KR102636885B1 - 세라마이드 및 이의 관상동맥질환 진단 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 특히 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 농도를 측정하고 대조군과 상기 농도를 비교함으로써, AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CV 합병증을 예측하는 방법 및 이의 용도를 제공한다. 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드의 농도가 감소하고 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 농도가 증가하는 것을 발견하면 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가한다는 것을 나타낸다. 또한, 새로이 확인된 세라마이드 분자의 서브 세트, 이의 표지된 버전, 그리고 CV 합병증을 예측 및/또는 진단하는데 사용하기 위한 키트 및 이를 포함하는 조성물이 제공된다.
Description
관련 출원
본원은 2014년 6월 16일자에 출원된 미국 가출원 제62/012,543호, 2015년 4월 2일자에 출원된 미국 출원 제14/677,595호에 대한 우선권을 주장하고, 이의 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된다.
본원은 일반적으로 세라마이드 바이오마커 및 AMI (급성 심근 경색), ACS (급성 관상 동맥 증후군), 뇌졸중 또는 심혈관(CV) 사망과 같은 CV 합병증 발병에 대해 리스크가 증가된 대상체를 식별하는 이의 용도에 관한 것이다.
현재 CV 마커인, LDL-C, HDL-C 및 총 콜레스테롤로는 관상동맥질환(CAD) 환자 또는 더 안정한 질병을 가진 환자에서 AMI, ACS, 뇌졸중 또는 CV 사망과 같은 CV 합병증 발병에 대한 리스크가 높은 대상체를 식별할 수 없다.
심근 경색이라는 용어는 병리학적으로 관류 수요의 증가 또는 혈류의 감소에 의해 유발될 수 있는 확장된 허혈로 인한 심장 근세포의 죽음을 나타낸다. 상기 질환이 갑작스럽고 심각할 경우에 "급성"이라 한다. AMI의 진단은 심장병 바이오마커(크레아티닌 키나아제 MB [CK-MB], 트로포닌 및 마이오글로빈) 및 심전도(ECG) 소견의 변화뿐만 아니라 병력 및 신체 검사의 높은 임상적 의심으로 결정된다. 2차원 심장 초음파와 같은 이미징 기술은 또한 심근 기능 장애를 확인하는데 유용하다. 그러나 현재 CV 마커인, LDL-C, HDL-C 및 총 콜레스테롤은 이미 심장 조직의 손상이 발생한 때에만 확인할 수 있다. 이들은 CVD 합병증의 발생 가능성을 예측하지 못한다.
급성 관상 동맥 증후군(Acute Coronary Syndrome, ACS)은 심장에 갑작스런 혈류 감소로 야기되는 어떤 증상에 사용되는 용어이다. 급성 관상 동맥 증후군의 첫 징후는 심장 마비라고 불리는 심장이 갑자기 멈추는 현상이다. 급성 관상 동맥 증후군은 응급실이나, 동일한 심장병 마커 또는 손상된 심장 조직이나 심장의 전기 활동에 문제가 있음을 보여주는 AMI 심전도(ECG)가 있는 병원에서 종종 진단된다.
뇌졸중은 뇌의 혈액 공급 장애로 인한 뇌 기능 상실로 뇌 조직에 산소와 영양분을 공급하지 못하게 된다. 몇 분 안에 뇌 세포가 죽기 시작한다. 뇌졸중은 막힌 동맥(허혈성 뇌졸중) 또는 혈액이 누출되거나 파열된 혈관(출혈성 뇌졸중)으로 인해 발생할 수 있다. 어떤 사람들은 뇌를 통한 일시적인 혈류 중단을 경험할 수 있다 (일시적인 허혈 발작, 또는 TIA). 뇌졸중은 대개 뇌 영상과 신체 검사를 통해 진단된다.
급성 심장사(Sudden cardiac death, SCD)는 급성 심정지(sudden cardiac arrest, SCA)라고도 불리는 심장 기능의 상실로 인한 갑작스럽고 예상치 못한 사망이다. 급성 심정지는 심장 마비(심근 경색)가 아니다. 심장 마비는 하나 이상의 관상 동맥에 막힌 부분이 있어 심장이 충분히 산소가 풍부한 혈액을 받지 못하게 될 때 발생한다. 반면, 급성 심정지는 심장에 전기적인 시스템이 오작동하고 갑자기 매우 불규칙하게 될 때 발생한다. 심장이 위험할 정도로 빠르게 뛰게 된다. 심실 세동이 발생할 수 있으며, 혈액이 체내로 전달되지 않는다. 처음 몇 분 동안 가장 큰 관심사는 뇌로 가는 혈류가 너무 급격히 감소하여 의식을 잃을 것이라는 것이다. 응급 치료가 즉시 시작되지 않는다면 사망에 이른다. 급성 심정지는 예고 없이 발생하며 일어나더라도 의료 검사로 진단되는 것은 드물다. 대신에, SCA는 돌연혼도(sudden collapse)의 다른 원인을 배제함으로써 종종 발생 후에 진단된다.
AMI, ACS, 뇌졸중 및 급성 심장사는 급성기로 진단되지만 예측 마커를 이용할 수 없다. 이러한 질환의 리스크 요소는 예를 들어 나이, 저지질혈증(hypolipidemia), 고혈압, 흡연, 당뇨병, CAD 또는 이전의 심장 마비 등이다. 그러나 질환을 예측할 수 있는 진단 테스트가 존재하지 않으며 심혈관 질환은 전 세계적으로 사망의 주요 원인이다. 게다가 CVD는 다른 질병 군보다 사회에 더 많은 비용이 든다. CVD 진단에 사용되는 동일 테스트는 질환을 예측하는데 사용된다. 오늘날 가장 혁신적인 방법은 LDL-C, HDL-C, Lp(a), Lp-PLA2 (PLAC 테스트) 또는 CRP를 사용하는 것이다. 그러나 나열된 지질 기반 마커(LDL-C, HDL-C, Lp (a), Lp-PLA2 (PLAC 테스트)) 중 어느것도 의사에게 판정 보조를 허용하는 임상적으로 유용한 예측 정보를 제공하지 않는다. CRP는 연구 환경에서 유망해 보였지만, 이는 불특정한 것으로 판명되고(CRP는 매우 다양한 시험 결과를 유도하는 많은 다른 자극에 반응할 수 있는 급성 단계 반응물이다), CRP 값은 임상적 용도로 해석하기가 어렵다.
AMI (급성 심근 경색), ACS (급성 관상 동맥 증후군), 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CV 합병증을 예측할 수 있는 진단 테스트가 필요한 실정이다.
세라마이드 기반 리스크 판정은 오늘날 다른 지질 기반 바이오마커에 비해 우수한 p-값을 제공한다. 또한, 혈장 세라마이드의 수준은 특정 지질 강하 치료 (예: 스타틴)에 영향을 받을 수 있으므로 세라마이드 마커는 정확하고 실행 가능한 리스크 판정을 제공한다.
특정 세라마이드를 포함한 지질 분자 대그룹과 2가지 지질 분자로 계산된 비율이 스타틴 치료를 받고 있거나 스타틴 치료를 받고 있지 않은 CAD 환자의 CV 결과 예측하기 위해(Zora Biosciences 특허 출원 WO2013068373 및 WO2013068374), 또는 고위험의 CAD 환자를 식별하거나 대상체가 CV 합병증을 발병할 위험이 있는지를 예측하기 위해(Zora Biosciences 특허 출원 US 13/695,766 및 US 13/805,319) 확인되었다.
그러나, AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CV 합병증 발병 환자의 리스크를 예측하는 개선된 방법이 필요한 실정이다.
요약
본원은 세라마이드의 구조에 기초하여 이들의 조합을 선택하고, AMI, ACS, 뇌졸중, 및 CV 사망을 포함하는 CVD/CAD-관련 합병증을 예측하기 위해 이들을 사용하는 유일한 규칙을 개시한다. 따라서, 이러한 세라마이드 마커는 고위험 관상 동맥 질환 환자를 식별하고 치료할 수 있는 수단을 제공한다. 민감하고 특수한 세라마이드 마커는 CVD/CAD 결과를 예측하는 현재 임상적으로 사용되는 마커와 비교하여 우수한 진단 및 예후 가치를 나타내기 위해 특별히 테스트되었다. 새로 설립된 규칙에 따라 세라마이드 바이오마커의 조합의 사용은 조기 치료, 증상 발별과 고통의 감소 및 CVD와 관련된 이환율/사망률 감소를 촉진시킬 것이다. 따라서, 본원에서 기술되고 클레임된 세라마이드 마커의 조합은 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 주요한 합병증을 일으킬 위험이 있는 환자에 대한 치료, 약물 개입 및 후속 조치의 개별 맞춤을 가능하게 한다.
상기 새롭게 확인된 규칙에 따라, 특정 세라마이드는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CV 합병증을 일으킬 증가된 리스크와 결합될 때(농도 증가 또는 저하 중 하나에 기초하여), 이의 구조 및 관련성을 기반으로 하여 별도의 그룹으로 분류된다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 (I)의 세라마이드(그룹 A 세라마이드) 및 적어도 하나의 화학식 (II)의 세라마이드(그룹 B 세라마이드)의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
적어도 하나의 화학식 (I) 세라마이드 농도의 감소가 적어도 하나의 화학식 (II) 세라마이드 농도의 증가와 결합하는 경우, AMI, ACS, 뇌졸중, CV 사망과 같은 CVD 합병증이 발병할 대상체의 증가된 리스크와 관련된다.
화학식 (I)의 세라마이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다.
화학식 (II)의 세라마이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
일 구현예에서, 대상체에서 하나 이상의 CV 합병증을 발병할 리스크가 있는지를 결정하는 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드의 농도를 측정하는 단계, b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 농도를 측정하는 단계, c) 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는지를 결정하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 방법은 화학식 I 및 II의 적어도 하나의 세라마이드 농도를 측정하기에 앞서, 적어도 하나의 중수소-표지된 화학식 I 세라마이드 및 적어도 하나의 중수소-표지된 화학식 II 세라마이드를 가진 생물학적 샘플을 스파이킹하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도가 측정된다: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1). 또 다른 구현예에서, 하기 화학식 (I)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/24:0) 및 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정된다.
