KR102156850B1 - A composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis comprising Spermidine - Google Patents

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Abstract

본 발명의 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시키고, 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시키며, 폐조직 손상을 줄이고, 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제하고, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양을 억제하며, 소포체 스트레스, 노화를 억제하였는 바, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Spermidine of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof reduces the incidence of pulmonary inflammation due to bleomycin administration, reduces the number of neutrophils that play the most important role in lung injury, and reduces lung tissue damage, It inhibits pulmonary fibrosis due to collagen fiber accumulation, suppresses the amount of pulmonary collagen increased due to pulmonary fibrosis due to bleomycin, and suppresses endoplasmic reticulum stress and aging, and is used in the prevention or treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis. It can be useful.

Description

스퍼미딘을 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료용 조성물{A composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis comprising Spermidine}A composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis comprising Spermidine}

본 발명은 스퍼미딘을 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a pharmaceutical composition and a food composition for the treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis comprising spermidine.

급성 폐손상(acute lung injury, ALI)은 성인에서는 물론 소아에서도 높은 이환율과 사망률로 인하여 임상적으로 매우 중요한 질환 중 하나이다. 급성 폐손상은 AECC(American-European consensus conference)의 진단 기준에 따라, 좌심방 압력이 높지 않은 상태(좌심방 압력 18 mmHg 이하)에서 흉부 X-선 검사상 양측 폐에 음영이 증가한 폐부종 소견을 보이면서 동맥혈 산소분압과 흡기산소 농도비(PaO2/FiO2)가 300mmHg 이하이면 급성 폐손상으로 정의한다.Acute lung injury (ALI) is one of the clinically very important diseases in both adults and children due to its high morbidity and mortality. Acute lung injury was diagnosed according to the criteria of the American-European consensus conference (AECC), when the left atrial pressure was not high (less than 18 mmHg of left atrial pressure), chest X-ray examination showed increased pulmonary edema in both lungs and arterial blood oxygenation. If the partial pressure and the intake oxygen concentration ratio (PaO2/FiO2) is less than 300mmHg, it is defined as acute lung injury.

급성 폐손상은 폐포에서 진행되는 경우 또는 폐 혈관에서 진행되는 경우 모두 궁극적으로는 폐의 심한 염증 반응으로 진행되어 여러 가지 병태생리적 현상을 나타낸다. 급성 폐손상의 병리 소견을 보면 주로 염증 반응에 의하여 폐포 내에 공기 대신 염증 세포와 단백질이 채워지고, 유리질 막이 생기게 되며, 폐 간질(pulmonary interstitium)에도 염증세포의 침윤을 보인다. 이 과정에서 여러 가지 사이토카인들이 역할을 하게 되고, 특히 혈액 응고 기능에 이상을 보이는 경우가 많다. 이와 같이 급성 폐손상은 다양한 원인으로 발병 가능한 병리 상태이며, 기관지 주위의 염증 세포 침윤, 기도과민성, 혈관 투과성의 증가와 혈장 삼출이 동반되어 나타나는 것으로 알려져 있다.Acute lung injury, either in the alveoli or in the pulmonary blood vessels, ultimately proceeds to a severe inflammatory reaction in the lungs, resulting in various pathophysiological phenomena. In the pathologic findings of acute lung injury, inflammatory cells and proteins are filled instead of air in the alveoli due to the inflammatory reaction, a vitreous membrane is formed, and inflammatory cells infiltrate into the pulmonary interstitium. In this process, various cytokines play a role, and in particular, there are many cases of abnormal blood clotting function. As described above, acute lung injury is a pathological condition that can be caused by various causes, and is known to be accompanied by inflammatory cell infiltration around the bronchi, airway hypersensitivity, increased vascular permeability, and plasma effusion.

급성 폐손상의 치료에 대해서는 오랜 기간 동안 많은 연구자들에 의해 연구되어 왔으나 현재까지 궁극적인 치료에는 도달하지 못하고 보존적인 치료에만 그치고 있는 상태로, 그 치사율이 매우 높다.The treatment of acute lung injury has been studied by many researchers for a long period of time, but until now, the ultimate treatment has not been reached and only conservative treatment has been ended, and the mortality rate is very high.

한편, 폐섬유화증(pulmonary fibrosis) 또는 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 만성적으로 진행하는 폐 간질의 섬유화를 특징으로 하는 원인 불명의 질환이다. 상기 질환은 주로 폐에 국한되어 나타나며 조직학적으로 특징적인 통상형 간질성 폐렴(usual interstitial pneumonia, UIP) 소견을 보인다. 이 질환의 유병률은 보고마다 차이가 있지만 인구 10만 명 중 2-29명으로 알려져 있으며, 국내에서는 희귀난치성 질환으로 지정되어 있다. IPF의 임상 경과는 다양하며, 일반적으로 서서히 진행하는 폐 기능 저하로 인해 호흡부전으로 진행하여 진단 이후 평균 생존기간이 2-3년 이내인 치명적인 질환이다. 이 때문에 IPF의 정확한 원인과 병인을 밝히고 이에 따른 치료제를 개발하기 위한 노력이 많이 시도되고 있지만 아직까지 명확한 치료제가 없는 상태이다.On the other hand, pulmonary fibrosis or idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a disease of unknown cause characterized by chronic fibrosis of the lung interstitial. The disease is mainly confined to the lungs and exhibits histologically characteristic normal interstitial pneumonia (UIP) findings. Although the prevalence of this disease varies from report to report, it is known to be 2-29 out of 100,000 population, and it is designated as a rare and intractable disease in Korea. The clinical course of IPF is diverse, and it is a fatal disease in which the average survival period after diagnosis is within 2-3 years, as it progresses to respiratory failure due to the slow progression of lung function. For this reason, many efforts are being made to identify the exact cause and etiology of IPF and to develop a therapeutic agent according to it, but there is no clear treatment yet.

대한민국 공개특허공보 제10-2013-0089417호Korean Patent Application Publication No. 10-2013-0089417

본 발명의 목적은 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis, comprising spermidine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은, 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving acute lung injury or pulmonary fibrosis, comprising as an active ingredient spermidine or a food acceptable salt thereof.

본 발명의 다른 목적은, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제 후보물질을 기관지 상피세포에 처리하는 단계; 상기 후보물질 처리군에서의 GRP78 또는 CHOP 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 GRP78 또는 CHOP 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제로 선택하는 단계;를 포함하는, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is the step of treating bronchial epithelial cells with a candidate substance for treating acute lung injury or pulmonary fibrosis; Measuring the expression level of GRP78 or CHOP protein in the candidate substance-treated group; And when the measured expression level of the GRP78 or CHOP protein decreases compared to the control group not treated with the candidate substance, selecting the candidate substance as a therapeutic agent for acute lung injury or pulmonary fibrosis; Containing, acute lung injury or lung fiber It is to provide a screening method for the treatment of chemotherapy.

본 발명자는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증을 치료할 수 있는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 스퍼미딘(Spermidine)이 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시키고, 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시키며, 폐조직 손상을 줄이고, 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제하고, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양을 억제하며, 소포체 스트레스, 노화를 억제하는 것을 확인하여, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.As a result of diligently trying to find a substance capable of treating acute lung injury or pulmonary fibrosis, the inventors of the present invention reduced the incidence of pulmonary inflammation caused by bleomycin administration, and the number of neutrophils playing the most important role in lung injury. It was confirmed that it reduces lung tissue damage, inhibits lung fibrosis due to collagen fiber accumulation, suppresses the amount of lung collagen increased due to lung fibrosis due to bleomycin, and inhibits endoplasmic reticulum stress and aging, It was confirmed that it can be usefully used in the prevention or treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis, and the present invention was completed.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.As an aspect for achieving the above object, the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis, comprising spermidine or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.

