CN112986454A - 急性心肌梗死的血清标志物、试剂盒和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种急性心肌梗死的血清标志物，所述血清标志物至少包括如下神经酰胺标志物：神经酰胺(d18:1/16:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)，神经酰胺(d18:1/20:0)，神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)，神经酰胺(d18:1/24:2)，神经酰胺(d18:1/25:0)，神经酰胺(d18:1/26:0)中的一种或两种以上。利用本发明血清标志物能够检测血清中急性心肌梗死神经酰胺标志物水平，能够在早期鉴别急性心肌梗死。
Description
技术领域
本发明属于医学技术领域，尤其是一种急性心肌梗死的血清标志物、试剂盒和用途。
背景技术
急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）是指由不稳定的缺血综合征引起的心肌坏死，也被认为是急性冠状动脉综合征。通常持续至少20分钟，症状包括不稳定型心绞痛、胸部不适伴有或不伴有呼吸困难、恶心、发汗或晕厥。它是一种危及生命紧急心脏病发作事件，发生时，流向心肌的血液突然切断，造成组织损伤。这通常是一个或多个冠状动脉阻塞的结果。心肌梗死可能在没有症状或类似胃肠、神经、肺或肌肉骨骼疾病的非典型症状的情况下发生，导致难以进行特定的预测或诊断。在美国，AMI的年发病率约为55万次首发和20万次复发，根据残疾调整生命年标准的评估，在全球范围内，这种类型的缺血性心脏病已经成为导致疾病负担的主要因素。急性心肌梗死可对心脏造成不可逆转的损害，并导致约30%的死亡率，而如果急性心肌梗死发生在医院外且未及时治疗或护理，则在到达医院前死亡率会显著增加至约50%。目前在临床实践中，AMI的诊断依赖于临床评价、心电图、生化检测、影像学和病理学评价。然而，这些诊断工具仅有限存在于医院中，如果AMI发生在院外，如家中，则很难做出准确的早期诊断和临床管理决策。肌钙蛋白已被公认为急性心肌梗死的特异性生物标志物，但肌钙蛋白检测存在着检测抗体特异性、缺乏标准化导致检测不准确、早期诊断敏感性低等局限性。为解决上述临床上对AMI诊断的需求，需要一种早期、方便、可靠的诊断、预测和监测工具，对AMI进行更精确地检测和诊断，以便及时干预，这将大大提高我们对AMI发病机制的认识。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种急性心肌梗死的血清标志物、试剂盒和用途。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种急性心肌梗死的血清标志物，所述血清标志物至少包括如下神经酰胺标志物：神经酰胺 (d18:1/16:0)，神经酰胺 (d18:1/18:0)，神经酰胺 (d18:1/20:0)，神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺 (d18:1/23:0)，神经酰胺 (d18:1/24:0)，神经酰胺 (d18:1/24:1)，神经酰胺 (d18:1/24:2)，神经酰胺 (d18:1/25:0)，神经酰胺 (d18:1/26:0)中的一种或两种以上。
进一步地，所述血清标志物的丰度比值组成如下神经酰胺预测因子，具体包括：神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)。
进一步地，所述血清标志物的水平表示方法，步骤如下：
质谱方法评估血清中的神经酰胺标志物的一种或两种以上，以确定血清中每种急性心肌梗死神经酰胺标志物的水平，计算神经酰胺预测因子的一种或两种以上。
如上所述的急性心肌梗死的血清标志物在制备急性心肌梗死的诊断、预测、监测和/或治疗的试剂盒方面中的应用。
一种利用如上所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒。
一种检测如上所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒，所述试剂盒包括a）；其中，a）为一个或两个以上用于检测样本中一组神经酰胺预测因子的检测组分，这些预测因子来自包括所述神经酰胺标志物的急性心肌梗死标志物，所述标志物选自神经酰胺（d18:1/16:0），神经酰胺（d18:1/18:0），神经酰胺（d18:1/20:0），神经酰胺（d18:1/22:0），神经酰胺（d18:1/23:0），神经酰胺（d18:1/24:0），神经酰胺（d18:1/24:1），神经酰胺（d18:1/24:2），神经酰胺（d18:1/25:0），神经酰胺（d18:1/26:0）。