또 다른 양태는 이전에 인간 혈액 샘플에 존재하는 것으로 알려지지 않았던 그룹 A 세라마이드의 서브세트 및/또는 그룹 B 세라마이드의 서브세트, 그리고 대상체에 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지를 결정하는 방법에 대한 이들의 용도에 관한 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 방법은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 (III)의 세라마이드 (그룹 C 세라마이드) 및 적어도 하나의 화학식 (IV)의 세라마이드 (그룹 D 세라마이드)의 농도를 측정하는 것을 포함한다.
적어도 하나의 화학식 (III)의 세라마이드 농도의 감소가 적어도 하나의 화학식 (IV)의 세라마이드 농도의 증가와 결합하는 경우, AMI, ACS, 뇌졸중, CV 사망과 같은 CV 합병증이 발병할 대상체의 증가된 리스크와 관련된다.
화학식 (III)의 세라마이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
화학식 (IV)의 세라마이드는 하기 구조를 갖는다:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
일 구현예에서, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지를 결정하는 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드의 농도를 측정하는 단계, b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드의 농도를 측정하는 단계, c) 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는 것을 결정하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 화학식 III 및 IV의 세라마이드 농도를 측정하기에 앞서, 적어도 하나의 중수소-표지된 화학식 III 세라마이드 및 적어도 하나의 중수소-표지된 화학식 IV 세라마이드를 가진 생물학적 샘플을 스파이킹하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 화학식 (I) 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 (II) 세라마이드, 또는 적어도 하나의 화학식 (III) 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 (IV) 세라마이드의 농도는 하기 수학식에 따라 측정된다: Z = (화학식 I의 세라마이드)a / (화학식 II의 세라마이드)b 또는 Z = (화학식 III의 세라마이드)a / (화학식 IV의 세라마이드)b, 상기 a, b ∈ R.
또 다른 양태는 대상체에서 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증 치료의 유효성을 평가하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드)의 농도를 측정하는 단계, b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 측정하는 단계, c) 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드)의 농도 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드) 농도가 동등하거나 증가하고, 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D) 세라마이드 농도가 동등하거나 감소하는 경우, 그 치료가 유효한지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 대상체에서 죽상동맥경화증 또는 CVD 및/또는 하나 이상의 합병증의 치료 유효성을 평가하는 방법을 상기 결정하는 단계 이후에, 상기 결정하는 단계에서 얻은 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 그룹 B 세라마이드의 농도를 기초로 하여 대상체에 이미 처치된 치료와 동일하도록 변경, 보충 또는 유지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도가 측정된다:Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1). 또 다른 구현예에서, 하기 화학식 (I)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/24:0) 및 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정된다.
또 다른 양태는 대상체에서 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증의 적절한 치료를 선택하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드)의 농도를 측정하는 단계, b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 측정하는 단계, c) 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드)의 농도 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계; 및 d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드(적어도 하나의 그룹 C 세라마이드) 농도가 감소하고, 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D) 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 치료가 필요하거나 이미 처치된 치료의 변경 또는 보충이 필요한지를 결정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도가 측정된다: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1). 또 다른 구현예에서, 하기 화학식 (I)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/24:0) 및 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정된다.
일 구현예에서, 그 효과가 평가되거나 또는 본원에 기술되고 청구된 방법에 따라 적절하게 선택된, 치료는 지질 변형 치료(예: 스타틴 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 다른 지질 저하 약물)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 대상체가 (d) 단계에 필요하다고 결정된 치료를 대상체에 처치하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태는 대상체에서 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 이의 합병증 중 하나 이상을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 약물을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 약물은 스타틴(statin); 스타틴 외에 HMG-CoA 환원 효소 억제제, 니아신(니코틴산), 콜레스테롤 흡수 억제제, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (CETP), 담즙산 격리제, 피브레이트, 피토스테롤, 및 PCSK9 억제제 중에서 선택된 또 다른 지질 저하제; 또는 소분자, 항체, 안티센스 RNA, 소형 간섭 RNA(siRNA), 및 천연 또는 개질된 지질 중에서 선택된 지질/지질 농도비 조절제이다. 그리고 상기 약물 처치 전에 상기 대상체는 대조군 샘플과 비교하여, 적어도 하나의 그룹 A의 세라마이드(또는 적어도 하나의 그룹 C의 세라마이드)의 농도가 감소하고 적어도 하나의 그룹 B의 세라마이드(적어도 하나의 그룹 D의 세라마이드)의 농도가 증가하는 것을 기반으로 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CVD 합병증을 앓고 있거나 발병할 리스크가 증가된 것으로 확인되었다.
생물학적 샘플에서의 세라마이드의 농도는 현재 이용 가능한 기술 또는 차후 개발되는 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세라마이드의 농도는 질량 분광기를 사용하여 측정한다. 특정 구현예에서, 상기 질량 분석기는 직접 시료 주입법 또는 고성능 분리법과 결합된다.
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플과 대조군 샘플은 바람직하게는 혈액 샘플,보다 바람직하게는 혈장 샘플, 또는 보다 바람직하게는 혈청 샘플이다. 특정 구현예에서, 상기 혈액 샘플은 필터에서 건조된 혈반이다. 이는 또한 혈액, 혈장 또는 혈청의 분획, 예를 들어 이의 지질 분획일 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 상기 방법은 그룹 A, B, C 및/또는 D 세라마이드의 농도를 측정하기 전에 생물학적 샘플로부터 지질을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 그 대신에, 대상체로부터 얻은 샘플과 대조군 샘플 모두는 조직 샘플, 예컨대 경동맥 조직과 같은 동맥 조직 또는 경동맥 플라크 물질과 같은 동맥 플라크 물질일 수 있다.
또 다른 양태는 CV 합병증을 예측하거나 본원에 개시된 임의의 방법을 수행하기 위한 조성물 또는 키트이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 I의 세라마이드 및/또는 적어도 하나의 화학식 (II)의 세라마이드를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 키트는 다음 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (II)의 세라마이드를 포함한다: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1). 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 다음 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (I)의 세라마이드를 포함하며: Cer(d18:1/24:0), 그리고 다음 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (II)의 세라마이드를 포함한다: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1).
또 다른 구현예는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (III) 세라마이드 및/또는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (IV)의 세라마이드를 포함하는 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본 명세서 포함되고, 명세서 일부를 구성하는 첨부 도면은 특정 구현예들을 도시하며, 기술된 설명과 함께 본원에 개시된 조성물 및 방법의 특정 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1은 가장 낮은 스튜던트 t-검정의 P 값을 갖는 10개의 그룹 A 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 2는 가장 낮은 스튜던트 t-검정의 P 값을 갖는 10개의 그룹 B 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 3은 그룹 A 또는 그룹 B 세라마이드 중 어디에도 속하지 않는 6개의 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일부 구현예에 따른 시스템의 개략도를 제공한다. 특히, 이 도면은 개시된 시스템 및 방법에 따라 컴퓨터 시스템 106의 구현에 사용될 수 있는 다양한 하드웨어, 소프트웨어 및 기타 리소스를 도시한다.
도 1은 가장 낮은 스튜던트 t-검정의 P 값을 갖는 10개의 그룹 A 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 2는 가장 낮은 스튜던트 t-검정의 P 값을 갖는 10개의 그룹 B 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 3은 그룹 A 또는 그룹 B 세라마이드 중 어디에도 속하지 않는 6개의 세라마이드 종의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일부 구현예에 따른 시스템의 개략도를 제공한다. 특히, 이 도면은 개시된 시스템 및 방법에 따라 컴퓨터 시스템 106의 구현에 사용될 수 있는 다양한 하드웨어, 소프트웨어 및 기타 리소스를 도시한다.
이하, 다양한 실시예로 상세히 참조될 것이며, 그 예는 첨부된 도면에 예시되어 있으며, 다음 상세한 설명에서 논의될 것이다. 다음의 상세한 설명은 독자에게 본 발명의 특정 구현예, 특징 및 세부 사항에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
1. 약어
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용된 약어는 다음과 같은 의미를 갖는다: LDL-C: 저밀도 지단백질 콜레스테롤; HDL-C: 고밀도 지단백질 콜레스테롤; CVD: 심혈관 질환; CV: 심혈 관계; CAD: 관상 동맥 질환; IVUS: 혈관 내 초음파; NIRS: 근적외선 분광법; OCT: 광학 단층 촬영; CABG: 관상 동맥 우회 수술; MS: 질량 분석; OR: 오즈비(odds ratio); SD: 표준 편차; AUC: 곡선하면적; Sens: 민감도; Spec: 특이도; MRC %: 평균 상대 변화; p-val: P-값; q-val: 및 Q-값; Pr (> Chi): 카이-제곱; ICD-10: 질병 및 관련 건강 문제에 대한 국제 통계 분류 제10 개정.
2. 정의
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가적인 정의는 상세한 설명을 통해 설명된다.
"대상체", "숙주", "환자" 및 "개체"라는 용어는 진단 또는 치료가 필요한 포유동물 대상체, 특히 인간을 지칭하기 위해 본원에 대체 가능하도록 사용된다. 상기 대상체는 협심증, 심근 경색 또는 뇌졸중과 같은 심혈관 질환으로 이전에 고통을 겪었을 수 있다. CVD는 죽상 동맥 경화증의 결과일 수도 아닐 수도 있다. 또는 대상체는 CVD의 이전 징후가 없는 건강한 개체일 수 있다.
관상 동맥 질환 / 심혈관 질환 (CVD)은 당 분야에 있어서 일반적인 의미를 가지며, CAD를 포함하여 심장, 심장 판막, 혈액 및 혈관계에 영향을 미치는 다수의 증상을 분류하기 위해 사용된다. 본 명세서에서 CVD 및 CAD라는 용어는 상호 교환 적으로 사용될 수 있다. 심혈관 질환은 내피 기능 장애, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근 경색, 죽상 동맥 경화증, 울혈성 심부전, 고혈압, 뇌혈관 질환, 뇌졸중, 일과성 허혈성 발작, 심부정맥 혈전증, 말초 동맥 질환, 심근증, 부정맥, 대동맥 협착증 및 동맥류가 포함된다. 그러한 질환은 종종 죽상 동맥 경화증을 수반한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 심혈관 질환은 죽상 동맥 경화증과 관련된 심혈관 질환이다.
