KR101652957B1 - Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof - Google Patents

Abstract

본 발명은 ATF3 siRNA 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 당뇨병을 포함하는 대사성 질환용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 ATF3 siRNA은 기존의 ATF3 siRNA 보다 ATF3 유전자 발현을 더욱 억제하고 ATF3와 관련된 iNOS의 단백질 발현, NO 생성 및 ROS의 생성을 포함하는 산화적 스트레스, CHOP을 포함하는 ER 스트레스, 췌장베타세포기능 저하 및 혈장 인슐린 양 등을 개선함으로써 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a composition for metabolic diseases including diabetes mellitus containing ATF3 siRNA and a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. More particularly, the ATF3 siRNA of the present invention inhibits the expression of ATF3 gene more than the existing ATF3 siRNA For the prevention and treatment of metabolic diseases by improving oxidative stress including protein expression of iNOS associated with ATF3, NO production and production of ROS, ER stress including CHOP, pancreatic beta cell dysfunction and plasma insulin level, etc. It can be usefully used in an emulsion composition.

Description

ATF3 유전자 발현을 억제하는 신규 siRNA 및 이의 용도{Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof}Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof < RTI ID = 0.0 >

본 발명의 목적은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA(small interacting RNA) 또는 이를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
An object of the present invention is to provide siRNA (small interacting RNA) composed of sense RNA and antisense RNA that specifically binds to mRNA of ATF3 (Activating Transcription Factor 3) gene or a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases containing the siRNA .

대사성 질환(metabolic disease)은 만성적인 대사 장애로 인하여 발생하는 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 비만, 관상 또는 동맥경화증과 같은 여러 가지 질환이 동시에 발생하는 질환을 일컫는 것으로서 1988년 Reaven(Reaven GM, Diabetes, 1988, 37:1595-1607)에 의해 처음으로 규명되었다. 대사성 질환은 인슐린저항성과 고혈압, 이상지질혈증을 특징으로 하고 있으며, 대부분 과체중이나 비만을 동반하고 있다. 대사성 질환은 또한 심혈관질환의 위험 인자이며, 여러 원인으로 인한 사망과 연관되어 있다고 보고되었다. 제2형 당뇨병 환자의 경우 제1형 당뇨병과 달리 대사성 질환의 유병률이 높다고 보고되고 있으며, 제2형 당뇨병 환자가 대사성 질환을 동반할 때 사망률이 증가한다고 알려져 있다(Bonora E, et al. Diabet Med., 2004, 21:52-8; Ford ES, Diabetes Care., 2005, 28:1769-78; Alexander CM, et al. Diabetes, 2003, 52:1210-1214). 또한, 제2형 당뇨병은 대혈관 및 미세혈관 질환과 고혈압, 이상지질혈증 등의 합병증 발생의 주요 원인 질환으로 알려져 있다(Mykkanen L, et al. Diabetologia., 1993, 36:553-559; Haffner SM, et al. Diabetes, 1992, 41:715-722).
BACKGROUND ART Metabolic disease refers to diseases in which various diseases such as diabetes, hypertension, hyperlipidemia, obesity, coronary artery or atherosclerosis are simultaneously caused by chronic metabolic disorders. Reaven (Reaven GM, Diabetes 1988 , 37: 1595-1607). Metabolic diseases are characterized by insulin resistance, hypertension, dyslipidemia, and most of them are overweight or obese. Metabolic diseases are also a risk factor for cardiovascular disease and have been reported to be associated with death from multiple causes. Unlike type 1 diabetes, the prevalence of metabolic disease is high in patients with type 2 diabetes, and it is known that type 2 diabetes mellitus is associated with increased metabolic disease (Bonora E, et al. Diabet Med , 2004, 21: 52-8; Ford ES, Diabetes Care., 2005, 28: 1769-78; Alexander CM, et al. Diabetes, 2003, 52: 1210-1214). In addition, type 2 diabetes is known to be a major cause of complications such as macrovascular and microvascular diseases, hypertension and dyslipidemia (Mykkanen L, et al. Diabetologia 1993, 36: 553-559; Haffner SM , et al. Diabetes, 1992, 41: 715-722).

당뇨병은 가장 대표적인 만성 성인병 중의 하나이다. 우리나라의 당뇨병 환자는 2011년 기준으로 30세 이상 인구의 12.4%에 해당하는 약 400 만 명에 이르는 것으로 보고된 바 있다(2013년 대한 당뇨병학회). 당뇨병(Diabetes)은 혈중에 있는 당분이 췌장에서의 인슐린 생성 또는 분비 능력의 감소나 근육, 간, 또는 지방조직 등에서의 인슐린의 작용, 당 흡수 또는 분해 능력이 감소함으로 인해 에너지로 사용되지 못하고 혈액에 그대로 남아 있게 됨으로 혈액에서의 당 성분이 증가함으로 나타나는 질병이다. 당뇨병의 원인으로는 대표적으로 식생활의 서구화, 비만증, 운동부족, 스트레스 등이 잘 알려져 있다. 현재 미국, 유럽 및 일본과 같은 선진국에서는 비만 및 당뇨병의 증가로 인한 사회 경제적인 폐해가 심화되고 있고, 한국의 경우도 경제 성장에 따른 식생활습관의 서구화로 인해 당뇨병 환자가 급속도로 증가하여 2050년이 되면 지금보다 약 190%가 증가한 6백만명에 이를 것으로 전망하고 있다(대한당뇨병 학회 당뇨병 실태보고서 2013). 2004년 와일드(Wild) 등이 보고한 바에 따르면 2000년 당시 전 세계 당뇨병 환자가 약 1억 7,100만명에서 2030년에는 약 3억 6,600만명으로 증가할 것으로 추정하였지만 2013년 현재 전 세계 당뇨병 환자가 이미 3억 4,600만명에 이르는 것으로 보고되었다(WHO Health 보고서, 2013). 이러한 추세라면 2030년 세계 당뇨병 환자는 그 예상치를 훨씬 넘어 설 것으로 예상된다. 특히, 국민건강보험공단에서 발표한 자료에 따르면 당뇨병 진료인원은 2006년 인구 10만 명당 3,305명에서 2010년 3,985명 연평균 4.8% 증가하였으며, 당뇨병으로 인한 총 진료비는 2006년 8,101억 원에서 2010년 1조 2,935억 원으로 연평균 12.4%가 증가하여 당뇨병 환자의 폭발적 증가와 함께 의료비 지출도 급격하게 증가하고 있어 국가적인 차원의 대책 마련이 시급한 현안으로 대두되고 있다. 그러나 앞에서도 언급한 바와 같이 당뇨병은 모든 만성질환의 주요 원인질환으로 여러 합병증으로 인한 의료비용과 사망에 따른 손실비용을 추산하게 되면 국가적인 대응을 해야만 하는 주요 질환으로 여겨지고 있다.Diabetes is one of the most common chronic adult diseases. The number of diabetic patients in Korea has been reported to reach about 4 million in 2011 (12.4% of the population over 30 years of age) (2013 Korean Diabetes Association). Diabetes is caused by the fact that sugar in the blood can not be used as energy due to decreased insulin production or secretion ability in the pancreas, insulin action in muscle, liver, or adipose tissue, It is a disease caused by an increase in sugar content in blood as it is left as it is. The cause of diabetes is typically westernization of diet, obesity, lack of exercise, and stress are well known. In developed countries such as the US, Europe and Japan, socioeconomic harm is increasing due to the increase in obesity and diabetes. In Korea, too, the westernization of eating habits due to economic growth has led to a rapid increase in diabetic patients. (About 190% more than now) to 6 million people (Korea Diabetes Association Diabetes Report 2013). In 2004, Wild et al. Estimated that worldwide diabetes patients would increase from about 171 million people in 2000 to about 366 million in 2030, but as of 2013, Reported to reach 46 million (WHO Health Report, 2013). With this trend, world diabetes patients in 2030 are expected to exceed their expectations. In particular, according to data released by the National Health Insurance Corporation, the number of diabetic patients increased by an annual average of 4.8% from 3,305 per 100,000 population in 2006 to 3,985 in 2010. Total medical expenses from diabetes increased from 810.1 billion won in 2006 to 1 in 2010 The average annual increase rate of 12.4% is 293.5 billion won, so the expenditure of medical expenses is rapidly increasing along with the explosive increase of diabetic patients. Therefore, it is urgent to prepare national measures. However, as mentioned above, diabetes is a major cause of all chronic diseases. It is considered to be a major disease that should be treated nationally if the cost of medical expenses due to various complications and the cost of loss due to death are estimated.

당뇨병은 크게 인슐린 의존성인 제1형 당뇨병과 비의존성 제2형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 제1형 당뇨병 환자는 유전적 원인 또는 바이러스 감염 등에 의하여 어렸을 때부터 췌장베타세포의 사멸로 인하여 인슐린을 거의 분비하지 못하여 발생하는 것으로 알려져 있지만, 제2형 당뇨병 환자는 인슐린 분비 능력은 거의 정상으로 가지고 있었지만 성장을 하면서 노출되는 여러 생활습관적 또는 환경적 요인들에 의해 대부분 발생하는 것으로 알려져 있다. 많은 경우 비만을 동반하는 제2형 당뇨병은 혈중 내 지방산의 증가로 인하여 인슐린 저항성이 유도되어 포도당 대사에 이상이 발생하여 결국 혈중 내 혈당이 높아지는 질환이며, 아울러, 췌장소도의 기능 부전 및 이로 인한 인슐린 분비의 이상과 신호 전달 이상이 제2형 당뇨병의 원인으로 또한 생각된다. 인슐린 저항성은 제2형 당뇨병 환자의 90%이상에서 나타나는 주요 병인 요소로서, 고혈당이 나타나기 수년 전부터 선행되는 것으로 알려져 있다(Haffner S M, et al. JAMA, 1990, 263:2893-2898). 인슐린 저항성과 이에 따른 대사 이상 및 혈관계 이상들의 집합체를 인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome) 또는 대사 증후군(metabolic syndrome)이라 한다. 인슐린 저항성과 대사증후군은 심혈관계 질환, 특히 관상동맥 질환의 위험도 증가와 연관성이 매우 높으며(Isomaa B, et al. Diabetes Care, 2001, 24:683-9), 관상동맥 질환의 위험도와 사망률을 3배 정도 증가시키는 것으로 보고되고 있다(Lakka H, et al. JAMA, 2002, 288:2709-2716).
Diabetes is largely divided into insulin-dependent type 1 diabetes and non-dependent type 2 diabetes. It is known that type 1 diabetes occurs due to genetic causes or viral infections resulting from insufficient secretion of insulin due to the death of pancreatic beta cells from childhood. However, type 2 diabetic patients have almost normal insulin secretory ability , But it is known to occur mostly due to various habitual or environmental factors exposed during growth. In many cases, type 2 diabetes, which is accompanied by obesity, is a disease in which insulin resistance is induced and an abnormality occurs in glucose metabolism due to an increase in fatty acids in blood, resulting in increase in blood glucose level in the blood. In addition, Abnormalities of secretion and abnormal signal transduction are also thought to be the cause of type 2 diabetes. Insulin resistance is a major pathogenesis factor in over 90% of type 2 diabetic patients and is known to precede many years before hyperglycemia occurs (Haffner SM, et al. JAMA, 1990, 263: 2893-2898). Insulin resistance and the resulting aggregation of metabolic abnormalities and vascular system abnormalities are referred to as insulin resistance syndrome or metabolic syndrome. Insulin resistance and metabolic syndrome are associated with increased risk of cardiovascular disease, especially coronary artery disease (Isomaa B, et al. Diabetes Care, 2001, 24: 683-9) (Lakka H, et al. JAMA, 2002, 288: 2709-2716).

최근 연구에 의하면, ATF3(Activating Transcription factor)은 당뇨, 비만 등 대사이상질환에 있어서 췌장 베타세포의 기능 저하 및 세포사멸을 유도하고 특히, ATF3가 과발현되면 췌장베타세포에서 당분해 효소인 글루코키나제(Glucokinase; GCK)와 이의 전사조절인자인 PDX-1 등의 발현 저하에 직접적으로 관여하여 인슐린 생성기능 저하 및 세포사멸을 증가시킴이 보고되었다(Kim et al., JBC. 2010, 285: 37251-37262; Kim et al., BBRC, 2011, 414: 681-687)Recent studies have shown that ATF3 (Activating Transcription Factor) induces pancreatic beta cell dysfunction and apoptosis in metabolic disorders such as diabetes and obesity. In particular, when ATF3 is overexpressed, glucan kinase 1], [2], [3], [4], [6], [7] and [8], which have been shown to inhibit insulin secretion and decrease cell proliferation, Kim et al., BBRC, 2011, 414: 681-687)

ATF3(Activating transcription factor 3) 단백질은 전사인자의 포유동물 활성전사조절인자/cAMP 반응요소-결합 단백질(mammalian activation transcription factor/cAMP responsive element-binding(CREB)protein)의 구성성분으로 두 개의 다른 동형단백질(isoforms)을 암호화하는 다수의 전사변이(transcript variants)가 이 유전자에서 발견되었다. 긴 변이는 ATF 결합 요소를 갖는 프로모터로부터 전사 활성화를 억제하고, ATF3 유전자는 암 발생에 관여하는 여러 요인들에 의해 나타나는 다양한 신호들에 의해 유도되며, 세포내 스트레스 반응의 복잡한 과정에 연관되어 있는 것으로 알려져 왔다. 그러나 최근에는 ATF3의 동형단백질 또는 이형단백질간의 복합체 형성 여부에 따라 표적 유전자들의 발현을 억제 또는 증가시키는 것으로 알려져 있다. Activating transcription factor 3 (ATF3) is a component of the mammalian activation transcription factor / cAMP responsive element-binding (CREB) protein, A number of transcript variants encoding isoforms have been found in this gene. Long mutations inhibit transcriptional activation from promoters with ATF binding elements and the ATF3 gene is induced by a variety of signals that are caused by various factors involved in cancer development and is involved in the complex process of intracellular stress response It has been known. Recently, however, it is known that ATF3 inhibits or increases the expression of target genes depending on whether a homologous protein or a heterologous protein is formed.

