KR102654662B1 - 당뇨병 예방 및 치료를 위한 신규 약물(Plk3 억제제)과 관련 물질 개발 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Plk3 억제제를 포함한 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물; 인비트로(in-vitro) 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물; 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물; 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물; 이를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료 방법; 및 베타세포의 사멸 억제 방법에 관한 것이다.

Description

당뇨병 예방 및 치료를 위한 신규 약물(Plk3 억제제)과 관련 물질 개발 {Development of a novel pharmaceutics (Plk3 inhibitor) and related materials thereof}

본 발명은 Plk3 억제제를 포함한 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물; 인비트로(in-vitro) 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물; 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물; 이를 이용한 당뇨병 예방 또는 치료 방법; 및 베타세포의 사멸 억제 방법 에 관한 것이다.

당뇨병은 췌장 베타세포가 인슐린을 분비하지 않거나 전신 세포가 인슐린에 내성이 있을 때 발생하는 질환이다. 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 및 임신성 당뇨병으로 나뉘며 소수의 사람들의 경우 기타 다른 원인에 의해 특정 유형의 당뇨병으로 발전한다. 제1형 당뇨병은 자가면역 반응에 의해 췌장에서 인슐린을 생산하는 랑게르한스의 베타 세포가 파괴되어 정상적인 포도당 저장 기능의 상실로 인하여 발생한다. 제2형 당뇨병은 만성 고혈당증과 세포 인슐린 저항성이 특징이다. 당뇨병은 망막병증, 신장병증, 신경병증 및 심혈관 질환과 관련된 혈관 합병증을 유발한다. 임신성 당뇨병은 이전에 당뇨병이 없었던 임산부에게 발생하는 당뇨병이다. 이는 신체가 임신 중에 충분한 인슐린을 생산할 수 없을 때 발생하며 이러한 여성은 나중에 인슐린 저항성으로 인해 제2형 당뇨병에 걸릴 가능성이 더 높다. 다른 유형의 당뇨병에는 단일 유전자 당뇨병 증후군, 외분비 췌장 질환, 약물 또는 화학 물질에 의해서 유발된 당뇨병이 포함된다.

한편, 당뇨병에 대한 가장 이상적인 치료를 위해 여러 신약들이 개발되거나 환자에게 사용되고 있으나 (한국 등록특허공보 제10-1880164호), 당뇨병 유도 및 유사 환경 발생시 췌장세포 내에서 일어나는 일련의 부정적 신호 작용을 원천적으로 차단한다거나 인슐린을 안정적으로 분비하고 베타세포의 성장을 균형있게 조절하는 약물의 개발은 여전히 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자는 스트렙토 조토신 당뇨 유발물질로 인해 증가하는 Plk3 유전자를 전사단계에서 (초기단계에서) 차단함으로써 췌장 세포내 미토콘드리아 활성산소를 차단은 물론 췌장 분비 섬 세포의 인슐린 분비를 안정화시키는 역할을 하는 물질을 발견하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함한 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 포함한 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Plk3 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 인비트로에서 베타세포에 Plk3 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 베타세포의 사멸 억제 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명 내용에 대하여 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시한 일 양태의 설명 및 실시형태는 공통된 사항에 대하여 다른 양태의 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 아울러, 본 발명에 기재된 문헌은 본원의 참조로 삽입될 수 있다. 더불어, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

본 발명의 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸(apoptosis) 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "베타세포"는 랑게르한스 섬에서 인슐린을 생성할 수 있는 세포이다. 상기 베타세포는 당뇨병 모델 세포일 수 있다.

일 구현 예로, 상기 베타세포는 스트렙토조토신이 처리된 것일 수 있고, 이로 인해 정상세포에 비해 세포 사멸이 증가된 것일 수 있으며, 활성산소종이 증가된 것(특히, 미토콘드리아 활성산소종 증가)일 수 있으며, 미토콘드리아 막전위가 손실된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "Polo-like kinase(Plk)"는 유사분열, 감수분열, 세포질 분열, DNA 복제, 염색체 분리. 및 여러 스트레스 반응 과정과 관련된 다양한 기능을 가진 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. 상기 Plk 계열은 포유류에서 Plk1, Plk2, Plk3, 및 Plk4로 구분되며, 본 발명의 Plk는 Plk3를 의미한다.

본 기술분야에서 상기 Plk3와 당뇨병 간 관계에 대한 연구 및 보고는 불충분한 반면, 본 발명은 Plk3 억제제를 이용하여 당뇨병을 예방, 치료, 또는 개선할 수 있음을 최초로 규명하였다는 데에 기술적 의의가 있다.

본 발명의 일 실험예에서는, Plk3 억제가 당뇨병 예방, 치료, 또는 개선에 깊은 연관이 있는 반면, 동일한 Plk 계열 단백질인 Plk1 및 Plk2는 낮은 연관성을 보이는 것을 확인하였다(실험예 3.1 및 도 4 등).

일 구현 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 베타세포 사멸(apoptosis)를 감소, 미토콘드리아 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)을 감소, 및/또는 미토콘드리아 막전위 손실을 회복시키는 것일 수 있다,

일 구현 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 인슐린 불가능의 직접적 요인으로 알려져 있는 불안정한 미토콘드리아 활성산소의 증가를 직접적으로 차단하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, Plk3는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있다. 구체적으로, 상기 Plk3는 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 폴리펩티드로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 Plk3는 공지의 데이터 베이스인 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank), Uniprot, 및 Genecard 등에서 얻을 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 Plk3의 아미노산 서열은 상기 서열번호 로 기재된 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 발명의 단백질의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이(silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.

상기 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 통상적으로, 보존적 치환은 단백질 또는 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않을 수 있다.

본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.

보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.

임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ET AL/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 유니터리 매트릭스(unitary matrix) (동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.

또한, 상기 Plk3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.