본원에 사용된 용어 "컴퓨터 실행 방법"은 기계 또는 장치를 이용하여 그 목적을 달성하는 방법을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "프로세서"는 명령을 해석하고 실행할 수 있는 장치를 의미한다. 특히, 프로세서는 논리 회로를 이용하여 입력 데이터를 수신하고 적절한 출력 데이터를 제공한다. 프로세서는 네트워크를 통해 서로 통신할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "그룹 A 세라마이드". "그룹 A의 세라마이드" 등은 화학식 (I)의 세라마이드를 의미한다):
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "그룹 B 세라마이드". "그룹 B의 세라마이드" 등은 화학식 (II)의 세라마이드를 의미한다):
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "그룹 C 세라마이드". "그룹 C의 세라마이드" 등은 화학식 (III)의 세라마이드를 의미한다):
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "그룹 D 세라마이드". "그룹 D의 세라마이드" 등은 화학식 (IV)의 세라마이드를 의미한다):
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 "지질 저하 약물"은 바람직하게 HMG-CoA 환원효소 억제제, 니아신(니코틴산), 콜레스테롤 흡수 억제제, 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(CETP) 억제제, 담즙산 격리제, 피브레이트, 피토스테롤, 또는 PCSK9 억제제이다.
본원에 사용된 바와 같이, "콜레스테롤 흡수 억제제"는 바람직하게 에제티미브 또는 SCH-48461이다; 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질(CETP) 억제제는 바람직하게 에바세파닙, 안나세트라핍(anacetrapib) 또는 달세트라핍(dalcetrapib)이다; 담즙산 격리제는 바람직하게 콜레세벨람(colesevelam), 콜레스티라민(cholestyramine) 또는 콜레스티폴(colestipol)이다; 피브레이트는 바람직하게 페노피브레이트, 젬피브라질, 클로피브레이트, 또는 베자피브레이트이다, 그리고 PCSK9 억제제는 PCSK9 특이적 항체, siRNA 및 펩타이드 모방제(peptidomimetic)로부터 선택된다.
3. 세라마이드 구조 및 명명법
세라마이드 분자는 스핑고이드 염기(sphingoid base, SB)와 지방산(fatty acid, FA) 사슬로 구성된다. 대표적인 세라마이드 분자의 구조는 다음과 같다.
이 Cer(d18:1/18:0) 지질은 그룹 B 세라마이드이며, 상기 R1은 탄소수 15의 모노-불포화 알킬 사슬이며, 상기 R2는 탄소수 17의 포화 알킬 사슬이다.
세라마이드의 명명법은 일반적으로 SB에 해당하는 첫 번째 숫자 쌍 및 FA에 해당하는 두 번째 숫자 쌍으로 표시된다. 예를 들면, 상기 Cer (d18:1/18:0) 분자에서 첫 번째 숫자 쌍(d18:1)은 SB를 나타내고, 두 번째 숫자 쌍(18:0)은 FA를 나타낸다. SB 및 FA 명명법에서, 각 쌍의 첫 번째 수는 SB 또는 FA 사슬의 탄소 원자 수를 나타내며 두 번째 수는 SB 또는 FA 사슬의 탄소-탄소 이중 사슬 수를 나타낸다. 따라서, Cer (d18:1/18:0)에서 SB는 18개의 탄소 원자와 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가지며, FA는 18개의 탄소 원자와 탄소-탄소 이중 결합을 갖지 않는다. FA는 구조 내에 이중 결합을 갖는지 여부에 따라 포화되거나 불포화될 수 있다. 예를 들어, FA 16:1은 16개의 탄소 원자와 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 FA이고, FA 18:0은 18개의 탄소 원자와 탄소-탄소 이중 결합을 갖지 않는 포화 FA이다.
추가 예로서, Cer (d18:2/23:0)의 구조는 다음과 같다:
이 지질은 그룹 A 세라마이드이며, 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이며, 상기 R2는 탄소수 22의 포화 알킬 사슬이다.
추가 예로서, Cer (d16:1/22:1)의 구조는 다음과 같다:
이 지질은 그룹 B 세라마이드이며, 상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이며, 상기 R2는 탄소수 21의 모노-불포화 알킬 사슬이다.
드노보 세라마이드 합성에서, SB의 첫 번째 이중 결합은 탄소 4에서 형성되어 SB d16:1 및 d18:1를 형성한다. SB의 두 번째 이중 결합은 탄소 14에 가장 일반적으로 위치하며 SB d18:2를 형성한다.
FA 사슬의 이중 결합은 FA 사슬의 길이 및 탄소-탄소 이중 결합의 수에 따라 다양한 위치에 있을 수 있다. 22:1 FA에서 가장 일반적인 이중 결합 위치는 탄소 13이다. 23:1 FA에서 가장 일반적인 이중 결합 위치는 탄소 14이다. 24:1 FA에서 가장 보편적인 이중 결합 위치는 15이다. 24:2 및 26:2 FA에서, 가장 보편적인 이중 결합 위치는 탄소 5 및 9이다.
4. 진단 방법
본원은 생물학적 샘플에서 세라마이드의 특정 조합을 측정함으로써 AMI, ACS, 뇌졸중 및 심혈관 사망을 포함하는 CV 합병증을 예측하는 방법을 개시한다. 세라마이드는 동물 실험에 근거한 CVD의 병인에 연루되어 왔지만, 인간 데이터는 매우 부족한 실정이다. 우리는 CV 사망률과 함께, 특정 세라마이드 분자를 포함하는 특정 지질의 연관성을 최근에 보여주었다 (US 13/695,766, US 13/805,319, WO2013068373, WO2013068374 및 Tarasov et al. 2014).
진단 용도로 마커는 가능한 한 높은 민감도와 특이도를 가져야 한다. 민감도는 마커에 의해 해당 케이스로 정확히 분류되어 해당 케이스의 비율을 측정하고, 특이도는 마커에 의해 대조군으로 정확히 분류되어 대조군의 비율을 측정한다. 진단 용도로 앞으로 CV 질환이 있을 대상체의 충분히 높은 퍼센트가 초기 단계에서 표적 치료로 확인될 것이라는 점에서 중요하다. 그러나, 치료 비용을 제한하기 위해, 높은 특이도를 갖는 마커가 특이도가 낮은 마커 보다 바람직하다.
예를 들어, 민감도가 0.7인 검사는 CV 질환을 앓고 있는 100,000명의 환자 집단 중에서 70,000명이 이 검사로 인해 상기 질환 리스크가 높은 것으로 확인될 거라는 것을 의미한다. 특이도가 0.2라면, 안정적인 CVD가 있긴 하나 심각한 질환이 없는 100,000명의 환자 집단 중 단지 20,000명이 리스크가 낮은 것을 정확하게 확인될 수 있으며, 80,000명은 고위험일 거라 잘못 확인될 수 있다. 이것은 80,000명의 환자를 대상으로 한 치료 비용이 헛된 것으로 사용된다는 것을 의미한다. 이와 반대로, 동일한 질환에 대한 특이도 0.8의 대체 검사를 사용한 경우, 심각한 질환에 대한 리스크가 높은 것으로 잘못 확인되는 환자는 20,000명에 불과하다. 낮은 특이도 검사와 비교하면 60,000명의 환자의 치료비가 절감된다.
본 출원은 현저히 개선된 민감도 및 특이도를 갖는 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가된 환자를 확인하기 위해 세라마이드의 조합을 선정하는 규칙을 개시한다.
이러한 개선된 민감도 및 특이도는 제1 구조 분류로부터 적어도 하나의 세라마이드의 농도 감소 및 제2 구조 분류로부터 적어도 하나의 세라마이드의 농도 증가가 CV 합병증 발병 리스크의 증가를 나타내는 2가지로 구분된 분류에 속하는 세라마이드의 구조에 의해 결정된다. 개시된 규칙에 따라 선택된 두 가지 분류에서의 세라마이드류의 특이한 조합은 종래의 리스크 마커 또는 개별 세라마이드 분자 또는 이의 비율과 비교하여 CV 합병증을 예측하는데 있어 우수하다.
개선된 진단은 세라마이드류의 조합을 임의로 선택하여 얻을 수 없다. 대신에, 적어도 하나의 매우 긴 포화지방산을 가진 세라마이드와 적어도 하나의 긴 사슬 포화지방산 또는 매우 긴 사슬 불포화지방산을 가진 세라마이드를 결합시킴으로써 본원에 개시된 규칙에 따라 세라마이드 조합을 선택해야 한다. 특히 선정된 세라마이드 조합은 개별 세라마이드 또는 2개의 지질 분자로부터 유래된 비율과 비교하여 개선된 진단 민감도 및 특이도를 나타내었다. 세라마이드의 이러한 특정 조합의 특이도와 관련된 질환은 세라마이드류의 구조 및 세라마이드 분류의 멤버를 만드는 다양한 세라마이드 합성 효소의 생물학적 기능에 의해 결정된다.
매우 긴 포화지방산 사슬(22:0 내지 26:0)을 가진 세라마이드의 농도는 CV 합병증에 대한 리스크가 높은 사람들에서 더 낮다(그룹 A 세라마이드). 반면에 긴 사슬 포화지방산(16:0 및 18:0)과 매우 긴 사슬 불포화지방산(22:1 내지 26:2)을 가진 세라마이드의 농도는 CV 합병증에 대한 리스크가 높은 사람들에서 더 높다(그룹 B 세라마이드). CV 합병증 진단은, 예를 들어 두 개의 그룹 A 또는 그룹 B 세라마이드를 선택하는 대신에 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드가 측정될 때 개선된다.
결합 시 개선된 진단력을 제공하는 것으로 밝혀진 두 가지 구분되는 세라마이드 분류는 하기 표에 나타낸다. 여기서, 그룹 A에 대한 세라마이드류는 나열된 스핑고이드 염기(SB) 중 하나와 나열된 지방산(FA) 중 하나를 포함하고, 그룹 B에 대한 세라마이드류는 나열된 스핑고이드 염기(SB) 중 하나와 나열된 지방산(FA) 중 하나를 포함한다.
또한, 세라마이드의 두 가지 구조 분류를 화학식에 의해 정의하는 것이 가능하다. 그룹 A 세라마이드(CV 합병증의 리스크 증가와 관련된 농도 감소)는 화학식 I에 따른 구조를 갖는다:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다.