ATF3는 알려진 표적 유전자들의 활성인자(activator) 또는 억제제(repressor)로서 역할을 하고, 현재까지 문헌적으로 알려져 있는 ATF3의 잠재적 표적 유전자들은 20여 개가 넘으며, 여기에는 AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A, CCL2, CCL4, Cyclin D1, FN-1, GLUT4, HIF-2α, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-12b, IRS2, MMP1, MMP13, Noxa, p15PAF, Slug, Snail, STAT1, TNFα, TWIST1, p53, p73, PDX-1, 아디포넥틴(adiponectin) 등이 포함되는 것으로 알려져 있다. ATF3 acts as an activator or repressor of known target genes and there are more than 20 potential target genes of ATF3 which are known literally to date and include AdipoR1, AdipoR2, bNIP3, Cdc25A, IL-6, IL-12b, IRS2, MMP1, MMP13, Noxa, p15PAF, Slug, Snail, STAT1, TNF? , TWIST1, p53, p73, PDX-1, adiponectin, and the like.

대식세포(macrophage), 비만세포(mast cell), T 세포(T cell), 수지상 세포(dendritic cell) 등의 면역세포에서뿐만 아니라 섬유아세포나 상피세포를 비롯한 대부분의 세포에서 NFκB, JNK, Erk, p38, PKC 등 다양한 경로가 ATF3를 유도하고, 유도된 ATF3는 다양한 유전자들의 전사를 조절하여 세포사멸(apoptosis), 세포성장(cell proliferation), 세포이동(cell motility), DNA수선(DNA repair), 대사(metabolism)에 관여하며, 데이타베이스들도 상당수의 중요 전사인자들(AP1, CHOP, NFκB, p53 등)과의 연관성을 예시하고 있어 중심 신호분자로서의 역할 규명이 매우 중요한 것으로 알려져 있다. 특히 ATF3는 비만이나 당뇨병 발생에 의해서 증가하는 여러 유리 지방산이나 산화적 스트레스 물질들에 의해 발현이 크게 증가되는 것으로 확인되고 있다.
JNK, Erk, and p38 in most cells, including macrophages, mast cells, T cells, and dendritic cells, as well as fibroblasts and epithelial cells. , And PKC induce ATF3 and inducible ATF3 regulates transcription of various genes to regulate apoptosis, cell proliferation, cell motility, DNA repair, metabolism (AP1, CHOP, NFκB, p53, etc.), and its role as a central signal molecule is very important. In particular, ATF3 has been shown to be significantly increased by various free fatty acids and oxidative stress substances, which are increased by obesity or diabetes.

최근 연구에 따르면 19-21개 정도의 핵산으로 구성된 짧은 이중가닥(double strand) 간섭 RNA인 에스아이알엔에이(siRNA)가 세포 내에서 RISC(RNA-induced silencing complex)와 결합하여 세포 내 상보적인 염기 서열을 가진 mRNA에 특이적으로 작용하여 표적 mRNA를 분해하는 RNA 간섭 작용을 하는 것으로 매우 잘 알려져 있다.Recent studies have shown that SIS (siRNA), a short double strand interference RNA consisting of about 19 to 21 nucleotides, binds to RNA-induced silencing complex (RISC) It is well known that it acts specifically on mRNA having a sequence to cause RNA interference that degrades the target mRNA.

상기 siRNA는 안티센스 올리고 뉴클레오티드에 비해 4-10배 정도 적은 양으로도 유전자 발현을 저해할 수 있어 세포 독성이 적고 유전자의 선택적 발현 저해가 뛰어나 이를 이용하여 암이나 유전적 질병을 유도하는 유전자가 단백질로 되는 것을 저해하면 질병의 원인을 없앨 수 있게 됨으로써 새로운 효과적인 질병치료제로 많은 관심을 받고 있다.
The siRNA can inhibit gene expression by 4-10 times less than the antisense oligonucleotide, so that it is less cytotoxic and inhibits selective expression of the gene. Therefore, the gene that induces cancer or genetic disease is protein , It is able to eliminate the cause of disease, and thus it is attracting much attention as a new effective disease remedy.

이에, 본 발명자들은 신규한 siRNA를 이용하여 대사성 질환 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 시험관 내 및 생체 내에 전달된 ATF3 유전자 발현을 억제하는 ATF3 siRNA가 췌장베타세포의 대사기능 저하 및 세포사멸을 억제시키고, 더불어 비만, 당뇨병 발생을 억제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.As a result of efforts to develop a therapeutic agent for metabolic diseases using the novel siRNA, the present inventors have found that ATF3 siRNA which inhibits the expression of ATF3 gene in vitro and in vivo suppresses metabolic function and cell death of pancreatic beta cells , Obesity, and the occurrence of diabetes can be suppressed, thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA 및 이의 용도를 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an siRNA that specifically binds to mRNA of an ATF3 (activating transcription factor 3) gene and its use.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an siRNA that specifically binds to the mRNA of ATF3 (Activating Transcription Factor 3) gene.

또한, 본 발명은 ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 siRNA를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
The present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing an siRNA specifically binding to the mRNA of the ATF3 gene as an active ingredient.

본 발명의 신규한 ATF3 siRNA가 기존 상업적으로 시판되고 있는 ATF3 siRNA를 처리한 경우에 비해 ATF3 유전자 발현을 더욱 크게 억제시키고 스트레스로 인해 생성되는 iNOS의 단백질 발현, NO 생성 및 ROS의 생성을 포함하는 산화적 스트레스, CHOP를 포함하는 ER 스트레스, 췌장베타세포기능 저하 및 혈장 인슐린 양 등을 더욱 크게 개선함으로써, 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
The novel ATF3 siRNA of the present invention inhibits the expression of ATF3 gene even more than that of ATF3 siRNA, which is commercially available, and inhibits the expression of iNOS protein, NO production and ROS production Can be usefully used for the prevention and treatment of metabolic diseases by further improving the ER stress including CHOP, the decrease of pancreatic beta cell function and the plasma insulin level.

도 1은 각각의 ATF3 siRNA를 세포 및 랫드(rat)의 생체 내로 전달시킨 후 ATF3 발현억제 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 ATF3 mRNA(A) 및 단백질(B) 발현 억제에 대한 기존의 ATF3 siRNA와 본 발명의 ATF3 siRNA의 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 ATF3 단백질 발현 억제에 대한 기존의 ATF3 siRNA와 본 발명의 ATF3 siRNA의 농도 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드(rat)에서 혈당, 트리글리세리드, 당분해, 지방간 및 인슐린민감도 등을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 췌장베타세포의 세포사멸 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 활성산소(iNOS, 니트리트, ROS) 발현 억제 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 에탄올로 유도된 GCK, PDX-1, 인슐린 및 세포사멸의 발현저해가 ATF3 siRNA에 의해 개선되는 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 제작한 ATF3 siRNA를 이용하여 비만성당뇨쥐 모델에서 나타나는 췌장 베타세포의 기능 저하 및 내당능저하를 개선함으로써 당뇨병 발생을 예방할 수 있음을 나타내는 전체 모식도이다.FIG. 1 is a graph showing the inhibition of ATF3 expression after the delivery of each ATF3 siRNA into cells and in vivo in rats.
Fig. 2 is a graph showing the results of comparison between ATF3 siRNAs of the present invention and ATF3 siRNAs against ATF3 mRNA (A) and protein (B) expression inhibition.
FIG. 3 is a graph showing the results of comparing the concentrations of ATF3 siRNA of the present invention and ATF3 siRNA against ATF3 protein expression inhibition.
FIG. 4 is a graph showing the results of measurement of blood glucose, triglyceride, sugar solution, fatty liver and insulin sensitivity in a rat injected with ATF3 siRNA of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing the results of inhibition of cell death of pancreatic beta cells in a rat injected with ATF3 siRNA of the present invention. FIG.
6 is a graph showing the inhibition of the expression of reactive oxygen species (iNOS, nitrite, ROS) in a rat injected with ATF3 siRNA of the present invention.
FIG. 7 shows the results of the ethanol-induced inhibition of expression of GCK, PDX-1, insulin and apoptosis by ATF3 siRNA.
FIG. 8 is a schematic diagram showing that the occurrence of diabetes can be prevented by improving the function and the impaired glucose tolerance of pancreatic beta cells in the obese diabetic rat model using the produced ATF3 siRNA.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 ATF3(Activating transcription factor 3) 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA(small interacting RNA)를 제공한다.The present invention provides an siRNA (small interacting RNA) composed of a sense RNA and an antisense RNA that specifically bind to the mRNA of ATF3 (Activating Transcription Factor 3) gene.

상기 ATF3는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 센스 RNA 가닥은 서열번호 1 및 3인 것이 바람직하고 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The ATF3 preferably has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto. The siRNA may comprise an independent sense RNA strand homologous to the target sequence and a complementary antisense RNA strand or a single RNA strand of a stem-loop structure in which the sense RNA strand and the antisense RNA strand are connected by a loop. The sense RNA strands are preferably SEQ ID NOS: 1 and 3, and the antisense RNAs are antisense RNAs represented by SEQ ID NOS: 2 and 4, but are not limited thereto.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(8):5515-5520, 2002), CCC, CCACC 또는 CCACACC(Paul et al., Nature Biotechnology 20:505-508, 2002), UUCG(Lee et al., Nature Biotechnology 20:500-505), CTCGAG, AAGCUU(Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003), UUCAAGAGA(Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCG(www.genscript.com의 default spacer). siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.
The siRNA is not limited to a complete pair of double-stranded RNAs paired with each other, and may have a hairpin structure that forms a stem-loop structure. Specifically, the siRNA may be a short hairpin RNA Quot; On the other hand, the double-chain or stem portion may include a non-paired portion due to a mismatch (the corresponding base is not complementary), a bulge (no base corresponding to one chain), or the like. The total length is 10 to 80 bases, preferably 15 to 60 bases, more preferably 20 to 40 bases. In addition, the loop region has no special significance in the sequence, and it is enough to have about 3-10 bases in order to connect the sense sequence and the antisense sequence at appropriate intervals. Previously used examples of siRNA loop regions were as follows: AUG (Sui et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 99 (8): 5515-5520, 2002), CCC, CCACC or CCACACC (Nature et al., Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002), UUCG (Lee et al., Nature Biotechnology 20: 500-505), CTCGAG, AAGCUU (Editors of Nature Cell Biology Whither RNAi, Nat Cell Biol. USA 99 (9): 6047-6052, 2002) and TTGATATCCG (default spacer at www.genscript.com). The siRNA termini are both blunt or cohesive termini. The sticky end structure can be a protruding structure with a 3 'end and a protruding structure with a 5' end, and the number of protruding bases is not limited. For example, the base water may be from 1 to 8 bases, preferably from 2 to 6 bases. In addition, the siRNA can be added to a protruding portion of one end in a range where the effect of suppressing the expression of the target gene can be maintained, for example, a small RNA (for example, a natural RNA molecule such as tRNA, rRNA, ). The siRNA terminal structure does not need to have a cleavage structure on both sides, and a stem loop structure in which one terminal region of double-stranded RNA is connected by linker RNA may be used. The length of the linker is not particularly limited as long as it does not interfere with the pairing of the stem portions.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및/또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분, 뉴클레오베이스 부분 또는 인터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서, 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-아미노, 2'-티오, 또는 2'-O-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2', 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-OH 그룹을 대체하는 2'-O-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우, 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘, 2,6-디아미노퓨린(DAP, 5-메틸-2'-데옥시시티딘, 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시-유리딘(pdU), 5-(1-프로피닐)-2'-데옥시시티딘(pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테롤과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로, 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 메틸포스포네이트, 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신(PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형(염기, 당, 골격)은 몰포리노(morpholino) 타입의 변형된 핵산(몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA(펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.In addition, in an siRNA according to the invention, it is possible for the sense RNA strand and / or the antisense RNA strand to comprise at least one chemical modification in its sugar moiety, nucleobase moiety or internucleotide structure. Such modifications can make it possible to inhibit the destruction of siRNA by nuclease in vivo. All chemical modifications that can improve the stability and biocompatibility of siRNA according to the present invention in vivo are within the scope of the present invention. Of the preferred modifications to the sugar moieties, mention may be made of positions 2 ', 2'-fluoro, 2'-amino, 2'-thio, or 2'- And preferably in the presence of 2'-O-methyl replacing the normal 2'-OH group on the ribonucleotide or in the presence of methylene bridges between positions 2 'and 4' of the LNA. In the case of nucleobases, 5-bromo-uridine, 5-iodo-uridine, N3-methyl-uridine, 2,6-diaminopurine (DAP, 5-methyl-2'-deoxycytidine , Modified bases such as 5- (1-propynyl) -2'-deoxy-uridine (pdU), 5- (1-propinyl) -2'-deoxycytidine (pdC) Finally, a preferred modification of the internucleotide backbone involves the substitution of a phosphodiester group in the backbone by phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodiamidate groups. (Base, sugar, skeleton) composed of N- (2-aminoethyl) -glycine (PNA, peptide nucleic acid) linked by a peptide bond. (Base linked to morpholine ring and linked by phosphorodiamidate group) or PNA It may be coupled to the base fixed to the glycine units) - N- (2- aminoethyl) connected by a coupling.