본 발명에서 용어, "Plk3 억제제"란 Plk3 해독 및 전사과정 또는 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 모두 통칭한다. 본 발명에서 "Plk3"는 별도의 언급이 없는 한 Plk3 mRNA와 단백질을 모두 지칭하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3 단백질, mRNA, 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 표적으로 할 수 있다. 일 예로, Plk3 억제제는 Plk3 유전자 발현(생산)을 조절하는 프로모터 지역에 직접적으로 결합하거나 증폭 신호를 주는 전사인자를 억제하는 물질 또는 단백질 유사체, plk3 유전자에 결합하여 그 발현을 전사 수준에서 억제하는 전사인자; 전사되어 생성된 전사체에 결합하여 전사체를 분해하는 miRNA, siRNA, shRNA 등의 RNA; 발현된 단백질과 결합할 수 있는 항체, 압타머, 안타고니스트, 또는 화합물 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

전술한 구현 예 중 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3를 코딩하는 염기서열 또는 이의 단편을 표적으로 하고, 상기 염기서열 또는 이의 단편에 상보적으로 결합하여 Plk3 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하는 것일 수 있다. 그 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 siRNA, shRNA, miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 앱타머 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명에서 용어, "siRNA(small interfering RNA)" 및 "shRNA(small hairpin RNA"란 RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 또는 유전자 침묵(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용된다.

본 발명에서 용어, "RNA 간섭(RNA interference, RNAi)"이란 표적 유전자의 mRNA와 상동 서열인 센스(sense) RNA와, 이와 상보적인 서열인 안티센스(anti-sense) RNA로 구성되는 이중 사슬 RNA(double strand RNA, dsRNA)를 도입함으로써 RNA에 의해 전사 후 표적 유전자 mRNA의 파괴를 유도하여 표적 유전자의 발현을 80% 이상 억제할 수 있는 현상으로, 유전자 침묵(silencing)으로도 명명된다.

상기 siRNA 및 shRNA는 RNAi 현상을 유도하는 약 20 뉴클레오티드 이상, 21 뉴클레오티드 이상, 22 뉴클레오티드 이상, 23 뉴클레오티드 이상, 24 뉴클레오티드 이상, 또는 25 뉴클레오티드 이상, 및 100 뉴클레오티드 이하의 짧은 dsRNA을 의미한다.

상기 siRNA 및 shRNA의 제조방법은 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, siRNA 및 shRNA를 직접 화학적으로 합성하는 방법, 시험관 내(in vitro) 전사를 이용한 siRNA 및 shRNA의 합성법, 시험관 내(in vitro) 전사에 의해 합성된 긴 이중 가닥 RNA를 효소를 이용하여 절단하는 방법, shRNA 발현 플라스미드나 바이러스성 벡터의 세포 내 전달을 통한 발현법 및 PCR(polymerase chain reaction) 유도 siRNA 발현 카세트(cassette)의 세포 내 전달을 통한 발현법 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

전술한 구현예 중 다른 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3을 타겟으로 하는 shRNA일 수 있다. 본 발명의 Plk3을 타겟으로 하는 shRNA는 센스 올리고뉴클레오티드 및 이와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 상기 센스와 안티센스 올리고뉴클레오티드 사이에 루프 서열을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 일 예로, 본 발명의 Plk3를 타겟으로 하는 shRNA는 서열번호 2 내지 4의 염기서열중 어느 하나 이상을 센스 올리고뉴클레오티드 및 이와 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 포함할 수 있다. 본 발명에서 서열번호 2 내지 4의 염기서열을 포함하는 shRNA는 인간 및 마우스 췌장세포로의 호환이 가능하다. 이는 인간 Plk3(단백질 ID: Q9H4B4) 및 마우스 Plk3(XP_021055741.1)의 상동성 및 동일성 확인 결과에 근거한 것이다.

본 발명에서 용어, "miRNA(micro RNA)"란 세포 내에서 자연적으로 존재하는 물질로, RNAi 현상을 유도하여 특정한 유전자의 조절에 관여하는 물질을 의미한다. 본 발명의 Plk3의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 miRNA라면 그 종류에 한정되지 않고 본 발명에 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"란 특성 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 Plk3 표적 서열에 상보적이고, 상기 서열에 결합할 수 있는 DAN 또는 RNA 서열일 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 5 내지 100 nt, 8 내지 60 nt, 10 내지 40 nt 또는 10 내지 30 nt일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여되거나, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성된 형태로 투여될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 생물/화학적인 방법에 의하여 합성될 수 있다. 또한, 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 하는 형태는 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시키는 재조합 벡터 등을 이용하여 실현할 수 있고, 이러한 방법은 본 발명의 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 Plk3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 염기서열을 참조하여, 본 발명의 기술분야에서 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.

본 발명의 용어 “항체”는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 이는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않는바, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 및 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고, 모든 면역글로불린 항체뿐만 아니라 인간화 항체 등의 특수한 항체를 포함할 수 있다. 아울러, 상기 항체는 전체 길이의 경쇄 2개 및 전체 길이의 중쇄 2개를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체의 기능적인 단편 또한 포함한다. 상기 항체의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합성을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 될 수 있다. 본 발명의 목적상 항체는 Plk3에 결합하여 그 활성을 억제할 수 잇는 한 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 용어 “안타고니스트(antagonist)”는 수용체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 물질을 의미하며, 수용체의 리간드와 함께

사용하는 경우에 상기 리간드의 작용을 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상 상기 안타고니스트는 Plk3 단백질에 결합하여 그 활성을 억제할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다.