구체적으로, 본 발명의 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 치료용 약학 조성물은 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.Specifically, the pharmaceutical composition for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis of the present invention may include spermidine or a pharmaceutically acceptable salt thereof.

본 발명에서, 용어 "스퍼미딘(Spermidine)"은 모든 생체 중에 존재하는 폴리아민의 하나로, N-(3-아미노프로필)-1, 4-부탄디아민이다. DNA 이중나선 구조의 안정화와 변화, RNA의 안정화, RNA와 DNA 폴리메라아제의 활성화 등 생리작용이 있다.In the present invention, the term "spermidine" is one of polyamines present in all living organisms, and is N-(3-aminopropyl)-1, 4-butanediamine. It has physiological actions such as stabilization and change of DNA double helix structure, stabilization of RNA, activation of RNA and DNA polymerase.

본 발명에서, 상기 스퍼미딘은 폐의 염증을 억제할 수 있다. In the present invention, the spermidine can suppress inflammation of the lungs.

본 발명의 일실시예에서는 마우스를 이용한 유도 급성 폐손상 마우스 모델에서, 스퍼미딘의 투여가 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시키고, 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시킴을 확인하였으며, 마우스 폐조직의 손상을 줄이는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, in a mouse model of induced acute lung injury using a mouse, administration of spermidine reduces the incidence of pulmonary inflammation due to bleomycin administration, and reduces the number of neutrophils that play the most important role in lung injury. It was confirmed, and it was confirmed that the damage to the mouse lung tissue was reduced.

본 발명에서, 상기 스퍼미딘은 콜라겐 축적을 억제할 수 있다. In the present invention, the spermidine can inhibit collagen accumulation.

본 발명의 일실시예에서는 마우스를 이용한 유도 급성 폐손상 마우스 모델에서, Spermidine을 투여한 실험군의 샘플들에서 파란색으로 나타나는 콜라겐 축적이 현저하게 적게 나타나는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Spermidine의 발현이 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제할 수 있음을 알 수 있었다. In one embodiment of the present invention, in a mouse model of induced acute lung injury using a mouse, it was confirmed that collagen accumulation, which appears in blue color, appears significantly less in samples of the experimental group to which Spermidine was administered. It was found that it can inhibit lung fibrosis caused by.

또한, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양이 Spermidine의 투여로 정상군과 비슷하게 억제되는 것을 확인하여, Spermidine이 급성 폐손상에 의한 폐 섬유화를 억제하는 것을 확인하였다. In addition, it was confirmed that the amount of pulmonary collagen increased due to pulmonary fibrosis due to bleomycin was suppressed similarly to that of the normal group by administration of Spermidine, and it was confirmed that Spermidine inhibited pulmonary fibrosis due to acute lung injury.

본 발명에서, 상기 스퍼미딘은 소포체 스트레스 또는 노화를 억제할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 상기 소포체 스트레스에 관여하는 단백질은 GRP78, 또는 CHOP 이며, 상기 노화에 관여하는 단백질은 p16 또는 pRb일 수 있다. 본 발명에서 상기 스퍼미딘은 소포체 스트레스에 관여하는 GRP78, CHOP, 또는 XBP-1의 발현을 억제할 수 있으며, 구체적으로 이들의 단백질 또는 상기 단백질을 코팅하는 유전자의 발현을 억제할 수 있으며, 노화에 관여하는 p16 또는 pRb 단백질 또는 상기 단백질을 코팅하는 유전자의 발현을 억제할 수 있다. In the present invention, the spermidine may inhibit endoplasmic reticulum stress or aging. In addition, in the present invention, the protein involved in endoplasmic reticulum stress is GRP78, or CHOP, and the protein involved in aging may be p16 or pRb. In the present invention, the spermidine may inhibit the expression of GRP78, CHOP, or XBP-1, which are involved in endoplasmic reticulum stress, and specifically suppress the expression of their proteins or genes that coat the proteins, and It is possible to inhibit the expression of the p16 or pRb protein involved or the gene coating the protein.

본 발명의 일실시예에서는 Spermidine을 투여한 실험군에서 GRP78 단백 크기에 해당하는 78kDa 밴드와, CHOP 단백 크기에 해당하는 30kDa의 밴드가 블레오마이신만 투여한 그룹과 비교하여 약하게 나타나서 Spermidine 투여군에서 ER stress가 감소한 것을 확인할 수 있었다.In one embodiment of the present invention, the 78 kDa band corresponding to the GRP78 protein size and the 30 kDa band corresponding to the CHOP protein size in the experimental group administered with Spermidine appeared weaker compared to the group administered only bleomycin, so that the ER stress in the Spermidine-administered group was reduced. It was confirmed that it decreased.

또한, Spermidine을 투여한 실험군에서 p16 단백 크기에 해당하는 16kDa 밴드와, pRb 단백 크기에 해당하는 110kDa의 밴드가 블레오마이신만 투여한 그룹과 비교하여 약하게 나타나서 Spermidine 투여군에서 노화(senescence)가 억제된 것을 확인할 수 있었다.In addition, in the experimental group administered with Spermidine, the 16kDa band corresponding to the p16 protein size and the 110kDa band corresponding to the pRb protein size appeared weaker compared to the group administered only bleomycin, indicating that senescence was suppressed in the Spermidine-administered group. I could confirm.

본 발명에서, 상기 스퍼미딘은 산화적 스트레스를 억제할 수 있다. In the present invention, the spermidine may suppress oxidative stress.

본 발명의 일실시예에서는 mouse primary alveolar 세포에 H2O2를 처리하여 산화적 스트레스를 유발하였으며, 스퍼미딘 처리에 의해, 세포 사멸을 억제하고 생존력을 증가시키는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the mouse primary alveolar cells were treated with H 2 O 2 to induce oxidative stress, and by spermidine treatment, cell death was inhibited and viability was increased.

이에 따라, 본 발명의 스퍼미딘은 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 치료에 유용하게 적용될 수 있다.Accordingly, spermidine of the present invention can be usefully applied to the prevention or treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis.

본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예를 들어, 나트륨, 또는 칼륨, 알칼리 토금속, 예를 들어, 마그네슘을 포함할 수 있다.In the present invention, the term "pharmaceutically acceptable salt" refers to all salts that retain the desired biological or physiological activity of the compound and exhibit minimal undesired toxicological effects. It means a salt prepared according to a conventional method in the art, and such a preparation method is known to those skilled in the art. Specifically, the pharmaceutically acceptable salts include, but are not limited to, salts derived from pharmacologically or physiologically acceptable inorganic acids and organic acids and bases. Examples of suitable acids are hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid. , Benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like. Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, or potassium, alkaline earth metals such as magnesium.

본 발명의 용어 "급성 폐손상"이란, AECC(American-European consensus conference)의 진단 기준에 따라, 좌심방 압력이 높지 않은 상태(좌심방 압력 18 mmHg 이하)에서 흉부 X-선 검사상 양측 폐에 음영이 증가한 폐부종 소견을 보이면서 동맥혈 산소분압과 흡기산소 농도비(PaO2/FiO2)가 300mmHg 이하이면 급성 폐손상으로 정의한다The term "acute lung injury" of the present invention means that the left atrial pressure is not high (left atrial pressure 18 mmHg or less), according to the diagnostic criteria of the American-European consensus conference (AECC). Acute lung injury is defined if the arterial blood oxygen partial pressure and inspiratory oxygen concentration ratio (PaO2/FiO2) is less than 300mmHg with increased pulmonary edema.