그룹 B 세라마이드(CV 합병증의 리스크 증가와 관련된 농도 증가)는 화학식 II에 따른 구조를 갖는다:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
그룹 A 및 그룹 B의 세라마이드는 또한 그들의 합성에 관여하는 세라마이드 합성 효소의 기능에 의해 분류될 수 있다. 6개의 상이한 세라마이드 합성 효소 (CerS1-6)는 인간에서 특징지어졌다. FA 기질에 대한 알려진 세라마이드 합성 효소(CerS)의 특이도에 기초하여, 그룹 B 세라마이드는 긴 FA(14-18 탄소들)를 갖는 세라마이드를 합성하는 것으로 알려진 CerS1, S4, S5 및 S6에 의해 독점적으로 생산된 세라마이드들을 포함한다. CerS2와 S3에 의해 합성된 매우 긴 FA(≥ 22개 탄소 원자)를 갖는 지방산은 그룹 A와 그룹 B 둘 다에서 발견된다. 그러나 그룹 A의 매우 긴 세라마이드 분자는 포화되어 있는 반면, 그룹 B의 매우 긴 세라마이드는 불포화된다. 따라서 CerS2와 S3의 생성물은 포화 수준에 따라 그룹 A 또는 그룹 B에 배치된다.
세라마이드 내에서 발견되는 지방산 기질에 대한 세라마이드 합성 효소의 구조 및/또는 특이도에 기초하여 특정 세라마이드를 구별되는 그룹으로 분류함으로써, 본 출원은 CV 합병증이 발병할 리스크가 높은 환자를 확인하기 위해 현저하게 개선된 민감도 및 특이도를 갖는 세라마이드의 선별용 규칙을 개시한다.
특정 구현예에서, 대상체에 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지를 결정하는 방법이 제공되며, 상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 생물학적 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는지 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태는 대상체에 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증에 대한 치료의 유효성을 평가하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고,
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 동등하거나 증가하고, 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드 농도가 동등하거나 감소하는 경우, 그 치료가 유효한지를 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태는 대상체에 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증에 대한 적절한 치료를 선택하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 감소하고, 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 치료가 필요하거나 이미 처치된 치료의 변경 또는 보충이 필요한지를 결정하는 것을 포함한다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 I의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 II의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 I의 세라마이드 농도가 측정되고, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 II의 세라마이드 농도가 측정된다.
일 구현예에서, 적어도 하나의 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도가 측정된다: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1). 특정 구현예에서, 하기 화학식 (II)의 세라마이드 또는 이의 조합은 상술한 방법으로 측정될 수 있다:
또 다른 구현예에서, 하기 화학식 (I)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/24:0)와, 적어도 하나의 화학식 (II)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)이 측정된다. 특정 구현예에서, 하기 화학식 (I) 및 화학식 (II) 세라마이드의 조합의 농도는 상술한 방법으로 측정될 수 있다:
또 다른 양태는 이전에 인간 혈액 샘플에 존재하지 않았던 그룹 A 세라마이드 및 그룹 B 세라마이드의 서브 세트, 및 대상체에 AMI, ACS, 뇌졸중, CV 사망과 같은 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지 여부를 결정하는 방법에 대한 이의 용도에 관한 것이다. 새롭게 확인된 세라마이드는 하기 표 1에 나열한다:
표 1: 새롭게 확인된
d16:1
,
d18:2
세라마이드
그룹 A 세라마이드의 서브 세트를 나타내는 새롭게 확인된 세라마이드는 화학식 III의 구조를 갖는다:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
그룹 B 세라마이드의 서브 세트를 나타내는 새롭게 확인된 세라마이드는 화학식 IV의 구조를 갖는다:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
따라서, 특정 구현예는 대상체에 하나 이상의 AMI, ACS, 뇌졸중, CV 사망과 같은 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지를 결정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 감소하고, 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는지를 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 구현예는 대상체에 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증에 대한 치료의 유효성을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 동등하거나 증가하고, 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 동등하거나 감소하는 경우, 그 치료가 유효한지를 결정하는 것을 포함한다.
또 다른 양태는 대상체에 CVD 및/또는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 하나 이상의 합병증에 대한 적절한 치료를 선택하는 방법에 관한 것으로,
상기 방법은
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 감소하고, 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 치료가 필요하거나 이미 처치된 치료의 변경 또는 보충이 필요한지를 결정하는 것을 포함한다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 III의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 IV의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 III의 세라마이드 농도가 측정되고, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 IV의 세라마이드 농도가 측정된다.
상술한 방법의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 화학식 (I) 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 (II) 세라마이드 또는 적어도 하나의 화학식 (III) 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 (IV)의 세라마이드의 농도는 하기 수학식에 따라 측정된다: Z = (화학식 I의 세라마이드)a / (화학식 II의 세라마이드)b 또는 Z = (화학식 III의 세라마이드)a / (화학식 IV의 세라마이드)b, 상기 a, b ∈ R, (화학식 I의 세라마이드), (화학식 II의 세라마이드), (화학식 III의 세라마이드) 및 (화학식 IV의 세라마이드)는 화학식 I의 세라마이드의 농도, 화학식 II의 세라마이드의 농도, 화학식 III의 세라마이드의 농도 및 화학식 IV의 세라마이드의 농도를 각각 나타낸다. 이 구현예에 따르면, 생물학적 샘플이 대조 샘플과 비교하여 증가된 Z값을 포함하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가한다. 다른 구현예에서, 상기 수학식은 상기 샘플이 대조 샘플과 비교하여 동일하거나 감소된 Z 값을 포함하는 경우 그 치료가 효과적인지를 결정하기 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서, 상기 샘플이 대조 샘플과 비교하여 증가된 Z 값을 포함하는 경우, 대상체에 심혈관 질환 환자 치료에 대한 적절한 지침서, 처방된 요법 및 이의 투여량에 따라 치료 수준을 조절할 필요가 있는지 또는 치료의 필요가 있는지를 결정하기 위해 Z값이 계산된다.
상기 대상체로부터 얻은 샘플에서 총 콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C), 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C), 아포지질단백질 A-I, 아포지질단백질 A-II, 및/또는 아포지질단백질 B(ApoB) 및/또는 아포지질단백질 C-III(ApoC-III)의 혈청 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것이 본원에 기술된 방법 및 용도에 유용하고 심지어 유리할 수 있다. 게다가, 개시된 방법 또는 용도의 일 구현예에 따라, 대상체는 바람직하게는 총 콜레스테롤, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C), 아포지질단백질 C-III(ApoC-III) 또는 아포지질단백질 B(ApoB)의 혈청 수준이 높지 않은 대상이거나, HDL-콜레스테롤(HDL-C)의 혈청 수준이 감소된 대상이다.
5. 검출 방법
또한, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 검출하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하는 단계:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하는 단계:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다; 및 임의로
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계.
상술한 방법의 일 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 I의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 II의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 I의 세라마이드 농도가 측정되고, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 II의 세라마이드 농도가 측정된다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 적어도 하나의 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정된다. 특정 구현예에서, 하기 화학식 (II)의 세라마이드 또는 이의 조합은 상술한 방법으로 측정될 수 있다:
또 다른 구현예에서, 하기 화학식 (I)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/24:0)와, 적어도 하나의 화학식 (II)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정된다. 특정 구현예에서, 하기 화학식 (I) 및 화학식 (II) 세라마이드의 조합의 농도는 상술한 방법으로 측정될 수 있다:
상술한 방법의 일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플 및 대조군 샘플은 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소) 표지된 화학식 I의 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소) 표지된 화학식 (II)의 세라마이드를 포함한다. 일반적으로, 동위원소-표지된 세라마이드는 생물학적 샘플에서 검출되는 것과 동일한 세라마이드일 것이다. 예를 들면, 하기 화학식 (I)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/24:0)와, 적어도 하나의 화학식 (II)의 세라마이드의 농도: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)가 측정되는 경우, 생물학적 샘플 및 대조군 샘플은 동위원소로 표지된 Cer(d18:1/16:0), 동위원소-표지된 Cer(d18:1/18:0), 동위원소-표지된 Cer(d18:1/24:1), 및 동위원소-표지된 Cer(d18:1/24:0)을 포함할 것이다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 상기 대상체는 협심증, 심근 경색 또는 뇌졸중과 같은 심혈관 질환을 이전에 앓았다.
또한, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 검출하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하는 단계:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하는 단계: 및 임의로
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다;
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계.
상술한 방법의 일 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 III의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 IV의 세라마이드 농도가 측정된다. 또 다른 구현예에서, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 III의 세라마이드 농도가 측정되고, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 화학식 IV의 세라마이드 농도가 측정된다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 상기 생물학적 샘플 및 대조군 샘플은 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 III의 세라마이드 및/또는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 IV의 세라마이드를 포함한다. 일반적으로, 동위원소로 표지된 세라마이드는 생물학적 샘플에서 검출되는 것과 동일한 세라마이드일 것이다.
상술한 방법의 일 구현예에서, 상기 대상체는 협심증, 심근 경색 또는 뇌졸중과 같은 심혈관 질환를 이전에 앓았다.
6. 세라마이드 농도 측정
본원에 기술되고 청구된 모든 양태 및 구현예와 관련하여, 세라마이드 농도의 측정은 전형적으로 분석을 통해 수행된다. 대상체의 샘플과 이에 적합한 해당 대조군 샘플로부터 세라마이드의 농도에 관한 정보를 수집하는 것은 다양한 화학적 그리고 고해상도 분석 기술로 수행될 수 있다. 적합한 분석 기술은 질량 분석 및 핵 공명 분광법을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 개별 세라마이드 또는 세라마이 부류를 분석하고 그 구조 정보를 제공할 수 있는 고해상도 기술은 예를 들어 생물학적 샘플로부터의 세라마이드 프로파일과 같은 질문의 세라마이드 마커에 대한 정보를 수집하는데 사용될 수 있다. 질량 분광법(MS)으로 세라마이드 마커에 관한 정보를 수집하는 것은 개시된 방법의 바람직한 구현예들 중 하나이다. 상기 MS 장비는 로봇 나노플로우 이온 소스 장치와 같은 직접 샘플 주입법이나 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 또는 초고성능 액체 크로마토 그래피(UPLC)와 같은 고성능 분리법에 연결할 수 있다.
핵자기 공명 분광법, 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 형광 분광법 또는 이중 편광 간섭계, 및/또는 ELISA와 같은 면역 측정법의 다른 방법을 사용하거나 MS 및/또는 HPLC/UPLC와 결합하여 관심있는 세라마이드를 검출할 수 있다. 대안적인 또는 추가의 구현예에 따라, 샘플 내의 세라마이드는 세라마이드에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 모이어티를 사용하여 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 상기 결합 모이어티는 예를 들어 리간드-수용체 쌍의 멤버, 즉 특이적 결합 상호 작용을 가질 수 있는 한 쌍의 분자를 포함할 수 있다. 상기 결합 모이어티는 예를 들어, 항체-항원, 효소-기질, 핵산-염기 리간드, 다른 단백질 리간드들, 또는 당업계에 공지된 다른 특이적 결합 쌍과 같은 특정 결합 쌍의 멤버를 포함할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 세라마이드 농도는 질량 분광법(MS)을 사용하여 측정되며, MS 장치는 직접 주입법 또는 HPLC 또는 UPLC와 같은 고성능 분리법에 연결 될 수 있다.