본 발명에 따른 siRNA는 "분리된 것"이며, 이는 자연 상태에 있지 않은 것을 의미하지만 인간의 개입과 관련된 모든 수단에 의해 얻어질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 본 발명에 따른 siRNA는 화학적 합성, 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의한 요구되는 뉴클레오타이드 서열의 증폭, 또는 재조합 합성에 의해 이미 존재하는 siRNA를 정제함으로써 얻어질 수 있다.
An siRNA according to the invention is "isolated ", meaning it is not in a natural state, but means that it can be obtained by any means associated with human intervention. In particular, the siRNA according to the present invention can be obtained by chemical synthesis, amplification of the required nucleotide sequence by polymerase chain reaction (PCR), or purification of the siRNA already present by recombinant synthesis.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 ATF3 siRNA를 제작하여 가장 효율적으로 ATF3를 억제하는 siRNA를 선별하였고(도 1A 참조), 상기 siRNA는 비만성 당뇨병이 발생한 ZDF 랫드의 생체내에서도 ATF3 mRNA 및 단백질의 발현을 억제하였으며(도 1B 및 1C 참조), 본 발명의 ATF3 siRNA가 기존에 판매되는 ATF3 siRNA보다 현저한 ATF3 억제 효과를 나타내는 것을 확인함으로써(도 2A, 2B 및 3 참조), 본 발명의 ATF3 siRNA는 기존의 ATF3 siRNA보다 우수한 ATF3 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다.
In a specific example of the present invention, we constructed ATF3 siRNA to select ATF3-inhibiting siRNAs most efficiently (see FIG. 1A), and these siRNAs were also able to express ATF3 mRNA and protein in vivo in ZDF rats with obese diabetes mellitus (See FIGS. 1B and 1C), confirming that the ATF3 siRNA of the present invention exhibits a remarkable ATF3 inhibitory effect over ATF3 siRNAs sold in the past (see FIGS. 2A, 2B and 3) Showed an ATF3 inhibitory effect superior to the conventional ATF3 siRNA.

본 발명은 ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 센스 RNA 및 안티센스 RNA로 구성된 siRNA를 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing, as an active ingredient, an siRNA composed of a sense RNA and an antisense RNA specifically binding to the mRNA of the ATF3 gene.

상기 ATF3는 서열번호 9로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 센스 RNA 가닥은 서열번호 1 및 3인 것이 바람직하고 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The ATF3 preferably has the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto. The siRNA may comprise an independent sense RNA strand homologous to the target sequence and a complementary antisense RNA strand or a single RNA strand of a stem-loop structure in which the sense RNA strand and the antisense RNA strand are connected by a loop. The sense RNA strands are preferably SEQ ID NOS: 1 and 3, and the antisense RNAs are antisense RNAs represented by SEQ ID NOS: 2 and 4, but are not limited thereto.

상기 조성물은 공복혈당 및 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The composition is preferably, but not limited to, reducing the fasting blood glucose and triglyceride levels and increasing the sugar disintegration capacity.

상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증(LDL, HDL, VLDL), 고지혈증(트리글리세라이드), 면역 결핍, 암, 제2형 당뇨, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알코올성 지방간(fatty liver), 대사성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The metabolic diseases are selected from the group consisting of obesity, weight loss, diabetes, atherosclerosis, arteriosclerosis, cardiovascular disease, neurological diseases, Alzheimer's disease, cognitive disorders, oxidative stress, skin diseases, skin aging, damage by UV irradiation, hypertension, (LDL, HDL, VLDL), hyperlipidemia (triglyceride), immunodeficiency, cancer, type 2 diabetes, insulin resistance, hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver, metabolic syndrome But it is not limited thereto.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 본 발명의 ATF3 siRNA를 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may contain 0.1 to 99.9% by weight of the ATF3 siRNA of the present invention as an active ingredient based on the total weight of the composition, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.

본 발명의 ATF3 siRNA를 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases including ATF3 siRNA of the present invention may further include pharmaceutically acceptable additives. Examples of the pharmaceutically acceptable additives include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, But are not limited to, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, lactose, mannitol, sugar, arabic rubber, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropylcellulose, opaques, sodium starch glycolate, Synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol and talc. The pharmaceutically acceptable additives according to the present invention are preferably included in the composition in an amount of 0.1 to 90 parts by weight, but are not limited thereto.

본 발명에 따른 조성물은 본 발명에 따른 siRNA의 생적합성과 전달성을 향상시키는 것을 가능하게 하는 당업자에게 잘 알려진 모든 운반체를 추가로 포함할 수 있다. 특히, siRNA와 함께 사용될 수 있는 운반체는 세포막을 투과할 수 있는 리포좀 및 펩타이드("세포-투과성 펩타이드")를 포함한다.
The compositions according to the present invention may further comprise all carriers well known to those skilled in the art which make it possible to improve the biocompatibility and transmission of the siRNA according to the invention. In particular, carriers that may be used with siRNA include liposomes and peptides ("cell-permeable peptides") that are capable of permeabilizing cell membranes.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate), 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a commonly used filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant or a surfactant may be used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which may contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose lactose, or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like may also be used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions and syrups. In addition to water and liquid paraffin, which are commonly used diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives may be included. have. Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories. Examples of non-aqueous solvents and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라, 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 흉부내 또는 뇌혈관내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally according to the intended method and may be administered orally, parenterally, rectally, intravenously, muscularly, subcutaneously, intracavitally, It is preferable to select it.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.The dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease, But is not limited to. The individual dosages will specifically contain amounts in which the active drug is administered in one go.

일일 투여량은 siRNA의 양을 기준으로 0.6 내지 1.2 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.7 내지 1.1 ㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.1 ㎎/㎏이며, 하루 1회 투여되고 이때 여러 부위에 나누어 투여될 수 있다.The daily dose is 0.6 to 1.2 mg / kg, preferably 0.7 to 1.1 mg / kg, more preferably 0.8 to 1.1 mg / kg, based on the amount of siRNA, administered once a day, Can be administered separately.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
The pharmaceutical composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers.

본 발명의 구체적인 실시예에서, ATF3 유전자에 대한 억제가 비만성 당뇨병에 대해 개선효과가 있는지를 ZDF 당뇨 랫드에서 조사한 결과, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 공복혈당 및 혈장의 트리글리세라이드가 크게 감소함을 확인하였고(도 4A 및 도 4B 참조), 당분해 능력이 크게 향상됨을 확인하였으며(도 4C 참조), 인슐린에 의한 당 분해 능력이 회복됨을 확인하였다(도 4D 참조). 또한, 19주령 ZDF 랫드에 ATF3 siRNA를 주사하였을 때, 혈장 인슐린 양이 크게 증가되었고(도 4E 및 4F 참조), 췌장 베타세포의 세포사멸이 크게 감소하였으며(도 5A 참조), 이와 동일하게 ER 스트레스 관련 단백질인 CHOP, GRP78이 감소하고 당분해 효소 단백질인 글루코카이나아제 (GCK)의 감소가 회복됨을 보였고(도 5B 참조), 산화적 스트레스 마커인 iNOS 단백질 발현과 함께 NO 및 ROS 생성이 크게 감소함을 확인하였다(도 6A 및 6B 참조).In a specific example of the present invention, ZDF diabetic rats showed that inhibition of the ATF3 gene has an improving effect on obesity diabetes, indicating that fasting blood glucose and plasma triglycerides are greatly reduced in rats injected with ATF3 siRNA (See FIG. 4A and FIG. 4B), it was confirmed that the sugar-splitting ability was greatly improved (see FIG. 4C), and the glucose-decomposing ability by insulin was restored (see FIG. 4D). In addition, when ATF3 siRNA was injected into 19-week-old ZDF rats, the plasma insulin level was greatly increased (see FIGS. 4E and 4F), and the cell death of pancreatic beta cells was greatly reduced (see FIG. 5A) The relative proteins CHOP and GRP78 decreased, and the decrease in glucocorticase (GCK), the sugar protein, was restored (see FIG. 5B), and the expression of iNOS protein, an oxidative stress marker, (See FIGS. 6A and 6B).

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA의 생체 내 주입에 따른 ATF3 발현 억제를 통한 췌장베타세포의 기능 개선효과를 확인한 결과, ATF3 유전자를 직접 췌장베타세포인 INS-1 세포에 과발현 한 경우 GCK의 발현이 감소함을 확인하였다. 이와 동일하게 에탄올을 처리한 세포에서도 GCK, PDX-1 발현의 감소와 함께 인슐린 발현이 크게 감소됨을 알 수 있었다. 그러나 ATF3 siRNA를 과발현시킨 세포에 에탄올을 처리한 경우 이들 유전자들의 발현 저하를 현저히 억제함을 확인하였다(도 7A 및 7B 참조).As a result of the in vivo injection of ATF3 siRNA in rats fed with alcohol, ATF3 expression was suppressed and pancreatic beta cell function was improved. When ATF3 gene was directly overexpressed in pancreatic beta cells, INS-1 cells, expression of GCK Respectively. Similarly, in the cells treated with ethanol, the expression of GCK and PDX-1 decreased and the insulin expression was greatly reduced. However, when ethanol-treated cells were overexpressed with ATF3 siRNA, the expression of these genes was significantly inhibited (see FIGS. 7A and 7B).

또한, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우에 ATF3와 PDX-1/HDAC1/2의 결합이 저해됨으로써 PDX-1과 p300의 결합이 증가하면서 히스톤 단백질에 아세틸화가 증가되어 GCK 유전자 발현이 증가함을 확인하였다(도 7C 참조). 에탄올 섭취한 랫드는 당분해 능력이 크게 감소되고 세포사멸이 증가한 반면에, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 알코올에 의한 당분해 능력 감소가 크게 개선되었고 증가하였던 세포사멸이 크게 억제됨으로써(도 7D 및 7E 참조), 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
In addition, ATF3 and PDX-1 / HDAC1 / 2 binding was inhibited in the case of ATF3 siRNA injected rats, indicating that the binding of PDX-1 and p300 was increased and the acetylation of histone protein was increased to increase the expression of GCK gene (See FIG. 7C). In rats fed with ethanol, the sugar-degrading ability was greatly reduced and the cell death was increased, whereas in rats injected with ATF3 siRNA, the alcohol-induced decrease in sugar-degrading ability was greatly improved and the increased cell death was greatly suppressed (Figs. 7D and 7E ), And may be useful as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases.

상기 센스 RNA는 서열번호 1 및 3으로 기재되는 센스 RNA인 것이 바람직하다.Preferably, the sense RNA is the sense RNA described in SEQ ID NOS: 1 and 3.

상기 안티센스 RNA는 서열번호 2 및 4로 기재되는 안티센스 RNA인 것이 바람직하다.Preferably, the antisense RNA is the antisense RNA of SEQ ID NOS: 2 and 4.

상기 조성물은 공복혈당 및 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The composition is preferably, but not limited to, reducing the fasting blood glucose and triglyceride levels and increasing the sugar disintegration capacity.

상기 대사성 질환은 비만, 체중 감소, 당뇨병, 죽상경화증, 동맥경화증, 심혈관 질환, 신경 질환, 알츠하이머 질환, 인지 장애, 산화적 스트레스, 피부 질환, 피부 노화, UV 조사에 의한 손상, 고혈압, 고콜레스테롤혈증(LDL, HDL, VLDL), 고지혈증(트리글리세라이드), 면역 결핍, 암, 제2형 당뇨, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알코올성 지방간(fatty liver), 대사성 증후군으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The metabolic diseases are selected from the group consisting of obesity, weight loss, diabetes, atherosclerosis, arteriosclerosis, cardiovascular disease, neurological diseases, Alzheimer's disease, cognitive disorders, oxidative stress, skin diseases, skin aging, damage by UV irradiation, hypertension, (LDL, HDL, VLDL), hyperlipidemia (triglyceride), immunodeficiency, cancer, type 2 diabetes, insulin resistance, hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver, metabolic syndrome But it is not limited thereto.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 비교예에 의해 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, Experimental Examples and Comparative Examples.

단, 하기의 실시예, 실험예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 비교예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples, experimental examples and comparative examples are merely illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited by the following examples, experimental examples and comparative examples.

<< 실시예Example 1>  1> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 의 제작Production

랫드 ATF3 siRNA를 제작하기 위해 랫드 ATF3 유전자(NM_012912) 염기서열을 바탕으로 다마콘(Dharmacon) siRNA제작 프로그램을 이용하여 일차적으로 후보군 올리고 뉴클레오티드를 선정하였고, 이를 다시 ㈜코스모진텍에 의뢰를 하여 생체 내 siRNA 전달시스템에 가장 효율적으로 반응할 수 있는 서열을 상기 회사의 알고리즘에 적용하여 재분석하여 최종 4개의 후보 염기서열대로 합성하였다. siRNA의 합성은 진파마사(GenePharma co.(중국))의 주문형 합성 siRNA(custome siRNA) 서비스를 이용하였다.For the preparation of rat ATF3 siRNA, candidate oligonucleotides were firstly selected using the Dharmacon siRNA production program based on the rat ATF3 gene (NM_012912) base sequence, Sequences that can respond most efficiently to the siRNA delivery system were re-analyzed by applying to the company's algorithm and synthesized as the final four candidate sequences. The synthesis of siRNA was performed using a custom synthetic siRNA (siRNA) service of Gene Pharma (China).

그 결과, 랫드(rat) siRNA 275 및 319의 올리고(oligo) 서열을 하기의 표 1에 나타냈다.
As a result, the oligo sequences of rat siRNAs 275 and 319 are shown in Table 1 below.