본 발명의 용어 "폐섬유화증(pulmonary fibrosis)"이란, 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)이라고도 하는 만성적 간질성 폐질환의 일종으로서, 폐조직세포가 섬유세포로 변화되어, 호흡곤란, 기침, 청색증, 곤봉지 등을 유발하는 질환을 의미한다. 조직 검사시에는 벌집모양 또는 비정형의 섬유세포 군집이 관찰된다. 지금까지는 스테로이드계 치료제, 인터페론 감마, 아세틸시스테인, 피르페니돈, 보세탄 등을 치료제로서 사용하고 있으나, 특이적인 치료효과를 나타내는 제제는 보고되어 있지 않다.The term "pulmonary fibrosis" of the present invention is a type of chronic interstitial lung disease, also called idiopathic pulmonary fibrosis, in which lung tissue cells change into fibroblasts, dyspnea, cough, cyanosis , Refers to a disease that causes clubs, etc. During histological examination, a honeycomb or atypical fibrous cell cluster is observed. Until now, steroid-based therapeutic agents, interferon gamma, acetylcysteine, pirfenidone, and bosetan have been used as therapeutic agents, but no agents showing specific therapeutic effects have been reported.

본 발명의 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.The term "prevention" of the present invention means any action of inhibiting or delaying the onset of the acute lung injury or pulmonary fibrosis by administration of the composition according to the present invention.

본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 조성물의 투여로 상기 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.The term "treatment" of the present invention means any action in which the symptoms of acute lung injury or pulmonary fibrosis are improved or advantageously changed by administration of the composition according to the present invention.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다.The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable diluent, excipient, or carrier. The term "pharmaceutically acceptable" of the present invention means exhibiting properties that are not toxic to cells or humans exposed to the composition.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. The pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried agents, and suppositories. It may have a dosage form of, and may be various oral or parenteral dosage forms. In the case of formulation, it is prepared using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants that are usually used.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름,에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. Further, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, etc.In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweetening agents, fragrances, and preservatives may be included. have. Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate may be used. As a base for suppositories, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알 려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a pharmaceutically effective amount. In the present invention, the term "pharmaceutically effective amount" means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type and severity of the individual, age, sex, and disease. It can be determined by the type, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent. And can be administered single or multiple. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and can be easily determined by a person skilled in the art.

본 발명에서 용어, "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 경구 또는 비 경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 피 내 경로를 통하여 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.In the present invention, the term "administration" means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to an individual by any suitable method, and the route of administration of the composition is various oral or parenteral routes as long as it can reach the target tissue. It may be administered via oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermal, intranasal, inhalation, or intradermal routes.

본 발명의 약학적 조성물은 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 인간, 조류 및 어류 등 어느 것이나 사용할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. The pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an individual for the purpose of treating acute lung injury or pulmonary fibrosis, and anything can be applied. For example, non-human animals such as monkeys, dogs, cats, rabbits, mormons, rats, mice, cows, sheep, pigs, goats, etc., humans, birds and fish, etc. can be used, and the pharmaceutical composition may be parenterally, It can be administered subcutaneously, intraperitoneally, intrapulmonally and intranasally, and for topical treatment, if necessary, can be administered by a suitable method including intralesional administration. The preferred dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and weight of the individual, the severity of the disease, the form of the drug, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.

적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.A suitable total daily use amount can be determined by the treating physician within the range of correct medical judgment, and generally in an amount of 0.001 to 1000 mg/kg, preferably 0.05 to 200 mg/kg, more preferably 0.1 to 100 mg/ The amount of kg can be divided and administered once to several times a day.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a food composition for preventing or improving acute lung injury or pulmonary fibrosis, comprising as an active ingredient spermidine or a food pharmaceutically acceptable salt thereof.

상기 스퍼미딘(Spermidine), 급성 폐손상, 폐섬유화증, 예방에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.The spermidine, acute lung injury, pulmonary fibrosis, and prevention are as described above.

본 발명에서의 용어, "개선"은 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.The term "improvement" in the present invention refers to the suspicion and onset of acute lung injury or pulmonary fibrosis disease that is prevented or treated using a food composition containing spermidine or a food pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Any behavior that improves or benefits an individual's symptoms.

구체적으로, 본 발명의 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.Specifically, spermidine of the present invention or a food pharmaceutically acceptable salt thereof may be added to a food composition for the purpose of preventing or improving acute lung injury or pulmonary fibrosis.

본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 스퍼미딘(Spermidine)을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.The food composition of the present invention may include the form of a pill, powder, granule, pill, tablet, capsule or liquid, and there is no particular limitation on the type of food to which the spermidine of the present invention can be added, For example, there are various beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health supplements.

상기 식품 조성물에는 스퍼미딘(Spermidine) 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.In addition to spermidine, other ingredients may be added to the food composition, and the kind is not particularly limited. For example, it may contain various herbal extracts, food additives or natural carbohydrates, and the like, as additional ingredients, as in ordinary foods, but is not limited thereto.

본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.In the present invention, the term "food supplementary additive" refers to a component that can be added auxiliary to food, and is added to the manufacture of health functional foods of each formulation, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art. Examples of food additives include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavors and natural flavors, coloring agents and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners. , pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonation agents used in carbonated beverages, etc. are included, but the types of the food additives of the present invention are not limited by the above examples.

상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.Examples of the natural carbohydrate include monosaccharides such as glucose and fructose; Disaccharides such as maltose and sucrose; And polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol. As flavoring agents other than those described above, natural flavoring agents (such as taumatin), stevia extract (rebaudioside A, glysir) Hydrine, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be used advantageously.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능성 식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능성 식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성 식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.The food composition of the present invention may contain health functional food. The term "health functional food" as used in the present invention refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body. Here, the term "functionality" refers to obtaining useful effects for health purposes such as controlling nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body. The health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and at the time of manufacture, it can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art. In addition, unlike general drugs, it has the advantage of not having side effects that may occur when taking drugs for a long time by using food as a raw material, and it can be excellent in portability.

유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 스퍼미딘은 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.The mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment). In general, during the manufacture of food, spermidine of the present invention may be added in an amount of 0.1 to 50% by weight, preferably 1 to 10% by weight, but is not limited thereto. However, in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or for the purpose of health control, the amount may be used even below the above range.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함한다.There is no particular limitation on the type of food. Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and all health functional foods in the usual sense are included.

본 발명은 다른 하나의 양태로서, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제 후보물질을 기관지 상피세포에 처리하는 단계; 상기 후보물질 처리군에서 GRP78 또는 CHOP 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 GRP78 또는 CHOP 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면, 상기 후보물질을 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제로 선택하는 단계;를 포함하는, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention comprises the steps of treating bronchial epithelial cells with a therapeutic agent for acute lung injury or pulmonary fibrosis; Measuring the expression level of GRP78 or CHOP protein in the candidate substance-treated group; And when the measured expression level of the GRP78 or CHOP protein decreases compared to the control group not treated with the candidate substance, selecting the candidate substance as a therapeutic agent for acute lung injury or pulmonary fibrosis; Containing, acute lung injury or lung fiber It provides a screening method for the treatment of chemotherapy.