7. 샘플 준비 및 동위 원소-표지된 세라마이드
본원에 기술되고 청구된 방법에 따라, 대상체로부터 생물학적 샘플 및 대조군 샘플 모두는 바람직하게 혈액 샘플, 보다 바람직하게 혈장 샘플 또는 혈청 샘플이다. 상기 샘플은 또한 건조된 혈반일 수 있다. 이는 또한 혈액, 혈장 또는 혈청의 분획, 예를 들어 샘플로부터 추출된 지질 분획일 수 있다. 상기 혈액 샘플은 예를 들어 환자의 콜레스테롤 수치를 측정하는 것과 관련하여 취할 수 있다. 수집된 혈액 샘플을 준비할 수 있고, 혈청 또는 혈장은 당업자에게 공지된 기술로 분리될 수 있다. Vena 혈액 샘플은 바늘과 BD Vacutainer® 플라스틱 튜브 또는 Vacutainer® 플러스 플라스틱 튜브(BD Vacutainer® SSTTM 튜브는 분무 코팅된 실리아와 혈청 분리를 위한 고분자 겔을 포함함)를 사용하여 환자로부터 수집할 수 있다. 혈청은 수집된 혈액 샘플에서 분리할 수 있고, 예를 들면 1300 RCF에서 10 분 동안 실온에서 원심 분리하고 -80 ℃의 작은 플라스틱 튜브에 보관된다. 혈장은 예를 들어 2,500 x g에서 4 ℃에서 5분간 원심 분리하여 분리할 수 있다. 건조된 혈반은 여과지 위에 혈반을 놓고 에어 건조를 허용함으로써 준비된다.
대안적으로, 대상체로부터 얻은 샘플 및 대조군 샘플 모두는 조직 샘플, 예컨대 경동맥 조직과 같은 동맥 조직 또는 경동맥 플라크 물질과 같은 동맥 플라크 물질일 수 있다.
일 구현예에서, 생물학적 샘플은 동위 원소-표지된 그룹 A, 그룹 B, 그룹 C 또는 그룹 D의 세라마이드의 공지된 양으로 스파이크한다. 해당 세라마이드를 검출하는데 사용될 수 있는 임의의 동위 원소로는 수소(예, 중수소), 탄소, 및 산소 동위 원소를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 생물학적 샘플은 지질 추출 전에 동위 원소-표지된 세라마이드와 함께 스파이크한다. 동위 원소-표지된 세라마이드는 내부 표준으로 사용되며 자연 발생 분자는 아니다. 바람직한 구현예에서, 중수소 표지는 중수소-표지된 세라마이드를 생성하는데 사용되며, N-팔미토일-D-에리쓰로-스핑고신-d7(d18:1/16:0), N-스테아로일-D-에리쓰로-스핑고신-d7(d18:1/18:0), N-리그노세로일-D-에리쓰로-스핑고신-d7(d18:1/24:0), 및 N-노르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7(Cer(d18:1/24:1))를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
8. 대조군
대상체로부터 얻은 생물학적 샘플의 세라마이드 수준을 대조군과 비교한다. 상기 대조군은 건강한 개체의 생물학적 샘플일 수 있다. 상기 대조군은 주요 CVD 질환 병력이 없는 CAD 환자(들)의 샘플일 수도 있다. 또한, 건강한 개체의 일반화된 집단의 샘플들의 조합을 나타내는 샘플 또는 주요 CVD 질환의 병력이 없는 CAD 환자 집단으로부터 얻은 샘플들의 조합을 나타내는 샘플일 수 있다. 상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈청 또는 혈장일 수 있다. 또한, 조직 샘플일 수도 있다. 그러나, 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 혈장 또는 혈청이다.
대안적으로, 상기 대조군은 본 발명에 따른 세라마이드 마커에 관한 데이타 세트, 예를 들어 건강한 개체로부터 채취된 샘플에서, 또는 건강한 개체의 일반화된 집단에서, 또는 주요 CVD 질환의 병력이 없는 CAD 환자(들)에서, 또는 주요 CVD 질환의 병력이 없는 CAD 환자 집단에서 채취한 샘플들의 조합에서, 본 발명에 따른 세라마이드(들)의 농도에 대한 정보일 수 있다. 상기 정보 및 이에 해당하는 데이타 세트를 이전에 측정, 계산 또는 외삽하였을 수 있거나, 측정, 계산 또는 외삽하여야 할 수도 있거나, 또한 문헌에서 가져올 수 있다.
치료 효과를 평가하는 방법에서, 대조 샘플은 상기한 바와 같이 건강한 개체의 것일 수 있으며, 상기 논의된 바와 같이, 이 경우, 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플은 대조군 샘플과 거의 같거나 똑같은(별다른 차이는 없음) 적어도 하나의 그룹 A (또는 그룹 C) 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B (또는 그룹 D) 세라마이드의 농도를 포함한다는 발견은 치료가 효과적임을 나타낸다. 그 대신에, 대조 샘플은 AMI, ACS, 뇌졸중 또는 CV 사망과 같은 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스트가 있는 대상체로부터 얻을 수 있다. 특정 구현예에서, 대조 샘플은 치료받는 동일한 개체인 대상체로부터 얻으며, 대조군 샘플에 비해 적어도 하나의 그룹 A (또는 그룹 C) 세라마이드 농도가 증가하고 대조군 샘플에 비해 적어도 하나의 그룹 B (또는 그룹 D) 세라마이드 농도가 감소하는 경우, 치료가 효과적임을 나타낸다.
9. 조성물 및
키트
또 다른 양태는 CV 합병증을 예측하거나 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 수행하기 위한 키트이며, 상기 키트는 적어도 하나의 동위원소(예를 들어, 중수소)로 표지된 그룹 A, B, C, 또는 D 세라마이드 및 임의로 하나 또는 그 이상의 상기 방법을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 또한, 적어도 하나의 동위원소(예를 들어, 중수소)로 표지된 그룹 A, B, C 또는 D 세라마이드를 포함하는 조성물이 포함된다.
일 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 I 세라마이드를 포함한다:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 II 세라마이드를 포함한다:
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 하기 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 II의 세라마이드 또는 이의 조합 중 하나를 포함한다:
또 다른 구현예에서, 상기 키트 또는 조성물은 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 I의 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 II의 세라마이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 키트 또는 조성물은 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 I의 세라마이드 및/또는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 II의 세라마이드를 포함한다.
예를 들어, 특정 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 하기 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 (I) 및 화학식 II의 세라마이드를 포함한다:
다른 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 III의 세라마이드를 포함한다:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다.
또 다른 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 IV의 세라마이드를 포함한다:
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
또 다른 구현예에서, 상기 키트 또는 조성물은 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 III의 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 IV의 세라마이드를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 키트 또는 조성물은 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 II의 세라마이드 및/또는 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 적어도 여섯의 동위원소(예, 중수소)-표지된 화학식 IV의 세라마이드를 포함한다. 상기 조성물은 증류수, 완충 용액, 또는 다른 적절한 용매와 같은 용액을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 모든 키트는 AMI, ACS, 뇌졸중 및 CV 사망과 같은 CV 합병증 예측용으로 사용하기 위해 지시사항을 수반할 수 있다.
10. 컴퓨터-구현된 진단 방법
본원에 개시된 모든 양태 및 구현예에 따라, 제공된 방법은 컴퓨터로 구현 될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 임의의 컴퓨터-구현 방법은 추가로 다음 단계를 포함할 수 있다:
(i) 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드 (또는 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 반영하는 정보를 적어도 하나의 프로세서에 의해 얻는 단계; 및
(ii) 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(또는 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도를 사용자가 판독 가능한 형식으로 출력하는 단계.
또 다른 구현예에서, 상기 컴퓨터 구현 방법은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드(또는 적어도 하나의 그룹 C 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 D 세라마이드)의 농도 및 대조군 간의 백분율 차이를 적어도 하나의 프로세서에 의해 측정하는 단계; 및 상기 측정 단계 (iii)에서 얻어진 백분율 차이를 사용자가 판독 가능한 형식으로 출력하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 컴퓨터-구현방법은 상기 출력 단계에서 얻어진 백분율 차이에 기초하여 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 컴퓨터-구현방법의 일 구현예에서, 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드는 Cer(d18:1/24:0)를 포함하고, 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드는 Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1)를 포함한다.
도 4에 도시된 구현예에서, 컴퓨터 시스템 106은 운영 체계의 제어 하에서 또는 운영 체계와 함께 작동하는 랜덤 액세스 메모리에 결합된 하나 이상의 프로세서 110을 포함할 수 있다. 구현예에서 상기 프로세서(들) 110은 하나 이상의 서버, 클러스터, 또는 다른 컴퓨터 또는 하드웨어 리소스에 포함될 수 있거나, 또는 클라우드 기반 리소스를 사용하여 구현될 수 있다. 상기 운영 체계는 예를 들어 LinuxTM 운영 체계, UnixTM 운영 체계 또는 기타 오픈-소스 또는 독점 운영 체계 또는 플랫폼의 배포판일 수 있다. 프로세서(들) 110은 하드 드라이브 또는 드라이브 어레이에 저장된 데이타베이스와 같은 데이타 저장소 112와 통신하여 프로그램 지시에 엑세스하거나 다른 데이터를 저장한다.
프로세서(들) 110은 질의 또는 다른 요청이 클라이언트 102, 또는 다른 장치 또는 서비스로부터 수신될 수 있도록, 인터넷 또는 다른 공공 또는 사설 네트워크와 같은 하나 이상의 네트워크 104를 통해 차례로 통신할 수 있는 네트워크 인터페이스 108을 통해 추가로 통신할 수 있다. 또한, 프로세서 110은 하나 이상의 네트워크 104를 통해 사용자에게 정보, 지시사항, 워크플로우 질의 부분적 워크플로우, 또는 다른 데이타를 전송하기 위해 네트워크 인터페이스 108을 이용할 수 있다. 네트워크 인터페이스 104는 하나 이상의 서버를 포함할 수 있거나 또는 통신 가능하게 결합될 수 있다. 클라이언트 102는 예를 들어 인터넷에 연결된 개인용 컴퓨터일 수 있다.