일 구현 예로, 상기 안타고니스트는 (1) 후보 물질이 직접 Plk3 전사 프로모터 부위에 결합하여 전사인자와 경쟁적 저해를 하는 경우; (2) 후보 물질이 Plk3 전사 프로모터 부위에서 전사 활성을 지시하는 전사 인자를 촉진하는 조절 인자에 결합 후 그 기능을 억제하는 경우; (3) Plk3 단백질에 직접 결합하여 Plk3 단백질이 하위 단백질이 신호전달을 못하게 막는 경우; (4) Plk3 단백질을 활성을 촉진하는 조절 단백질과 결합하여 그 기능을 억제하는 경우; 또는 (5) Plk3 단백질이 특정 부위에 이동하여 작동하는 것을 사전에 막는 경우일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "압타머(aptamer)"란 단일가닥 올리고뉴클레오티드로서, 소정의 표적에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 압타머는 20 내지 60 뉴클레오티드 정도의 크기일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지고, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 압타머는 소정의 표적에 결합함으로써, 소정의 표적의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 앱타머는 Plk3 mRNA에 결합하여 Plk3의 발현 또는 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 압타머는 Plk3 표적 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.

전술한 구현예 중 또 다른 하나의 예로, 본 발명의 Plk3 억제제는 Plk3를 타겟으로 하는 shRNA를 발현하는 벡터일 수 있다.

본 발명에서 용어, "벡터(vector)"란 목적하는 DNA 단편을 숙주 세포에 도입시켜 증식할 수 있는 DNA로써 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. "발현 벡터"는 목적하는 코딩서열과, 특정 숙주생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 벡터는 발현 벡터와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합 된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있고, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으며, 바이러스 벡터로서 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 목적 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열 또는 발현 조절 영역과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병 예방 또는 치료용 조성물이다.

본 발명의 실험예에서, Plk3 억제제를 개체에 투여하여 당뇨병을 치료할 수 있음을 확인하였다.

일 구현 예로, 본 발명의 당뇨병은 스트렙토조토신(Streptozotocin)에 의해 유발되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로, 구체적으로는 0.001 중량% 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1일 0.0001 내지 500mg/kg으로, 구체적으로는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋을 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한 없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간에 적용되는 의약품뿐만 아니라, 동물 의약품의 형태로도 사용될 수 있다. 여기에서, 동물이란 가축 및 반려동물을 포함하는 개념이다.

본 출원의 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 Plk3, Plk3 억제제, 당뇨병, 및 예방 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개선"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 당뇨병 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합체, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함한다.

상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 식품은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 유효성분을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

상기 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 Plk3 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 식품 조성물은 식품 또는 음료에 대하여 50 중량부 이하, 구체적으로 20 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 식품 조성물은 당뇨병 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 다양한 중량%로 포함할 수 있으나, 구체적으로 유효성분을 식품 조성물의 총중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.

본 출원의 또 다른 하나의 양태는 Plk3 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 Plk3, Plk3 억제제, 당뇨병, 예방, 및 치료 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"는 당뇨병이 발병되었거나 발병 가능성이 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 인간을 제외한 것일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여 시 비강 투여, 피부 외용 또는 복강 내 주사, 직장 내 주사, 피하주사, 정맥 내 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 등의 주입방식을 선택할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 인비트로에서 베타세포에 Plk3 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 베타세포의 사멸 억제 방법을 제공한다.

상기 Plk3, Plk3 억제제, 및 베타세포 등은 다른 양태에서 설명한 바와 같다.

본 발명을 이용하여 효과적으로 Plk3를 억제하여 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1A 내지 1G는 스트렙토조토신 당뇨병 유도 물질 하에 발생되는 베타세포 내 세포 사멸과 이에 대한 억제 효과를 나타낸 도이다 (A, Evian; B, Smartwater; C, Aquafina; D, Fiji; E, Icelandic; F, Evamor; G, Eternal; H, Dasani; I, Crystal geyser; J, 실험물질(natural COA); K, Poland spring; L, Nestle pure life; M, Essentia; N, Ice mountain; O, commercial media (DMEM, Gibco)).
도 2A 내지 2E는 베타세포에서 스트렙토조토신으로 유발된 ROS 생성 차단 효과를 나타낸 도이다
도 3A 내지 3D는 활성 산소를 통한 미토콘드리아 막 전위 조절을 나타낸 도이다.
도 4A 내지 4F는 베타 세포에서 스트렙토조토신을 통한 미토콘드리아 매개 세포자멸사 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5A 내지 5D는 Plk3 의 미토콘드리아 활성 산소를 증가시키는 조절 단백질의 효과를 나타낸 도이다.
도 6A 내지 6C는 3D 오르가노이드 모델에서 스트렙토조토신 유발 당뇨병 스트레스 하 췌장 베타세포의 인슐린 분비 조절을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명 효과의 도식 모델을 나타낸 도이다.
도 8A 내지 8E은 Plk3 shRNA를 이용한 STZ 당뇨 자극 물질이 유도시키는 미토콘드리아 활성산소 증가 및 세포자멸사 억제 효과를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.

실시예 1. 세포 및 세포주, 시약 및 유전자 침묵(gene silencing)