进一步地，所述样本来自健康个体。
进一步地，所述样本来自急性心肌梗死患者。
进一步地，所述试剂盒还包括质控品、标准品、缓冲液中的一种或两种以上。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、利用本发明血清标志物能够检测血清中急性心肌梗死神经酰胺标志物水平，根据血清中特定神经酰胺图谱的丰度和功能反应，进而能够在早期鉴别急性心肌梗死，使用此标志物进行AMI检测的方法，在一些实施例中，其敏感性和特异性可分别达96.3%和93.9%。
2、本发明方法通过“诊断”AMI或“提供AMI诊断”，通常意味着提供AMI确定，例如确定受试者（例如，有AMI临床症状的受试者，无AMI症状但有AMI相关危险因素的受试者，无AMI症状且无危险因素的受试者与AMI相关）目前是否受AMI影响；确定AMI的严重程度；等等。通过“预测”AMI或“提供AMI预后”，通常意味着提供AMI预测，例如预测受试者发生AMI的易感性或风险；预测疾病进展和/或疾病结局的过程，例如预期的AMI发作；对受试者对AMI治疗的反应性的预测，例如，阳性反应、阴性反应、完全无反应等。通过“监视”AMI，通常意味着监视受试者的状况，例如通知AMI诊断、通知AMI预后、提供关于AMI治疗的效果或疗效的信息等。
3、本发明提供了急性心肌梗死（AMI）血清学标记物、急性心肌梗死标记物组和获得血清样本的急性心肌梗死标记物水平表示的方法。这些组分和方法可用于许多应用中，包括，例如诊断AMI、预测AMI、监测AMI患者和确定AMI的治疗。此外，还提供了在实践主体方法时使用的试剂盒和用途。
4、神经酰胺是鞘脂和真核细胞膜的组成部分。除了为细胞提供结构完整性外，神经酰胺还被证明在细胞信号传递过程中充当第二信使。本发明利用质谱进行血清中脂质组学及神经酰胺的分析，找出与AMI最相关的一些神经酰胺作为预测因子进行AMI预测，并验证其检测模型的性能。
质谱分析能够检测神经酰胺浓度的潜在的一系列广泛变化。
为了进行神经酰胺的研究，必须从高含量的样品中，如血清中，生成全面的神经酰胺图谱，血清长期以来被认为是一种用于医学诊断的丰富液体，目前许多临床分析都是在血清中进行的，因为它的代谢物种类很广泛（并且是可再生的）。
5、本发明具体实施方式中，给出了10个神经酰胺标志物以及13种神经酰胺比值的单因素分析结果，即单独作为预测因子进行AMI评估的性能，特异性、敏感性和AUC值均良好，表明用本发明所述的一个或多个神经酰胺标志物或一个或多个神经酰胺比值也可达到AMI评估的效果。
附图说明
图1为使用本发明中的神经酰胺预测因子进行AMI评估中每个特征的对照组和患者组的信号强度对比图；
图2为使用本发明中的神经酰胺预测因子进行AMI评估方法的ROC性能结果图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种急性心肌梗死的血清标志物，所述血清标志物至少包括如下神经酰胺标志物：神经酰胺 (d18:1/16:0)，神经酰胺 (d18:1/18:0)，神经酰胺 (d18:1/20:0)，神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺 (d18:1/23:0)，神经酰胺 (d18:1/24:0)，神经酰胺 (d18:1/24:1)，神经酰胺 (d18:1/24:2)，神经酰胺 (d18:1/25:0)，神经酰胺 (d18:1/26:0)中的一种或两种以上。
较优地，所述血清标志物的丰度比值组成如下神经酰胺预测因子，具体包括：神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)。
较优地，所述血清标志物的水平表示方法，步骤如下：
质谱方法评估血清中的神经酰胺标志物的一种或两种以上，以确定血清中每种急性心肌梗死神经酰胺标志物的水平，计算神经酰胺预测因子的一种或两种以上。
如上所述的急性心肌梗死的血清标志物在制备急性心肌梗死的诊断、预测、监测和/或治疗的试剂盒方面中的应用。
一种利用如上所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒。
一种检测如上所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒，所述试剂盒包括a）；其中，a）为一个或两个以上用于检测样本中一组神经酰胺预测因子的检测组分，这些预测因子来自包括所述神经酰胺标志物的急性心肌梗死标志物，所述标志物选自神经酰胺（d18:1/16:0），神经酰胺（d18:1/18:0），神经酰胺（d18:1/20:0），神经酰胺（d18:1/22:0），神经酰胺（d18:1/23:0），神经酰胺（d18:1/24:0），神经酰胺（d18:1/24:1），神经酰胺（d18:1/24:2），神经酰胺（d18:1/25:0），神经酰胺（d18:1/26:0）。