본 발명의 용어, "급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.The term "acute lung injury or pulmonary fibrosis drug candidate" as used herein is an individual nucleic acid, protein, estimated to have the potential for treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis, or randomly selected according to a conventional selection method. Other extracts, natural products, or compounds may be used.

본 발명에서 발현 수준 측정은 GRP78 또는 CHOP 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다. In the present invention, the expression level measurement may be measurement of the expression level of GRP78 or CHOP protein.

본 발명의 용어 "대조군"이란 급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제 후보물질을 처리하지 않은 세포 또는 조직으로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 세포 또는 조직을 의미한다.The term "control group" of the present invention refers to cells or tissues that have not been treated with a candidate substance for acute lung injury or pulmonary fibrosis, and that belong to a group treated with the candidate substance and belong to a parallel relationship.

본 발명의 “급성 폐손상 또는 폐섬유화증 치료제의 스크리닝 방법”은, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증에 관여하는 ER 스트레스에 GRP78 또는 CHOP의 발현이 관련됨을 확인함으로써, GRP78 또는 CHOP의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다. 급성 폐손상 또는 폐섬유화증을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 세포에서의 GRP78 또는 CHOP 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 GRP78 또는 CHOP 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 GRP78 또는 CHOP 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.In the "screening method for a therapeutic agent for acute lung injury or pulmonary fibrosis" of the present invention, by confirming that the expression of GRP78 or CHOP is related to the ER stress involved in acute lung injury or pulmonary fibrosis, the expression of GRP78 or CHOP is a therapeutic candidate It was designed in such a way that the material was compared to the untreated control cells. Measure the level of GRP78 or CHOP protein in cells in the absence of a candidate material capable of preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis, and also by measuring the level of GRP78 or CHOP protein in the presence of the candidate material. After comparison, a substance whose level of GRP78 or CHOP protein in the presence of the candidate substance is lower than the level in the absence of the candidate substance can be predicted as an agent for preventing or treating acute lung injury or pulmonary fibrosis.

또한, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증에 관여하는 노화에 p16 또는 pRb의 발현이 관련됨을 확인함으로써, p16 또는 pRb의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다.In addition, by confirming that the expression of p16 or pRb is related to aging involved in acute lung injury or pulmonary fibrosis, it was devised in a way to compare the expression of p16 or pRb with control cells not treated with a therapeutic candidate.

본 발명에서, 상기 후보물질 처리군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 p16 또는 pRb 단백질의 발현수준을 추가로 비교하여, 상기 후보물질 처리군에서 p16 또는 pRb 단백질의 발현이 감소하면, 상기 후보물질을 치료제로 선택할 수 있다. In the present invention, when the expression level of p16 or pRb protein in the candidate substance-treated group and the control group not treated with the candidate substance is further compared, and the expression of p16 or pRb protein in the candidate substance-treated group decreases, the candidate Substances can be selected as therapeutics.

또한, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증에 관여하는 ER 스트레스에 GRP78, CHOP, 또는 XBP-1 mRNA의 발현이 관련됨을 확인함으로써, GRP78, CHOP, 또는 XBP-1 mRNA의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다.In addition, by confirming that the expression of GRP78, CHOP, or XBP-1 mRNA is related to ER stress involved in acute lung injury or pulmonary fibrosis, the expression of GRP78, CHOP, or XBP-1 mRNA is not treated with therapeutic candidates. It was designed in a way that was compared to non-control cells.

본 발명에서, 상기 후보물질 처리군과 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 GRP78, CHOP, 또는 XBP-1 mRNA의 발현수준을 추가로 비교하여, 상기 후보물질 처리군에서 GRP78, CHOP, 또는 XBP-1 mRNA의 발현이 감소하면, 상기 후보물질을 치료제로 선택할 수 있다. In the present invention, by further comparing the expression level of GRP78, CHOP, or XBP-1 mRNA of the candidate substance-treated group and the control group not treated with the candidate substance, GRP78, CHOP, or XBP- 1 When the expression of mRNA decreases, the candidate substance can be selected as a therapeutic agent.

본 발명의 스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시키고, 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시키며, 폐조직 손상을 줄이고, 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제하고, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양을 억제하며, 소포체 스트레스, 노화를 억제하였는 바, 급성 폐손상 또는 폐섬유화증의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.Spermidine of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof reduces the incidence of pulmonary inflammation due to bleomycin administration, reduces the number of neutrophils that play the most important role in lung injury, and reduces lung tissue damage, It inhibits pulmonary fibrosis due to collagen fiber accumulation, suppresses the amount of pulmonary collagen increased due to pulmonary fibrosis due to bleomycin, and suppresses endoplasmic reticulum stress and aging, and is used in the prevention or treatment of acute lung injury or pulmonary fibrosis. It can be useful.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유도된 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 제조 과정을 설명하는 모식도. 스퍼미딘의 치료능을 확인하기 위해 블레오마이신으로 미리 폐손상(섬유화)를 진행시킨후, D10 부터 마지막날까지 매일 스퍼미딘을 IP(복강내)투여를 시행함.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 기관지폐포세척액 (BALF)으로부터 전체 폐염증세포, 대식세포, 호산구, 림프구 수를 측정한 결과를 보여주는 그래프.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 폐 조직 손상 정도를 보여주는 H&E 염색 결과.
도 4는 본 발명의 실시예 1에서 유도한 급성 폐손상 폐섬유화 마우스 모델의 폐 조직 내에 콜라겐 축적 정도의 트라이크롬 염색 결과.
도 5는 본 발명의 실시예 1에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 조직에 축적된 콜라겐 섬유의 양을 sircol assay를 통해 확인하고 정량화한 결과 (* p <0.05 by Mann-Whitney U test).
도 6은 본 발명의 실시예 1에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 폐 조직에서 ER stress 정도를 RT-PCR과 Immunoblotting으로 확인한 결과.
도 7은 본 발명의 실시예 1에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 폐 조직에서 senescence 정도를 Immunoblotting으로 확인한 결과.
도 8은 본 발명의 실시예 1에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 폐 조직에서 염증성 cytokine을 ELISA로 측정한 결과.
도 9는 본 발명의 실시예 1에서 유도한 마우스 폐질환 모델의 폐 조직에서 일어나는 cell death를 TUNEL assay로 측정한 결과.
도 10은 본 발명의 실시예 2의 ex vivo 모델에서 senescence가 일어난 정도를 Senescence associated beta-galactosidase staining으로 측정한 결과.
도 11은 본 발명의 실시예 3에서 유도한 산화스트레스 세포 모델에서 일어나는 cell death의 정도를 Annexin V-PI staining으로 측정한 결과.1 is a schematic diagram illustrating the manufacturing process of a mouse model of acute lung injury pulmonary fibrosis induced in Example 1 of the present invention. In order to confirm the therapeutic ability of spermidine, lung damage (fibrosis) was performed in advance with bleomycin, and then spermidine was administered IP (intraperitoneally) every day from D10 to the last day.
Figure 2 is a graph showing the results of measuring the total number of pulmonary inflammatory cells, macrophages, eosinophils, and lymphocytes from bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of a mouse model of acute lung injury pulmonary fibrosis induced in Example 1 of the present invention.
3 is an H&E staining result showing the degree of lung tissue damage in a mouse model of acute lung injury pulmonary fibrosis induced in Example 1 of the present invention.
4 is a trichrome staining result of the degree of collagen accumulation in lung tissue of a mouse model of acute lung injury pulmonary fibrosis induced in Example 1 of the present invention.
5 is a result of confirming and quantifying the amount of collagen fibers accumulated in the tissues of the mouse lung disease model induced in Example 1 of the present invention through sircol assay (* p <0.05 by Mann-Whitney U test).
6 is a result of confirming the degree of ER stress in lung tissue of the mouse lung disease model induced in Example 1 of the present invention by RT-PCR and Immunoblotting.
7 is a result of confirming the degree of senescence in lung tissue of the mouse lung disease model induced in Example 1 of the present invention by Immunoblotting.
Figure 8 is a result of measuring inflammatory cytokine by ELISA in lung tissue of the mouse lung disease model induced in Example 1 of the present invention.
9 is a result of measuring cell death occurring in lung tissue of the mouse lung disease model induced in Example 1 of the present invention by TUNEL assay.
10 is a result of measuring the degree of senescence in the ex vivo model of Example 2 of the present invention by Senescence-associated beta-galactosidase staining.
11 is a result of measuring the degree of cell death occurring in the oxidative stress cell model induced in Example 3 of the present invention by Annexin V-PI staining.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by examples. However, the following examples are merely illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.