모든 세포 주는 판매 업체로부터 공급받았다. 베타 TC-6 및 베타 TC-tet 마우스 췌장 분비 섬 세포주는 15%의 FBS, 스트렙토마이신, 및 페니실린이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)에서 배양하였다. 세포 배양을 위해서 분말 배지 성분은 시판되는 다양한 수용액(Evian, Smartwater, Aqua - fina, Fiji, Icelandic, Evamor, Eternal, Dasani, Crystal Geyser, Dr. coa(COA water), Poland Spring, Nestle pure life, Essentia, Ice mountain)에 용해시켰다. 연구에 사용된 모든 상업용 물은 온라인(인터넷) 또는 지역 식료품점(미네소타주 로체스터)에서 구입했다. 그 후, 그 배지는 0.2 μm의 다공성 막을 사용하여 여과시킴으로써 즉시 멸균하였다. DMEM 배지 분말(Millipore - Sigma, Burlington, Mass)을 실온에서 14 가지 다른 상업용 살균된 물에 희석했다. 팩 내부는 모든 배지 분말이 사용되도록 하기 위해 멸균수로 철저히 헹구었다. 총 부피가 1L가 되도록 멸균수로 채워진 배지를 여과하고 병모양인 0.2μm 막 필터(Millipore - Sigma, Burlington , MA)를 사용하여 즉시 멸균했다. 2',7' 디클로로플루오레세인 디아세테이트(2′, 7'-Dichlorofluorescein diacetate, DCF-DA), 요오드화 프로피듐(Propidium Iodide, PI, P 4864), N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC), 과산화수소(H₂O₂), 스티그마텔린(stigmatellin), 말로네이트(malonate), 로테논(rotenone) 및 아지드화 나트륨(sodium azide)은 Sigma - Aldrich에서 구입했다. MitoSOX 및 5,5',6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸릴 카르보시아닌 요오드화물(5,5′, 6,6'-tetrachloro-1,1′',3,3′'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodide, JC-1)은 Molecular Probes (Eugene, OR)에서 구입했다. 파라포름알데히드 용액(Paraformaldehyde Solution, MFCD 00133991) 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI, 62248)은 Thermo Scientific에서 구입하였다. MG132(Z-Leu-Leu-Leu-al, S2619)는 Selleck Chemicals에서 구입하였다. Plk3 렌티바이러스(lentiviral) shRNA 와 음성 대조군 shRNA는 Creative Biogene Company에서 구입하였다.

실시예 2. 세포 성장 곡선 측정 및 DAPI 염색

Beta TC-6 또는 Beta TC-tet 세포를 일반 물(대조군)과 실험물질로 제조한 각각의 배지에서 배양하고 72시간 동안 스트렙토조토신을 처리하였다. 또한 세포 생존율은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 분석을 사용하여 측정하였다. 세포를 3일동안 배양하고 MTT 용액을 20분간 염색한 후 Fluorescent Microplate Reader(GE-Nios Plus, Tecan)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 3.7% 파라포름알데히드(Sigma -Aldrich)가 포함된 인산염 완충 식염수(PBS, Gibco-Invitrogen)에 고정했다. 1X PBS로 3회 세척한 후, 세포를 PBS 완충액에서 0.5 mg/ml DAPI 용액(세포자멸사를 측정하기 위해)과 함께 10분 동안 배양하였다. 그 후 세포를 PBS로 두 번 세척하고 UV 광선 하에서 형광 현미경으로 검사했다.

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석 및 항체

2개의 다른 췌장 베타 세포주의 단백질 용해물 샘플은 RIPA 용해 완충액에 얼음이 추가된 상태에서 1mM PMSF를 포함한 프로테아제(protease) 억제제를 추가하여 용해시켰다. 단백질 용해물 샘플은 4-8시간 동안 아크릴아마이드을 이용한 10-15 % SDS-Page 겔을 준비하여 분리한 다음 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 실온에서 1시간 동안 5% 무지방 우유의 TBS-T 완충액에서 블락(block)처리하였다. 다음으로, PVDF 막을 1차 항체와 함께 배양하였다. 막을 1% TBST로 3회 세척한 후 관련 토끼 항-마우스 IgG-HRP 2차 항체(Abcam)와 함께 1시간 동안 배양했다. Cleaved Caspase-8(Asp384, #9748) 및 Cleaved Caspase-9 (Asp 353, #9509)를 인식하는 마우스 단클론 항체는 Cell Signaling에서 구입하였다. 절단된 PARP (Asp214, ab32064) 및 Plk 2 (ab137539)를 인식하는 토끼 다클론 항체는 Abcam에서 입수했다. Cleaved Caspase-3 (Asp175, #9661)를 인식하는 토끼 다클론 항체는 Cell Signaling에서 구입했다. Plk1을 인식하는 마우스 단클론항체 (35- 206)와 Plk3 invitrogen을 인식하는 토끼 다클론항체 (PA5-97143) 는 Invitrogen에서 구입하였다. 항-베타-액틴 마우스 항체는 Sigma에서 구입하였다.

실시예 4. 유세포 분석

FACS에 의한 세포 주기 프로파일의 분석을 위해, 유도 후 시간 경과에 따라 세포를 수확하였다. 췌장 베타 TC-6 분비 섬 세포를 실험군 및 대조군 각각의 배지에서 배양한 후 스트렙토조토신을 72시간 동안 처리하였다. 그 다음, 세포를 70% 메탄올로 고정하고 (ROS를 위해서는 CM-H 2DCFDA(5μg/ml))를 RNase A(100mg/ml, Sigma-Aldrich) 함유물과 함께 실온에서 30분 동안 처리하였다. FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson, CA)를 사용하여 DNA 함량을 분석했다. 실험은 독립적으로 세 번 수행되었다.