ATF3-RAT-319ATF3-RAT-319
Sense(서열번호 1)Sense (SEQ ID NO: 1) 5'-CACCUUUGCCAUCGGAUGUTT-3'5'-CACCUUUGCCAUCGGAUGUTT-3 ' Antisense(서열번호 2)Antisense (SEQ ID NO: 2) 5'-ACAUCCGAUGGCAAAGGUGTT-3'5'-ACAUCCGAUGGCAAAGGUGTT-3 ' ATF3-RAT-275ATF3-RAT-275
Sense(서열번호 3)Sense (SEQ ID NO: 3) 5'-CACCUUUUGUCAAGGAAGATT-3'5'-CACCUUUUGUCAAGGAAGATT-3 ' Antisense(서열번호 4)Antisense (SEQ ID NO: 4) 5'-UCUUCCUUGACAAAAGGUGTT-3'5'-UCUUCCUUGACAAAAGGUGTT-3 ' ATF3-RAT-520ATF3-RAT-520
Sense(서열번호 5)Sense (SEQ ID NO: 5) 5'-GGAGAGUGUGAAUGCCGAATT-3'5'-GGAGAGUGUGAAUGCCGAATT-3 ' Antisense(서열번호 6)Antisense (SEQ ID NO: 6) 5'-UUCGGCAUUCACACUCUCCTT-3'5'-UUCGGCAUUCACACUCUCCTT-3 ' ATF3-RAT-651ATF3-RAT-651
Sense(서열번호 7)Sense (SEQ ID NO: 7) 5'-GGAAGACGAGAGGAACCUUTT-3'5'-GGAAGACGAGAGGAACCUUTT-3 ' Antisense(서열번호 8)Antisense (SEQ ID NO: 8) 5'-AAGGUUCCUCUCGUCUUCCTT-3'5'-AAGGUUCCUCUCGUCUUCCTT-3 ' 랫드 ATF3 mRNA (서열번호 9)Rat ATF3 mRNA (SEQ ID NO: 9) AAGTGTCTACCTTGACAGGTGGGGTGGGACCACGTCCTCCACTGCGGCTGACAACATCCCTCCTAGGGAAGATGGAGTGAGAACATTCATCATTGAAGTTGTCCAATGGCCAGGGTATGCTTTCTAGAAACTATGCTGTTCTGTCCTAGACTGACTGTGCATAGGGCATTCATTTCTGAGCCTGGTGTTGTGCTATTTAGATGTTTGTCTTGCACAACATTGGCGTGATTTTTTTCCGGGAGTTTCATCAGACCTGATTTCCGAGAGTTTGGGGGTCTGCCACTGTGGACAATATCCCCCAAAAGTGTTTGGGTGGCCATGTAAACTGGCTGATGACCAGCTGTGCTACTCTGTGCTGACCGAGGACTGATGCCTCCTTCCCCTGTACCCACTGCTGAGGAAGAACCCGGGCACAGCAGCTGTCCTTGGCTACAAACTGTTACAATGTCACAGAACGAAGGCACAAAGTCCCGCTTTCAAAGGGCGTAGGACTCCACACTCAGTGACAGGGCAGGAAGAGCCAAGGATTCTCCGTTTTCCCTTCCTTCCCACCAAAAACCACAGCCCGTGGAGACTGGTATTTGAAGCCAGGAGTGGGGCAAGGAAGGTGTCTGCACTGTGGGATGTTAACTGCGCTTTTGTCTTGAAGCTATTTTGAGATGCGGTCCAGAGTATTTCAGCTGGGAGGTCCCTCCCACTGGCCACCAGGGCTCTGGCTACTGTTAAAATTCTGATGTTTCTGTGAAATCCTCAGTGTTCAATCCGACTCAGTAGTATATTACAGTTTTCTGTAAGAGAGAACGTTACTTATTTATCCCAGTATTCCTAGCCTGTCAACGTAATAAAATATCAGAATGAGACCTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3' AAGTGTCTACCTTGACAGGTGGGGTGGGACCACGTCCTCCACTGCGGCTGACAACATCCCTCCTAGGGAAGATGGAGTGAGAACATTCATCATTGAAGTTGTCCAATGGCCAGGGTATGCTTTCTAGAAACTATGCTGTTCTGTCCTAGACTGACTGTGCATAGGGCATTCATTTCTGAGCCTGGTGTTGTGCTATTTAGATGTTTGTCTTGCACAACATTGGCGTGATTTTTTTCCGGGAGTTTCATCAGACCTGATTTCCGAGAGTTTGGGGGTCTGCCACTGTGGACAATATCCCCCAAAAGTGTTTGGGTGGCCATGTAAACTGGCTGATGACCAGCTGTGCTACTCTGTGCTGACCGAGGACTGATGCCTCCTTCCCCTGTACCCACTGCTGAGGAAGAACCCGGGCACAGCAGCTGTCCTTGGCTACAAACTGTTACAATGTCACAGAACGAAGGCACAAAGTCCCGCTTTCAAAGGGCGTAGGACTCCACACTCAGTGACAGGGCAGGAAGAGCCAAGGATTCTCCGTTTTCCCTTCCTTCCCACCAAAAACCACAGCCCGTGGAGACTGGTATTTGAAGCCAGGAGTGGGGCAAGGAAGGTGTCTGCACTGTGGGATGTTAACTGCGCTTTTGTCTTGAAGCTATTTTGAGATGCGGTCCAGAGTATTTCAGCTGGGAGGTCCCTCCCACTGGCCACCAGGGCTCTGGCTACTGTTAAAATTCTGATGTTTCTGTGAAATCCTCAGTGTTCAATCCGACTCAGTAGTATATTACAGTTTTCTGTAAGAGAGAACGTTACTTATTTATCCCAGTATTCCTAGCCTGTCAACGTAATAAAATATCAGAATGAGACCTGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 '

<< 실시예Example 2>  2> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 선별 Selection

<2-1> 세포주의 형질감염<2-1> Transfection of cell line

상기 실시예 1에서 제조된 ATF3 siRNA가 췌장 베타세포(pancreatic β-cells), 간세포(hepatocytes), 섬유아세포(fibrobalst), 신장세포(kidney mesangial cells) 등에서 ATF3 단백질을 효과적으로 억제하는지를 확인하기 위하여 이를 상기 세포에 형질감염시켰다.To confirm whether ATF3 siRNA prepared in Example 1 effectively inhibited ATF3 protein in pancreatic beta-cells, hepatocytes, fibroblasts, kidney mesangial cells and the like, Cells were transfected.

siRNA를 준비하는 단계로서 각 바이알(vial)을 스핀다운(spin down)하고 ATF3 siRNA 275 및 319를 125 ㎕의 RNAse가 없는 물(RNAse free water)에 녹여 20 μM이 되도록 한다. 음성대조군 siRNA(negative control siRNA)를 62.5 ㎕의 RNAse가 없는 물에 녹여 20 μM이 되도록 한다.To prepare the siRNA, each vial is spun down and the ATF3 siRNAs 275 and 319 are dissolved in 125 μl of RNAse free water to 20 μM. Negative control siRNA (negative control siRNA) is dissolved in 62.5 μl RNAse-free water to 20 μM.

siRNA를 일시적으로 형질감염시키기 위하여, MIN6N8, INS-1, HepG2, 3T3L1 및 MES-13 세포에 리포펙타민 RNAiMAX(lipofectamine)(Invitrogen)를 사용하였다. 구체적으로, siRNA 형질감염 시키기 하루 전에 항생제가 없는 배지로 60 mm 세포 배양 플레이트에 30-50% 세포 밀도가 되도록 깔고 세포배양기(37℃, 5% CO₂)에서 배양한다. 형질감염시키는 당일에, 각각의 혈청(serum)없는 500 ㎕의 OPTI-MEM 배지에 6.25 ㎕의 본 발명의 siRNA duplex를 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 손가락으로 툭툭 치면서(tapping) 섞는다.To transiently transfect siRNA, lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) was used in MIN6N8, INS-1, HepG2, 3T3L1 and MES-13 cells. Specifically, the cells were cultured in a cell culture incubator (37 ° C, 5% CO ₂ ) with a 30-50% cell density on a 60 mm cell culture plate with an antibiotic-free medium one day before siRNA transfection. On the day of transfection, add 6.25 [mu] l of the siRNA duplex of the invention to a 1.5 ml tube in 500 [mu] l of OPTI-MEM medium without serum, tap and mix.

볼텍스(voltex)로 섞어준 리포펙타민 RNAiMAX에서 5 ㎕를 취하여 상기 각각의 1.5 ㎖ 튜브에 넣고 섞은 후(tapping) 상온에서 15분간 반응시킨다. 따라서, 최종 siRNA 농도는 50 nM이 되고, siRNA duplex-lipofectamine RNAiMax 복합체를 준비된 세포에 넣고 잘 섞는다. 37℃에서 48시간 동안 배양 후, 세포를 회수하여 RNA 및 단백질을 추출하여 RT-PCR 또는 웨스턴블랏을 실행하였다. 특히, ATF3는 정상세포에서 거의 발현을 하지 않으므로 siRNA로 형질감염시킨 후 24시간째에 TNF-α(20 ng/ml)를 처리하여 발현을 유도하였다.
5 μl of lipofectamine RNAiMAX mixed with vortex is added to each 1.5 ml tube, tapping and allowed to react at room temperature for 15 minutes. Thus, the final siRNA concentration is 50 nM and the siRNA duplex-lipofectamine RNAiMax complex is added to the prepared cells and mixed well. After culturing at 37 DEG C for 48 hours, the cells were recovered and RNA and protein were extracted and subjected to RT-PCR or Western blotting. In particular, ATF3 was not expressed in normal cells. Therefore, expression was induced by treatment with TNF-α (20 ng / ml) at 24 hours after transfection with siRNA.

<2-2> <2-2> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 에 의한 On by ATF3ATF3 발현 확인 Confirmation of expression

상기 실시예 <2-1>에서 형질감염시킨 ATF3 siRNA(siRNA 275, siRNA 319, siRNA 520 및 siRNA 651)가 ATF3를 억제하는지 여부를 확인하기 위하여, 세포를 배양용기에 하루밤 동안 키운 다음 리포펙타민 RNAiMAX 키트(Invitrogen, USA)을 이용하여 사용자설명서에 따라 ATF3 siRNA를 형질감염시킨 후 24시간 동안 37℃ 이산화탄소배양기에서 배양 후 세포를 모아 단백질을 분리하였다. 폴리아크릴 아마이드 단백질 분리 겔을 제작한 다음 여기에 단백질(30 μg 씩)을 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 후 겔 상에서 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 이동을 시킨 다음 5% 스킴 밀크 (Skim Milk)를 함유한 PBS에서 안정화를 시킨 후 ATF3 또는 튜블린(tublin; Santacruz, USA) 항체를 상기 용액에 1:1,000의 농도로 희석하여 4℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음으로 0.1% Tween PBS 용액으로 10분씩 3 회 세척한 후 HRP-conjugated anti-mouse IgG 또는 항-래빗 IgG 항체를 1:5,000으로 PBS에 있는 5% 탈지분유(Skim Milk)에 희석하여 상온에서 한 시간 배양하였다. 다음으로 0.1% Tween PBS 용액으로 10분씩 3회 세척한 후 ECL 용액(Santacruz, USA)에 반응 후 형광의 세기를 X-ray 필름(Kodak, USA)상에 현상하였다. To confirm whether or not ATF3 siRNA (siRNA 275, siRNA 319, siRNA 520 and siRNA 651) transfected in Example <2-1> suppressed ATF3, cells were grown in a culture vessel overnight, and then lipofectamine ATF3 siRNA was transfected using an RNAiMAX kit (Invitrogen, USA) according to the manufacturer's instructions, and then cultured in a 37 ° C carbon dioxide incubator for 24 hours. The polyacrylamide protein separation gel was prepared and then the protein (30 μg each) was electrophoresed. After electrophoresis, proteins were transferred to PVDF (polyvinylidene fluoride) membrane on gel, stabilized in PBS containing 5% skim milk, and incubated with ATF3 or tublin (Santacruz, USA) The solution was diluted to a concentration of 1: 1,000 and cultured at 4 占 폚 overnight. After washing with 0.1% Tween PBS solution for 3 minutes each, HRP-conjugated anti-mouse IgG or anti-rabbit IgG antibody was diluted 1: 5,000 in 5% skim milk in PBS. Time. Then, the cells were washed three times with 0.1% Tween PBS solution for 10 minutes, and then the fluorescence intensity was developed on an X-ray film (Kodak, USA) after ECL solution (Santacruz, USA).

그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 상기 모든 세포에서 ATF3 단백질 발현이 가장 효율적으로 억제된 것은 랫드(rat) siRNA 275 및 319임이 확인되었다(도 1A).
As a result, as shown in Fig. 1A, it was confirmed that the expression of ATF3 protein was most efficiently suppressed in all of the above cells as rat siRNAs 275 and 319 (Fig. IA).

<< 실시예Example 3>  3> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 생체 내  In vivo ATF3ATF3 유전자 발현 억제 확인 Confirmation of gene expression inhibition

<3-1> <3-1> ZDFZDF 랫드에서In the rats ATF3ATF3 siRNAsiRNA 의 생체 내 전달In vivo delivery

상기 실시예 2에서 선별한 siRNA가 생체 내에서 동일한 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, ZDF 랫드에 생체 내 jetPEI^TM를 사용하여 ATF3 siRNA를 랫드에 주사하였다. ZDF 랫드는 비만을 동반한 당뇨발생 랫드로서 6주령이면 당뇨 전단계인 고혈당, 고인슐린 현상이 나타나고 10주령 이후에는 당뇨로 진입을 하게 되고 19주 후부터는 당뇨 이후 단계에 해당 되어 대사기능이 심하게 감소 되는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 상기 랫드가 주령에 따라 췌장에서 인슐린의 합성 및 생산능력의 감소와 더불어 이에 대한 신호경로의 변화에 따른 당뇨병 발생의 주원인이 될 수 있는 ATF3 단백질의 기능제어를 통하여 당뇨병 발생을 제어할 수 있는지에 대한 가능성을 확인하고자 하였다.To confirm whether the siRNA screened in Example 2 exhibited the same effect in vivo, ATF3 siRNA was injected into rats using in vivo jetPEI ^™ in ZDF rats. ZDF rats are diabetic rats with obesity. At 6 weeks of age, hyperglycemia and hyperinsulinemia, which precede diabetes, appear at 10 weeks of age, and diabetes mellitus after 19 weeks of age. It is known. The present invention can control the occurrence of diabetes by controlling the function of ATF3 protein, which is a main cause of diabetes mellitus according to changes in signal pathway of insulin synthesis and production ability in the pancreas, And to determine the possibility of

폴리플러스 트랜스펙션 TM(Polyplus transfection TM)의 생체내 jetPEI^TM siRNA 운반 시약(in vivo-jetPEI^TM siRNA delivery reagent)를 사용하였다. 생체내 jetPEI^TM은 생체내에 핵산(DNA, shRNA, siRNA 및 onucleotides 등)들을 효율적으로 전달하는데 사용되는 선형의 폴리에틸레이민(linear polyethylenimine, PEI)으로서 독성이 매우 낮은 것으로 알려져 있다. 생체내 jetPEI^TM 은 핵산을 정맥주사(intravenous, i.v.), 복강내주사(intraperitoneal, i.p.), 심장내주사(intracardiac), 종양내 화학요법(intratumoral), 피하주사(sub-cutaneous) 등의 다양한 방법으로 조작으로 전달할 수 있는 효율적인 방법이다. The in vivo jetPEI ^TM of Polyplus transfection (TM) siRNA delivery reagents (in vivo-jetPEI ^TM siRNA delivery reagent) was used. In vivo, jetPEI ^™ is a linear polyethylenimine (PEI) that is used to efficiently deliver nucleic acids (DNA, shRNA, siRNA, and onucleotides) in vivo. In vivo, jetPEI ^™ can be prepared by a variety of methods including intravenous (iv), intraperitoneal (ip), intracardiac, intratumoral, sub-cutaneous As shown in FIG.