较优地，所述样本来自健康个体。
较优地，所述样本来自急性心肌梗死患者。
较优地，所述试剂盒还包括质控品、标准品、缓冲液中的一种或两种以上。
具体地，相关制备及检测如下：
在本发明的一些方面中，提供一种急性心肌梗死的血清标志物，所述血清标志物至少包括如下神经酰胺特征：神经酰胺(d18:1/16:0), 神经酰胺(d18:1/18:0), 神经酰胺(d18:1/20:0), 神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1), 神经酰胺(d18:1/24:2), 神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/26:0)。
在本发明的一些方面中，所述AMI神经酰胺标志物AMI标志物选择含有14种神经酰胺的组团作为标志物，包括： 神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0),神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)。
在本发明的一些方面中，提供了一种用于为对象提供AMI标记物级别表示的方法。在一些实施例中，所述方法包括评估来自受试者的血清样品中的AMI神经酰胺标记物组以确定血清样品中每个AMI神经酰胺标记物的水平；以及基于所述组中每个神经酰胺标记物的水平计算AMI神经酰胺标记物水平表示。在一些实施例中，所述组分包含一个或多个AMI特异性神经酰胺特征，包含神经酰胺(d18:1/16:0), 神经酰胺(d18:1/18:0), 神经酰胺(d18:1/20:0), 神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1), 神经酰胺(d18:1/24:2), 神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/26:0)。在一些实施例中，所述模型包含血清神经酰胺的比率：神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/26:0),神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0). 在一些实施例中，该方法还包括提供AMI神经酰胺标记物水平表示的报告。在某些实施例中，AMI标记表示是AMI风险分数。
在本发明的一些方面中，提供了一种用于为受试者提供AMI评估的方法。在一些实施例中，AMI评估是AMI的诊断。在一些实施例中，该方法包括例如如上文或本文其他地方所述，获得来自受试者样本的AMI标记物水平表示，并且基于AMI神经酰胺特征标记物水平表示为受试者提供AMI诊断。在一些实施例中，该方法还包括将AMI神经酰胺特征标记物水平表示与AMI表型决定因素进行比较，并基于该比较为受试者提供AMI诊断。在一些实施例中，受试者具有AMI的症状。在其它实施例中，受试者对AMI无症状。在一些实施例中，受试者具有与AMI相关联的一个或多个风险因素。在其它实施例中，受试者不具有与AMI相关联的危险因素。
在本发明的一些方面中，提供了一种用于对样本进行AMI评估的试剂盒。在一些实施例中，AMI评估是AMI诊断。在一些实施例中，试剂盒包括一个或多个样品收集和检测组分，用于测量样品中AMI标记物组的神经酰胺特征标记物的水平，该标记物组包括从由10个神经酰胺组成的组中选择的一个或多个标记物和上述计算的14个神经酰胺比率。
本发明下文中，给出了10个神经酰胺标志物以及13种神经酰胺比值的单因素分析结果，即单独作为预测因子进行AMI评估的性能评价，特异性、敏感性和AUC值均良好，表明用本发明所述的一个或多个神经酰胺标志物或一个或多个神经酰胺比值可达到AMI评估的良好效果。
本发明中的一些实施例中，进一步用复杂算法对AMI评估方法进行提升，以期达到更准确的预测结果。在一些实施方式中，使用XGBoost算法构建包含本发明所述的14个神经酰胺比率的评估AMI的算法，即AMI评估模型，然后对该模型性能评估，即特异性、敏感性或AUC值（Area Under Curve，用于评价检测方法或预测方法的优劣性），AUC最优值对应的点即为临界值。XGBoost算法是"极端梯度提升"(Extreme Gradient Boosting)的简称，XGBoost是对梯度提升算法的改进，求解损失函数极值时使用了牛顿法，将损失函数泰勒展开到二阶，另外损失函数中加入了正则化项。XGBoost是一个树集成算法，是将k（树的个数）个决策树的结果进行求和，作为最终的预测值。该算法的优点是速度快、效果好、能处理大规模数据。