실시예 5. ROS 생성 측정 및 면역형광분석

Beta TC-6는 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 배양하였고 그 후, 스트렙토조토신(STZ)으로 18시간 동안 처리했다. 세포를 CM-H2DCFDA (5μg/ml) 또는 MitoSOX (5μM)로 30분 동안 염색한 다음 형광 현미경으로 관찰했다. 면역형광분석을 위해, 세포를 실온에서 10분 동안 3.7% 파라포름알데히드(Sigma - Aldrich)에 고정시켰다. 면역형광분석을 위해 Beta TC-6 세포는 지정된 플라스미드(Flag 또는 Flag-Plk3)로 형질감염(transfected)되거나 지정된 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염되었다. 그 다음, 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 세포를 배양한 다음 스트렙토조토신으로 18시간 동안 처리하였다. 세포를 3.7% 파라포름알데히드에 10분 동안 고정하고 0.2% Triton X- 100으로 10분 동안 막 투과를 위해 상온 정치시켰다. 그 후 표준 프로토콜을 사용하여 토끼 다클론 항-Plk3(Invitrogen)과 함께 세포를 37°C에서 24시간 동안 배양했다. 각 실험에서 형광 현미경으로 100-200개의 세포들을 모니터링하였고 ROS 또는 단백질 위치 변경을 정량화 하기 위해 이전에 설명한 대로 검증했다. 실험은 독립적으로 세 번 수행하였다. 세포 내 ROS 생성은 형광현미경(Olympus LX71 현미경)을 사용하여 측정하였고, 이미지는 MetaMorph 소프트웨어(Universal Imaging, Westchester, PA)를 사용하여 분석하였다. 미토콘드리아 전자전달계 중 어떤 것이 스트렙토조토신 처리에 의해 조절되는지 결정하기 위해 항산화제(NAC), 로테논(10μM), 말로네이트(100μM)가 있는 상태에서 세포를 4시간 동안 배양했다. 세포들은 MitoSOX (5 μM)에 30분 동안 염색되었고 면역형광분석을 위해서 채취하였다. 초록(또는 빨강) 형광은 480nm(빨강의 경우 572nm)의 여기 파장과 535nm(빨강의 경우 600nm)의 방사체 주파수 대역을 이용하여 정량화 하였다. 형광 이미지는 다양한 시야(fields of view)에서 촬영하였고 ROS 형광 강도는 세포 수에 따라 정량화 하였다.

실시예 6. 미토콘드리아 막 전위 측정(△Ψm)

ΔΨm의 변화를 확인하기 위해 Beta TC-6 췌장 분비 섬 세포를 18시간 동안 스트렙토조토신이 처리된 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 37°C에서 30분 동안 JC-1 (5 mM)과 함께 배양하고 JC-1 염색 완충액으로 두 번 세척했다. JC-1은 490nm에서 활성화되었다. JC-1 염색된 세포의 510-560 nm에서 활성화를 조사하기 위해 형광 현미경(Olympus LX71 현미경)을 사용하였고 570-620 nm에서의 조사를 위해 방출 필터를 사용하였다. 방출 형광을 필터링하고 FACScan 유세포 분석기(Becton Dickson)를 사용하여 FITC (녹색, 530nm) 채널에 대한 이미지를 수집했다. 형광은 MetaMorph 소프트웨어(Universal Imaging, Westchester, PA, USA)로 분석되었다. 미토콘드리아 탈분극은 적색/녹색 형광 강도 비율의 감소를 이용하여 분석하였다. 실험은 독립적으로 세 번 수행하였다.

실시예 7. 일시적 형질감염, 바이러스 감염 및 안정 형질도입

일시적인 과발현 연구를 위해 Beta TC-6 세포는 먼저 기존의 혈청 함유 배지를 버리고 1xPBS로 3회 헹군 다음 무혈청 배지로 교체하고 5분 동안 방치되었다. 그 다음, 세포는 lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 같은 형질감염 시약을 사용하여 Flag 또는 Flag-tagged된 Plk3로 일시적으로 형질감염시켰다. 6시간 후, 형질감염 시약이 들어 있는 무혈청 배지를 버리고 1XPBS로 다시 헹궜다. 신선한 혈청이 첨가된 배지로 교체한 후 세포를 24시간 동안 배양한 후 형광현미경으로 유전자 발현을 확인하였다. 바이러스 감염은 Beta TC-6 세포의 경우 60~70%의 세포 밀도에서 수행되었고 세포 배양 배지는 하루 전에 폴리브렌(polybrene)으로 전처리되었다. Plk3 lentiviral shRNA (Creative Biogene)는 12시간 동안 세포에 감염되도록 처리하였고 이 후 새로운 배지로 교체하였다. 2 ㎍/ml 퓨로마이신(Sigma-Aldrich)으로 감염된 세포는 선택적으로 채취하였다. 대조군 shRNA는 음성 대조군으로 동시에 사용되었다.

실시예 8. 3D 오르가노이드 분석 및 인슐린 측정

3D 오르가노이드 분석을 위해 마우스 췌장 분비 섬 베타 TC-6 또는 베타 TC-tet 세포를 NanoCulture plates(Scivax, Japan)에서 배양했다. 세포를 조직 인큐베이터 배양한 후, 인터넷이나 지역 식료품점에서 구입한 14개의 각각의 실험군 및 대조군 배지에서 세포 배양 후 스트렙토조토신을 72시간 동안 처리한 배지에서 배양한 세포와 동일한 2D 배양 조건에서 세포를 배양하였다. 세포 구(cell sphere) 수를 관찰하고 0, 3, 5 및 7 일에 나누어 관찰하였다. 세포는 1시간 동안 KRBH 완충액에서 3mM 포도당 또는 25mM 포도당과 함께 배양하였다. 상등액 배지의 포도당 자극 인슐린 분비는 Crystal Chem ELISA 키트(Downers Grove, IL)로 측정하였다

실시예 9. 통계 분석

시험관 내(in vitro) 또는 생체 외(ex vivo) 실험 각각에 대해 최소 3개의 독립적인 결과를 평가하고 통합 데이터를 평균 ± 표준 오차로 표시했다. 결과는 개별 데이터 포인트 또는 평균 ±SD로 표현하였다. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 6.0; GraphPad Software, San Diego, CA)를 사용하여 통계 분석을 수행했다. 산점도 및 막대 그래프의 통계적 비교는 Holm-Sidak 사후 테스트와의 다중 비교를 위한 일원 분산 분석(ANOVA) 또는 2원 ANOVA를 사용하여 수행되었다. <0.05의 P값은 유의미한 것으로 간주되었다. 통계적 유의성은 P < 0.05(*), P < 0.01(**), P < 0.001(***)로 정의하였으며, ns는 유의하지 않음을 나타내었다.