폴리에틸레이민(PEI)은 폴리-L-라이신(Poly-L-Lysine)의 개발 이후에 개발된 두 번째 중합과발현 전달물질이다. PEI는 DNA를 양성전극을 가진 입자로 응축을 하여 음성전극을 가진 세포 표면 잔기에 쉽게 결합을 하여 세포흡수작용(Endocytosis)을 통해 세포 안으로 전달하게 한다. Polyethylenimine (PEI) is the second polymer over-expressing substance developed after the development of Poly-L-Lysine. PEI condenses DNA into particles with positive electrodes, allowing them to bind easily to cell surface residues with negative electrodes and deliver them into cells via endocytosis.

구체적으로, 합성된 ATF3 siRNA(#275 및 #319)는 21 bp로 이루어져 있고 1 OD는 약 33.2 ㎍에 해당되므로, 1 OD 기준으로 125 ㎕의 DEPC가 처리된 물에 siRNA를 녹이면 약 20 μM의 최종 농도가 된다. 랫드 한 마리당 150 ㎍의 siRNA를 3일 간격으로 1회씩 총 6번의 정맥 주사한 후 1 내지 2주 동안 유지하였다. Specifically, the synthesized ATF3 siRNA (# 275 and # 319) consist of 21 bp and 1 OD corresponds to about 33.2 μg. Therefore, if siRNA is dissolved in 125 μl of DEPC-treated water on an OD basis, about 20 μM The final concentration becomes. 150 ㎍ of siRNA per rat were injected intravenously every 6 days, once every 3 days, and then maintained for 1 to 2 weeks.

ATF3 siRNA 주사방법으로서, 하기의 단계에 따라 수행하였다.As the ATF3 siRNA injection method, the following steps were performed.

1) 250 ㎕의 멸균된 물로 150 ㎍의 siRNA를 녹이고 250 ㎕의 10% 글루코오스 용액을 첨가하여 최종 500 ㎕ (5% 글루코오스)가 되도록 섞어준 후 스핀다운(spin down)한다. 1) Dissolve 150 μg of siRNA in 250 μl of sterilized water, add 250 μl of 10% glucose solution, mix to final 500 μl (5% glucose), and spin down.

2) 226 ㎕의 멸균된 물에 24 ㎕의 생체내-jetPEI 시약을 넣고 여기에 250 ㎕의 10% 글루코오스 용액을 첨가하여 최종 500 ㎕(5% 글루코오스)가 되도록 섞어준 후 스핀다운(spin down)한다. 2) Add 24 μl of in vivo-jetPEI reagent to 226 μl of sterilized water, add 250 μl of 10% glucose solution to the final 500 μl (5% glucose), and spin down. do.

3) 상기 1)과 2)가 완성이 되면 양쪽을 잘 섞고 스핀다운(spin down)한 후 상온에서 15분간 반응시킨다.3) When the above 1) and 2) are completed, both sides are well mixed and spin down and reacted at room temperature for 15 minutes.

4) 반응이 끝난 후, 즉시 각각의 랫드 1마리당 1 ㎖씩 정맥주사(반복 주사도 가능함)를 한다.4) Immediately after the reaction is completed, intravenously (repeated injections are possible) immediately with 1 ml per each rat.

5) 3일 간격으로 하루에 한 번씩 6회 주사한 후, 각 장기(간, 췌장, 신장 등)에서 ATF3 발현의 저하를 확인한다.
5) After 6 injections once a day at intervals of 3 days, the decrease of ATF3 expression is confirmed in each organ (liver, pancreas, kidney, etc.).

<3-2> <3-2> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리된  Treated 랫드에서In the rats ATF3ATF3 mRNAmRNA 발현 억제 확인 Confirmation of expression inhibition

상기 실시예 <3-1>의 방법으로 ZDF 랫드의 생체 내로 전달된 ATF3 siRNA가 ATF3 유전자 발현을 억제하는지 확인하였다. mRNA는 랫드의 폐, 간, 췌장 조직 및 쥐의 췌장에서 분리한 소도세포로부터 분리를 한 후 이를 역전사 효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA로 전환을 시킨 후 상기 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 랫드 ATF3 (NM_012912)에 대한 프라이머 (primer)의 염기서열은 Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3’(서열번호 10)와 Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3’(서열번호 11)을 사용하였다. PCR은 조건은 (94℃-55℃-72℃)로 30 사이클(Cycle)로 수행하였다. 수행한 후 1% agarose 겔에 전기영동한 후 UV상에서 밴드를 확인하고 이에 대한 밴드 세기를 정량화하여 그래프화 하였다.It was confirmed by the method of Example <3-1> that ATF3 siRNA delivered in vivo of ZDF rat inhibits ATF3 gene expression. mRNA was isolated from the lung, liver, pancreas tissue and rat pancreas of the rat, and transformed into cDNA using a reverse transcriptase (Invitrogen, USA), followed by PCR using the cDNA as a template Respectively. Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3 '(SEQ ID NO: 10) and Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3' (SEQ ID NO: 11) were used for the base sequence of the primer for rat ATF3 (NM_012912). The PCR was performed under the conditions of (94 ° C-55 ° C-72 ° C) for 30 cycles. After performing the electrophoresis on a 1% agarose gel, the band was identified on the UV, and the intensity of the band was quantitated and plotted.

그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이 당뇨병 랫드의 폐(Lung) 및 간(Liver)에서 각각 ATF3의 mRNA 및 단백질의 발현이 현저히 저해되고(도 1B), 도 1C에 나타낸 바와 같이, 췌장조직(Pancreas tissues) 및 분리한 소도세포(islet cells)에서도 각각 ATF3의 mRNA 및 단백질의 발현이 현저히 저해됨을 확인할 수 있었다(도 1C).
As a result, as shown in Fig. 1B, the expression of mRNA and protein of ATF3 was significantly inhibited in the lungs and liver of diabetic rats (Fig. 1B), and the pancreatic tissue (Pancreas tissues) and isolated islet cells were significantly inhibited the expression of mRNA and protein of ATF3 (Fig. 1C).

<< 비교예Comparative Example 1> 기존에 판매되는  1> Previously sold ATF3ATF3 siRNAsiRNA 와 본 발명의 And ATF3ATF3 siRNAsiRNA 비교 compare

<1-1> <1-1> ATF3ATF3 mRNAmRNA 발현억제 효과 비교 Comparison of inhibition of expression

상기 실시예 1에서 선별된 본 발명의 ATF3 siRNA와 기존에 시판되는 산타크루즈사(Santacruz Biotech; sc-72029)의 제품 및 퀴아젠사(QIAGEN)에서 주문 합성한 센스(sense) 5'-AGUCAGUUACCGUCAACAA-3' (서열번호 12) 및 안티센스(antisense) 5'-UUGUUGACGGUAACUGACU-3' (서열번호 13) ATF3 siRNA를 이용하여 ATF3 유전자 발현 억제 효과를 비교하기 위하여 RT-PCR을 수행하였다. 구체적으로, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 각 바이알(vial)을 스핀다운(spin down)하고 ATF3 siRNA를 330 ㎕의 RNAse가 없는 물(RNAse free water)에 녹여 10 μM이 되도록 한다. 대조군 siRNA(control siRNA)를 66 ㎕의 RNAse가 없는 물에 녹여 10 μM이 되도록 준비하여 상기 실시예 <2-1>의 방법으로 형질감염을 수행하였고, 이때 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 12.5 ㎕를 사용한 후, 상기 실시예 <3-2>의 방법을 사용하여 확인하였다. 세포나 조직으로부터 추출한 2 ㎍ RNA에 DNA분해효소를 넣어 DNA를 완전히 제거한 후 EDTA 용액을 넣어 반응을 종결시켰다. RNA의 순수도를 확인하기 위해 아가로우즈 겔에 반응샘플 3 ㎕를 전기영동하여 확인하고 스펙트로 포토미터기기를 이용하여 OD₂₆₀에서 RNA 정량을 하였다. 정량한 RNA 1-2 ㎍에 DEPC가 든 물을 15 ㎕가 되게 채우고 이에 0.5 ㎕의 10 μM 프라이머를 넣고 70℃에서 10분간 가열한 후 얼음위에서 식히고 간단히 원심분리하였다. 역전사반응 용액(5 x RT 버퍼, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 믹스, RNAsin, Superscript II)을 제조하여 0.2 ㎖ PCR 튜브에 든 RNA 샘플에 9.5 ㎕씩 분주를 하여 PCR 기계에 넣고 18℃ 5분, 42℃ 90분, 50℃ 10분, 70℃ 10분 반응을 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 2 ㎕에 10 x PCR 버퍼, 25 mM MgCl_{2 ,} 10 mM dNTPs, 10 μM 프라이머 1/2, Taq DNA 중합효소, 증류수를 넣어 총 50 ㎕로 만들어 94℃ 2분 x 1회, 94℃ 30초 - 55℃ 30초 - 72℃ 2분 x 30회, 72℃ 5분 x 1회로 PCR 반응을 시키고 4℃로 식힌다. PCR 반응물 25 ㎕를 1% 아가로우즈 겔에서 전기영동을 하여 UV 램프 상에서 확인하였다. 사용한 랫드 ATF3에 대한 프라이머는 Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3’(서열번호 10)와 Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3’(서열번호 11)을 사용하였다. The 5'-AGUCAGUUACCGUCAACAA-AUCAAA-S synthesized from the commercially available ATF3 siRNA of the present invention selected in Example 1 and a commercially available product of Santa Cruz Biotech (sc-72029) and QIAGEN, RT-PCR was performed in order to compare ATF3 gene expression inhibitory effects using ATF3 siRNA (SEQ ID NO: 12) and antisense 5'-UUGUUGACGGUAACUGACU-3 '(SEQ ID NO: 13) Specifically, the siRNAs from Santa Cruz and Quiagen are spun down each vial and the ATF3 siRNA is dissolved in 330 μl of RNAse-free water to make 10 μM. Control siRNA (control siRNA) was dissolved in 66 μl of RNAse-free water to prepare 10 μM, and transfection was carried out by the method of Example <2-1>. The siRNAs of Santa Cruz and Quiagen were 12.5 Mu] l, and confirmed using the method of Example <3-2> above. The DNA was completely removed from 2 ㎍ RNA extracted from cells or tissues, and EDTA solution was added to terminate the reaction. To confirm the purity of the RNA, 3 μl of the reaction sample was confirmed by electrophoresis on agarose gel, and RNA was quantified at OD ₂₆₀ using a spectrophotometer. To 1-2 μg of the quantified RNA, 15 μl of DEPC water was added, and 0.5 μl of 10 μM primer was added. The mixture was heated at 70 ° C for 10 minutes, cooled on ice and briefly centrifuged. (5 x RT buffer, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP mix, RNAsin, Superscript II) were prepared and added to the RNA samples in 0.2 ml PCR tubes in an amount of 9.5 μl. CDNA was synthesized by reacting at 42 ° C for 90 minutes, 50 ° C for 10 minutes, and 70 ° C for 10 minutes. To 2 μl of the synthesized cDNA was added 10 μl of PCR buffer, 25 mM MgCl _{2 ,} 10 mM dNTPs, 10 μM primer 1/2, Taq DNA polymerase and distilled water to make a total of 50 μl. 30 sec - 55 ℃ 30 sec - 72 ℃ 2min 30min, 72 ℃ 5min x 1 PCR reaction and cool to 4 ℃. 25 [mu] l of PCR reaction was electrophoresed on 1% agarose gel and confirmed on UV lamp. Forward: 5'-CTCTAGCCGCTCTCTGGACC-3 '(SEQ ID NO: 10) and Reverse: 5'-CGGCATTCACACTCTCCAGT-3' (SEQ ID NO: 11) were used as primers for the used rat ATF3.

그 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA와 비교하여 본 발명의 siRNA 275 및 319가 ATF3 mRNA를 더욱 현저히 억제하는 것을 확인하였다(도 2A 참조).
As a result, as shown in Fig. 2A, it was confirmed that the siRNAs 275 and 319 of the present invention suppress the ATF3 mRNA more remarkably as compared with the siRNAs of Santa Cruz and Quiagen (see Fig. 2A).

<1-2> <1-2> ATF3ATF3 단백질 발현억제 효과 비교 Comparison of inhibition of protein expression

상기 비교예 <1-1>과 동일한 방법으로 각각 본 발명의 siRNA, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA를 INS-1 세포에 형질감염시키고 24시간 후, 20 ng/㎖의 TNF-α을 24시간 동안 처리하고 RNA 또는 단백질을 분리하여 웨스턴블랏을 수행하였다.The INS-1 cells were transfected with the siRNA of the present invention, the Santa Cruz strain and the quasiagen siRNA in the same manner as in the above Comparative Example <1-1>, and after 24 hours, 20 ng / ml of TNF- And Western blotting was performed by separating RNA or protein.

그 결과, 도 2B에 나타낸 바와 같이, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA와 비교하여 본 발명의 siRNA 275 및 319가 ATF3 단백질을 더욱 현저히 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 이들의 억제효과는 기존의 상업적으로 시판되는 siRNA보다 더 높은 것으로 확인되었다(도 2 ).
As a result, as shown in Fig. 2B, it was confirmed that the siRNAs 275 and 319 of the present invention suppress the ATF3 protein more remarkably as compared with the siRNAs of Santa Cruz and Quiagen. Thus, their inhibitory effect was found to be higher than that of commercially available siRNAs (Fig. 2).