在一些实施例中，将本发明中的14种预测因子带入XGBoost中，得出含有20棵决策树的AMI评估模型（XGBoost算法）。从0到1依次设为阈值，并计算该设置点的特异性和敏感性，AUC值最优的点即为临界值。在本实施例中，AUC值最优为97.9%，此值对应的点为0.388，即将0.388设为该方法或称该评估模型的临界值。
将试验血清中的14种预测因子带入到20棵决策树，根据每颗决策树的指示进行分类，每颗树会有一个预测值，将20颗树的预测值求和，得到最终的预测结果。当试验样本的结果或称分值小于0.388时表明结果为阴性即AMI低风险，等于或大于0.388时结果为阳性即AMI高风险。
一、方法和材料
1、研究设计
根据心肌梗死的普遍定义标准（Universal Definition of MyocardialInfarction, UDMI）或心肌肌钙蛋白（cTn）水平升高，从正常对照组（n=114）和AMI患者（n=107）中收集血清样本。前处理后的脂质提取物中的血清神经酰胺用质谱进行分析，并用峰识别和归一化平台进行处理。采用单变量和多变量分析比较正常和AMI血清样本，回顾性研究旨在确定正常对照组（AMI患者与正常受试者不同）中独特的神经酰胺图谱，从而建立区分急性心肌梗死患者与正常人群的模型。
2、样本收集
血清样本从至少40岁的男性和女性登记受试者的静脉血中分离出来。正常对照组和AMI患者均按UDMI标准确认。入选患者来自同一地点（114名正常对照组和107名AMI患者）。这项研究得到了机构审查委员会的批准。
3、靶向质谱分析
将每种10μL校准品（2D7-16:0神经酰胺、2D7-18:0神经酰胺、2D7-24:1神经酰胺、2D7-24:0神经酰胺；6种不同浓度的校准品，浓度分别为：0.01uM，0.02uM，0.05uM，0.25uM，1uM，10uM）和质控工作液（2D7-16:0神经酰胺、2D7-18:0神经酰胺、2D7-24:1神经酰胺、2D7-24:0神经酰胺；浓度分别为：0.01uM、0.025uM、0.4uM、8uM）加入10μL脱脂血清（空白液或称稀释液）中，得到一套校准品和一套质控品（LLOQ、QC低、QC中和QC高）。将8-12µL试验血清加入8-12µL 异丙醇。在16-24µL预处理校准品、质控品和试验血清中加入180-220µL含有同位素标记内标物的提取液（甲醇：异丙醇，体积比为1:1溶液，包括 2D7-16:0神经酰胺、2D7-18:0神经酰胺、2D7-24:1神经酰胺、2D7-24:0神经酰胺，各4-6nm）。样品剧烈涡旋0.8-1.2分钟。在11000-13000 g离心5分钟后，收集160-190μL上清液，然后进行质谱（MS）分析。
质谱分析使用高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS），色谱柱为ACE Super18柱（2.1 mmx 100 mm x 1.7μm。在一些实施例中，使用Vanquish UPLC***和TSQ AltisTM三重四极杆质谱仪（Thermo Scientific，San Jose，CA）。将5μL血清提取物注入UPLC***，流动相为：含有10mM碳酸氢铵的甲醇：异丙醇（体积比为1:1）溶液。
样品通过30°C ACE Super18柱（2.1 mm x 100 mm x 1.7μm），在质谱仪ESI负极模式下注入。三重四极杆质谱仪参数设置如表1所示：
4、统计分析
神经酰胺浓度用同批次测定中产生的校准曲线进行定量。在对神经酰胺的质谱特征进行处理和标准化后，利用单因素分析方法对各质谱特征的性能进行评价（敏感性、特异性、AUC值等），筛选出性能较好的指标。使用各神经酰胺特征的浓度或强度的比值作为预测因子，继续用单因素分析方法对各质谱特征的性能进行评价，筛选出性能较好的指标。再次用其中性能较好的一些指标，建立依托于XGBoost算法的AMI评估模型，用来区分AMI患者和正常对照者，以期得到跟准确的评估XGBoost算法）。该模型使用神经酰胺的浓度/强度作为预测因子（即特征）。以发现队列中的受试者为研究对象，采用10倍交叉验证算法对模型性能进行验证。
二、结果
1、受试者人口统计学特征
这项研究包括221名登记的受试者（n=114为正常受试者，n=107为AMI受试者）。每位受试者在临床手术或临床治疗前采集血清样本。正常和AMI受试者的特征如表2所示。
表2 队列人口统计学特征
2、用神经酰胺特征或预测因子的AMI评估性能