실험예 1. 스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병에서 β-세포 생존을 보호하는 물질 확인

당뇨병 스트레스 모델에 대한 췌장 β-세포의 생존 가능성을 확인하기 위해 스트렙토조토신 처리 후 두 개의 다른 베타 TC-6 또는 베타 TC-tet 췌장분비 섬 세포를 테스트했다. 베타 TC-6의 IC50이 MTT 분석을 사용하여 50μM임을 확인하였다. 다른 췌장 세포의 결과와 유사하게 Beta TC-tet은 스트렙토조토신이 췌장 β-세포 사멸에 강하게 영향을 미친다는 것을 보여주었다 (도 1A). 현재 판매되고 있는 15가지 물을 준비한 배지에 스트렙토조토신을 처리하여 세포 배양액을 준비하고 베타세포를 배양하였다. 그 결과, 일반 물(대조군)이 스트렙토조토신에 의해 유도된 베타 TC-6 세포를 세포자멸사로부터 보호하지 않는 반면 닥터코아 (이하, 실험물질)는 이를 억제한다는 것을 발견했다 (도 1B 내지 1D). 다른 췌장 분비 섬 세포(Beta TC-tet)에서도 동일한 결과가 얻어졌다 (도 1D). 일반 물과 실험물질로부터 얻은 베타 세포 용해물의 면역 블롯 분석은 실험물질을 사용하여 배양한 세포에서는 활성화된 PARP1 단백질 수준이 감소한 것을 밝혔다(도 1E). 또한 fractionated DNA 함량을 통해 세포 주기와 세포 상태를 예측하는 방법인 유세포 분석을 사용하였으며 이때 sub-G1 값이 나오는 경우 이는 세포자멸(apoptosis)을 의미한다. 스트렙토조토신 처리에 의해 증가된 베타세포의 sub-G1 개체군은 실험물질에 의해 감소되었다 (도 1F). 또한 스트렙토조토신 세포 사멸이 괴사의 영향을 받는지 여부를 테스트했다. 30mM의 스트렙토조토신으로 처리된 베타 세포는 괴사를 보인 반면, 우리가 IC50으로 발견한 50μM의 스트렙토조토신에서는 괴사가 관찰되지 않았다 (도 1 G). 이는 괴사가 50μM의 스트렙토조토신으로 인하여 발생한 세포 사멸에 어떠한 영향도 미치지 않았음을 의미한다. 또한, 이러한 결과는 실험물질이 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 대표 예 물질임을 시사한다.

실험예 2. ROS를 통한 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실 조절 확인

2-1. 당뇨병 조절과 연계된 ROS 하향조절 확인

실험예 1에서 확인한 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 실험물질로 처리 후, 산화제에 민감한 염료인 5-(and-6)-chloromethyl-2',7'- dichlorodihydrofluorescein diacetate acetyl ester(CM-H2DCFDA)로 베타 세포를 염색하여 스트렙토조토신 유도 ROS 생성 변화를 조사했다(도 2A 및 B).

그 결과, 스트렙토조토신으로 유도된 ROS 생성은 일반 생수로 처리된 배양 대조군 췌장 세포에서 증가했지만 실험물질에서는 유의미하게 억제되었다(도 2A). Beta TC-tet에서와 같은 결과를 Beta TC-6에서도 얻었다(도 2B). 또한, 유세포 분석을 통해 실험물질이 당뇨병 단계에서 항산화 활성을 가지고 있음을 확인했으며(도 2C), 이는 ROS 생성 하향 조절이 당뇨병 조절에 필수적인 역할을 할 수 있음을 시사한다.

2-2 ROS 증가의 유래(미토콘드리아) 확인

베타 세포에서 스트렙토조토신에 의한 ROS 증가가 미토콘드리아에서 유래했는지 확인하기 위해 미토콘드리아 ROS를 과산화물로 검출하는 데 널리 사용되는 MitoSOX 프로브를 사용하였다 (도 2D 및 E). 미토콘드리아 ROS는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 검출되었으며 수치는 대조군보다 약 3배 높았다. 스트렙토조토신 유도 미토콘드리아 ROS 상승은 실험물질에서 배양된 베타 세포에서는 일어나지 않았다. 이러한 결과는 다른 베타 세포에서도 유사했다 (도 2E).

스트렙토조토신에 의해 조절되는 미토콘드리아 전자전달계 전자전달과정을 알아내기 위해 항산화제(NAC), 미토콘드리아 호흡 전자전달 복합체 I 억제제(로테논), 복합체 II 억제제(malonate), 복합체 III 억제제(stigmatelin) 또는 복합 IV 억제제(sodium azide)의 존재 하에 세포를 배양하였고 미토콘드리아 ROS를 면역 형광 분석법으로 평가했다(도 3A).

그 결과, 스트렙토조토신으로 유도된 ROS가 로테논, 스티그마탈린, 아지드화나트륨 및 NAC에 의해 차단된다는 것을 확인하였다. 반면, 다른 억제제인 말로네이트는 스트렙토조토신에 의해 유도된 미토콘드리아 ROS 생성을 억제하는 데 실패했다. 상기 결과는 베타 세포에서 스트렙토조토신 처리에 의한 미토콘드리아 ROS의 생성이 미토콘드리아 전자전달복합체 I/III/IV형에서 일어나는 것임을 입증한 것이다.

2-3. 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실 조절 확인

미토콘드리아 막전위(MMP; △Ψm)는 ATP 생성에 핵심적인 역할을 하기 때문에 세포의 건강상태를 확인하는 중요한 지표로 널리 사용되고 있다. MMP에 따라 녹색 또는 적색 형광 수율로 나누어 분석하는 JC-1 형광 염료를 사용하였다.

그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 스트렙토조토신이 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)를 자극하여 MMP의 감소를 유발함을 확인했다. 스트렙토조토신 처리에 의한 미토콘드리아 기능 장애는 3-4배 증가했는데, 이는 스트렙토조토신이 베타 세포에서 강력한 MMP 의존성 세포독성을 유도함을 의미한다. 그러나, 실험물질로 준비한 배지는 이러한 효과를 방지하여 스트렙토조토신 처리에 의해 생성된 미토콘드리아 막 전위(△Ψm)의 손실을 회복시킴을 시사한다. 동일한 취지로 H₂O₂ 유도 실험에서 실험물질의 항산화 활성에 대한 연구를 재현하였으며 이전 실험과 동일한 결과를 얻었다(도 3C 및 D).