실시예Example 1 : 마우스를 이용한 유도 급성 1: Induction acute using mice 폐손상Lung damage 마우스 모델에서 In mouse model Spermidine의Spermidine 효과실험 Effect experiment

1) 실험과정1) Experiment process

마우스의 기관지(intratracheal) 내로 블레오마이신(Bleomycin)을 투여하여 실험동물에 급성 폐손상과 폐섬유화증을 유도하였다. 구체적으로　도　１에　나타난　것처럼, 블레오마이신 투여한 후 10일째에 스퍼미딘(Spermidine)을 12일간 복강 (intraperitoneal)내로 투여하고 21일째에 희생하여 기관지 폐포세척액(BALF), 기관지 및 폐소 조직 등을 확보하여 이후 실험을 진행했다.Acute lung injury and pulmonary fibrosis were induced in experimental animals by administering bleomycin into the bronchi (intratracheal) of mice. Specifically, as 　Do　1　appeared　, Spermidine was administered intraperitoneal for 12 days on the 10th day after bleomycin administration and sacrificed on the 21st day to secure bronchial alveolar lavage (BALF), bronchi and lung tissue, etc. Then, the experiment was conducted.

대조군 : Bleomycin (3mg/kg) 투여군Control group: Bleomycin (3mg/kg) administration group

실험군 : Bleomycin (3mg/kg) + Spermidine (50mg/kg)투여군Experimental group: Bleomycin (3mg/kg) + Spermidine (50mg/kg) administration group

2) 기관지 폐포세척액 (2) Bronchial alveolar lavage fluid ( BALFBALF ) 분석) analysis

마우스의 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar labage fluid; BALF)은 주사기로 PBS 1000μL를 상기 질환이 유도된 마우스의 기도에 반복하여 주의 깊게 넣고 흡입시킴으로써 수득하였으며, 원심분리하여 상층액을 따로 모았다.The bronchoalveolar labage fluid (BALF) of the mouse was obtained by repeatedly carefully placing 1000 μL of PBS into the airway of the disease-induced mouse with a syringe and inhaling it, and the supernatant was collected separately by centrifugation.

BALF에 함유된 전체 폐염증세포를 계산한 후, 상기 수득된 폐포 세척액에 포함된 각종 면역 세포를 사이토스핀 챔버 (cytospin chamber)를 사용하여 1000 rpm에서 슬라이드 글라스 위에 도말하고 Diff-Quick로 염색한 다음, 대식세포, 림프구, 중성구 및 호산구의 세포수를 400배 비율의 광학현미경 (Nicon, Japan)으로 관찰하였으며, 500개의 세포를 무작위로 선택하여 각각의 세포수를 계산하였고, 그 결과를 도 ２에 나타내었다.After calculating the total pulmonary inflammatory cells contained in BALF, various immune cells contained in the obtained alveolar lavage solution were spread on a slide glass at 1000 rpm using a cytospin chamber and stained with Diff-Quick. , Macrophages, lymphocytes, neutrophils, and eosinophils were observed with a 400-fold ratio optical microscope (Nicon, Japan), and 500 cells were randomly selected to calculate the number of cells, and the results are shown in FIG. Indicated.

상기　도 ２의 결과를 참조하면, Spermidine의 투여가 블레오마이신 투여로 인한 폐 염증 발생을 감소시켰으며, 특히 폐손상에서 가장 중요한 역할을 하는 호중구의 수를 감소시킴을 확인하였다.Referring to the results in Fig. 2, it was confirmed that administration of spermidine reduced the incidence of pulmonary inflammation due to the administration of bleomycin, and in particular, reduced the number of neutrophils, which play the most important role in lung injury.

3) H&E 염색을 통한 3) Through H&E dyeing 폐손상Lung damage 평가 evaluation

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플로 제조하였다. 조직 샘플은 deparaffinization 과정을 거친 후 Hematocyline 200 μL로 1분간 염색하고 10분간 수세하였다. 이어서, Eosin 200 μL로 1분간 염색하였고 10분간 수세한 후 Dehydration 과정을 거쳐서 마운팅하여 관찰하였으며, 그 결과를　도　３에 나타내었다.The sacrificed mouse lung tissue was fixed with 4% paraformaldehyde, prepared with paraffin blocks, and cut at 4 μm intervals to prepare a tissue sample. Tissue samples were stained with 200 μL of Hematocyline for 1 minute after deparaffinization and washed with water for 10 minutes. Subsequently, it was stained with 200 μL of Eosin for 1 minute, washed with water for 10 minutes, and then mounted and observed through a dehydration process, and the results are shown in Fig. 3.

상기 도　３을 참조하면, Spermidine에 의해 조직 손상이 현저하게 줄어든 것을 확인할 수 있었다.Referring to Figure 3, it was confirmed that tissue damage was significantly reduced by spermidine.

4) 4) 트리크롬Trichrome 염색 ( dyeing ( TrichromeTrichrome stain)을 이용한 콜라겐 형성 collagen formation using stain) 억제능Inhibitory ability 평가 evaluation

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플을 제조하였다. 조직 샘플은 deparaffinization 과정을 거친 후 흐르는 물에 수세하고 Bouin solution을 200 μL 처리하여 56℃의 인큐베이터에서 1시간 매염하였다. 흐르는 물에 수세하고 Weigrt iron hematoxylin 200 μL로 상온에서 10분간 염색을 진행하였다. Bibrich scarlet 200 μL로 상온에서 10분간 염색한 후 수세하고, Phosphomolybdic-phosphotungstic acid를 상온에서 10분간 처리한 후, Aniline blue 200 μL로 상온에서 2시간 염색하는 과정을 거쳤다. 이렇게 처리된 조직 샘플은 흐르는 물에 수세하고 Dehydration 과정을 거친 후 마운팅하여 관찰하였으며, 그 결과를 도 ４에 나타내었다.The sacrificed mouse lung tissue was fixed with 4% paraformaldehyde, prepared with paraffin blocks, and cut at 4 μm intervals to prepare a tissue sample. Tissue samples were deparaffinized, washed with running water, treated with 200 μL of Bouin solution, and mordized in an incubator at 56° C. for 1 hour. After washing with running water, dyeing was performed at room temperature for 10 minutes with 200 μL of Weigrt iron hematoxylin. It was stained with 200 μL of Bibrich scarlet at room temperature for 10 minutes, washed with water, treated with Phosphomolybdic-phosphotungstic acid for 10 minutes at room temperature, and then stained with 200 μL of Aniline blue at room temperature for 2 hours. The tissue samples treated in this way were washed with running water, subjected to a dehydration process, and then mounted and observed, and the results are shown in FIG. 4.