프로세서(들) 110은 일반적으로 본원에 개시된 방법을 구현하기 위해 제어 논리 및 제어 작동을 실행하도록 프로그램되거나 구성될 수 있다. 프로세서 110은 코-프로세서 114에 추가로 통신 가능하게 결합될 수 있다(즉, 통신 채널을 통해 결합됨). 코-프로세서 114는 본원에 개시된 방법을 실행하도록 구성된 전용 하드웨어 및/또는 펌웨어 구성 요소일 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 프로세서 110 및/또는 코-프로세서 114에 의해 실행될 수 있다.
네트워크 접속, 및 다른 하드웨어, 소프트웨어 및 서비스 리소스와 관련된 컴퓨터 시스템 106의 다른 구성이 가능하다.
하기 실시예는 본원의 구현예를 추가로 정의하고 기술한다.
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실시예
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실시예
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연구 환자. 코로진(Corogene) 연구는 유망한 코호트 연구이며, 5000명의 일련의 핀란드 환자가 헬싱키 대학교 중부 병원 구역의 진단 관상 동맥 촬영에 배정되었다. 이 연구에서, 적어도 하나의 관상 동맥에 협착이 50% 보다 큰 436명의 CAD 환자를 분석하였다. 이 내포 케이스-대조군 연구에서, 하나의 대조군 대상체가 각각의 케이스에 대해 매칭되었다. 상기 케이스는 평균 2.5년의 추적 관찰 중에 CV 원인으로 사망한 CAD 환자들이었다. 매칭하는 대조군은 어떤 이유로든 추적 관찰 중에 사망하지 않은 CAD 환자들이었다. 매칭 기준에는 연령, 성별, 체질량 지수, 스타틴 사용, 흡연 및 제2형 당뇨병이 포함된다.
분석 방법. 정량화를 위해, 본원에 참조문헌으로서 전체적으로 포함된 Jung HR 등, High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochim Biophys Acta. 2011 Nov;1811(11):925-34에 기술된 바와 같이, Hamilton Microlab Star robot에서 수행된 변형된 Folch 지질 추출을 사용하여 세라마이드를 추출하였다.
알려진 양의 비-내생 합성 내부 표준 물질과 함께 샘플을 스파이크하였다. 지질 추출 후, 샘플을 클로로포름:메탄올(1:2, v/v)에서 재구성하고, 합성 외부 표준을 상기 추출물에 후-추출 스파이크하였다. 상기 추출물은 MS 분석 전에 -20 ℃에서 보관하였다.
세라마이드는 Sullards MC 등, Structure-specific, quantitative methods for analysis of sphingolipids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: "inside-out" sphingolipidomics. Methods Enzymol에 기술된 음이온 모드에서 다중 반응 모니터링(MRM)-기반의 방법을 사용하는 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템 (Eksigent ultraLC 100 system)이 장착된 하이브리드 삼중 4 극/선형 이온 트랩 질량 분석기(QTRAP 5500))에서 분석되었다.
LC-MRM 분석은 이전에 인간 혈장에 존재하지 않았던 새로운 그룹(d16:1 및 d18:2)의 세라마이드의 정확한 측정을 포함하도록 보완되었다 (표 1 참조). 이들의 존재는 순차적 MS/MS 분석 및 머무름 시간에 의해 인간 혈장에서 확인되었다. MS/MS에서, 예상 분자 이온, 예를 들면, d16:1에 해당하는 236.25의 m/z, d18:2에 해당하는 262.25의 m/z에 의해 생성된 선택적 스핑고신 분절 이온에 의해 확인되었다. 또한, 이는 체계적인 머무름 시간 이동에 의해 보완되었다. 이러한 특징적인 이동은 새로운 세라마이드류의 정체를 확인시켜 주었다. 본 출원에 기술된 목적을위한 바이오마커로서의 존재 및 능력은 놀랍고 예기치 않은 것이었다.
질량 분광계에 의해 검출된 피크의 질량 및 카운트는 해당 지질 이름 및 농도 리스트로 변환되었다. 모니터링된 각 지질 부류에 대한 동적 정량 범위, 예를 들어 정량 한계를 측정하기 위해 보정 라인을 생성하였다. 내부 표준은 내생 지질류를 정량화하기 위해 사용되었다. 상기 방법의 정량 한계를 측정하기 위해 보정 라인을 사용하였다.
실제 지질 피크에서 배경 노이즈를 분리하기 위해 엄격한 차단이 적용되었다. 각각의 샘플은 컨드롤되었으며 수용 기준을 충족할 때만 허용된다. 검출된 피크의 질량과 카운트는 해당 지질명의 리스트로 변환되었다. 지질을 각각의 내부 표준 및 샘플 용적으로 표준화하여 이의 농도를 검색하였다.
Cer ( d18:1/16:0 ), Cer ( d18:1/18:0 ), Cer ( d18:1/24:0 ), 및 Cer ( d18:1/24:1 ) 분자의 표적화된 세라마이드 정량. 세라마이드는 Jung 등으로 기술된 바와 같이, Hamilton Microlab Star robot에서 수행된 변형된 Folch 지질 추출을 사용하여 추출되었다. Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), Cer(d18:1/24:0), 및 Cer(d18:1/24:1)의 특정 조합의 정량화를 위해, 생물학적 샘플을 지질 추출 전에 공지된 양의 하기 중수소-표지된 내부 표준으로 스파이크하였다: N-팔미토일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/16:0)), N-스테아로일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/18:0)), N-리그노세로일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:0)), 및 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1)). 적합한 지질이 없는 매트릭스를 사용할 수 없으므로 용액에서 보정 라인 표준을 만들었다. 공지된 양의 분석 물질 및 안정 동위원소-표지된 내부 표준 물질을 클로로포름:메탄올 (1:2, v/v)에 첨가하여 보정 라인 점을 만들었다.
LC-MS/MS는 양이온 모드에서 다중 반응 모니터링(MRM) 기반 방법을 이용한 초고압 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템(Eksigent ultraLC 100 system)이 장착된 하이브리드 삼중 4극/선형 이온 트랩 질량 분석기(QTRAP 5500)에서 수행되었다.
샘플 추출물 (5㎕)을 Waters Acquity BEH C18 1.7 ㎛ VanGuard Pre-Column에 연결된, Waters Acquity BEH C18, 50 mm id. 1.7 ㎛ 상에 60 ℃의 칼럼 온도에서 로딩하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산과 함께 HPLC 급수 내 10 mM 암모늄 아세테이트 및 이동상 B로 구성된다. 다음 구배를 갖는 0.5 ℓ/분의 유속: 0.0-0.5 분, 85% B; 0.5-1.5 분, 85-100 & B; 1.5-4 분, 100% B; 4.10-5 분, 85% B. 공급원 온도는 300 ℃로 설정되었다; 이온 분무는 5000V였고; 디클러스터링 전위 30 V; 입구 전위는 10이었고, 가스 1과 가스 2 세팅은 50과 30이었다. 각 스캔의 체류 시간은 25msec이고 충돌 에너지는 40V로 설정되었다. 총 수집 시간은 4.5분이다.
분석 소프트웨어 (버전 1.6)로 데이터를 수집하고 MultiQuant (버전 3.0)로 처리하였다. 보정 라인 곡선은, 예를 들어, Cer(d18:1/16:0) 및 Cer(d18:1/18:0)에 대한 1/x2 그리고 Cer(d18:1/24:1) 및 Cer(d18:1/24:1)에 대한 1/y2의 가중치를 사용하여 실제 농도에 대하여, 분석물/내부 표준의 피크 면적 비율을 플로팅함으로써 구성되었다. 샘플의 피크 면적 비율을 보정 라인에서 판독하였다.
표지된 표준의 스핑고신 골격에 있는 7 중수소는 모 이온의 MS/MS 상 스핑고신 분절 이온에서 7 Da의 질량 이동을 제공한다. 따라서 내생과 내부 표준의 MRM 분석에서 스핑고신 분절 이온을 포함하는 모 이온의 질량 차이는 각각 7 Da가 되며, 예를 들어, Cer d18:1/16:0 및 D7-Cer 18:1/16:0의 MRM 전환은 538.5/264.2 및 545.5/271.2이다.
내부 표준 및 질량 이동을 포함하는 해당 내생 종류의 추출 횟수, 이온화 및 머무름 시간과 같은 동일한 분석 거동은 정확한 측정 및 정량화를 용이하게 한다. 샘플에서 내생 세라마이드 대 이의 내부 표준의 피크 면적비는 샘플에서 내생 세라마이드의 정확한 양을 제공하기 위해 보정 라인에서 판독된다. 상기 보정 라인은 설명된 대로 LC-MRM에 의해 중수소화된 표준의 고정된 양과 혼합된 내생 세라마이드의 희석 시리즈를 분석함으로써 얻어진다.
상기 중수소 표지된 내부 표준은 이 분석을 위해 특별히 제조되었다. 따라서, 이들 특정 중수소-표지된 세라마이드의 절대 정량은 이전에 수행된 적이 없다.
통계 방법. 오즈비(odds ratio)는 기술된 심혈관 결과 이벤트 유무와 집단 내 안정된 CAD 개체에 대한 이벤트 없음의 유무 사이의 연관성을 정량적으로 설명한다. 표준 편차 당 오즈비(SD당 OR)는 변수의 표준 편차 변화에 대한 반응으로 케이스 그룹의 양성 예측 확률을 대조군의 양성 예측 확률로 나누어 정량화한다. 4분위수 오즈비(OR 2-4)는 제1 4분위수의 음성 결과 대 양성 결과의 비율에 비례하여 다른 4분위수의 음성 결과 대 양성 결과의 비율을 정량화한다. 수용자 작동 특징 곡선하 면적(AUC)은 마커의 전반적인 예측 성능을 설명한다. 이의 값은 랜덤에 해당하는 0.5, 50/50 (예: 동전 뒤집기), 결과 예측과 민감도(sens) 및 특이도(spec) 측면에서 더 나은 예측 정확도를 나타내는 더 높은 값으로, 0과 1 사이이다. 평균 상대 변화(MRC%)는 케이스 그룹과 대조군의 평균 세라마이드 농도 값의 차이를 대조군의 평균 값으로 나누어 계산된다. P-값은 로그 변환 데이타에 대한 스튜던트의 t-검정을 사용하여 계산된다. 또한, 가발견 비율(false discover rate) q-값 추정치를 계산한다. 이 q-값은 p-값이 해당 마커의 p-값 보다 더 작은 모든 마커 중에서 가양성 검사 결과(false positive findings)의 백분율을 추정한다.