실험예 3. 스트렙토조토신(STZ) 유발 당뇨병에서 Plk3 발현 조절 확인

3-1. 세포자멸사 및 Caspase-9 및 3 확인

미토콘드리아는 또한 포유동물 세포에서 세포자멸사를 활성화하는 데 필수적인 역할을 한다. 미토콘드리아에 의한 세포자멸사는 cytochrome c와 caspase-9를 결합시켜 caspase-3를 활성함으로써 작동하므로, caspase-9 및 3을 확인하였다.

그 결과, 스트렙토조토신이 처리된 대조군 세포에서는 절단된 caspase-9 와 -3 단백질 수준이 증가했지만 실험물질로 준비한 배지에서는 증가하지 않았다(도 4A). 이는 세포자멸사가 caspase-8과 관련된 세포 사멸과 관계가 없음을 시사한다.

3-2. 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 물질의 Plk3의 단백질 안정화 음성 제어 확인

스트렙토조토신이 처리된 췌장 세포에서 Plk1 및 Plk2와 달리 유의하게 증가된 Plk3 단백질 발현을 관찰했다 (도 4A, B 및 C). 반면, 실험물질로 제조한 배지에서는 Plk3의 높은 단백질 발현이 관찰되지 않았으며, 이는 스트렙토조토신 유발 당뇨병 및 세포사멸에 대한 활성을 가지는 물질이 Plk3의 단백질 안정화를 음성 제어함을 시사한다.

또한, 췌장세포 내 세포 사멸이 세포 내 ROS 증가로 인한 것인지 여부를 조사하기 위해 세포를 H₂O₂로 처리했다. 실험물질 역시 변화를 확인하기 위해 동일한 조건에서 배양하였다(도 4B).

그 결과, 과산화수소(H₂O₂)를 처리한 췌장 세포에서 caspase-9와 -3에 의해 활성화된 단백질인 절단된 단백질의 수준이 도 4A에서 확인할 수 있듯 스트렙토조토신 처리된 세포에서와 같이 유의하게 증가하였다. 이러한 단백질의 변화는 plk3 억제제인 실험물질에 의해 억제되었다. 또한, 스트렙토조토신에 의해 유도된 세포자멸사가 세포 내 ROS를 증가시킴을 확인하기 위해 스트렙토조토신 처리 후 항산화 억제제인 NAC를 사용하였을 때 상기 기능이 억제됨을 입증하였다(도 4C). 실험물질은 Beta TC-6 세포에서 내인성 Plk3 단백질을 감소시킬 뿐만 아니라 스트렙토조토신 또는 H₂O₂와 같은 외부 스트레스에 의해 증가된 Plk3 단백질을 차단함을 확인하였다(도 4A, B, C).

실험물질이 Plk3 단백질을 분해할 수 있는지 여부를 알아내기 위해 베타 TC-6 세포를 도 4ABC와 동일한 조건에서 프로테아좀 억제제인 MG 132로 처리했다(도 4D). 스트렙토조토신은 베타세포에서 Plk3 단백질의 수준을 현저히 증가시켰고 이 단백질의 증가는 실험물질에 의해 감소되었다. 그러나, 실험물질에 의한 Plk3 단백질 감소 효과는 MG132 처리에도 불구하고 전혀 변하지 않았다. 또한, 실험물질이 사용된 스트렙토조토신 처리한 배지에서 항산화 활성에 대한 연구를 재현한 결과 NAC 처리와 동일한 결과를 얻었다(도 4E 및 F).

3-3. Plk3의 미토콘드리아 ROS와 세포자멸사 조절 여부 확인

Plk3의 발현이 미토콘드리아 ROS와 세포자멸사를 조절하는지 여부를 확인하기 위해, 먼저 Plk3가 과 발현된 세포가 형질감염되지 않은 정상 베타 세포에 비해 미토콘드리아 ROS를 유의하게 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 5A). 형광현미경 하에서 정상 베타 세포에서의 Plk3 단백질의 발현 수준은 매우 낮았고 미토콘드리아 ROS도 밝게 측정되지 않았지만 스트렙토조토신 처리된 췌장 세포에서 두 신호가 모두 증가하여(도 5B) 도 4의 웨스턴 블롯의 결과로 나온 단백질 수준 패턴과 일치했다. Plk3가 없는 경우 미토콘드리아 ROS 생성이 극적으로 감소했으며 이러한 결과는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 더 두드러졌다. 스트렙토조토신에 의해 증가된 Plk3 단백질 및 미토콘드리아 ROS의 발현은 실험물질을 사용하여 만든 배지에서 유의미하게 감소하였다(도 5C).

3-4. Plk3 억제에 의한 베타세포의 세포 자멸사 조절 확인

또한, Plk3 생성 미토콘드리아 ROS가 스트렙토조토신이 처리된 베타 세포에서 세포 사멸을 유도여부를 확인하였고 Plk3 유전자 결실 또는 실험물질이 그 효과를 억제할 수 있는지 여부 또한 조사하였다. 상당한 수의 세포 사멸 세포가 스트렙토조토신 처리된 세포와 Plk3로 과 발현된 세포 각각에서 관찰되었다 (도 5D). 또한, 스트렙토조토신으로 처리된 베타 세포의 세포자멸사가 Plk3 녹다운에 의해 유의하게 감소된다는 것을 발견했다.