利用单因素分析方法对各质谱检测出的各特征的性能进行评价（敏感性、特异性、AUC值等），从而筛选出性能较好的指标，如表3为10种神经酰胺特征的性能评价结果，从各个评价指标结果可以看出用其中一个或多个特征进行AMI评估效果良好（注：表中Cer为神经酰胺ceramide的英文缩写，下同）。
使用各神经酰胺特征的浓度或强度的比值作为预测因子，继续用单因素分析方法对各特征比值的性能进行评价，从而筛选出性能较好的指标。表4为利用上述10种神经酰胺特征的浓度或强度的比值组合成的45种预测因子的性能评价，通过此步骤性能筛选并结合下一步多种算法模型的性能筛选出：神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)，表明用其中一个或多个预测因子进行AMI评估效果良好。
再次用其中性能较好的一些指标，建立依托于XGBoost算法的AMI评估模型，用来区分AMI患者和正常对照者，以期得到更准确的评估。
3、基于算法的AMI评估模型性能
用上述预测因子建立依托于XGBoost算法的AMI评估模型（具体模型使用的算法和构建方法请见前文所述），并验证分析性能。表5给出了每个特征的单变量和多变量分析，AMI受试者的所有比率特征均显著上调（P<0.001），图1显示每个特征的标准化信号强度值（图中所示Cer为神经酰胺英文缩写，A为AMI疾病组，B为对照组），表明采用本发明的预测因子建立的检测方法进行AMI预测结果良好。
AMI评估模型验证性能水平如表6所示。评估模型可以检测出107例AMI患者中的103例，敏感性为96.3%（95%置信区间[CI]，92.5-99.1%）。
114例无AMI事件的正常对照者中，评估模型的特异性为93.9%（95%CI，89.5-98.2%）。
在模型预测准确性方面，发现队列中AMI患病率为48.4%（107/221），阴性预测值（NPV）和阳性预测值（PPV）分别为96.4%（107/111）和93.6%（103/110）。
在该模型中，真阳性率（TPR，等同于敏感性）为96.3%（103/107），超过假阳性率（FPR，等同于1-特异性）6.1%（7/114）。TPR与FPR的差异为90.1%，有统计学意义。
表6 评估方法验证结果
该评估模型的ROC（Receiver Operating Characteristic）曲线图如图2所示，AUC值（Area Under Curve）为97.9%（95%CI，96.1-99.7%），AUC值大于95%，表明结果非常好。
在某些实施例中，该评估模型的临界值为0.388，结果值小于0.388时检测结果为阴性，等于或大于0.388时检测结果为阳性。
4、试剂***和试剂盒
本发明还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂及其***。 本发明的试剂及其***可以有很大的不同。试剂包括专门设计用于标准化生产上述样本中AMI标记物的神经酰胺标志物水平的试剂，例如，一种或多种提取元素，校准溶液，质量控制（QC）溶液，含有定量内标物的萃取溶液或用于检测血清神经酰胺质谱流动相等。在某些情况下，检测组分包括用于检测AMI神经酰胺标志物水平的试剂，例如，检测组分可以是包含一种或多种检测元素的混合缓冲溶液，其可以用于同时检测一种或多种AMI神经酰胺标志物的水平。
一种专门为产生神经酰胺标志物水平而定制的试剂，例如， AMI标志物水平表征，是一系列神经酰胺定量、质量控制、样品预处理缓冲液（包括内标）的集合，专门沉淀蛋白质并提取神经酰胺标志物，例如，以基于有机溶剂的分离形式。使用它们的方法在本领域中是众所周知的。这些缓冲液可以以工作溶液或进行适当稀释后的储备溶液的形式提供。
在某些情况下，可能会提供***。如本文所用，术语“***”是指具有应用检测平台的试剂的集合，但其来源不同或相同。在某些情况下，可能会提供试剂盒。如本文所用，术语“试剂盒”是指提供的试剂集合，如出售的试剂集合。例如，神经酰胺检测试剂可以与样本采集设备和质谱平台结合使用，以实现对这些生物标志物的多重检测，以实现个性化AMI治疗。
本发明的***和试剂盒还可包括一个或多个AMI表型确定元件，在许多实施例中，该元件是参考或对照样品或标记物表示，例如，通过合适的实验或计算手段，基于“输入”标记物水平图谱进行AMI检测/预后，例如，已用上述标记物确定元件确定的。代表性的AMI表型确定元件包括来自已知患有或不患有AMI的个体的样品，标志物水平表示的数据库，例如，如上所述的参考或对照图谱或得分等。
除上述组件外，试剂盒还将进一步包括用于实践方法的说明。 这些说明书可以以多种形式存在于试剂盒中，试剂盒中可能会出现其中一种或多种说明书。 这些说明书可能存在的一种形式是，在适当的介质或基材上印刷信息，例如，将含有打印信息的一张或几张纸放置于试剂盒的包装中。 另一方法是含有记录信息的计算机可读介质，例如软盘，CD等。另一种可能存在的方式是网站地址，可以通过互联网访问被删除的网站上的信息。试剂盒中可能存在任何方便的方式。