지질 농도(단일 마커 대 두 개의 마커 진단 모델에 해당하는 모델의 단일 또는 2개의 지질 중 하나)를 이용한 해당 케이스 대 대조군을 설명하기 위한 로지스틱 회귀 모델은 코로진 연구 집단에 적합하였다. 편차 통계로 우도비(likelihood ratio) 검정을 수행하였다. 편차 측정은 일반적으로 모델을 비교하는데 사용된다. 편차는 모델과 데이타 간의 적합성 부족의 척도를 나타내는 모델에 대한 통계 적합성 품질이다. 일반적으로 편차가 클수록 모델에 대한 데이타의 적합성이 떨어진다. 편차는 일반적으로 직접 해석되지 않고 오히려 동일한 데이타에 맞는 다른 모델의 편차와 비교된다. 예를 들면, Nelder, J.A.; Wedderburn, R.W.M. (1972). "Generalized Linear Models." Journal of the Royal Statistical Society. Series A (General) 135 (3): 370-384를 참조하시오.
우도비 테스트는 내포 모델(nested model)에 적용할 수 있다. 즉, 변수 중 더 큰 수를 가지는 모델과 상기 더 큰 모델의 변수 중 서브세트를 가지는 다른 모델의 두 모델에 적용할 수 있다. 편차 통계는 통계적 유의성을 평가할 수 있는 거의 카이-제곱 분포를 따른다. 여기서 p<0.05는 유의한 차이의 임계치로 사용되었다. p>0.05인 경우, 상기 두 모델이 대조군과 케이스를 구별되는 관점에서 서로 크게 다르지 않다. 반대로, p<0.05일 때, 변수 중 더 큰 수를 가지는 모델은 더 작은 모델 보다 더 나은 결과를 낸다. 편차 통계를 사용하는 내포 모델에 대한 우도비 검정은 다른 수의 변수를 갖는 모델을 비교하기 위해 확립된 방법이다.
결과.
실시예 연구에서, 추적 관찰 기간 동안 CV 질환을 가진 CAD 환자의 세라마이드 농도를 질환이 없는 대조군과 비교하였다. 도 1과 도 2는 가장 낮은 스튜던트 t-검정의 p-값을 갖는 10개의 그룹 A와 10개의 그룹 B 세라마이드류의 평균 상대 변화/차이(대조군의 평균 농도로 나눈 케이스 평균 대 대조군 평균의 차이)를 보여준다.
이는 그룹 A 또는 그룹 B 중 대부분의 세라마이드류들이 p <0.05로 해당 케이스와 대조군을 구분하므로, (CV 질환을 가질) 고위험군 환자를 대조군 환자와 구별할 수 있는 개별 세라마이드류의 파워(예: 더 나은 오즈비(AUC), 또는 민감도 및 특이도, 더 낮은 p 값)를 입증한다.
그룹 A 또는 그룹 B 중 어디에도 속하지 않는 세라마이드도 분석되었으며, 일반적으로, 그러한 세라마이드는 도 3에서와 같이, 로그 변환된 농도 추정치에 대한 Student 's t-test에 의해 p<0.05로 해당 케이스와 대조군을 구별하지 않는다.
코로진 연구에서 환자, 특히 질환이 없는 대조 대상체와 비교하여 추적 관찰 기간 동안 CV 질환이 있는 CAD 환자의 세라마이드 농도의 다양한 조합을 분석하기 위해 편차 통계를 사용하였다. 편차 통계의 결과는 모델 비교 1-9에 요약되어 있다.
실시예
2
모델 비교 1. 모델 비교 1에서, 하나의 세라마이드류(그룹 A 또는 그룹 B)를 그룹 A의 하나와 그룹 B의 하나인 두 개의 세라마이드의 조합과 비교하였다. 모델 비교 1에서, 단일 마커 모델 중 하나와 비교하여 조합된 두 마커 모델에 대한 Pr(>Chi)<0.05는 하기 표 4에 보여준 바와 같이, 조합된 모델의 검정력이 단일 마커 모델의 검정력 보다 유의하게 더 나음을 나타낸다.
표 4: 모델 비교 1
실시예
3
[001] 모델 비교 2. 차별적 모델을 단지 두 개의 세라마이드의 조합으로 제한할 특별한 이유는 없다. 그러나, 실용적인 목적 및 비용을 제한하는 이유로, 가능한 세라마이드를 적게 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 더 많은 분자 지질류를 분석하는 추가 비용에 대해 민감도와 특이도를 증가시키는 이점을 고려해야 한다. 모델 비교 2에서, 2개의 세라마이드류를 갖는 모델을 3개의 세라마이드류를 갖는 모델과 비교하였는데, 상기 3개의 세라마이드 마커는 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 포함하였다. 모델 비교 2에서, 2종 마커 모델 중 하나와 비교하여 조합된 3개 마커 모델에 대한 Pr(>Chi)<0.05는 하기 표 5에 보여준 바와 같이, 3개 마커 모델의 검정력이 2종 마커 모델의 검정력 보다 유의하게 더 나음을 나타낸다.
표 5: 모델 비교 2
실시예
4
모델 비교 3: 모델에서 세라마이드류의 수를 늘리는 것이 꼭 좋은 모델이 된다는 것을 의미하지는 않는다. 한 예로, 모델 비교 3은 3가지 세라마이드 모델이 2가지 세라마이드 모델 보다 우수하지 않음을 보여준다. 이 경우, 그룹 B의 2개 세라마이드를 그룹 B의 3개 세라마이드와 비교하였다. 모델 비교 3에서, 2개 마커 모델과 비교하여 조합된 3개 마커 모델에 대한 Pr(>Chi)>0.05는 하기 표 6에 보여준 바와 같이, 3개 마커 모델의 검정력이 2개 마커 모델의 검정력 보다 유의하게 더 낫지 않음을 나타낸다.
표 6: 모델 비교 3
따라서, 모델 비교 3은 세라마이드의 수를 단순히 증가시키더라도 모델 성능이 개선되지 않는다는 것을 보여준다. 오히려, 조합된 세라마이드는 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드로, 본 출원에서 제공된 지침에 따라 선정되어야 한다.
실시예
5
모델 비교 4. 세라마이드류의 흥미로운 조합은 모델 비교 4에 나와 있다. 이 조합은 3개의 그룹 B 세라마이드: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1); 및 1개의 그룹 A 세라마이드: Cer(d18:1/24:0)를 포함한다. 이 특정 조합은 분석된 모든 연구 집단에서 체계적으로 나타난다. 또한, 모델 비교 4의 세라마이드류는 일반적으로 세라마이드류의 풍족함과 비교할 때 인간 혈청 또는 혈장 샘플에 풍부하다. 4개의 세라마이드류를 조합한 모델은 표 7에 나타낸 바와 같이, 모든 경우(all Pr(>Chi)<0.05)에서 단일 구성 요소를 갖는 모델을 능가한다.
표 7: 모델 비교 4
실시예
6
모델 비교 5-7.
분석된 바이오마커의 수가 증가함에 따라 바이오마커의 조합의 진단력이 증가한다는 일반적인 인식이 있을 수 있다. 그러나 모델 비교 3에서 볼 수 있듯이, 이 인식은 CV 합병증을 예측하는 맥락에서 세라마이드 바이오마커와 반드시 일치하지는 않는다. 모델 비교 5-7은 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 선정하는 규칙을 적용하지 않고, 모델에서 세라마이드류의 수를 단순히 증가시키는 것이 모델 성능을 향상시키지 않는다는 것을 추가로 입증한다. 따라서 모델 비교 5-7은 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 선정하는 새로 확인된 규칙을 근거로 하여 세라마이드를 선택하는 것과 비교할 때 임의로 세라마이드를 선택하는 것에 대한 진단력 부족을 보여준다.
모델 비교 5에서, 그룹 A 또는 그룹 B에 속하지 않는 세라마이드의 조합을 분석하였다. 표 8에서, 15가지 모델 비교가 편차 통계 및 카이-제곱 p-값 추정과 함께 표시된다(p<0.05는 모델 간 유의차임). 각 모델 비교에서 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 포함하지 않는 세라마이드의 랜덤 조합을 비교하였다. 다양한 모델 사이즈를 갖는 15가지 모든 예에서, 편차 통계에 대한 p-값은 0.05보다 크며, 이는 비 A/B 세라마이드(non A/B ceramides)가 더 많은 모델이 더 적은 모델에 비해 케이스-대조군을 구분하는 데 있어 유의하게 더 낫지 않음을 의미한다.
표 8: 모델 비교 5
모델 비교 6에서, 그룹 A 세라마이드 (적어도 하나의 그룹 B 세라마이드 없음)의 랜덤 조합을 비교하였다. 표 9에서 15가지 모델 비교는 편차 통계 및 카이-제곱 p-값 추정과 함께 표시된다(p<0.05는 모델 간 유의차임). 다양한 모델 크기를 갖는 15가지 모든 예에서, 편차 통계에 대한 p-값은 0.05보다 크며, 이는 그룹 A 세라마이드가 더 많이 함유된 모델이 그룹 A 세라마이드 수가 더 적은 모델에 비해 케이스-대조군을 구분하는 데 있어 유의하게 더 낫지 않음을 의미한다.
표 9: 모델 비교 6
모델 비교 7에서, 그룹 B 세라마이드 (적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 없음)의 랜덤 조합을 비교하였다. 표 10에서 15가지 모델 비교는 편차 통계 및 카이-제곱 p-값 추정과 함께 표시된다(p<0.05는 모델 간의 유의한 차이를 나타냄). 다양한 모델 크기를 갖는 15가지의 모든 예에서, 편차 통계에 대한 p-값은 0.05 보다 크며, 이는 그룹 B 세라마이드가 더 많은 모델이 그룹 B 세라마이드 수가 적은 모델과 비교할 때 케이스-대조군을 구분하는 데 있어 유의하게 더 낫지 않음을 의미한다.
표 10: 모델 비교 7
실시예
7
모델 비교 8-9.
모델 비교 8-9는, 모든 그룹 A 세라마이드 (모델 비교 8) 또는 모든 그룹 B 세라마이드(모델 비교 9) 중 하나의 조합과 적어도 하나의 그룹 A와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 조합을 비교하는, 모델 비교 1, 2 및 4를 보완한다. 이 모델 비교는 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 갖는 새로이 규명된 규칙에 근거하여 세라마이드 선정의 진단력을 입증한다.