상기　도　４를 참조하면, Spermidine을 투여한 실험군의 샘플들에서 파란색으로 나타나는 콜라겐 축적이 현저하게 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 Spermidine의 발현이 콜라겐 섬유 축적에 의한 폐섬유화를 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다. Referring to Figure 4 above, it was confirmed that the accumulation of collagen in blue appeared significantly less in the samples of the experimental group administered with spermidine, indicating that the expression of spermidine can inhibit pulmonary fibrosis caused by collagen fiber accumulation. It is the result.

5) 마우스 5) mouse 폐조직에서In the lung tissue 폐섬유화Lung fibrosis 억제 효과 확인- Check the inhibitory effect- sircolsircol assay assay

Sircol assay를 이용해서 마우스 폐조직에서 Spermidine의 폐섬유화 억제 효과를 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직을 lysis buffer를 가하여 폐조직 용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 단백질 용해물과 standard 용액을 각각 실험 tube에 넣고 sircol dye를 넣은 후, 30분간 상온에서 반응시켰다. 14000rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 pellet을 washing buffer로 깨끗하게 수세하였다. 다시 14000rpm으로 15분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 alkali reagent로 pellet을 충분히 풀어주었다. ELISA reader 기계로 540nm의 파장에서 collagen 양을 측정하고, protein을 정량하여 보정한 값을 도　5에 나타냈다.Sircol assay was used to confirm the inhibitory effect of Spermidine on lung fibrosis in mouse lung tissue. Specifically, a lysis buffer was added to the sacrificed mouse lung tissue to prepare a lung tissue lysate, and proteins were extracted. Protein lysate and standard solution were added to each test tube, sircol dye was added, and then reacted at room temperature for 30 minutes. After centrifugation at 14000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was washed with washing buffer. After centrifuging again at 14000 rpm for 15 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was sufficiently released with an alkali reagent. The amount of collagen was measured at a wavelength of 540 nm with an ELISA reader machine, and the corrected value by quantifying protein is shown in Figure 5.

상기 도　5의　결과를 참조하면, 블레오마이신으로 인한 폐섬유화로 인해 증가된 폐 콜라겐의 양이 Spermidine의 투여로 정상군과 비슷하게 억제된다는 점을 확인할 있었고, 도 5의 sircol assay을 이용한 정량적 평가에서도 통계적으로 유의미한 수준(* p<0.05 by Mann-Whitney U test)으로 폐손상 유도군(BLM)과 비교한 실험군 (BLM+Spermidine)의 콜라겐의 양이 억제되어 Spermidine이 급성 폐손상에 의한 폐 섬유화를 억제한다는 결과를 얻을 수 있었다.Referring to the result of Figure 5, it was confirmed that the amount of pulmonary collagen increased due to pulmonary fibrosis due to bleomycin was suppressed similarly to that of the normal group by administration of Spermidine, and also statistically in the quantitative evaluation using the sircol assay of FIG. As a significant level (* p<0.05 by Mann-Whitney U test), the amount of collagen in the experimental group (BLM+Spermidine) compared to the lung injury induction group (BLM) was suppressed, so that Spermidine inhibited lung fibrosis due to acute lung injury. I was able to get the result.

6-1) 실험동물 ER stress 억제 효과 확인-Reverse Transcription 6-1) Confirmation of ER stress inhibition effect in experimental animals-Reverse Transcription PCRPCR >>

<Total RNA 추출><Total RNA extraction>

희생된 마우스 폐조직을 막자 사발에 넣어 충분히 갈은 후, trizol을 넣고 14000rpm, 5분간 원심분리 한 후 상층액을 새로운 ER tube에 옮겼다. 클로로포름 300 μL를 더해서 원심분리기를 이용하여 1400rpm에서 원심분리 한 후 상층액을 새로운 EP tube에 옮겼다. 아이소프로판올 600 μL를 넣고 1400rpm에서 원심분리 한 후 상층액은 버리고 70% 에틸알코올 1 mL를 넣고 5분간 인큐베이션하고 에틸알코올을 제거한 후, 건조하였다. 이후, DEPC DW를 넣고 용리하였다.The sacrificed mouse lung tissue was put in a mortar bowl and sufficiently ground, then trizol was added and centrifuged at 14000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new ER tube. After adding 300 μL of chloroform and centrifuging at 1400 rpm using a centrifuge, the supernatant was transferred to a new EP tube. After adding 600 μL of isopropanol and centrifuging at 1400 rpm, the supernatant was discarded, 1 mL of 70% ethyl alcohol was added, incubated for 5 minutes, and ethyl alcohol was removed, followed by drying. Thereafter, DEPC DW was added and eluted.

<cDNA 합성><cDNA synthesis>

추출한 RNA가 3 μg/μL가 되도록 총량이 10μL가 되게 정량했다. Oligo dT, dNTP를 넣고 65℃ heat block에서 인큐베이션했다. 얼음에서 식히고 5x First strand buffer, DTT, RNase out, SS Ⅱ를 넣고 42℃ 항온수조에서 인큐베이션 후, 70℃ heat block에서 인큐베이션 했다.The extracted RNA was quantified so that the total amount was 10 μL so that 3 μg/μL. Oligo dT and dNTP were added and incubated in a 65°C heat block. After cooling on ice, 5x First strand buffer, DTT, RNase out, and SS II were added and incubated in a 42℃ constant temperature water bath, followed by incubation in a 70℃ heat block.

<Reverse Transcription PCR><Reverse Transcription PCR>

CHOP primer, 5x Taq polymerase, DW, cDNA를 PCR tube에 넣고 60℃에서 31cycle PCR했다. 1% SDS PAGE를 이용하여 전개하고 그 결과를　도　6에 나타내었다. 양성대조군으로 베타액틴을 적용하였다. 나머지 프라이머인 GRP78 (58℃, 31cycle, 231bp), 베타액틴(58℃, 31cycle, 253bp), XBP-1 (59℃, 33cycle, unsplicing:205bp, splicing:179bp)에 대해서도 상기 CHOP에서 설명한 방법과 동일한 방법을 적용하였다. CHOP primer, 5x Taq polymerase, DW, and cDNA were put into a PCR tube and PCR was performed at 60°C for 31 cycles. It was developed using 1% SDS PAGE, and the results are shown in Figure 6. Beta actin was applied as a positive control. The remaining primers, GRP78 (58°C, 31cycle, 231bp), betaactin (58°C, 31cycle, 253bp), XBP-1 (59°C, 33cycle, unsplicing:205bp, splicing:179bp), were also the same as those described in the CHOP. Method was applied.

도　6a를　참조하면, Spermidine이 투여된 실험군에서 ER 스트레스에 관여하는 CHOP, GRP78, XBP-1의 각 RNA 크기에 해당하는 밴드가 대조군 (Bleomycin 3mg/kg)과 비교하여 약하게 나타나서 실험군의 경우, ER stress가 감소한 것을 확인할 수 있었다.Referring to Figure 6a, in the experimental group administered spermidine, the bands corresponding to the size of each RNA of CHOP, GRP78, and XBP-1, which are involved in ER stress, appeared weaker compared to the control group (Bleomycin 3mg/kg). It was confirmed that the stress decreased.

