인하였다.As a result, it was confirmed that three types of shRNA (SEQ ID NO: 2 to 4) reduced apoptosis of diabetic cells.
상기 결과로부터, 본 발명은 스트렙토조토신 당뇨병 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하기 위해 이러한 plk3를 차단할 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the present invention can block plk3 to suppress cell death caused by streptozotocin diabetic stress.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing its technical idea or essential features. In this regard, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as including the meaning and scope of the patent claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the equivalent concept thereof are included in the scope of the present invention.
Claims (15)
상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 조성물.
A composition for inhibiting in-vitro apoptosis of beta cells containing a Plk3 inhibitor,
A composition wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
A composition for inhibiting reactive oxygen species (ROS) in beta cells in vitro , comprising a Plk3 inhibitor, wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
The composition of claim 1 or 2, wherein the shRNA includes any one or more of SEQ ID NOs: 2 to 4.
The composition according to claim 1 or 2, wherein the beta cells are diabetes model cells.
The composition of claim 6, wherein the beta cells are treated with streptozotocin.
상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 약학적 조성물.
A pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes containing a Plk3 inhibitor,
A pharmaceutical composition wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
The pharmaceutical composition of claim 8, wherein the Plk3 inhibitor reduces beta cell death (apoptosis).
The pharmaceutical composition of claim 8, wherein the Plk3 inhibitor reduces mitochondrial reactive oxygen species (ROS).
The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the Plk3 inhibitor restores loss of mitochondrial membrane potential.
The pharmaceutical composition according to claim 8, wherein the diabetes is caused by streptozotocin.
A food composition for preventing or improving diabetes containing a Plk3 inhibitor, wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 방법.
A method for preventing or treating diabetes, comprising administering a Plk3 inhibitor to a subject other than a human,
The method wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 방법.A method of inhibiting apoptosis of beta cells, comprising the step of treating beta cells with a Plk3 inhibitor in vitro ,
The method wherein the Plk3 inhibitor is shRNA that inhibits the expression or activity of Plk3.
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| CN110339363A (en) | 2019-08-28 | 2019-10-18 | 南方医科大学 | PKC enzyme inhibitor improves and protects the purposes in pancreas islet beta cell function drug in preparation |
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Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2010. Vol.51, No.10, pp.5034-5040.* |
| Scientific Reports. 2019. Vol.9, Article 20085. |
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