모델 비교 8에서, 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 조합을 그룹 A 세라마이드만의 조합과 비교하였다. 표 11에서 30가지 모델 비교가 편차 통계 및 카이-제곱 p-값 추정과 함께 표시된다(p<0.05는 모델 간 유의차임). 다양한 모델 크기를 갖는 30가지의 모든 예에서, 편차 통계에 대한 p-값은 0.05 보다 작으며, 이는 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 갖는 모델이 그룹 A 세라마이드만을 갖는 모델과 비교할 때 케이스-대조군을 구분하는 데 있어 유의하게 더 나음을 의미한다.
표 11: 모델 비교
모델 비교 9에서, 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드의 조합을 그룹 B 세라마이드만의 조합과 비교하였다. 표 12에서 30가지 모델 비교가 편차 통계 및 카이-제곱 p-값 추정과 함께 표시된다(p<0.05는 모델 간 유의차임). 다양한 모델 크기를 갖는 30가지의 모든 예에서, 편차 통계에 대한 p-값은 0.05 보다 작으며, 이는 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 갖는 모델이 그룹 B 세라마이드만을 갖는 모델과 비교할 때 케이스-대조군을 구분하는 데 있어 유의하게 더 나음을 의미한다.
표 12: 모델 비교 9
따라서, 이 연구의 결과는 적어도 다음과 같은 추세를 보여준다: (1) 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 조합하는 것은 그룹 A 세라마이드 또는 그룹 B 세라마이드 단독에 비해 그들의 판별력을 현저히 향상시킨다; (2) 세라마이드의 조합이 적어도 하나의 그룹 A 및 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 포함하면, 그룹 A 및 그룹 B 세라마이드의 수 증가시키는 것은 판별력을 상당히 증가시킨다; (3) 그룹 A 세라마이드 (그룹 B 세라마이드가 없이)의 수를 증가시키면 조합된 세라마이드의 판별력을 크게 향상되지 않는다; (4) 그룹 B 세라마이드 (그룹 A 세라마이드가 없이)의 수를 증가시키면 조합된 세라마이드의 판별력이 크게 향상되지 않는다; 그리고 (5) 그룹 A 또는 그룹 B에 속하지 않는 세라마이드의 수를 증가시키더라도 조합된 세라마이드의 판별력이 크게 향상되지 않는다.
따라서, 이 데이터는 판별력이 현저하게 향상된 CV 합병증을 예측하기 위한 세라미드 바이오마커를 선정하는 새로운 규칙을 세우는데 도움이 되었다 (대조군 환자에서 CV 합병증이 발병할 리스크가 있는 환자를 구별). 새로운 선정 규칙을 따르고 적어도 하나의 그룹 A 세라마이드와 적어도 하나의 그룹 B 세라마이드를 조합함으로써, 케이스 대조군(사례 대조군)은 이 선정 규칙에 따라 선정되지 않은 개별 마커 또는 지질 비율 또는 세라마이드 마커의 조합과 비교하여 훨씬 더 정확할 수 있다.
본 발명은 이의 바람직한 실시예를 참조하여 구체적으로 도시되고 설명되었지만, 첨부된 청구범위에 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부 사항에서 다양한 변화가 이루어질 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다.
Claims (33)
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 생물학적 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는지를 결정하는 것을 포함하는;
인간 대상체에서 하나 이상의 심혈관(CV) 합병증 발병 리스크 여부를 결정하기 위한 데이터를 수집하는 방법으로서,
상기 방법은 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도를 측정하기 전에, 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 I 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드를 생물학적 샘플과 스파이킹하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))를 포함하는 방법:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 대상체에 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는지를 결정하는 것을 포함하는;
인간 대상체에서 하나 이상의 CV 합병증 발병 리스크 여부를 결정하기 위한 데이터를 수집하는 방법:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 증가하고, 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도가 감소하는 경우, 그 치료가 유효한지를 결정하는 것을 포함하는;
인간 대상체에서 CVD 및/또는 이의 합병증 하나 이상에 대한 치료의 유효성을 평가하기 위한 데이터를 수집하는 방법으로서,
상기 방법은 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도를 측정하기 전에, 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 I 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드를 생물학적 샘플과 스파이킹하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))를 포함하는 방법:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 동등하거나 증가하고 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 동등하거나 감소하는 경우, 그 치료가 유효한지를 결정하는 것을 포함하는,
인간 대상체에서 CVD 및/또는 이의 합병증 하나 이상에 대한 치료의 유효성을 평가하기 위한 데이터를 수집하는 방법:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드의 농도 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 농도가 감소하고, 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 인간 대상체에 치료가 필요하거나 이미 처치된 치료의 변경 또는 보충이 필요한지를 결정하는 것을 포함하는;
인간 대상체에서 CVD 및/또는 이의 합병증 하나 이상에 대한 적절한 치료를 선택하기 위한 데이터를 수집하는 방법으로서,
상기 방법은 적어도 하나의 화학식 I 세라마이드 및 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도를 측정하기 전에, 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 I 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드를 생물학적 샘플과 스파이킹하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))를 포함하는 방법:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- (a) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도를 측정하고;
(b) 인간 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 측정하고;
(c) 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드의 농도 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하고; 그리고
(d) 상기 샘플이 대조군 샘플과 비교하여 적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 농도가 감소하고 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도가 증가하는 경우, 인간 대상체에 치료가 필요하거나 이미 처치된 치료의 변경 또는 보충이 필요한지를 결정하는 것을 포함하는,
인간 대상체에서 CVD 및/또는 이의 합병증 하나 이상에 대한 적절한 치료를 선택하기 위한 데이터를 수집하는 방법:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이며, 상기 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 또는 이로부터 얻은 지질단백질 분획이다;
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 적어도 두 개의 하기 화학식 (II)의 세라마이드 농도를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드 농도를 측정하기 전에, 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드를 생물학적 샘플과 스파이킹하는 단계를 추가로 포함하고,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 II 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))를 포함하는 방법: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1).
- 제 7 항에 있어서,
하기 화학식 (I)의 세라마이드의 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법: Cer(d18:1/24:0).
. - 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
적어도 두 개의 화학식 II 세라마이드의 농도 또는 화학식 I 세라마이드의 농도를 대조군 샘플과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세라마이드의 농도는 질량 분광법으로 측정하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,상기 세라마이드의 농도는 직접 샘플 주입법 또는 고성능 분리법과 결합된 질량 분석기를 사용하여 측정하는 방법.
- 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 둘 또는 적어도 셋의 화학식 (I) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법.
- 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 둘 또는 적어도 셋의 화학식 (III) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법.
- 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 셋의 화학식 (II) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법.
- 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 둘 또는 적어도 셋의 화학식 (IV) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 수학식에 따라 생물학적 샘플이 대조 샘플과 비교하여 증가된 Z 값을 포함하는 경우, 대상체는 하나 이상의 CV 합병증이 발병할 리스크가 증가하는 방법: Z = (화학식 I의 세라마이드)a / (화학식 II의 세라마이드)b 또는 Z = (화학식 III의 세라마이드)a / (화학식 IV의 세라마이드)b, 상기 a, b ∈ R.
- 제 1 항, 제 3 항 또는 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 화학식 (II) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법: Cer(d18:1/16:0), Cer(d18:1/18:0), 및 Cer(d18:1/24:1).
- 제 17 항에 있어서,
적어도 하나의 하기 화학식 (I) 세라마이드의 농도를 측정하는 방법: Cer(d18:1/24:0)
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
하나 이상의 CV 합병증은 AMI(급성 심근 경색), ACS(급성 관상동맥 증후군), 뇌졸중 또는 CV 사망 중의 하나 이상인 방법.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
세라마이드의 농도를 측정하기 전에, 생물학적 샘플로부터 지질을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 2 항, 제 4 항 또는 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 화학식 III 세라마이드 및 적어도 하나의 화학식 IV 세라마이드 농도를 측정하기 전에, 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 III 세라마이드 및 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 IV 세라마이드를 가진 생물학적 샘플을 스파이킹하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제 21 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 세라마이드의 동위원소는 중수소인 방법.
- 제1항, 제3항, 제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 세라마이드의 동위원소는 중수소인 방법.
- CV 합병증 예측용 조성물로서,
(a) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 (I) 세라마이드; 및
(b) 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드를 포함하는 조성물:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다; 및
상기 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))을 포함한다.
- 제 24 항에 있어서,
상기 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드는 Cer(d18:1/16:0) 및 Cer(d18:1/18:0)을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 25 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 (I) 세라마이드는 Cer(d18:1/24:0)인 조성물.
- CV 합병증 예측용 조성물로서,
(a) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 III 세라마이드; 및
(b) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 IV 세라마이드를 포함하는 조성물:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다;
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 세라마이드의 동위원소는 중수소인 조성물.
- CV 합병증 예측용 키트로서,
(a) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 (I) 세라마이드; 및
(b) 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드를 포함하는 키트:
[화학식 (I)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-25의 포화 알킬 사슬이다;
[화학식 (II)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 포화, 모노-불포화 또는 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23 또는 25의 디-불포화 알킬 사슬이다; 및
상기 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드는 N-네르보노일-D-에리쓰로-스핑고신-d7 (Cer(d18:1/24:1))을 포함한다.
- 제 29 항에 있어서,
상기 적어도 두 개의 동위원소-표지된 화학식 (II) 세라마이드는 Cer(d18:1/16:0) 및 Cer(d18:1/18:0)을 추가로 포함하는 키트.
- 제 30 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 (I) 세라마이드는 Cer(d18:1/24:0)인 키트.
- CV 합병증 예측용 키트로서,
(a) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 III 세라마이드; 및
(b) 적어도 하나의 동위원소-표지된 화학식 IV 세라마이드를 포함하는 키트:
[화학식 (III)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬 또는 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 21-23, 또는 25의 포화 알킬 사슬이다;
[화학식 (IV)]
상기 R1은 탄소수 13의 모노-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이거나; 상기 R1은 탄소수 15의 디-불포화 알킬 사슬이고, 상기 R2는 탄소수 15 또는 17의 포화 알킬 사슬, 탄소수 21-23의 모노-불포화 알킬 사슬, 또는 탄소수 23의 디-불포화 알킬 사슬이다.
- 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 동위원소-표지된 세라마이드의 동위원소는 중수소인 키트.
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