实施例1：
急性心肌梗死神经酰胺标志物水平表示有许多用途。例如，标记物水平表示可以用于检测AMI事件；也就是说，提供关于受试者是否患有AMI的判断。在某些情况下，受试者可能表现出AMI的临床症状，例如，胸部有压力或憋闷，胸部疼痛，呼吸急促，出汗，恶心，呕吐，疲劳，轻盈或突然头晕和焦虑。在其他情况下，受试者可能对AMI没有症状，但是具有与AMI相关的危险因素，例如，男性年龄大于45岁，女性年龄大于55岁；吸烟者或长期接触；高血压;高血胆固醇或甘油三酸酯水平；肥胖；糖尿病；代谢综合症；心脏病家族史；缺乏体育锻炼；压力；非法使用毒品；女性先兆子痫病史和自身免疫性疾病。在其他情况下，受试者可能没有AMI症状，并且没有与AMI相关的危险因素。
实施例2：
作为另一个实施例，可以使用AMI神经酰胺标志物水平表示来监测AMI事件。“监测”AMI，通常是指检测受试者的状况，例如。 通知AMI检测，告知AMI预后，提供有关AMI治疗的效果或功效信息，等等。
实施例3：
在一些实施例中，提供AMI评估的受试者神经酰胺检测方法，例如检测AMI事件，预测AMI，监测AMI治疗等，可能包括与受试者临床标志物水平表征相结合使用的附加评估。例如，方法可以进一步包括测量与AMI相关的一个或多个临床参数/因素，例如，心电图（ECG）测量，影像学检查，组织血管造影或尸检或心肌肌钙蛋白（[cTn]）测试。例如，可以针对一个或多个临床测试结果对受试者进行评估，其中将临床评估的阳性结果（即，检测与AMI相关的一种或多种症状）与标志物水平表示法结合使用以提供AMI检测，AMI预后，监测AMI治疗等。在某些情况下，可以在获得AMI标志物水平表示之前对临床测试进行测量，例如，告知医疗保健提供者是否应获得AMI标志物水平表征，例如，做出或确认AMI检测的诊断。在某些情况下，临床试验可能在获得AMI标志物水平表征后进行测试。例如，确认AMI诊断或监测AMI治疗效果。
实施例4：
作为另一个示例，提供AMI评估神经酰胺测量方法可以进一步包括评估与发生AMI风险相关的一个或多个因素。AMI危险因素的非限制性例子包括，例如，男性年龄大于45岁，女性年龄大于55岁；吸烟或长期接触；高血压；高血胆固醇或甘油三酸酯水平；肥胖；糖尿病；代谢综合症；心脏病家族史；缺乏体育锻炼；压力；非法使用毒品；女性先兆子痫病史和自身免疫性疾病。例如，一个受试者可能通过健康检查或人口筛查评估一个或多个风险因素，如医疗状况、代谢特征测试、家族史等，其中风险评估结果为阳性（即确定与AMI相关的一种或多种风险因素）与标志物水平表征结合使用以提供AMI检测，AMI预后，监视AMI治疗等。
实施例5：
试剂盒及具体检测方法：
血清质谱分析：
将每种10μL校准品（2D7-16:0神经酰胺、2D7-18:0神经酰胺、2D7-24:1神经酰胺、2D7-24:0神经酰胺，6种不同浓度的校准品，浓度分别为：0.01uM，0.02uM，0.05uM，0.25uM，1uM，10uM）和质控液（0.01uM、0.025uM、0.4uM、8uM）加入10μL脱脂血清（稀释液）中，得到一套血清校准品和一套血清质控品（LLOQ、QC低、QC中和QC高）。将10µL试验血清加入10µL 异丙醇。在20µL预处理校准品、质控品和试验血清中加入200µL含有同位素标记内标物的提取液（甲醇：异丙醇，体积比为1:1溶液，包括 2D7-16:0神经酰胺、2D7-18:0神经酰胺、2D7-24:1神经酰胺、2D7-24:0神经酰胺各5nm）。样品剧烈涡旋1分钟。在12000 g离心5分钟后，收集180μL上清液，然后进行质谱（MS）分析。
质谱分析使用高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS），色谱柱为ACE Super18柱（2.1 mmx 100 mm x 1.7μm。在一些实施例中，使用Vanquish UPLC***和TSQ AltisTM三重四极杆质谱仪（Thermo Scientific，San Jose，CA）。将5μL血清提取物注入UPLC***，流动相为：含有10mM碳酸氢铵的甲醇：异丙醇（体积比为1:1）溶液。
样品通过30°C ACE Super18柱（2.1 mm x 100 mm x 1.7μm），在ESI负极模式下注入。