3-5. Plk3 shRNA의 당뇨병 세포 자멸 방지 확인

Plk3 shRNA가 스트렙토조토신-유발 세포자멸을 방지한다는 것을 더 증명하기 위해 우리는 스트렙토조토신 처리된 세포에서 Plk3 construct(또는 빈 벡터)를 안정적으로 발현시키고 이때 세포자멸사하는 세포를 계산했다. 미토콘드리아 ROS에 의한 세포자멸사는 Plk3 shRNA를 안정적으로 발현하는 스트렙토조토신 처리 세포에서 감소한 반면, shRNA 내성 Plk3으로 재구성하면 세포자멸사 정도가 회복되었다(도 5D). 그러나 Plk3 shRNA- 저항성 Plk3 유도하는 재구성에 의한 세포자멸사의 재증가는 실험물질에 의해 재 억제되었다.

상기 결과는 Plk3 매개 세포자멸사가 미토콘드리아 ROS의 활성화와 밀접한 관련이 있음을 시사한다(도 5A, B, D).

실험예 4. 3D 오르가노이드 모델 상 스트렙토조토신 유발 당뇨병에서 인슐린 분비 조절에 미치는 영향 확인 .

포도당으로 자극한 생체 외 모델에서 췌장 베타 세포의 인슐린 분비를 조사했다(도 6). 인체의 각 조직과 다양한 세포는 많은 복잡한 모양으로 구성되어 있기 때문에 정확한 데이터를 얻고 이의 분석을 위해서는 인체와 같은 최상의 생물학적 환경을 구축해야 했다. 3D 세포 배양은 세포에게 최적의 자연적인 환경을 직접 제공함으로써 세포가 자연적인 인체와 유사한 환경에서 살 수 있도록 하여 세포의 기능을 돕도록 하는 최고의 배양 시스템 중 하나이다. 이 배양법은 콜라겐이나 다른 기질(matrix)과 같은 지지체를 사용하거나 세포 배양 접시의 표면에 나노물질을 부착시켜 최적의 세포 성장을 돕는다는 점에서 2D 방법과 구별된다(도 6A). 이 실험을 위해 나노플레이트를 이용한 3D 스페로이드(spheroid) 배양을 사용하였고, 세포주를 파종한 지 3일 후에 모든 췌장 세포가 스페로이드를 형성하기 시작했다(도 6A).

그 결과, plk3 억제제의 대표인 실험물질로 준비된 배지가 ROS를 통한 스트렙토조토신 유도 세포자멸사를 차단한다는 것을 알 수 있다(도 6B). 또한, 일반 물에서 스트렙토조토신 처리된 베타 세포가 대조군 세포보다 포도당 자극에 의한 상등액 배지의 인슐린 분비가 더 낮았지만 plk3 억제제인 실험물질이 사용된 배지에서 배양된 세포들의 경우 3D 배양 시스템에서 여전히 인슐린을 생산한다는 것을 발견했다(도 6C).

상기 결과는 plk3 억제제가 베타 세포의 성장을 안정화하고 인슐린 분비를 촉진하는 역할을 하는 것뿐만 아니라 당뇨병을 예방 및 치료하는 역할 또한 하는 것을 시사한다 (도 7).

실험예 5. shRNA 추가 확인

베타 TC-6 세포를 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염(infection)시키고 면역블로팅(immunoblotting)으로 인해 Plk3 단백질 변화를 관찰하였다(도 8A). 감염시킨 세포는 스트렙토조토신으로 18시간 동안 처리한 후 MitoSOX (5μM)로 30분 동안 염색한 다음 면역형광분석하고 이를 정량분석하였다(도 8B 및 8C).

또한, 베타 TC-6 세포를 플라스미드(대조군 shRNA 또는 Plk3 shRNA)로 감염(infection)시키고 24시간 후, 스트렙토조토신으로 72시간 처리하고 형광 현미경분석(fluroscence microscopy)하고 이를 정량분석하였다(도 8D 및 8E). 모든 실험은 독립적으로 3회 수행하였다.

이 때, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군 shRNA(scrambled control shRNA lentiviral vector)는 서열번호 5이며, Plk3 shRNA는 하기 서열번호 2 내지 4와 같다.

서열번호	명칭	서열(5'-3')
2	Plk3 shRNA (#1)	CAGCGCGAGAAGATCCTAAAT
3	Plk3 shRNA (#2)	TCGAGGATGCTGACAACATAT
4	Plk3 shRNA (#3)	GTATAGCCTACGCGGTCAAAG
5	scrambled control shRNA lentiviral vector	TTCTCCGAACGTGTCACGT

그 결과, 3 종의 shRNA(서열번호 2 내지 4)이 당뇨병 세포의 세포자멸사를 감소시킴을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명은 스트렙토조토신 당뇨병 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하기 위해 이러한 plk3를 차단할 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

1. Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 사멸 억제용 조성물로서,
   상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 조성물.
   
2. Plk3 억제제를 포함하는 베타세포의 인비트로(in-vitro) 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS) 억제용 조성물로서, 상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 shRNA는 서열번호 2 내지 4 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 조성물.
   
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 베타세포는 당뇨병 모델 세포인 것인, 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 베타세포는 스트렙토조토신이 처리된 것인, 조성물.
   
8. Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 약학적 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 Plk3 억제제는 베타세포 사멸(apoptosis)를 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
   
10. 제8항에 있어서, 상기 Plk3 억제제는 미토콘드리아 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
    
11. 제8항에 있어서, 상기 Plk3 억제제는 미토콘드리아 막전위 손실을 회복시키는 것인, 약학적 조성물.
    
12. 제8항에 있어서, 상기 당뇨병은 스트렙토조토신(Streptozotocin)에 의해 유발되는 것인, 약학적 조성물.
    
13. Plk3 억제제를 포함하는 당뇨병 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 식품 조성물.
    
14. Plk3 억제제를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법으로서,
    상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 방법.
    
15. 인비트로(in-vitro)에서 베타세포에 Plk3 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 베타세포의 사멸 억제 방법으로서,
    상기 Plk3 억제제는 Plk3의 발현 또는 활성을 억제하는 shRNA인 것인, 방법.