6-2) 실험동물 ER stress 억제 효과 확인-6-2) Confirmation of ER stress inhibition effect in experimental animals- ImmunoblottingImmunoblotting

Immunoblotting을 이용해서 마우스 폐조직에서 Spermidine의 ER stress와 senescence 억제 효과를 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직을 lysis buffer를 가하여 폐조직 용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 10% SDS-PAGE를 이용하여 상기 단백질을 전개하고, 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 후 1차 항체로 anti-GRP78 항체(Cell Signaling Technologies, 1:1000), anti-CHOP(Santa Cruz Biotechnology, 1:200), 2차 항체는 anti-rabbit IgG(GRP78, CHOP 1:3000)를 이용하여 반응시킨 후 detecting 과정을 수행하여, 그 결과를 도　６b에 나타내었다. 양성 조군으로 베타액틴을 적용하였다.Immunoblotting was used to confirm the inhibitory effect of spermidine on ER stress and senescence in mouse lung tissue. Specifically, a lysis buffer was added to the sacrificed mouse lung tissue to prepare a lung tissue lysate, and proteins were extracted. The protein was developed using 10% SDS-PAGE, blocked with 5% skim milk, and then anti-GRP78 antibody (Cell Signaling Technologies, 1:1000), anti-CHOP (Santa Cruz Biotechnology) as a primary antibody. , 1:200), the secondary antibody was reacted with anti-rabbit IgG (GRP78, CHOP 1:3000) and then a detecting process was performed, and the results are shown in Fig. 6b. Beta actin was applied as a positive control group.

상기 도　６b를 참조하면, Spermidine을 투여한 실험군에서 ER 스트레스에 관여하는 GRP78 단백 크기에 해당하는 78kDa 밴드와, CHOP 단백 크기에 해당하는 30kDa의 밴드가 블레오마이신만 투여한 그룹과 비교하여 약하게 나타나서 Spermidine 투여군에서 ER stress가 감소한 것을 확인할 수 있었다.Referring to Figure 6b, in the experimental group administered with Spermidine, the 78kDa band corresponding to the size of the GRP78 protein involved in ER stress and the 30kDa band corresponding to the size of the CHOP protein appeared weaker compared to the group administered only bleomycin. It was confirmed that the ER stress decreased in the administration group.

7) 실험동물 senescence 억제 효과 확인-7) Confirmation of senescence inhibition effect in experimental animals- ImmunoblottingImmunoblotting

Immunoblotting을 이용해서 마우스 폐조직에서 Spermidine의 senescence 억제 효과를 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직을 lysis buffer를 가하여 폐조직 용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 10% SDS-PAGE를 이용하여 상기 단백질을 전개하고, 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹한 후 1차 항체로 p16(abcam, 1:1000), pRb (Cell Signaling Technologies, 1:1000), 2차 항체는 anti-rabbit IgG(p16, pRB 1:3000)를 이용하여 반응시킨 후 detecting 과정을 수행하여, 그 결과를 도　7에 나타내었다. 양성　대조군으로 베타액틴을 적용하였다.Immunoblotting was used to confirm the inhibitory effect of Spermidine on senescence in mouse lung tissue. Specifically, a lysis buffer was added to the sacrificed mouse lung tissue to prepare a lung tissue lysate, and proteins were extracted. The protein was developed using 10% SDS-PAGE, blocked with 5% skim milk, and then p16 (abcam, 1:1000), pRb (Cell Signaling Technologies, 1:1000), 2 as primary antibodies. The primary antibody was reacted with anti-rabbit IgG (p16, pRB 1:3000) and then subjected to a detecting process, and the results are shown in Fig. 7. Beta actin was applied as a positive control group.

상기 도　7을 참조하면, Spermidine을 투여한 실험군에서 senescence에 관여하는 p16 단백 크기에 해당하는 16kDa 밴드와, pRb 단백 크기에 해당하는 110kDa의 밴드가 블레오마이신만 투여한 그룹과 비교하여 약하게 나타나서 Spermidine 투여군에서 노화(senescence)가 억제된 것을 확인할 수 있었다.Referring to Fig.7, in the experimental group administered with Spermidine, the 16kDa band corresponding to the size of the p16 protein involved in senescence and the 110kDa band corresponding to the size of the pRb protein appeared weaker compared to the group administered only bleomycin. It was confirmed that senescence was suppressed.

8) Mouse lung 8) Mouse lung lysatelysate ELISA ELISA

ELISA를 이용해서 마우스 폐조직에서 Spermidine의 염증성 cytokine의 감소 효과를 확인했다. 구체적으로, 희생된 마우스 폐조직을 lysis buffer를 가하여 폐조직 용해물을 제조하고, 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질을 1차 항체 (IL-1β, TNF-α, active TGF-β1)가 코팅되어 있는 플레이트에 100ul씩 넣은 후 37℃에서 두 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세 번 수세 후 2차 항체를 넣어주고 상온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 세 번 수세 후 streptavidin-HRP를 넣어 상온에서 한 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 세 번 수세 후 TMB solution을 넣어 상온에서 30분간 반응 시킨 후 stop solution을 넣고 ELISA reader로 측정하였다.ELISA was used to confirm the effect of Spermidine on reducing inflammatory cytokines in mouse lung tissue. Specifically, a lysis buffer was added to the sacrificed mouse lung tissue to prepare a lung tissue lysate, and proteins were extracted. The extracted protein was put into a plate coated with primary antibodies (IL-1β, TNF-α, active TGF-β1) by 100ul, and incubated at 37°C for 2 hours. After washing with water three times, the secondary antibody was added and incubated at room temperature for one hour. Thereafter, after washing with water three times, streptavidin-HRP was added and incubated at room temperature for one hour. Thereafter, after washing with water three times, TMB solution was added and reacted at room temperature for 30 minutes, and then the stop solution was added and measured with an ELISA reader.

상기 도 8을 참조하면, Spermidine을 투여한 실험군에서 염증성 cytokine인 IL-1β, TNF-α, active TGF-β1가 블레오마이신만 투여한 그룹과 비교에 비해 감소한 것으로 보아 Spermidine 투여로 인해 폐의 염증 정도가 줄어든 것을 확인할 수 있었다.Referring to FIG. 8, in the experimental group administered with Spermidine, the inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α, and active TGF-β1 decreased compared to the group administered only bleomycin. It could be confirmed that the decreased.

9) 9) 실험 동물Experimental animals 조직 group apoptosisapoptosis 억제 효과 확인- Check the inhibitory effect- TUNELTUNEL assay assay

희생된 마우스 폐조직은 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고 파라핀 블록으로 제조된 후 4 μm 간격으로 절단하여 조직 샘플을 제조하였다. 조직 샘플은 deparaffinization 과정을 거친 후 흐르는 물에 수세하고 proteinase K 20ug/ml를 함유하는 1M tris/HCl을 37℃에서 30분간 처리해 permiabilization 과정을 수행하였다. TUNEL assay solution mixture를 그룹 당 50ul씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. DPBS로 2번 수세하고 형광 염색용 마운팅 용액으로 마운팅하여 현미경으로 찍었다.The sacrificed mouse lung tissue was fixed with 4% paraformaldehyde, prepared with paraffin blocks, and cut at 4 μm intervals to prepare a tissue sample. Tissue samples were subjected to a deparaffinization process, washed with running water, and treated with 1M tris/HCl containing 20 ug/ml proteinase K at 37° C. for 30 minutes to perform a permiabilization process. 50ul of the TUNEL assay solution mixture was added to each group and incubated at 37°C for 1 hour. Washing with DPBS twice, mounting with a mounting solution for fluorescent staining, and photographing with a microscope.