<1-3> <1-3> siRNAsiRNA 농도에 따른 발현억제 효과 비교 Comparison of inhibitory effect on expression by concentration

선택한 랫드 siRNA 275 및 319의 특이적 발현 저하 효과를 더욱 확인하기 위하여, 각 제품들을 농도별로 형질감염시킨 후 상기 비교예 <1-2>와 동일한 방법으로 효과를 비교하였다. 이때, 효과의 민감도를 보기 위하여, 산타크루즈사 및 퀴아젠사의 siRNA는 25, 50 nM로, 본 발명의 랫드 siRNA 275 및 319는 기존 제품들보다 농도를 반으로 줄여 12.5, 25 nM를 형질감염시켰다. 24시간 후 20 ng/㎖의 TNF-α을 24시간 동안 처리한 후 단백질을 분리하여 웨스턴블랏을 수행하였다.In order to further confirm the effect of reducing the expression of selected siRNAs 275 and 319, the effect of each product was examined in the same manner as in Comparative Example 1-2 after transfection of each product by concentration. At this time, in order to see the sensitivity of the effect, the siRNAs of Santa Cruz and Quiagen were 25, 50 nM, and the siRNAs 275 and 319 of the present invention were transfected with 12.5, 25 nM by reducing the concentration by half compared with the existing products . Twenty-four hours later, 20 ng / ml of TNF-α was treated for 24 hours, followed by Western blotting.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, TNF-α에 의해 증가한 ATF3의 단백질 발현을 산타크루즈사 및 퀴아젠사와 비교한 결과, 본 발명의 ATF3 siRNA 275 및 319에 의한 ATF3 단백질 발현 저하가 더 큰 것으로 확인되었다(도 3).
As a result, as shown in Fig. 3, the protein expression of ATF3 increased by TNF-α was compared with that of Santa Cruz and Qiagen. As a result, ATF3 siRNA 275 and 319 of the present invention showed a greater decrease in ATF3 protein expression (Fig. 3).

<< 실험예Experimental Example 1>  1> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리된 당뇨  Treated diabetes 랫드Rat 모델에서 대사기능 저해 Inhibition of metabolism in models

<1-1> 혈당변화 확인<1-1> Confirmation of blood sugar change

ATF3 유전자에 대한 억제가 비만성 당뇨병에 대해 개선효과가 있는지를 조사하기 위하여, 랫드의 혈당 내 글루코오스 양을 조사하였다.To investigate whether the inhibition of ATF3 gene has an improving effect on obesity diabetes, the amount of glucose in the blood of rats was examined.

상기 실시예 <3-1>과 동일하게 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다. 상기 ATF3 siRNA-319를 1회(single) 주사(급성)를 한 경우와 6회 주사(만성)한 랫드에서 공복혈당에 미치는 효과를 비교확인하기 위해서, ATF3 siRNA-319를 주사한 후 19주까지 랫드에게 먹이를 유지시키고, 희생되기 하루 전에 먹이를 중단시킨 후(16시간) 다음날 아침에 포도당 측정기(glucometer DEX(Bayer))를 사용하여 혈당을 측정하였다. ATF3 siRNA-319 was injected into the tail vein of a ZDF rat in the same manner as in Example <3-1> above. In order to compare the effect of ATF3 siRNA-319 on single-injection (acute) and 6-injection (chronic) rats on fasting glucose, ATF3 siRNA-319 was injected, The rats were kept prey and the food was stopped one day before sacrifice (16 hours) and the following morning the blood glucose was measured using a glucometer DEX (Bayer).

그 결과, 도 4A에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA-319를 6회 주사한 랫드에서 공복혈당이 크게 감소됨을 확인하였다(도 4A).
As a result, as shown in Fig. 4A, fasting blood glucose was significantly reduced in rats injected with ATF3 siRNA-319 6 times (Fig. 4A).

<1-2> <1-2> 트리글리세리드Triglyceride 양의 변화 확인 Confirmation of change in quantity

랫드 혈장(plasma) 내 트리글리세리드(plasma triglyceride) 양을 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>과 동일하게 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다.ATF3 siRNA-319 was injected into the tail vein of a ZDF rat in the same manner as in Example <3-1> to examine the amount of plasma triglyceride in the rat plasma.

상기 실험예 <1-1>과 동일하게 실험하되, 랫드를 희생시키고 얻은 혈장에서 간지방축적의 마커로서 활용되는 트리글리세라이드(triglyceride(Tg))의 양을 트리글리세라이드 시약 키트(Infinity Triglyceride reagent kit(Thermo Scientific))를 사용하여 제조사의 프로토콜과 동일한 방법으로 수행하였다.Experiments were carried out in the same manner as in Experimental Example 1-1 except that the amount of triglyceride (Tg) used as a marker of hepatic fat accumulation in the plasma obtained by sacrificing the rats was measured using the Infinity Triglyceride reagent kit ( Thermo Scientific) in the same manner as the manufacturer's protocol.

그 결과, 도 4B에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA-319를 6회 주사를 한 랫드에서 혈장의 트리글리세라이드가 크게 감소됨을 나타냈다(도 4B).
As a result, as shown in Fig. 4B, the plasma triglyceride was significantly reduced in rats injected with ATF3 siRNA-319 six times (Fig. 4B).

<1-3> <1-3> 내당능Glucose tolerance 및  And 당분해Sugar 변화 확인 Confirm change

랫드의 내당능 및 당분해능을 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>의 동일한 방법으로 ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사를 하였다. ATF3 siRNA-319 was injected into the tail vein of a ZDF rat in the same manner as in Example <3-1> above to examine the glucose tolerance and glucose degradation ability of the rat.

상기 실험예 <1-1>과 동일하게 실험하되, 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 제한한 후 내당능 검사를 하기 위하여, 랫드 1kg당 1.5 g의 글루코오스(glucose)를 각각의 랫드 복강에 주사를 한 후 30분, 60분 및 120분에 혈당을 측정하였고(GTT 측정), 당분해 능력을 확인하기 위하여 랫드 1kg당 2 IU의 인슐린을 복강에 주사한 후 30분, 60분 및 120분에 혈당을 측정하였다(ITT(인슐린 민감도)측정). Experiments were carried out in the same manner as in Experimental Example 1-1. In order to test glucose tolerance after sacrificing the rats, 1.5 g of glucose per kg of the rats was injected into each rat peritoneal cavity Blood glucose was measured at 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes (GTT measurement), and 2 IU of insulin per kg of the rat was injected into the abdominal cavity to confirm the glucose tolerance and blood glucose was measured at 30 minutes, 60 minutes, and 120 minutes (ITT (insulin sensitivity) measurement).

그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 감소되었던 당분해 능력이 ATF3 siRNA-319를 주사한 랫드에서 크게 향상되었고(도 4C), 도 4D에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 인슐린에 의한 당 분해 능력이 감소되었지만, ATF3 siRNA를 주사한 ZDF 당뇨 랫드에서는 인슐린에 의한 당 분해 능력이 회복됨을 확인하였다(도 4D).
As a result, as shown in Fig. 4C, the sugar-decomposing ability greatly reduced in the ZDF diabetic rats was greatly improved in the rats injected with ATF3 siRNA-319 (Fig. 4C) (Fig. 4D). However, in the ZDF diabetic rats injected with ATF3 siRNA, the ability of glucose degradation by insulin was restored (Fig. 4D).

<1-4> 인슐린 민감도 및 인슐린 양 변화 확인<1-4> Identification of Insulin Sensitivity and Insulin Level Change

ZDF 랫드는 6주(당뇨 전단계)를 거쳐 10주(당뇨)를 거치면서 고혈당, 고인슐린 증상이 나타나고 인슐린 저항증이 오게됨으로써 당분해 능력이 떨어지는 것으로 알려져 있다. 그러나 ZDF 랫드 19주령의 경우에 고혈당 현상은 더욱 심화되어 있지만 췌장베타세포에서의 기능저하와 세포사멸에 의해 인슐린 합성이 적어지고 분비량이 적어지면 혈장의 인슐린 양이 적어지는 것으로 알려져 있다. ZDF rats are known to have high glycemic and hyperinsulinemic symptoms through 10 weeks (diabetes) through 6 weeks (pre-diabetic), and insulin resistance increases, resulting in decreased ability of sugar disinfection. However, although the hyperglycemia is further intensified at the age of 19 weeks in ZDF rats, it is known that insulin synthesis is reduced due to impaired function and cell death in pancreatic beta cells, and insulin amount in plasma decreases as the secretion amount decreases.

이에 ATF3 siRNA를 주사한 후 췌장베타세포의 인슐린 합성 및 분비 기능이 개선되는지를 확인하기 위하여, 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 상기 실험예 <1-1>에서 실시한 동일한 방법으로 혈장 내 인슐린 양을 측정하였다. In order to confirm whether the insulin synthesis and secretion function of pancreatic beta cells improved after injection of ATF3 siRNA, the amount of insulin in plasma was measured in a 19-week-old ZDF diabetic rat by the same method as in Experimental Example 1-1 .

그 결과, 도 4E 및 4F에 나타낸 바와 같이, 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 혈장 인슐린 양이 크게 감소하였으나 ATF3 siRNA를 6회 주사한 19주령 ZDF 당뇨 랫드에서 혈장 인슐린 양이 크게 증가됨을 확인하였다(도 4E 및 4F).As a result, as shown in FIGS. 4E and 4F, plasma insulin levels were significantly decreased in 19-week-old ZDF diabetic rats, but plasma insulin levels were significantly increased in 19-week-old ZDF diabetic rats injected with ATF3 siRNA six times And 4F).

결론적으로, 본 발명의 ATF3 siRNA에 의한 ATF3 유전자 발현 감소를 통하여 비만성 당뇨병 발생 시 증가되었던 인슐린 저항증을 통한 당 분해 능력 감소를 크게 개선시켰고, 췌장베타세포에서의 인슐린생성 및 ATP 생성 감소와 같은 기능저하가 크게 개선됨을 확인하였다.
In conclusion, the reduction of ATF3 gene expression by the ATF3 siRNA of the present invention greatly improved the reduction of glucose degradation through increased insulin resistance during the development of obesity diabetes, and decreased insulin production and ATP production in pancreatic beta cells It was confirmed that the functional deterioration was greatly improved.

<< 실험예Experimental Example 2>  2> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 에 처리한 Treated 당뇨랫드Diabetic rat 모델에서  In the model 췌장베타세포의Pancreatic beta cell 세포사멸 억제 효과 확인 Confirmation of cytotoxic effect

ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 췌장베타세포의 세포사멸을 확인하기 위하여, 랫드의 소도세포에서 세포사멸을 관찰하였다.In order to confirm the apoptosis of pancreatic beta cells in the rat injected with ATF3 siRNA, apoptosis was observed in rat pancreatic islets.

ATF3 siRNA-319를 ZDF 랫드 꼬리 정맥에 주사한 후, 췌장으로부터 소도세포를 분리한 후 곧바로 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-medaited dUTP nick end labeling, Promega, Madison, USA) 분석을 수행하였다. 여기서 사용한 DeadEndtM Colorimetric TUNEL 시스템은 기존 TUNEL 분석방법을 변형시킨 방법으로 세포사멸이 일어나는 세포의 핵에서 DNA가 쪼개지게 되는데 이 쪼개진 DNA의 작은 조작들의 3‘-OH 끝에 바이오틴이 붙어있는 뉴클레오티드를 말단 탈하이드록시기 전이 재조합(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase recombinant, rTdT)효소를 이용하여 붙이는 방법이다. 상기 반응이 끝난 후, Horseradish peroxidase가 붙어있는 스트렙타비딘 (Streptavidin)을 첨가하여 반응을 시키면 바이오틴이 붙어있는 뉴클레오티드에 결합이 되고 여기에 산화효소 기질인 과산화수소, 크로모겐(Chromogen), 디아미노베지딘 (Diaminobenzidine, DAB)을 넣어 반응을 시켜 세포사멸이 일어난 세포의 핵이 어두운 갈색으로 염색이 된다. ATF3 siRNA-319 was injected into the tail vein of ZDF rats, and the islet cells were isolated from the pancreas and immediately analyzed by TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling, Promega, Madison, USA). The DeadEndtM Colorimetric TUNEL system used here is a modification of the existing TUNEL analysis method, in which DNA is cleaved from the nuclei of apoptotic cells. The nucleotides with biotin attached to the 3'-OH ends of the cleaved DNA small manipulations are terminated (RTdT) enzyme for the first time. When the reaction is completed by adding Streptavidin with Horseradish peroxidase, biotin binds to the attached nucleotide and hydrogen peroxide such as hydrogen peroxide, Chromogen, diaminobezidine (Diaminobenzidine, DAB), and the nuclei of apoptotic cells are dark brown.

그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 췌장 베타세포의 세포사멸이 크게 감소함을 나타냈다(도 5A). 도 5A의 그래프는 도 5A에서 TUNEL-양성 세포를 무작위로 50개씩 세어서 수치화하여 나타낸 그래프이다.
As a result, as shown in Fig. 5A, the cell death of pancreatic beta cells was significantly reduced in the rats injected with ATF3 siRNA (Fig. 5A). The graph of FIG. 5A is a graph showing the number of TUNEL-positive cells randomly counted in FIG. 5A and quantified.

<< 실험예Experimental Example 3>  3> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리한 당뇨  Treated diabetes 랫드Rat 모델에서  In the model ERER 스트레스 억제 효과 확인 Confirm stress relief

<3-1> <3-1> ERER 스트레스  stress 마커의Marker 단백질 발현 변화 확인 Identification of changes in protein expression

19주령 ZDF 랫드의 췌장조직에서 ER 스트레스 마커인 CHOP, GRP78와 세포사멸마커인 Bax, Caspase 3 cleavage, 췌장베타세포 당대사관련 글루코카이나제(GCK), 인슐린 및 지방축적에 관한 마커인 FAS SREBP1c 들의 단백질 발현에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 <3-1>에서 사용한 동일한 방법으로 랫드에 ATF3 siRNA를 주사하여, 상기 서술한 바와 같이 웨스턴블랏을 수행하였다.In the pancreatic tissues of 19-week-old ZDF rats, the ER stress markers CHOP and GRP78 and the cell death markers Bax and Caspase 3 cleavage, pancreatic beta cell peritoneal glucose-related glucokinase (GCK), insulin and fat accumulation markers FAS SREBP1c , ATF3 siRNA was injected into rats in the same manner as in Example < 3-1 > to perform Western blotting as described above.