通过质谱方法得出神经酰胺(d18:1/16:0), 神经酰胺(d18:1/18:0), 神经酰胺(d18:1/20:0), 神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1), 神经酰胺(d18:1/24:2), 神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/26:0)的丰度值，并进一步计算神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0),神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0), 神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0), 神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/26:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0), 神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)。带入AMI评估模型（即XGBoost算法）进行打分，得出分值小于0.388时表明试验血清结果为阴性即AMI低风险，等于或大于0.388时结果为阳性即AMI高风险。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (7)
1.一种急性心肌梗死的血清标志物，其特征在于：所述血清标志物至少包括如下神经酰胺标志物：神经酰胺 (d18:1/16:0)，神经酰胺 (d18:1/18:0)，神经酰胺 (d18:1/20:0)，神经酰胺 (d18:1/22:0)，神经酰胺 (d18:1/23:0)，神经酰胺 (d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)，神经酰胺 (d18:1/24:2)，神经酰胺 (d18:1/25:0)，神经酰胺 (d18:1/26:0)中的一种或两种以上。
2.根据权利要求1所述的急性心肌梗死的血清标志物，其特征在于：所述血清标志物的丰度比值组成如下神经酰胺预测因子，具体包括：神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/16:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/25:0)，神经酰胺(d18:1/18:0)/神经酰胺(d18:1/26:0)，神经酰胺(d18:1/20:0)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:1)/神经酰胺(d18:1/24:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/22:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/23:0)，神经酰胺(d18:1/24:2)/神经酰胺(d18:1/24:0)。
3.根据权利要求1或2所述的急性心肌梗死的血清标志物，其特征在于：所述血清标志物的水平表示方法，步骤如下：
质谱方法评估血清中的神经酰胺标志物的一种或两种以上，以确定血清中每种急性心肌梗死神经酰胺标志物的水平，计算神经酰胺预测因子的一种或两种以上。
4.如权利要求1至3任一项所述的急性心肌梗死的血清标志物在制备急性心肌梗死的诊断、预测、监测和/或治疗的试剂盒方面中的应用。
5.一种利用如权利要求1至3任一项所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒。
6.一种检测如权利要求1至3任一项所述的急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括a）；其中，a）为一个或两个以上用于检测样本中一组神经酰胺预测因子的检测组分，这些预测因子来自包括所述神经酰胺标志物的急性心肌梗死标志物，所述标志物选自神经酰胺（d18:1/16:0），神经酰胺（d18:1/18:0），神经酰胺（d18:1/20:0），神经酰胺（d18:1/22:0），神经酰胺（d18:1/23:0），神经酰胺（d18:1/24:0），神经酰胺（d18:1/24:1），神经酰胺（d18:1/24:2），神经酰胺（d18:1/25:0），神经酰胺（d18:1/26:0）。
7.根据权利要求6所述的检测急性心肌梗死的血清标志物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括质控品、标准品、缓冲液中的一种或两种以上。
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