상기 도 9의 결과를 참조하면, 블레오마이신 자극으로 인해 증가된 apoptosis가 Spermidine을 처리한 그룹에서 억제된다는 결과를 얻을 수 있었다.Referring to the results of FIG. 9, it was possible to obtain a result that increased apoptosis due to bleomycin stimulation was inhibited in the Spermidine-treated group.

실시예Example 2 : ex 2: ex vivo에서in vivo 블레오마이신Bleomycin 에 대한 for Spermidine의Spermidine 효과 실험 Effect experiment

세포내Intracellular senescence 억제 효과 확인-Senescence associated beta-gal staining Confirmation of senescence inhibitory effect-Senescence associated beta-gal staining

대조군 : Bleomycin (10μg/mL) Control: Bleomycin (10μg/mL)

실험군 : Bleomycin (10μg/mL) + Spermidine (100uM)Experimental group: Bleomycin (10μg/mL) + Spermidine (100uM)

Cellular senescence assay kit (Cell biolabs, INC)를 이용하였다. Mouse primary alveolar epithelial cell 세포에 Bleomycin 또는 Bleomycin과 Spermidine (100uM)을 48시간 동안 투여하였다. Mouse primary alveolar epithelial cell을 두차례 수세한 후, 1X Fixing solution 1mL를 넣고 인큐베이션 한 후, 흡인하고 세차례 수세했다. Staining working solution을 넣고 37℃에서 인큐베이션했다. 다음날 흡인하고 세차례 수세했다. 메틸알코올로 세포를 수세하고 건조시킨 후 현미경으로 관찰한 결과를 도　１0에 나타내었다.Cellular senescence assay kit (Cell biolabs, INC) was used. Bleomycin or Bleomycin and Spermidine (100uM) were administered to the mouse primary alveolar epithelial cell cells for 48 hours. After washing the mouse primary alveolar epithelial cell twice with water, 1 mL of 1X Fixing solution was added and incubated, aspirated and washed three times. Put the staining working solution and incubated at 37°C. The next day, I aspirated and washed three times. The cells were washed with methyl alcohol, dried, and observed under a microscope. The results are shown in Fig. 10.

상기　도　１0을 참조하면, Spermidine이 투여된 실험군의 세포에서 파란색으로 나타나는 senescence가 일어난 부분이 대조군 (Bleomycin 10μg/mL)과 비교하여 현저하게 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 Spermidine이 세포의 senescence를 억제할 수 있음을 보여주는 결과이다.Referring to the above 　do　10, it was confirmed that the part in which the blue senescence occurred in the cells of the test group administered with Spermidine appeared significantly less than that of the control group (Bleomycin 10μg/mL), which Spermidine inhibited the senescence of the cells. It's a result that shows you can do it.

실시예Example 3 : ex 3: ex vivo의vivo 산화 스트레스 유도 세포에서 In oxidative stress-induced cells Spermidine의Spermidine 효과 실험 Effect experiment

세포 cell apoptosisapoptosis , necrosis 확인-, necrosis check- AnnexinAnnexin V-PI staining V-PI staining

대조군 : H2O2 (0.5mM) Control: H 2 O 2 (0.5mM)

실험군 : H2O2 (0.5mM) + Spermidine (100uM)Experimental group: H 2 O 2 (0.5mM) + Spermidine (100uM)

Mouse primary alveolar epithelial cell에 H2O2 (0.5mM), H2O2 (0.5mM) + Spermidine (100uM), Spermidine (100uM)을 투여한 후 dish에서 상층액을 따서 FACS tube에 넣었다. DPBS로 수세한 후 Trypsin 200μL 넣고 인큐베이션 후 cell을 걷어서, 원심분리기를 이용하여 1300rpm으로 원심분리하였다. Cell에 DPBS를 넣고 수세한 후 원심분리하고, 상층액을 버리고 1X binding buffer를 1ml 넣어주었다. Annexin V : PI = 1 : 1 비율로 tube에 넣고 빛 차단한 상태로 인큐베이션 후 측정한 결과를 도　11에 나타내었다.After administration of H 2 O 2 (0.5mM), H 2 O 2 (0.5mM) + Spermidine (100uM), and Spermidine (100uM) to the mouse primary alveolar epithelial cell, the supernatant was picked from the dish and placed in a FACS tube. After washing with DPBS, 200 μL of Trypsin was put in, and after incubation, the cell was rolled and centrifuged at 1300 rpm using a centrifuge. DPBS was added to the cell, washed with water, centrifuged, the supernatant was discarded, and 1 ml of 1X binding buffer was added. Annexin V: PI = 1: 1 ratio of the tube was put in a light-blocked state after incubation and the measurement results are shown in FIG.

상기　도　１1을 참조하면, Spermidine이 투여된 실험군의 세포에서 apoptosis가 대조군 (H2O2 0.5mM)과 비교하여 적게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통해 Spermidine이 세포의 apoptosis를 억제함을 확인하였다.Referring to FIG. 1, it was confirmed that apoptosis appeared less in the cells of the experimental group to which Spermidine was administered compared to the control (H 2 O 2 0.5mM), and through this, it was confirmed that Spermidine inhibited apoptosis of the cells.

상기 결과를 요약하면, Spermidine이 블레오마이신(Bleomycin) 유도된 마우스의 급성 폐손상과 폐 섬유화를 억제하는 것을 확인하였는 바, 급성 폐손상과 폐 섬유화 치료제로 사용할 수 있음을 의미한다. Summarizing the above results, it was confirmed that Spermidine inhibited acute lung injury and pulmonary fibrosis in bleomycin-induced mice, indicating that it can be used as a therapeutic agent for acute lung injury and pulmonary fibrosis.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, those skilled in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in other specific forms without changing the technical spirit or essential features. In this regard, the embodiments described above are illustrative in all respects and should be understood as non-limiting. The scope of the present invention should be construed that all changes or modifications derived from the meaning and scope of the claims to be described later rather than the above detailed description, and equivalent concepts thereof, are included in the scope of the present invention.

Claims (11)

스퍼미딘(Spermidine) 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 블레오마이신에 의한 폐섬유화증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
A food composition for preventing or improving pulmonary fibrosis caused by bleomycin comprising spermidine or a food pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
제1항에 있어서, 상기 스퍼미딘은 동시에 폐의 염증 질환을 예방 또는 개선하기 위해 사용되는 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 1, wherein the spermidine is used to prevent or improve inflammatory diseases of the lungs at the same time.
제1항에 있어서, 상기 스퍼미딘은 콜라겐 축적을 억제하는 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 1, wherein the spermidine inhibits collagen accumulation.
삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서, 상기 스퍼미딘은 추가로 급성 폐손상을 예방 또는 개선하는 것인, 식품 조성물.
The food composition of claim 1, wherein the spermidine further prevents or improves acute lung injury.
제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품인 것인, 식품 조성물.
The food composition according to claim 1, wherein the food composition is a health functional food.
삭제delete 삭제delete 삭제delete
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