그 결과, ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 ER 스트레스(CHOP 및 GRP78)와 세포사멸을 유도하는 Caspase-3의 절단을 저해하는 것으로 나타났다. 그러나, 당대사효소인 GCK 발현은 크게 증가를 하였고 인슐린의 발현도 증가를 하였다. 반면 지질 축적에 관련된 FAS 및 mSREBP1c의 발현은 크게 감소를 하였다(도 5B).
As a result, it was shown that the ATF3 siRNA injection inhibited ER stress (CHOP and GRP78) and caspase-3 cleavage leading to apoptosis. However, the expression of GCK, a glucose metabolizing enzyme, was greatly increased and the expression of insulin was also increased. On the other hand, expression of FAS and mSREBP1c associated with lipid accumulation was greatly reduced (Fig. 5B).

<3-2> 소도세포에서 <3-2> ERER 스트레스  stress 마커Marker 단백질 발현 확인 Confirmation of protein expression

랫드의 소도세포에서 ER 스트레스 마커인 CHOP의 단백질 발현 여부를 조사하기 위하여, 하기의 실험방법을 수행하였다.In order to investigate the protein expression of CHOP, an ER stress marker in rat islet cells, the following experimental methods were performed.

ATF3 siRNA 주사를 한 랫드의 췌장조직을 파라핀(Paraffin)으로 고정하고 절단한 후, ATF3, 인슐린 및 CHOP 항체로 염색을 하여 소도세포에서의 이들 단백질들의 발현을 조사하였다. 또한, 이들 조직에서 헤마톡실린/에오신(hematoxylin & eosin)염색을 하여 조직의 생리학적 행태를 조사분석하였다. The pancreatic tissues of ATF3 siRNA-injected rats were fixed with paraffin and cut, and then stained with ATF3, insulin and CHOP antibody to examine the expression of these proteins in islet cells. In addition, these tissues were stained with hematoxylin and eosin to investigate physiological behavior of tissues.

그 결과, 도 5C에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 증가한 ATF3 및 CHOP의 발현이 ATF3 siRNA에 의해 크게 감소되었고 인슐린 발현은 크게 증가함을 나타냈다(도 5C). 도 5D는 항체를 이용하여 염색한 단백질 발현 세포 및 염색 강도를 측정한 후 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다(도 5D). As a result, as shown in Fig. 5C, the expression of ATF3 and CHOP greatly increased in ZDF diabetic rats was greatly reduced by ATF3 siRNA, and the expression of insulin was greatly increased (Fig. 5C). FIG. 5D is a graph showing the protein-expressing cells stained using the antibody and the intensity of the staining after the measurement, and then graphically showing them (FIG. 5D).

상기 결과로부터 대조군 siRNA를 주사한 랫드의 경우, 19주령의 ZDF 랫드에서 볼 수 있는 소도세포의 크기가 작아져 있고, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우는 대조군에서 작아진 소도세포의 크기를 회복되는 것으로 나타났다.
From the above results, in the case of the rats injected with the control group siRNA, the size of cancellous cells seen in the 19-week-old ZDF rats was small, and in the case of the rats injected with ATF3 siRNA, Respectively.

<< 실험예Experimental Example 4>  4> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리한 당뇨  Treated diabetes 랫드Rat 모델에서  In the model 산화적Oxidative 스트레스 억제 효과 확인 Confirm stress relief

<4-1> <4-1> iNOSiNOS 단백질 발현 확인 Confirmation of protein expression

세포사멸시 관련되어있는 것으로 알려진 산화적 스트레스가 ATF3와 연관되어 있는지를 조사하기 위하여, 상기 서술한 바와 같이, 웨스턴블랏 분석 및 면역항체 염색법을 사용하여 산화적 스트레스의 마커인 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다.To investigate whether oxidative stress, which is known to be involved in cell death, is associated with ATF3, the expression of iNOS protein, which is a marker of oxidative stress, was examined using Western blot analysis and immunoassay Respectively.

그 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, ZDF 랫드에서 증가한 iNOS의 단백질 발현이 ATF3 siRNA를 주사를 한 랫드에서 크게 감소함을 확인하였다(도 6A). 상기 결과는 췌장 조직의 소도세포에서도 동일하게 나타났다. As a result, as shown in Fig. 6A, it was confirmed that the protein expression of iNOS increased in the ZDF rat significantly decreased in the mice injected with ATF3 siRNA (Fig. 6A). The results were the same in pancreatic islet cells.

<4-2> 산화질소(<4-2> Nitric oxide ( nitrixnitrix oxideoxide ) 발현 확인) Expression confirmation

산화적 스트레스가 증가하면 iNOS의 발현과 함께 산화질소(nitric oxide)의 증가가 함께 나타나는 것으로 알려져 있다. ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서 산화질소의 측정을 위하여, 그리에스(Griess) 측정방법을 이용하였다. 산화질소(Nitric Oxide, NO)는 많은 생물학적 시스템에서 중요한 생리적전달자 및 조절자로서 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 다양한 시스템에서의 역할 때문에 생물학적 시스템에서 NO의 양을 측정하는 것은 매우 중요하다고 할 수 있다. NO형성을 측정하는 방법으로는 주로 NO의 분해될 때 나오는 산물들 중 가장 안정된 니트리트(nitrite(NO₂ ^-))를 측정함으로 확인을 하게 된다. 이 측정 방법은 1879년에 Griess에 의해 만들어진 디아조화 (diazotization) 반응에 근거해서 고안된 방법으로서, 설파닐아미드(sufanilamide)와 NED(N-1-napthylethylenediamine dihydrochliride)를 사용하여 산성화(Phophoric acid)조건에서 일어나는 화학반응을 근거로 한다. 설파닐아미드가 니트리트 (NO₂ ^-)를 만나게 되면 물 한분자가 만들어져 나가게 되고 이는 다시 NED를 만나게 되면 아조 화합물이 형성된다. 이때 형성된 아조 화합물이 색깔을 띄게 되면서 NO의 양을 간접적으로 측정하는 원리로서, 먼저 4℃에 보관되어 있던 설파닐아미드와 NED를 상온에 15-30 분간 미리 꺼낸 후, 각 실험 샘플 50 ㎕씩을 각 플레이트 웰에 넣고 다채널 파이펫으로 50 ㎕의 설파닐아미드 용액을 모든 실험 샘플에 넣어 상온에서 5-10 분간 반응을 시켰다. 이때 빛을 차단하고 반응이 끝이 난 후 50 ㎕의 NED 용액을 모든 샘플에 넣어주고 다시 상온에서 5-10분간 반응을 시켰다. 반응을 시키는 것과 동시에 보라색/자홍색이 나타나고 30분 안에 520 nm ~ 550 nM 사이의 필터를 가지고 있는 플레이트 리더기에서 흡광도를 측정하였다. 이때 보라/자홍색이 나타남으로써 이들이 반응을 통해 azo (아조)가 형성이 되었음을 나타낸다. Increased oxidative stress has been associated with the expression of iNOS and increased nitric oxide (NO). For the measurement of nitric oxide in rats injected with ATF3 siRNA, the Griess measurement method was used. Nitric oxide (NO) is known to act as an important physiological transmitter and regulator in many biological systems. It is very important to measure the amount of NO in a biological system because of its role in these various systems. The method of measuring NO formation is mainly confirmed by measuring nitrite (NO ₂ ^- ), which is the most stable nitric oxide (NO ₂ ^- ) produced during the decomposition of NO. This measurement method is based on the diazotization reaction made by Griess in 1879. It is a method that uses sulfanilamide and NED (N-1-napthylethylenediamine dihydrochliride) in the presence of phophoric acid It is based on the chemical reaction taking place. When the sulfanilamide meets nitrate (NO ₂ ^- ), a water molecule is formed, which, when encountered again, forms an azo compound. First, sulfanilamide and NED stored at 4 ° C were taken out at room temperature for 15-30 minutes in advance, and then 50 μl of each test sample was added to each well. Plate wells were filled with 50 μl of sulfanilamide solution by multi-channel pipette into all experimental samples and allowed to react at room temperature for 5-10 minutes. At this time, 50 μL of NED solution was added to all samples after the light was blocked and the reaction was completed, and the reaction was continued at room temperature for 5-10 minutes. Absorbance was measured on a plate reader with a filter between 520 nm and 550 nM within 30 minutes with purple / magenta appearing at the same time as the reaction. At this time, purple / magenta appears, indicating that azo (azo) is formed through the reaction.

그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, ZDF 당뇨 랫드에서 크게 증가한 NO 생성 및 ROS의 생성이 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 크게 감소됨을 확인하였다(도 6B).
As a result, as shown in Fig. 6B, it was confirmed that NO production and ROS production, which were greatly increased in ZDF diabetic rats, were greatly reduced in rats injected with ATF3 siRNA (Fig. 6B).

<< 실험예Experimental Example 5>  5> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 에 의한 On by 췌장베타세포의Pancreatic beta cell 기능 개선 효과 확인 Check the function improvement effect

<5-1> <5-1> 췌장베타세포에서In pancreatic beta cells ATF3ATF3 과발현에 의한  Over-expression GSKGSK mRNAmRNA 발현 변화 확인 Identification of expression changes

산화적 스트레스를 유발하는 알코올을 섭취하게 한 랫드에서 증가하는 ATF3는 당분해효소인 글루코카이나제(GCK) 유전자의 전사조절인자인 PDX-1 단백질과 직접결합을 하여 유전자발현 조절에 필요한 히스톤(histone) 단백질에 아세틸기를 전달해주는 효소인 p300 (acetyltransferase)과 PDX-1과의 결합을 억제하고 히스톤디아세틸화 효소인 HDAC1/2 (Histone deacetylase 1, 2)를 끌어당김으로써 GCK 유전자 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다. ATF3, which increases in rats fed with alcohol that induces oxidative stress, binds directly to the PDX-1 protein, a transcription factor of the glucokinase (GCK) gene, a sugar enzyme, Histone deacetylase 1, 2 (HDAC1 / 2), which inhibits the binding of p300 (acetyltransferase), an enzyme that transfers acetyl groups to proteins, and PDX-1 and inhibits GCK gene expression .

췌장베타세포인 INS-1세포와 만성적 알코올 섭취를 하게 한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 ATF3 발현 억제를 통한 췌장베타세포의 기능 개선효과 확인하기 위하여, 췌장 베타세포인 INS-1세포에 ATF3 cDNA를 과발현시킨 후 당분해 효소인 글루코카이나제(GCK) mRNA 발현을 RT-PCR로 확인하였다. In order to confirm the effect of ATF3 siRNA-induced ATF3 expression in pancreatic beta cells, INS-1 cells and chronic alcohol-induced rats, ATF3 cDNA was overexpressed in pancreatic beta cells, INS-1 cells (GCK) mRNA expression was confirmed by RT-PCR.

그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, ATF3가 과발현된 세포에서 GCK mRNA 크게 감소함을 확인하였다(도 7A).
As a result, as shown in Fig. 7A, it was confirmed that GCK mRNA was significantly decreased in cells overexpressing ATF3 (Fig. 7A).

<5-2> <5-2> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리에 의한 단백질 발현 변화 확인 Identification of protein expression changes by treatment

에탄올 처리한 세포에서 ATF3 siRNA에 의한 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 단백질의 발현 변화를 확인하기 위하여, 상기 실험예 <3-2>에 서술된 바와 같이 면역항체 염색법을 수행하였고, 이때 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 항체를 사용하였다.In order to confirm the expression of GCK, ATF3, PDX-1 and insulin protein by ATF3 siRNA in ethanol-treated cells, immunoassay was performed as described in Experimental Example <3-2> ATF3, PDX-1 and insulin antibody were used.

INS-1세포에 ATF3 siRNA를 형질감염시킨 세포와 시키지 않은 세포에 각각 100 mM 에탄올을 24 시간 동안 처리한 후 GCK, ATF3, PDX-1 및 인슐린 항체로 세포에 염색을 하여 발현정도를 형광 현미경으로 관찰하였다. Cells transfected with ATF3 siRNA and cells not transfected with INS-1 cells were treated with 100 mM ethanol for 24 hours, and stained with GCK, ATF3, PDX-1 and insulin antibody. The degree of expression was measured by fluorescence microscopy Respectively.

그 결과, 도 7B에 나타낸 바와 같이, 에탄올을 처리한 군에서 GCK, PDX-1 및 인슐린의 발현이 감소하였으나 ATF3 siRNA를 이용하여 ATF3의 발현을 억제시킨 세포에서는 감소되었던 GCK, PDX-1 및 인슐린의 발현이 현저히 증가함을 확인하였다(도 7B).
As a result, as shown in FIG. 7B, the expression of GCK, PDX-1 and insulin was decreased in the ethanol-treated group, whereas the expression of GCK, PDX-1 and insulin decreased in cells in which ATF3 expression was suppressed using ATF3 siRNA (Fig. 7B).

<5-3> <5-3> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 처리에 의한 단백질 결합 확인 Confirmation of protein binding by treatment

ATF3의 발현억제에 따른 단백질의 상호작용을 확인하기 위하여 면역침전을 수행하였다. 면역침전법은 세포를 깬 용해물과 특정단백질에 대한 항체를 반응시켜 이 항체만을 정제하여 사용하는 방법으로 특정 단백질들에 결합하는 단백질들을 확인하는데 유용하게 사용되는 방법이다. 실험방법은 실험 군 세포나 조직을 용해시킨 다음 약 500 ~ 1,000 ㎍ 단백질과 1-2 ㎍ 항체를 4℃에서 16시간 동안 회전을 시키면서 반응을 시킨 후 반응 특이성을 높이기 위해 항체만을 정제를 하게 되는 이때 항체에 반응을 하는 단백질 G 또는 A 아가로즈(Protein G/A agarose)에 붙어있는 비드(bead)를 사용하여 반응을 시켰다. 반응이 끝닌 후 간단 원심분리와 간단 세정(Washing)과정 반복을 통하여 비드에 결합된 단백질만을 분리하였다. 이들에 결합된 단백질들을 확인하기 위해 얻어진 샘플 적당량 (20 ㎕)을 5분간 100℃에서 끓인 후 폴리아크릴 아마이드 겔에서 전기영동을 하고 PVDF 막으로 흡착을 시켜 항체반응을 통해 원하는 항체를 사용하여 상기 방법과 동일하게 웨스턴블랏을 수행하였다. Immunoprecipitation was performed to confirm the interaction of protein with inhibition of ATF3 expression. Immunoprecipitation is a useful method for identifying proteins that bind to specific proteins by reacting a soluble protein that breaks the cell with an antibody against a specific protein and purifying only the antibody. Experimental method was to dissolve the cells or tissues of the test group, and then reacted with about 500-1,000 μg of protein and 1-2 μg of antibody at 4 ° C for 16 hours, followed by purification of the antibody alone The reaction was carried out using a protein G or a bead attached to an A agarose that reacts with the antibody. After the reaction was completed, only the proteins bound to the beads were separated through simple centrifugation and repeated washing steps. An appropriate amount (20 쨉 l) of the obtained sample was boiled at 100 째 C for 5 minutes to identify the proteins bound thereto, and then subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel and adsorbed on a PVDF membrane, And western blotting was performed.

INS-1세포에 ATF3 siRNA를 이용하여 결핍시킨 세포와 시키지 않은 세포에 각각 에탄올을 처리한 후 세포를 용해시키고 PDX-1 항체로 면역침전(immunoprecipitation)을 시킨 후 결합하는 단백질들의 변화를 관찰하였다. 여기서 사용한 생체 내 결합분석은 INS-1세포에 직접 ATF3의 발현을 저해하는 siRNA를 제작하여 과발현을 시킨 후 100 mM 에탄올을 24 시간동안 처리한 후 세포를 모아 용해를 시킨 다음 1,000 ㎍의 단백질과 PDX-1 항체를 16시간 동안 반응시켜 단백질 G/A-agarose와 반응을 시킨 다음 분리 정제하여 전기영동을 하여 각각의 항체를 사용하여 웨스턴블랏을 수행하여 PDX-1 단백질과 특이적으로 결합을 하는 단백질들의 발현을 확인하였다.In cells treated with ATF3 siRNA for INS-1 cells, the cells were treated with ethanol and the cells were lysed. After immunoprecipitation with PDX-1 antibody, the binding proteins were observed. In vivo binding analysis, siRNAs that inhibit the expression of ATF3 directly in INS-1 cells were overexpressed and treated with 100 mM ethanol for 24 hours. The cells were collected and dissolved, and then 1,000 μg of protein and PDX -1 antibody was reacted with protein G / A-agarose for 16 hours, followed by separation and purification. Electrophoresis was performed to Western blot using each antibody to obtain a protein specifically binding to PDX-1 protein Respectively.

그 결과, 도 7C에 나타낸 바와 같이, 에탄올 처리한 군에서 PDX-1과 에탄올에 의해 증가한 ATF3가 서로 강하게 결합을 하고 있고, 반면에 PDX-1과 결합을 하는 것으로 알려진 아세틸화축매효소(acetyltransfecrase)인 p300과의 결합은 오히려 크게 감소를 하였다. 이와는 반대로 히스톤 탈아세틸화촉매효소(histone deacetylase, HDAC)인 HDAC1 또는 HDAC2와 PDX-1의 결합은 오히려 ATF3가 증가한 것과 동일하게 증가함을 나타냈다. 이와 함께 베타세포에서의 당분해효소인 GCK 발현은 알코올에 의해 총 용해물에서 감소함을 확인하였다. 또한, ATF3 siRNA를 주사한 랫드의 경우에 ATF3와 PDX-1/HDAC1/2의 결합이 저해됨으로써 PDX-1과 p300의 결합이 증가하면서 히스톤 단백질에 아세틸화가 증가되어 GCK 유전자 발현이 증가하였다(도 7C).
As a result, as shown in FIG. 7C, in the ethanol-treated group, ATF3 increased by PDX-1 and ethanol strongly bound to each other, while acetyltransfecrase, which is known to bind PDX-1, And p300. In contrast, the binding of histone deacetylase (HDAC), HDAC1 or HDAC2, to PDX-1 was increased to the same level as that of ATF3. In addition, the expression of GCK, a glycoprotein in beta cells, was found to decrease in the total solubles by alcohol. In addition, ATF3 and PDX-1 / HDAC1 / 2 binding was inhibited in ATF3 siRNA-injected rats, resulting in increased binding of PDX-1 and p300, resulting in increased acetylation of histone proteins and increased expression of GCK gene 7C).

<5-4> <5-4> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 에 의한 On by 당분해능Per resolution 증가 확인 Confirm increase

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 당분해능을 확인하기 위해, 에탄올을 6주 동안 섭취한 랫드에 ATF3 siRNA를 정맥주사를 통해 전달을 하게 한 후 10주에서 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 중단시킨 후 내당능 검사를 실시하였다. 내당능 검사는 실험예 2에서와 동일한 방법으로 수행하였다.In order to confirm glucose degradation by ATF3 siRNA in rats fed with alcohol, ATF3 siRNA was intravenously injected into rats fed with ethanol for 6 weeks, and the feed was stopped before sacrificing the rats at 10 weeks Postprandial glucose tolerance test. The glucose tolerance test was carried out in the same manner as in Experimental Example 2.

그 결과, 도 7D에 나타낸 바와 같이, 에탄올 섭취를 한 랫드의 경우에 당분해 능력이 크게 감소되어 있는 반면에 ATF3 siRNA를 주사한 랫드에서는 당분해 능력이 크게 향상됨을 확인하였다(도 7D).
As a result, as shown in FIG. 7D, in the case of the rat fed with ethanol, the sugar disintegration ability was greatly reduced, whereas in the rat injected with ATF3 siRNA, the sugar disintegration ability was greatly improved (FIG. 7D).

<5-5> <5-5> ATF3ATF3 siRNAsiRNA 에 의한 On by 췌장베타세포의Pancreatic beta cell 세포사멸 억제 효과 확인 Confirmation of cytotoxic effect

알코올을 섭취한 랫드에서 ATF3 siRNA에 의한 췌장베타세포의 세포사멸을 확인하기 위하여, 에탄올을 6주 동안 섭취한 랫드에 ATF3 siRNA를 정맥주사를 통해 전달을 하게 한 후 10주에서 랫드를 희생시키기 전에 먹이를 중단시키고 상기 실험예 2와 동일동일한 방법으로 TUNEL 분석을 이용하여 췌장베타세포의 세포사멸을 조사하였다.In order to confirm the cell death of pancreatic beta cells by ATF3 siRNA in rats fed with alcohol, ATF3 siRNA was intravenously injected into rats that had been fed with ethanol for 6 weeks, and after 10 weeks, And the cell death of pancreatic beta cells was examined using TUNEL analysis in the same manner as in Experimental Example 2 above.

그 결과, 도 7E에 나타낸 바와 같이, 에탄올 섭취에 의해 증가되는 랫드의 췌장베타세포의 세포사멸은 ATF3 siRNA에 의해 억제됨을 확인하였다(도 7E).As a result, as shown in FIG. 7E, it was confirmed that ATF3 siRNA inhibited apoptosis of pancreatic beta cells in rats increased by ethanol ingestion (FIG. 7E).

<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof <130> 14p-01-64 <160> 13 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Sense <400> 1 caccuuugcc aucggaugut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Antisense <400> 2 acauccgaug gcaaaggugt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Sense <400> 3 caccuuuugu caaggaagat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Antisense <400> 4 ucuuccuuga caaaaggugt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Sense <400> 5 ggagagugug aaugccgaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Antisense <400> 6 uucggcauuc acacucucct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Sense <400> 7 ggaagacgag aggaaccuut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Antisense <400> 8 aagguuccuc ucgucuucct t 21 <210> 9 <211> 1928 <212> RNA <213> rat <400> 9 ctcagcgaga cgcgcggtgc acggtgcttc cccggcggag ccgaccgacc aacccgcgct 60 ccggcagagt ccttggcgct cgcctgccgg cgggacagac agcccgcctc tagccgctct 120 ctggaccctg gccgccccga gcgaagactg gagcaaaatg atgcttcaac atccaggcca 180 ggtctctgcc tcagaagtca gcgcgaccgc catcgtcccc tgcctctcac ctcctgggtc 240 actggtgttt gaggattttg ctaacctgac accttttgtc aaggaagagc tgagattcgc 300 catccagaac aagcaccttt gccatcggat gtcctctgcg ctggagtcag tcaccatcaa 360 caacagacct ctggagatgt cagtcaccaa gtctgaggtg gcccctgaag aagatgagag 420 aaaaaggagg cggcgggaaa gaaacaaaat tgctgctgcc aagtgtcgaa acaagaaaaa 480 agagaagaca gagtgcctgc agaaggagtc agagaaactg gagagtgtga atgccgaact 540 gaaggcccag atcgaggagc tgaagaatga gaagcagcat ctgatttaca tgctcaacct 600 gcaccggccc acgtgtatcg tccgggctca gaacgggcgg acgccggaag acgagaggaa 660 cctttttatc caacagataa aagaaggaac attgcagagc taagcagagg tggcatgggg 720 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ccaccaaaaa ccacagcccg tggagactgg tatttgaagc caggagtggg 1620 gcaaggaagg tgtctgcact gtgggatgtt aactgcgctt ttgtcttgaa gctattttga 1680 gatgcggtcc agagtatttc agctgggagg tccctcccac tggccaccag ggctctggct 1740 actgttaaaa ttctgatgtt tctgtgaaat cctcagtgtt caatccgact cagtagtata 1800 ttacagtttt ctgtaagaga gaacgttact tatttatccc agtattccta gcctgtcaac 1860 gtaataaaat atcagaatga gacctggtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaa 1928 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-F <400> 10 ctctagccgc tctctggacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-R <400> 11 cggcattcac actctccagt 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-sense <400> 12 agucaguuac cgucaacaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-antisense <400> 13 uuguugacgg uaacugacu 19 <110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Novel siRNA suppressing ATF3 gene expression and use thereof <130> 14p-01-64 <160> 13 <170> Kopatentin 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Sense <400> 1 caccuuugcc aucggaugut t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-319-Antisense <400> 2 acauccgaug gcaaaggugt t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Sense <400> 3 caccuuuugu caaggaagat t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-275-Antisense <400> 4 ucuuccuuga caaaaggugt t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Sense <400> 5 ggagagugug aaugccgaat t 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-520-Antisense <400> 6 uucggcauuc acacucucct t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Sense <400> 7 ggaagacgag aggaaccuut t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-651-Antisense <400> 8 aagguuccuc 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ctagaatctc agcagccacg agctgttggg tcaggagggc 840 ctgcggtgac tactgcgttg tcccactctg tccccgagtg aaccgtggag caggcaggag 900 catcctttgt ctcaccggct ccaggattta ggccttacca tcccggccat tctcagatga 960 cctagctggc cccaggctgg ggtcccatgc aaagcaggat cgcactaatg ggatgcaggc 1020 agaagtgtct accttgacag gtggggtggg accacgtcct ccactgcggc tgacaacatc 1080 cctcctaggg aagatggagt gagaacattc atcattgaag ttgtccaatg gccagggtat 1140 gctttctaga aactatgctg ttctgtccta gactgactgt gcatagggca ttcatttctg 1200 agcctggtgt tgtgctattt agatgtttgt cttgcacaac attggcgtga tttttttccg 1260 ggagtttcat cagacctgat ttccgagagt ttgggggtct gccactgtgg acaatatccc 1320 ccaaaagtgt ttgggtggcc atgtaaactg gctgatgacc agctgtgcta ctctgtgctg 1380 accgaggact gatgcctcct tcccctgtac ccactgctga ggaagaaccc gggcacagca 1440 gctgtccttg gctacaaact gttacaatgt cacagaacga aggcacaaag tcccgctttc 1500 aaagggcgta ggactccaca ctcagtgaca gggcaggaag agccaaggat tctccgtttt 1560 cccttccttc ccaccaaaaa ccacagcccg tggagactgg tatttgaagc caggagtggg 1620 gcaaggaagg tgtctgcact gtgggatgtt aactgcgctt ttgtcttgaa gctattttga 1680 gatgcggtcc agagtatttc agctgggagg tccctcccac tggccaccag ggctctggct 1740 actgttaaaa ttctgatgtt tctgtgaaat cctcagtgtt caatccgact cagtagtata 1800 ttacagtttt ctgtaagaga gaacgttact tatttatccc agtattccta gcctgtcaac 1860 gtaataaaat atcagaatga gacctggtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaa 1928 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-F <400> 10 ctctagccgc tctctggacc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATF3-primer-R <400> 11 cggcattcac actctccagt 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-sense <400> 12 agucaguuac cgucaacaa 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> QIAGEN ATF3 siRNA-antisense <400> 13 uuguugacgg uaacugacu 19

Claims (9)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 9로 구성된 ATF3 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 서열번호 3으로 구성된 센스 RNA 및 서열번호 4로 구성된 안티센스 RNA로 구성된 siRNA를 유효성분으로 함유하는 비만 또는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
A siRNA consisting of a sense RNA consisting of SEQ ID NO: 3 and an antisense RNA consisting of SEQ ID NO: 4, which specifically binds to the mRNA of the ATF3 gene consisting of SEQ ID NO: 9, as an active ingredient; and a pharmaceutical composition for preventing or treating obesity or diabetes.
삭제delete 삭제delete 제5항에 있어서, 상기 조성물은 공복혈당 또는 트리글리세리드(triglyceride)양을 감소시키고, 당분해 능력을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비만 또는 당뇨병 예방 및 치료용 약학적 조성물.
The pharmaceutical composition for the prevention and treatment of obesity or diabetes according to claim 5, wherein the composition reduces the fasting blood glucose level or triglyceride level and increases the sugar disintegration ability.
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